JPH044883A - プリン・ヌクレオシド・ホスホリラーゼをコードするｄｎａ断片 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔発明の背景〕 〈産業上の利用分前〉 本発明は、バシラス属に属する好熱菌由来の新規プリン
・ヌクレオシド・ホスホリラーゼをコードするＤＮＡ断
片等に関するものである。

〈従来の技術〉 核酸系化学療法剤は、抗腫瘍、免疫抑制、抗ウィルス′
、９の種々の用途に使用されている。

近年、エイズの流行とともにヌクレオシドアナログの抗
ウィルス作用か注目され、種々のヌクレオシドアナログ
の抗ウィルス活性が試験されている（たとえば、化学と
生物、第２７巻、第６号、第３５６〜３６６頁（１９８
９年）など参照）。

従来、これらのヌクレオシドアナログは化学的に合成さ
れていたか、４５℃以上の温度条件下でヌクレオシド・
ホスホリラーゼを利用することにより数々のヌクレオシ
ドアナログを収率よく調製することができることが判明
するに至り、ヌクレオシド・ホスホリラーゼを利用した
ヌクレオシドアナログの合成はヌクレオシドアナログを
調製するための重要な技術となっている（たとえば、発
酵と工業、第３９巻、第１０号、第９２７〜９３７頁（
１９８１年）参照）。

ヌクレオシド・ホスホリラーゼは、動物、微生物などの
種々の生物に存在することが確認されており、そのいく
つかは単離精製されて、酵素学的諸性質が報告されてい
る（たとえば、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏ
ｇｙ、　Ｖｏｌ、　Ｌｌ、　４２３〜４５ｇ　、同５１
７〜５４２（＋９７８）参照）。

ヌクレオシド・ホスホリラーゼの調製源としては微生物
が何列であり、バシラス属に属する好熱菌の一種である
バシラス・ステアロサーモフィラスについてもヌクレオ
シド・ホスホリラーゼの存在が確認されている。すなわ
ち、ピリミジン・ヌクレオシド・ホスホリラーゼ（Ｅ、
　　Ｃ，２，４゜２．２）、プリン・ヌクレオシド・ホ
スホリラーゼ（Ｅ、　Ｃ，２，４，２，１）ともバシラ
ス・ステアロサーモフィラスから単離精製され、その諸
性質が報告されているとともに（Ｊ、　Ｂｉｏ、　Ｃｈ
ｅｗ、。

２４４　、３８９１〜３６９７（１９６９）、Ａｇｒｉ
ｃ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｆｆｌ、。

５３、２２０５〜２２１０（１９８９）参照）、それら
の酵素を利用してのヌクレオシドおよびそのアナログの
調製およびその可能性も報告されている（Ａｇｒｉｅ。

Ｂｌｏｌ、　Ｃｈｅｎ、、　５３．１９７　〜２０２（
１９８９）　、特開昭５６−１６６１９９号公報、特開
昭５６−Ｐ６４７９３号公報、特開平１−３２０９９５
号公報など参照）。

また、ヌクレオシド・ホスホリラーゼをコードする遺伝
子の解析に関しては、以下の報告かなされている。

Ｐｒｏｃ、　Ｎａ１１．＾ｃａｄ、　Ｓｃｉ、、　Ｕ、
Ｓ、Ａ、、　８０（１４）。

４２８１〜４２８５　（１９８３）　、Ｎｕｃｌｅｉｅ
　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、、　１２（１４）、　　５７７
９〜５７８７　　（１９８４）　、Ｇｏｎｇｙｅ　Ｗｅ
ｉｓｈｅｎｇｗｎ。

１９（４）　１〜５（１９８９）　、Ｇｃｎｃｔｉｋａ
、　１９（Ｇ）、　８８１〜８８７　（１９８３）。

しかしながら、従来報告されているヌクレオシド・ホス
ホリラーゼは、（ｉ）耐熱性が弱い、（ｊ　ｉ）比活性
が低く、効率的にヌクレオシドアナログの調製ができな
い、（Ｉｉｌ）基質特異性か厳密すぎて、種々のヌクレ
オシドアナログを調製するには不都合である、等のいず
れかの欠点を有していて、必ずしも満足できるものでは
なかった。

たとえば、本発明者は、先に、バシラス属に属する好熱
菌から、耐熱性があって比活性の高いヌクレオシド・ホ
スホリラーゼを大量に発現する菌株群を見出し、それら
からヌクレオシド・ホスホリラーゼを単離するのに成功
しているが（日本農芸化学会誌、第６３巻、第３号（１
９８９年度大会講演要旨集）、第２８３頁参照）、得ら
れたヌクレオシド・ホスホリラーゼのうちプリン・ヌク
レオシド・ホスホリラーゼは、比活性か高く、耐熱性を
有しているものの、アデノシン系の化合物にはほとんど
作用しないものであった。

また、最近アデノシンにも作用するプリン・ヌクレオシ
ド・ホスホリラーゼがバシラス・ステアロサーモフィラ
スから単離されているが、８０℃で失活し、かつ収率よ
（単離てきないという問題点を有していた（Ａｇｒｉｅ
、　ｌ３ｉｏ１．　Ｃｈｅｉ、、　５３．３２１９〜３
２２４（１９８９）参照）。

〔発明の概要〕

〈発明が解決しようとする課題〉 本発明は、上記の点に解決を与えることを目的とするも
のである。

く課題を解決するための手段〉 本発明者らは上記問題点を解決すべく種々の微生物をス
クリーニングした結果、バシラス属に属する好熱菌から
、以前に報告したプリン・ヌクレオシド・ホスホリラー
ゼとはその酵素学的性質が異なり、基質特異性が厳密で
なく、かつ耐熱性のすぐれた新規なプリン・ヌクレオシ
ド・ホスホリラーゼならびにこの酵素をコートする遺伝
子を含ＨするＤＮＡ断片を特定することに成功して、本
発明を完成させた。

