KR20010083655A - 대장균을 이용한 삼일열 말라리아 원충의 표면 단백질의제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 대장균을 이용한 삼일열 말라리아 원충(Plasmodium vivax) 표면 단백질의 제조방법에 관한 것으로, 구체적으로 삼일열 말라리아 원충의 표면 단백질 중 상기 원충의 아종 사이에서 아미노산 서열이 100% 일치하는 표면 단백질인 MSP(Merozoit Surface protein)의 C-말단 부위 PV200C 폴리펩타이드를 히스티딘(Histidine) 표지가 결합된 상태로 발현하는 재조합 벡터 및 이를 대장균에 형질전환시킨 형질전환체를 이용하여 상기의 말라리아 표면 단백질 PV200C의 폴리펩타이드를 발현시키고, 히스티딘 친화 칼럼 및 젤 여과 크로마토그래피를 이용하여 말라리아 표면 단백질 PV200C 폴리펩타이드를 분리 정제하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 의해 대장균에서 제조된 말라리아 표면 단백질 PV200C 폴리펩타이드는 순도가 높으며, 대량으로 얻을 수 있을 뿐만 아니라, 항체에 대한 민감도 및 특이성이 높아 위반응의 확률이 현저히 적으므로 한국형 말라리아 진단에 효율적으로 사용할 수 있다.

Description

대장균을 이용한 삼일열 말라리아 원충의 표면 단백질의 제조방법{Method for producing the recombinant malaria surface protein from E. coli}

본 발명은 말라리아 원충의 메로조이트 표면 단백질(Merozoit surface protein; 이하 'MSP'라 약칭함)의 제조방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 PV200C 유전자, 히스티딘(Histidine) 표지 및 T7 프로모터를 포함하는 발현 벡터; 상기 발현 벡터로 형질전환된 형질전환체 및 상기 발현 벡터를 이용하여 말라리아 항원을 얻는 방법에 관한 것이다.

말라리아는 모기를 매개로 하여 발생하는 질병으로 원인균인 말라리아 원충이 적혈구내에 감염되어 발생한다. 현재 전세계 인구 중 1/6(약 10억명)이 말라리아 감염 가능지역에 거주하고 있으며, 매년 5억명 이상이 말라리아에 감염되고 그 중 2 백명 이상이 목숨을 잃는다. 1960년대 이후로는 효과적인 방제로 인하여 그 발생율이 꾸준히 감소되어 왔으며 일부 지역에서는 소멸되기도 하였으나, 최근 엘리뇨 현상 등의 이상 기온 현상, 약제 내성 균주의 증가 및 살충제에 대한 저항성 증가 등의 요인으로 인해 전세계적으로 다시 확산되고 있는 추세이다.

말라리아는 원충의 지리적 분포의 차이, 종적 특성, 유전적 성향에 따라 크게 중남미를 중심으로한 아메리카형, 아프리카형, 그리고 인도와 동남아시아를 중심으로 한 아시아형으로 나뉘며, 현재까지 플라스모디움 비박스(Plasmodiumvivax), 플라스모디움 팔시파룸(Plasmodium falciparum), 플라스모디움 말라리애(Plasmodium malariae), 플라스모디움 오바레(Plasmodium ovale)의 4종류가 알려져 있다.

상기 원충이 모기로부터 사람의 적혈구로 이동함으로써 말라리아가 발생하게 되며 말라리아 원충의 생활사는 사람에서의 분열생식기(Schizogony)와 모기에서의 포자기(Sporogony)로 나누어지는데, 처음 모기가 사람을 물면 원충이 혈관을 따라 간으로 이동하여 간세포에서 증식을 하거나, 휴면상태로 존재하다가 일정한 기간이 지나면 혈중으로 나와 본격적인 증식을 한다. 혈중에서는 적혈구를 숙주 세포로 하여 영양체인 고리형에서 증식형을 거쳐 분열체를 생성하며, 생성된 분열체가 수십개의 분열소체를 방출하면 각각 다시 다른 적혈구에 침입하여 같은 생활사를 반복하게 된다. 이중 일부가 생식모세포형태로 존재하게 되는데 모기가 이런 상태의 사람을 흡혈하면 생식모세포가 모기로 유입되어 증식되고 모기의 위와 침샘에 포자상태로 존재하다가 다시 모기에 의해 사람에게 감염되는 과정을 반복하게 된다.

