JP2014502163A - 高収量の組換えタンパク質発現を得るためのmgmtに基づく方法 - Google Patents
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Abstract
Description
(A)Argで置換されたLys31、もしくはSerで置換されたMet32、もしくはAlaで置換されたCys93、もしくはAlaで置換されたLys156、もしくはThrで置換されたAla158、もしくはAlaで置換されたArg159、もしくはLysで置換されたGly162、もしくはThrで置換されたGly163、もしくはLeuで置換されたMet165、もしくはSerで置換されたArg166、もしくはSerで置換されたCys181、もしくはGlyで置換されたAsn188、もしくはGluで置換されたSer190、もしくはProで置換されたGly214、もしくはAlaで置換されたSer215、もしくはGlyで置換されたSer216、もしくはIleで置換されたGly217、もしくはGlyで置換されたLeu218、もしくはProで置換されたGly220、もしくはGlyで置換されたAla221、もしくはSerで置換されたTrp222、または
(B)Arg−Serで置換されたLys31−Met32、もしくはThr−Alaで置換されたAla158−Arg159、もしくはLys−Thrで置換されたGly162−Gly163、もしくはLeu−Serで置換されたMet165−Arg166、もしくはLys−Thr/Leu−Serで置換されたGly162−Gly163/Met165−Arg166、もしくはGly/Gluで置換されたAsn188/Ser190、もしくはPro−Ala−Gly−Ile−Glyで置換されたGly214−Ser215−Ser216−Gly217−Leu218、もしくはPro−Gly−Serで置換されたGly220−Ala221−Trp222、好ましくは(A)に挙げられた他の任意のアミノ酸置換との組合せ、または
(C)Leu223の後での末端切断(アミノ酸224〜238が欠失)、好ましくは、(A)または(B)に挙げられた他の任意のアミノ酸置換との組合せ
を含む。
a)前記宿主細胞において機能的であるペプチド分泌シグナル、
b)6−メチルグアニン−DNA−メチルトランスフェラーゼ酵素(MGMT、EC2.1.1.63)、その突然変異体または触媒ドメイン、および
c)組換えタンパク質
をコードするヌクレオチド配列を含んでなるベクターに関する。
・細菌またはウイルス免疫原性タンパク質、より好ましくは、(感染性、病原性)ウイルスタンパク質、例えば、デング熱ウイルス、日本脳炎ウイルス、ダニ媒介脳炎ウイルス、黄熱ウイルス、ウスツウイルス、ロシオウイルス、マレー脳炎ウイルス、ベッセルブロンウイルス、ジカウイルスもしくは西ナイルウイルス由来のEDIIIタンパク質、またはリフトバレー熱ウイルスもしくはトスカナウイルス由来の核タンパク質N、またはチクングニアウイルス由来のE2エンベロープタンパク質の可溶型、または西ナイルウイルスのEエンベロープタンパク質の可溶型、
・血液因子、抗凝固因子、増殖因子、ホルモン、ワクチン、治療用酵素、モノクローナル抗体およびサイトカイン(IFNα、グランザイムMおよびFasLなど)、
・抗原、例えば、癌抗原(癌精巣抗原SSX2など)、またはERC/メソテリンのN末端領域(NERCMSL)、
・抗腫瘍タンパク質、例えば、FasL、またはヘパラン硫酸6−O−エンドスルファターゼ(hSULF)、
・微生物、ウイルスおよび/または寄生虫ポリペプチド、
・他の任意の有用タンパク質(例えば、コンタクチン)
からなる群から選択される。
・ペプチドBiP昆虫シグナル(好ましくは、S2ショウジョウバエ細胞において機能的である)または上記で定義されたBiP様シグナル、
・配列番号4のMGMTタンパク質または配列番号2のSNAPタンパク質、
・目的組換えタンパク質、
・エンテロキナーゼペプチド切断部位または上記で定義されたproTEV切断部位、
・ポリヒスチジン標識、および
・アミノ酸配列グリシン−グリシン−グリシン−セリン(GGGS、配列番号63)を有する2つのスペーサー配列
をコードし得る。
・配列番号48のペプチドBiP昆虫シグナル、
・配列番号4のMGMTタンパク質または配列番号2のSNAPタンパク質、
・目的組換えタンパク質、
・配列番号62のエンテロキナーゼペプチド切断部位、
・ポリヒスチジン標識、および
・アミノ酸配列グリシン−グリシン−グリシン−セリン(GGGS)を有する2つのスペーサー配列
をコードする。
・配列番号51のBiP様ペプチドシグナル、
・配列番号4のMGMTタンパク質または配列番号2のSNAPタンパク質、
・目的組換えタンパク質、
・配列番号53のproTEVペプチド切断部位、
・ポリヒスチジン標識、および
・アミノ酸配列グリシン−グリシン−グリシン−セリン(GGGS)を有する2つのスペーサー配列
をコードする。
a)ペプチド分泌シグナル、
b)配列番号4のMGMTタンパク質または配列番号2のSNAPタンパク質、
c)少なくとも1つのペプチド切断部位、
d)ポリヒスチジン標識、および
e)少なくとも1つのスペーサー配列
をコードするヌクレオチド配列を含んでなるベクターを開示する。
a)ペプチド分泌シグナル、
b)配列番号4のMGMTタンパク質または配列番号2のSNAPタンパク質、
c)少なくとも1つのペプチド切断部位、
d)ポリヒスチジン標識、および
e)少なくとも1つのスペーサー配列
(各成分は上記で定義された通り)
をコードするヌクレオチド配列を含んでなる発現ベクターにより安定にトランスフェクトされた組換え細胞を対象とする。
・プラスミド配列番号64(DeSNAP Univを含むpUC57)、または2011年12月9日に、ブタペスト条約に従い、the Centre National de Culture et de Microorganismes(CNCM),パスツール研究所(フランス 75724 パリ セデックス 15 リュ デュ ドクトール ル 25)に番号CNCM I−4581として寄託された細胞にクローニングされたヌクレオチド配列、