すなわち、本発明によるＤＮＡ断片は、バシラス属に属
する好熱菌由来のプリン・ヌクレオシド・ホスホリラー
ゼ遺伝子を含みかつ下記の制限酵素地図で示される、大
きさが約２．４ｋｂである、ものである。

（ここで、Ｓｕは制限酵素５ａｕ３ＡＴ認識部位を、Ｐ
は制限酵素ｐｖｕＩＩ認識部位を、Ｔは制限酵素Ｔｔｈ
ｌｌｌＩ認識部位を、Ｄは制限酵素Ｄｒａ　Ｉ認識部位
を、Ｓｐは制限酵素５ｐｈｌ認識部位を、それぞれ示す
） 本発明は、また、このＤＮＡ断片を細菌内で複製可能な
ベクターに組込んでなる組換えプラスミドにも、この組
換えプラスミドで形質転換体された形質転換体を培養し
て当該プリン・ヌクレオシド・ホスホリラーゼを発現さ
せてなるバシラス属に属する好熱菌由来のプリン・ヌク
レオシド・ホスホリラーゼを含有する細菌菌体を含む培
養物にも、そして、この培養物から分離したバシラス属
に属する好熱菌由来のプリン・ヌクレオシド・ホスホリ
ラーゼを含有する菌体、またはその処理物にも、さらに
本発明のＤＮＡ断片のコードするプリン。ヌクレオシド
・ホスホリラーゼ自体にも、関する。

〈発明の効果〉 本発明によるＤＮＡ断ハは、これを用いれば、大腸菌等
の他の宿主においてもプリン・ヌクレオシド・ホスホリ
ラーゼを大量に発現させることができるものであるとこ
ろ、この酵素はアデノシンを最も好適な基質とするばか
りでなく、イノシンやグアノシンにも作用するという広
い基質特異性を有し、しかも耐熱性もあることから、種
々のヌクレオシドアナログを調製するための酵素として
極めて有用である。

また、このＤＮＡ断ｊ１は上記したところから遺伝子上
学的方法によってヌクレオシド・ホスホリラーゼを調製
するための道具として有用であるか、その方法をバシラ
ス属に属する好熱菌そのものからこの酵素を調製する場
合と比較すれば、本発明のＤＮＡ断片を使用することに
より、下記の（イ）および（ロ）の利点が得られる。

（イ）　微生物からの酵素の抽出が容易になる。

従来のバシラス属に属する好熱菌からの酵素の抽出は極
めて困難であったが、大腸菌を宿主として利用する場合
にはりゾチーム法等の極めて容易な操作で収率よく本発
明酵素を回収することができる。すなわち、本発明の遺
伝子を発現させる際は、宿主の修飾（分泌）系を介して
膜近く　（ダラム陰性細菌の場合はべりプラズム）にそ
の多くが移行するので、宿主に成育阻害等の悪影響を及
はすことなく大量発現がなされる。また、該酵素の回収
はりゾチーム法等細菌で一般的に用いられる簡便な方法
によりなされ、かつ該酵素か耐熱性を有することから熱
処理によって比活性の向上も効率よく行なうことかでき
る。

（ロ）　胞子形成に伴う自己溶解による酵素の漏出、失
活等のデメリットがなくなる。

バシラス属微生物は胞子を形成する際に自己溶解して、
酵素の漏出、失活等がみられ、これが生菌体を酵素源と
して使用して連続反応を行う際のデメリットとなってい
たのであるが、大腸菌を宿主とすることにより上記デメ
リットを克服することができる。

また、本発明のＤＮＡ断片中の発現関連領域は外来遺伝
子を発現させるのにも好適であり、宿主に対する影響を
最少限に抑えながら効率的な異種タンパク質の発現が期
待される。

〔発明の詳細な説明〕

＜ＤＮＡ断片〉 本発明によるＤＮＡ断片は、バシラス属に属する好熱菌
由来のプリン・ヌクレオシド・ホスホリラーゼ遺伝子を
含み、下記の制限酵素地図で示されて、大きさが約２，
４ｋｂのものである。

二こで、記号は、下記の通りの制限酵素認識部位を示す
。なお、この表には、本発明に関連するその他の制限酵
素の記号をも示しである。

記号　　　　制限酵素 ＥＶ　　　　　ＥｃｏＲＶ Ｐ　　　　　　Ｐｖｕｉｌ Ｔ　　　　　　Ｔｔｈｌｌｌｌ Ｄ　　　　　　Ｄｒａ！ ｓｐ　　　　　５ｐｈＩ ＳＩ　　　　　　５ａｉｌ Ｓｕ　　　　　５ａｕ３ＡＩ ＥＩ　　　　　　ＥｃｏＲＩ Ｓｃ　　　　　Ｓａｃｌ Ｓｍ　　　　　Ｓｍａ　ｌ ５ａｕ３ＡＩは４塩基認識制限酵素であって、この地図
中で他の場所にもその認識部位をＨする筈であるので、
この特定の部位のものについては（Ｓ　ｕ）と表示して
いる。

本発明によるＤＮＡ断片はバシラス属に属する好熱菌由
来のヌクレオシド・ホスホリラーゼ遺伝子を含むもので
あることは前記したところであるが、ここで「バシラス
属に属する好熱菌由来」ということは塩基配列がバシラ
ス属に属する好熱菌の遺伝子のそれと実質的に同じであ
るということを意味するものであって、必ずしも本発明
によるＤＮＡ断片かバシラス属に属する好熱菌から抽出
されたものに限定されることを意味するものではない。

なお、「塩基配列が実質的に同じ」ということは、ヌク
レオシド・ホスホリラーゼとしての遺伝情報が維持され
ている限り、いくつかの＋１を位ヌクレオチド（塩ＩＸ
）の置換、欠失および（または）付加があってもよいこ
とを意味する。