한국에서 발생하는 말라리아는 상기 4종의 말라리아 원충 중 플라스모디움 비박스에 의해 감염이 되는데(Chom. S. Y. 등,Korean J. Parasit.32(4), 281-284) 오랜 잠복기를 거치고, 혈액내 원충수가 적은수로 존재하므로 진단이 매우 어려운 유형이다. 1970년대 이후 거의 박멸되었던 한국형 말라리아는 1993년 이후 급속히 확산되어 1998년에는 3800명에 이르는 환자가 발생된 것으로 보고되었다. 이러한, 말라리아의 증가 추세에도 불구하고 그에 따른 진단 방법이나 진단 시약의국내 자체 개발은 아직 미미한 수준으로, 수입진단 시약에 의존하고 있는데 수입진단 시약은 말라리아의 젖산 환원효소(Lactate dehydrogenase) 등의 항원을 검출하는 방식으로 진단하는 것이므로, 항원 생성이 적은 한국형 말라리아에 대해 민감도가 50% 수준에 머물고 있는 실정이므로 한국형 말라리아를 진단할 수 있는 진단 시약의 자체 개발에 대한 요구가 증가되고 있다.

말라리아의 진단 방법으로는 현미경으로 말라리아에 감염되어 염색된 혈구를 관찰하는 혈액 도말법이 가장 많이 사용되고 있으나, 이 방법은 시간이 많이 소요될 뿐 아니라, 감염된 혈구를 판별해내기 위하여 검사자의 전문 교육이 요구되는 단점이 있다. 최근에는 이러한 문제점을 해결하기 위해, 말라리아의 항원을 검출하는 시약이 시판되고 있으나, 이들 시약들 역시 민감도가 낮기 때문에 상기 혈액 도말법과 동시에 사용하도록 권고되고 있다. 또 다른 진단 방법으로서 말라리아 원충의 유전자를 검사하는 PCR 방법은 민감도는 높지만 과정상의 어려움으로 아직 실용화되지 못하고 실험실에서만 행하여지고 있는 실정이다. 이와 같은 종래의 진단 방법은 특히 플라스모디움 비박스에 의해 감염되어 잠복기가 길고 혈액 내 원충수가 적은 한국형 말라리아를 진단하는데는 더욱 어려움이 있었다.

이에 상기한 문제점을 극복하기 위하여 본 발명자들은 삼일열 말라리아 원충인 플라스모디움 비박스의 특이한 MSP의 C-말단을 항원으로 이용하여 환자의 혈액 내에 존재하는 항체를 측정하여 말라리아를 진단하는 방법을 개발하였다.

MSP는 말라리아 원충 플라스모디움 비박스의 표면에 특이적으로 존재하는 표면 단백질로서 특히 MSP의 C-말단 부위를 코딩하는 PV200C 폴리펩타이드는 108개 아미노산으로 구성되며, 그 서열은 플라스모디움 비박스 원충들의 아종 사이에서 100 %의 상동성을 보이는 것으로 알려져 있어서, PV200C 폴리펩타이드를 말라리아 진단을 위한 목적 항원 단백질로 사용할 경우 한국형 삼일열 말라리아를 진단하는데 매우 유용하다.

