JP7424968B2 - 細胞におけるｒｎａ発現を増強する方法 - Google Patents

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Description

本発明は、例えば、ウイルス由来因子をコードするＲＮＡで細胞をトランスフェクトすることにより、細胞に提供されると、細胞においてペプチド又はタンパク質をコードするＲＮＡの発現を増強するウイルス由来因子を記載する。特に、ウイルス由来因子は、特にＲＮＡで繰り返しトランスフェクトした場合に、細胞の生存率を高め、トランスフェクトしたＲＮＡに対する細胞のＩＦＮ応答を低下させる。従って、本発明は、細胞におけるＲＮＡの発現を増強するための方法及び手段を提供する。細胞は、好ましくはＲＮＡでトランスフェクトされる。
外来遺伝子情報を標的細胞中に送達するためのＲＮＡの使用は、ＤＮＡの魅力的な代替物を提供する。ＲＮＡを使用する利点には一過性発現と非形質転換特性が含まれる。ＲＮＡは発現されるために核に入る必要はなく、更に宿主ゲノムに組み込まれ得ず、よって発がんリスクを排除する。
ＲＮＡは、胚又は胎仔を生み出すことなく体細胞を幹様細胞に脱分化させるのに有用であると記載されている。幹細胞特性、特に多能性を有する細胞への体細胞の脱分化は、体細胞への体細胞の脱分化を誘導するＲＮＡコード化因子を導入し（リプログラミング転写因子（ｒＴＦ）又は単にリプログラミング因子とも呼ばれる）、体細胞を培養して細胞を脱分化させることによって、なされうる。脱分化後、細胞は、同一又は異なる体細胞型、例えば神経、造血、筋肉、上皮、及びその他の細胞型に再分化するように誘導されうる。従って、そのような幹様細胞は、「細胞療法」による変性疾患の治療に医学的用途があり、心臓、神経、内分泌、血管、網膜、皮膚、筋肉骨格障害、及び他の疾患の治療における新規の治療戦略に利用されうる。
しかし、外因性の一本鎖ＲＮＡは哺乳動物細胞における防御機構を活性化する。よって、ＲＮＡベースの遺伝子導入には、一般に、送達されたＲＮＡの連続的な発現を妨げるＩＦＮ応答の誘導が伴う。
本発明によれば、トスカーナウイルス由来のウイルスエスケープタンパク質ＮＳｓ（Ｎ）がＩＦＮ応答の強力な阻害剤であり、ＲＮＡトランスフェクションと組み合わせて使用できることが観察された。更に、本発明によれば、トスカーナウイルス由来のウイルスエスケープタンパク質ＮＳｓ（Ｎ）を使用して、目的のタンパク質のＲＮＡベースの発現を成功させるためにＥＫＢ（Ｅ３、Ｋ３、Ｂ１８Ｒ）を置換できることが観察された。
一態様では、本発明は、（ｉ）ペプチド又はタンパク質をコードするＲＮＡを細胞に導入する工程と、（ｉｉ）トスカーナウイルスＮＳｓタンパク質又はトスカーナウイルスＮＳｓタンパク質の機能的バリアントを含むウイルス由来因子を細胞に提供する工程を含む、細胞においてペプチド又はタンパク質（ここでは目的のペプチド又はタンパク質とも呼ぶ）を発現させる方法に関する。
一実施態様では、ウイルス由来因子は、トスカーナウイルスＮＳｓタンパク質を含む。
一実施態様では、ＲＮＡは細胞に繰り返し導入される。一実施態様では、ＲＮＡは、エレクトロポレーション又はリポフェクションにより細胞に導入される。
一実施態様では、ＲＮＡはインビトロ転写ＲＮＡである。
一実施態様では、ウイルス由来因子を細胞に提供することは、ウイルス由来因子をコードするＲＮＡなどの核酸を細胞に導入することを含む。
一実施態様では、本発明の方法は、（ｉ）細胞外ＩＦＮによるＩＦＮ受容体の結合を防止すること、及び／又は（ｉｉ）細胞内ＩＦＮシグナル伝達を阻害することを更に含みうる。よって、一実施態様では、本発明の方法は、ワクシニアウイルスＢ１８Ｒ、ワクシニアウイルスＥ３及びワクシニアウイルスＫ３の一又は複数、例えばワクシニアウイルスＢ１８Ｒ及び／又はワクシニアウイルスＥ３を細胞に提供することを含む。一実施態様では、ワクシニアウイルスＢ１８Ｒ、ワクシニアウイルスＥ３及びワクシニアウイルスＫ３の一又は複数を細胞に提供することは、それをコードするＲＮＡなどの核酸を細胞に導入することを含む。
しかし、本発明によれば、トスカーナウイルス由来のウイルスエスケープタンパク質ＮＳ（Ｎ）を使用して、目的のタンパク質のＲＮＡベースの発現を成功させるためにＥＫＢ（Ｅ３、Ｋ３、Ｂ１８Ｒ）を完全に置換できることが観察された。よって、一実施態様では、本発明の方法は、ウイルス由来因子を細胞に提供することを含むが、ワクシニアウイルスＢ１８Ｒ、ワクシニアウイルスＥ３及びワクシニアウイルスＫ３の一又は複数を細胞に提供することを含まず、好ましくはワクシニアウイルスＢ１８Ｒ、ワクシニアウイルスＥ３及びワクシニアウイルスＫ３の何れかを細胞に提供することを含まず、より好ましくは、ウイルス由来因子以外のＩＦＮ応答の如何なる阻害剤も細胞に提供することを含まない。
一実施態様では、ウイルス由来因子を細胞に提供することは、ウイルス由来因子が提供されない状況と比較して、細胞におけるＲＮＡの安定性及び／又は発現を増強する。
一実施態様では、細胞におけるＲＮＡの発現の増強は、好ましくは、細胞におけるＲＮＡの発現レベルの増加及び／又は発現の持続時間の増加を含む。
一実施態様では、ウイルス由来因子を細胞に提供することは、ウイルス由来因子が提供されない状況と比較して細胞生存率を高める。
一実施態様では、細胞はバリア機能を有する細胞である。一実施態様では、細胞は線維芽細胞、ケラチノサイト、上皮細胞、又は内皮細胞であり、内皮細胞は好ましくは心臓の内皮細胞、肺の内皮細胞、又は臍静脈内皮細胞である。一実施態様では、細胞はＴ細胞又は抗原提示細胞である。一実施態様では、細胞はヒト細胞である。
本発明はまた幹細胞特性を有する細胞を提供するための方法であって、（ｉ）体細胞を含む細胞集団を提供する工程、（ｉｉ）トスカーナウイルスＮＳｓタンパク質又はトスカーナウイルスＮＳｓタンパク質の機能的バリアントを含むウイルス由来因子を体細胞に提供する工程、（ｉｉｉ）一又は複数のリプログラミング因子をコードするＲＮＡを体細胞に導入する工程、及び（ｉｖ）幹細胞特性を有する細胞の発生を可能にする工程を含む、方法に関する。
一実施態様では、ウイルス由来因子は、トスカーナウイルスＮＳｓタンパク質を含む。
一実施態様では、ＲＮＡは体細胞に繰り返し導入される。一実施態様では、ＲＮＡは、エレクトロポレーション又はリポフェクションにより体細胞に導入される。
一実施態様では、ＲＮＡはインビトロ転写ＲＮＡである。
一実施態様では、ウイルス由来因子を体細胞に提供することは、ウイルス由来因子をコードするＲＮＡなどの核酸を体細胞に導入することを含む。
一実施態様では、本発明の方法は、（ｉ）細胞外ＩＦＮによるＩＦＮ受容体の結合を防止すること、及び／又は（ｉｉ）細胞内ＩＦＮシグナル伝達を阻害することを更に含みうる。よって、一実施態様では、本発明の方法は、ワクシニアウイルスＢ１８Ｒ、ワクシニアウイルスＥ３及びワクシニアウイルスＫ３の一又は複数、例えばワクシニアウイルスＢ１８Ｒ及び／又はワクシニアウイルスＥ３を体細胞に提供することを含む。一実施態様では、ワクシニアウイルスＢ１８Ｒ、ワクシニアウイルスＥ３及びワクシニアウイルスＫ３の一又は複数を体細胞に提供することは、それをコードするＲＮＡなどの核酸を体細胞に導入することを含む。
しかし、本発明によれば、トスカーナウイルス由来のウイルスエスケープタンパク質ＮＳ（Ｎ）を使用して、目的のタンパク質のＲＮＡベースの発現を成功させるためにＥＫＢ（Ｅ３、Ｋ３、Ｂ１８Ｒ）を完全に置換できることが観察された。よって、一実施態様では、本発明の方法は、ウイルス由来因子を体細胞に提供することを含むが、ワクシニアウイルスＢ１８Ｒ、ワクシニアウイルスＥ３及びワクシニアウイルスＫ３の一又は複数を体細胞に提供することを含まず、好ましくはワクシニアウイルスＢ１８Ｒ、ワクシニアウイルスＥ３及びワクシニアウイルスＫ３の何れかを体細胞に提供することを含まず、より好ましくはウイルス由来因子以外のＩＦＮ応答の如何なる阻害剤も体細胞に提供することを含まない。
一実施態様では、ウイルス由来因子を体細胞に提供することは、ウイルス由来因子が提供されない状況と比較して、体細胞におけるＲＮＡの安定性及び／又は発現を増強する。
一実施態様では、体細胞におけるＲＮＡの発現の増強は、好ましくは、体細胞におけるＲＮＡの発現レベルの増加及び／又は発現の持続時間の増加を含む。
一実施態様では、ウイルス由来因子を体細胞に提供することは、ウイルス由来因子が提供されない状況と比較して細胞生存率を向上させる。
一実施態様では、本方法は、幹細胞特性を有する細胞への体細胞のリプログラミングを増強するｍｉＲＮＡを体細胞に導入することを更に含む。
一実施態様では、一又は複数のリプログラミング因子は、ＯＣＴ４とＳＯＸ２を含む。一又は複数のリプログラミング因子は、ＫＬＦ４及び／又はｃ－ＭＹＣ及び／又はＮＡＮＯＧ及び／又はＬＩＮ２８を更に含みうる。一実施態様では、一又は複数のリプログラミング因子は、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４及びｃ－ＭＹＣを含み、更にＬＩＮ２８と場合によってはＮＡＮＯＧを含みうる。一実施態様では、一又は複数のリプログラミング因子は、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ及びＬＩＮ２８を含む。
一実施態様では、本方法は、少なくとも一種のヒストンデアセチラーゼ阻害剤の存在下で体細胞を培養する工程を更に含み、少なくとも一種のヒストンデアセチラーゼ阻害剤は、好ましくはバルプロ酸、酪酸ナトリウム、トリコスタチンＡ及び／又はスクリプタイドを含む。
一実施態様では、幹細胞特性を有する細胞の発生を可能にする工程は、胚性幹細胞培養条件下で体細胞を培養することを含む。
一実施態様では、幹細胞特性は、胚性幹細胞の形態を含む。
一実施態様では、幹細胞特性を有する細胞は、正常な核型を有し、テロメラーゼ活性を発現し、胚性幹細胞に特徴的な細胞表面マーカーを発現し、及び／又は胚性幹細胞に特徴的な遺伝子を発現する。
一実施態様では、幹細胞特性を有する細胞は多能性状態を示す。
一実施態様では、幹細胞特性を有する細胞は、三つ全ての一次胚葉の高度な派生物に分化する発生能を有する。
一実施態様では、体細胞は、線維芽細胞、例えば肺線維芽細胞、包皮線維芽細胞又は皮膚線維芽細胞、ケラチノサイト又は内皮前駆細胞である。好ましくは、体細胞はヒト細胞である。
本発明はまた分化した細胞型を提供するための方法であって、（ｉ）本発明に係る幹細胞特性を有する細胞を提供するための方法を使用して、幹細胞特性を有する細胞を提供する工程と、（ｉｉ）分化した細胞型への部分的又は完全な分化を誘導し又は方向付ける条件下で幹細胞特性を有する細胞を培養する工程を含む、方法に関する。
本発明はまたトスカーナウイルスＮＳｓタンパク質又はトスカーナウイルスＮＳｓタンパク質の機能的バリアントを含むウイルス由来因子をコードするＲＮＡなどの核酸を含む組成物に関する。更に、本発明はまた本発明の組成物を含むキットに関する。一実施態様では、本発明の組成物又はキットは、本発明の方法において有用である。従って、キットは、ここに記載の方法におけるキットの使用に関する印刷された説明書などの説明書を含みうる。本発明の組成物又はキットの様々な実施態様は、本発明の方法について上に記載している。
一実施態様では、本発明の組成物又はキットは、発現のために細胞に導入されるＲＮＡ、例えば、一又は複数のリプログラミング因子などの目的の一又は複数のペプチド又はタンパク質をコードするＲＮＡを含む。
本発明は、例えば、目的のペプチド又はタンパク質の発現を、そのような目的のペプチド又はタンパク質をコードするＲＮＡで細胞をトランスフェクションする際に、増加させるために利用されうる。より具体的には、組換えタンパク質を産生する場合、細胞ベースの系における組換えタンパク質の発現のために本発明の方法及び薬剤を使用することが可能である。これにより、とりわけ生産コストの削減が可能になる。
本発明の方法及び薬剤を遺伝子治療用途に使用することもまた可能である。従って、トランスフェクトされるＲＮＡは遺伝子治療ベクターであり得、導入遺伝子の発現に使用されうる。細胞は、これらのベクターで、例えばリンパ球又は樹状細胞においてインビトロで、又は直接投与によりインビボでトランスフェクトすることができる。
ＲＮＡは、例えば、適用可能な分野が、細胞内にインビトロでトランスフェクトされるかインビボで直接投与されるＲＮＡベースのワクチンである遺伝子の一過性発現、例えば細胞において分化過程を開始させ又はタンパク質の機能を研究するためのインビトロでの機能的組換えタンパク質の一過性発現、及び特に医薬としてのインビボでの、エリスロポエチン、ホルモン、凝固阻害剤等々の機能的組換えタンパク質の一過性発現に用いることができる。
ＲＮＡは、特に抗原提示細胞をトランスフェクトするために、従って提示される抗原を送達するため、また抗原提示細胞にインビトロ及びインビボで提示される前記抗原をロードするためのツールとして使用することができる。そのような抗原提示細胞は、Ｔ細胞、特にＣＤ４＋及び／又はＣＤ８＋Ｔ細胞を刺激するために使用することができる。
以下に本発明を詳細に説明するが、本発明はここに記載の特定の方法論、プロトコル及び試薬には、これらは変わりうるので、限定されないことを理解されたい。また、ここで使用される用語は、特定の実施態様を説明するためのみのものであり、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される本発明の範囲を限定するものではないこともまた理解されたい。別の定義がなされない限り、ここで使用される全ての技術用語及び科学用語は、当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。
次に、本発明の要素を説明する。これらの要素は特定の実施態様と共に列挙されているが、更なる実施態様を創出するために、それらを任意の方法及び任意の数で組み合わせてもよいことを理解されたい。様々に説明された実施例及び好ましい実施態様は、明示的に説明された実施態様のみに本発明を限定するように解釈されるべきではない。この説明は、明示的に説明された実施態様を任意の数の開示された及び／又は好ましい要素と組み合わせる実施態様を裏付け、包含すると理解されるべきである。更に、この出願における全ての説明された要素のあらゆる並び替えと組み合わせが、文脈がそうでないことを示さない限り、本出願の説明により開示されているとみなされるべきである。
好ましくは、ここで使用される用語は、“A multilingual glossary of biotechnological terms: (IUPAC Recommendations)”, H.G.W. Leuenberger, B. Nagel,及びH. Kolbl編, Helvetica Chimica Acta, CH-4010 Basel, Switzerland, (1995)に記載されている通りに定義される。
本発明の実施には、特に明記しない限り、当該分野の文献で説明されている化学、生化学、細胞生物学、免疫学、及び組換えＤＮＡ技術の一般的な方法が用いられる（例えば、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2版, J. Sambrook等編, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor 1989を参照）。
本明細書と続く特許請求の範囲を通して、文脈が他の定義を必要としない限り、「含む（comprise）」という語、及び「含む（comprises）」及び「含む（comprising）」などの変形語は、述べられたメンバー、整数又は工程又はメンバー群、整数群又は工程群を包含することを意味し、任意の他のメンバー、整数又は工程又はメンバー群、整数群又は工程群を除外することを意味していないことが理解される。本発明を記載する文脈において（特に特許請求の範囲において）使用される「ａ」及び「ａｎ」及び「ｔｈｅ」という用語及び類似の引用は、ここで別の定義を示さない限り又は明らかに文脈と矛盾しない限り、単数と複数の双方を包含すると解釈される。ここでの値の範囲の列挙は、単に、その範囲内に入る個々の各値を個別に参照する簡単な方法となることを意図している。ここで別の定義が示されない限り、個々の各値は、ここで個々に記載されているかのように、明細書に組み込まれている。ここに記載された全ての方法は、ここに別の方法が示されない限り、又は文脈と明らかに矛盾しない限り、任意の適切な順序で実施されうる。ここで提供されるありとあらゆる例、又は例示的な文言（例えば、「など」）の使用は、単に本発明をよりよく例証することを意図しており、特許請求の範囲に記載等された発明の範囲を限定するものではない。本明細書中の如何なる文言も、本発明の実施に不可欠な請求項非記載の要素を示していると解釈されるべきではない。
本明細書の全体を通して幾つかの文献が引用される。ここで引用される各文献（全ての特許、特許出願、科学刊行物、製造業者の仕様書、説明書等々を含む）は、上記又は下記にかかわらず、その全体が出典明示によりここに援用される。ここの如何なるものも、本発明が先行発明のためにそのような開示に先行する権利を与えられないという自認として解釈されるべきではない。
本発明によれば、トスカーナウイルス由来のウイルスエスケープタンパク質ＮＳｓ（Ｎ）はＩＦＮ応答の強力な阻害剤であり、ＲＮＡによってコードされた対象のペプチド又はタンパク質の発現を増強するためにＲＮＡトランスフェクションと組み合わせて使用できることが観察された。
一実施態様では、本発明の方法はインビトロ法である。一実施態様では、本発明の方法は、例えば手術による、ヒト又は動物対象からの細胞の除去を含むか又は含まない。本発明の方法から得られる細胞は、対象に投与されうる。細胞は、対象に対して自己、同系、同種異系又は異種でありうる。トランスフェクトされた細胞は、当該分野で知られた任意の手段を使用して対象に導入されうる。
他の実施態様では、細胞は、患者などの対象に存在していてもよい。これらの実施態様では、本発明の方法は、対象へのＲＮＡの投与を含むインビボ方法である。
本発明の一実施態様では、例えば一又は複数のリプログラミング因子などの、発現されるペプチド又はタンパク質をコードするＲＮＡの導入、あるいはＲＮＡの最初の導入（例えば、トランスフェクションを繰り返す場合）の前、同時及び／又は後に、トスカーナウイルスＮＳｓタンパク質又はトスカーナウイルスＮＳｓタンパク質の機能的バリアントを含むウイルス由来因子が細胞に提供される。一実施態様では、ＲＮＡの導入あるいはＲＮＡの最初の導入（例えば、トランスフェクションを繰り返す場合）の後、好ましくは直後に、トスカーナウイルスＮＳｓタンパク質又はトスカーナウイルスＮＳｓタンパク質の機能的バリアントを含むウイルス由来因子が細胞に提供される。
特に好ましい一実施態様では、ウイルス由来因子をコードするＲＮＡを細胞に導入することにより、トスカーナウイルスＮＳｓタンパク質又はトスカーナウイルスＮＳｓタンパク質の機能的バリアントを含むウイルス由来因子が細胞に提供される。本発明の一実施態様では、ウイルス由来因子をコードするＲＮＡは、発現されるペプチド又はタンパク質をコードするＲＮＡの導入、あるいは発現されるペプチド又はタンパク質をコードするＲＮＡの最初の導入（例えば、トランスフェクションを繰り返す場合）の前、同時、及び／又は後に、細胞に導入される。一実施態様では、ウイルス由来因子をコードするＲＮＡは、発現されるペプチド又はタンパク質をコードするＲＮＡの導入、あるいは発現されるペプチド又はタンパク質をコードするＲＮＡの最初の導入（例えば、トランスフェクションを繰り返す場合）の後、好ましくは直後に、細胞に導入される。
ブニヤウイルス科には、動物に感染するオルソブニヤウイルス属、フレボウイルス属、ハンタウイルス属、及びナイロウイルス属、及び植物に感染するトスポウイルス属が含まれる。フレボウイルスは、スナバエ熱群とウークニエミ群で構成される。リフトバレー熱ウイルス（ＲＶＦＶ）、トスカーナウイルス（ＴＯＳＶ）、スナバエ熱シチリアウイルス（ＳＦＳＶ）、及びプンタトロウイルス（ＰＴＶ）を含むスナバエ熱群の幾つかのメンバーは、ヒトに対して病原性である。ＴＯＳＶは、Ｌ（大）、Ｍ（中）、Ｓ（小）と指定される三つのセグメントを含む、マイナスセンス一本鎖ＲＮＡゲノムを保有するエンベロープウイルスである。Ｌセグメントはウイルスポリメラーゼ（Ｌ）をコードし、Ｍセグメントはエンベロープ糖タンパク質Ｇｎ及びＧｃをコードし、Ｓセグメントは核タンパク質（Ｎ）をコードする。加えて、Ｓセグメントはまたアンビセンス式で非構造タンパク質ＮＳｓをコードする。フレボウイルスＮＳｓタンパク質は、宿主の自然免疫応答からのウイルス回避において重要な役割を果たす。
本発明によれば、「トスカーナウイルスＮＳｓタンパク質」という用語は、トスカーナウイルス由来の非構造タンパク質ＮＳｓに関する。特に、この用語は、次のアミノ酸配列を含むタンパク質に関する：
MQSRAVILKHRSGSGHKRSLPRFYIDCDLDTFDFEKGCSLIENEFPIYINNYEVVYKSKPTLSHFLIEKEFPAVLGPGMISAVRTRLYEPTMRELYQESIHQLKRNNKKYLLSALRWPTGIPTLEFIDYYFEELLFLSEFDPGSIQRYLKLLVKASGLYNSTIEEQLVEIHRRVLIEGKKHGLTAFDLPGNDILGDICVVQAARVTRLVAKTFSKMTRDTHLMIYFSISPVELVLNKLDKKEDKRAKAKGLMSMCAARSYDYFMRTDLGFRETALSTFWAKDWPTLQETILSDKRCLKEDMRVTKWLPSPPHYPPL（配列番号：１）。
「トスカーナウイルスＮＳｓタンパク質の機能的バリアント」という用語は、トスカーナウイルスＮＳｓタンパク質と同様の機能を示す任意のタンパク質、特に任意のウイルス由来タンパク質に関する。特定の一機能は、細胞においてペプチド又はタンパク質をコードするＲＮＡの発現を高めることである。従って、この用語には、トスカーナウイルスＮＳｓタンパク質の機能的断片又はトスカーナウイルスＮＳｓタンパク質の機能的配列バリアント又はその断片を含むタンパク質が含まれる。
アミノ酸配列（ペプチド又はタンパク質）に関する「断片」は、アミノ酸配列の一部、すなわち、Ｎ末端及び／又はＣ末端で短縮されたアミノ酸配列を表す配列に関する。Ｃ末端で短縮された断片（Ｎ末端断片）は、例えば、オープンリーディングフレームの３’末端を欠く切断型オープンリーディングフレームの翻訳によって、取得可能である。Ｎ末端で短縮された断片（Ｃ末端断片）は、例えば、切断型オープンリーディングフレームが翻訳を開始する役割を果たす開始コドンを含む限り、オープンリーディングフレームの５’末端を欠く切断型オープンリーディングフレームの翻訳によって、取得可能である。アミノ酸配列の断片は、例えばアミノ酸配列からのアミノ酸残基の少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％を含む。
