JP2017023012A

JP2017023012A - タンパク質発現用塩基配列及びそれを用いるタンパク質の製造方法

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Publication number: JP2017023012A
Application number: JP2015142213A
Authority: JP
Inventors: 智新川; Satoru Shinkawa; 茂信光澤; Shigenobu Mitsuzawa; 麻衣子田中; Maiko Tanaka; 町田　雅之; Masayuki Machida; 雅之町田; 萩原　央子; Hisako Hagiwara; 央子萩原; 英明小池; Hideaki Koike; 万保子國永; Mahoko Kuninaga
Original assignee: Honda Motor Co Ltd; National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST
Current assignee: Honda Motor Co Ltd; National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST
Priority date: 2015-07-16
Filing date: 2015-07-16
Publication date: 2017-02-02
Anticipated expiration: 2035-07-16
Also published as: JP6709590B2; US20180201942A1; EP3322808A1; WO2017010109A1; US10266833B2; EP3322808B1

Abstract

【課題】特定の遺伝子のプロモーターをさらに活性化して、糖化酵素等のタンパク質の生産量を増加させることができるタンパク質発現用塩基配列提供。【解決手段】タンパク質発現用塩基配列１は、タンパク質２をコードする遺伝子３と、遺伝子３の上流側に連結された遺伝子３のプロモーター４と、プロモーター４のさらに上流側に連結されたシスエレメント５とからなる。人工転写因子６により活性が向上されるシスエレメント５が特定の配列である、タンパク質発現用塩基配列１。【選択図】図１

Description

本発明は、麹菌を用いて糖化酵素等のタンパク質を生産する際に用いられるタンパク質発現用塩基配列及びそれを用いるタンパク質の製造方法に関する。

従来、麹菌を用いて糖化酵素等のタンパク質を生産する際に、該タンパク質を生産する特定の遺伝子のプロモーターに、特定の塩基配列からなるシスエレメントを連結したタンパク質発現用塩基配列を用いることが知られている（例えば、特許文献１，２参照）。前記従来のタンパク質発現用塩基配列によれば、前記プロモーターに前記シスエレメントを連結することにより、該プロモーターの活性を向上させることができ、前記タンパク質の生産量を増加させることできる。

例えば、特許文献１には、ＸｌｎＲ／Ａｃｅ２結合配列及びＨａｐ複合体結合配列からなるエンハンサーＤＮＡをシスエレメントとし、ｔｅｆ１遺伝子のプロモーターの上流側（５´側）に該シスエレメントを１２個連結する技術が記載されている。特許文献１によれば、このようにすることにより、小麦フスマを炭素源とした固体培養条件下で、前記プロモーターによるＧＵＳ活性を約４．９倍向上することができるとされている。

また、特許文献２には、麹菌（アスペルギルス・オリゼ）のａ−グルコシダーゼ遺伝子のプロモーターに存在するエンハンサーＤＮＡをシスエレメントとし、該プロモーターの上流側（５´側）に該シスエレメントを１２個連結する技術が記載されている。特許文献２によれば、このようにすることにより、デンプンを炭素源とする培養条件下で、前記プロモーターによるＧＵＳ活性を約６倍向上することができるとされている。

特開２０１２−７５３６９号公報特許第３３４３５６７号公報

しかしながら、前記従来のタンパク質発現用塩基配列は、特定の遺伝子のプロモーターに、特定の塩基配列からなるシスエレメントを連結したに過ぎず、さらに改良が望まれる。

本発明は、かかる事情に鑑み、特定の遺伝子のプロモーターをさらに活性化して、糖化酵素等のタンパク質の生産量を増加させることができるタンパク質発現用塩基配列及びそれを用いるタンパク質の製造方法を提供することを目的とする。

前記目的を達成するために、本発明のタンパク質発現用塩基配列は、タンパク質をコードする遺伝子と、該遺伝子の上流側に連結された該遺伝子のプロモーターと、該プロモーターのさらに上流側に連結されたシスエレメントとからなるタンパク質発現用塩基配列であって、人工転写因子により活性が向上される該シスエレメントが配列番号１で示されることを特徴とする。