・配列番号19、または2010年8月19日に、ブタペスト条約に従い、the Centre National de Culture et de Microorganismes(CNCM),パスツール研究所(フランス 75724 パリ セデックス 15 リュ デュ ドクトール ル 25)に番号CNCM I−4357として寄託された細胞にクローニングされたヌクレオチド配列を含んでなるベクター、
・配列番号22、または2010年10月27日に、the Centre National de Culture et de Microorganismes(CNCM),パスツール研究所に番号CNCM I−4381として寄託された細胞にクローニングされたヌクレオチド配列を含んでなる本発明のベクター、
・配列番号21、または2010年10月27日に、the Centre National de Culture et de Microorganismes(CNCM),パスツール研究所に番号CNCM I−4382として寄託された細胞にクローニングされたヌクレオチド配列を含んでなる本発明のベクター、
・配列番号9、または2010年9月29日に、the Centre National de Culture et de Microorganismes(CNCM),パスツール研究所に番号CNCM I−4368として寄託された細胞にクローニングされたヌクレオチド配列のベクター、
・配列番号20、または2010年9月29日に、the Centre National de Culture et de Microorganismes(CNCM),パスツール研究所に番号CNCM I−4369として寄託された細胞にクローニングされたヌクレオチド配列を含んでなる本発明のベクター、
・配列番号71のベクター、
・配列番号57もしくは72もしくは74(目的タンパク質がIFNαである場合)、配列番号77、79もしくは81(目的タンパク質が癌抗原SSX2である場合)、配列番号55(目的タンパク質がグランザイムMである場合)、配列番号89(目的タンパク質がFasLである場合)、配列番号84もしくは86(目的タンパク質が癌抗原NERCMSLである場合)、配列番号92(目的タンパク質がコンタクチンCNTN4である場合)、または配列番号96(目的タンパク質がhSULF−2ΔTMDである場合)を含んでなる本発明のベクター
からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含んでなる。
・2010年8月19日に、the Centre National de Culture et de Microorganismes(CNCM),パスツール研究所(フランス 75724 パリ セデックス 15 リュ デュ ドクトール ル 25)に番号CNCM I−4357として寄託された細胞、
・2010年10月27日に、the Centre National de Culture et de Microorganismes(CNCM),パスツール研究所(フランス 75724 パリ セデックス 15 リュ デュ ドクトール ル 25)に番号CNCM I−4381として寄託された細胞、
・2010年10月27日に、the Centre National de Culture et de Microorganismes(CNCM),パスツール研究所(フランス 75724 パリ セデックス 15 リュ デュ ドクトール ル 25)に番号CNCM I−4382として寄託された細胞、
・2010年9月29日に、the Centre National de Culture et de Microorganismes(CNCM),パスツール研究所(フランス 75724 パリ セデックス 15 リュ デュ ドクトール ル 25)に番号CNCM I−4368として寄託された細胞、
・2010年9月29日に、the Centre National de Culture et de Microorganismes(CNCM),パスツール研究所(フランス 75724 パリ セデックス 15 リュ デュ ドクトール ル 25)に番号CNCM I−4369として寄託された細胞、
・2011年12月5日に、the Centre National de Culture et de Microorganismes(CNCM),パスツール研究所(フランス 75724 パリ セデックス 15 リュ デュ ドクトール ル 25)に番号CNCM I−4565として寄託された細胞、
・2011年12月5日に、the Centre National de Culture et de Microorganismes(CNCM),パスツール研究所(フランス 75724 パリ セデックス 15 リュ デュ ドクトール ル 25)に番号CNCM I−4566として寄託された細胞、
・2011年12月5日に、the Centre National de Culture et de Microorganismes(CNCM),パスツール研究所(フランス 75724 パリ セデックス 15 リュ デュ ドクトール ル 25)に番号CNCM I−4567として寄託された細胞、
・2011年12月5日に、the Centre National de Culture et de Microorganismes(CNCM),パスツール研究所(フランス 75724 パリ セデックス 15 リュ デュ ドクトール ル 25)に番号CNCM I−4568として寄託された細胞、
・2011年12月5日に、the Centre National de Culture et de Microorganismes(CNCM),パスツール研究所(フランス 75724 パリ セデックス 15 リュ デュ ドクトール ル 25)に番号CNCM I−4569として寄託された細胞、
・2011年12月5日に、the Centre National de Culture et de Microorganismes(CNCM),パスツール研究所(フランス 75724 パリ セデックス 15 リュ デュ ドクトール ル 25)に番号CNCM I−4570として寄託された細胞、
・2011年12月5日に、the Centre National de Culture et de Microorganismes(CNCM),パスツール研究所(フランス 75724 パリ セデックス 15 リュ デュ ドクトール ル 25)に番号CNCM I−4571として寄託された細胞、