「バリアント」という用語には、全てのスプライスバリアント、翻訳後修飾バリアント、コンフォメーション、アイソフォーム、及び種ホモログ、特に細胞によって自然に発現されるものが含まれる。
本発明の目的では、アミノ酸配列の「バリアント」は、アミノ酸挿入バリアント、アミノ酸付加バリアント、アミノ酸欠失バリアント及び／又はアミノ酸置換バリアントを含む。アミノ酸挿入バリアントは、特定のアミノ酸配列における単一又は二つ以上のアミノ酸の挿入を含む。挿入を有するアミノ酸配列バリアントの場合、一又は複数のアミノ酸残基がアミノ酸配列の特定の部位に挿入されるが、得られる産物の適切なスクリーニングを伴うランダム挿入もまた可能である。アミノ酸付加バリアントは、１、２、３、５、１０、２０、３０、５０、又はそれ以上のアミノ酸など、一又は複数のアミノ酸のアミノ及び／又はカルボキシ末端融合を含む。アミノ酸欠失バリアントは、１、２、３、５、１０、２０、３０、５０、又はそれ以上のアミノ酸の除去など、配列からの一又は複数のアミノ酸の除去によって特徴付けられる。欠失はタンパク質のどの位置にあってもよい。タンパク質のＮ末端及び／又はＣ末端に欠失を含むアミノ酸欠失バリアントは、Ｎ末端及び／又はＣ末端切断バリアントとも呼ばれる。アミノ酸置換バリアントは、配列内の少なくとも一つの残基が除去され、その場所に別の残基が挿入されていることを特徴とする。相同タンパク質又はペプチド間で保存されていないアミノ酸配列の位置にある修飾、及び／又はアミノ酸を類似の性質を有する他のアミノ酸で置換するものが好ましい。好ましくは、タンパク質バリアントのアミノ酸変化は、保存的アミノ酸変化、すなわち、同様に荷電した又は未荷電のアミノ酸の置換である。保存的アミノ酸変化には、その側鎖に関連したアミノ酸のファミリーの一つの置換が含まれる。天然に生じるアミノ酸は、一般に、酸性（アスパラギン酸、グルタミン酸）、塩基性（リジン、アルギニン、ヒスチジン）、非極性（アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、及び非荷電の極性（グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、スレオニン、チロシン）アミノ酸の４ファミリーに分類される。フェニルアラニン、トリプトファン、及びチロシンは、芳香族アミノ酸としてまとめて分類される場合がある。
好ましくは、所定のアミノ酸配列と、該所定のアミノ酸配列のバリアントであるアミノ酸配列との間の類似性、好ましくは同一性の度合は、少なくとも約６０％、６５％、７０％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％であろう。類似性又は同一性の度合は、好ましくは、参照アミノ酸配列の全長の少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％又は約１００％であるアミノ酸領域に対して与えられる。例えば、参照アミノ酸配列が２００のアミノ酸からなる場合、類似性又は同一性の度合は、好ましくは、少なくとも約２０、少なくとも約４０、少なくとも約６０、少なくとも約８０、少なくとも約１００、少なくとも約１２０、少なくとも約１４０、少なくとも約１６０、少なくとも約１８０、又は約２００のアミノ酸、好ましくは連続アミノ酸に対して与えられる。好ましい実施態様では、類似性又は同一性の度合は、参照アミノ酸配列の全長に対して与えられる。配列類似性、好ましくは配列同一性を決定するためのアライメントは、好ましくは最良配列アラインメントを使用し、例えばＡｌｉｇｎを使用し、標準設定を使用し、好ましくはＥＭＢＯＳＳ：：ｎｅｅｄｌｅ，Ｍａｔｒｉｘ：Ｂｌｏｓｕｍ６２，Ｇａｐ Ｏｐｅｎ １０．０，Ｇａｐ Ｅｘｔｅｎｄ０．５を使用する、当該分野で既知のツールを用いて行うことができる。
「配列類似性」は、同一であるか保存的アミノ酸置換を表すアミノ酸のパーセントを示す。二つのアミノ酸配列間の「配列同一性」は、配列間で同一であるアミノ酸又はヌクレオチドのパーセントを示す。
「パーセント同一性」という用語は、最良のアライメント後に得られた、比較される二つの配列間で同一であるアミノ酸残基のパーセントを示すことが意図され、このパーセントは純粋に統計的であり、二つの配列間の差はランダムにその全長にわたって分布している。二つのアミノ酸配列間の配列比較は、通常、これらの配列を最適に整列させた後に比較することにより実施され、前記比較は、配列類似性の局所領域を特定し比較するために、セグメント毎に又は「比較ウインドウ」により実施される。比較のための配列の最適なアラインメントは、手作業のほか、Ｓｍｉｔｈ及びＷａｔｅｒｍａｎ（1981, Ads App. Math. 2, 482）の局所相同性アルゴリズムによって、Ｎｅｄｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈ（1970, J. Mol. Biol. 48, 443）の局所相同性アルゴリズムによって、Ｐｅａｒｓｏｎ及びＬｉｐｍａｎ（1988, Proc. Natl Acad. Sci. USA 85, 2444）の類似性検索法によって、又はこれらのアルゴリズムを使用するコンピュータープログラム（Wisconsin Genetics Software Package（Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wis.）のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ Ｐ、ＢＬＡＳＴ Ｎ及びＴＦＡＳＴＡ）によって、作り出されうる。
パーセント同一性は、比較されている二つの配列間の同一位置の数を決定し、この数を比較される位置の数で除算し、得られた結果に１００を掛けて、これら二つの配列間のパーセント同一性を得ることによって計算される。
本発明によれば、相同アミノ酸配列は、アミノ酸残基の少なくとも４０％、特に少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、少なくとも９８又は少なくとも９９％の同一性を示す。
ここに記載のアミノ酸配列バリアントは、例えば組換えＤＮＡ操作により、当業者により容易に調製されうる。置換、付加、挿入又は欠失を有するペプチド又はタンパク質を調製するためのＤＮＡ配列の操作は、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ等（１９８９）に詳細に記載されている。更に、ここに記載のペプチド及びアミノ酸バリアントは、例えば、固相合成及び類似の方法などの既知のペプチド合成技術を用いて容易に調製することができる。
本発明は、「ペプチド」及び「タンパク質」という用語に含まれる、ここに記載のペプチド又はタンパク質の誘導体を含む。本発明によれば、タンパク質及びペプチドの「誘導体」は、タンパク質及びペプチドの修飾形態である。そのような修飾は、任意の化学修飾を含み、タンパク質又はペプチドに関連する任意の分子、例えば炭水化物、脂質及び／又はタンパク質又はペプチドの単一又は複数の置換、欠失及び／又は付加を含む。一実施態様では、タンパク質又はペプチドの「誘導体」は、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、パルミトイル化、ミリストイル化、イソプレニル化、脂質化、アルキル化、誘導体化、保護／ブロッキング基の導入、タンパク分解性切断又は抗体又は別の細胞リガンドへの結合から生じる修飾アナログを含む。「誘導体」という用語はまた前記タンパク質及びペプチドの全ての機能的な化学的均等物にも拡張される。好ましくは、修飾ペプチドは、増加した安定性及び／又は増加した免疫原性を有する。
一実施態様では、本発明の方法は、（ｉ）細胞外ＩＦＮによるＩＦＮ受容体の結合を防止すること、及び／又は（ｉｉ）細胞内ＩＦＮシグナル伝達を阻害することを更に含みうる。これは、細胞に（ｉ）細胞外ＩＦＮによるＩＦＮ受容体の結合を防ぐ薬剤及び／又は（ｉｉ）細胞内ＩＦＮシグナル伝達を阻害する薬剤を提供することによって達成することができる。
一実施態様では、細胞は処理されて（ｉ）細胞外ＩＦＮによるＩＦＮ受容体の結合を防止し、及び／又は（ｉｉ）発現されるペプチド又はタンパク質をコードするＲＮＡの導入、あるいはＲＮＡの最初の導入（例えば、トランスフェクションが繰り返される場合）の前、同時及び／又は後に細胞内ＩＦＮシグナル伝達を阻害する。一実施態様では、細胞は処理されて、（ｉ）細胞外ＩＦＮによるＩＦＮ受容体の結合を防止し、及び／又は（ｉｉ）ＲＮＡの導入、あるいはＲＮＡの最初の導入（例えば、トランスフェクションが繰り返される場合）の後、好ましくは直後に細胞内ＩＦＮシグナル伝達を阻害する。
インターフェロンは、抗ウイルス、抗増殖及び免疫調節活性を特徴とする重要なサイトカインである。インターフェロンは二つのタイプに分類されうる。ＩＦＮ－γは唯一のＩＩ型インターフェロンである；他の全てはＩ型インターフェロンである。Ｉ型とＩＩ型のインターフェロンは、遺伝子構造（ＩＩ型インターフェロン遺伝子には三つのエクソンがある；Ｉ型は一つ）、染色体の位置（ヒトでは、ＩＩ型は染色体１２に位置する；Ｉ型インターフェロン遺伝子は結合され、染色体９上にある）、及びそれらが生成される組織型（Ｉ型インターフェロンは遍在的に合成され、ＩＩ型はリンパ球によって合成される）において異なる。Ｉ型インターフェロンは細胞受容体への結合を互いに競合的に阻害するが、ＩＩ型インターフェロンには異なる受容体がある。本発明によれば、「インターフェロン」又は「ＩＦＮ」という用語は、好ましくは、Ｉ型インターフェロン、特にＩＦＮ－α及びＩＦＮ－βに関する。
ＩＦＮは、ウイルス複製サイクルを妨げる可能性がある多量の抗ウイルス遺伝子の発現を誘導する。本発明によれば、「抗ウイルス活性エフェクタータンパク質」という用語は、その転写がＩ型ＩＦＮによってシグナル伝達されるＩＦＮ刺激遺伝子（ＩＳＧ）によってコードされる一群のタンパク質に関する。これらのタンパク質は、侵入するウイルスを排除することを目的として、異なるウイルス成分とウイルスライフサイクルの異なる段階を標的とする。「抗ウイルス活性エフェクタータンパク質」は、ウイルス転写を個別にブロックし、ウイルスＲＮＡを分解させ、翻訳を阻害し、タンパク質機能を改変してウイルス複製の全工程を制御する様々なエフェクター経路に関与している。そのようなタンパク質には、２’，５’－オリゴアデニル酸合成酵素（ＯＡＳ）、特に２’，５’－オリゴアデニル酸合成酵素１（ＯＡＳ１）、ＲＮＡ依存性プロテインキナーゼＲ（ＰＫＲ）、及びＲＮａｓｅＬが含まれる。ＰＫＲとＯＡＳは両方ともｄｓＲＮＡによって直接活性化される。従って、ｄｓＲＮＡはこれらの抗ウイルス活性エフェクタータンパク質の発現を誘導し、それらの活性化にもまた必要である。
本発明によれば、「細胞外ＩＦＮによるＩＦＮ受容体の結合を防止する」という用語は、その特異的受容体でのＩＦＮ、特にＩ型ＩＦＮの相互作用の阻害、すなわち遮断又は低減、従ってＩＦＮ機能の阻害又は低減に関する。細胞外ＩＦＮによるＩＦＮ受容体の結合は、例えば、細胞外ＩＦＮのための結合剤の提供により防止されうる。細胞外ＩＦＮによるＩＦＮ受容体の結合を防止することに一又は複数のタンパク質又はペプチド、例えばここに開示されるタンパク質又はペプチド、例えば細胞外ＩＦＮのための一又は複数の結合剤が関与する本発明の態様は、例えば核酸を細胞に導入することによる、これら一又は複数のタンパク質又はペプチドをコードする核酸、特にＲＮＡの細胞への提供を含みうる。
例えば、Ｂ１８Ｒタンパク質は、強力な中和活性を持つマウス、ヒト、ウサギ、ブタ、ラット、及びウシのＩ型インターフェロンに特異性を有するワクシニアウイルスでコードされたＩ型インターフェロン受容体である。Ｂ１８Ｒタンパク質はＷｅｓｔｅｒｎ Ｒｅｓｅｒｖｅワクシニアウイルス株のＢ１８Ｒ遺伝子によってコードされる。６０～６５ｋＤの糖タンパク質はインターロイキン－１受容体に関連しており、クラスＩＩサイトカイン受容体ファミリーに属する他のＩ型ＩＦＮ受容体とは異なり、免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーである。Ｂ１８Ｒタンパク質は、ヒトＩＦＮアルファに対して高い親和性（ＫＤ，１７４ｐＭ）を有している。ウイルス宿主応答修飾因子の中で、Ｂ１８Ｒタンパク質は、可溶性細胞外、並びに細胞表面タンパク質として存在し、自己分泌及び傍分泌ＩＦＮ機能の両方の遮断を可能にするという点で独特である。Ｂ１８Ｒタンパク質は、ヒト細胞上のＩＦＮ－アルファ１、ＩＦＮ－アルファ２、ＩＦＮ－アルファ－８／１／８、及びＩＦＮ－オメガの抗ウイルス効力を阻害することが示されている。可溶性Ｂ１８Ｒタンパク質は、ＩＦＮ－アルファ、ベータ、デルタ、カッパを含むＩ型インターフェロンを中和するのに非常に強力である。
細胞外ＩＦＮによるＩＦＮ受容体の結合は、例えばＩＦＮ、特に細胞外ＩＦＮのレベルを低下させることにより、更に防止されうる。一実施態様では、細胞外ＩＦＮによるＩＦＮ受容体の結合は、ＩＦＮ遺伝子発現を妨げることにより防止される。例えば、Ｃ型肝炎ウイルスのセリンプロテアーゼＮＳ３／４Ａタンパク質複合体は、ＩＦＮプロモーター活性を妨害し低下させることができ、ＩＦＮ遺伝子発現の特異的な阻害剤である。
本発明によれば、「細胞内ＩＦＮシグナル伝達」という用語は、その特異的受容体と相互作用するＩＦＮにより活性化される細胞内シグナル伝達事象及びエフェクター機能、特に抗ウイルス機能に関し、ＩＦＮにより誘導されるタンパク質、特に抗ウイルス活性のエフェクタータンパク質の機能を含む。特に、「細胞内ＩＦＮシグナル伝達」という用語には、ＰＫＲ依存性経路の一部であるタンパク質、特にＰＫＲ及びｅＩＦ２－アルファ、及び／又はＯＡＳ依存性経路の一部であるタンパク質、特にＯＡＳ及びＲＮａｓｅＬによって発揮されるシグナル伝播及びエフェクター機能、特に抗ウイルス機能が含まれる。
「細胞内ＩＦＮシグナル伝達の阻害」という用語は、細胞内ＩＦＮシグナル伝達の阻害又は低減に関し、細胞内ＩＦＮシグナル伝達に関与するタンパク質、特にＰＫＲ依存性経路及び／又はＯＡＳ依存性経路の一部であるタンパク質の発現、活性又は活性化を阻害することにより達成されうる。例えば、多くのウイルスは、ＰＫＲ及びＯＡＳ／ＲＮａｓｅ Ｌ経路に対抗する機構を進化させてきた。これらの機構は、細胞内ＩＦＮシグナル伝達を阻害するために本発明によって使用されうる。細胞内ＩＦＮシグナル伝達の阻害に一又は複数のタンパク質又はペプチド、例えばここに開示されるタンパク質又はペプチド、例えばＰＫＲ依存性経路及び／又はＯＡＳ依存性経路を阻害する一又は複数のタンパク質又はペプチドが関与する本発明の態様は、例えば核酸を細胞に導入することによる、これらの一又は複数のタンパク質又はペプチドをコードする核酸、特にＲＮＡの細胞への提供を含みうる。
本発明によれば、ＰＫＲ依存性経路は、ＰＫＲの活性又は活性化を阻害し又は低減する薬剤によって、又はｅＩＦ２－アルファを脱リン酸化するか又はそのリン酸化を防止し、それによってＰＫＲ誘発シグナルを停止する薬剤によって阻害されうる。例えば、細胞内ＩＦＮシグナル伝達は、ＰＫＲシグナル伝達カスケードに対するウイルス防御機構の任意のものを利用することにより、本発明によって阻害されうる。この点に関し、本発明は、デコイｄｓＲＮＡ（例えば、アデノウイルスＶＡＩ ＲＮＡ；エプスタイン－バーウイルスＥＢＥＲ；ＨＩＶ ＴＡＲ）、ＰＫＲ分解をもたらす化合物（例えば、ポリオウイルス２Ａｐｒｏ）、例えばウイルスｄｓＲＮＡを隠すことによってＰＫＲの活性化を阻害する化合物（例えば、ワクシニアウイルスＥ３／Ｅ３Ｌ；レオウイルスσ３；インフルエンザウイルスＮＳ１、単純ヘルペスウイルス１型（ＨＳＶ－１）ＵＳ１１）、二量体化を遮断する化合物（例えば、インフルエンザウイルスｐ５８ＩＰＫ；Ｃ型肝炎ウイルスＮＳ５Ａ）、偽基質（例えば、ワクシニアウイルスＫ３／Ｋ３Ｌ；ＨＩＶ Ｔａｔ）又は基質の脱リン酸化（例えば、単純ヘルペスウイルスＩＣＰ３４．５）の使用を含みうる。ワクシニアウイルスＥ３は、ｄｓＲＮＡに結合して隔離し、ＰＫＲ及びＯＡＳの活性化を防ぐ２５ｋＤａのｄｓＲＮＡ結合タンパク質（遺伝子Ｅ３Ｌによってコードされる）である。Ｅ３はＰＫＲに直接結合でき、その活性を阻害し、ｅＩＦ２－アルファのリン酸化が低減される。ワクシニアウイルス遺伝子Ｋ３Ｌは、ＰＫＲの非リン酸化可能偽基質として作用し、ｅＩＦ２－アルファのリン酸化を競合的に阻害するｅＩＦ２－アルファサブユニットの１０．５ｋＤａのホモログをコードする。ワクシニアウイルスＣ７／Ｃ７ＬはｅＩＦ２－アルファのリン酸化を阻害する。ＨＳＶ－１由来のＩＣＰ３４．５タンパク質は、細胞性ＰＰ１ホスファターゼの調節サブユニットとして機能し、それを方向付けしてｅＩＦ２－アルファを脱リン酸化し、それによってＰＫＲ誘導シグナルを停止する。マウスサイトメガロウイルス（ＭＣＭＶ）タンパク質ｍ１４２及びｍ１４３は、ＰＫＲ活性化、翻訳開始因子ｅＩＦ２のリン酸化、及びその後のタンパク質合成シャットオフを阻害するｄｓＲＮＡ結合タンパク質として特徴付けられている。
デコイＲＮＡは、酵素を実際の基質ではなく偽基質に結合させ、よって酵素の活性を遮断するために、酵素のＲＮＡ基質と類似の構造を有する偽基質ＲＮＡである。
本発明によれば、「ＲＮＡ依存性プロテインキナーゼ（ＰＫＲ）の活性を低下させる」という用語は、ＰＫＲの活性が人によって低下しない／低下しなかった正常な状況、特に細胞内の正常な状況と比較した、ＰＫＲのより低い程度のホモ二量体化、ＰＫＲのより低い程度の自己リン酸化及び／又はｅＩＦ２－アルファなどのＰＫＲのキナーゼ基質である標的のより低い程度のリン酸化をもたらす処置に関する。好ましくは、前記用語は、ＰＫＲのより低い程度の自己リン酸化及び／又はＰＫＲのキナーゼ基質である標的のより低い程度のリン酸化をもたらす全ての処置を含む。
一実施態様では、細胞におけるＲＮＡ依存性プロテインキナーゼ（ＰＫＲ）の活性を低下させることは、ＰＫＲの発現及び／又は活性の阻害剤で細胞を処理することを含む。本発明によれば、「発現及び／又は活性を阻害する」という語句は、発現及び／又は活性の完全な又は本質的に完全な阻害、及び発現及び／又は活性の低下を含む。
一実施態様では、前記ＰＫＲ阻害剤はＰＫＲタンパク質に向けられ、好ましくはＰＫＲに特異的である。ＰＫＲは様々な方法で、例えばＰＫＲ自己リン酸化及び／又は二量体化の阻害、ＰＫＲ偽活性化因子の提供、又はＰＫＲ偽基質の提供を通じて、阻害されうる。ＰＫＲ阻害剤は、上で検討されたウイルス防御機構に関与する薬剤でありうる。例えば、ワクシニアウイルスＥ３Ｌは、おそらくｄｓＲＮＡ活性化因子を隔離することにより、ウイルス感染細胞のＰＫＲを阻害するｄｓＲＮＡ結合タンパク質をコードする。ワクシニアウイルスによってもまたコードされるＫ３は、ＰＫＲに結合することにより、偽基質阻害剤として機能する。よって、ワクシニアウイルスＥ３Ｌの提供は、ＰＫＲの阻害をもたらしうる。アデノウイルスＶＡＩ ＲＮＡ、ＨＩＶ Ｔａｔ又はエプスタイン・バーウイルスＥＢＥＲ１ ＲＮＡの提供は、ＰＫＲ偽活性化をもたらしうる。よって、例えば、ここに記載されるもののようなＰＫＲ活性を遮断する全てのウイルス因子、すなわちウイルス由来の阻害剤が、ＰＫＲの活性を低下させるために使用されうる。
一実施態様では、ＰＫＲ阻害剤は化学的阻害剤である。好ましくは、ＰＫＲ阻害剤は、ＲＮＡ誘導性ＰＫＲ自己リン酸化の阻害剤である。好ましくは、ＰＫＲ阻害剤はＰＫＲのＡＴＰ結合部位特異的阻害剤である。
一実施態様では、ＰＫＲ阻害剤は６，８－ジヒドロ－８－（１Ｈ－イミダゾール－５－イルメチレン）－７Ｈ－ピロロ［２，３－ｇ］ベンゾチアゾール－７－オンである。一実施態様では、ＰＫＲ阻害剤は２－アミノプリンである。
更なる実施態様では、ＰＫＲの活性の阻害剤は、ＰＫＲに特異的に結合する抗体である。抗体のＰＫＲへの結合は、ＰＫＲの機能を、例えば結合活性又は触媒活性を阻害することにより、妨げうる。
一実施態様では、ワクシニアウイルスＥ３及び／又はＫ３などの一又は複数のウイルス由来阻害剤で細胞を処理し、並びに一又は複数の化学的ＰＫＲ阻害剤、例えば６，８－ジヒドロ－８－（１Ｈ－イミダゾール－５－イルメチレン）－７Ｈ－ピロロ［２，３－ｇ］ベンゾチアゾール－７－オン及び／又は２－アミノプリンで細胞を処理することにより、細胞におけるＰＫＲの活性を低下させることが想定される。
本発明によれば、ＯＡＳ依存性経路は、ＯＡＳ及び／又はＲＮａｓｅＬの活性又は活性化を阻害し又は低減する薬剤によって阻害されうる。例えば、ワクシニアウイルスＥ３は、ｄｓＲＮＡに結合して隔離し、ＯＡＳの活性化を防ぐ２５ｋＤａのｄｓＲＮＡ結合タンパク質（遺伝子Ｅ３Ｌによってコードされる）である。
本発明によれば、「ＯＡＳの活性を低下させる」という用語は、好ましくは、２’，５’－オリゴアデニル酸のより低い程度の産生、従ってＲＮａｓｅＬの活性化をもたらす処置に関する。
一実施態様では、細胞におけるＯＡＳ及び／又はＲＮａｓｅＬの活性を低下させることは、ＯＡＳ及び／又はＲＮａｓｅＬの発現及び／又は活性の阻害剤で細胞を処理することを含む。本発明によれば、「発現及び／又は活性を阻害する」という語句は、発現及び／又は活性の完全な又は本質的に完全な阻害と発現及び／又は活性の低下を含む。
一実施態様では、次に「標的タンパク質」と呼ばれるＰＫＲ、ＯＡＳ又はＲＮａｓｅＬの発現の阻害は、例えば、転写を阻害するか又は転写物の分解を誘導することにより、標的タンパク質をコードする転写物、すなわちｍＲＮＡの産生を阻害するか又はそのレベルを低減させることにより、及び／又は例えば、標的タンパク質をコードする転写物の翻訳を阻害することにより、標的タンパク質の産生を阻害することにより、起こりうる。一実施態様では、前記阻害剤は、標的タンパク質をコードする核酸に特異的である。特定の実施態様では、標的タンパク質の発現の阻害剤は、標的タンパク質をコードする核酸に選択的にハイブリダイズし、それに特異的であり、それにより、その転写及び／又は翻訳を阻害（例えば、低下）する阻害性核酸（例えば、アンチセンス分子、リボザイム、ｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、又はそれをコードするＤＮＡ）である。