また、「バシラス属に属する好熱菌由来」ということは
、バシラス属に属する好熱菌に属する合目的的なすべて
の菌株を対象とするものである。

ここで、バシラス属に属する好熱菌としては、バシラス
・ステアロサーモフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｔｅａ
ｒｏＬｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）　、バシラス・シエレ
ゲリ（１３ａｃｉｌｌｕｓ　ｓｅｈｌｅｇｅｌｉ）　、
バシラス・アンドカルダリアス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ａ
ｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ）などの中等度好熱菌が例
示される。

なお、本発明によるＤＮＡ断片は上記の制限酵素地図で
示される所定の大きさのものであるか、本発明によるこ
のＤＮＡ断片はそれ自身としての存在に限定されない。

すなわち、本発明によるＤＮＡ断片は、基本的なそれ自
身としての存（Ｅの外に、その上流および（または）下
流側に希望するＤＮＡ鎖が結合している形態ならびに所
定ＤＮＡ鎖中に介在ないし組込まれている形態であって
もよい。

後者の所定ＤＮＡ鎖中に介在している形態の一例は、プ
ラスミドであって、所定宿主細胞に対する発現ベクター
に組込まれてなるプラスミドは本発明によるＤＮＡ断片
の有用性が現実のものとなるという点で本発明ＤＮＡ断
片の好ましい具体例である。発現ベクター中に適当なシ
グナルペプチド遺伝子を結合させてあれば、発現酵素の
菌体外ないしペリプラズム中への分泌が促進される。

本発明によるＤＮＡ断片は、前記制限酵素地図の５ｕ−
３ｐの部分に対応するものである。このＤＮＡ断片がコ
ードするヌクレオシド・ホスホリラーゼは、プリン・ヌ
クレオシド・ホスホリラーゼ（Ｐｕｒｉｎｅ　ｎｕｃｌ
ｅｏｓｉｄｅ　ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｓｅ：ＰｕＮＰ
ａ　ｓ　ｅ）である。

＜ＤＮＡ断片の作成／取得〉 本発明によるＤＮＡ断片は、希望するならばその鎖中の
全部または一部を化学合成することによって得ることが
できるが、その鎖長がかなり長いことを考慮すれば、バ
シラス属に属する好熱菌の染色体を適当な制限酵素で一
段ないし多段に分解して得ることが好ましい。

バシラス属に属する好熱菌からのＤＮＡ断片の調製は、
既に知られている合目的的な任意の方法によって行なう
ことができる。具体的な方法は、たとえば、下記の通り
である。

染色体ＤＮＡを取得するための微生物としてはバシラス
属に属する好熱菌に属し、目的とする酵素を発現してい
るものであれば、ある特定の株に制限されないことは前
記したところであるが、具体的にはバシラス・ステアロ
サーモフィラスＴＨ６−２（微工研条寄第２７５８号）
、同Ｐ−２１，１、ｊｌ　Ｐ　−２３ならびにＡＴＣＣ
８００５、Ｉｎ＋　１０１４９、同１２０１６、Ｉｎ＋
　１２９７６、同１２９７８、同１２９８０、同１５９
５２、同２１３６５、同２９６０９などを例示すること
ができる。ＴＨ６−２、Ｐ−２１およびＰ−２３は本発
明者の見出した株であって、本発明で対象とするのに好
ましいものの具体例であるが、これらの微生物、就中特
に好ましいＴＨ６−２、の詳細、特に菌学的性質、は特
願平１−２０３５５６号明細書に記載されている。

バシラス属に属する好熱菌からの染色体ＤＮＡの調製は
、菌体の溶菌、タンパク質の除去、およびＲＮＡの除去
の工程を順次または同時に行うことにより実施すること
ができる。より具体的には、ＭａｒｒＯｕｒ法（Ｊ、　
Ｂｉｏｌ、　３．２０８　（１９６１））　、Ｔｈｏｎ
＋ａｓ法（Ｊ、　Ｈｏｔ、　Ｂｉｏｌ、、１１．４７ｆ
ｉ　（１９６５））、Ｓａｉ　ｔｏ−Ｍｉｕｒａ法（Ｂ
ｉｏｃｈｉｎ＋、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ａｅｔａ、　７
２゜０１９（１９Ｇ３））、Ｓｍ１ｔｈ法（Ｍｅｔｈｏ
ｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　。

Ｖｏｌ、　１２．　Ｐａｒｔ　Ａ、　５４５　（１９［
ｉ７）　）　、ｌ”ａｋａｈａｓｈｉ法（Ｊ、　Ｍｏ１
．　Ｅｖｏｌ、、　３．２３９（１９７４）　、Ｊ、　
Ｂａｃｔｃｒｌｏｌ、。

８９、１００５　（１９０５）　、Ｄａｖｃｒｎ法（Ｐ
ｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　５５．７９２　（１９８６）、Ｎ
ａｔｕｒｃ、　２１９　、１２５１（ＩＨＩＩＩ））　
、Ｋａｖｃｎｏｒｆ法（Ｊ、　Ｈｏｔ、　Ｂｉｏｌ、、
　７２．８０１（１９７２））　、Ｗｏｒｃｃｌ−Ｂｕ
ｒｇｉ法（Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、、　７１゜１２
７　（１９７２）、Ｊ、　Ｍｏ１．　ＢＩｏｌ、＋　８
２．９１　（１９７４）　）などの各法に記載の方法を
適宜応用することにより染色体ＤＮＡを調製すればよい
。

得られた染色体ＤＮＡは、ＢａｍＨＩ、５ａｕ３ＡＩ、
Ｈｉｎｄｍなどの適当な制限酵素で分解した後、ショ糖
密度勾配遠心法（たとえば、生化学実験講座２「核酸の
化学Ｉ」第３２３〜３３３頁（東京化学同人１９７５年
発行）など参照）にて２．５〜８．ＯｋｂのＤＮＡ断片
を万両採取する。