・2011年12月5日に、the Centre National de Culture et de Microorganismes(CNCM),パスツール研究所(フランス 75724 パリ セデックス 15 リュ デュ ドクトール ル 25)に番号CNCM I−4572として寄託された細胞、
・2011年12月8日に、the Centre National de Culture et de Microorganismes(CNCM),パスツール研究所(フランス 75724 パリ セデックス 15 リュ デュ ドクトール ル 25)に番号CNCM I−4576として寄託された細胞、
・2011年12月8日に、the Centre National de Culture et de Microorganismes(CNCM),パスツール研究所(フランス 75724 パリ セデックス 15 リュ デュ ドクトール ル 25)に番号CNCM I−4577として寄託された細胞、
・2011年12月8日に、the Centre National de Culture et de Microorganismes(CNCM),パスツール研究所(フランス 75724 パリ セデックス 15 リュ デュ ドクトール ル 25)にthe Centre National de Culture et de Microorganismes(CNCM),パスツール研究所(フランス 75724 パリ セデックス 15 リュ デュ ドクトール ル 25)に番号CNCM I−4578として寄託された細胞、
・2011年12月8日に、the Centre National de Culture et de Microorganismes(CNCM),パスツール研究所(フランス 75724 パリ セデックス 15 リュ デュ ドクトール ル 25)に番号CNCM I−4579として寄託された細胞、
・2011年12月8日に、the Centre National de Culture et de Microorganismes(CNCM),パスツール研究所(フランス 75724 パリ セデックス 15 リュ デュ ドクトール ル 25)に番号CNCM I−4580として寄託された細胞、
・2011年12月9日に、the Centre National de Culture et de Microorganismes(CNCM),パスツール研究所(フランス 75724 パリ セデックス 15 リュ デュ ドクトール ル 25)に番号CNCM I−4582として寄託された細胞、
・2011年12月9日に、the Centre National de Culture et de Microorganismes(CNCM),パスツール研究所(フランス 75724 パリ セデックス 15 リュ デュ ドクトール ル 25)に番号CNCM I−4583として寄託された細胞、
・2011年12月9日に、the Centre National de Culture et de Microorganismes(CNCM),パスツール研究所(フランス 75724 パリ セデックス 15 リュ デュ ドクトール ル 25)に番号CNCM I−4584として寄託された細胞、
・2011年12月9日に、the Centre National de Culture et de Microorganismes(CNCM),パスツール研究所(フランス 75724 パリ セデックス 15 リュ デュ ドクトール ル 25)に番号CNCM I−4585として寄託された細胞、および
・2011年12月9日に、the Centre National de Culture et de Microorganismes(CNCM),パスツール研究所(フランス 75724 パリ セデックス 15 リュ デュ ドクトール ル 25)に番号CNCM I−4586として寄託された細胞
からなる群から選択することもできる。
a)前記目的タンパク質をコードする本発明のヌクレオチド発現ベクターを提供する工程、
b)前記発現ベクターを宿主細胞、好ましくは無脊椎動物または脊椎動物宿主細胞に導入する工程、
c)前記宿主細胞内で導入されたヌクレオチドの発現を可能として前記目的組換えタンパク質を生産する工程
を含んでなる。
(a)目的組換えタンパク質をコードする異種DNA配列を取得する工程;
(b)前記異種DNA配列を本発明のヌクレオチド発現ベクターに挿入する工程(該ベクターは例えば配列番号9、配列番号10、配列番号64または配列番号71のDNA配列を有する);
(c)宿主細胞(好ましくは、昆虫細胞または哺乳動物細胞)を工程(b)で得られたポリヌクレオチドでトランスフェクトする工程;
(d)工程(c)で得られた前記ポリヌクレオチドの発現を可能として目的タンパク質を生産する工程;
(e)場合により、MGMTポリペプチドを切断する工程、
(f)目的タンパク質を回収する工程、
(g)場合により、目的タンパク質を精製する工程
を含んでなる。
(a)本発明のウイルスベクターを好適な細胞株に導入する工程、
(b)前記細胞株を、前記感染性ウイルス粒子の生産を可能とするために好適な条件下で培養する工程、
(c)生産された感染性ウイルス粒子を前記細胞株の培養物から回収する工程、および
(d)場合により、前記の回収された感染性ウイルス粒子を精製する工程
を含んでなる方法によって生産される。
1.1.プラスミドpMT/BiP/V5−His Aを使用した。このプラスミドは3642ヌクレオチドを含み、下記の特徴を含む:
・メタロチオネインプロモーター:塩基412〜778、
・転写開始:塩基778、
・MTフォワードプライミング部位:塩基814〜831、
・BiPシグナル配列:塩基851〜904(配列番号11)、
・多重クローニング部位:塩基906〜999、
・V5エピトープタグ:塩基1003〜1044、
・ポリヒスチジン領域:塩基1054〜1074、
・BGHリバースプライミング部位:塩基1094〜1111、
・SV40後期ポリアデニル化シグナル:塩基1267〜1272、
・pUC起点:塩基1765〜2438(相補鎖)、
・blaプロモーター:塩基3444〜3542(相補鎖)、
・アンピシリン(bla)耐性遺伝子ORF:塩基2583〜3443(相補鎖)。
・独特なクローニング部位EcoRI、