一実施態様では、細胞外ＩＦＮによるＩＦＮ受容体の結合の防止は、オートクリン及び／又はパラクリンＩＦＮ機能を阻害する。一実施態様では、細胞外ＩＦＮによるＩＦＮ受容体の結合の防止は、細胞外ＩＦＮのためのウイルス結合剤などの細胞外ＩＦＮのための結合剤を提供することを含む。一実施態様では、細胞外ＩＦＮのためのウイルス結合剤は、ウイルスインターフェロン受容体である。一実施態様では、細胞外ＩＦＮのためのウイルス結合剤はワクシニアウイルスＢ１８Ｒである。一実施態様では、細胞外ＩＦＮのためのウイルス結合剤は、結合剤をコードする核酸の形態で細胞に提供され、ここで、核酸は好ましくはＲＮＡである。
一実施態様では、細胞内ＩＦＮシグナル伝達を阻害することは、一又は複数のＩＦＮ誘導性抗ウイルス活性エフェクタータンパク質を阻害することを含む。一実施態様では、ＩＦＮ誘導性抗ウイルス活性エフェクタータンパク質は、ＲＮＡ依存性プロテインキナーゼ（ＰＫＲ）、２’，５’－オリゴアデニル酸合成酵素（ＯＡＳ）及びＲＮａｓｅＬからなる群から選択される。一実施態様では、細胞内ＩＦＮシグナル伝達を阻害することは、ＰＫＲ依存性経路及び／又はＯＡＳ依存性経路を阻害することを含む。一実施態様では、ＰＫＲ依存性経路の阻害は、ｅＩＦ２－アルファリン酸化の阻害を含む。一実施態様では、ｅＩＦ２－アルファリン酸化を阻害することは、ＰＫＲを阻害すること、及び／又はｅＩＦ２－アルファを模倣する偽基質を提供することを含む。一実施態様では、ｅＩＦ２－アルファを模倣する偽基質は、ｅＩＦ２－アルファを模倣するウイルス偽基質である。一実施態様では、ｅＩＦ２－アルファを模倣するウイルス偽基質はワクシニアウイルスＫ３である。一実施態様では、ｅＩＦ２－アルファを模倣するウイルス偽基質は、ウイルス偽基質をコードする核酸の形態で細胞に提供され、ここで、核酸は好ましくはＲＮＡである。一実施態様では、ＰＫＲを阻害することは、少なくとも一種のＰＫＲ阻害剤で細胞を処理することを含む。一実施態様では、ＰＫＲ阻害剤は、ＲＮＡ誘導性ＰＫＲ自己リン酸化を阻害する。一実施態様では、ＰＫＲ阻害剤は、ＰＫＲのＡＴＰ結合部位特異的阻害剤である。一実施態様では、ＰＫＲ阻害剤はイミダゾロ－オキシインドール化合物である。一実施態様では、ＰＫＲ阻害剤は、６，８－ジヒドロ－８－（１Ｈ－イミダゾール－５－イルメチレン）－７Ｈ－ピロロ［２，３－ｇ］ベンゾチアゾール－７－オン及び／又は２－アミノプリンである。一実施態様では、ＰＫＲ阻害剤はＰＫＲのウイルス阻害剤である。一実施態様では、ＰＫＲのウイルス阻害剤はワクシニアウイルスＥ３である。一実施態様では、ＰＫＲのウイルス阻害剤は、阻害剤をコードする核酸の形態で細胞に提供され、核酸は好ましくはＲＮＡである。一実施態様では、ＰＫＲを阻害することは、ＰＫＲ遺伝子の発現のサイレンシングを含む。一実施態様では、ＯＡＳ依存性経路の阻害は、ＲＮａｓｅＬの活性化の阻害を含む。一実施態様では、ＯＡＳ依存性経路の阻害は、ＯＡＳの阻害を含む。一実施態様では、ＯＡＳの阻害は、少なくとも一種のＯＡＳ阻害剤で細胞を処理することを含む。一実施態様では、ＯＡＳ阻害剤はＯＡＳのウイルス阻害剤である。一実施態様では、ＯＡＳのウイルス阻害剤はワクシニアウイルスＥ３である。一実施態様では、ＯＡＳのウイルス阻害剤は、阻害剤をコードする核酸の形態で細胞に提供される。
一実施態様では、（ｉ）細胞外ＩＦＮによるＩＦＮ受容体の結合の防止及び／又は（ｉｉ）細胞内ＩＦＮシグナル伝達の阻害の工程は、（ｉ）ワクシニアウイルスＢ１８Ｒ及び／又は（ｉｉ）ワクシニアウイルスＥ３又はワクシニアウイルスＫ３、又はその両方で細胞を処理することを含む。一実施態様では、ワクシニアウイルスＢ１８Ｒ及び／又はワクシニアウイルスＥ３及び／又はワクシニアウイルスＫ３は、ワクシニアウイルスＢ１８Ｒ及び／又はワクシニアウイルスＥ３及び／又はワクシニアウイルスＫ３を、同じ又は二つ以上の異なる核酸分子上の何れかでコードする核酸の形態で細胞に提供され、好ましくは核酸は、好ましくは細胞内で発現されるＲＮＡと場合によってはトスカーナウイルスＮＳｓタンパク質又はトスカーナウイルスＮＳｓタンパク質の機能的バリアントを含むウイルス由来因子をコードするＲＮＡと共に細胞に導入されるＲＮＡである。
トスカーナウイルス由来のウイルスエスケープタンパク質ＮＳ（Ｎ）は、ＩＦＮ応答の成功裡の阻害のためにＥＫＢ（Ｅ３、Ｋ３、Ｂ１８Ｒ）を置換できる。従って、本発明の方法は、一実施態様では、細胞に（ｉ）細胞外ＩＦＮによるＩＦＮ受容体の結合を妨げる薬剤及び／又は（ｉｉ）細胞内ＩＦＮシグナル伝達を阻害する薬剤を提供することは含まない。従って、本発明の方法は、一実施態様では、ワクシニアウイルスＢ１８Ｒ及び／又はワクシニアウイルスＥ３及び／又はワクシニアウイルスＫ３を細胞に提供することは含まず、好ましくはワクシニアウイルスＢ１８Ｒ、ワクシニアウイルスＥ３及びワクシニアウイルスＫ３の何れかを細胞に提供することは含まない。
本発明によれば、上記のＩＦＮ阻害剤（トスカーナウイルスＮＳｓタンパク質又はトスカーナウイルスＮＳｓタンパク質の機能的バリアントを含むウイルス由来因子を含む）の代わりに、タンパク質をコードする核酸を提供できることを理解されたい。ここで使用される「核酸の形態で提供される」という語句は、この可能性を説明するためのものである。例えば、細胞は、タンパク質をコードする核酸、特にＲＮＡでトランスフェクトされ得、核酸はタンパク質を産生するように細胞内で発現されうる。
本発明によれば、核酸は、好ましくはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）又はリボ核酸（ＲＮＡ）、より好ましくはＲＮＡ、最も好ましくはインビトロ転写ＲＮＡ（ＩＶＴ ＲＮＡ）である。核酸には、本発明によれば、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、組換えにより産生された分子及び化学的に合成された分子が含まれる。本発明によれば、核酸は、一本鎖又は二本鎖で線状又は共有結合的に閉環した分子として存在しうる。本発明によれば、核酸は単離されうる。「単離された核酸」という用語は、本発明によれば、核酸が（ｉ）例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を介してインビトロで増幅されており、（ｉｉ）クローニングにより組換え的に産生され、（ｉｉｉ）例えば、ゲル電気泳動による切断及び分離によって精製され、又は（ｉｖ）例えば化学合成によって合成されていることを意味する。核酸は、細胞への導入、すなわち細胞のトランスフェクションのために、特に、ＤＮＡ鋳型からのインビトロ転写により調製されうるＲＮＡの形態で、用いられうる。ＲＮＡは、配列の安定化、キャッピング、及びポリアデニル化により、適用前に更に修飾されうる。
一を超えるペプチド又はタンパク質の発現のための核酸、特にＲＮＡとして、異なるペプチド又はタンパク質が異なる核酸分子に存在するオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）によってコードされる核酸型あるいは異なるペプチド又はタンパク質が同じ核酸分子に存在するオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）によってコードされる核酸型の何れかを使用できる。従って、一を超えるリプログラミング因子をコードするＲＮＡなど、一を超えるペプチド又はタンパク質をコードするＲＮＡは、異なるペプチド又はタンパク質をコードする異なるＯＲＦを含む異なるＲＮＡ分子の混合物、又は異なるペプチド又はタンパク質をコードする異なるＯＲＦを含む単一のＲＮＡ分子に関連しうる。
本発明の文脈において、「ＲＮＡ」という用語は、リボヌクレオチド残基を含み、好ましくは完全に又は実質的にリボヌクレオチド残基から構成される分子に関する。「リボヌクレオチド」という用語は、β－Ｄ－リボフラノシル基の２’位にヒドロキシル基を有するヌクレオチドに関する。「ＲＮＡ」という用語は、二本鎖ＲＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、部分的又は完全に精製されたＲＮＡなどの単離されたＲＮＡ、本質的に純粋なＲＮＡ、合成ＲＮＡ、及び一又は複数のヌクレオチドの付加、欠失、置換及び／又は改変によって天然に生じるＲＮＡとは異なる修飾ＲＮＡなどの組換え産生ＲＮＡを含む。そのような改変は、例えばＲＮＡの一又は複数のヌクレオチドでのＲＮＡの末端又は内部などへの非ヌクレオチド材料の付加を含みうる。ＲＮＡ分子中のヌクレオチドは、非天然発生ヌクレオチド又は化学合成ヌクレオチド又はデオキシヌクレオチドなどの非標準ヌクレオチドをまた含みうる。これらの改変されたＲＮＡは、アナログ、特に天然に生じるＲＮＡのアナログと称されうる。本発明によれば、ＲＮＡにはｍＲＮＡが含まれる。
「ｍＲＮＡ」という用語は「メッセンジャーＲＮＡ」を意味し、ＤＮＡ鋳型を使用して産生され、ペプチド又はタンパク質をコードする転写物に関する。典型的には、ｍＲＮＡは５’－ＵＴＲ、タンパク質コード領域、３’－ＵＴＲ、及びポリ（Ａ）配列を含む。ｍＲＮＡは、ＤＮＡ鋳型からのインビトロ転写によって産生されうる。インビトロ転写方法は当業者に知られている。例えば、様々なインビトロ転写キットが市販されている。
本発明によれば、一又は複数のリプログラミング因子をコードするＲＮＡなどのペプチド又はタンパク質（ここでは目的のペプチド又はタンパク質とも呼ばれる）をコードするＲＮＡは、ペプチド又はタンパク質をコードするｍＲＮＡあるいはペプチド又はタンパク質をコードするレプリコンＲＮＡなどの自己複製ＲＮＡでありうる。更に、本発明による細胞への提供のためのトスカーナウイルスＮＳｓタンパク質又はトスカーナウイルスＮＳｓタンパク質の機能的バリアントを含むウイルス由来因子をコードするＲＮＡは、ウイルス由来因子をコードするｍＲＮＡあるいはウイルス由来因子をコードするレプリコンＲＮＡなどの自己複製ＲＮＡでありうる。本発明の一実施態様では、目的のペプチド又はタンパク質をコードするｍＲＮＡである目的のペプチド又はタンパク質をコードするＲＮＡは、ウイルス由来因子をコードするｍＲＮＡであるウイルス由来因子をコードするＲＮＡと共に共トランスフェクトされる。本発明の一実施態様では、目的のペプチド又はタンパク質をコードするレプリコンＲＮＡである目的のペプチド又はタンパク質をコードするＲＮＡは、ウイルス由来因子をコードするｍＲＮＡであるウイルス由来因子をコードするＲＮＡと共に共トランスフェクトされる。レプリコンＲＮＡがトランスレプリコンＲＮＡである場合、アルファウイルス非構造タンパク質をコードするＲＮＡ、例えばｍＲＮＡ（ここでは機能的アルファウイルス非構造タンパク質を発現するためのＲＮＡコンストラクトとも呼ばれる）もまた共トランスフェクトされうる。「共トランスフェクション」とは、同じ時点又は異なる時点の何れかでの異なる核酸のトランスフェクションを意味する。
本発明の一実施態様では、ＲＮＡは、一本鎖自己複製ＲＮＡなどの自己複製ＲＮＡである。一実施態様では、自己複製ＲＮＡはプラスセンスの一本鎖ＲＮＡである。一実施態様では、自己複製ＲＮＡは、ウイルスＲＮＡ又はウイルスＲＮＡに由来するＲＮＡである。一実施態様では、自己複製ＲＮＡはアルファウイルスゲノムＲＮＡであるか、アルファウイルスゲノムＲＮＡに由来する。一実施態様では、自己複製ＲＮＡはウイルス遺伝子発現ベクターである。一実施態様では、ウイルスはセムリキ森林ウイルスである。一実施態様では、自己複製ＲＮＡは一又は複数の導入遺伝子を含む。一実施態様では、ＲＮＡがウイルスＲＮＡであり又はウイルスＲＮＡに由来する場合、導入遺伝子は、構造タンパク質をコードするウイルス配列などのウイルス配列を部分的又は完全に置き換えうる。一実施態様では、自己複製ＲＮＡはインビトロ転写ＲＮＡである
アルファウイルスは、プラス鎖ＲＮＡウイルスの典型的な代表例である。アルファウイルスのゲノムは、非構造タンパク質（ウイルスＲＮＡの転写、修飾及び複製と、タンパク質修飾に関与）及び構造タンパク質（ウイルス粒子の形成）をコードしている。ゲノムには典型的には二つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）がある。４つの非構造タンパク質（ｎｓＰ１－ｎｓＰ４）が典型的にはゲノムの５’末端付近で始まる第一ＯＲＦによって一緒にコードされる一方、アルファウイルス構造タンパク質は、第一ＯＲＦの下流に見出され、ゲノムの３’末端付近まで伸長する第二ＯＲＦによって一緒にコードされる。典型的には、第一ＯＲＦは第二ＯＲＦよりも大きく、比率は約２：１である。アルファウイルスに感染した細胞では、非構造タンパク質をコードする核酸配列のみがゲノムＲＮＡから翻訳される一方、構造タンパク質をコードする遺伝情報は、真核生物のメッセンジャーＲＮＡに類似したＲＮＡ分子であるサブゲノム転写物から翻訳可能である（mRNA; Gould等, 2010, Antiviral Res., vol. 87 pp. 111-124）。感染後、つまりウイルスライフサイクルの初期段階において、（＋）鎖ゲノムＲＮＡは非構造ポリタンパク質（ｎｓＰ１２３４）をコードするオープンリーディングフレームの翻訳のためにメッセンジャーＲＮＡのように直接作用する。一部のアルファウイルスには、ｎｓＰ３とｎｓＰ４のコード配列の間にオパール停止コドンがある：ｎｓＰ１、ｎｓＰ２、及びｎｓＰ３を含むポリタンパク質Ｐ１２３は、翻訳がオパール停止コドンで終了すると産生され、加えてｎｓＰ４を含むポリタンパク質Ｐ１２３４は、このオパールコドンのリードスルーによって産生される（Strauss及びStrauss, Microbiol. Rev., 1994, vol. 58, pp. 491-562；Rupp等, 2015, J. Gen. Virology, vol. 96, pp. 2483-2500）。ｎｓＰ１２３４は自己タンパク質分解により断片ｎｓＰ１２３及びｎｓＰ４に分解される。ポリペプチドｎｓＰ１２３及びｎｓＰ４は会合し、（＋）鎖ゲノムＲＮＡを鋳型として使用して、（－）鎖ＲＮＡを転写する（－）鎖レプリカーゼ複合体を形成する。典型的には後の段階で、ｎｓＰ１２３断片は完全に個々のタンパク質ｎｓＰ１、ｎｓＰ２、及びｎｓＰ３に切断される（Shirako及びStrauss, 1994, J. Virol., vol. 68, pp. 1874-1885）。４つのタンパク質全てが、鋳型としてゲノムＲＮＡの（－）相補鎖を使用して、新しい（＋）鎖ゲノムを合成する（＋）鎖レプリカーゼ複合体を形成する（Kim等, 2004, Virology, vol. 323, pp. 153-163，Vasiljeva等, 2003, J. Biol. Chem. vol. 278, pp. 41636-41645）。
アルファウイルス構造タンパク質（コアヌクレオカプシドタンパク質Ｃ、エンベロープタンパク質Ｅ２、及びエンベロープタンパク質Ｅ１，ウイルス粒子の全構成要素）は、典型的には、サブゲノムプロモーターの制御下で単一のオープンリーディングフレームによってコードされる（Strauss & Strauss, Microbiol. Rev., 1994, vol. 58, pp. 491-562）。サブゲノムプロモーターは、シスで作用するアルファウイルス非構造タンパク質によって認識される。特に、アルファウイルスレプリカーゼは、鋳型としてゲノムＲＮＡの（－）相補鎖を使用して（＋）鎖サブゲノム転写物を合成する。（＋）鎖サブゲノム転写物は、アルファウイルス構造タンパク質をコードする（Kim等, 2004, Virology, vol. 323, pp. 153-163，Vasiljeva等, 2003, J. Biol. Chem. vol. 278, pp. 41636-41645）。サブゲノムＲＮＡ転写物は、構造タンパク質を一つのポリタンパク質としてコードするオープンリーディングフレームの翻訳のための鋳型として機能し、ポリタンパク質が切断されて構造タンパク質を生成する。宿主細胞におけるアルファウイルス感染の後期には、ｎｓＰ２のコード配列内に位置するパッケージングシグナルにより、構造タンパク質によってパッケージされた出芽ビリオンへのゲノムＲＮＡの選択的なパッケージングが保証される（White等, 1998, J. Virol., vol. 72, pp. 4320-4326）。
本発明の実施態様では、自己複製ＲＮＡは、シスレプリコン又はトランスレプリコンであるＲＮＡレプリコンでありうる。例えば、アルファウイルス構造タンパク質をコードするオープンリーディングフレームは、目的のタンパク質をコードするオープンリーディングフレームに置き換えられうる。アルファウイルスベースのトランス複製システムは、二つの別個の核酸分子上のアルファウイルスヌクレオチド配列エレメントに依存している：一方の核酸分子がウイルスレプリカーゼ（典型的にはポリタンパク質ｎｓＰ１２３４として）をコードし、他方の核酸分子がトランスの前記レプリカーゼ（従って、トランス複製システムと命名）によって複製可能である。トランス複製には、所定の宿主細胞においてこれら双方の核酸分子の存在が必要である。トランスでレプリカーゼによって複製可能な核酸分子は、アルファウイルスレプリカーゼによる認識及びＲＮＡ合成を可能にする所定のアルファウイルス配列エレメントを含んでいなければならない。
本発明によれば、「ＲＮＡ複製」は、一般に、所定のＲＮＡ分子（鋳型ＲＮＡ分子）のヌクレオチド配列に基づいて合成されたＲＮＡ分子を意味する。合成されるＲＮＡ分子は、例えば鋳型ＲＮＡ分子と同一又は相補的でありうる。一般に、ＲＮＡ複製はＤＮＡ中間体の合成を介して起こりうるか、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲＰ）を介したＲＮＡ依存性ＲＮＡ複製によって直接起こりうる。アルファウイルスの場合、ＲＮＡ複製はＤＮＡ中間体を介しては起こらないが、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲＰ）によって媒介される：鋳型ＲＮＡ鎖（第一ＲＮＡ鎖）＜又はその一部＞は、第一ＲＮＡ鎖又はその一部に相補的な第二ＲＮＡ鎖の合成の鋳型となる。次に、場合によっては、第二ＲＮＡ鎖＜又はその一部＞は、第二ＲＮＡ鎖又はその一部に相補的な第三ＲＮＡ鎖の合成のための鋳型となりうる。それにより、第三ＲＮＡ鎖は、第一ＲＮＡ鎖又はその一部と同一である。よって、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼは、鋳型の相補的ＲＮＡ鎖を直接合成でき、（相補的中間鎖を介して）同一のＲＮＡ鎖を間接的に合成できる。
レプリカーゼ、好ましくはアルファウイルスレプリカーゼによって複製可能な核酸コンストラクトは、レプリコンと呼ばれる。本発明によれば、「レプリコン」という用語は、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼによって複製され得、＜ＤＮＡ中間体なしで＞ＲＮＡレプリコンの一又は複数の同一又は本質的に同一のコピーを生じるＲＮＡ分子を定義する。「ＤＮＡ中間体なし」とは、ＲＮＡレプリコンのコピーを形成する過程においてデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）コピー又はレプリコンの相補鎖が形成されないこと、及び／又はＲＮＡレプリコンのコピー又はその相補鎖を形成する過程においてデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）分子が鋳型として使用されないことを意味する。レプリカーゼ機能は、典型的には、機能的アルファウイルス非構造タンパク質によって提供される。
本発明のＲＮＡレプリコンは、好ましくは５’複製認識配列と３’複製認識配列を含む。複製認識配列は、機能的アルファウイルス非構造タンパク質によって認識されうる核酸配列である。
一実施態様では、５’複製認識配列と３’複製認識配列は、機能的アルファウイルス非構造タンパク質の存在下で本発明によるＲＮＡレプリコンの複製を方向付けることができる。よって、単独で又は好ましくは一緒に存在する場合、これらの認識配列は、機能的アルファウイルス非構造タンパク質の存在下でＲＮＡレプリコンの複製を方向付ける。
機能的アルファウイルス非構造タンパク質は、シス（レプリコンのオープンリーディングフレームによって目的のタンパク質としてコードされる）又はトランス（別個のレプリカーゼコンストラクトのオープンリーディングフレームによって目的のタンパク質としてコードされる）で提供されることが好ましく、それはレプリコンの５’複製認識配列と３’複製認識配列の両方を認識することができる。
本発明によるＲＮＡレプリコンは、好ましくは一本鎖ＲＮＡ分子である。本発明によるＲＮＡレプリコンは、典型的には（＋）鎖ＲＮＡ分子である。一実施態様では、本発明のＲＮＡレプリコンは、単離された核酸分子である。
本発明によれば、ＲＮＡレプリコンは、以下からなる群から選択されるアルファウイルスに由来しうる：バーマフォレストウイルス複合体（バーマフォレストウイルスを含む）；東部ウマ脳炎複合体（７種類の抗原性の東部ウマ脳炎ウイルスを含む）；ミデルバーグウイルス複合体（ミデルバーグウイルスを含む）；ヌドゥムウイルス複合体（ヌドゥムウイルスを含む）；セムリキ森林ウイルス複合体（ベバルウイルス、チクングニアウイルス、マヤロウイルスとそのサブタイプのウナウイルス、オニョンニョンウイルスとそのサブタイプのイグボオラ（Ｉｇｂｏ－Ｏｒａ）ウイルス、ロスリバーウイルスとそのサブタイプのベバルウイルス、ゲタウイルス、サギヤマウイルス、セムリキ森林ウイルスとそのサブタイプのメトリ（Ｍｅ Ｔｒｉ）ウイルスを含む）；ベネズエラ馬脳炎複合体（カバソウウイルス、エバーグレーズウイルス、モッソダスペドラスウイルス、ムカンボウイルス、パラマナウイルス、ピクスナウイルス、リオネグロウイルス、トロカラウイルスとそのサブタイプのビジューブリッジウイルス、ベネズエラ馬脳炎ウイルスを含む）；西部馬脳炎複合体（オーラウイルス、ババンキウイルス、キズラガハウイルス、シンドビスウイルス、オッケルボウイルス、ワタロアウイルス、バギークリークウイルス、フォートモーガンウイルス、ハイランドＪウイルス、西部馬脳炎ウイルスを含む）；及びサーモン膵臓病ウイルスを含む幾つかの未分類ウイルス；睡眠病ウイルス；サザンゾウアザラシウイルス；トネートウイルス。より好ましくは、アルファウイルスは、セムリキ森林ウイルス複合体（セムリキ森林ウイルスを含む上記のウイルス型を含む）、西部馬脳炎複合体（シンドビスウイルスを含む上記のウイルス型を含む）、東部ウマ脳炎ウイルス（上記のウイルス型を含む）、ベネズエラ馬脳炎複合体（ベネズエラ馬脳炎ウイルスを含む上記のウイルス型を含む）からなる群から選択される。更に好ましい実施態様では、アルファウイルスはセムリキ森林ウイルスである。別の更に好ましい実施態様では、アルファウイルスはシンドビスウイルスである。別の更に好ましい実施態様では、アルファウイルスはベネズエラ馬脳炎ウイルスである。