本発明のタンパク質発現用塩基配列によれば、前記プロモーターの上流側に連結された前記配列番号１で示されるシスエレメントの活性が前記人工転写因子により向上され、活性が向上された該シスエレメントにより該プロモーターの活性をさらに向上させることができる。この結果、活性が向上された前記プロモーターにより、前記遺伝子の活性が向上され、該遺伝子にコードされるタンパク質の生産量を増加させることができる。

本発明のタンパク質発現用塩基配列において、前記人工転写因子は、転写因子ＫｏｊＲの上流側１〜１１８ａａの塩基配列からなるＤＮＡ結合ドメインと、転写因子ＡｍｙＲの下流側１１３〜６０４ａａの塩基配列からなる活性ドメインとからなり、該ＤＮＡ結合ドメインの下流側に該活性ドメインが連結され、配列番号２で示されることを特徴とする。前記配列番号２で示される人工転写因子によれば、前記シスエレメントの活性を向上させることができる。

また、本発明のタンパク質発現用塩基配列は、前記配列番号２で示される人工転写因子をコードする遺伝子と、該遺伝子の上流側に連結された該遺伝子のプロモーターとからなる人工転写因子発現用塩基配列を備えることが好ましい。前記人工転写因子発現用塩基配列によれば、前記配列番号２で示される人工転写因子をコードする遺伝子のプロモーターにより該遺伝子の活性が向上され、該遺伝子にコードされた人工転写因子が生産される。

また、本発明のタンパク質発現用塩基配列において、前記配列番号１で示されるシスエレメントは、前記プロモーターの上流側に少なくとも１個連結されていることが必要であり、例えば１〜１０個の範囲の数が連結される。

本発明の発現ベクターは、本発明のタンパク質発現用塩基配列を含むことを特徴とする。本発明の発現ベクターによれば、本発明のタンパク質発現用塩基配列を含む形質転換体を製造することができる。

また、本発明の形質転換体は、本発明のタンパク質発現用塩基配列を含むことを特徴とする。本発明の形質転換体によれば、前記遺伝子にコードされるタンパク質の生産量を増加させることができる。

本発明の形質転換体は、麹菌を宿主細胞とすることが好ましく、該麹菌はアスペルギルス・オリゼＨＯ２株（受託番号：ＮＩＴＥＢＰ−０１７５０）であることがさらに好ましい。

また、本発明のタンパク質の製造方法は、本発明のタンパク質発現用塩基配列を含む形質転換体を培養し、培養後の培地又は該形質転換体内から、該タンパク質発現用塩基配列により発現亢進される遺伝子によりコードされるタンパク質を回収することを特徴とする。

本発明のタンパク質発現用塩基配列によれば、前述のように前記遺伝子によりコードされるタンパク質の生産量を増加させることができる。そこで、本発明のタンパク質発現用塩基配列を含む形質転換体を培養すると、生産されたタンパク質が培養後の培地又は該形質転換体内に蓄積されるので、該タンパク質を回収することができる。

本発明のタンパク質発現用塩基配列の構成及び作用を模式的に示す説明図。転写因子ＫｏｊＲの予測される構造を模式的に示す説明図。転写因子ＡｍｙＲの予測される構造を模式的に示す説明図。本発明の形質転換体をデキストリンを基質として６０時間培養したときのＧＵＳ活性の相対値を示すグラフ。本発明の形質転換体をデキストリンを基質として９０時間培養したときのＧＵＳ活性を示すグラフ。本発明の形質転換体をグルコースを基質として６０時間培養したときのＧＵＳ活性を示すグラフ。

次に、添付の図面を参照しながら本発明の実施の形態についてさらに詳しく説明する。

図１に示すように、本実施形態のタンパク質発現用塩基配列１は、所望のタンパク質２をコードするタンパク質遺伝子３と、タンパク質遺伝子３の上流側（５´側）に連結されたプロモーター４と、プロモーター４の上流側（５´側）に連結されたシスエレメント５とを備える。

タンパク質２は例えば糖化酵素等であり、タンパク質遺伝子３はタンパク質２をコードする遺伝子であればどのようなものであってもよい。

シスエレメント５は、ｋｏｊＴ遺伝子のプロモーターに存在するエンハンサーＤＮＡを含む塩基配列からなり、該塩基配列は、gacggaaaagtcgggtagat（配列番号１）である。タンパク質発現用塩基配列１では、プロモーター４の上流側に、１〜１０個、例えば８個のシスエレメント５が連結される。