分画して得られたＤＮＡ断片とＤＮＡ断片を調製する際
に使用した制限酵素もしくは同じ活管末端を生じる制限
酵素で分解したプラスミドＤＮＡとを連結し、これを大
腸菌等の宿主菌内に導入して、宿主菌を形質転換させる
。

使用できるプラスミドとしては、通常使用されているＣ
ｏ１Ｅ１の系統、ｐＭＢ９の系統、ｐＢＲ３２２の系統
、ｐｓｃｌｏｌの系統、Ｒ６にの系統などいずれであっ
てもよい。

具体的にはｐＢＲ３２２、ｐｓｃｌ　０１、ｐＵＣ１１
８、ｐＵｃ１１９、ｐＢＲ３２５などが使用される。

染色体ＤＮＡから切り出したＤＮＡ断片とプラスミドＤ
ＮＡ断片との連結は、制限酵素で切断したプラスミドＤ
ＮＡ断片を必要によりアルカリホスファターゼ処理（Ｓ
ｃｉｅｎｃｅ、　１９６．１３１３（１９７７））して
からりガーゼで結合する方法により行うことができる。

ハイブリッドプラスミドによる宿主菌の形質転換は、常
法に準じて行なえばよく、たとえば宿主として大腸菌（
たとえば、Ｋ−１２株　Ｃ−６００）を使用する場合に
は塩化カルシウムを用いる方法によればよい（たとえば
、「分子生物実験マニュアル」第１５９〜１６１真（講
談社１９８３年発行）など参照）。宿主菌は通常使用さ
れている細菌であればいずれをも使用することができ、
必ずしも大腸菌に限られるものでもない。

具体的には、大腸菌等のダラム陰性菌、枯草菌等のダラ
ム陽性菌等があるが、大腸菌が使用に便利であるので好
ましいといえる。

このようにして得られた形質転換体は、まず上述のハイ
ブリッドプラスミドを有する形質転換体を選別後、ヌク
レオシド・ホスホリラーゼ誘導培地中で培養し、溶菌液
の酵素活性を調べて、プリン・ヌクレオシド・ホスホリ
ラーゼ生産能を有する株を選択する。

第一次の選別は、通常、使用したプラスミドの保持する
抗生物質（たとえば、アンピシリン、テトラサイクリン
等）等の薬剤耐性の有無による判別によって行なうこと
ができる。

薬剤耐性株を培養するのに用いるヌクレオシド・ホスホ
リラーゼ誘導培地は大腸菌等の宿主菌か生育可能な培地
であればよく、具体的には、実施例に示したように、ペ
プトン、酵母エキス、肉メト、食塩等を自白する培地を
用いればよい。

また、溶菌液中の酵素活性の測定は、大腸菌等の宿主由
来のヌクレオシド・ホスホリラーゼと本発明酵素とを区
別するため、宿主由来のヌクレオシド・ホスホリラーゼ
の失活する温度（７５〜８５℃）条件下で行えばよい。

ヌクレオシド・ホスホリラーゼ活性陽性の菌株は、菌体
からプラスミドＤＮＡを抽出後、再度上述と同様の方法
により宿主に導入して、酵素活性を確認することが望ま
しい。

プラスミドの抽出はアルカリ溶菌法等（Ｎｏ　ｌ　ｃ−
ｃｕ！ａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、　ｐ３６ｆｔ−３６９，
Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　ＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔ
ｏｒｙ、　（１９８２））　、精製は塩化セシウム−エ
チジウムプロミドを用いる方法（Ｐｒｏｅ、　Ｎａｐ、
　Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、ＵＳＡ、　５７．１５１４　（１９６７）など
参照）、などの常法により行なうことができる。

活性が確認された菌株からプラスミドを再度抽出し、制
限酵素（たとえばｓｐｈ　１など）を用いて染色体由来
のＤＮＡ断片を小型化してから、本発明のＤＮＡ断片を
得ることかできる。すなわち、後述の実施例の場合には
ＥｃｏＲＶおよび５ａｌＩで抽出プラスミドを消化すれ
ば、本発明のＤＮＡ断片を含むＤＮＡ断片得ることがで
きる。

上記の方法のうち、好ましい態様をフローシートで示せ
ば、下記の通りである。

プラスミドｐＢＲ３２２ ↓ Ｂａｍ　　Ｈ１分解 ＴＨ６−２株染色体全ＤＮＡ ↓ ５ａｕ３Ａ１部分分解 ライゲーション　〈−蔗糖密度勾配遠心による分画操作
↓　　　　　（２，５ｋｂ〜８　ｋ　ｂ　ｆｔ１ｉ）ｌ
１ｊｌ“ゝＥ、ｃｏｌｉ　　Ｋ−１２株　Ｃ−６００に
導入↓ アンピシリンにより選択 ↓ 酵素誘導培地で培義 ↓ 溶菌液の酵素活性探索 プラスミド抽出（ｐＰＵＲｌ） ↓ 再度Ｃ−６００に導入／酵素活性確認 ↓ プラスミド抽出、制限酵素地図作成 ↓ サブクローニング（ｐＰＵＲ１Δ５ｐｈｌ）（約３．４
ｋｂのＤＮＡ断片をｓｐｈ　Ｉで切り縮め、本発明酵素
遺伝子を含むＥｃｏＲＶ−５ａ　ｌ　Ｉ（約２．４ｋｂ
）断片をｐＵｃ１１８に結合）＜ＤＮＡ断片の利用〉 本発明のＤＮＡ断片は、少なくともパンラス属に属する
好熱菌由来のヌクレオシド・ホスホリラゼの構造遺伝子
領域と構造遺伝子を発現させるのに必要な領域（発現関
連領域）の２つの領域を含有する。