현재 말라리아 항원 자체의 발현에 관한 연구는 많이 이루어지지 않은 상태이며, 일반적인 항원 단백질을 코딩하는 유전자를 과발현시켜 단백질을 얻는 방법이 많이 연구되었는데, 제조된 대부분의 항원들은 혈액응고인자 Xa(Ellinger 등,Virol.180, 81, 1991)나 스타필로코커스의 단백질 A (Marczinovits 등,J. Biochem.31, 225, 1993), 갈락토시다아제(galactosidase) 등의 단백질에 융합시켜 발현한 것이었다. 그 결과 발현양은 증가하였으나 융합 파트너로 쓰인 단백질이 비감염자를 환자로 오진하게 하는 위양성(pseudo-positive signal) 반응을 일으키는 문제점이 발견되었으며, 이에 융합단백질을 절단하여 이러한 문제점을 제거하려는 시도가 있었으나(Chang 등,Biotechnology3, 985-990, 1985; Ellinger 등,Virology,180, 811-813, 1991), 복잡한 절단 및 정제 과정으로 인하여 수율이 감소하고 제조 원가가 상승되었을 뿐만 아니라 추가적인 위양성율 감소에 있어서도 효과적이지 못하였다.

이에 본 발명자는 상기와 같은 문제를 해결하기 위하여 한국형 말라리아 원충인 플라스모디움 비박스의 MSP C-말단 폴리펩타이드 PV200C의 대장균에서의 발현 조건을 최적화 하였으며, 본 발명에 의하여 순도가 높은 항원을 대량으로 얻을 수 있을 뿐만 아니라, 항체에 대한 높은 민감도를 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 한국형 삼일열 말라리아 원충(Plasmodium vivax)의 표면 단백질 유전자를 클로닝한 재조합 발현벡터를 이용하여 대장균에 형질전환시키고, 상기 형질전환된 대장균을 이용하여 항체에 대한 민감도 및 특이성이 높아 위반응의 확률이 현저히 적은 한국형 말라리아 진단용 항원을 대량 생산하는 방법을 제공하는 것이다.

도 1은 대장균에서 말라리아 표면 단백질 MSP의 C-말단 PV200C 폴리펩타이드를 발현하는 발현 벡터 pELK-MSP의 제조 과정을 도시한 것이고,

도 2는 히스티딘 친화 수지를 이용한 PV200C 폴리펩타이드의 정제 결과를 SDS-PAGE(Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel)상에서 전기영동한 결과이고,

M : 크기 마커

레인 1 : 발현을 유도한 세포 배양액

레인 2 : 발현을 유도하지 않은 세포 배양액

레인 3 : 컬럼으로 정제한 단백질

도 3은 PV200C 말라리아 표면 단백질을 말라리아 환자의 항체로 웨스턴 블러팅한 결과이다.

M : 크기 마커

레인 4 : 발현을 유도한 세포 배양액

레인 5 : 정제된 MSP 단백질

상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 삼일열 말라리아 원충(Plasmodium vivax) 표면 단백질 MSP 유전자, 히스티딘 표지 및 T7 프로모터를 포함하는 발현벡터; 상기 발현 벡터로 형질전환된 형질전환체; 상기 형질전환체를 이용하여 표면 항원 단백질 MSP를 제조하는 방법을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 MSP 유전자, 히스티딘 표지 및 T7 프로모터를 포함하는 발현 벡터를 제공한다.

본 발명의 MSP 유전자는 그 유전자의 전부 또는 일부를 이용할 수 있으며, 바람직하기로는 플라스모디움 비박스 원충들의 아종 사이에서 아미노산 서열이 100% 일치하는 표면 단백질 MSP C-말단 부위의서열번호 1로 기재되는 108개 아미노산을 코딩하는 유전자인 PV200C 유전자를 사용하는 것이 바람직하다. 본 발명에서는 바람직한 실시예의 하나로 약 330 bp 크기의 유전자를 사용하였으며, 이는 말라리아 환자의 혈액으로부터 중합효소 연쇄 반응(Polymerase chain reaction; 이하 'PCR'이라 약칭함)을 이용하여 얻는다. 발현 벡터의 외래 유전자 삽입 부위에 삽입되는 유전자의 크기, 염기서열 등은 공지의 기술에 의해 다양하게 변화시킬 수 있음은 당업자에게 명백하다.