また、タンパク質発現用塩基配列１は、人工転写因子６をコードする人工転写因子遺伝子７と、人工転写因子遺伝子７の上流側（５´側）に連結されたプロモーター８とからなる人工転写因子発現用塩基配列９を備え、シスエレメント５は人工転写因子６により活性が向上される。

人工転写因子６は、図２に示す転写因子ＫｏｊＲ１１と、図３に示す転写因子ＡｍｙＲ２１とから作製される。転写因子ＫｏｊＲ１１、ＡｍｙＲ２１は、亜鉛配位ＤＮＡ結合ドメイン（Ｚｎ＿Ｃｌｕｓｔｅｒ）を持つ転写因子中、いずれもＣｙｓ６ｃｙｓｔｅｉｎｅ−Ｚｉｎｃｃｌｕｓｔｅｒタイプに分類される転写因子である。

図２に示すように、転写因子ＫｏｊＲ１１は、上流側（５´側）にＺｎ＿Ｃｌｕｓｔｅｒ１２を備え、下流側（３´側）にＣｙｓ６ｃｙｓｔｅｉｎｅ−Ｚｉｎｃｃｌｕｓｔｅｒタイプに分類される転写因子に共通する相同性の高い領域であるＭＨＲ１３を備える。ここで、転写因子ＫｏｊＲ１１は全長５５５ａａの塩基配列からなり、Ｚｎ＿Ｃｌｕｓｔｅｒ１２は１５〜４５ａａの塩基配列からなり、ＭＨＲ１３は１４８〜２８１ａａの塩基配列からなる。

転写因子ＫｏｊＲ１１では、上流側のＺｎ＿Ｃｌｕｓｔｅｒ１２を含む領域１４に、シスエレメント５との結合に関係するＤＮＡ結合ドメインが存在すると予想される。前記ＤＮＡ結合ドメインの候補となる領域として、例えば、１〜１１８ａａの塩基配列からなる領域、１〜１９５ａａの塩基配列からなる領域、１〜２３９ａａの塩基配列からなる領域を挙げることができる。

一方、図３に示すように、転写因子ＡｍｙＲ２１は、上流側（５´側）にＺｎ＿Ｃｌｕｓｔｅｒ２２を備え、下流側（３´側）に活性ドメインを含む領域２３を備える。ここで、転写因子ＡｍｙＲ２１は全長６０４ａａの塩基配列からなり、Ｚｎ＿Ｃｌｕｓｔｅｒ２２は１３〜５２ａａの塩基配列からなる。

転写因子ＡｍｙＲ２１では、活性ドメインの候補となる領域として、例えば、１１３〜６０４ａａの塩基配列からなる領域、１５０〜６０４ａａの塩基配列からなる領域、２１９〜６０４ａａの塩基配列からなる領域、２５７〜６０４ａａの塩基配列からなる領域を挙げることができる。

そこで、本実施形態の人工転写因子は、転写因子ＫｏｊＲの上流側１〜１１８ａａの塩基配列からなるＤＮＡ結合ドメインの下流側に、転写因子ＡｍｙＲの下流側１１３〜６０４ａａの塩基配列からなる活性ドメインを連結した構成（配列番号２）を備える。

本実施形態のタンパク質発現用塩基配列１では、図１に示すように、人工転写因子発現用塩基配列９においてプロモーター８により活性が向上された人工転写因子遺伝子７によりコードされた人工転写因子６が生産され、生産された人工転写因子６がシスエレメント５に結合する。シスエレメント５は人工転写因子６と結合することにより活性が向上され、活性が向上されたシスエレメント５により、プロモーター４の活性が向上される。

そして、活性が向上されたプロモーター４によりタンパク質遺伝子３の活性が向上され、活性が向上されたタンパク質遺伝子３にコードされたタンパク質２が生産される。この結果、本実施形態のタンパク質発現用塩基配列１によれば、タンパク質２の生産量を増加させることができる。