したかって、本発明によるＤＮＡ断片はそれが担う遺伝
子情報を利用すべく、たとえば、パンラス属に属する好
熱菌由来のヌクレオシド・ホスホリラーゼを発現させ、
該酵素を利用してヌクレオシド類を合成したり、または
本発明のＤＮＡ断片中の発現関連領域を利用して他の外
来遺伝子を発現させるべく、分子生物学ないし遺伝子工
学の技術に従って、各種の利用かロエ能である。

本発明によるＤＮＡ断片の利用を、本発明のＤＮＡ断片
を細菌内で複製可能なベクターに絹み込んでなる組換え
プロスミド、数組換えプラスミドを用いて形質転換させ
た形質転換体、および該形質転換体の利用について具体
的に説明すれば、下記の通りである。

（１）組換えプラスミド 本発明かＤＮＡ断片を大腸菌内で複製可能なベクターに
組込んでなる組換えプラスミドにも関することは前シ己
しｔこところである。

このような組換えプラスミドの一例は、それに必要な宿
主菌内で複製可能なベクターと共に、ＤＮＡ断片取得の
観点で前記した通りであるか、本発明による組換えプラ
スミドは調製後のＤＮＡ断片をあらためて発現プラスミ
ドに組込んで得たものであってもよいことはいうまでも
ない。

この後者の場合は、ＤＮＡ断ハの末端の制限酵素認識配
列を考慮して、必要に応じて適当なリンカ−の介在ない
し読み枠の調節等を行なって、発現プラスミドに組込め
ばよく、その場合の技術は既に分子生物学において慣用
されたものである。

このような組換えプラスミドによる宿主菌の形質転換も
慣用技術であって、合［１的的な任意のｈ゛法によって
得ることができる。

宿主菌としては、大腸菌等のダラム陰性菌、枯草菌等の
ダラム陽性菌が例示されるが、好ましいのは大腸菌であ
る。大腸菌を具体的に例示すれば、たとえば、Ｋ−１２
株（たとえばＣ−６００、ＭＣ１０６１）、等の各種菌
株が使用可能である。

（２）形質転換体およびその利用 本発明が上記のようにして得られる形質転換体を培養し
てプリン・ヌクレオシド・ホスホリラーゼを発現させて
なるパンラス属に属する好熱菌由来のプリン・ヌクレオ
シド・ホスホリラーゼを含有する細菌菌体を含む培養物
、該培養物から分離して得られる菌体、およびその処理
物、さらに本発明のＤＮＡ断片のコードするプリン・ヌ
クレオシド・ホスホリラーゼにも関することは前記した
ところである。

本発明によるＤＮＡ断片から上記培養物を得るには、上
述と同様に適当なプラスミドに本発明のＤＮＡ断片を導
入後、大腸菌等の宿主を形質転換させ、該形質転換体を
宿主の増殖しうる培地成分を含有する培地中で培養すれ
ばよい。

培養に使用する培地成分としては炭素源（グルコース、
フラクトース、グリセロール、シュクロースなど）、窒
素源（塩化アンモニウム、硝酸アンモニウム、硫酸アン
モニウム、尿素、などの無機態窒素、酵母エキス、ペプ
トン、ポリペプトン、肉エキス、などの有機態窒素）、
その他の微量成分（塩化ナトリウム（食塩）、塩化マグ
ネシウム、塩化マンガンなどの金属塩、ビオチン、ビタ
ミン８１２などのビタミン類など）などを使用すればよ
い。

培養条件は培養温度２０〜４０°Ｃ５ｐＨ５〜１０、期
間１日〜１５日間程度の範囲内より適宜選定することが
できる。

このようにして得られたパンラス属に属する好熱菌由来
のヌクレオシド・ホスホリラーゼを含有する細菌菌体を
含む培養物は、ヌクレオシドアナログを調製するための
酵素源として有用である。

また、培養物以外にもこの培養物から分離した菌体、菌
体処理物（菌体破浪物、変性菌体、粗酵素、精製酵素、
固定化酵素（菌体））なども酵素源として有用である。

これらの酵素源は常法に従って調製することができる。

たとえば、培養菌体からの本発明酵素の抽出および精製
は、リゾチーム法、ガラスピーズ法、浸透圧ショック法
、その他、好ましくはりゾチーム法、により抽出した酵
素活性画分について酵素の通常の単離精製手段（たとえ
ば塩析処理（硫安分画）、各種クロマトグラフィー法、
各種電気泳動法など）を適宜組み合わせて行なえばよい
。また、大腸菌由来のタンパク質を除去する目的で酵素
の単離精製の前処理として熱処理（６０〜８０℃で１〜
１０分間加熱）を追加するとより効率的である。

（３）プリン・ヌクレオシド・ホスホリラーゼ本発明に
よるＤＮＡ断片の遺伝情報の発現によって生成するヌク
レオシド・ホスホリラーゼかプリンヌクレオシド・ホス
ホリラーゼであることは前記したところである。

この酵素の諸性質は、下記の通りである。

（１）作用 この酵素は、下記の反応を触媒する。

プリン・ヌクレオシド＋リン酸（塩） ＝α−Ｄ−リボースー１−リン酸＋プリン従って、この
酵素は、国際酵素分類 ＥＣ２，４，２，１に属するプリン・ヌクレオシド−ホ
スホリラーゼである。

（２）基質特異性 アデノシンに対する加リン酸分解活性を１００とした場
合の各種ヌクレオシドに対する活性は、第１表に示す通
りである。

第１表 第１表から明らかなようにこの酵素はアデノシンに対す
る基質特異性が最も高いものであり、またイノシンおよ
びグアノシン等のその他のプリン・ヌクレオシドにも広
く作用するものであることが明らかである。

（３）分子量 ５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法により求め
たこの酵素の分子量は、約２７０００である。