本発明によるＲＮＡ分子は、場合によっては、更なる特徴、例えば、５’キャップ、５’－ＵＴＲ、３’－ＵＴＲ、ポリ（Ａ）配列、及び／又はコドン使用頻度の適応によって特徴付けられうる。詳細は次に記載される。
幾つかの実施態様では、本発明によるＲＮＡ（ｍＲＮＡ及び／又はレプリコンＲＮＡ）は、５’キャップを含む。
「５’－キャップ」、「キャップ」、「５’－キャップ構造」、「キャップ構造」という用語は、前駆体メッセンジャーＲＮＡなどの幾つかの真核生物一次転写物の５’末端に見出されるジヌクレオチドを指すために同義的に使用される。５’キャップは、（場合によっては修飾された）グアノシンが５’から５’の三リン酸結合（又は所定のキャップアナログの場合は修飾三リン酸結合）を介してｍＲＮＡ分子の最初のヌクレオチドに結合する構造である。この用語は、通常のキャップ又はキャップアナログを指す場合がある。
「５’キャップを含むＲＮＡ」又は「５’キャップを備えたＲＮＡ」又は「５’キャップで修飾されたＲＮＡ」又は「キャップ化ＲＮＡ」とは、５’－キャップを含むＲＮＡを指す。例えば、ＲＮＡに５’キャップを提供することは、該５’キャップの存在下でのＤＮＡ鋳型のインビトロ転写により達成することができ、該５’キャップは生成されたＲＮＡ鎖に同時転写的に組み込まれ、又はＲＮＡは、例えば、インビトロ転写により生成され得、５’キャップは、キャッピング酵素、例えば、ワクシニアウイルスのキャッピング酵素を使用して転写後にＲＮＡに結合されうる。キャップ化ＲＮＡでは、（キャップ化）ＲＮＡ分子の最初の塩基の３’位が、ホスホジエステル結合を介してＲＮＡ分子の次の塩基（「第二の塩基」）の５’位に結合する。
宿主細胞又は宿主生物への各ＲＮＡの導入後の初期段階においてタンパク質をコードする核酸配列の翻訳が望まれる場合、ＲＮＡ分子上のキャップの存在が強く好まれる。例えば、キャップの存在により、ＲＮＡによってコードされる目的の遺伝子が、それぞれのＲＮＡを宿主細胞に導入した後の初期段階において効率的に翻訳される。「初期段階」とは、典型的には、ＲＮＡ導入後の最初の１時間以内、又は最初の２時間以内、又は最初の３時間以内を意味する。
機能的レプリカーゼの非存在下で翻訳が起こることが望まれる場合、又は僅かなレベルのレプリカーゼしか宿主細胞に存在しない場合、ＲＮＡレプリコンのキャップの存在がまた好ましい。例えば、たとえレプリカーゼをコードする核酸分子が宿主細胞に導入されたとしても、導入後の初期段階ではレプリカーゼのレベルは典型的には少ないであろう。本発明によれば、機能的アルファウイルス非構造タンパク質を発現するためのＲＮＡコンストラクトが５’キャップを含むことが好ましい。
特に、本発明によるＲＮＡレプリコンが、機能的アルファウイルス非構造タンパク質をコードする第二の核酸分子（例えばｍＲＮＡ）と共に使用又は提供されない場合、ＲＮＡレプリコンが５’キャップを含むことが好ましい。独立して、ＲＮＡレプリコンは、機能的アルファウイルス非構造タンパク質をコードする第二の核酸分子と共に使用又は提供される場合でも、５’キャップをまた含んでいてもよい。
「通常の５’キャップ」という用語は、天然に生じるる５’キャップ、好ましくは７－メチルグアノシンキャップを意味する。７－メチルグアノシンキャップでは、キャップのグアノシンは、修飾が７位のメチル化からなる修飾グアノシンである。
本発明の文脈において、「５’－キャップアナログ」という用語は、通常の５’－キャップに似ているが、好ましくはインビボで及び／又は細胞中で、それに結合した場合にＲＮＡを安定化する能力を有するように修飾されている分子構造を意味する。キャップアナログは、通常の５’キャップではない。
真核生物ｍＲＮＡの場合、５’キャップはｍＲＮＡの効率的な翻訳に関与していると一般的に説明されている：一般的に、真核生物では、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）が存在しないならば、翻訳はメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）分子の５’末端でのみ開始される。真核細胞は、核内での転写中にＲＮＡに５’キャップを提供できる：新しく合成されたｍＲＮＡは、例えば転写物が２０～３０ヌクレオチドの長さに達すると、通常５’キャップ構造で修飾される。先ず、５’末端ヌクレオチドｐｐｐＮ（ｐｐｐは三リン酸を表す；Ｎは任意のヌクレオシドを表す）は、ＲＮＡ５’－トリホスファターゼ及びグアニリルトランスフェラーゼ活性を有するキャッピング酵素によって細胞内で５’ＧｐｐｐＮに変換される。その後、ＧｐｐｐＮは（グアニン－７）－メチルトランスフェラーゼ活性を持つ第二の酵素によって細胞内でメチル化され、モノメチル化ｍ７ＧｐｐｐＮキャップを形成しうる。一実施態様では、本発明において使用される５’キャップは、天然５’キャップである。
本発明において、天然５’キャップジヌクレオチドは、典型的には、非メチル化キャップジヌクレオチド（Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｎ；ＧｐｐｐＮとも呼ばれる）及びメチル化キャップジヌクレオチド（（ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｎ；ｍ７ＧｐｐｐＮとも呼ばれる）からなる群から選択される。ｍ７ＧｐｐｐＮ（ここで、ＮはＧである）は、次式で表される：
Figure 0007424968000001
本発明のキャップ化ＲＮＡは、インビトロで調製することができ、従って、宿主細胞のキャッピング機構に依存しない。キャップ化ＲＮＡをインビトロで作製するために最も頻繁に使用される方法は、４つ全てのリボヌクレオシド三リン酸及びキャップジヌクレオチド、例えばｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ（ｍ７ＧｐｐｐＧとも呼ばれる）の存在下で細菌又はバクテリオファージＲＮＡポリメラーゼでＤＮＡ鋳型を転写することである。ＲＮＡポリメラーゼは、次の鋳型ヌクレオシド三リン酸（ｐｐｐＮ）のα－リン酸のｍ７ＧｐｐｐＧのグアノシン部分の３’－ＯＨによる求核攻撃で転写を開始し、中間体ｍ７ＧｐｐｐＧｐＮ（ここで、ＮはＲＮＡ分子の第二塩基である）を生じる。競合するＧＴＰ開始産物ｐｐｐＧｐＮの形成は、インビトロ転写中にキャップとＧＴＰのモル比を５～１０に設定することによって抑制される。
本発明の好ましい実施態様では、５’キャップ（存在する場合）は５’キャップアナログである。これらの実施態様は、ＲＮＡがインビトロ転写により得られ、例えばインビトロ転写ＲＮＡ（ＩＶＴ－ＲＮＡ）である場合に特に適している。キャップアナログは、インビトロ転写によるＲＮＡ転写物の大規模な合成を促進することが初期に記載されている。
メッセンジャーＲＮＡについて、幾つかのキャップアナログ（合成キャップ）がこれまで一般的に記載されており、それらは全て本発明の文脈で使用することができる。理想的には、より高い翻訳効率及び／又はインビボ分解に対する耐性の増加及び／又はインビトロ分解に対する耐性の増加を伴うキャップアナログが選択される。
好ましくは、一方向でのみＲＮＡ鎖に取り込むことができるキャップアナログが使用される。Ｐａｓｑｕｉｎｅｌｌｉ等（1995, RNA J., vol., 1, pp. 957-967）は、インビトロ転写中、バクテリオファージＲＮＡポリメラーゼは転写の開始に７－メチルグアノシン単位を使用し、それによりキャップを持つ転写物の約４０～５０％が逆方向のキャップジヌクレオチドを保有している（つまり、最初の反応生成物はＧｐｐｐｍ７ＧｐＮである）ことを証明した。正しいキャップを持つＲＮＡと比較して、逆キャップを持つＲＮＡは、核酸配列のタンパク質への翻訳に関して機能的ではない。よって、キャップを正しい方向に取り込み、すなわち、ｍ７ＧｐｐｐＧｐＮなどに本質的に対応する構造を持つＲＮＡが得られることが望ましい。キャップ－ジヌクレオチドの逆組み込みは、メチル化グアノシン単位の２’－又は３’－ＯＨ基の何れかの置換により阻害されることが示されている（Stepinski等, 2001; RNA J., vol. 7, pp. 1486-1495；Peng等, 2002; Org. Lett., vol. 24, pp. 161-164）。そのような「アンチリバースキャップアナログ」の存在下で合成されるＲＮＡは、通常の５’キャップｍ７ＧｐｐｐＧの存在下でインビトロ転写されるＲＮＡよりも効率的に翻訳される。そのために、メチル化グアノシン単位の３’ＯＨ基がＯＣＨ３で置換された一つのキャップアナログが、例えばHoltkamp等, 2006, Blood, vol. 108, pp. 4009-4017（７－メチル（３’－Ｏ－メチル）ＧｐｐｐＧ；アンチリバースキャップアナログ（ＡＲＣＡ））によって記載されている。ＡＲＣＡは、本発明による適切なキャップジヌクレオチドである。
Figure 0007424968000002
本発明の好ましい実施態様では、本発明のＲＮＡは、デキャッピングを本質的に受けない。これは、一般に、培養哺乳動物細胞に導入された合成ｍＲＮＡから生成されるタンパク質の量は、ｍＲＮＡの自然分解によって制限されるため、重要である。ｍＲＮＡ分解の一つのインビボ経路は、ｍＲＮＡキャップの除去で始まる。この除去は、調節サブユニット（Ｄｃｐ１）と触媒サブユニット（Ｄｃｐ２）を含むヘテロ二量体ピロホスファターゼによって触媒される。触媒サブユニットは、三リン酸架橋のα及びβリン酸基の間を切断する。本発明では、その切断のタイプに対して感受性でないか又は感受性が低いキャップアナログを選択し又は存在させうる。この目的に適したキャップアナログは、式（Ｉ）によるキャップジヌクレオチドから選択されうる：
Figure 0007424968000003
上式中、Ｒ１は、置換されていてもよいアルキル、置換されていてもよいアルケニル、置換されていてもよいアルキニル、置換されていてもよいシクロアルキル、置換されていてもよいヘテロシクリル、置換されていてもよいアリール、及び置換されていてもよいヘテロアリールからなる群から選択され、
Ｒ２及びＲ３は、Ｈ、ハロ、ＯＨ、及び置換されていてもよいアルコキシからなる群から独立して選択されるか、又はＲ２及びＲ３は一緒になってＯ－Ｘ－Ｏを形成し、Ｘは置換されていてもよいＣＨ２、ＣＨ２ＣＨ２、ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２、ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）、及びＣ（ＣＨ３）２からなる群から選択され、又はＲ２は、Ｒ２が結合している環の４’位の水素原子と組み合わされて－Ｏ－ＣＨ２－又は－ＣＨ２－Ｏ－を形成し、
Ｒ５は、Ｓ、Ｓｅ、及びＢＨ３からなる群から選択され、
Ｒ４及びＲ６は、Ｏ、Ｓ、Ｓｅ、及びＢＨ３からなる群から独立して選択され、
ｎは１、２、又は３である。
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６の好ましい実施態様は、国際公開第２０１１／０１５３４７Ａ１号に開示されており、本発明において適宜選択されうる。
例えば、本発明の好ましい実施態様では、本発明のＲＮＡはホスホロチオエートキャップアナログを含む。ホスホロチオエートキャップアナログは、三リン酸鎖中の三つの非架橋Ｏ原子の一つがＳ原子で置換された、すなわち、式（Ｉ）のＲ４、Ｒ５又はＲ６の一つがＳである、特定のキャップアナログである。ホスホロチオエートキャップアナログは、J. Kowalska等, 2008, RNA, vol. 14, pp. 1119-1131によって、望ましくないデキャッピング過程の解決手段として、従ってインビボでのＲＮＡの安定性を高める解決手段として記載されている。特に、５’－キャップのベータリン酸基において酸素原子を硫黄原子に置換すると、Ｄｃｐ２に対して安定化される。本発明において好ましいその実施態様では、式（Ｉ）のＲ５はＳであり；Ｒ４とＲ６はＯである。
本発明の更に好ましい実施態様では、本発明のＲＮＡは、ホスホロチオエートキャップアナログを含み、ＲＮＡ５’キャップのホスホロチオエート修飾が「アンチリバースキャップアナログ」（ＡＲＣＡ）修飾と組み合わされる。それぞれのＡＲＣＡ－ホスホロチオエートキャップアナログは、国際公開第２００８／１５７６８８Ａ２号に記載されており、それらは全て本発明のＲＮＡに使用することができる。その実施態様では、式（Ｉ）のＲ２又はＲ３の少なくとも一方はＯＨではなく、好ましくはＲ２及びＲ３の一方はメトキシ（ＯＣＨ３）であり、Ｒ２及びＲ３の他方は好ましくはＯＨである。好ましい実施態様では、酸素原子は、ベータリン酸基において硫黄原子と置換される（従って、式（Ｉ）のＲ５はＳであり；Ｒ４及びＲ６はＯである）。ＡＲＣＡのホスホロチオエート修飾により、α、β、及びγホスホロチオエート基が、翻訳及びデキャッピング機構の両方でキャップ結合タンパク質の活性部位内に正確に位置させられると考えられる。これらのアナログの少なくとも幾つかは、本質的にピロホスファターゼＤｃｐ１／Ｄｃｐ２に耐性がある。ホスホロチオエート修飾ＡＲＣＡは、ホスホロチオエート基を欠く対応するＡＲＣＡよりも、ｅＩＦ４Ｅに対する親和性が遥かに高いと記載されている。
本発明において特に好ましいそれぞれのキャップアナログ、すなわちｍ２’ ７，２’－ＯＧｐｐｓｐＧは、ベータ－Ｓ－ＡＲＣＡと呼ばれる（国際公開第２００８／１５７６８８Ａ２号；Kuhn等, Gene Ther., 2010, vol. 17, pp. 961-971）。よって、本発明の一実施態様では、本発明のＲＮＡは、ベータ－Ｓ－ＡＲＣＡで修飾される。ベータ－Ｓ－ＡＲＣＡは、次の構造で表される：
Figure 0007424968000004
一般に、架橋リン酸の酸素原子を硫黄原子に置き換えると、ＨＰＬＣでのその溶出パターンに基づいてＤ１及びＤ２と命名されるホスホロチオエートジアステレオマーが生成される。簡単に言えば、「ベータ－Ｓ－ＡＲＣＡ」又は「ベータ－Ｓ－ＡＲＣＡ（Ｄ１）」のＤ１ジアステレオマーは、ベータ－Ｓ－ＡＲＣＡのＤ２ジアステレオマー（ベータ－Ｓ－ＡＲＣＡ（Ｄ２））と比較してＨＰＬＣカラムで最初に溶出し、従って保持時間が短くなるベータ－Ｓ－ＡＲＣＡのジアステレオマーである。ＨＰＬＣによる立体化学配置の決定は、国際公開第２０１１／０１５３４７Ａ１号に記載されている。
本発明の第一の特に好ましい実施態様では、本発明のＲＮＡは、ベータ－Ｓ－ＡＲＣＡ（Ｄ２）ジアステレオマーで修飾される。ベータ－Ｓ－ＡＲＣＡの二つのジアステレオマーは、ヌクレアーゼに対する感度が異なる。ベータ－Ｓ－ＡＲＣＡのＤ２ジアステレオマーを保有するＲＮＡは、Ｄｃｐ２切断に対してほぼ完全に耐性である一方（非修飾ＡＲＣＡ５’－キャップの存在下で合成されたＲＮＡと比較して僅か６％の切断）、ベータ－Ｓ－ＡＲＣＡ（Ｄ１）５’－キャップを持つＲＮＡは、Ｄｃｐ２切断に対して中間の感度を示す（７１％の切断）ことが示されている。更に、Ｄｃｐ２切断に対する安定性の増加は、哺乳動物細胞におけるタンパク質発現の増加と相関することが示されている。特に、ベータ－Ｓ－ＡＲＣＡ（Ｄ２）キャップを保有するＲＮＡは、β－Ｓ－ＡＲＣＡ（Ｄ１）キャップを保有するＲＮＡよりも哺乳動物細胞でより効率的に翻訳されることが示されている。従って、本発明の一実施態様では、本発明のＲＮＡは、ベータ－Ｓ－ＡＲＣＡのＤ２ジアステレオマーのＰβ原子のものに対応する式（Ｉ）の置換基Ｒ５を含むＰ原子での立体化学配置を特徴とする式（Ｉ）によるキャップアナログで修飾される。その実施態様では、式（Ｉ）のＲ５はＳであり；Ｒ４及びＲ６はＯである。加えて、式（Ｉ）のＲ２又はＲ３の少なくとも一方は好ましくはＯＨではなく、好ましくはＲ２及びＲ３の一方はメトキシ（ＯＣＨ３）であり、Ｒ２及びＲ３の他方は好ましくはＯＨである。
第二の特に好ましい実施態様では、本発明のＲＮＡは、ベータ－Ｓ－ＡＲＣＡ（Ｄ１）ジアステレオマーで修飾される。この実施態様は、ワクチン接種などのために、キャップ化ＲＮＡを未成熟抗原提示細胞に移すのに特に適している。ベータ－Ｓ－ＡＲＣＡ（Ｄ１）ジアステレオマーは、各キャップ化ＲＮＡを未成熟抗原提示細胞に移すと、ＲＮＡの安定性を高め、ＲＮＡの翻訳効率を高め、ＲＮＡの翻訳を延長し、ＲＮＡの総タンパク質発現を増加させ、及び／又は前記ＲＮＡによってコードされる抗原又は抗原ペプチドに対する免疫応答を増加させるのに特に適していることが実証されている（Kuhn等, 2010, Gene Ther., vol. 17, pp. 961-971）。従って、本発明の別の実施態様では、本発明のＲＮＡは、ベータ－Ｓ－ＡＲＣＡのＤ１ジアステレオマーのＰβ原子のものに対応する式（Ｉ）の置換基Ｒ５を含むＰ原子での立体化学配置を特徴とする式（Ｉ）によるキャップアナログで修飾される。それぞれのキャップアナログ及びその実施態様は、国際公開第２０１１／０１５３４７Ａ１号及びKuhn等, 2010, Gene Ther., vol. 17, pp. 961-971に記載されている。置換基Ｒ５を含むＰ原子での立体化学配置がベータ－Ｓ－ＡＲＣＡのＤ１ジアステレオマーのＰβ原子のものに対応する国際公開第２０１１／０１５３４７Ａ１号に記載されている任意のキャップアナログを本発明で使用することができる。好ましくは、式（Ｉ）のＲ５はＳであり；Ｒ４及びＲ６はＯである。加えて、式（Ｉ）のＲ２又はＲ３の少なくとも一方は好ましくはＯＨではなく、好ましくはＲ２及びＲ３の一方はメトキシ（ＯＣＨ３）であり、Ｒ２及びＲ３の他方は好ましくはＯＨである。
一実施態様では、本発明のＲＮＡは、何れか一つのリン酸基がボラノリン酸基又はホスホセレノエート基によって置換されている式（Ｉ）による５’キャップ構造で修飾される。このようなキャップは、インビトロ及びインビボの両方で安定性が向上している。場合により、それぞれの化合物は２’－Ｏ－又は３’－Ｏ－アルキル基を有する（ここで、アルキルは好ましくはメチルである）；それぞれのキャップアナログは、ＢＨ３－ＡＲＣＡ又はＳｅ－ＡＲＣＡと呼ばれる。ｍＲＮＡのキャッピングに特に適した化合物には、国際公開第２００９／１４９２５３Ａ２号に記載されているように、β－ＢＨ３－ＡＲＣＡ及びβ－Ｓｅ－ＡＲＣＡが含まれる。これらの化合物については、ベータ－Ｓ－ＡＲＣＡのＤ１ジアステレオマーのＰβ原子のものに対応する式（Ｉ）の置換基Ｒ５を含むＰ原子の立体化学配置が好ましい。
「非翻訳領域」又は「ＵＴＲ」という用語は、転写されるがアミノ酸配列に翻訳されないＤＮＡ分子の領域、又はｍＲＮＡ分子などのＲＮＡ分子の対応する領域に関する。非翻訳領域（ＵＴＲ）は、オープンリーディングフレーム（５’－ＵＴＲ）の５’（上流）及び／又はオープンリーディングフレーム（３’－ＵＴＲ）の３’（下流）に存在しうる。
３’－ＵＴＲは、存在する場合、タンパク質のコード領域の終止コドンの下流の遺伝子の３’末端に位置するが、「３’－ＵＴＲ」という用語はポリ（Ａ）テールを含まないことが好ましい。よって、３’－ＵＴＲはポリ（Ａ）テール（存在する場合）の上流にあり、例えばポリ（Ａ）テールに直接隣接している。
５’－ＵＴＲは、存在する場合、タンパク質のコード領域の開始コドンの上流の遺伝子の５’末端に位置する。５’－ＵＴＲは５’－キャップ（存在する場合）の下流にあり、例えば５’－キャップに直接隣接している。
本発明によれば、５’－及び／又は３’－非翻訳領域は、これらの領域が、オープンリーディングフレームに関連付けられて、前記オープンリーディングフレームを含むＲＮＡの安定性及び／又は翻訳効率が増加するように、オープンリーディングフレームに機能的に連結されうる。
幾つかの実施態様では、本発明によるｍＲＮＡは、５’－ＵＴＲ及び／又は３’－ＵＴＲを含む。
好ましい実施態様では、本発明によるｍＲＮＡは、
（１）５’－ＵＴＲ、
（２）オープンリーディングフレーム、及び
（３）３’－ＵＴＲ
を含む。
ＵＴＲは、ＲＮＡの安定性と翻訳効率に関係している。特定の５’及び／又は３’非翻訳領域（ＵＴＲ）を選択することにより、ここに記載される５’キャップ及び／又は３’ポリ（Ａ）テールに関する構造改変に加えて、両方を改善できる。ＵＴＲ内の配列要素は一般に、翻訳効率（主に５’－ＵＴＲ）及びＲＮＡ安定性（主に３’－ＵＴＲ）に影響を与えると理解される。ＲＮＡの翻訳効率及び／又は安定性を高めるために活性な５’－ＵＴＲが存在することが好ましい。独立して又は追加的に、ＲＮＡの翻訳効率及び／又は安定性を高めるために活性な３’－ＵＴＲが存在することが好ましい。
第一核酸配列（例えばＵＴＲ）に関して、「翻訳効率を高めるために活性な」及び／又は「安定性を高めるために活性な」という用語は、第一核酸配列が、第一核酸配列の非存在下での第二核酸配列の翻訳効率及び／又は安定性との比較において翻訳効率及び／又は安定性が増加するような形で前記第二核酸配列の翻訳効率及び／又は安定性を、第二核酸配列を有する共通転写物において、改変可能であることを意味する。
３’－ＵＴＲは典型的には２００～２０００ヌクレオチド、例えば５００～１５００ヌクレオチドの長さを有する。免疫グロブリンｍＲＮＡの３’非翻訳領域は比較的短く（約３００ヌクレオチド未満）、他の遺伝子の３’非翻訳領域は比較的長い。例えば、ｔＰＡの３’非翻訳領域は約８００ヌクレオチド長であり、第ＶＩＩＩ因子のそれは約１８００ヌクレオチド長であり、エリスロポエチンのそれは約５６０ヌクレオチド長である。哺乳動物ｍＲＮＡの３’非翻訳領域は、典型的にはＡＡＡＵＡＡヘキサヌクレオチド配列として知られる相同領域を有している。この配列はおそらくポリ（Ａ）付着シグナルであり、しばしばポリ（Ａ）付着部位の１０～３０塩基上流に位置する。３’－非翻訳領域は、折り畳まれてエキソリボヌクレアーゼの障壁として作用するか、ＲＮＡ安定性を高めることが知られているタンパク質（例えばＲＮＡ結合タンパク質）と相互作用するステムループ構造をもたらしうる一又は複数の逆方向反復を含みうる。
幾つかの実施態様では、本発明によるＲＮＡは、３’－ポリ（Ａ）配列を含む。
本発明によれば、一実施態様では、ポリ（Ａ）配列は、少なくとも２０、好ましくは少なくとも２６、好ましくは少なくとも４０、好ましくは少なくとも８０、好ましくは少なくとも１００、好ましくは５００まで、好ましくは４００まで、好ましくは３００まで、好ましくは２００まで、特に１５０までのＡヌクレオチド、特に約１２０のＡヌクレオチドを含むか又はそれから本質的になるか又はそれからなる。この文脈において、「から本質的になる」とは、ポリ（Ａ）配列の殆どのヌクレオチド、典型的には「ポリ（Ａ）配列」のヌクレオチド数の典型的には少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７５％がＡヌクレオチド（アデニル酸）であることを意味するが、残りのヌクレオチドが、例えばＵヌクレオチド（ウリジル酸）、Ｇヌクレオチド（グアニル酸）、Ｃヌクレオチド（シチジル酸）などのＡヌクレオチド以外のヌクレオチドであることを許容する。この文脈において、「からなる」とは、ポリ（Ａ）配列内の全てのヌクレオチド、すなわちポリ（Ａ）配列内のヌクレオチド数の１００％がＡヌクレオチドであることを意味する。「Ａヌクレオチド」又は「Ａ」という用語はアデニル酸を意味する。