・メタロチオネインプロモーター、
・西ナイルウイルスIS−98−ST1株由来ゲノムRNAの5’非コード領域、
・翻訳開始コドン(ATG)、
・西ナイルウイルスIS−98−ST1株由来エンベロープEタンパク質のシグナルペプチド(配列番号15)、
・2つのリピート配列と3’末端ステム−ループが削除された、西ナイルウイルスIS−98−ST1株由来ゲノムRNAの3’非コード領域、
・S40ポリAシグナルモチーフ、
・独特なクローニング部位ApaI。
配列番号2のSNAPタンパク質配列をコードするDNAの増幅を、5’−SNAPプライマーと3’−MCSプライマーの組合せを用い、PCRにより、pMT/BiP/CHIK.sE2+SNAPタグを鋳型として行った。
プライマー5’−SNAP:
プライマー3’−MCS:
・配列番号11の昆虫ssBiP配列、
・配列番号1のSNAP DNA配列、
・配列番号12のエンテロキナーゼ切断部位、
・EcoRV−SmaI制限部位、
・制限部位の下流に位置する、His6タグをコードするDNA(配列番号14)、
・i)エンハンサー配列とEcoRV−SmaI制限部位の間、およびii)EcoRV−SmaI制限部位とHis6タグをコードするDNAの間に位置する、配列番号13の2つのDNAスペーサー配列。
・独特なクローニング部位EcoRI、
・メタロチオニン(Methallothionin)プロモーター、
・西ナイルウイルスIS−98−ST1株由来ゲノムRNAの5’非コード領域、
・翻訳開始コドン、
・配列番号15の、西ナイルウイルスIS−98−ST1株由来エンベロープEタンパク質のシグナルペプチド、
・配列番号47のSNAP DNA配列、
・外来配列をインフレームで挿入するためのSmaI/XmaIにおける独特なクローニング部位EcoRV、
・SNAPエンハンサーDNAとクローニング部位の間に位置する、配列番号12のエンテロキナーゼ切断部位、
・ヘキサヒスチジンタグ配列をコードするDNA(配列番号14)、
・エンハンサー配列とEcoRV−SmaI制限部位の間、およびii)EcoRV−SmaI制限部位とHis6タグをコードするDNAの間に位置する、配列番号13の2つのDNAスペーサー配列、
・2つの翻訳停止コドン、
・2つのリピート配列と3’末端ステム−ループが削除された、西ナイルウイルスIS−98−ST1株由来ゲノムRNAの3’非コード領域、
・S40ポリAシグナルモチーフ、および
・独特なクローニング部位ApaI。
・独特なクローニング部位EcoRI、
・メタロチオニン(Methallothionin)プロモーター、
・西ナイルウイルスIS−98−ST1株由来ゲノムRNAの5’非コード領域、
・翻訳開始コドン、
・配列番号15の、西ナイルウイルスIS−98−ST1株由来エンベロープEタンパク質のシグナルペプチド、
・配列番号47のSNAP DNA配列、
・外来配列をインフレームで挿入するための独特なクローニング部位BamHI、EcoRV、ApaIおよびXmaI、
・SNAPエンハンサーDNAとHisタグの間に位置する、配列番号52の2つのproTEV切断部位、
・ヘキサヒスチジンタグ配列をコードするDNA(配列番号14)、
・i)エンハンサー配列とEcoRV−SmaI制限部位の間、およびii)ApaI制限部位とHis6タグをコードするDNAの間に位置する、配列番号13の2つのDNAスペーサー配列、
・2つの翻訳停止コドン、
・2つのリピート配列と3’末端ステム−ループが削除された、西ナイルウイルスIS−98−ST1株由来ゲノムRNAの3’非コード領域、
・S40ポリAシグナルモチーフ、および
・独特なクローニング部位ApaI。
1.3.1.リフトバレー熱ウイルスの核タンパク質N(RVF−N)
RFV−Nタンパク質配列をコードするcDNAに対する突然変異誘発を、下記に挙げた5’−Nプライマーと3’−N’プライマーの組合せを用いてPCRにより行った。
プライマー5’−N:
プライマー3’−N:
配列番号32のヒトIFNα1タンパク質配列も使用可能である。
1.4.1.RVF.N
1.3.1.項で得られたPCR産物をBssHIIおよびAgeIで消化し、1.2.項で得られた線状化プラスミドp/MT/BiP/SNAP−Hisタグの、独特なBssHII(SNAP遺伝子の3’末端)部位とAgeI(シャトルベクターのMCSの3’末端)の間に挿入した。
組換えフラビウイルス抗原に基づくELISAまたは免疫ブロット試験の特異性を高めるために、Eタンパク質の抗原ドメインIII(EDIII)は有望なアプローチであると思われる(Ludolfs et al. 2007)。西ナイル(WN)ウイルス、ウスツ(USU)ウイルス、日本脳炎(JE)ウイルス、ダニ媒介脳炎(TBE)ウイルス、デング熱血清型1〜4(DEN−1、−2、−3、−4)ウイルスおよび黄熱(YF)ウイルスからの組換えEDIIIの製造に関して、本発明の方法を用いて試験した。
プラスミドpMT/BiP/SNAP−IFN−Hisタグ(図4参照)およびpMT/BiP様/SNAP−IFN−Hisタグ(図8の詳細を参照)を得た。
プラスミドpMT/BiP/SNAP−GrM−Hisタグを得た(図6の詳細を参照)。
2.1.S2細胞へのトランスフェクション
得られたプラスミドpMT/BiP/SNAP−タンパク質−Histag(Histagで終わる分泌融合タンパク質としてのSNAPタグを有するタンパク質の生産を可能とする)は、選択マーカーpCo−BlastとともにS2細胞に同時トランスフェクトし、アンピシリン耐性を示す安定なS2/sSNAP−タンパク質−Histag細胞株を作出した。
このプラスミドpMT/BiP様/SNAP−IFN−HistagをHeLa細胞にトランスフェクトした。
細胞外の、HisタグおよびSNAPタグを有するタンパク質を、金属キレート樹脂およびHLPC法を用いて精製した。
RVF−N
Plate-Forme 5 Production de Proteines recombinantes et d'Anticorps (Institut Pasteur)との共同研究において、2リットルのS2/sSNAP−RVFV.N−Histag細胞上清から、Cd2+刺激の10日後に、精製度の高い、SNAPタグを有するRVF.Nタンパク質が97mgもの量で得られた。