〈実施例〉 下記の実施例は、バシラス・ステアロサーモフィラスＴ
Ｈ６−２の染色体ＤＮＡより ＰｕＮＰａ５ｅ遺伝子含有ＤＮＡ断片を調製する方法を
示すものである。

本実施例における各種制限酵素、およびＴ４ＤＮＡリガ
ーゼはすべて宝酒造■から人手し、酵素の反応条件はｒ
Ｍｏｌｅｃｕｌｏｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｊ（Ｃｏｌｄ　
Ｓｐｒｉｎｇ　１ｌａｒｂｏｒ　１．ａｂｏｒａＬｏｒ
ｙ（１９ｇ２））の記載に従った。

実施例Ｉ ＴＨ６−２にのプリン・ヌクレオシド・ホスホリラーゼ
（ＰｕＮＰａｓｅ）活性を有するＤＮＡのショットガン
・クローニングを下記の通りに行なった。

（イ）　　ＴＨ６−２株染色体ＤＮＡの取得バシラス・
ステアロサーモフィラスＴＨ６−２株をスラントから５
００ｍ１容三角フラスコ中のＶＹ培地１００ｍ１に接種
した後、４８℃で１６時間振盪培養し、菌体を集めた。

この菌体を、２０ｍＭのＥＤＴＡを含む５０ｍＭトリス
−塩酸緩衝液（ｐＨ８，０）５０ｍｌで洗浄し、同緩衝
液２０ｍ１に懸濁させ、リゾチーム（シグマ社製、グレ
ード１）粉体４０ｆｆ１ｇとりボヌクレアーゼＡ（ＲＮ
ａｓｅＡ）（シグマ社製、タイプＸ１ｌ−Ａ）溶液を終
濃度２０μｇ　／　ｍｌで加え、３７℃に３０分装いた
後、１０％ＳＤＳ　（ドデシル硫酸ナトリウム）溶液（
終濃度０．５％）を加えてよく混合し、ブロテイナーゼ
Ｋ（シグマ社製、プロテアーゼタイプＸＩ）溶液（終濃
度１００μｇ／ｍｌ）を加えて３７℃で更に４５分間保
温した。この溶液に等量のフェノール／クロロホルム／
イソアミルアルコール（２５：　２４　：　１）溶液を
加えて、フェノール処理を行なった。フェノール処理は
、続けて２回行なった。回収した水層に２倍容の冷工タ
ノールを加え、析出した高分子ＤＮＡを巻き取り法によ
り回収し、室温エタノールで洗浄した後、］ｍＭのＥＤ
ＴＡを含む１０ｍＭ）リス−塩酸緩衝液（ｐＨ８，０）
（以下ＴＥ緩衝液と略す）に対して一晩透析を行なって
、染色体ＤＮＡを透析内液として得た。

なお、ＶＹ培地は次の組成のものである。

ヴイール・インフュージョン（デイフコ社製）２．５酵
母エキス　　　　（〃）　　０．５ （ｐＨ７，０、単位は％（徂ｆｆｉ／体積）、以降の培
地組成中に用いる９６も同じ意味を示す。）（ロ）　　
ＤＮＡのショットガン・クローニング前記ＴＨ６−２株
の染色体ＤＮＡを常法により（Ａｄｖａｎｃｅｄ　Ｂａ
ｃｔｃｒｉａｌ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、　ｐ２２Ｂ−２３
０，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｙ、　（１９８０）等参照）、制限酵素５ａｕ
３ＡＩで部分分解した。これを１０４０　％蔗糖密度勾
配溶液層（蔗糖はＴＥ緩衝？＆に溶解）に重層し、２万
６千回転／２０℃で１８時間遠心して分画した。２．５
〜８．Ｏｋｂの大きさのＤＮＡ断片をｕＨする両分を合
わせて、ＴＥ緩衝液に対して透析した。

一方、プラスミドｐＢＲ３２２（宝酒造■製）をＢａｍ
ＨＩで分解後、アルカリホスファターゼ（宝／ＩＩＩＩ
造株製、大腸菌Ｃ７５株山来）処理、次いでフェノール
処理した後、エタノールを加えて、ＤＮＡを回収した。

両者のＤＮＡを混合し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼにより連結
した。

このＤＮＡで、常法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉ
ｎｇ。

ｐ２５０−２５１．　　Ｃｏ１ｄ　　Ｓｐｒｉｎｇ　　
ｌ１ａｒｂｏｒ　　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８２）
）に従って、大腸菌に一１２株Ｃ−６００（微工研菌寄
第８０３７号）を形質転換させた。

培地は、２５μｇ／ｍｌのアンピンリンを含むし培地（
１９６バクトトリプトン（デイフコ社製）、０．５％酵
母エキス、０．５％食塩、０．１％グルコース、ｐＨ７
，２）を使用した。得られたアンピシリン耐性形質転換
体を１２．５μｇ　／　ｍｌのテトラサイクリンを含む
し一培地にレプリカし、テトラサイクリン耐性を示すも
のはｐＢＲ３２２１：　ｆｆｉ　的のＤＮＡ断片が挿入
されていないものとして除外した。選択された形質転換
体を、滅菌楊子で誘導培地（バクトペプトン（デイフコ
社製）１．０％、肉エキス０．７％、酵母エキス０．５
％、食塩０．３９６、ｐＨ７，５）５ｍｌに移して、３
７℃、−夜培養した。

得られた菌体を１ｍｌの溶菌緩衝液（５ｍＭＥＤＴＡ、
０．１％トリトンＸ−１００（シグマ社製）を含む５０
ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７，７））に懸濁させ、
終濃度０．　２ｍｇ／ｍｌのりゾチームを加えて、３７
℃に１時間保った。この溶菌液を１万６千回転／３℃で
１０分間遠心し、上清を回収した。この上清をサンプル
液として、以下の活性Δｐ１定を行なった。