次に、本発明の実施例を示す。

〔実施例１〕
〔人工転写因子遺伝子導入形質転換体の構築〕
本実施例では、まず、アスペルギルス・オリゼＨＯ２株（受託番号：ＮＩＴＥＢＰ−０１７５０）のゲノムＤＮＡ遺伝子を鋳型に、プライマー１、２にてｔｐｐＡ遺伝子の上流配列、プライマー３、４にて下流配列、プライマー５、６にてｔｅｆ１プロモーター遺伝子、プライマー７、８にてａｇｄＡターミネーター遺伝子、プライマー９、１０にてマーカーリサイクリング用の遺伝子断片、アスペルギルス・アワモリＨＡ１株（受託番号：ＮＩＴＥＢＰ−０１７５１）のゲノムＤＮＡ遺伝子を鋳型に、プライマー１１、１２にてｐｙｒＧ遺伝子発現用遺伝子カセットを、それぞれＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡績株式会社製、商品名：KOD FX neo）にてＰＣＲ増幅し、精製キット（QIAGEN社製、商品名：QIAquick PCR purification kit）にて精製して、計６つの遺伝子断片を取得した。

次に、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のプラスミドｐＭＤ２０（タカラバイオ株式会社製）を鋳型に、プライマー１３、１４にてプラスミド由来の遺伝子断片を、前記ＤＮＡポリメラーゼにてＰＣＲ増幅し、前記精製キットにて精製して、該遺伝子断片を取得した。

次に、以上の７つの遺伝子断片を、順次クローニングキット（タカラバイオ株式会社製、商品名：In-Fusion HD Cloning kit）を用いて処理し、Ｅ．ｃｏｌｉＨＳＴ０８株（タカラバイオ株式会社製）に形質転換し、プラスミドｐＰＴを構築した。

次に、前記プラスミドｐＰＴを制限酵素ＳｍａＩ（タカラバイオ株式会社製）により３０℃で処理し、前記精製キットにて精製して、プラスミドの制限処理物（遺伝子断片）を取得した。

次に、アスペルギルス・オリゼＨＯ２株のゲノムＤＮＡ遺伝子を鋳型に、プライマー１５、１６にて転写因子ＫｏｊＲのＤＮＡ結合ドメイン、プライマー１７、１８にて転写因子ＡｍｙＲの活性ドメインを、それぞれ前記ＤＮＡポリメラーゼにてＰＣＲ増幅し、前記精製キットにて精製して、前記ＤＮＡ結合ドメイン及び前記活性ドメインを取得した。

次に、前記ＤＮＡ結合ドメイン及び前記活性ドメインを、前記クローニングキットを用いて処理し、Ｅ．ｃｏｌｉＨＳＴ０８株に形質転換し、前記ＤＮＡ結合ドメインと前記活性ドメインとを結合した人工転写因子遺伝子を導入したプラスミドを構築した。

前記人工転写因子遺伝子を導入したプラスミドを鋳型として、プライマー１９、２０にて麹菌形質転換用の遺伝子断片を、ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡績株式会社製、商品名：KOD-plus-neo）にてＰＣＲ増幅し、前記精製キットにて精製して、該麹菌形質転換用の遺伝子断片を取得した。

次に、前記麹菌形質転換用の遺伝子断片を用い、ＰＥＧ−カルシウム法の定法に従って、アスペルギルス・オリゼＨＯ２株を形質転換した。次に、得られた形質転換体からＣＤプレート培地で生育できる株を選択し、転写因子生産株を得た。

次に、前記転写因子生産株を、ＣＤ培地に終濃度１ｍｇ／ｍＬのフルオロオロチン酸一水和物（和光純薬工業株式会社製）と終濃度２０ｍＭのウリジン（シグマアルドリッチ社製）とを加えた培地に、１×１０^６個／プレートとなるように植菌し、生育できる株を選択して、転写因子生産株のウリジン要求性株を取得した。

プライマー１〜２０の塩基配列を表１に示す。

〔シスエレメントが連結されたＧＵＳ生産株の構築〕
まず、配列番号１のシスエレメントを４個タンデムに連結し、その５´側に制限酵素サイトＳｐｈＩ、ＢａｍＨＩサイトを、３´側にＢｇｌＩＩ、ＮｃｏＩサイトを付加した第１の遺伝子断片をオリゴ合成により作製した。