상기 PV200C 폴리펩타이드를 대장균으로부터 대량으로 생산할 수 있는 발현 벡터를 얻기 위하여 pET-19b의 T7 프로모터 하류에 PV200C 유전자를 클로닝하여 pELK-MSP를 제작한다(도 1참조). 출발 벡터인 pET-19b에는 lacZ 유전자가 존재하기 때문에, IPTG(Isopropyl thio-β-D-galactoside) 첨가시 IPTG가 발현유도자의 역할을 하여 lacZ의 발현을 유도하므로 결과적으로 T7 프로모터로부터 PV200C의 발현이 유도된다. 또한 상기 발현 벡터에 의해 발현되는 PV200C 폴리펩타이드는 위양성에 영향을 주지않는 10개의 히스티딘 잔기가 N-말단에 융합되어 발현되므로 히스티딘 친화 수지로 손쉽게 정제할 수 있는 특징을 가지고 있다. 상기 재조합 단백질을 대장균에서 발현한 결과 전체단백질의 15 - 20%의 수율이 나타남을 확인하였다.

또한 본 발명은 상기 발현 벡터 pELK-MSP로 형질전환된 대장균을 제공한다.

상기 대장균 균주는 대장균 균주 BL21(DE3)lysS에 상기 발현 벡터 PELK-MSP를 도입하여 제조할 수 있으며, 그 도입 방법은 공지의 기술, 즉 열충격법, 전기천공법 등을 통해 도입할 수 있고, 상기 대장균 균주 BL21(DE3)lysS이외에도 다양한 형질전환용 대장균이 사용될 수 있다. 상기 대장균 균주E. Coli/BL21(DE3)lysS/PELK-MSP

는 1999년 12월 18일자로 생명공학연구소 부설 유전자은행에 기탁되었다(수탁번호 : KCTC 8976P).

또한 본 발명은 상기의 대장균 형질전환체를 이용하여 MSP PV200C 단백질을 대량 발현시켜 정제 분리하는 삼일열 말라리아 항원의 제조방법을 제공한다.

PV200C 단백질의 정제는 히스티딘 친화 크로마토그래피 및 젤 여과 크로마토그래피를 연속하여 사용하는 것이 바람직하다. 상기의 발현 벡터에 의해 발현된 PV200C 폴리펩타이드 표면 단백질은 N-말단에 10개의 히스티딘 잔기가 결합된 형태로 발현되므로, 히스티딘 잔기의 결합에 의해 분리 정제가 용이한 히스티딘 친화 수지를 이용하여 1차 정제한다. 분리된 단백질은 농축시켜 젤여과 크로마토그래피를 연속 수행하여 2차 정제하는데, 상기의 방법에 의해 99% 이상의 순도를 갖는 항원을 얻을 수 있음을 확인하였다.

상기의 정제 방법에 의해 얻어진 PV200C 단백질은 108개 아미노산으로 이루어졌으며 15 KDa의 크기를 가지고, 절단되지 않은 폴리펩타이드를 가졌다. 말라리아 환자의 혈청으로 상기 항원의 항원성 및 민감도를 조사한 결과 말라리아 환자는 PV200C에 대한 항체를 보유할 뿐만 아니라 그 민감도가 매우 높음을 웨스턴 블러팅(Western blotting)으로 확인하였으며, 따라서 진단 시약에 사용 가능함을 알 수 있었다.

