JP2017023139A - タンパク質発現用塩基配列及びそれを用いるタンパク質の製造方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】図1において、タンパク質発現用塩基配列1は、タンパク質2をコードする遺伝子3と、遺伝子3の上流側に連結された遺伝子3のプロモーター4と、プロモーター4のさらに上流側に連結され人工転写因子6により活性が向上されるシスエレメント5とからなる。シスエレメント5は、アスペルギルス・オリゼのゲノムDNA遺伝子を鋳型にして作成した特定の塩基配列で示される。
【選択図】図1
Description
〔人工転写因子遺伝子導入形質転換体の構築〕
本実施例では、まず、アスペルギルス・オリゼHO2株(独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター、千葉県木更津市かずさ鎌足2−5−8 122号室、寄託日:平成25年11月12日、受託番号:NITE BP−01750)のゲノムDNA遺伝子を鋳型に、プライマー1、2にてtppA遺伝子の上流配列、プライマー3、4にて下流配列、プライマー5、6にてtef1プロモーター遺伝子、プライマー7、8にてagdAターミネーター遺伝子、プライマー9、10にてマーカーリサイクリング用の遺伝子断片、アスペルギルス・アワモリHA1株(独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター、千葉県木更津市かずさ鎌足2−5−8 122号室、寄託日:平成25年11月12日、受託番号:NITE BP−01751)のゲノムDNA遺伝子を鋳型に、プライマー11、12にてpyrG遺伝子発現用遺伝子カセットを、それぞれDNAポリメラーゼ(東洋紡績株式会社製、商品名:KOD FX neo)にてPCR増幅し、精製キット(QIAGEN社製、商品名:QIAquick PCR purification kit)にて精製して、計6つの遺伝子断片を取得した。
まず、配列番号1のシスエレメントを4個タンデムに連結し、その5´側に制限酵素サイトSphI、BamHIサイトを、3´側にBglII、NcoIサイトを付加した第1の遺伝子断片をオリゴ合成により作製した。
を含むプラスミドpPEA2を制限酵素SphI、NcoIで処理して断片化し、ライゲーション反応した後、E.coliに形質転換し、プラスミドpEA4Kを構築した。
前記シスエレメントが8個タンデムに連結されたGUS生産株を、CDプレート培地にて1週間培養して胞子を形成させ、該胞子を0.01%POLYSORBATE20(和光純薬工業株式会社製)を用いて回収し、胞子懸濁液を取得した。
NaH2PO4・2H2O(MW=156.01)(pH7)
1.56g(50mM)
0.5M EDTA 4mL (10mM)
非イオン性界面活性剤(シグマアルドリッチ社製、商品名:TritonX-100)
0.2g (0.1%)
N−ラウリルサルコシン酸Na 0.2g (0.1%)
β−メルカプトエタノール(MW=78.13) 142μL(10mM)
蒸留水 200mL
次に、前記抽出液を、次の組成のGUS活性測定用バッファーに加え、37℃で15分間反応させた後、波長415nmで吸光度を測定し活性値(U)を算出した。1Uは、37℃において1分間にPNP−Glucuronide(プリンヌクレオシドホスホリラーゼ−グルクロン酸包合物)から1mMのPNPを生成するのに必要な酵素量である。
NaH2PO4・2H2O(MW=156.01)(pH7)
1.56g(50mM)
β−メルカプトエタノール(MW=78.13) 142μL(10mM)
非イオン性界面活性剤(シグマアルドリッチ社製、商品名:TritonX-100)
0.2g (0.1%)
p−ニトロフェニル β−D−グルクロン酸包合物(MW=315.23)
63mg (1mM)
蒸留水 200mL
次に、プロテインアッセイCBB溶液(ナカライタスク株式会社製)を用いて、前記抽出液に含まれるタンパク質量を測定し、前記活性値をタンパク質量で除して、GUS活性(U/mg)を算出した。結果をGUS活性の相対値として、図4に示す。
本比較例では、人工転写因子遺伝子を導入せず、シスエレメントを全く連結しなかった以外は、実施例1と全く同一にして、GUS生産株を構築した。
本実施例では、200mL三角フラスコにPG培地(2質量/容量%グルコース、1質量/容量%ポリペプトン、0.1質量/容量%カザミノ酸、0.5質量/容量%リン酸2水素カリウム、0.05質量/容量%硫酸マグネシウム、0.1質量/容量%硝酸ナトリウム)50mLを取り、これに前記実施例1で得られた前記シスエレメントが8個タンデムに連結されたGUS生産株の胞子を、最終胞子濃度が1×105/mLとなるように植菌し、30℃で60時間液体培養した以外は、実施例1と全く同一にしてGUS活性(U/mg)を算出した。結果を図6に示す。
