JP2010183885A - タンパク質の製造方法およびそれに用いる発現ベクター - Google Patents
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Abstract
【解決手段】 本発明のタンパク質製造方法は、前記目的タンパク質をコードする核酸に、シグナルペプチドをコードする核酸を2つ以上付加した核酸を宿主細胞に導入し、前記宿主細胞を培養することにより、前記目的タンパク質を培養液中に分泌させる目的タンパク質の製造方法である。
【選択図】 図4
Description
本発明の製造方法は、前述のように、目的タンパク質をコードする核酸が導入された宿主を培養して、前記目的タンパク質を培養液中に分泌させる目的タンパク質の製造方法であって、前記目的タンパク質をコードする核酸に、シグナルペプチドをコードする核酸が2つ以上付加されていることを特徴とする。本発明において、以下、目的タンパク質をコードする核酸を「タンパク質遺伝子」、シグナルペプチドをコードする核酸を「シグナルペプチド遺伝子」とも言う。本発明において、前記核酸は、例えば、DNA、RNAがあげられ、この他に、例えば、PNA等の人工核酸であってもよい。
トリアシルグリセロールリパーゼシグナルペプチド
5'−ATGCATCTTGCTATCAAGTCTCTCTTTGTCTCTCTCCTCGGAGCCAGCGTTCTCGCAAGCCCTCTTCCCAGCAATGCTCTGGTTGAGAGA−3'(配列番号1)
MHLAIKSLFVSLLGASVLASPLPSNALVER(配列番号2)
グルコアミラーゼAシグナルペプチド
5'−ATGGTGTCTTTCTCCTCTTGTCTCCGGGCCTTAGCCCTCGGATCCTCAGTTCTCGCGGTCCAACCTGTCCTTAGA−3'(配列番号3)
MVSFSSCLRALALGSSVLAVQPVLR(配列番号4)
グルコアミラーゼBシグナルペプチド
5'−ATGCGGAACAACCTTCTTTTTTCCCTCAATGCCATTGCTGGCGCTGTCGCGCATCCGTCCTTCCCTATCCATAAGAGG−3'(配列番号5)
MRNNLLFSLNAIAGAVAHPSFPIHKR(配列番号6)
Taka−アミラーゼAシグナルペプチド
5'−ATGATGGTCGCGTGGTGGTCTCTATTTCTGTACGGCCTTCAGGTCGCGGCACCTGCTTTGGCT−3'(配列番号7)
MMVAWWSLFLYGLQVAAPALA(配列番号8)
本発明の発現ベクターは、前述のように、本発明の目的タンパク質の製造方法に使用する発現ベクターであって、目的タンパク質をコードする核酸を挿入可能な挿入領域と、シグナルペプチドをコードする核酸が2つ以上付加されたシグナルペプチドコード領域とを有することを特徴とする。本発明の発現ベクターは、前記挿入領域と前記シグナルペプチドコード領域とを有していればよく、その他の構成等は、何ら制限されない。前記発現ベクターは、例えば、従来公知のベクターに、前記シグナルペプチド遺伝子を挿入することで製造できる。前記シグナルペプチド遺伝子を導入する前記ベクターは、特に限定されず、例えば、前記発現ベクターを導入する宿主の種類、導入方法等に応じて適宜決定できる。なお、本発明の発現ベクターは、前記挿入領域と前記シグナルペプチド領域とを有する以外は、特に示さない限り、前述の発現ベクターと同様である。
非分泌タンパク質であるEGFPタンパク質の遺伝子にシグナルペプチド遺伝子を付加し、Aspergillus oryzaeに導入して、発現した前記EGFPタンパク質の局在を確認した。
まず、EGFPタンパク質を発現する発現ベクターpISI−EGFPを作製した(Appl. Microbiol. Biotechnol. 81, 711−719, (2008).)。この発現ベクターの構造の概略を図1に示す。他方、Aspergillus oryzaeのゲノムDNAから、PCR法により、トリアシルグリセロールリパーゼのシグナルペプチド遺伝子(stglA)、グルコアミラーゼAのシグナルペプチド遺伝子(sglaA)、グルコアミラーゼBのシグナルペプチド遺伝子(sglaB)およびTaka−アミラーゼAのシグナルペプチド遺伝子(sTAA)を増幅させた。この際、5’末端にAscI認識配列を、3’末端にSalI認識配列を付加した。そして、前記pISI−EGFPのsodMプロモーター下流のss−N28部分を制限酵素AscIおよびSalIで除去し、そこに、制限酵素AscIおよびSalIで処理した前記sglaA、sglaB、sTAAまたはstglAのDNA断片を挿入した。このようにして得られた発現ベクターを、それぞれ、pISI−sglaA−EGFP、pISI−sglaB−EGFP、pISI−sTAA−EGFPおよびpISI−stglA−EGFPとした。