１　ｍｌの基質溶液（０，１Ｍリン酸二水素カリウムを
含む２０ｍＭアデノシン溶液（ｐＨ８，０））に］　Ｏ
ｌｔ　Ｉのサンプル液を加え、８０℃で１０分反応後、
０．１ｍｌの２規定塩酸水溶液を加えて反応を停止し、
遠心後、上清を希釈して、高速液体クロマトグラフィー
（ＨＰＬＣ）法（カラム：ＹＭＣＡ−３１２株山村化学
研究所製、溶出剤ニアセトニトリル５．０％含有２０ｍ
Ｍトリスー塩酸緩衝液（ｐＨ７，５）、検出：２６０ｎ
ｍ）により、分解された塩基の有無を調べた。

約４，０００株の蚊補株より陽性の株１株が見出された
。陽性柱よりアルカリ溶菌法（ＭｏｌｃｃｕｌａｒＣｌ
ｏｎｉｎｇ、ｐ３０ｇ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ！Ｉ
ａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８２））によ
りプラスミドを粗精製し、再度Ｃ６００に導入して活性
を確認後、大量の培養菌体よりアルカリ溶菌法、エチジ
ウムプロミドを含む塩化セシウム密度勾配遠心法により
プラスミドを精製した。得られたプラスミドをｐＰＵＲ
ｌと名付けた。このプラスミドは、ｐＢＲ３２２のＢａ
ｍＨＩ認識部位に３．４ｋｂのＤＮＡ断片が挿入された
ものであることがわかった。その各種制限酵素に対する
切断部位は、第１図に示す通りであった。この挿入ＤＮ
ＡがＴＨ６−２株の染色体ＤＮＡから、欠失や断片の再
結合をともなうことなく、そのままの形でクローニング
されていることは、サザン・ハイブリダイゼーション（
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　ｐ３８２−３８
９．　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇｌｌａｒｂｏｒ　Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ（１９ｇ２）　）により確認された。

実施例２ Ｓａｕ３Ａ１部分分解により得られた３、４ｋｂ断片の
切り縮めを、下記の通りに行なった。

精製したｐＰＵＲＩを制限酵素ｓｐｈ　Ｉ及び３ａｃＩ
で切断し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼにより連結処理を行なっ
た。これを用いて大腸菌に一１２株Ｃ−６００を形質転
換させた。得られた形質転換体からプラスミドの抽出及
び溶菌液の酵素活性４１す定を行ない、陽性の活性を示
す株の中からｐＰＵＲＩの挿入ＤＮＡが最も切り縮まっ
たプラスミドを有する株を得た。このプラスミドはｐＰ
ＵＲＩから約１ｋｂの５ｐｈｌ断片か切り出されたもの
であることか確認され、このプラスミドをｐＰＵＲＩ・
△Ｓと名付けた。更に、ｐＰＵＲＩ・△ＳのＴＨ６−２
株に由来する２、４ｋｂ（７）断片を含む２．７ｋｂ（
７）ＥｃｏＲＶと５ａｌｌによって切り出される断片を
精製し、ｐＵｃ１１８プラスミドのポリリンカ一部位に
挿入したプラスミドｐＵｃ１１８　　ＰＵＲ５−ＥＶＳ
を作成した。両プラミドの各種制限酵素による切断部位
は、第２図および第３図に示す通りである。

なお第２〜３図で、太線部分はＴＨ６−２株由来のＤＮ
Ａを示す。Ａｍｐ’はアンピシリン耐性遺伝子を示す（
その他の記号は、前記の通りである）。また、第３図で
ＥｃｏＲＶおよびＳｍａｌ切断により生ずる末端は平滑
末端であり、両制限酵素で切断した断片を連結した後は
、いずれの制限酵素でも切断されない。

実施例３ 大腸菌での発現及び粗酵素液からの遊離酵素の回収を下
記の通り行なった。

大腸菌に一１２株ＭＣ−１０６１をプラスミドｐＵｃ１
１８ＰＵＲ３−ＥＶ−３で形質転換させ、得られた形質
転換体を５００ｍ１容の三角フラスコ中の５０μｇ　／
　ｍｌのアンピシリンを含む誘導培地に植菌し、３７℃
で１６時間振盪培養した。得られた菌体を０．５ｍｇ／
ｍｌのりゾチームを含む溶菌緩衝／＆４０ｍ１に懸濁さ
せて、３７℃に５０分保温した。この溶菌液を遠心して
得られた上７’ＦＪ約３３ｍ１に１Ｍ酢酸−酢酸ナトリ
ウム緩衝液３ｍｌを加え、５０℃にて１０分加熱し、生
じた変性蛋白を遠心により除いた。得られた粗酵素液に
対して終濃度０．９飽和となる様に粉末硫酸アンモニウ
ムを加え、塩析操作を行った。遠心により沈澱として得
られた粗蛋白画分は少量の２ｍＭのβ−メルカプトエタ
ノールを含む５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７，２
）に溶解し、同緩衝液に対して一夜透析した。塩析後の
遠心上清中に残った脂質層は塩析により析出しないリン
脂質とコンプレックスを形成したタンパク質を含む両分
と考え、分取して低温に保存した。

対照としてプラスミドｐＵｃ１１８を用いたＭＣ１０６
１の形質転換体を同じ方法により項五および溶菌して、
粗酵素液を得た。

粗酵素液及び塩析操作後の両分のアデノシン加リン酸分
解活性は第２表に示す通りであった。

活性１１Ｆｌ定は実施例１に記載と同し方法で、たたし
６０℃にて、行った。

第２表 ＊Ｕは、酵素液１ｍｌ当り、１分間に１マイクロモルの
アデニンか生成する酵素量、と定義したものである。

ｐＵｃｌ　１８ＰＵＲ８−ＥＶ−８て形質転換した大腸
菌に一１２株ＭＣ１０６１を培養して得られた粗酵素液
を用いて明らかとなった一部の性質を、第４〜５図およ
び第３表に示す。すなわち、第４図は各温度でのアデノ
シン分解？＋’ｒ性を、第５図は耐熱性を、それぞれ示
すものである。なお、耐熱性は、５０’Ｃての活性を１
００としての相対活性を示したものであって、粗酵素液
に１Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７，０）を１／９ｍ加
えて、最終濃度が０．１Ｍ１−リスとなるようにして、
各濃度で１−５分間処理後、８０℃にて前述の方法によ
って測定したものである。