本比較例では、比較例1で得られたGUS生産株を用いた以外は、実施例2と全く同一にしてGUS活性を測定した。前記液体培養を30℃で60時間行ったときのGUS活性(U/mg)を図6に示す。
〔人工転写因子遺伝子導入形質転換体の構築〕
本実施例では、まず、アスペルギルス・オリゼHO4株(独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター、千葉県木更津市かずさ鎌足2−5−8 122号室、寄託日:平成26年12月9日、受託番号:NITE BP−01980)のゲノムDNA遺伝子を鋳型に、プライマー29、30にてligD遺伝子の上流配列、プライマー31、32にて下流配列、プライマー33、34にてマーカーリサイクリング用配列、プライマー35、36にてpyrG遺伝子を、それぞれDNAポリメラーゼ(東洋紡績株式会社製、商品名:KOD FX neo)にてPCR増幅し、精製キット(QIAGEN社製、商品名:QIAquick PCR purification kit)にて精製して、計4つの遺伝子断片を取得した。
まず、アスペルギルス・オリゼHO4株(独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター、千葉県木更津市かずさ鎌足2−5−8 122号室、寄託日:平成26年12月9日、受託番号:NITE BP−01980)のゲノムDNA遺伝子を鋳型に、プライマー41、42にてpyrG遺伝子の上流配列、プライマー43、44にて下流配列を、実施例1で得られたシスエレメントが連結されたGUS(β−グルクロニダーゼ)生産カセット遺伝子断片を鋳型に、プライマー45、46にてシスエレメントが連結されたプロモーター遺伝子、プライマー47、48にてagdAターミネーター遺伝子を、アクレモニウム・セルロリィティカスH1株(独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター、千葉県木更津市かずさ鎌足2−5−8 122号室、寄託日:平成23年9月5日、受託番号:FERM BP−11508)のゲノムDNA遺伝子を鋳型に、プライマー49、50にてセロビオハイドロラーゼ(cbh1)遺伝子を、アスペルギルス・アワモリHA1株(独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター、千葉県木更津市かずさ鎌足2−5−8 122号室、寄託日:平成25年11月12日、受託番号:NITE BP−01751)のゲノムDNA遺伝子を鋳型に、プライマー51、52にてpyrG遺伝子発現用遺伝子カセットを、それぞれ前記DNAポリメラーゼにてPCR増幅し、前記精製キットにて精製して、計6つの遺伝子断片を取得した。
CBH1生産株による酵素(セロビオハイドロラーゼ)生産量を測定するために、まず、前記シスエレメントが8個タンデムに連結されたCBH1生産株を、CDプレート培地にて1週間培養して胞子を形成させ、該胞子を0.01%POLYSORBATE20(和光純薬工業株式会社製)を用いて回収し、胞子懸濁液を取得した。
本比較例では、人工転写因子遺伝子を導入せず、シスエレメントを全く連結しなかった以外は、実施例3と全く同一にして、CBH1生産株を構築した。
Claims (15)
- タンパク質をコードする遺伝子と、該遺伝子の上流側に連結された該遺伝子のプロモーターと、該プロモーターのさらに上流側に連結され人工転写因子により活性が向上されるシスエレメントとからなり、該シスエレメントが配列番号1で示されるタンパク質発現用塩基配列であって、
該人工転写因子は、転写因子KojRの上流側1〜118aaの塩基配列からなるDNA結合ドメインと、転写因子AmyRの下流側150〜604aaの塩基配列からなる活性ドメインとからなり、該DNA結合ドメインの下流側に該活性ドメインが連結され、配列番号2で示されることを特徴とするタンパク質発現用塩基配列。 - 請求項1記載のタンパク質発現用塩基配列において、前記人工転写因子をコードする遺伝子と、該遺伝子の上流側に連結された該遺伝子のプロモーターとからなる人工転写因子発現用塩基配列を備えることを特徴とするタンパク質発現用塩基配列。
- 請求項1記載のタンパク質発現用塩基配列において、前記タンパク質をコードする遺伝子のプロモーターの上流側に1〜10個の範囲の数の前記シスエレメントが連結されることを特徴とするタンパク質発現用塩基配列。