次に、前記第１の遺伝子断片と、アスペルギルス・オリゼ由来のｅｎｏＡプロモータを含むプラスミドｐＰＥＡ２を制限酵素ＳｐｈＩ、ＮｃｏＩで処理して断片化し、ライゲーション反応した後、Ｅ．ｃｏｌｉに形質転換し、プラスミドｐＥＡ４Ｋを構築した。

次に、前記遺伝子断片を制限酵素ＢａｍＨＩで処理する一方、プラスミドｐＥＡ４Ｋを制限酵素ＢｇｌＩＩ、ＮｃｏＩで処理し、２つの処理物をライゲーション反応した後、Ｅ．ｃｏｌｉに形質転換し、プラスミドｐＥＡ８Ｋを構築した。

次に、プラスミドｐＥＡ８Ｋを鋳型にプライマー２１、２２を用い、ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡績株式会社製、商品名：ＫＯＤ−ｐｌｕｓ−）にてＰＣＲ増幅し、精製キット（プロメガ株式会社製、商品名：ＷｉｚａｒｄＳＶＧｅｌａｎｄＰＣＲＣｌｅａｎ−ＵｐＳｙｓｔｅｍ）にて精製して、第２の遺伝子断片を取得した。

次に、アスペルギルス・オリゼのゲノムＤＮＡを鋳型にプライマー２３、２４を用い、ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡績株式会社製、商品名：ＫＯＤ−ｐｌｕｓ−）にてＰＣＲ増幅し、精製キット（プロメガ株式会社製、商品名：ＷｉｚａｒｄＳＶＧｅｌａｎｄＰＣＲＣｌｅａｎ−ＵｐＳｙｓｔｅｍ）にて精製して、第３の遺伝子断片を取得した。

次に、前記第２の遺伝子断片と前記第３の遺伝子断片とを鋳型にプライマー２２、２４を用い、フュージョンＰＣＲを行い、該第２の遺伝子断片と該第３の遺伝子断片とを結合させた第４の遺伝子断片を作製した。

次に、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のプラスミドｐＭＤ２０（タカラバイオ株式会社製）に、アスペルギルス・オリゼ由来のｐｙｒＧ遺伝子の上流１０００ｂｐ、アスペルギルス・オリゼ由来のｐｙｒＧ発現カセット、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のｕｉｄＡ遺伝子が導入されているプラスミドｐＰＰＧを制限酵素で処理したものと、プラスミドｐＰＰＧを鋳型にプライマー２５、２６を用い、ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡績株式会社製、商品名：ＫＯＤ−ｐｌｕｓ−）にてＰＣＲ増幅し、精製キット（プロメガ株式会社製、商品名：ＷｉｚａｒｄＳＶＧｅｌａｎｄＰＣＲＣｌｅａｎ−ＵｐＳｙｓｔｅｍ）にて精製して取得したマーカーリサイクリング用遺伝子断片とを、ライゲーション反応した後、Ｅ．ｃｏｌｉに形質転換し、プラスミドｐＰＰＲＧを構築した。

次に、プラスミドｐＰＰＲＧを鋳型に、プライマー２７、２８を用い、ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡績株式会社製、商品名：ＫＯＤ−ｐｌｕｓ−）にてＰＣＲ増幅し、精製キット（プロメガ株式会社製、商品名：ＷｉｚａｒｄＳＶＧｅｌａｎｄＰＣＲＣｌｅａｎ−ＵｐＳｙｓｔｅｍ）にて精製して、第５の遺伝子断片を取得した。

前記第４の遺伝子断片と前記第５の遺伝子断片とを鋳型にプライマー２４、２７を用い、フュージョンＰＣＲを行い、該第４の遺伝子断片と該第５の遺伝子断片とを結合させ、シスエレメントが連結されたＧＵＳ（β−グルクロニダーゼ）生産カセット遺伝子断片を作製した。

次に、前記シスエレメントが連結されたＧＵＳ生産カセット遺伝子断片を用い、ＰＥＧ−カルシウム法の定法に従って、転写因子生産株のウリジン要求性株を形質転換した。次に、得られた形質転換体からＣＤプレート培地で生育できる株を選択し、シスエレメントが８個タンデムに連結されたＧＵＳ生産株を得た。