Plate-Forme 5 Production de Proteines recombinantes et d'Anticorps (Institut Pasteur)との共同研究において、2リットルのS2/sSNAP−TOS.N−Histag細胞上清から、Cd2+刺激の10日後に、精製度の高い、SNAPタグを有するRVF.Nタンパク質が41mgもの量で得られた。
可溶性IFNα1タンパク質は、エンテロキナーゼ酵素(Novagenキット)を用いて切断することにより、SNAPタグから遊離させた。
3.3.種々のフラビウイルス由来の抗原
・ectoM:1型デング熱ウイルス由来Mタンパク質のエクトドメイン
・RVF由来N遺伝子:リフトバレー熱ウイルスの核タンパク質N(主要ウイルス抗原)
・TOS由来N遺伝子:トスカナウイルスの核タンパク質N(主要ウイルス抗原)
・WN由来sE:西ナイルウイルス由来エンベロープEタンパク質の可溶型
・CHIK由来sE2:チクングニアウイルス由来エンベロープE2タンパク質の可溶型
・SNAP−IFNΑI:SNAPと融合したインターフェロン−α1
7日で、1リットルの培養上清当たり10mgのSNAP−GrMタンパク質が回収された。
特異的抗体(目的タンパク質および/またはHisタグ標識を認識する)を用いた免疫ブロットアッセイは、細胞外の、SNAPタグを有するタンパク質の実質的生産を検出した:
免疫ブロットアッセイは、ヤギ血清抗Histagを用いて、細胞外の、SNAPタグを有するRVF.Nタンパク質を検出した(図2B)。RVF.Nに対するヒトおよびマウス免疫血清は、組換え型の、SNAPタグを有するRVF.Nタンパク質を特異的に認識する。
・誘導を受けたS2/SNAP−IFNα1細胞から分泌された可溶性組換えSNAP−IFNα1はCHIKVに対して強い抗ウイルス効果を示す
誘導10日後に、Cd2+刺激S2/SNAP−IFNα1(5×106細胞/ml)の上清(5ml)を回収した。細胞上清に対して、抗Hisタグ抗体を用いた免疫ブロットにより、可溶性SNAP−IFNα1タンパク質の蓄積が見られた(下記参照)。SNAP−IFNα1の抗ウイルス活性を、ルシフェラーゼ(Luc)遺伝子を発現するチクングニアウイルスに感染させたHeLa細胞で評価した。感染6時間後にLuc活性を測定した。HeLa細胞における、CHIKVに対するその強力な抗ウイルス作用が知られるIFNαcon1(インファゲン)を内部アッセイとして使用した。Cd2+刺激S2/SNAP−Tos.N(トスカナウイルス由来Nタンパク質)の上清を陰性対照として用いた。図4Cに示されたグラフは、1μlの分泌SNAP−IFNα1または0.1μgのインファゲンが感染宿主細胞内でのCHIKV複製を抑制できたことを示す。このグラフには、SNAP−IFNαの用量依存効果が示される。0.1μlの可溶性SNAP−IFNα1または0.01μgのインファゲンでなお20%のLuc活性が見られた。SNAP−TOS−Nを用いた場合には、試験したより高い用量でも抗ウイルス作用は見られなかった。
これまでに述べたように、ベクターpMT/BiP/SNAP−GrM−HisタグでトランスフェクトされたS2細胞の上清では、3つの形態のSNAP−GrMが検出された(図6C参照)。
組換えプラスミドpcDNA3/De SNAPuniv−hSULF−2ΔTMDでトランスフェクトされたHEK−293細胞からhSULF−2ΔTMDが発現および精製された(図13A参照)。
驚くことに、SNAPペプチドを含んでなる融合タンパク質はその不在の場合よりもin vitroにおいてはるかに安定であることが見出された。
上述のプロトコールに従って産生されたSNAP−RVF.N融合タンパク質を、感染ヒツジの血清中の抗RVF.N抗体を検出するための診断ツールとして用いた。
本発明において、体液中のアルボウイルスに対する抗体の迅速かつ同時検出のためにマルチプレックスビーズに基づくイムノアッセイが開発された。この系はxMAP技術(Luminex corporation)に基づくものであり、特異的ヒト免疫グロブリンの捕捉試薬として抗原をコーティングしたマイクロスフェアの混合物を使用する。異なるマイクロスフェアセット(Magplex、Luminex corporation)を精製MGMT融合タンパク質、すなわち、第3.3節に記載のSNAPタグを有するウイルス組換えタンパク質:sSNAP−DV1.EDIII、sSNAP−DV2.EDIII、sSNAP−DV3.EDIII、sSNAP−DV4.EDIII、sSNAP−WN.EDIII、sSNAP−JE.EDIII、sSNAP−USU.EDIII、sSNAP−TBE.EDIII、sSNAP−YF.EDIII、sSNAP−MVE.EDIII、sSNAP−ロシオ.EDIII、sSNAP−WSL.EDIII、sSNAP−ジカ.EDIII、SNAP−DV1ectoM、sSNAP−N.RVF、sSNAP−N.TOS、およびCHIK.sE2−SNAPと連結した。組換え抗原は、MGMTタンパク質の基質をリンカーとして用いてカルボキシルマイクロスフェア表面に共有結合させ(BG−PEG−NH2、New England Biolabs)、それにより、標準的アミンカップリング手順に比べて抗体捕捉効率を高めた。
Claims (44)
- 宿主細胞において組換えタンパク質を発現するためのベクターであって、単一のオープンリーディングフレーム内に、5’から3’方向に、
a)前記宿主細胞において機能的であるペプチド分泌シグナル、
b)6−メチルグアニン−DNA−メチルトランスフェラーゼ酵素(MGMT、EC2.1.1.63)、その触媒ドメインまたは突然変異体、および
c)組換えタンパク質
をコードするヌクレオチド配列を含んでなる、ベクター。 - 前記MGMT酵素が配列番号4のタンパク質またはその同族体である、請求項1に記載の発現ベクター。
- 前記MGMT突然変異体が配列番号2のSNAPタンパク質またはその同族体である、請求項1に記載の発現ベクター。
- 前記オープンリーディングフレームが、前記ペプチドシグナルと同じ宿主細胞において機能的である誘導プロモーターと機能的に連結されている、請求項1〜3のいずれか一項に記載の発現ベクター。
- 前記分泌ペプチドシグナルおよび前記誘導プロモーターが無脊椎動物細胞、好ましくは、昆虫細胞、より好ましくは、ショウジョウバエS2細胞において機能的である、請求項1〜4のいずれか一項に記載の発現ベクター。
