JP6709590B2 - タンパク質生産用システム及びタンパク質の製造方法 - Google Patents
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Description
〔人工転写因子遺伝子導入形質転換体の構築〕
本実施例では、まず、アスペルギルス・オリゼHO2株(受託番号:NITE BP−01750)のゲノムDNA遺伝子を鋳型に、プライマー1、2にてtppA遺伝子の上流配列、プライマー3、4にて下流配列、プライマー5、6にてtef1プロモーター遺伝子、プライマー7、8にてagdAターミネーター遺伝子、プライマー9、10にてマーカーリサイクリング用の遺伝子断片、アスペルギルス・アワモリHA1株(受託番号:NITE BP−01751)のゲノムDNA遺伝子を鋳型に、プライマー11、12にてpyrG遺伝子発現用遺伝子カセットを、それぞれDNAポリメラーゼ(東洋紡績株式会社製、商品名:KOD FX neo)にてPCR増幅し、精製キット(QIAGEN社製、商品名:QIAquick PCR purification kit)にて精製して、計6つの遺伝子断片を取得した。
まず、配列番号1のシスエレメントを4個タンデムに連結し、その5´側に制限酵素サイトSphI、BamHIサイトを、3´側にBglII、NcoIサイトを付加した第1の遺伝子断片をオリゴ合成により作製した。
前記シスエレメントが8個タンデムに連結されたGUS生産株を、CDプレート培地にて1週間培養して胞子を形成させ、該胞子を0.01%POLYSORBATE20(和光純薬工業株式会社製)を用いて回収し、胞子懸濁液を取得した。
NaH2PO4・2H2O(MW=156.01)(pH7)
1.56g(50mM)
0.5M EDTA 4mL (10mM)
非イオン性界面活性剤(シグマアルドリッチ社製、商品名:TritonX-100)
0.2g (0.1%)
N−ラウリルサルコシン酸Na 0.2g (0.1%)
β−メルカプトエタノール(MW=78.13) 142μL(10mM)
蒸留水 200mL
次に、前記抽出液を、次の組成のGUS活性測定用バッファーに加え、37℃で15分間反応させた後、波長415nmで吸光度を測定し活性値(U)を算出した。1Uは、37℃において1分間にPNP−Glucuronide(プリンヌクレオシドホスホリラーゼ−グルクロン酸包合物)から1mMのPNPを生成するのに必要な酵素量である。
NaH2PO4・2H2O(MW=156.01)(pH7)
1.56g(50mM)
β−メルカプトエタノール(MW=78.13) 142μL(10mM)
非イオン性界面活性剤(シグマアルドリッチ社製、商品名:TritonX-100)
0.2g (0.1%)
p−ニトロフェニル β−D−グルクロン酸包合物(MW=315.23)
63mg (1mM)
蒸留水 200mL
次に、プロテインアッセイCBB溶液(ナカライタスク株式会社製)を用いて、前記抽出液に含まれるタンパク質量を測定し、前記活性値をタンパク質量で除して、GUS活性(U/mg)を算出した。結果をGUS活性の相対値として、図4に示す。
本比較例では、人工転写因子遺伝子を導入せず、シスエレメントを全く連結しなかった以外は、実施例1と全く同一にして、GUS生産株を構築した。
本実施例では、200mL三角フラスコにPG培地(2質量/容量%グルコース、1質量/容量%ポリペプトン、0.1質量/容量%カザミノ酸、0.5質量/容量%リン酸2水素カリウム、0.05質量/容量%硫酸マグネシウム、0.1質量/容量%硝酸ナトリウム)50mLを取り、これに前記実施例1で得られた前記シスエレメントが8個タンデムに連結されたGUS生産株の胞子を、最終胞子濃度が1×105/mLとなるように植菌し、30℃で60時間液体培養した以外は、実施例1と全く同一にしてGUS活性(U/mg)を算出した。結果を図6に示す。
本比較例では、比較例1で得られたGUS生産株を用いた以外は、実施例2と全く同一にしてGUS活性を測定した。前記液体培養を30℃で60時間行ったときのGUS活性(U/mg)を図6に示す。
Claims (8)
- タンパク質をコードする遺伝子と、該遺伝子の上流側に連結された該遺伝子のプロモーターと、該プロモーターのさらに上流側に連結された配列番号1で示されるシスエレメントと、該シスエレメントの活性を向上する人工転写因子とからなるタンパク質生産用システムであって、
該人工転写因子は、転写因子KojRの上流側1〜118aaのアミノ酸配列からなるDNA結合ドメインと、転写因子AmyRの下流側113〜604aaのアミノ酸配列からなる活性ドメインとからなり、該DNA結合ドメインの下流側に該活性ドメインが連結され、配列番号2で示されることを特徴とするタンパク質生産用システム。 - 請求項1記載のタンパク質生産用システムにおいて、人工転写因子により活性が向上されるタンパク質発現用遺伝子断片は、前記人工転写因子をコードする遺伝子と、該遺伝子の上流側に連結された該遺伝子のプロモーターとからなる人工転写因子発現用遺伝子断片を備えることを特徴とするタンパク質生産用システム。
- 請求項1又は請求項2記載のタンパク質生産用システムにおいて、前記シスエレメントは、前記タンパク質をコードする遺伝子のプロモーターの上流側に1〜10個の範囲の数が連結されることを特徴とするタンパク質生産用システム。
- 請求項1〜請求項3のいずれか1項記載のタンパク質生産用システムを含むことを特徴とする発現ベクター。
- 請求項1〜請求項3のいずれか1項記載のタンパク質生産用システムを含むことを特徴とする形質転換体。
- 請求項5記載の形質転換体において、麹菌を宿主細胞とすることを特徴とする形質転換体。
- 請求項6記載の形質転換体において、前記麹菌は、アスペルギルス・オリゼHO2株(受託番号:NITE BP−01750)であることを特徴とする形質転換体。
- 請求項1〜請求項3のいずれか1項記載のタンパク質生産用システムを含む形質転換体を培養し、培養後の培地又は該形質転換体内から、該タンパク質生産用システムにより発現亢進される遺伝子によりコードされるタンパク質を回収することを特徴とするタンパク質の製造方法。
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