pISI−stglA−EGFP
5'−GGCGCGCCCATGCATCTTGCTATCAAGTCTCTCTTTGTCTCTCTCCTCGGAGCCAGCGTTCTCGCAAGCCCTCTTCCCAGCAATGCTCTGGTTGAGAGAGTCGAC−3'(配列番号9)
MHLAIKSLFVSLLGASVLASPLPSNALVERVD(配列番号10)
pISI−sglaA−EGFP
5'−GGCGCGCCCATGGTGTCTTTCTCCTCTTGTCTCCGGGCCTTAGCCCTCGGATCCTCAGTTCTCGCGGTCCAACCTGTCCTTAGAGTCGAC−3'(配列番号11)
MVSFSSCLRALALGSSVLAVQPVLRVD(配列番号12)
pISI−sglaB−EGFP
5'−GGCGCGCCCATGCGGAACAACCTTCTTTTTTCCCTCAATGCCATTGCTGGCGCTGTCGCGCATCCGTCCTTCCCTATCCATAAGAGGGTCGAC−3'(配列番号13)
MRNNLLFSLNAIAGAVAHPSFPIHKRVD(配列番号14)
pISI−sTAA−EGFP
5'−GGCGCGCCCATGATGGTCGCGTGGTGGTCTCTATTTCTGTACGGCCTTCAGGTCGCGGCACCTGCTTTGGCTGTCGAC−3'(配列番号15)
MMVAWWSLFLYGLQVAAPALAVD(配列番号16)
pISI−2stglA−EGFP
5'−GGCGCGCCCATGCATCTTGCTATCAAGTCTCTCTTTGTCTCTCTCCTCGGAGCCAGCGTTCTCGCAAGCCCTCTTCCCAGCAATGCTCTGGTTGAGAGAATGCATCTTGCTATCAAGTCTCTCTTTGTCTCTCTCCTCGGAGCCAGCGTTCTCGCAAGCCCTCTTCCCAGCAATGCTCTGGTTGAGAGAGTCGAC−3'(配列番号17)
MHLAIKSLFVSLLGASVLASPLPSNALVERMHLAIKSLFVSLLGASVLASPLPSNALVERVD(配列番号18)
pISI−2sTAA−EGFP
5'−GGCGCGCCCATGATGGTCGCGTGGTGGTCTCTATTTCTGTACGGCCTTCAGGTCGCGGCACCTGCTTTGGCTATGATGGTCGCGTGGTGGTCTCTATTTCTGTACGGCCTTCAGGTCGCGGCACCTGCTTTGGCTGTCGAC−3'(配列番号19)
MMVAWWSLFLYGLQVAAPALAMMVAWWSLFLYGLQVAAPALAVD(配列番号20)
宿主株は、niaD欠損のAspergillus oryzae IF4 niaD−株を使用し、培地は、下記組成のCzapek−Dox(CD)培地(pH5.5)を使用した。なお、発現ベクター未導入の宿主は、N源としてNaNO2を含むCD培地を使用し、発現ベクター導入後の宿主は、N源としてNaNO3を含むCD培地を使用した。
2% グルコース
0.2% N源(NaNO2またはNaNO3)
0.1% KH2PO4
0.05% MgSO4・7H2O
0.2% KCl
0.8mol/L NaCl
適量 微量元素
合計 100mL
3% グルコース
0.5% pepton
0.5% 酵母抽出物
0.1% KH2PO4
0.05% MgSO4・7H2O
0.2% KCl
合計 100mL
各形質転換体の培養上清をそれぞれ回収し、EGFPタンパク質の量を下記ウエスタンブロッティングにより定量した。また、コントロールとして、シグナルペプチドを有さないEGFPタンパク質を発現するpISI−EGFPを導入したAspergillus oryzae IF4 niaD−株(以下、pISI−EGFP株という)についても、同様にウエスタンブロッティングを行った。