- 前記分泌ペプチドシグナルおよび前記誘導プロモーターが脊椎動物細胞、好ましくは、哺乳動物細胞、より好ましくは、CHO細胞、YB2/O細胞、COS細胞、HEK細胞、NIH3T3細胞、HeLa細胞またはそれらの誘導体において機能的である、請求項1〜5のいずれか一項に記載の発現ベクター。
- 前記組換えタンパク質が診断用および/または治療用タンパク質および/またはポリペプチドからなる群から選択される、請求項1〜6のいずれか一項に記載の発現ベクター。
- 前記診断用および治療用タンパク質および/またはポリペプチドが、
−細菌またはウイルス免疫原性タンパク質、より好ましくは、デング熱ウイルス、日本脳炎(JE)ウイルス、ダニ媒介脳炎(TBE)ウイルス、黄熱(YF)ウイルス、ウスツ(USU)ウイルス、ロシオウイルス、マレー脳炎(MVE)ウイルス、ベッセルブロン(WSL)ウイルス、ジカウイルスもしくは西ナイル(WN)ウイルス由来のEDIIIタンパク質、またはリフトバレー熱(RVF)ウイルスもしくはトスカナ(TOS)ウイルス由来の核タンパク質N、またはチクングニアウイルス由来のE2エンベロープタンパク質の可溶型、または西ナイルウイルスのEエンベロープタンパク質の可溶型、および
−血液因子、抗凝固因子、増殖因子、ホルモン、治療用酵素およびモノクローナル抗体およびサイトカイン、
−抗腫瘍タンパク質、
−微生物、ウイルスおよび/または寄生虫ポリペプチド、
−癌抗原などの抗原
からなる群から選択される、請求項7に記載の発現ベクター。 - 前記診断用および治療用タンパク質がIFNα、グランザイムM、FasL、SSX2、NERCMSL、hSULF2ΔTMDおよびCNTN4からなる群から選択される、請求項7に記載の発現ベクター。
- 前記MGMT酵素が配列番号3または配列番号68のDNA配列によりコードされている、請求項1〜9のいずれか一項に記載の発現ベクター。
- 前記MGMT酵素突然変異体が配列番号1または配列番号47のDNA配列によりコードされている、請求項1〜9のいずれか一項に記載の発現ベクター。
- 少なくとも1つのペプチド切断部位をさらにコードし、それが好ましくはMGMT酵素、その突然変異体または触媒ドメインと組換えタンパク質との間に位置する、請求項1〜11のいずれか一項に記載の発現ベクター。
- 標識をさらにコードし、それが好ましくは組換えタンパク質のC末端に位置する、請求項1〜12のいずれか一項に記載の発現ベクター。
- スペーサー配列をさらにコードし、それが好ましくは前記MGMT酵素、その突然変異体または触媒ドメインと前記組換えタンパク質との間、かつ/または前記組換えタンパク質と前記標識との間に位置する、請求項1〜13のいずれか一項に記載の発現ベクター。
- −ペプチドBiP昆虫シグナル、
−配列番号2のSNAPタンパク質、
−請求項9に定義される組換えタンパク質、
−エンテロキナーゼペプチド切断部位、
−ポリヒスチジン標識、および
−アミノ酸配列グリシン−グリシン−グリシン−セリン(GGGS)を有する2つのスペーサー配列
をコードする、請求項1に記載の発現ベクター。 - −BiP様ペプチドシグナル、
−配列番号2のSNAPタンパク質、
−請求項9に定義される組換えタンパク質、
−proTEVペプチド切断部位、
−ポリヒスチジン標識、および
−アミノ酸配列グリシン−グリシン−グリシン−セリン(GGGS)を有する2つのスペーサー配列
をコードする、請求項1に記載の発現ベクター。 - 宿主細胞において組換えタンパク質を発現するためのベクターであって、単一のオープンリーディングフレーム内に、5’から3’方向に、
a)BiP様ペプチドシグナル、
b)配列番号4のMGMTタンパク質または配列番号2のSNAPタンパク質、
c)2つのproTEVペプチド切断部位、
d)ポリヒスチジン標識、および
e)アミノ酸配列グリシン−グリシン−グリシン−セリン(GGGS)を有する2つのスペーサー配列
をコードするヌクレオチド配列を含んでなる、ベクター。 - 好ましくは配列番号59または配列番号69を含んでなる、請求項1〜17のいずれか一項に記載の発現ベクターを含んでなるプラスミドにより安定にトランスフェクトされた組換え細胞。
- 細菌、好ましくは、大腸菌細胞である、請求項18に記載の安定にトランスフェクトされた組換え細胞。
- 細菌、昆虫細胞、より好ましくは、ショウジョウバエS2細胞またはそれらの誘導体;哺乳動物細胞、より好ましくは、CHO細胞、YB2/O細胞、COS細胞、HEK細胞、NIH3T3細胞、HeLa細胞、PER.C6細胞またはそれらの誘導体;および鳥類細胞、例えば、EBx細胞、好ましくは、EB66細胞またはそれらの誘導体である、請求項18に記載のトランスフェクトされた組換え細胞。
- 請求項1〜17のいずれか一項に定義される発現ベクターを生産するための、請求項18〜20のいずれか一項に記載の組換え細胞の使用。
- 組換えタンパク質を生産するための、請求項18〜20のいずれか一項に記載の組換え細胞の使用。
- ペプチド分泌シグナルと、6−メチルグアニン−DNA−メチルトランスフェラーゼ酵素(MGMT、EC2.1.1.63)、その突然変異体または触媒ドメインとを含んでなる、融合ポリペプチド。
- 前記MGMT突然変異体が配列番号2のSNAPタンパク質またはその同族体である、請求項23に記載の融合ポリペプチド。
- 前記MGMT酵素が配列番号4のタンパク質またはその同族体である、請求項23に記載の融合ポリペプチド。
- 前記MGMT酵素、その突然変異体または触媒ドメインのC末端に組換えタンパク質をさらに含んでなる、請求項23〜25のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
- 前記組換えタンパク質のC末端に位置する標識、好ましくは、ポリヒスチジン標識をさらに含んでなる、請求項26に記載の融合ポリペプチド。
- 請求項1〜5および7〜14のいずれか一項に記載の発現ベクターにより安定トランスフェクトされた、無脊椎動物組換え細胞。
- 昆虫細胞である、請求項28に記載の安定にトランスフェクトされた細胞。
- キイロショウジョウバエ細胞、より好ましくは、ショウジョウバエS2細胞である、請求項29に記載の安定にトランスフェクトされた細胞。
- i)前記発現ベクターが、