また、５ＤＳ−ポリアクリルアミドケル電気泳動を用い
てハ１定した本発明の酵素の分子量は、約２７０００で
あった。

第３表 リボヌクレオシドに対する反応性 アデノシンに対する活性を１００として相対活性で示す
。

実施例４ 粗酵素液の熱処理による好熱菌酵素の選択的回収は、下
記の通りに行なった。

実施例３で得られた、ｐｌＪｃ１１８ＰＵＲ５・ＥＶ−
３で形質転換された大腸菌に一１２株ＭＣ１０６１の溶
菌液の熱処理（５０℃、１０分間）上１ｇを更に６０℃
及び７０℃にてそれぞれ１０分処理し、その遠心上？Ｒ
をＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＮａＬｕｒ
ｅ、　Ｖａｔ、　２２７．　ｐ６８０−６８５　（＋９
７０）　）に供した。対照として、ｐＵＣ１１８で形質
転換された大腸菌に一１２株ＭＣ１０６１の溶菌液の熱
処理上清も同時に電気泳動に付した。なお、サンプル、
対照ともに５０℃熱処理上清時の玉白質総量は約４０μ
ｇに調整し、分析に供した。分子量マーカーにはファル
マシア社の低分子量マーカーを用い、ル−ン当たり総量
で約３ＣＪｔｔｇを供した。

その結果、ＴＨ６−２株由来のヌクレオシド・ホスホリ
ラーゼは失活せずに上清に残留するのに対して、大腸菌
由来のタンパク質は変性して沈殿部に移行することが確
認できた。

く微生物の寄託〉 プラスミドｐＢＲ３２２に本発明によるＤＮＡ断片を組
込んでなる組換えプラスミドｐＰＵＲ１・ΔＳを保持す
る大腸菌に１２−株ＭＣ１０６１は、ニジエリシア・コ
リ（Ｅｓｅｈｅｒｉｅｈｌａ　ｃｏｌｉ）ＫＹ−１（ｐ
ＰＵＲｌ・ΔＳ）という名称で平成２年１月１６０に工
業技術院微生物工業技術研究所に寄託されて、微工研菌
寄第１１１９６号の受託番号を得ている。なお、寄託さ
れた微生物の菌学的性質は、バシラス・ステアロサーモ
フィラス由来のプリン・ヌクレオシド・ホスホリラーゼ
を含６″している点を除けば大腸菌に一１２株ＭＣ１０
６１と同じであって、この形質転換株は大腸菌に分類さ
れる。

バシラス命ステアロサーモフィラスＴＨ６−２は、平成
元年２月４１１に同様に寄託されて、微工研条寄第２７
５８号の受託番号を得ている。また、大腸菌に一１２株
Ｃ６００は、昭和６０年１月７１１に同様に寄託されて
、微工研菌寄第８０３７号の受託番号を得ている。

【図面の簡単な説明】

第１図は、プラスミドｐＰＵＲ１の制限酵素地図を示す
説明図である。 第２図は、プラスミドｐＰＵ１・△Ｓの制限酵素地図を
示す説明図である。 第３図は、プラスミドｐＵＣ１１８ＰＵＲ８−ＥＶ−３
の制限酵素地図を示す説明図である。 第４図は本発明による酵素の各濃度でのアデノシン分解
活性を示すグラフである。 第５図は、 本発明による酵素の耐熱性を示すグ ラフである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、バシラス属に属する好熱菌由来のプリン・ヌクレオ
   シド・ホスホリラーゼ遺伝子を含みかつ下記の制限酵素
   地図で示される、大きさが約２．４ｋｂである、ＤＮＡ
   断片。 ▲数式、化学式、表等があります▼ （ここで、Ｓｕは制限酵素Ｓａｕ３Ａ I 認識部位を、
   Ｐは制限酵素ＰｖｕII認識部位を、Ｔは制限酵素Ｔｔｈ
   １１１ I 認識部位を、Ｄは制限酵素Ｄｒａ I 認識部位
   を、Ｓｐは制限酵素Ｓｐｈ I 認識部位を、それぞれ示
   す） ２、バシラス属に属する好熱菌がバシラス属に属する中
   等度好熱菌である、請求項１記載のＤＮＡ断片。 ３、バシラス属に属する好熱菌がバシラス・ステアロサ
   ーモフィラスである、請求項１記載のＤＮＡ断片。 ４、請求項１記載のＤＮＡ断片を細菌内で複製可能なベ
   クターに組込んでなる、組換えプラスミド。 ５、請求項４記載の組換えプラスミドで形質転換された
   形質転換体を培養して当該プリン・ヌクレオシド・ホス
   ホリラーゼを発現させてなる、バシラス属に属する好熱
   菌由来のヌクレオシド・ホスホリラーゼを含有する細菌
   菌体を含む培養物。 ６、請求項５記載の培養物から分離したバシラス属に属
   する好熱菌由来のプリン・ヌクレオシド・ホスホリラー
   ゼを含有する菌体、またはその処理物。 ７、請求項１記載のＤＮＡ断片のコードする下記の性質
   を有するプリン・ヌクレオシド・ホスホリラーゼ。 ［１］作用 プリン・ヌクレオシド＋リン酸 ■α−Ｄ−リボース−１−リン酸＋プリン ［２］基質特異性 アデノシンに対する基質特異性が高い ［３］分子量 ２７０００（ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動法） ［４］熱安定性 １００℃で１５分間処理しても５０％以上の残存活性を
   示す。