- タンパク質をコードする遺伝子と、該遺伝子の上流側に連結された該遺伝子のプロモーターと、該プロモーターのさらに上流側に連結され人工転写因子により活性が向上されるシスエレメントとからなり、該シスエレメントが配列番号1で示されるタンパク質発現用塩基配列を含む発現ベクターであって、
該人工転写因子は、転写因子KojRの上流側1〜118aaの塩基配列からなるDNA結合ドメインと、転写因子AmyRの下流側150〜604aaの塩基配列からなる活性ドメインとからなり、該DNA結合ドメインの下流側に該活性ドメインが連結され、配列番号2で示されることを特徴とする発現ベクター。 - 請求項4記載の発現ベクターにおいて、前記タンパク質発現用塩基配列は、前記人工転写因子をコードする遺伝子と、該遺伝子の上流側に連結された該遺伝子のプロモーターとからなる人工転写因子発現用塩基配列を備えることを特徴とする発現ベクター。
- 請求項4記載の発現ベクターにおいて、前記タンパク質発現用塩基配列は、前記タンパク質をコードする遺伝子のプロモーターの上流側に1〜10個の範囲の数の前記シスエレメントが連結されることを特徴とする発現ベクター。
- タンパク質をコードする遺伝子と、該遺伝子の上流側に連結された該遺伝子のプロモーターと、該プロモーターのさらに上流側に連結され人工転写因子により活性が向上されるシスエレメントとからなり、該シスエレメントが配列番号1で示されるタンパク質発現用塩基配列を含む形質転換体であって、
該人工転写因子は、転写因子KojRの上流側1〜118aaの塩基配列からなるDNA結合ドメインと、転写因子AmyRの下流側150〜604aaの塩基配列からなる活性ドメインとからなり、該DNA結合ドメインの下流側に該活性ドメインが連結され、配列番号2で示されることを特徴とする形質転換体。 - 請求項7記載の形質転換体において、前記タンパク質発現用塩基配列は、前記人工転写因子をコードする遺伝子と、該遺伝子の上流側に連結された該遺伝子のプロモーターとからなる人工転写因子発現用塩基配列を備えることを特徴とする形質転換体。
- 請求項7記載の形質転換体において、前記タンパク質発現用塩基配列は、前記タンパク質をコードする遺伝子のプロモーターの上流側に1〜10個の範囲の数の前記シスエレメントが連結されることを特徴とする形質転換体。
- 請求項7記載の形質転換体において、麹菌を宿主細胞とすることを特徴とする形質転換体。
- 請求項10記載の形質転換体において、前記麹菌は、アスペルギルス・オリゼHO2株(独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター、千葉県木更津市かずさ鎌足2−5−8 122号室、寄託日:平成25年11月12日、受託番号:NITE BP−01750)であることを特徴とする形質転換体。
- 請求項10記載の形質転換体において、前記麹菌は、アスペルギルス・オリゼHO4株(独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター、千葉県木更津市かずさ鎌足2−5−8 122号室、寄託日:平成26年12月9日、受託番号:NITE BP−01980)であることを特徴とする形質転換体。
- タンパク質をコードする遺伝子と、該遺伝子の上流側に連結された該遺伝子のプロモーターと、該プロモーターのさらに上流側に連結され人工転写因子により活性が向上されるシスエレメントとからなり、該シスエレメントが配列番号1で示されるタンパク質発現用塩基配列を含む形質転換体を培養し、培養後の培地又は該形質転換体内から、該タンパク質発現用塩基配列により発現亢進される遺伝子によりコードされるタンパク質を回収するタンパク質の製造方法であって、
該人工転写因子は、転写因子KojRの上流側1〜118aaの塩基配列からなるDNA結合ドメインと、転写因子AmyRの下流側150〜604aaの塩基配列からなる活性ドメインとからなり、該DNA結合ドメインの下流側に該活性ドメインが連結され、配列番号2で示されることを特徴とするタンパク質の製造方法。 - 請求項13記載のタンパク質の製造方法において、前記タンパク質発現用塩基配列は、前記人工転写因子をコードする遺伝子と、該遺伝子の上流側に連結された該遺伝子のプロモーターとからなる人工転写因子発現用塩基配列を備えることを特徴とするタンパク質の製造方法。
- 請求項13記載のタンパク質の製造方法において、前記タンパク質発現用塩基配列は、前記タンパク質をコードする遺伝子のプロモーターの上流側に1〜10個の範囲の数の前記シスエレメントが連結されることを特徴とするタンパク質の製造方法。
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