実際、約１２０のＡヌクレオチドの３’ポリ（Ａ）配列は、トランスフェクトされた真核細胞のＲＮＡのレベル、並びに３’ポリ（Ａ）配列の上流（５’）に存在するオープンリーディングフレームから翻訳されるタンパク質のレベルに有益な影響を与えることが実証されている（Holtkamp等, 2006, Blood, vol. 108, pp. 4009-4017）。
本発明は、コード鎖に相補的な鎖に反復ｄＴヌクレオチド（デオキシチミジル酸）を含むＤＮＡ鋳型に基づいて、ＲＮＡ転写中、すなわちインビトロ転写ＲＮＡの調製中に付けられる３’ポリ（Ａ）配列を提供する。ポリ（Ａ）配列（コード鎖）をコードするＤＮＡ配列は、ポリ（Ａ）カセットと呼ばれる。
本発明の好ましい実施態様では、ＤＮＡのコード鎖に存在する３’ポリ（Ａ）カセットは、本質的にｄＡヌクレオチドからなるが、４つのヌクレオチド（ｄＡ、ｄＣ、ｄＧ、ｄＴ）の等しい分布を有するランダム配列によって中断される。そのようなランダム配列は、長さが５～５０、好ましくは１０～３０、より好ましくは１０～２０ヌクレオチドでありうる。そのようなカセットは、国際公開第２０１６／００５００４Ａ１号に開示されている。国際公開第２０１６／００５００４Ａ１号に開示されている任意のポリ（Ａ）カセットが本発明において使用されうる。本質的にｄＡヌクレオチドからなるが、四つのヌクレオチド（ｄＡ、ｄＣ、ｄＧ、ｄＴ）の等しい分布を持ち、例えば５～５０ヌクレオチド長を有するランダム配列によって中断されるポリ（Ａ）カセットが、ＤＮＡレベルで大腸菌内のプラスミドＤＮＡの絶え間ない増殖を示し、ＲＮＡレベルで、ＲＮＡの安定性と翻訳効率のサポートに関して有益な特性と依然として関連している。
従って、本発明の好ましい実施態様では、ここに記載のＲＮＡ分子に含まれる３’ポリ（Ａ）配列は、本質的にＡヌクレオチドからなるが、四つのヌクレオチド（Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｕ）の等しい分布を有するランダム配列によって中断される。そのようなランダム配列は、５～５０、好ましくは１０～３０、より好ましくは１０～２０ヌクレオチド長でありうる。
ここで特定される核酸配列、特に転写可能なコード核酸配列は、前記核酸配列と相同又は異種でありうる発現制御配列と機能的に連結され得、「相同」という用語は、核酸配列がまた自然に発現制御配列に機能的に連結されるという事実を意味し、「異種」という用語は、核酸配列が自然には発現制御配列に機能的に連結されないという事実を意味する。
転写可能な核酸配列あるいはペプチド又はタンパク質をコードする核酸配列と、発現制御配列は、それらが転写可能な又はコード核酸配列の転写又は発現が発現制御配列の制御下又は影響下にあるように互いに共有結合しているならば、互いに「機能的に」結合している。核酸配列が機能的なペプチド又はタンパク質に翻訳される場合、コード配列に機能的に連結された発現制御配列の誘導は、コード配列あるいは所望のペプチド又はタンパク質に翻訳することができないコード配列にフレームシフトを引き起こすことなく、前記コード配列の転写をもたらす。
「発現制御配列」という用語は、本発明によれば、プロモーター、リボソーム結合配列、及び遺伝子の転写又はＲＮＡの翻訳を制御する他の制御エレメントを含む。本発明の特定の実施態様では、発現制御配列を調節することができる。発現制御配列の正確な構造は、種又は細胞型によって変わりうるが、通常は、ＴＡＴＡボックス、キャッピング配列、ＣＡＡＴ配列等、それぞれ転写と翻訳の開始に関与する５’－非転写配列及び５’－及び３’－非翻訳配列を含む。より具体的には、５’－非転写発現制御配列は、機能的に連結された遺伝子の転写制御のためのプロモーター配列を包含するプロモーター領域を含む。発現制御配列は、エンハンサー配列又は上流アクチベーター配列をまた含みうる。
「プロモーター」又は「プロモーター領域」という用語は、ＲＮＡポリメラーゼの認識及び結合部位を提供することにより前記コード配列の発現を制御する遺伝子のコード配列の上流（５’）のＤＮＡ配列を意味する。プロモーター領域は、前記遺伝子の転写の調節に関与する更なる因子のための更なる認識又は結合部位を含みうる。プロモーターは、原核生物又は真核生物の遺伝子の転写を制御しうる。プロモーターは「誘導性」であり得、誘導因子に応答して転写を開始するか、転写が誘導因子によって制御されていない場合は「構成的」でありうる。誘導性プロモーターは、誘導因子が存在しない場合、ごく僅かしか発現されないか、全く発現されない。誘導因子の存在下で、遺伝子は「スイッチオン」されるか、又は転写のレベルが増加する。これは、通常、特定の転写因子の結合によって媒介される。
本発明による好ましいプロモーターの例は、ＳＰ６、Ｔ３又はＴ７ポリメラーゼのプロモーターである。
本発明によれば、「発現」という用語は、その最も一般的な意味で使用され、ＲＮＡ及び／又はタンパク質の発現を含む。また、核酸の部分発現も含む。更に、発現は一過性又は安定的でありうる。ＲＮＡに関して、「発現」又は「翻訳」という用語は、メッセンジャーＲＮＡの鎖がアミノ酸配列のアセンブリを指示してペプチド又はタンパク質を作る細胞のリボソームでの過程に関する。
本発明の文脈において、「転写」という用語は、ＤＮＡ配列中の遺伝暗号がＲＮＡに転写される過程に関する。その後、ＲＮＡはタンパク質に翻訳されうる。本発明によれば、「転写」という用語は、「インビトロ転写」を含み、ここで、「インビトロ転写」という用語は、ＲＮＡ、特にｍＲＮＡが無細胞系でインビトロ合成される過程に関する。好ましくは、クローニングベクターが転写物の産生に適用される。これらのクローニングベクターは一般に転写ベクターと命名され、本発明によれば「ベクター」という用語に包含される。本発明によれば、ＲＮＡは好ましくはインビトロ転写ＲＮＡ（ＩＶＴ－ＲＮＡ）であり、適切なＤＮＡ鋳型のインビトロ転写によって得ることができる。転写を制御するためのプロモーターは、任意のＲＮＡポリメラーゼの任意のプロモーターでありうる。インビトロ転写のためのＤＮＡ鋳型は、核酸、特にｃＤＮＡをクローニングし、それをインビトロ転写のための適切なベクター中に導入することにより、得ることができる。ｃＤＮＡは、ＲＮＡの逆転写により得ることができる。
「発現の増強」、「増強された発現」又は「増加した発現」などの用語は、本発明の文脈において、所定数のＲＮＡ分子により発現されるペプチド又はタンパク質の量が同数のＲＮＡ分子によって発現されるペプチド又はタンパク質の量よりも多いことを意味し、ＲＮＡ分子の発現は、トスカーナウイルスＮＳｓタンパク質又はトスカーナウイルスＮＳｓタンパク質の機能的バリアントを含むウイルス由来因子の細胞への提供対トスカーナウイルスＮＳｓタンパク質又はトスカーナウイルスＮＳｓタンパク質の機能的バリアントを含むウイルス由来因子の細胞への非提供など、ＲＮＡの増強された又は増加した発現を生じる条件を除いて同じ条件下で実施される。これに関連して、「同じ条件」とは、同じペプチド又はタンパク質をコードする同じＲＮＡ配列が同じ手段によって同じ細胞に導入され、細胞が同じ条件下（発現の増強又は増加を生じる条件を除く）で培養され、ペプチド又はタンパク質の量が同じ手段で測定される状況を意味する。ペプチド又はタンパク質の量は、モル又は重量、例えばグラム、又は質量又はポリペプチド活性で与えられ得、例えばペプチド又はタンパク質が酵素である場合、それは触媒活性として与えられうるか、あるいはペプチド又はタンパク質が抗体又は抗原又は受容体である場合、それは結合親和性として与えられうる。一実施態様では、「発現の増強」、「増強された発現」又は「増加した発現」などの用語は、本発明の文脈において、所定数のＲＮＡ分子により、所定の期間内に発現されるペプチド又はタンパク質の量が、同じ数のＲＮＡ分子によって同じ期間内に発現されるペプチド又はタンパク質の量よりも高いことを意味する。例えば、所定数のＲＮＡ分子によって特定の時点で発現されるペプチド又はタンパク質の最大値は、同じ数のＲＮＡ分子によって発現されるペプチド又はタンパク質の最大値よりも高い場合がある。他の実施態様では、所与の数のＲＮＡ分子によって発現されるペプチド又はタンパク質の最大値は、同じ数のＲＮＡ分子によって発現されるペプチド又はタンパク質の最大値よりも高い必要はないが、所定の期間内に所定数のＲＮＡ分子によって発現されるペプチド又はタンパク質の平均量は、同じ数のＲＮＡ分子によって発現されるペプチド又はタンパク質の平均量よりも高い場合がある。後者の場合は、ここでは「より高いレベルの発現」又は「増加したレベルの発現」と呼ばれ、発現のより高い最大値及び／又は発現のより高い平均値に関する。あるいは又は加えて、「発現の増強」、「増強された発現」又は「増加した発現」などの用語は、本発明の文脈において、ペプチド又はタンパク質がＲＮＡ分子によって発現される時間が、ペプチド又はタンパク質が同じＲＮＡ分子によって発現される時間よりも長くなりうることをまた意味する。よって、一実施態様では、「発現の増強」、「増強された発現」又は「増加した発現」などの用語は、本発明の文脈において、ＲＮＡが安定して存在し発現される期間が、同数のＲＮＡ分子が安定して存在し発現される期間よりも長いため、所定数のＲＮＡ分子により発現されるペプチド又はタンパク質の量が、同数のＲＮＡ分子によって発現されるペプチド又はタンパク質の量よりも多いことをまた意味する。これらの場合は、ここでは「発現期間の増加」とも呼ばれる。好ましくは、そのようなより長い期間は、細胞中へのＲＮＡの導入後又は最初の導入後（例えば繰り返しトランスフェクションの場合）の少なくとも４８時間、好ましくは少なくとも７２時間、より好ましくは少なくとも９６時間、特に少なくとも１２０時間、又は更に長い間の発現を意味する。
ＲＮＡの発現レベル及び／又は発現期間は、例えば、ＥＬＩＳＡ手順、免疫組織化学手順、定量的画像解析手順、ウエスタンブロット、質量分析、定量的免疫組織化学手順、又は酵素アッセイを使用することにより、ＲＮＡによってコードされるペプチド又はタンパク質の発現の量、例えば発現した全量及び／又は所定の期間に発現した量、及び／又は発現の時間を測定することにより、決定されうる。
本発明によれば、特定のペプチド又はタンパク質に関して「コードするＲＮＡ」という用語は、適切な環境、好ましくは細胞内に存在する場合、ＲＮＡを発現させて前記ペプチド又はタンパク質を産生できることを意味する。好ましくは、本発明によるＲＮＡは、細胞翻訳機構と相互作用して、それがコードするペプチド又はタンパク質を提供することができる。
特定の実施態様では、本発明によるＲＮＡは、単一タイプのＲＮＡ分子、異なるＲＮＡ分子の集団、例えば、場合によっては異なるペプチド及び／又はタンパク質をコードする異なるＲＮＡ分子の混合物、全細胞ＲＮＡ、ＲＮＡライブラリー、又はその一部、例えば、未分化細胞、特に胚性幹細胞などの特定の幹細胞などの特定の細胞型で発現されるＲＮＡ分子のライブラリー、又は未分化細胞、特に分化細胞に対して胚性幹細胞のような幹細胞における濃縮発現したＲＮＡなどのＲＮＡ分子のライブラリーの画分を含む。よって、本発明によれば、「ＲＮＡ」という用語は、ＲＮＡ分子の混合物、全細胞ＲＮＡ又はその画分を含み得、それは、細胞からのＲＮＡの単離を含むプロセス及び／又は組換え手段、特にインビトロ転写によって得ることができる。
本発明によって使用されるＲＮＡは、既知の組成を有し得（この実施態様では、どのペプチド又はタンパク質がＲＮＡにより発現されるかが好ましくは知られている）、又はＲＮＡの組成は部分的又は完全に未知でありうる。あるいは、本発明によって使用されるＲＮＡは既知の機能を有していてもよく、又はＲＮＡの機能は部分的又は完全に未知であってもよい。
好ましくは、本発明によれば、細胞で発現されるＲＮＡが、インビトロ又はインビボの何れか、好ましくはインビトロで、前記細胞に導入される。ＲＮＡは、トスカーナウイルスＮＳｓタンパク質又はトスカーナウイルスＮＳｓタンパク質の機能的バリアントを含むウイルス由来因子を細胞に提供する前、後、及び／又は同時に細胞に細胞に導入されうる。好ましくは、細胞におけるＲＮＡの発現が望まれる限り、トスカーナウイルスＮＳｓタンパク質又はトスカーナウイルスＮＳｓタンパク質の機能的バリアントを含むウイルス由来因子が提供される。本発明による方法の一実施態様では、細胞に導入されるＲＮＡは、適切なＤＮＡ鋳型のインビトロ転写によって得られる。
本発明によれば、ＲＮＡは、インビトロ又はインビボの何れか、好ましくはインビトロで細胞に導入されうる。ＲＮＡがインビトロで導入される細胞は、好ましくは、本発明の方法によるインビトロでのＲＮＡの発現に続いて、患者に投与されうる。
「トランスフェクション」という用語は、核酸、特にＲＮＡの細胞への導入に関する。本発明の目的のために、「トランスフェクション」という用語は、細胞への核酸の導入又はそのような細胞による核酸の取り込みをまた含み、ここで、細胞は対象、例えば患者に存在しうる。従って、本発明によれば、ここに記載の核酸のトランスフェクションのための細胞は、インビトロ又はインビボで存在し得、例えば、細胞は、患者の器官、組織、及び／又は生物の一部を形成しうる。本発明によれば、トランスフェクションは一過性又は安定でありうる。トランスフェクションの幾つかの適用では、トランスフェクトされた遺伝物質が一過性にのみ発現されれば十分である。通常、トランスフェクション過程で導入された核酸は核ゲノムには組み込まれないため、外来核酸は有糸分裂によって希釈され又は分解される。核酸のエピソーム増幅を可能にする細胞は、希釈率を大幅に低下させる。トランスフェクトされた核酸が実際に細胞及びその娘細胞のゲノムに残ることが望まれる場合、安定したトランスフェクションが行われなければならない。ＲＮＡを細胞にトランスフェクトして、そのコードされたタンパク質を一過性に発現させることができる。
本発明によれば、核酸を細胞に導入する、すなわち移入し又はトランスフェクトするのに有用な任意の技術を使用することができる。好ましくは、ＲＮＡは標準的な技術により細胞にトランスフェクトされる。そのような技術には、エレクトロポレーション、リポフェクション及びマイクロインジェクションが含まれる。本発明の特に好ましい一実施態様では、ＲＮＡがエレクトロポレーションにより細胞に導入される。エレクトロポレーション又はエレクトロパーミアビリゼーションは、外部から加えられた電場によって引き起こされる細胞形質膜の電気伝導率と透過性の有意な増加に関連している。通常、分子生物学では、ある物質を細胞に導入する方法として使用される。本発明によれば、タンパク質又はペプチドをコードする核酸を細胞に導入すると、前記タンパク質又はペプチドの発現が生じることが好ましい。
細胞は、コードされたペプチド又はタンパク質を細胞内で（例えば、細胞質及び／又は核内で）発現し得、コードされたペプチド又はタンパク質を分泌し得、又は表面にそれを発現しうる。
本発明によれば、細胞は、単離された細胞でありうるか、又は器官、組織及び／又は生物の一部を形成しうる。本発明によれば、核酸の投与は、ネイキッド核酸として、又は投与試薬と組み合わせて達成される。好ましくは、核酸の投与はネイキッド核酸の形態である。好ましくは、ＲＮＡは、ＲＮａｓｅ阻害剤などの安定化物質と組み合わせて投与される。本発明は、核酸を細胞に繰り返し導入して、長期間にわたって持続的に発現させることをまた想定している。
本発明によれば、核酸は特定の細胞に向けられうる。そのような実施態様では、細胞に核酸を投与するために使用される担体（例えば、レトロウイルス又はリポソーム）は、結合したターゲティング分子を有しうる。例えば、標的細胞上の表面膜タンパク質に特異的な抗体などの分子、又は標的細胞上の受容体に対するリガンドが、核酸担体に取り込まれるか、又は結合されうる。リポソームによる核酸の投与が望ましい場合、エンドサイトーシスに関連する表面膜タンパク質に結合するタンパク質が、ターゲティング及び／又は吸収を可能にするためにリポソーム製剤に取り込まれうる。そのようなタンパク質には、特定の細胞型に特異的なカプシドタンパク質又はその断片、内在化されるタンパク質に対する抗体、細胞内部位を標的とするタンパク質等々が含まれる。
本発明によれば、「細胞へのＲＮＡの導入」という用語は、ＲＮＡが細胞の一部にただ導入され、細胞の一部がトランスフェクトされないままである実施態様を含み、好ましくはその実施態様に関する。一を超えるＲＮＡ分子、例えば、リプログラミング因子の機能セットを発現する一を超えるＲＮＡ分子又は目的のタンパク質をコードするＲＮＡ及びトスカーナウイルスＮＳｓタンパク質又はトスカーナウイルスＮＳｓタンパク質の機能性バリアントを含むウイルス由来因子をコードするＲＮＡが細胞に導入される場合、その用語は、全てのＲＮＡ分子が細胞の一部にただ導入され、細胞の一部がトランスフェクトされないままであるか又は前記ＲＮＡ分子の必ずしも全てではないものによってトランスフェクトされたままである実施態様が含まれ、好ましくはその実施態様に関する。何れにせよ、本発明に従って一を超えるＲＮＡ分子、例えば、リプログラミング因子の機能セットを発現する一を超えるＲＮＡ分子が細胞に導入される場合、目的は、例えば単一細胞内でリプログラミング因子の機能セットを発現させるために全てのＲＮＡ分子を細胞に導入することである。
「細胞生存率の向上」、「向上した細胞生存率」又は「増加した細胞生存率」などの用語は、本発明の文脈において、所定の条件下での生存又は生細胞の量が他の条件下での生存又は生細胞の量よりも多いことを意味し、ここで、トスカーナウイルスＮＳｓタンパク質又はトスカーナウイルスＮＳｓタンパク質の機能的バリアントを含むウイルス由来因子の細胞への提供対トスカーナウイルスＮＳｓタンパク質又はトスカーナウイルスＮＳｓタンパク質の機能的バリアントを含むウイルス由来因子の細胞への提供なしなど、向上した又は増加した細胞生存率をもたらす条件を除いて同じ条件下で培養が実施される。これに関連して、「同じ条件」とは、同じ細胞が使用され、細胞が同じ条件で（向上した又は増加した細胞生存率をもたらす条件を除く）培養され、細胞生存率が同じ手段によって測定される状況を意味する。「同じ条件」はまた細胞へのＲＮＡの導入又は繰り返し導入を包含する。
「細胞」又は「宿主細胞」という用語は、好ましくはインタクトな細胞、すなわち、酵素、細胞小器官、又は遺伝物質などのその正常な細胞内成分を放出していないインタクトな膜を有する細胞に関する。インタクトな細胞は、好ましくは、生存可能細胞、すなわち、その正常な代謝機能を実行できる生細胞である。好ましくは、前記用語は、本発明によれば、外因性核酸で形質転換又はトランスフェクトできる任意の細胞に関する。「細胞」という用語は、本発明によれば、原核細胞（例えば、大腸菌）又は真核細胞を含む。ヒト、マウス、ハムスター、ブタ、ヤギ、霊長類の細胞などの哺乳動物細胞が特に好ましい。細胞は、多数の組織型に由来し得、初代細胞及び細胞株を含みうる。具体例には、ケラチノサイト、末梢血白血球、骨髄幹細胞及び胚性幹細胞が含まれる。他の実施態様では、宿主細胞は、抗原提示細胞、特に樹状細胞、単球又はマクロファージである。一実施態様では、細胞は、ここに記載の体細胞である。一実施態様では、細胞はバリア機能を有する細胞である。好ましくは、細胞は、ここに記載の線維芽細胞などの線維芽細胞、ケラチノサイト、上皮細胞、又は内皮細胞、例えば心臓の内皮細胞、肺の内皮細胞、又は臍静脈内皮細胞である。好ましくは、細胞はヒト細胞である。
線維芽細胞は、細胞外マトリックスとコラーゲンを合成し、創傷治癒に重要な役割を果たす細胞型である。線維芽細胞の主な機能は、細胞外マトリックスの前駆体を連続的に分泌することにより、結合組織の構造的完全性を維持することである。線維芽細胞は、動物の結合組織の最も一般的な細胞である。線維芽細胞は形態的に不均一であり、その位置と活動に応じて多様な外観を持つ。
ケラチノサイトは、ヒトの皮膚の最外層である表皮の主要な細胞型である。ケラチノサイトの主な機能は、熱、紫外線、水分損失などの環境損傷から皮膚とその下の組織を保護するケラチン層の形成である。
上皮は、身体全体の腔と構造の表面を覆う細胞で構成される組織である。多くの腺もまた上皮組織から形成される。それは結合組織の上にあり、二つの層は基底膜によって分離される。ヒトでは、上皮は主要な体組織に分類され、他の組織は結合組織、筋肉組織及び神経組織である。上皮細胞の機能には、分泌、選択的吸収、保護、経細胞輸送、感覚の検出が含まれる。
内皮は血管の内面を覆う細胞の薄い層であり、管腔内の循環血液と血管壁の残りの部分との間に界面を形成する。これらの細胞は内皮細胞と呼ばれる。内皮細胞は、心臓から最小の毛細血管まで、循環系全体を覆っている。内皮組織は特殊なタイプの上皮組織である。
本発明の文脈における「組換え」という用語は、「遺伝子工学により作られた」ことを意味する。好ましくは、本発明の文脈における組換え細胞などの「組換え体」は、天然には生じない。
ここで使用される「天然に生じる」という用語は、対象が天然に見出すことができるという事実を意味する。例えば、（ウイルスを含む）生物中に存在し、自然の源から単離することができ、実験室において人間によって意図的に改変されていないペプチド又は核酸は天然に生じている。
細胞で発現されるＲＮＡは、一又は複数の目的のペプチド又はタンパク質をコードする。従って、ＲＮＡは、一又は複数の目的のペプチド又はタンパク質をコードする一又は複数のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含みうる。細胞で発現されるＲＮＡは、様々な目的のペプチド又はタンパク質、特に、特定の細胞型で発現されると特定の機能を果たすことができるため、特定の細胞型で発現されると対象となるペプチド又はタンパク質をコードしうる。
本発明によれば、「ペプチド」という用語は、オリゴペプチド及びポリペプチドを含み、２つ以上、好ましくは３つ以上、好ましくは４つ以上、好ましくは６つ以上、好ましくは８つ以上、好ましくは１０以上、好ましくは１３以上、好ましくは１６以上、好ましくは２０以上、及び好ましくは５０まで、好ましくは１００又は好ましくは１５０までの、ペプチド結合を介して互いに連結された連続アミノ酸を含む物質を意味する。「タンパク質」という用語は、大きなペプチド、好ましくは少なくとも１５１のアミノ酸を有するペプチドを意味するが、ここでは「ペプチド」及び「タンパク質」という用語は通常同義語として使用される。
「ペプチド」及び「タンパク質」という用語は、本発明によれば、アミノ酸成分だけでなく糖及びリン酸構造などの非アミノ酸成分もまた含む物質を含み、エステル、チオエーテル又はジスルフィド結合などの結合を含む物質もまた含む。