이상에서 본 바와 같이 본 발명의 방법에 의하여 제조된 말라리아 표면 단백질 MSP는 순도가 높으며, 항체에 대한 민감도 및 특이성이 높고, 위반응의 확률이 현저히 적어 한국형 말라리아 진단용 말라리아 항원으로 사용이 가능하다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 말라리아 양성 혈액에서의 cDNA 제조

말라리아 양성혈액에서 TRI 시약(Sigma)을 사용하여 시약 제조사가 제시하는 하기의 방법으로 RNA를 정제하였다. 말라리아 양성 혈액 0.1 ㎖에 TRI 시약 TM(Sigma, Cat. No. T9424) 0.1 ㎖을 혼합하고 상온에서 5분간 방치하였다. 이 용액에 BCP 20 ㎕를 혼합하고 상온에서 5분간 방치한 다음, 4℃, 12,000 rpm의 조건에서 15분간 원심분리를 하였다. 원심분리 결과 3개의 층이 형성되었는데 이 중 RNA를 포함하는 최상층의 용액만을 새 튜브로 옮기고, 여기에 이소프로판올(isopropanol) 50 ㎕를 혼합하여 상온에서 5분간 방치하였다. 이 용액을 다시 4 ℃, 12,000 rpm의 조건에서 10분간 원심분리하여 상등액(Supernatant)을 제거하였고, 펠렛(pellet)은 75% 에탄올로 씻은 후 DEPC(Diethyl pyrocarbonate) 처리된 증류수 20 ㎕에 녹여서 사용하였다.

상기에서 정제한 RNA 9 ㎕와 N6 랜덤 프라이머(random primer; Genotech) 1 ㎕를 혼합하여 65℃에서 5분간 반응시키고 얼음으로 옮긴 다음, 반응 용액에 추가적으로 PCR 완충액 4 ㎕, 0.1 M DTT 2 ㎕, 10 mM dNTP 1 ㎕, 역전사 효소(Reverse transcriptase; Gibco) 1 ㎕, 역전사 저해제(RT inhibitor; Promega) 1 ㎕, 탈이온수 1 ㎕를 넣고 42℃에서 1시간 반응하고 이어서 70℃에서 10분간 반응하여 cDNA를 제조하였다.

<실시예 2> PV200C 코딩 유전자를 포함하는 재조합 플라스미드의 제작

실시예 1에서 제조한 cDNA를 주형으로 하고서열번호 2로 기재되는 순방향프라이머와서열번호 3으로 기재되는 역방향 프라이머를 이용하여 PCR을 실시하였다. PCR 반응은 PCR 완충액 5 ㎕, 2.5 mM dNTP 5 ㎕, 순방향 프라이머 1 ㎕, 역방향 프라이머 1 ㎕, cDNA 주형 2 ㎕, 탈이온수 35 ㎕를 혼합하고 94 ℃에서 30초간 반응한 후, 이 용액에 벤트 중합효소(Vent polymerase ; BioLab) 1 ㎕를 넣고 94℃ 30초, 55℃ 30초, 72℃ 30초 반응을 36회 반복 수행하였다.

증폭된 DNA를 주형으로 하고서열번호 3으로 기재되는 순방향 프라이머와서열번호 4로 기재되는 역방향 프라이머를 이용하여 상기와 같은 조건으로 다시 PCR을 수행하였다. 1% 아가로즈 겔(agarose gel)을 이용해 전기영동을 수행한 결과 약 657 bp 크기의 DNA가 증폭되었음을 확인하였다. 증폭된 DNA(이하 'Pv200-ct657'로 명명)와 EcoRV 제한효소로 처리한 pBluscript KS(+) 벡터를 T4 DNA 리가아제(ligase)를 이용하여 접합함으로써 재조합 플라스미드 pBC-Pv200-ct657를 얻었고, 보관을 위해 대장균(E. coliJM 109)에 형질전환시켰다.