プライマー２１〜２８の塩基配列を表２に示す。

〔ＧＵＳ活性測定方法〕
前記シスエレメントが８個タンデムに連結されたＧＵＳ生産株を、ＣＤプレート培地にて１週間培養して胞子を形成させ、該胞子を０．０１％ＰＯＬＹＳＯＲＢＡＴＥ２０（和光純薬工業株式会社製）を用いて回収し、胞子懸濁液を取得した。

次に、２００ｍＬ三角フラスコにＰＤ培地（２質量／容量％デキストリン、１質量／容量％ポリペプトン、０．１質量／容量％カザミノ酸、０．５質量／容量％リン酸２水素カリウム、０．０５質量／容量％硫酸マグネシウム、０．１質量／容量％硝酸ナトリウム）５０ｍＬを取り、これに前記胞子を、最終胞子濃度が１×１０^５／ｍＬとなるように植菌した。

次に、３０℃で６０時間の液体培養を行い、培養終了後、菌体を破砕し、次の組成の菌体内タンパク質抽出用バッファーに破砕粉末を懸濁して抽出液を取得した。

〔菌体内タンパク質抽出用バッファー組成〕
ＮａＨ_２ＰＯ_４・２Ｈ_２Ｏ（ＭＷ＝１５６．０１）（ｐＨ７）
１．５６ｇ（５０ｍＭ）
０．５ＭＥＤＴＡ４ｍＬ（１０ｍＭ）
非イオン性界面活性剤（シグマアルドリッチ社製、商品名：TritonX-100）
０．２ｇ（０．１％）
Ｎ−ラウリルサルコシン酸Ｎａ０．２ｇ（０．１％）
β−メルカプトエタノール（ＭＷ＝７８．１３）１４２μＬ（１０ｍＭ）
蒸留水２００ｍＬ
次に、前記抽出液を、次の組成のＧＵＳ活性測定用バッファーに加え、３７℃で１５分間反応させた後、波長４１５ｎｍで吸光度を測定し活性値（Ｕ）を算出した。１Ｕは、３７℃において１分間にＰＮＰ−Ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄｅ（プリンヌクレオシドホスホリラーゼ−グルクロン酸包合物）から１ｍＭのＰＮＰを生成するのに必要な酵素量である。

〔ＧＵＳ活性測定用バッファーの組成〕
ＮａＨ_２ＰＯ_４・２Ｈ_２Ｏ（ＭＷ＝１５６．０１）（ｐＨ７）
１．５６ｇ（５０ｍＭ）
β−メルカプトエタノール（ＭＷ＝７８．１３）１４２μＬ（１０ｍＭ）
非イオン性界面活性剤（シグマアルドリッチ社製、商品名：TritonX-100）
０．２ｇ（０．１％）
ｐ−ニトロフェニル β−Ｄ−グルクロン酸包合物（ＭＷ＝３１５．２３）
６３ｍｇ（１ｍＭ）
蒸留水２００ｍＬ
次に、プロテインアッセイＣＢＢ溶液（ナカライタスク株式会社製）を用いて、前記抽出液に含まれるタンパク質量を測定し、前記活性値をタンパク質量で除して、ＧＵＳ活性（Ｕ／ｍｇ）を算出した。結果をＧＵＳ活性の相対値として、図４に示す。

また、前記液体培養を３０℃で９０時間行ったときのＧＵＳ活性（Ｕ／ｍｇ）を、図５に示す。

〔比較例１〕
本比較例では、人工転写因子遺伝子を導入せず、シスエレメントを全く連結しなかった以外は、実施例１と全く同一にして、ＧＵＳ生産株を構築した。

次に、本比較例で得られたＧＵＳ生産株を用いた以外は、実施例１と全く同一にしてＧＵＳ活性を測定した。

前記液体培養を３０℃で６０時間行ったときのＧＵＳ活性（Ｕ／ｍｇ）の相対値を図４に、３０℃で９０時間行ったときのＧＵＳ活性（Ｕ／ｍｇ）を図５にそれぞれ示す。

図４から、デキストリンを基質として前記液体培養を３０℃で６０時間行ったときに、人工転写因子遺伝子を導入せず、シスエレメントを全く連結しなかった比較例１のＧＵＳ生産株のＧＵＳ活性（Ｕ／ｍｇ）を１とすると、実施例１のＧＵＳ生産株では２３．３倍のＧＵＳ活性を得ることができることが明らかである。