−配列番号19、または2010年8月19日にthe Centre National de Culture et de Microorganismes(CNCM),パスツール研究所(フランス パリ)に番号CNCM I−4357として寄託された細胞にクローニングされたヌクレオチド配列を含んでなるベクター、
−配列番号22、または2010年10月27日にthe Centre National de Culture et de Microorganismes(CNCM),パスツール研究所に番号CNCM I−4381として寄託された細胞にクローニングされたヌクレオチド配列を含んでなる請求項7のベクター、
−配列番号21、または2010年10月27日にthe Centre National de Culture et de Microorganismes(CNCM),パスツール研究所に番号CNCM I−4382として寄託された細胞にクローニングされたヌクレオチド配列を含んでなる請求項7のベクター、
−配列番号9、または2010年9月29日にthe Centre National de Culture et de Microorganismes(CNCM),パスツール研究所に番号CNCM I−4368として寄託された細胞にクローニングされたヌクレオチド配列を含んでなるベクター、
−配列番号20、または2010年9月29日にthe Centre National de Culture et de Microorganismes(CNCM),パスツール研究所に番号CNCM I−4369として寄託された細胞にクローニングされたヌクレオチド配列を含んでなる請求項7のベクター、
−配列番号10または59または69を含んでなる請求項17のベクター、
−配列番号64、または2011年12月9日にthe Centre National de Culture et de Microorganismes(CNCM),パスツール研究所に番号CNCM I−4581として寄託された細胞にクローニングされたヌクレオチド配列のベクター、
−配列番号71のベクター、
−配列番号55、配列番号57もしくは72もしくは74、配列番号77、79もしくは81、配列番号89、配列番号84もしくは86、配列番号92、または配列番号96を含んでなる請求項9のベクター
からなる群から選択されるか、あるいは
ii)それが、
−2010年8月19日にthe Centre National de Culture et de Microorganismes(CNCM),パスツール研究所に番号CNCM I−4357として寄託された細胞、
−2010年10月27日にthe Centre National de Culture et de Microorganismes(CNCM),パスツール研究所に番号CNCM I−4381として寄託された細胞、
−2010年10月27日にthe Centre National de Culture et de Microorganismes(CNCM),パスツール研究所に番号CNCM I−4382として寄託された細胞、
−2010年9月29日にthe Centre National de Culture et de Microorganismes(CNCM),パスツール研究所に番号CNCM I−4368として寄託された細胞、
−2010年9月29日にthe Centre National de Culture et de Microorganismes(CNCM),パスツール研究所に番号CNCM I−4369として寄託された細胞、
−2011年12月5日にthe Centre National de Culture et de Microorganismes(CNCM),パスツール研究所(フランス 75724 パリ セデックス 15 リュ デュ ドクトール ル 25)に番号CNCM I−4565として寄託された細胞、
−2011年12月5日にthe Centre National de Culture et de Microorganismes(CNCM),パスツール研究所(フランス 75724 パリ セデックス 15 リュ デュ ドクトール ル 25)に番号CNCM I−4566として寄託された細胞、
−2011年12月5日にthe Centre National de Culture et de Microorganismes(CNCM),パスツール研究所(フランス 75724 パリ セデックス 15 リュ デュ ドクトール ル 25)に番号CNCM I−4567として寄託された細胞、
−2011年12月5日にthe Centre National de Culture et de Microorganismes(CNCM),パスツール研究所(フランス 75724 パリ セデックス 15 リュ デュ ドクトール ル 25)に番号CNCM I−4568として寄託された細胞、
−2011年12月5日にthe Centre National de Culture et de Microorganismes(CNCM),パスツール研究所(フランス 75724 パリ セデックス 15 リュ デュ ドクトール ル 25)に番号CNCM I−4569として寄託された細胞、
−2011年12月5日にthe Centre National de Culture et de Microorganismes(CNCM),パスツール研究所(フランス 75724 パリ セデックス 15 リュ デュ ドクトール ル 25)に番号CNCM I−4570として寄託された細胞、
−2011年12月5日にthe Centre National de Culture et de Microorganismes(CNCM),パスツール研究所(フランス 75724 パリ セデックス 15 リュ デュ ドクトール ル 25)に番号CNCM I−4571として寄託された細胞、
−2011年12月5日にthe Centre National de Culture et de Microorganismes(CNCM),パスツール研究所(フランス 75724 パリ セデックス 15 リュ デュ ドクトール ル 25)に番号CNCM I−4572として寄託された細胞、
−2011年12月8日にthe Centre National de Culture et de Microorganismes(CNCM),パスツール研究所(フランス 75724 パリ セデックス 15 リュ デュ ドクトール ル 25)に番号CNCM I−4576として寄託された細胞、