<실시예 3> 발현 벡터 pELK-MSP의 제작

실시예 2에서 얻어진 재조합 플라스미드 pBC-pv200-ct657을 주형으로서열번호 5의 염기서열을 갖는 순방향 프라이머와서열번호 6의 염기서열을 갖는 역방향 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였다. 결과물을 아가로즈 겔을 이용하여 전기영동한 결과 약 330 bp의 DNA 절편이 증폭되었음을 확인하였다. 얻어진 DNA 절편을 페놀/클로로포름(phenol/chloroform) 혼합 용액으로 정제하여 순도가 높은 DNA 절편을 얻어, 제한효소 NdeI과 BamHI으로 처리하고, 같은 제한효소로 처리한 pET-19b(Novagen)에 삽입하여 6.0 kb크기의 발현 벡터 pELK-MSP을 얻었다(도 2).

제조된 플라스미드 pELK-MSP는 CaCl2 방법으로 대장균 BL21(DE3)lysS에 형질전환시켰고, 얻어진 형질전환체는 생명공학연구소 내 유전자은행에 1999년 12월 18일자로 기탁하였다(수탁번호 KCTC 8976P).

<실시예 4> 대장균 내에서 PV200C 폴리펩타이드의 대량 생산 및 정제

형질전환체 pELK-MSP/BL21 균주(KCTC 8976P)를 암피실린(100 ㎍/㎖)과 클로람페니콜(50 ㎍/㎖)이 첨가된 LB 배지에서 12시간 동안 배양하였다. 얻어진 배양액 50 ㎖을 다시 LB 배지 1 ℓ에 접종하고 37 ℃에서 2 시간 정도 배양한 다음 흡광도(OD600)가 0.3이 되었을 때 최종농도가 0.2 mM이 되도록 IPTG(Isopropyl β-D-Thiogalactopyranoside)를 첨가하고 7시간 더 배양하였다.

배양 후 원심분리하여 세포만을 분리한 다음 얻어진 세포를 인산완충용액(Phosphate Buffered Saline, PBS) 30 ㎖에 현탁시켜 초음파파쇄기(Sonicator; Branson, Sonifier 450) 를 사용하여 상기 현탁액내의 대장균을 파쇄한 다음 5000 rpm에서 원심분리하였다. 발현된 MSP단백질의 일부는 상등액에, 나머지는 원심분리한 침전물에 각각 존재하므로 상등액과 펠렛을 4M 요소완충액(PBS에 4M urea를 녹인 완충액, pH 7.5)에 완전히 현탁시킨 다음 다시 원심분리하여 상등액 만을 모았다. 과발현된 표면 단백질은 N- 말단에 10개의 히스티딘으로 구성된 His 표지를 갖고 있으므로 정제를 위해 히스티딘 친화 컬럼(Invitrogen)에 흡착시켰다. 흡착되지 않는 불순물은 세척완충액(10 mM imidazol 및 0.1 M NaCl을 PBS에 용해시킨 완충액)으로 반복하여 제거하고, 흡착된 표면 단백질은 용출완충액(1 M imidazol 및 0.1 M NaCl을 PBS에 용해시킨 완충액)으로 탈착시켜 분리하였는데, 도 2에서 보듯이 이 과정에서 거의 90%이상 표면 단백질이 분리되었음을 15% SDS PAGE를 통해 확인할 수 있었다.

분리된 단백질이 포함된 용액을 농축하여 다시 Sephacryl S-200(Pharmacia co., Sweden) 젤여과 크로마토그라피를 수행함으로써 재조합 대장균으로부터 삼일열 말라리아 분열소체의 표면 단백질인 MSP PV200C 폴리펩타이드를 거의 순도 99%로 얻을 수 있음을 확인하였다.