また、図５から、デキストリンを基質として前記液体培養を３０℃で９０時間行ったときに、人工転写因子遺伝子を導入せず、シスエレメントを全く連結しなかった比較例１のＧＵＳ生産株のＧＵＳ活性（Ｕ／ｍｇ）を１とすると、実施例１のＧＵＳ生産株では２２倍のＧＵＳ活性を得ることができることが明らかである。

〔実施例２〕
本実施例では、２００ｍＬ三角フラスコにＰＧ培地（２質量／容量％グルコース、１質量／容量％ポリペプトン、０．１質量／容量％カザミノ酸、０．５質量／容量％リン酸２水素カリウム、０．０５質量／容量％硫酸マグネシウム、０．１質量／容量％硝酸ナトリウム）５０ｍＬを取り、これに前記実施例１で得られた前記シスエレメントが８個タンデムに連結されたＧＵＳ生産株の胞子を、最終胞子濃度が１×１０^５／ｍＬとなるように植菌し、３０℃で６０時間液体培養した以外は、実施例１と全く同一にしてＧＵＳ活性（Ｕ／ｍｇ）を算出した。結果を図６に示す。

〔比較例２〕
本比較例では、比較例１で得られたＧＵＳ生産株を用いた以外は、実施例２と全く同一にしてＧＵＳ活性を測定した。前記液体培養を３０℃で６０時間行ったときのＧＵＳ活性（Ｕ／ｍｇ）を図６に示す。

図６から、グルコースを基質として前記液体培養を３０℃で６０時間行ったときに、人工転写因子遺伝子を導入せず、シスエレメントを全く連結しなかった比較例２のＧＵＳ生産株のＧＵＳ活性（Ｕ／ｍｇ）を１とすると、実施例２のＧＵＳ生産株では１３．５倍のＧＵＳ活性を得ることができることが明らかである。

１…タンパク質発現用塩基配列、２…タンパク質、３…遺伝子、４…プロモーター、５…シスエレメント、６…人工転写因子。

Claims

タンパク質をコードする遺伝子と、該遺伝子の上流側に連結された該遺伝子のプロモーターと、該プロモーターのさらに上流側に連結されたシスエレメントとからなるタンパク質発現用塩基配列であって、
人工転写因子により活性が向上される該シスエレメントが配列番号１で示されることを特徴とするタンパク質発現用塩基配列。
請求項１記載のタンパク質発現用塩基配列において、前記人工転写因子は、転写因子ＫｏｊＲの上流側１〜１１８ａａの塩基配列からなるＤＮＡ結合ドメインと、転写因子ＡｍｙＲの下流側１１３〜６０４ａａの塩基配列からなる活性ドメインとからなり、該ＤＮＡ結合ドメインの下流側に該活性ドメインが連結され、配列番号２で示されることを特徴とするタンパク質発現用塩基配列。
請求項２記載のタンパク質発現用塩基配列において、前記人工転写因子をコードする遺伝子と、該遺伝子の上流側に連結された該遺伝子のプロモーターとからなる人工転写因子発現用塩基配列を備えることを特徴とするタンパク質発現用塩基配列。
請求項１〜請求項３のいずれか１項記載のタンパク質発現用塩基配列において、前記シスエレメントは、前記タンパク質をコードする遺伝子のプロモーターの上流側に１〜１０個の範囲の数が連結されることを特徴とするタンパク質発現用塩基配列。
請求項１〜請求項４のいずれか１項記載のタンパク質発現用塩基配列を含むことを特徴とする発現ベクター。
請求項１〜請求項４のいずれか１項記載のタンパク質発現用塩基配列を含むことを特徴とする形質転換体。
請求項６記載の形質転換体において、麹菌を宿主細胞とすることを特徴とする形質転換体。
請求項７記載の形質転換体において、前記麹菌は、アスペルギルス・オリゼＨＯ２株（受託番号：ＮＩＴＥＢＰ−０１７５０）であることを特徴とする形質転換体。
請求項１〜請求項４のいずれか１項記載のタンパク質発現用塩基配列を含む形質転換体を培養し、培養後の培地又は該形質転換体内から、該タンパク質発現用塩基配列により発現亢進される遺伝子によりコードされるタンパク質を回収することを特徴とするタンパク質の製造方法。