各形質転換体の培養上清をそれぞれ回収し、EGFPタンパク質の量を蛍光強度測定により定量した。また、コントロールとして、pISI−EGFP株の培養上清を用いて同様に蛍光強度測定を行った。具体的には培養開始から所定時間(0、2、4、6、8、10日)経過後に、培養上清を回収し、マイクロプレートリーダー(Perkin Elmer社)を用いて、前記培養上清50μlの蛍光強度を測定した。
Claims (20)
- 目的タンパク質をコードする核酸が導入された宿主を培養して、前記目的タンパク質を培養液中に分泌させる目的タンパク質の製造方法であって、
前記目的タンパク質をコードする核酸に、シグナルペプチドをコードする核酸が2つ以上付加されていることを特徴とする製造方法。 - 前記目的タンパク質をコードする核酸に、前記シグナルペプチドをコードする核酸が2つ付加されている、請求項1記載の製造方法。
- 前記目的タンパク質をコードする核酸の5’末端に、前記シグナルペプチドをコードする核酸が2つ以上付加されている、請求項1または2記載の製造方法。
- 前記宿主と、前記シグナルペプチドの由来とが同一である、請求項1から3のいずれか一項に記載の製造方法。
- 前記宿主が、Aspergillus属である、請求項1から4のいずれか一項に記載の製造方法。
- 前記宿主が、Aspergillus oryzaeである、請求項5記載の製造方法。
- 前記シグナルペプチドの由来が、Aspergillus属である、請求項1から6のいずれか一項に記載の製造方法。
- 前記シグナルペプチドの由来が、Aspergillus oryzaeである、請求項7記載の製造方法。
- 前記シグナルペプチドが、トリアシルグリセロールリパーゼ、グルコアミラーゼA、グルコアミラーゼBおよびTaka−アミラーゼAからなる群から選択された少なくとも一つのシグナルペプチドである、請求項1から8のいずれか一項に記載の製造方法。
- 前記シグナルペプチドをコードする核酸が、配列番号1、3、5および7で表される塩基配列からなる群から選択された少なくとも一つの塩基配列からなるポリヌクレオチドである、請求項1から9のいずれか一項に記載の製造方法。
- 前記目的タンパク質をコードする核酸に前記シグナルペプチドをコードする核酸が2つ以上付加された発現ベクターを、宿主に導入する工程と、
前記発現ベクターが導入された宿主を培養する工程とを含む、請求項1から10のいずれか一項に記載の製造方法。 - さらに、培養液の上清を回収する工程を含む、請求項1から11のいずれか一項に記載の製造方法。
- 請求項1から12のいずれか一項に記載の目的タンパク質の製造方法に使用する発現ベクターであって、
目的タンパク質をコードする核酸を挿入可能な挿入領域と、
シグナルペプチドをコードする核酸が2つ以上付加されたシグナルペプチドコード領域とを有することを特徴とする発現ベクター。 - 前記シグナルペプチドコード領域において、前記シグナルペプチドをコードする核酸が2つ付加されている、請求項13記載の発現ベクター。
- 前記シグナルペプチドコード領域の下流に、前記挿入部位が配置されている、請求項13または14記載の発現ベクター。
- 前記シグナルペプチドの由来が、前記発現ベクターを導入する宿主と同一である、請求項13から15のいずれか一項に記載の発現ベクター。
- 前記シグナルペプチドの由来が、Aspergillus属である、請求項13から16のいずれか一項に記載の発現ベクター。
- 前記シグナルペプチドの由来が、Aspergillus oryzaeである、請求項17記載の発現ベクター。
- 前記シグナルペプチドが、トリアシルグリセロールリパーゼ、グルコアミラーゼA、グルコアミラーゼBおよびTaka−アミラーゼAからなる群から選択された少なくとも一つのシグナルペプチドである、請求項13から18のいずれか一項に記載の発現ベクター。
- 前記シグナルペプチドをコードする核酸が、配列番号1、3、5および7で表される塩基配列からなる群から選択された少なくとも一つの塩基配列からなるポリヌクレオチドである、請求項13から19のいずれか一項に記載の発現ベクター。
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