本発明によるＲＮＡは、単一のペプチド又はタンパク質、又は複数のペプチド又はタンパク質をコードしうる。複数のペプチド又はタンパク質は、単一のポリペプチド（融合ポリペプチド）として又は別個のペプチド又はタンパク質としてコードされうる。ポリタンパク質又は融合ポリペプチドは、場合によっては自己触媒的なプロテアーゼ切断部位（例えば、口蹄疫ウイルス２Ａタンパク質）又はインテインによって分離された個々のポリペプチドを含みうる。
本発明によれば、一実施態様では、ＲＮＡは薬学的に活性なＲＮＡを含むか又はそれからなる。「薬学的に活性なＲＮＡ」は、薬学的に活性なペプチド又はタンパク質をコードするＲＮＡでありうる。
「薬学的に活性なペプチド又はタンパク質」は、治療有効量で対象に投与されたとき、対象の状態又は病状に対して正の又は有利な効果を有する。好ましくは、薬学的に活性なペプチド又はタンパク質は治癒的又は対症的性質を有し、疾患又は障害の一又は複数の症状を回復させ、緩和し、軽減し、逆転し、その発症を遅らせ、又はその重症度を和らげるために投与されうる。薬学的に活性なペプチド又はタンパク質は予防的性質を有してもよく、疾患の発症を遅らせるため、又はそのような疾患又は病的状態の重症度を和らげるために使用されうる。「薬学的に活性なペプチド又はタンパク質」という用語は、タンパク質又はポリペプチド全体を含み、その薬学的に活性な断片をまた意味しうる。それはまたペプチド又はタンパク質の薬学的に活性なアナログを含みうる。「薬学的に活性なペプチド又はタンパク質」という用語には、抗原であるペプチド及びタンパク質が含まれ、すなわち、ペプチド又はタンパク質は、治療的又は部分的もしくは完全に保護的でありうる免疫応答を対象に誘発する。
一実施態様では、薬学的に活性なペプチド又はタンパク質は、免疫学的に活性な化合物又は抗原又はエピトープであるか、又はそれらを含む。
本発明によれば、「免疫学的に活性な化合物」という用語は、好ましくは免疫細胞の成熟を誘導し及び／又は抑制し、サイトカイン生合成を誘導し及び／又は抑制し、及び／又はＢ細胞による抗体産生を刺激することにより体液性免疫を改変することによって、免疫応答を改変する任意の化合物に関する。一実施態様では、免疫応答は、抗体応答（通常、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）を含む）の刺激を伴う。免疫学的に活性な化合物は、限定されないが、抗ウイルス及び抗腫瘍活性を含む強力な免疫刺激活性を有し、免疫応答の他の側面をまたダウンレギュレートすることができ、例えば広範囲のＴＨ２媒介疾患の治療に有用なＴＨ２免疫応答から免疫応答をシフトさせる。
本発明によれば、「抗原」又は「免疫原」という用語は、免疫応答を誘発する任意の物質を包含する。特に、「抗原」は、抗体又はＴリンパ球（Ｔ細胞）と特異的に反応する任意の物質に関する。本発明によれば、「抗原」という用語は、少なくとも一つのエピトープを含む任意の分子を含む。好ましくは、本発明の文脈における抗原は、場合によってはプロセシング後に、好ましくは抗原に特異的な免疫反応を誘導する分子である。本発明によれば、免疫反応の候補である任意の適切な抗原を使用することができ、免疫反応は体液性免疫反応と細胞性免疫反応の両方でありうる。本発明の実施態様の文脈において、抗原は、好ましくは、細胞、好ましくは抗原提示細胞により、ＭＨＣ分子の文脈で提示され、抗原に対する免疫反応をもたらす。抗原は、好ましくは、天然に生じる抗原に対応するか又は由来する産物である。そのような天然に生じる抗原は、アレルゲン、ウイルス、細菌、真菌、寄生虫、及び他の感染性因子及び病原体を含みうるか、又はそれらに由来し得、又は抗原はまた腫瘍抗原でありうる。本発明によれば、抗原は、天然に生じる産物、例えばウイルスタンパク質、又はその一部に対応しうる。好ましい実施態様では、抗原は表面ポリペプチド、すなわち、細胞、病原体、細菌、ウイルス、真菌、寄生虫、アレルゲン、又は腫瘍の表面に天然に提示されるポリペプチドである。抗原は、細胞、病原体、細菌、ウイルス、真菌、寄生虫、アレルゲン、又は腫瘍に対する免疫応答を誘発しうる。
「病原体」という用語は、生物、好ましくは脊椎動物に疾患を引き起こし得る病原性生物由来物質を意味する。病原体には、微生物、例えば細菌、単細胞真核生物（原生動物）、真菌、並びにウイルスが含まれる。
「エピトープ」、「抗原ペプチド」、「抗原エピトープ」、「免疫原性ペプチド」及び「ＭＨＣ結合ペプチド」という用語は、ここでは互換的に使用され、抗原などの分子の抗原決定基、すなわち、免疫系によって認識され、例えば、特にＭＨＣ分子の文脈で提示される場合、Ｔ細胞によって認識される免疫学的に活性な化合物の部分又は断片を意味する。タンパク質のエピトープは、好ましくは前記タンパク質の連続又は不連続部分を含み、好ましくは５～１００、好ましくは５～５０、より好ましくは８～３０、最も好ましくは１０～２５アミノ酸長であり、例えばエピトープは、好ましくは９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、又は２５アミノ酸長でありうる。本発明によれば、エピトープは、細胞の表面上のＭＨＣ分子などのＭＨＣ分子に結合し得、よって、「ＭＨＣ結合ペプチド」又は「抗原ペプチド」でありうる。「主要組織適合性複合体」という用語と「ＭＨＣ」という略語は、ＭＨＣクラスＩ及びＭＨＣクラスＩＩ分子を含み、全ての脊椎動物に存在する遺伝子の複合体に関する。ＭＨＣタンパク質又は分子は、免疫反応においてリンパ球と抗原提示細胞又は罹患細胞との間のシグナル伝達に重要であり、ＭＨＣタンパク質又は分子がペプチドに結合し、Ｔ細胞受容体による認識のためにそれらを提示する。ＭＨＣによってコードされるタンパク質は、細胞の表面に発現され、Ｔ細胞に対して自己抗原（細胞自体からのペプチド断片）と非自己抗原（例えば、侵入微生物の断片）の両方を提示する。好ましいそのような免疫原性部分は、ＭＨＣクラスＩ又はクラスＩＩ分子に結合する。ここで使用される場合、免疫原性部分は、そのような結合が当該技術分野で知られている任意のアッセイを使用して検出可能である場合、ＭＨＣクラスＩ又はクラスＩＩ分子に「結合」すると言われる。「ＭＨＣ結合ペプチド」という用語は、ＭＨＣクラスＩ及び／又はＭＨＣクラスＩＩ分子に結合するペプチドに関する。クラスＩ ＭＨＣ／ペプチド複合体の場合、結合ペプチドは典型的には８～１０アミノ酸長であるが、より長い又は短いペプチドも効果的でありうる。クラスＩＩ ＭＨＣ／ペプチド複合体の場合、結合ペプチドは典型的には１０～２５アミノ酸長であり、特に１３～１８アミノ酸長であるが、より長い及びより短いペプチドが効果的でありうる。
一実施態様では、本発明による目的のタンパク質は、標的生物のワクチン接種に適したエピトープを含む。当業者には、免疫生物学及びワクチン接種の原理の一つが、治療される疾患に対して免疫学的に関連する抗原で生物を免疫することにより疾患に対する免疫保護反応が生じるという事実に基づいていることが分かるであろう。本発明によれば、抗原は、自己抗原及び非自己抗原を含む群から選択される。非自己抗原は、好ましくは、細菌抗原、ウイルス抗原、真菌抗原、アレルゲン又は寄生虫抗原である。抗原は、標的生物に免疫応答を誘発することができるエピトープを含むことが好ましい。例えば、エピトープは、細菌、ウイルス、真菌、寄生虫、アレルゲン、又は腫瘍に対して免疫応答を誘発しうる。
幾つかの実施態様では、非自己抗原は細菌抗原である。幾つかの実施態様では、抗原は、鳥、魚、及び家畜を含む哺乳動物を含む動物に感染する細菌に対する免疫応答を誘発する。好ましくは、免疫応答が誘発される細菌は病原性細菌である。
幾つかの実施態様では、非自己抗原はウイルス抗原である。ウイルス抗原は、例えば、ウイルス表面タンパク質由来のペプチド、例えばカプシドポリペプチド又はスパイクポリペプチドでありうる。幾つかの実施態様では、抗原は、鳥、魚、及び家畜を含む哺乳動物を含む動物に感染するウイルスに対する免疫応答を誘発する。好ましくは、免疫応答が誘発されるウイルスは病原性ウイルスである。
幾つかの実施態様では、非自己抗原は真菌由来のポリペプチド又はタンパク質である。幾つかの実施態様では、抗原は、鳥、魚、及び家畜を含む哺乳動物を含む動物に感染する真菌に対する免疫応答を誘発する。好ましくは、免疫応答が誘発される真菌は病原性真菌である。
幾つかの実施態様では、非自己抗原は、単細胞真核生物寄生虫由来のポリペプチド又はタンパク質である。幾つかの実施態様では、抗原は、単細胞真核生物寄生虫、好ましくは病原性単細胞真核生物寄生虫に対する免疫応答を誘発する。病原性単細胞真核生物寄生虫は、例えば、プラスモジウム属、例えば熱帯熱マラリア原虫、三日熱マラリア原虫、四日熱マラリア原虫又は卵形マラリア原虫、リーシュマニア属、又はトリパノソーマ属、例えばクルーズトリパノソーマ又はブルセイトリパノソーマに由来しうる。
幾つかの実施態様では、非自己抗原はアレルゲン性ポリペプチド又はアレルゲン性タンパク質である。アレルゲン性タンパク質又はアレルゲン性ポリペプチドは、減感作としても知られているアレルゲン免疫療法に適している。
幾つかの実施態様では、抗原は自己抗原、特に腫瘍抗原である。腫瘍抗原とその決定は、当業者に知られている。
本発明の文脈において、「腫瘍抗原」又は「腫瘍関連抗原」という用語は、限られた数の組織及び／又は器官において、又は特定の発達段階で特異的に発現される通常の条件下にあるタンパク質に関し、例えば、腫瘍抗原は、胃組織、好ましくは胃粘膜、生殖器、例えば精巣、栄養膜組織、例えば胎盤、又は生殖系列細胞で特異的に発現される正常な条件下にあり得、一又は複数の腫瘍又はがん組織で発現又は異常発現される。この文脈において、「限られた数」は、好ましくは３以下、より好ましくは２以下を意味する。本発明の文脈における腫瘍抗原には、例えば、分化抗原、好ましくは細胞型特異的分化抗原、すなわち所定の分化段階で所定の細胞型に特異的に発現される正常な状態にあるタンパク質、がん／精巣抗原、すなわち精巣で、時には胎盤で特異的に発現される正常な状態にあるタンパク質、及び生殖系列特異的抗原が含まれる。本発明の文脈において、腫瘍抗原は、好ましくはがん細胞の細胞表面に随伴しており、好ましくは正常組織では発現されないか、又は稀にしか発現されない。好ましくは、腫瘍抗原又は腫瘍抗原の異常な発現により、がん細胞が特定される。本発明の文脈において、対象、例えばがん疾患を患っている患者のがん細胞によって発現される腫瘍抗原は、好ましくは、前記対象の自己タンパク質である。好ましい実施態様では、本発明の文脈における腫瘍抗原は、特に非必須の組織又は器官、すなわち免疫系により損傷を受けた場合に対象の死に至らない組織又は器官においてあるいは免疫系がアクセスできないか又は殆どアクセスできない身体の器官又は構造内で正常条件下で発現される。好ましくは、腫瘍抗原のアミノ酸配列は、正常組織で発現される腫瘍抗原とがん組織で発現される腫瘍抗原との間で同一である。
本発明において有用でありうる腫瘍抗原の例は、ｐ５３、ＡＲＴ－４、ＢＡＧＥ、ベータ－カテニン／ｍ、Ｂｃｒ－ａｂＬ ＣＡＭＥＬ、ＣＡＰ－１、ＣＡＳＰ－８、ＣＤＣ２７／ｍ、ＣＤＫ４／ｍ、ＣＥＡ、クローディンファミリーの細胞表面タンパク質、例えばクローディン－６、クローディン－１８．２及びクローディン－１２、ｃ－ＭＹＣ、ＣＴ、Ｃｙｐ－Ｂ、ＤＡＭ、ＥＬＦ２Ｍ、ＥＴＶ６－ＡＭＬ１、Ｇ２５０、ＧＡＧＥ、ＧｎＴ－Ｖ、Ｇａｐ１００、ＨＡＧＥ、ＨＥＲ－２／ｎｅｕ、ＨＰＶ－Ｅ７、ＨＰＶ－Ｅ６、ＨＡＳＴ－２、ｈＴＥＲＴ（又はｈＴＲＴ）、ＬＡＧＥ、ＬＤＬＲ／ＦＵＴ、ＭＡＧＥ－Ａ、好ましくはＭＡＧＥ－Ａ１、ＭＡＧＥ－Ａ２、ＭＡＧＥ－Ａ３、ＭＡＧＥ－Ａ４、ＭＡＧＥ－Ａ５、ＭＡＧＥ－Ａ６、ＭＡＧＥ－Ａ７、ＭＡＧＥ－Ａ８、ＭＡＧＥ－Ａ９、ＭＡＧＥ－Ａ１０、ＭＡＧＥ－Ａ１１、又はＭＡＧＥ－Ａ１２、ＭＡＧＥ－Ｂ、ＭＡＧＥ－Ｃ、ＭＡＲＴ－１／メランＡ、ＭＣ１Ｒ、ミオシン／ｍ、ＭＵＣ１、ＭＵＭ－１、－２、－３、ＮＡ８８－Ａ、ＮＦ１、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＮＹ－ＢＲ－１、ｐ１９０マイナーＢＣＲ－ａｂＬ、Ｐｍ１／ＲＡＲａ、ＰＲＡＭＥ、プロテイナーゼ３、ＰＳＡ、ＰＳＭ、ＲＡＧＥ、ＲＵ１又はＲＵ２、ＳＡＧＥ、ＳＡＲＴ－１又はＳＡＲＴ－３、ＳＣＧＢ３Ａ２、ＳＣＰ１、ＳＣＰ２、ＳＣＰ３、ＳＳＸ、ＳＵＲＶＩＶＩＮ、ＴＥＬ／ＡＭＬ１、ＴＰＩ／ｍ、ＴＲＰ－１、ＴＲＰ－２、ＴＲＰ－２／ＩＮＴ２、ＴＰＴＥ及びＷＴである。特に好ましい腫瘍抗原には、クローディン－１８．２（ＣＬＤＮ１８．２）及びクローディン－６（ＣＬＤＮ６）が含まれる。
本発明に従って、ここに記載のＲＮＡを使用することにより免疫応答を誘導し又は増強することが望まれる場合、ＲＮＡによりコードされる抗原又はエピトープ又はそのプロセシング産物は、樹状細胞などの抗原提示細胞上に発現される主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）タンパク質により提示されうる。ついで、ＭＨＣペプチド複合体は、Ｔ細胞などの免疫細胞によって認識され得、その活性化に至る。よって、抗原タンパク質又はペプチドをコードするＲＮＡに関連して使用される好ましい細胞は、樹状細胞などの抗原提示細胞である。
よって、本発明は、抗原をコードするＲＮＡがエクスビボで抗原提示細胞に、例えば患者から採取された抗原提示細胞に導入されて、抗原を発現し、場合によってはエクスビボでクローン増殖された抗原提示細胞が患者に、例えば同じ患者に移植される実施態様を想定する。トランスフェクトされた細胞は、当該分野で知られた任意の手段を使用して、好ましくは静脈内、腔内、腹腔内又は腫瘍内投与により滅菌形態で患者に導入されうる。
一実施態様では、特に抗原が関与する疾患を有する哺乳動物を治療することが望まれる場合、抗原をコードするＲＮＡを哺乳動物に投与することができる。同ＲＮＡは、トスカーナウイルスＮＳｓタンパク質又はトスカーナウイルスＮＳｓタンパク質の機能的バリアントを含むウイルス由来因子をコードするオープンリーディングフレームを含み得、又はトスカーナウイルスＮＳｓタンパク質又はトスカーナウイルスのＮＳｓタンパク質の機能的バリアントを含むウイルス由来因子をコードするオープンリーディングフレームを含むＲＮＡが加えて投与されうる。ＲＮＡは哺乳類の抗原提示細胞（単球、マクロファージ、樹状細胞又は他の細胞）に取り込まれる。ＲＮＡの抗原翻訳産物が形成され、その産物がＴ細胞による認識のために細胞の表面に提示される。
本発明の方法は、抗原をコードするＲＮＡを発現するための抗原提示細胞を含みうる。この目的のために、本発明の方法は、樹状細胞などの抗原提示細胞中への抗原をコードするＲＮＡの導入を含みうる。樹状細胞などの抗原提示細胞のトランスフェクションのために、抗原をコードするＲＮＡを含む薬学的組成物を使用してもよい。ＲＮＡを樹状細胞又は他の抗原提示細胞に標的化する送達ビヒクルを患者に投与して、インビボで起こるトランスフェクションを生じさせることができる。
幾つかの実施態様では、薬学的に活性なペプチド又はタンパク質が免疫応答を誘発する抗原である必要はない。適切な薬学的に活性なタンパク質又はペプチドは、サイトカイン及び免疫系タンパク質、例えば免疫学的に活性な化合物（例えば、インターロイキン、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、エリスロポエチン、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、インターフェロン、インテグリン、アドレシン、セレチン、ホーミング受容体、Ｔ細胞受容体、免疫グロブリン）、ホルモン（インスリン、甲状腺ホルモン、カテコールアミン、ゴナドトロピン、栄養ホルモン、プロラクチン、オキシトシン、ドーパミン、ウシ成長ホルモン、レプチン等）、成長ホルモン（例えば、ヒト成長ホルモン）、増殖因子（例えば、表皮増殖因子、神経増殖因子、インスリン様増殖因子等）、増殖因子受容体、酵素（組織プラスミノーゲンアクチベーター、ストレプトキナーゼ、コレステロール生合成又は分解性、ステロイド産生酵素、キナーゼ、ホスホジエステラーゼ、メチラーゼ、デメチラーゼ、デヒドロゲナーゼ、セルラーゼ、プロテアーゼ、リパーゼ、ホスホリパーゼ、アロマターゼ、シトクロム、アデニル酸又はグアニル酸シクラーゼ、ノイラミダーゼ等）、受容体（ステロイドホルモン受容体、ペプチド受容体）、結合タンパク質（成長ホルモン又は増殖因子結合タンパク質等）、転写及び翻訳因子、腫瘍増殖抑制タンパク質（例えば、血管新生を阻害するタンパク質）、構造タンパク質（コラーゲン、フィブロイン、フィブリノーゲン、エラスチン、チューブリン、アクチン、ミオシンなど）、血液タンパク質（トロンビン、血清アルブミン、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、インスリン、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、組織プラスミノーゲンアクチベーター、プロテインＣ、フォンウィルブランド因子、アンチトロンビンＩＩＩ、グルコセレブロシダーゼ、エリスロポエチン顆粒球コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）又は修飾第ＶＩＩＩ因子、抗凝固剤等からなる群から選択されうる。一実施態様では、本発明による薬学的に活性なタンパク質は、リンパ系ホメオスタシスの調節に関与するサイトカイン、好ましくはＴ細胞の発生、プライミング、増殖、分化及び／又は生存に関与し、好ましくはこれを誘導し又は増強するサイトカインである。一実施態様では、サイトカインはインターロイキン、例えばＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、又はＩＬ－２１である。
ここに記載のペプチド又はタンパク質を発現する細胞は、様々な疾患、特に前記ペプチド又はタンパク質の提供が治療又は予防効果をもたらす疾患の治療又は予防治療に使用されうる。例えば、ウイルスに由来する抗原の発現は、前記ウイルスにより引き起こされるウイルス性疾患の治療に有用でありうる。腫瘍抗原の発現は、がん細胞が前記腫瘍抗原を発現するがん疾患の治療に有用でありうる。
「疾患」という用語は、個体の身体に影響を及ぼす異常な状態を意味する。疾患はしばしば特定の症状や兆候に関連する病状として解釈される。疾患は、感染症などの元々外部からの因子によって引き起こされうるか、又は自己免疫疾患などの内部機能障害によって引き起こされうる。
本発明によれば、「疾患」という用語はがん疾患をまた意味する。「がん疾患」又は「がん」という用語（医学用語：悪性新生物）は、細胞群が、制御されない増殖（正常な限界を超えた分裂）、浸潤（隣接組織への侵入及び破壊）及びしばしば転移（リンパ又は血液を介して体内の他の部位に広がる）を示す疾患クラスを意味する。がんのこれら三つの悪性特性は、それらを、自己限定されており、浸潤も転移もしない良性腫瘍と区別する。殆どのがんは腫瘍、すなわち細胞（新生物細胞又は腫瘍細胞と呼ばれる）の異常な増殖によって形成される腫脹又は病変を形成するが、白血病のような一部はそうではない。がんの例には、限定されないが、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、神経膠腫及び白血病が含まれる。より具体的には、そのようながんの例には、骨がん、血液がん、肺がん、肝臓がん、膵臓がん、皮膚がん、頭頸部がん、皮膚又は眼内悪性メラノーマ、子宮がん、卵巣がん、直腸がん、肛門部のがん、胃がん、結腸がん、乳がん、前立腺がん、子宮がん、性器及び生殖器の癌腫、ホジキン病、食道のがん、小腸のがん、内分泌系のがん、甲状腺のがん、副甲状腺のがん、副腎のがん、軟部組織の肉腫、膀胱のがん、腎臓のがん、腎細胞癌腫、腎盂の癌腫、中枢神経系（ＣＮＳ）の新生物、神経外胚葉性がん、脊髄軸腫瘍、神経膠腫、髄膜腫、及び下垂体腺腫が含まれる。本発明による「がん」という用語は、がん転移をまた含む。
「感染症」という用語は、個体から個体へ、又は生物から生物へ伝染する可能性があり、微生物因子（例えば、風邪）によって引き起こされるあらゆる疾患を意味する。感染性疾患の例には、ウイルス感染症、例えばＡＩＤＳ（ＨＩＶ）、Ａ型、Ｂ型又はＣ型肝炎、ヘルペス、帯状疱疹（水疱）、風疹（風疹ウイルス）、黄熱病、デング熱等フラビウイルス、インフルエンザウイルス、出血性感染症（マールブルグ又はエボラウイルス）、及び重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）、細菌感染症、例えばレジオネラ病（レジオネラ）、性感染症（例えば、クラミジア又は淋病）、胃潰瘍（ヘリコバクター）、コレラ（ビブリオ）、結核、ジフテリア、大腸菌、ブドウ球菌、サルモネラ又は連鎖球菌（破傷風）による感染；マラリア、睡眠病、リーシュマニア症などの原虫病原体による感染；トキソプラズマ症、すなわち、マラリア原虫、トリパノソーマ、リーシュマニア及びトキソプラズマによる感染；又は例えばクリプトコッカス・ネオフォルマンス、ヒストプラズマ・カプスラーツム、コクシジオイデス・イミチス、ブラストミセス・デルマチチジス、又はカンジダ・アルビカンスにより引き起こされる真菌感染症が含まれる。
「自己免疫疾患」という用語は、身体がそれ自体の組織の何らかの構成要素に対して免疫原性（すなわち免疫系）応答を作り出す任意の疾患を意味する。言い換えれば、免疫系は、身体内の一部の組織又は系を自己として認識し、それが異物であるかのように標的にして攻撃する能力を失う。自己免疫疾患は、主に一つの器官が影響を受けるもの（例えば、溶血性貧血や抗免疫性甲状腺炎）と、自己免疫疾患の過程が多くの組織に拡散するもの（例えば、全身性エリテマトーデス）に分類できる。例えば、多発性硬化症は、脳と脊髄の神経線維を囲む鞘を攻撃するＴ細胞によって引き起こされると考えられている。これは、調整の失調、弱さ、及び視界不良をもたらす。自己免疫疾患は当該技術分野で知られており、例えば、橋本甲状腺炎、グレーブス病、ループス、多発性硬化症、リウマチ性関節炎、溶血性貧血、抗免疫甲状腺炎、全身性エリテマトーデス、セリアック病、クローン病、大腸炎、糖尿病、強皮症、乾癬等々を含む。
ここに記載のＲＮＡは、インビトロ又はインビボで、細胞、特にＴ細胞などの免疫エフェクター細胞においてＴ細胞受容体又は人工Ｔ細胞受容体を発現させるのにまた有用である。よって、一実施態様では、ここに記載のＲＮＡによってコードされるペプチド又はタンパク質は、Ｔ細胞受容体又は人工Ｔ細胞受容体の一又は複数の鎖である。