<실시예 5> 대장균에서 정제된 말라리아 표면 단백질의 항원성 검정

말라리아 환자혈청으로 웨스턴 블러팅(Western blotting)을 수행(Towbin 등,Proc. Natl. Acad. Sci.76, 4350-4354, 1979)하여 실시예 4의 과정으로 얻어진 MSP 표면 단백질 PV200C의 항원성을 검정하였다. 15% SDS-PAGE 겔에 실시예 4의 MSP 표면 단백질 PV200C를 웰당 5 ㎍의 농도로 넣어주고 전기영동을 수행하였다. 전기영동이 끝난 겔은 30분 동안 전이완충액(25 mM Tris-HCl, 190 mM glycine (pH 8.3), 20% methanol)에 담그어 둔 후 나이트로셀룰로즈 막으로 단백질을 옮겼다(Hafer Transphor Power Lid, Pharmacia co.). 단백질이 옮겨진 용지를 블로킹 완충액(3% Skim milk/PBS, pH 7.4)으로 상온에서 1시간 블로킹(blocking)하였고 1/100으로 희석한 말라리아 환자 혈청으로 상온에서 1시간 반응시켰다. 반응이 끝난 막을 세척완충액(0.05% Tween /PBS)을 사용하여 5분 간격으로 5회 세척 후 1/2000로 희석된 염소에서 만든 고추냉이 과산화효소(HRP-Peroxidase)가 접합된 2차 항체(Vector Labs., 미국)와 상온에서 1시간 반응시켰다. 다시 나이트로셀룰로즈 막을 세척완충액으로 씻은 후 4-클로로-나프톨(4-chloro-naphthol)과 과산화수소로 발색을 유도하였다.

그 결과 15 kD의 위치에서 MSP PV200C 만이 블러팅 됨을 볼 수 있었으며 이로써 본 발명의 제조방법에 의해 발현 정제된 MSP의 PV200C 폴리펩타이드가 높은 특이성을 가진 항원임을 확인할 수 있었다(도 3).

이상에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 제조방법에 의하면 말라리아 표면 단백질 MSP PV200C의 폴리펩타이드를 종래보다 훨씬 손쉽고 신속하게 대장균에서 정제할 수 있으며 대량으로 얻을 수 있을 뿐만 아니라, 본 발명의 제조방법에 의해 정제된 표면 단백질은 순도가 높으며, 항체에 대한 민감도 및 특이성이 높아 말라리아 진단 시약으로 사용될 수 있다.

Claims (10)

1. 삼일열 말라리아 원충(Plasmodium vivax)의 표면 단백질(Merozoit surface protein, MSP) 유전자, 히스티딘 표지 및 T7 프로모터를 포함하는 발현 벡터.
2. 제 1항에 있어서, MSP 유전자는 그 유전자의 전부 또는 일부를 포함하는 것을 특징으로 하는 발현 벡터.
3. 제 2항에 있어서, 유전자는 MSP 유전자 C-말단 부위의 PV200C 폴리펩타이드 유전자인 것을 특징으로 하는 발현 벡터.
4. 제 3항에 있어서, PV200C 폴리펩타이드는서열번호 1로 기재되는 것을 특징으로 하는 발현 벡터.
5. 제 4항에 있어서,도 1로 기재되는 개열지도를 가지는 pELK-MSP인 것을 특징으로 하는 발현 벡터.
6. 제 5항의 발현 벡터로 형질전환된 대장균 형질전환체(수탁번호: KCTC 8976P).
7. 대장균 형질전환체를 이용한 말라리아 원충 표면 단백질 MSP 제조방법.
8. 제 7항에 있어서,

   ⅰ) 말라리아 원충 표면 단백질 MSP의 발현벡터를 제조하는 단계;

   ⅱ) 상기 발현벡터를 대장균에 형질전환시켜 대장균 형질전환체를 얻는 단계;

   ⅲ) 상기 대장균 형질전환체를 배양하여 표면 단백질을 얻는 단계; 및,

   ⅳ) 상기 표면 단백질을 분리·정제하는 단계로 구성되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
9. 제 8항에 있어서, 단계 ⅳ)는 히스티딘-친화 칼럼 및 젤 여과 크로마토그라피 방법을 이용하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
10. 제 7항의 제조방법에 의해 생산된 말라리아 원충 표면 단백질을 포함하는 말라리아 진단 시약.