−2011年12月8日にthe Centre National de Culture et de Microorganismes(CNCM),パスツール研究所(フランス 75724 パリ セデックス 15 リュ デュ ドクトール ル 25)に番号CNCM I−4577として寄託された細胞、
−2011年12月8日にthe Centre National de Culture et de Microorganismes(CNCM),パスツール研究所(フランス 75724 パリ セデックス 15 リュ デュ ドクトール ル 25)に番号CNCM I−4578として寄託された細胞、
−2011年12月8日にthe Centre National de Culture et de Microorganismes(CNCM),パスツール研究所(フランス 75724 パリ セデックス 15 リュ デュ ドクトール ル 25)に番号CNCM I−4579として寄託された細胞、
−2011年12月8日にthe Centre National de Culture et de Microorganismes(CNCM),パスツール研究所(フランス 75724 パリ セデックス 15 リュ デュ ドクトール ル 25)に番号CNCM I−4580として寄託された細胞、
−2011年12月9日にthe Centre National de Culture et de Microorganismes(CNCM),パスツール研究所(フランス 75724 パリ セデックス 15 リュ デュ ドクトール ル 25)に番号CNCM I−4583として寄託された細胞、
−2011年12月9日にthe Centre National de Culture et de Microorganismes(CNCM),パスツール研究所(フランス 75724 パリ セデックス 15 リュ デュ ドクトール ル 25)に番号CNCM I−4584として寄託された細胞、
−2011年12月9日にthe Centre National de Culture et de Microorganismes(CNCM),パスツール研究所(フランス 75724 パリ セデックス 15 リュ デュ ドクトール ル 25)に番号CNCM I−4585として寄託された細胞、および
−2011年12月9日にthe Centre National de Culture et de Microorganismes(CNCM),パスツール研究所(フランス 75724 パリ セデックス 15 リュ デュ ドクトール ル 25)に番号CNCM I−4586として寄託された細胞
からなる群から選択される
請求項30に記載の安定にトランスフェクトされたS2細胞。 - 請求項1〜4、6〜14、および16〜17のいずれか一項に記載の発現ベクターにより安定にトランスフェクトされた、脊椎動物組換え細胞。
- 哺乳動物細胞、好ましくは、CHO細胞、YB2/O細胞、COS細胞、HEK細胞、NIH3T3細胞、HeLa細胞またはそれらの誘導体である、請求項32に記載の安定にトランスフェクトされた細胞。
- 前記発現ベクターが、配列番号57もしくは72もしくは74(目的タンパク質がIFNαである場合)、配列番号77、79もしくは81(目的タンパク質が癌抗原SSX2である場合)、配列番号55(目的タンパク質がグランザイムMである場合)、配列番号89(目的タンパク質がFasLである場合)、配列番号84もしくは86(目的タンパク質が癌抗原NERCMSLである場合)、または配列番号92(目的タンパク質がコンタクチンCNTN4である場合)、または配列番号96(目的タンパク質がhSULF2ΔTMDである場合)を含んでなる請求項9のベクターである、請求項32または33に記載の安定にトランスフェクトされた哺乳動物細胞。
- 組換えタンパク質の発現を増強する方法であって、前記タンパク質およびペプチド分泌シグナルを、酵素6−メチルグアニン−DNA−メチルトランスフェラーゼ酵素(MGMT、EC2.1.1.63)、その突然変異体または触媒ドメインとともに共発現させることを含んでなり、前記共発現が好ましくは無脊椎動物細胞で行われる、方法。
- 前記MGMT酵素が配列番号4のタンパク質である、請求項35に記載の方法。
- 前記MGMT突然変異体酵素が配列番号2のSNAPタンパク質またはその同族体である、請求項35に記載の方法。
- 細胞培養において組換えタンパク質を生産する方法であって、
a)請求項1〜16の発現ベクターを提供すること、
b)前記発現ベクターを宿主細胞に導入すること、
c)前記宿主細胞に導入されたヌクレオチドの発現を可能として組換えタンパク質を生産すること
を含んでなる、方法。 - 前記組換えタンパク質が、回収された細胞培養上清の少なくとも40mg/Lまたはそれを上回って発現される、請求項35〜38のいずれか一項に記載の方法。
- 複製ベクターまたは欠陥ベクターを感染させた宿主細胞において異種タンパク質の生産を増強するための、6−メチルグアニン−DNA−メチルトランスフェラーゼ酵素(MGMT、EC2.1.1.63)、その突然変異体または触媒ドメインの使用。
- 前記MGMT酵素が配列番号4のタンパク質である、請求項40に記載の使用。
- 前記MGMT突然変異体が配列番号2のSNAPタンパク質である、請求項40に記載の使用。
- 保存培地中、血漿中もしくはバッファー中での組換えタンパク質の半減期を改善するため、薬剤もしくはワクチンとして用いられる組換えタンパク質の半減期を改善するため、または診断キットで用いられる組換えタンパク質の半減期を改善するために、組換えタンパク質と融合または結合される保護ポリペプチドとしての、6−メチルグアニン−DNA−メチルトランスフェラーゼ酵素(MGMT、EC2.1.1.63)、その突然変異体または触媒ドメインの使用。
- 前記組換えタンパク質がインスリン、IFNα、グランザイムM、SSX2、FasL、エンドスルファターゼ(hSULF)、コンタクチンおよびメソテリン(NERMCSL)の中から選択される、請求項43に記載の使用。
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