そのようなＴ細胞受容体又は人工Ｔ細胞受容体を発現するように操作された細胞は、Ｔ細胞受容体又は人工Ｔ細胞受容体によって結合されるここに記載の抗原などの抗原の発現を特徴とする疾患、特にここに記載の疾患の治療に有用である。Ｔ細胞受容体又は人工Ｔ細胞受容体を発現する改変Ｔ細胞による養子細胞移植療法は、有望な治療法である。例えば、患者のＴ細胞は、患者の罹患細胞上の抗原に特異的に向けられたＴ細胞受容体又は人工Ｔ細胞受容体を発現するように遺伝子操作（遺伝子改変）され得、その後患者に注入される。
よって、更なる態様では、本発明は、Ｔ細胞受容体の鎖又は人工Ｔ細胞受容体の鎖をコードする一又は複数のＲＮＡ分子をＴ細胞又はその前駆体に導入し、トスカーナウイルスＮＳｓタンパク質又はトスカーナウイルスＮＳｓタンパク質の機能的バリアントを含むウイルス由来因子を細胞に提供する工程を含む免疫反応性細胞を産生する方法を提供する。
本発明の文脈における「免疫反応性細胞」又は「免疫エフェクター細胞」という用語は、免疫反応中にエフェクター機能を発揮する細胞に関する。「免疫反応性細胞」は、好ましくは、ＭＨＣ分子との関連で細胞の表面に発現されるか又は細胞の表面に提示される抗原などの抗原に結合し、免疫応答を媒介することができる。例えば、そのような細胞は、サイトカイン及び／又はケモカインを分泌し、微生物を殺し、抗体を分泌し、感染した又はがん性の細胞を認識し、場合によってはそのような細胞を排除する。例えば、免疫反応性細胞は、Ｔ細胞（細胞傷害性Ｔ細胞、ヘルパーＴ細胞、腫瘍浸潤Ｔ細胞）、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、好中球、マクロファージ、及び樹状細胞を含む。好ましくは、本発明の文脈において、「免疫反応性細胞」はＴ細胞、好ましくはＣＤ４＋及び／又はＣＤ８＋Ｔ細胞である。本発明によれば、「免疫反応性細胞」という用語は、適切な刺激で免疫細胞（Ｔ細胞、特にＴヘルパー細胞、又は細胞溶解性Ｔ細胞など）に成熟できる細胞をまた含む。免疫反応性細胞は、ＣＤ３４＋造血幹細胞、未熟及び成熟Ｔ細胞、並びに未熟及び成熟Ｂ細胞を含む。抗原に曝露されたときの、Ｔ細胞前駆体の細胞溶解性Ｔ細胞への分化は、免疫系のクローン選択に類似している。
大部分のＴ細胞には、幾つかのタンパク質の複合体として存在するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）がある。実際のＴ細胞受容体は、独立したＴ細胞受容体アルファ及びベータ（ＴＣＲα及びＴＣＲβ）遺伝子から生成され、α－及びβ－ＴＣＲ鎖と呼ばれる二つの別個のペプチド鎖で構成される。γδＴ細胞（ガンマデルタＴ細胞）は、その表面に別個のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を持つＴ細胞の小サブセットを表す。しかし、γδＴ細胞では、ＴＣＲは一つのγ鎖と一つのδ鎖で構成されている。この群のＴ細胞は、αβＴ細胞よりもはるかに一般的ではない（全Ｔ細胞の２％）。本発明の好ましい実施態様では、Ｔ細胞受容体はα－及びβ－ＴＣＲ鎖を含む。Ｔ細胞受容体のα鎖及びβ鎖をコードするＲＮＡは、別個の核酸分子、すなわちＲＮＡ分子、又は代わりに単一のＲＮＡ分子に含まれている場合がある。従って、細胞におけるＴ細胞受容体の発現には、異なるＴ細胞受容体鎖をコードする別個のＲＮＡ分子の共トランスフェクション、又は異なるＴ細胞受容体鎖をコードする一種類のみのＲＮＡ分子のトランスフェクションが必要とされる。
Ｔ細胞などの免疫エフェクター細胞にモノクローナル抗体の特異性などの任意の特異性を付与する、ここで「人工Ｔ細胞受容体」、「キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）」又は「キメラＴ細胞受容体」と呼ばれる操作受容体が産生されている。そのようなＴ細胞は、標的細胞の認識のために抗原のプロセシング及び提示を必ずしも必要とせず、むしろ標的細胞上に存在する任意の抗原を認識しうる。本発明によれば、人工Ｔ細胞受容体は、抗原結合ドメイン、例えば抗体の抗原結合部分及びＴ細胞受容体、例えば単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、Ｔ細胞シグナル伝達ドメイン、例えばＣＤ３－ゼータのエンドドメイン、及び場合によっては一又は複数の同時刺激ドメイン、例えばＣＤ２８、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、及びＣＤ２７８（ＩＣＯＳ）を含みうる。
ここに記載のＲＮＡは、体細胞を幹様細胞、すなわち、幹細胞特性を有する細胞にインビトロ又はインビボでリプログラミングし又は脱分化することにおいてまた有用である。これには、細胞のリプログラミング又は脱分化プロセスを開始するために、インビトロ又はインビボでのリプログラミング因子の一過性発現が含まれうる。よって、一実施態様では、ここに記載のＲＮＡによりコードされるペプチド又はタンパク質は、幹細胞特性を有する細胞への体細胞のリプログラミングを可能にする因子である。幹様細胞は、胚又は胎児を生成することなく、本発明によって提供されうる。幹細胞特性、特に多能性を有する細胞への体細胞の脱分化は、体細胞への体細胞の脱分化を誘導するＲＮＡコード化因子（リプログラミング転写因子（ｒＴＦ）又はリプログラミング因子とも呼ばれる）を導入し、細胞を培養して細胞を脱分化させることにより、なされうる。脱分化した後、細胞は、神経、造血、筋肉、上皮、及び他の細胞型などの同じ又は異なる体細胞型に再分化するように誘導されうる。よって、そのような幹様細胞は、「細胞療法」による変性疾患の治療に医学的用途があり、心臓、神経、内分泌、血管、網膜、皮膚、筋肉骨格障害、及び他の疾患の治療における新規治療戦略に利用できる。
従って、本発明は、また、（ｉ）体細胞を含む細胞集団を提供する工程、（ｉｉ）トスカーナウイルスＮＳｓタンパク質又はトスカーナウイルスＮＳｓタンパク質の機能的バリアントを含むウイルス由来因子を体細胞に提供する工程、（ｉｉｉ）一又は複数のリプログラミング因子をコードするＲＮＡを体細胞に導入する工程、及び（ｉｖ）幹細胞特性を有する細胞の発生を可能にする工程を含む、幹細胞特性を有する細胞を提供するための方法に関する。
一実施態様では、一又は複数のリプログラミング因子は、ＯＣＴ４及びＳＯＸ２を含む。一又は複数のリプログラミング因子は、ＫＬＦ４及び／又はｃ－ＭＹＣ及び／又はＮＡＮＯＧ及び／又はＬＩＮ２８を更に含みうる。一実施態様では、一又は複数のリプログラミング因子は、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４及びｃ－ＭＹＣを含み、ＬＩＮ２８と場合によってはＮＡＮＯＧを更に含みうる。一実施態様では、一又は複数のリプログラミング因子は、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、及びＬＩＮ２８を含む。
一実施態様では、本方法は、少なくとも一種のヒストンデアセチラーゼ阻害剤の存在下で体細胞を培養する工程を更に含み、少なくとも一種のヒストンデアセチラーゼ阻害剤は、好ましくはバルプロ酸、酪酸ナトリウム、トリコスタチンＡ及び／又はスクリプタイドを含む。
一実施態様では、幹細胞特性を有する細胞の発生を可能にする工程は、胚性幹細胞培養条件下で体細胞を培養することを含む。
一実施態様では、幹細胞の特徴は、胚性幹細胞の形態を含む。
一実施態様では、幹細胞特性を有する細胞は、正常な核型を有し、テロメラーゼ活性を発現し、胚性幹細胞に特徴的な細胞表面マーカーを発現し、及び／又は胚性幹細胞に特徴的な遺伝子を発現する。
一実施態様では、幹細胞特性を有する細胞は多能性状態を示す。
一実施態様では、幹細胞特性を有する細胞は、三つ全ての一次胚葉の高度な派生物に分化する発生能を有する。
一実施態様では、体細胞は、肺線維芽細胞、包皮線維芽細胞又は皮膚繊維芽細胞などの線維芽細胞である。好ましくは、体細胞はヒト細胞である。
一実施態様では、ＲＮＡは、エレクトロポレーション又はリポフェクションにより体細胞に導入される。一実施態様では、ＲＮＡは体細胞に繰り返し導入される。
一実施態様では、ここに開示されるリプログラミング因子をコードするＲＮＡの体細胞への導入は、長期間にわたって、好ましくは少なくとも１０日間、好ましくは少なくとも１１日間、より好ましくは少なくとも１２日間にわたって、前記因子の発現をもたらす。そのような長期の発現を達成するためには、好ましくはエレクトロポレーションを使用して、ＲＮＡを細胞に１回を超えて定期的に（すなわち、繰り返し）導入することが好ましい。好ましくは、ＲＮＡは、長期間にわたって一又は複数の因子の発現を確実にするために、少なくとも２回、より好ましくは少なくとも３回、より好ましくは少なくとも４回、更により好ましくは少なくとも５回から好ましくは６回まで、より好ましくは７回まで、又は更には８、９又は１０回まで、好ましくは少なくとも１０日間、好ましくは少なくとも１１日間、より好ましくは少なくとも１２日間の期間にわたって細胞に導入される。好ましくは、ＲＮＡの反復導入間に経過する期間は、２４時間から１２０時間、好ましくは４８時間から９６時間である。一実施態様では、ＲＮＡの反復導入間に経過する期間は、７２時間以下、好ましくは４８時間又は３６時間以下である。一実施態様では、次のエレクトロポレーションの前に、細胞を以前のエレクトロポレーションから回復させることができる。何れの場合でも、条件は、リプログラミング過程をサポートする量と期間で因子が細胞内で表現されるように選択されるべきである。
「幹細胞」とは、自己再生し、未分化のままであり、かつ分化する能力を有する細胞である。幹細胞は、少なくともそれが自然に存在する動物の寿命の間、無制限に分裂できる。幹細胞は最終分化していない；それは分化経路の最終段階にはない。幹細胞が分裂すると、各娘細胞は幹細胞のままであるか、又は最終分化に向かう過程に乗り出しうる。
全能性幹細胞は、全能性分化特性を有し、完全な生物に発達することができる細胞である。この特性は、精子による卵母細胞の受精後の８細胞期までの細胞が有している。これらの細胞を単離して子宮に移植すると、完全な生物になりうる。
多能性幹細胞は、外胚葉、中胚葉、及び内胚葉の層に由来する様々な細胞及び組織に発達することができる細胞である。受精後４～５日に発生される、胚盤胞の内部にある内部細胞塊に由来する多能性幹細胞は「胚性幹細胞」と呼ばれ、様々な組織細胞に分化できるが、新しい生物を形成することはできない。
多分化能幹細胞は、それらの組織及び起源の器官に固有の細胞型のみに通常は分化する幹細胞である。多分化能幹細胞は、胎児期、新生児期、成人期の様々な組織や器官の成長と発達だけでなく、成人組織の恒常性の維持と組織損傷時に再生を誘導する機能にも関与している。組織特異的な多分化能細胞は、総称して「成体幹細胞」と呼ばれる。
「胚性幹細胞」又は「ＥＳＣ」は、胚に存在するか、胚から単離された幹細胞である。それは、生物に存在するありとあらゆる細胞に分化する能力を有する多能性、又は一を超える細胞型に分化する能力を有する多分化能性でありうる。
ここで使用される場合、「胚」とは、その発生の初期段階にある動物を意味する。これらの段階は、三つの胚芽層が定義され樹立される着床と原腸形成、並びにそれぞれの器官と器官系への胚葉の分化によって特徴付けられる。三つの胚葉は内胚葉、外胚葉、及び中胚葉である。
「胚盤胞」とは、受精卵が卵割を受け、流体で満たされた空洞を取り囲む球形の細胞層が形成されているか、又は形成された発生初期の胚である。この球状の細胞層は栄養外胚葉である。栄養外胚葉の内部には、内部細胞塊（ＩＣＭ）と呼ばれる細胞クラスターがある。栄養外胚葉は胎盤の前駆体であり、ＩＣＭは胚の前駆体である。
体性幹細胞とも呼ばれる成体幹細胞は、成体に見出される幹細胞である。成体幹細胞は、分化した組織に見出され、それ自体を再生し得、幾つかの制限付きで分化して、その起源の組織の特殊化した細胞型を生じ得る。例には、間葉系幹細胞、造血幹細胞、神経幹細胞が含まれる。
「分化細胞」とは、より特殊化した形態又は機能への進行性の発達的変化を受けた成熟細胞である。細胞分化は、明らかに特殊化した細胞型に成熟するときに細胞が受ける過程である。分化細胞は異なる特徴を有し、特定の機能を果たし、分化の少ない対応物よりも分裂する可能性が低くなる。
「未分化」細胞、例えば、未成熟、胚、又は原始細胞は、典型的には非特異的な外観を有し、複数の非特異的な活動を実施し得、分化細胞によって典型的に実施される機能において、もしあったとしても不十分に機能しうる。
「体細胞」とは、任意の全ての分化細胞を指し、幹細胞、生殖細胞、又は配偶子は含まない。好ましくは、ここで使用される「体細胞」は最終分化細胞を指す。一実施態様では、体細胞は、肺線維芽細胞、包皮線維芽細胞又は皮膚線維芽細胞などの線維芽細胞、又はケラチノサイトである。
一実施態様では、体細胞は、間葉系表現型を有する胚性幹細胞由来の体細胞である。好ましい実施態様では、体細胞は、線維芽細胞、例えば胎児線維芽細胞又は出生後の線維芽細胞又はケラチノサイト、好ましくは毛包由来ケラチノサイトである。更なる実施態様では、線維芽細胞は肺線維芽細胞、包皮線維芽細胞又は皮膚繊維芽細胞である。特定の実施態様では、線維芽細胞は、カタログ番号ＣＣＬ－１８６の下でアメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）に寄託され、カタログ番号ＣＲＬ－２０９７の下にアメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）に寄託され、又はカタログ番号ＣＲＬ－２５２２の下にアメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）に寄託され、カタログ番号ＰＣ５０１Ａ－ＨＦＦの下にＳＢＩ Ｓｙｓｔｅｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓによって流通され、又はカタログ番号Ｐ１０８５７の下にＩｎｎｏｐｒｏｔによって流通された線維芽細胞である。一実施態様では、線維芽細胞は成人のヒト皮膚線維芽細胞である。好ましくは、体細胞はヒト細胞である。本発明によれば、体細胞は遺伝的に改変されうる。
ここで使用される場合、「コミットされた」とは、特定の機能に永続的にコミットされたとみなされる細胞を意味する。コミットされた細胞はまた「最終分化細胞」とも呼ばれる。
ここで使用される場合、「分化」とは、特定の形態又は機能に対する細胞の適応を意味する。細胞では、分化は、よりコミットされた細胞に導く。
ここで使用される場合、「脱分化」とは、形態又は機能の特殊化の喪失を意味する。細胞では、脱分化は、コミットが少ない細胞に導く。
ここで使用される場合、「リプログラミング」とは、細胞の遺伝的プログラムのリセットを意味する。リプログラムされた細胞は、好ましくは多能性を示す。
「脱分化した」及び「リプログラムされた」という用語又は類似の用語は、幹細胞特性を有する体細胞由来細胞を示すためにここでは互換的に使用される。しかしながら、前記用語は、機構的又は機能的考慮により、ここで開示される主題を限定することを意図していない。
ここで使用される場合、「生殖細胞」は、精母細胞又は卵母細胞などの生殖性細胞、又は生殖性細胞に発達する細胞を意味する。
ここで使用される場合、「多能性」とは、胎盤の細胞又は子宮の他の支持細胞を除く任意の細胞型を生じさせることができる細胞を意味する。
「幹細胞特性を有する細胞」という用語は、分化した体細胞性非幹細胞に由来するが、幹細胞、特に胚性幹細胞に典型的な一又は複数の特徴を示す細胞を示すためにここでは使用される。そのような特徴には、胚性幹細胞の形態、例えばコンパクトなコロニー、高い核対細胞質比及び顕著な核小体、正常核型、テロメラーゼ活性の発現、胚性幹細胞に特徴的な細胞表面マーカーの発現、及び／又は胚性幹細胞に特徴的な遺伝子の発現が含まれる。胚性幹細胞に特徴的な細胞表面マーカーは、例えば、ステージ特異的胎児抗原－３（ＳＳＥＡ－３）、ＳＳＥＡ－４、腫瘍関連抗原－１－６０（ＴＲＡ－１－６０）、ＴＲＡ－１－８１、及びＴＲＡ－２－４９／６Ｅからなる群から選択される。胚性幹細胞に特徴的な遺伝子は、例えば、内因性ＯＣＴ４、内因性ＮＡＮＯＧ、増殖及び分化因子３（ＧＤＦ３）、ｒｅｄｕｃｅｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ １（ＲＥＸ１）、線維芽細胞増殖因子４（ＦＧＦ４）、胚細胞特異的遺伝子１（ＥＳＧ１）、ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ２（ＤＰＰＡ２）、ＤＰＰＡ４、及びテロメラーゼ逆転写酵素（ＴＥＲＴ）からなる群から選択される。一実施態様では、幹細胞に典型的な一又は複数の特徴には多能性が含まれる。一実施態様では、幹細胞特性を有する細胞は多能性状態を示す。一実施態様では、幹細胞の特徴を有する細胞は、三つ全ての一次胚葉の高度な派生物に分化する発生能を有する。一実施態様では、一次胚葉は内胚葉であり、高度な派生物は腸様上皮組織である。更なる実施態様では、一次胚葉は中胚葉であり、高度な派生物は横紋筋及び／又は軟骨である。更に別の実施態様では、一次胚葉は外胚葉であり、高度な派生物は神経組織及び／又は表皮組織である。好ましい一実施態様では、幹細胞特性を有する細胞は、神経細胞及び／又は心臓細胞に分化する発生能を有する。本発明によれば、一般に、「幹細胞特性を有する細胞」、「幹細胞の性質を有する細胞」、「幹様細胞」、「リプログラム細胞」及び「脱分化細胞」という用語又は類似の用語は類似の意味を有し、ここでは互換的に使用される。
本発明による「リプログラミング因子」という用語は、幹細胞特性を有する細胞への体細胞のリプログラミングを、場合によっては更なるリプログラミング因子などの更なる薬剤と共に誘導するタンパク質及びペプチド並びにその誘導体及びバリアントを含む。例えば、「リプログラミング因子」という用語は、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、ＬＩＮ２８、ＫＬＦ４、及びｃ－ＭＹＣを含む。
リプログラミング因子は、あらゆる動物種（例えば哺乳類及びげっ歯類）のものでありうる。哺乳類の例には、ヒト及び非ヒト霊長類が含まれるが、これらに限定されない。霊長類には、ヒト、チンパンジー、ヒヒ、カニクイザル、及び任意の他の新世界又は旧世界サルが含まれるが、これらに限定されない。げっ歯類には、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、スナネズミが含まれるが、これらに限定されない。
本発明の一実施態様では、幹細胞特性を有する細胞への体細胞のリプログラミングを可能にすることができるリプログラミング因子は、（ｉ）ＯＣＴ４及びＳＯＸ２、（ｉｉ）ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、及びＮＡＮＯＧとＬＩＮ２８の一方又は両方、（ｉｉｉ）ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、及びＫＬＦ４とｃ－ＭＹＣの一方又は両方からなる群から選択される因子のアセンブリを含む。一実施態様では、前記リプログラミング因子は、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ及びＬＩＮ２８、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４及びｃ－ＭＹＣ、又はＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、ｃ－ＭＹＣ、ＮＡＮＯＧ及びＬＩＮ２８を含む。
ＯＣＴ４は、真核生物ＰＯＵ転写因子の転写因子であり、胚性幹細胞の多能性の指標である。それは母性発現されるオクトマー結合タンパク質である。卵母細胞、未分化胚芽細胞の内部細胞塊、及び始原生殖細胞にもまた存在することが観察されている。遺伝子ＰＯＵ５Ｆ１はＯＣＴ４タンパク質をコードしている。遺伝子名の同義語には、ＯＣＴ３、ＯＣＴ４、ＯＴＦ３及びＭＧＣ２２４８７が含まれる。特定の濃度でのＯＣＴ４の存在は、胚性幹細胞が未分化のままであるために必要である。好ましくは、「ＯＣＴ４タンパク質」又は単に「ＯＣＴ４」は、ヒトＯＣＴ４に関する。
Ｓｏｘ２は、単一のＨＭＧ ＤＮＡ結合ドメインを持つ転写因子をコードするＳｏｘ（ＳＲＹ関連ＨＭＧボックス）遺伝子ファミリーのメンバーである。ＳＯＸ２は、分化するその能力を阻害することにより、神経前駆細胞を制御することが見出されている。因子の抑制は、脳室帯からの剥離をもたらし、これに細胞周期の終了が続く。また、これらの細胞は、前駆細胞と初期の神経分化マーカーの喪失により、その前駆細胞の特性を失い始める。好ましくは、「ＳＯＸ２タンパク質」又は単に「ＳＯＸ２」は、ヒトＳＯＸ２に関する。
ＮＡＮＯＧはＮＫ－２型ホメオドメイン遺伝子であり、胚性幹細胞の再生と分化に重要な遺伝子の発現を調節することにより、おそらく幹細胞多能性を維持する上で重要な役割を果たすことが提案されている。ＮＡＮＯＧは、そのＣ末端に異常に強い二つの活性化ドメインが埋め込まれた転写活性化因子として機能する。ＮＡＮＯＧ発現の減少は、胚性幹細胞の分化を誘導する。好ましくは、「ＮＡＮＯＧタンパク質」又は単に「ＮＡＮＯＧ」はヒトＮＡＮＯＧに関する。
ＬＩＮ２８は、ＲＮＡ結合モチーフ：低温ショックドメインと一対のレトロウイルス型ＣＣＨＣジンクフィンガーの、異常な対形成を伴う保存された細胞質タンパク質である。哺乳類では、多様な型の未分化細胞に豊富にある。多能性哺乳動物細胞では、ＬＩＮ２８はポリ（Ａ）結合タンパク質とのＲＮａｓｅ感受性複合体、及びショ糖勾配のポリソーム画分で観察されており、ｍＲＮＡの翻訳に関連していることが示唆される。好ましくは、「ＬＩＮ２８タンパク質」又は単に「ＬＩＮ２８」はヒトＬＩＮ２８に関する。
Ｋｒｕｅｐｐｅｌ様因子（ＫＬＦ４）はジンクフィンガー転写因子であり、様々な組織、例えば結腸、胃、皮膚の有糸分裂後上皮細胞で強く発現している。ＫＬＦ４は、これらの細胞の最終分化に不可欠であり、細胞周期の調節に関与している。好ましくは、「ＫＬＦ４タンパク質」又は単に「ＫＬＦ４」はヒトＫＬＦ４に関する。
ＭＹＣ（ｃＭＹＣ）はプロトオンコジーンであり、広範囲のヒトがんで過剰発現している。特異的に変異し又は過剰発現すると、細胞増殖が増加し、癌遺伝子として機能する。ＭＹＣ遺伝子は、エンハンサーボックス配列（Ｅボックス）での結合とヒストンアセチルトランスフェラーゼ（ＨＡＴ）のリクルートを通じて、全ての遺伝子の１５％の発現を調節する転写因子をコードする。ＭＹＣは、転写因子のＭＹＣファミリーに属し、これにはＮ－ＭＹＣ及びＬ－ＭＹＣ遺伝子もまた含まれる。ＭＹＣファミリーの転写因子は、ｂＨＬＨ／ＬＺ（ベーシック・へリックス・ループ・へリックスロイシンジッパー）ドメインを含む。好ましくは、「ｃＭＹＣタンパク質」又は単に「ｃＭＹＣ」はヒトｃＭＹＣに関する。
ここでのＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、ＬＩＮ２８、ＫＬＦ４又はｃ－ＭＹＣなどの特定の因子への言及は、これらの因子の全てのバリアントも含むように理解されるべきである。特に、細胞によって自然に発現されるこれらの因子の全てのスプライスバリアント、翻訳後修飾バリアント、コンフォメーション、アイソフォーム、及び種ホモログも含むように理解されるべきである。
本発明によれば、ペプチド又はタンパク質のバリアントは、好ましくは、それが由来するペプチド又はタンパク質の機能特性を有する。そのような機能特性は、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、ＬＩＮ２８、ＫＬＦ４、及びｃ－ＭＹＣについてそれぞれここに記載される。好ましくは、ペプチド又はタンパク質のバリアントは、動物分化細胞のリプログラミングにおいて、それが由来するペプチド又はタンパク質と同じ特性を有する。好ましくは、バリアントは動物分化細胞のリプログラミングを誘導し又は増強する。
「リプログラミング因子の機能セット」は、幹細胞特性を有する細胞に体細胞をリプログラミングするのに有用なリプログラミング因子のセットであり、すなわち、体細胞で発現されたときのリプログラミング因子のセットは、幹細胞特性を有する細胞への体細胞のリプログラミングを行うのに十分である。
本発明の一実施態様では、リプログラミング因子の機能セットは、リプログラミングを達成するように細胞内に全て存在しなければならないリプログラミング因子より多くを含みうる。従って、本発明は、ＲＮＡレプリコンのセットなどのＲＮＡ分子のセットが異なるリプログラミング因子をコードする実施態様を含む。例えば、異なるＲＮＡ分子は、異なるリプログラミング因子をコードする異なるオープンリーディングフレームを含みうる。これらの異なるＲＮＡ分子、すなわちＲＮＡ分子のセットは、細胞に同時接種されて、リプログラミング因子の機能的なセットを提供しうる。
「ｍｉＲＮＡ」（マイクロＲＮＡ）という用語は、標的ｍＲＮＡの分解を誘導及び／又は翻訳を防止することにより、ＥＳＣ自己再生／分化及び細胞周期進行に関連するものを含む多くの細胞機能を調節する、真核細胞に見出される２１～２３ヌクレオチド長の非コードＲＮＡに関する。ｍｉＲＮＡは、標的メッセンジャーＲＮＡ転写物（ｍＲＮＡ）の相補配列に結合し、通常は翻訳抑制又は標的分解及び遺伝子サイレンシングをもたらす転写後調節因子である。適切な組み合わせのｍｉＲＮＡは、インビトロで幹細胞の特性を有する細胞への体細胞の直接的な細胞リプログラミングを誘導できることが見出された。例えば、ｍｉＲＮＡクラスター３０２～３６７は体細胞リプログラミングを増強することが観察された。
好ましくは、幹細胞特性を有する細胞の発生を可能にする工程は、胚性幹細胞培養条件下、好ましくは多能性幹細胞を未分化状態に維持するのに適した条件下で体細胞を培養することを含む。
好ましくは、幹細胞特性を有する細胞の発生を可能にするために、細胞は一又は複数のＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害剤及び／又は一又は複数のヒストンデアセチラーゼ阻害剤の存在下で培養される。好ましい化合物は、５’－アザシチジン（５’－ａｚａＣ）、スベロイルアニリドヒドロキサム酸（ＳＡＨＡ）、デキサメタゾン、トリコスタチンＡ（ＴＳＡ）、酪酸ナトリウム（ＮａＢｕ）、スクリプタイド及びバルプロ酸（ＶＰＡ）からなる群から選択される。好ましくは、細胞は、バルプロ酸（ＶＰＡ）の存在下で、好ましくは０．５から１０ｍＭの間、より好ましくは１から５ｍＭの間の濃度、最も好ましくは約２ｍＭの濃度で培養される。
本発明の方法は、あらゆる型の体細胞の脱分化をもたらすために使用することができる。使用されうる細胞には、本発明の方法により脱分化され又はリプログラムされうる細胞、特に完全に又は部分的に分化した、より好ましくは最終分化した細胞が含まれる。好ましくは、体細胞は、前胚、胚、胎児、及び出生後の多細胞生物に由来する二倍体細胞である。使用されうる細胞の例には、限定されないが、胎児及び新生児線維芽細胞又は成人線維芽細胞などの線維芽細胞、ケラチノサイト、特に初代ケラチノサイト、より好ましくは毛髪由来のケラチノサイト、脂肪細胞、上皮細胞、表皮細胞、軟骨細胞、卵丘細胞、神経細胞、グリア細胞、星状細胞、心臓細胞、食道細胞、筋肉細胞、メラニン細胞、造血細胞、骨細胞、マクロファージ、単球、及び単核細胞が含まれる。使用されうる細胞の例には、血液由来の内皮細胞及び内皮前駆細胞、及び尿由来の上皮細胞が含まれる。
本発明の方法を使用することができる細胞は、任意の動物種のもの；例えば哺乳類及びげっ歯類でありうる。本発明によって脱分化され再分化されうる哺乳動物細胞の例には、限定されないが、ヒト及び非ヒト霊長類細胞が含まれる。本発明を実施することができる霊長類細胞には、限定されないが、ヒト、チンパンジー、ヒヒ、カニクイザル、及び任意の他の新世界又は旧世界サルの細胞が含まれる。本発明が実施されうるげっ歯類細胞には、限定されないが、マウス、ラット、モルモット、ハムスター及びスナネズミ細胞が含まれる。
本発明に従って調製された脱分化細胞は、多能性幹細胞と同じ要件の多くを示すと予想され、胚性幹細胞に使用される条件下で、例えば、ＥＳ細胞培地又は胚細胞の増殖を維持する任意の培地で増殖させ維持することができる。胚性幹細胞は、培養中の照射されたマウス胚性線維芽細胞又はヒト線維芽細胞（例えば、ヒト包皮線維芽細胞、ヒト皮膚線維芽細胞、ヒト子宮内膜線維芽細胞、ヒト卵管線維芽細胞）などの不活化胎児線維芽細胞で維持されると、インビトロでその多能性を保持する。一実施態様では、ヒトフィーダー細胞は、直接分化によりリプログラムされた細胞の同じ培養物に由来する自己フィーダー細胞でありうる。
更に、ヒト胚性幹細胞は、マウス胎児線維芽細胞で馴化された培地中のマトリゲル上で成功裏に増殖させることができる。ヒト幹細胞は、長期間培養で増殖でき、特定の培養条件下では未分化のままである。
所定の実施態様では、細胞培養条件は、細胞の分化を阻害するか、そうでなければ細胞の脱分化を増強することができ、例えば、細胞の非ＥＳ細胞、栄養外胚葉又は他の細胞型への分化を防ぐ因子と細胞を接触させることを含みうる。
本発明に従って調製された脱分化細胞は、細胞の表現型の変化を監視し、それらの遺伝子及びタンパク質発現を特徴付けることを含む方法によって評価することができる。遺伝子発現はＲＴ－ＰＣＲにより決定でき、翻訳産物は免疫細胞化学及びウェスタンブロッティングにより決定できる。特に、脱分化細胞は、トランスクリプトミクスを含む当該分野でよく知られた技術を使用して、遺伝子発現のパターンと、胚幹細胞などの未分化多能性制御細胞に予想される発現パターンに類似した遺伝子発現のパターンをリプログラムされた細胞が示すかどうかを決定するために特徴付けることができる。
この点に関して、脱分化細胞の次の遺伝子の発現を評価できる：ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、ＬＩＮ２８、増殖及び分化因子３（ＧＤＦ３）、ｒｅｄｕｃｅｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ １（ＲＥＸ１）、線維芽細胞増殖因子４（ＦＧＦ４）、胚細胞特異的遺伝子１（ＥＳＧ１）、ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ２（ＤＰＰＡ２）、ＤＰＰＡ４、テロメラーゼ逆転写酵素（ＴＥＲＴ）、胚性抗原－３（ＳＳＥＡ－３）、ＳＳＥＡ－４、腫瘍関連抗原－１－６０（ＴＲＡ－１－６０）、ＴＲＡ－１－８１、及びＴＲＡ－２－４９／６Ｅ。
リプログラムされた細胞が比較されうる未分化又は胚性幹細胞は、分化体細胞と同じ種に由来しうる。あるいは、リプログラムされた細胞が比較されうる未分化又は胚性幹細胞は、分化体細胞とは異なる種に由来しうる。
幾つかの実施態様では、未分化細胞で特異的に発現される所定の遺伝子がリプログラムされた細胞においても発現される場合、リプログラムされた細胞と未分化細胞、例えば胚性幹細胞との間に遺伝子発現パターンの類似性が存在する。例えば、分化体細胞では典型的には検出できない所定の遺伝子、例えばテロメラーゼを使用して、リプログラミングの程度を監視することができる。同様に、所定の遺伝子については、発現の欠如を使用してリプログラミングの程度を評価することができる。
テロメラーゼ活性の誘導によって特徴付けられる自己再生能力は、脱分化細胞で監視できる幹細胞の別の特徴である。
核型分析は、有糸分裂細胞からの染色体の広がり、スペクトル核型分析、テロメア長のアッセイ、全ゲノムハイブリダイゼーション、又は当該技術分野で周知の他の技術によって実施されうる。
本発明を使用して、適切な因子をコードするＲＮＡが、一又は複数の体細胞に、例えば、エレクトロポレーションにより取り込まれる。取り込み後、細胞は、好ましくは、脱分化細胞の維持を支援する条件（すなわち、幹細胞培養条件）を使用して培養される。その後、脱分化細胞を増殖させ、誘導して、細胞療法に必要とされる様々な型の体細胞に再分化させることができる。本発明に従って得られた脱分化細胞は、インビトロ又はインビボで一又は複数の所望の体細胞型に分化するように誘導することができる。
好ましくは、本発明に従って得られた脱分化細胞は、三つの胚性胚葉、すなわち内胚葉、中胚葉、及び外胚葉の何れかから細胞を生じさせうる。例えば、脱分化細胞は、骨格筋、骨格、皮膚の真皮、結合組織、泌尿生殖器系、心臓、血液（リンパ細胞）、及び脾臓（中胚葉）；胃、結腸、肝臓、膵臓、膀胱；尿道のライニング、気管の上皮部分、肺、咽頭、甲状腺、副甲状腺、腸（内胚葉）；又は中枢神経系、網膜と水晶体、脳と感覚、神経節と神経、色素細胞、頭部結合組織、表皮、毛髪、乳腺（外胚葉）に分化しうる。本発明に従って得られた脱分化細胞は、当該分野で知られた技術を使用して、インビトロで又はインビボで再分化されうる。
本発明の一実施態様では、この発明の方法から得られるリプログラムされた細胞を使用して、分化した子孫を産生する。従って、一態様では、本発明は、（ｉ）この発明の方法を使用してリプログラムされた細胞を得ること；及び（ｉｉ）リプログラムされた細胞の分化を誘導して分化細胞を産生することを含む、分化細胞を産生する方法を提供する。工程（ｉｉ）はインビボ又はインビトロで実施されうる。更に、分化は、例えば、リプログラムされた細胞が導入されている身体、器官、又は組織内に加えられ得又はインサイツで存在する適切な分化因子の存在により、誘導されうる。分化細胞は、細胞、組織、及び／又は臓器移植の分野で有利に使用される細胞、組織、及び／又は臓器を誘導するために使用することができる。所望されるならば、例えば、リプログラミングの前に体細胞に遺伝子組換えを導入することができる。本発明の分化細胞は、好ましくは、胚性幹細胞又は胚性生殖細胞の多能性を有さず、本質的に、組織特異的な部分的又は完全に分化した細胞である。
本発明の方法の一つの利点は、本発明により得られるリプログラムされた細胞が、細胞株の事前の選択又は精製又は樹立なしに分化できることである。従って、所定の実施態様では、リプログラムされた細胞を含む細胞の異種集団は、所望の細胞型に分化される。一実施態様では、本発明の方法から得られた細胞の混合物は、一又は複数の分化因子に曝露され、インビトロで培養される。
ここに開示された方法によって得られたリプログラムされた細胞を分化させる方法は、リプログラムされた細胞の透過処理の工程を含みうる。例えば、ここに記載のリプログラミング技術によって産生された細胞、又は代わりにリプログラムされた細胞を含む細胞の異種混合物は、一又は複数の分化因子又は細胞抽出物又は分化因子を含む他の調製物への曝露の前に透過処理されうる。
例えば、分化細胞は、少なくとも一種の分化因子の存在下で未分化のリプログラムされた細胞を培養し、培養物から分化細胞を選択することにより得られうる。分化細胞の選択は、分化細胞上に存在する所定の細胞マーカーの発現などの表現型に基づいて、又は機能的アッセイ（例えば、特定の分化した細胞型の一又は複数の機能を実行する能力）に基づいてもよい。
別の実施態様では、本発明に従ってリプログラムされた細胞は、それらのＤＮＡ配列の付加、欠失、又は修飾により遺伝的に修飾される。
本発明に従って調製されたリプログラムされた細胞又は脱分化細胞、又はリプログラムされた細胞又は脱分化細胞に由来する細胞は、研究及び治療に有用である。リプログラムされた多能性細胞は、限定されないが皮膚、軟骨、骨骨格筋、心筋、腎臓、肝臓、血液及び造血、血管前駆体及び血管内皮、膵ベータ、ニューロン、グリア、網膜、神経、腸、肺、肝臓の細胞を含む体内の細胞の任意のものに分化されうる。
リプログラムされた細胞は、再生／修復療法に有用であり、それを必要とする患者に移植されうる。一実施態様では、細胞は患者の自己由来である。
本発明に従って提供されるリプログラムされた細胞は、例えば、心臓病、神経病、内分泌病、血管病、網膜病、皮膚病、筋骨格障害、及び他の疾患の治療における治療ストラテジーで使用されうる。
例えば、限定は意図されないが、本発明のリプログラムされた細胞は、年齢又はがん放射線療法及び化学療法などのアブレーション療法によりその天然細胞が枯渇した動物の細胞を補充するために使用できる。別の非限定的な例では、本発明のリプログラムされた細胞は、臓器再生及び組織修復に有用である。本発明の一実施態様では、リプログラムされた細胞を使用して、ジストロフィー筋肉及び心筋梗塞などの虚血性イベントによって損傷した筋肉を含む損傷した筋肉組織を再活性化することができる。本発明の別の実施態様では、ここに開示されるリプログラムされた細胞を使用して、外傷又は手術後のヒトを含む動物の瘢痕を回復させることができる。この実施態様では、本発明のリプログラムされた細胞は、静脈内など全身的に投与され、損傷細胞によって分泌された循環サイトカインによって動員された新たに外傷を受けた組織の部位に移動する。本発明の別の実施態様では、リプログラムされた細胞は、修復又は再生を必要とする治療部位に局所的に投与されうる。
ここに記載の薬剤、例えば核酸、特にＲＮＡ、並びに細胞は、特にここに記載の治療に使用される場合、薬剤と場合によっては一又は複数の薬学的に許容される担体、希釈剤及び／又は賦形剤を含む薬学的組成物又はキットの形態で存在しうる。
薬学的組成物は好ましくは無菌であり、有効量の核酸を含む。
薬学的組成物は通常、均一な剤形で提供され、当該技術分野で知られている方法で調製されうる。薬学的組成物は、例えば、溶液又は懸濁液の形態でありうる。
薬学的組成物は、塩、緩衝物質、保存料、担体、希釈剤及び／又は賦形剤を含み得、それらの全てが好ましくは薬学的に許容される。「薬学的に許容される」という用語は、薬学的組成物の活性成分の作用を妨げない材料の非毒性を意味する。
薬学的に許容可能ではない塩を、薬学的に許容される塩を調製するために使用してもよく、本発明に含まれる。この種の薬学的に許容される塩は、非限定的な形で、次の酸から調製された塩を含む：塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸、マレイン酸、酢酸、サリチル酸、クエン酸、ギ酸、マロン酸、コハク酸等々。薬学的に許容される塩は、ナトリウム塩、カリウム塩又はカルシウム塩などのアルカリ金属塩又はアルカリ土類金属塩としてまた調製されうる。
薬学的組成物での使用に適した緩衝物質には、塩中の酢酸、塩中のクエン酸、塩中のホウ酸、及び塩中のリン酸が含まれる。
薬学的組成物での使用に適した保存料には、塩化ベンザルコニウム、クロロブタノール、パラベン及びチメロサールが含まれる。
「担体」という用語は、適用を促進し、強化し又は可能にするために活性成分と組み合わされる、天然又は非天然（合成）の性質の有機又は無機成分を意味する。本発明によれば、「担体」という用語は、患者への投与に適した一又は複数の適合性のある固体又は液体充填剤、希釈剤又はカプセル化物質をまた含む。
非経口投与のための可能な担体物質は、例えば、滅菌水、グルコース溶液、リンゲル、乳酸リンゲル、滅菌塩化ナトリウム溶液、ポリアルキレングリコール、水素化ナフタレン、特に、生体適合性ラクチドポリマー、ラクチド／グリコリドコポリマー又はポリオキシエチレン／ポリオキシプロピレンコポリマーである。
ここで使用される「賦形剤」という用語は、薬学的組成物中に存在し得、例えば担体、結合剤、潤滑剤、増粘剤、界面活性剤、保存料、乳化剤、緩衝液、香料、又は着色料などの活性成分ではない全ての物質を示すことを意図している。
ここに記載の薬学的組成物は、注射又は注入を含む非経口投与によるなど、任意の一般的な経路を介して投与されうる。投与は、好ましくは非経口的、例えば静脈内、動脈内、皮下、リンパ節内、皮内又は筋肉内である。
非経口投与に適した組成物は、通常、活性化合物の滅菌水性又は非水性調製物を含み、これは好ましくはレシピエントの血液と等張である。適合性のある担体と溶媒の例は、リンゲル液と等張性塩化ナトリウム溶液である。加えて、通常、無菌の固定油が溶液又は懸濁媒質として使用される。
ここに記載の薬剤及び組成物は、好ましくは有効量で投与される。「有効量」とは、単独で又は更なる用量と一緒に、所望の反応又は所望の効果を達成する量を意味する。特定の疾患又は特定の状態の治療の場合、所望の反応は、好ましくは疾患の経過の阻害に関する。これは、病気の進行を遅くすること、特に、病気の進行を中断し又は逆転させることを含む。疾患又は状態の治療における所望の反応はまた前記疾患又は前記状態の発症の遅延又は発症の予防でありうる。
ここに記載の薬剤又は組成物の有効量は、治療される状態、疾患の重症度、年齢、生理学的状態、サイズ及び体重を含む患者の個々のパラメーター、治療期間、付随する治療（存在する場合）のタイプ、特定の投与経路、及び類似の要因に依存する。従って、ここに記載の薬剤の投与量は、これらのパラメーターの幾つかに依存しうる。患者の反応が初期用量では不十分である場合、より高い用量（又は異なる、より局所的な投与経路により達成される効果的により高い用量）が使用されうる。
本発明を、限定のためではなく、例示のためにのみ解釈されるべきである次の図及び実施例により詳細に説明する。説明及び実施例に基づいて、更なる実施態様が当業者に利用可能であり、同様に本発明の範囲内である。
ＮＳｓはヒト線維芽細胞における合成ｍＲＮＡに対するＩＦＮ応答の阻害のためにＥＫＢを置換できる ＮＳｓはＲＮＡベースのリプログラミングを可能にする ＮＳｓはＳＦＶ自己複製ＲＮＡに対するＩＦＮ応答を阻害し、プロテインキナーゼＲの活性化を防ぐ ＮＳｓはＶＥＥＶ自己複製ＲＮＡでトランスフェクション率を増加させ、翻訳を増加させ、ＩＦＮ応答を遮断する ＮＳｓはＶＥＥＶトランスレプリコンの発現を改善し、ＩＦＮ応答を阻害する ＮＳｓは免疫細胞におけるトランスレプリコンの発現を改善する ＮＳｓは、免疫細胞におけるＶＥＥＶトランス複製及び自己複製ＲＮＡの発現を改善し、細胞死を防ぐ
実施例１：ＮＳｓはヒト線維芽細胞における合成ｍＲＮＡに対するＩＦＮ応答の阻害のためにＥＫＢを置換できる
人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞の生成は、ヒト胚性幹（ｈＥＳ）細胞の使用に付随する倫理的懸念から幹細胞研究を解放する大きな可能性を秘めている。多能性が内因性多能性ネットワークによって維持されるまで、外因性多能性関連転写因子（ＴＦ）を連続発現させることが、体細胞のリプログラミングを達成するための鍵である。ｉＰＳ技術の臨床翻訳に関しては、標的細胞ゲノムへのゲノム統合のリスクを回避することが重要である。従って、合成ｍＲＮＡは厳密に一過性であり、複合ＲＮＡ混合物は体細胞に容易にトランスフェクトされうるため、合成ｍＲＮＡがおそらく最も適切なベクターである。それにもかかわらず、合成ｍＲＮＡは、細胞ＲＮＡとは異なる特定の分子パターンを区別できる細胞受容体によって認識される。これは、細胞の防御機構につながり、アポトーシス、細胞骨格再編成、ＲＮＡ分解、及び細胞の成功裡のリプログラミングを妨げる翻訳の停止をもたらす。我々は、ウイルスエスケープタンパク質Ｅ３、Ｋ３及びＢ１８Ｒ（ＥＫＢ）を使用して細胞のＩＦＮ応答を打ち消す、非修飾ＲＮＡベースのリプログラミングアプローチを確立することができ、ヒト線維芽細胞と血液成長内皮前駆細胞（ＥＰＣ）のリプログラミングを成功させることができた（Hum Gene Ther. 2015 Nov;26(11):751-66）。トスカーナウイルス由来のウイルスエスケープタンパク質ＮＳｓは、ＩＦＮ応答の強力な阻害剤であることが示された。ここでは、我々は、ヒト線維芽細胞のＩＦＮ応答に対するＮＳｓの効果を調査する。最初のステップにおいて、レポーター発現（ＧＦＰ）、ＩＦＮ応答遺伝子（ＯＡＳ１／ＩＦＮβ）の減少及び毎日のリポフェクション後の細胞生存に対するＮＳｓの効果を、究極の基準ＥＫＢと比較して分析した。
初代ヒト包皮線維芽細胞（ＨＦＦｓ，Ｓｙｓｔｅｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を６ウェル（１０００００細胞／ウェル）に播種し、翌日６μｌのＲＮＡｉＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と１．４μｇの非修飾合成ｍＲＮＡ（インビトロ転写）を使用してリポフェクションした。合成ｍＲＮＡ混合物は、よって、図１Ａに示されるように、ＩＦＮエスケープタンパク質Ｅ３（Ｅ）、Ｋ３（Ｋ）、Ｂ１８Ｒ（Ｂ）及び／又はＮＳｓ（Ｎ）の異なる混合物と共に０．８μｇの緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）から構成されていた。各ＩＦＮエスケープタンパク質の０．２μｇの合成ｍＲＮＡを使用し、ルシフェラーゼ（Ｌｕｃ）をコードする合成ｍＲＮＡを利用して、混合物を１．４μｇにまとめた。リポフェクションは、製造業者の指示書に従って実施した。トランスフェクションの２４時間後に細胞を収集し、細胞の半分をＦＡＣＳによるＧＦＰ発現の分析に使用した。９１～９６％のトランスフェクション効率で、全てのサンプルが等しくリポフェクションされていることが明らかになった（図１Ａ、左パネル）。我々は、ＥＫＢと共トランスフェクトすると、ＧＦＰ ｍＲＮＡ翻訳が約３倍増加することを観察した。この増加は、Ｎを単独で使用した場合は僅かに低く、ＥＮと共トランスフェクトした場合は僅かに高くなった。追加のＩＦＮエスケープタンパク質（Ｋ及びＢ）は、ＧＦＰ ｍＲＮＡの翻訳を更には増加させなかった。
前の実験の残りの細胞をペレット化し、全ＲＮＡを単離し、ＩＦＮβ及びＯＡＳ１のｍＲＮＡ発現をｑＲＴ－ＰＣＲによって定量した（図１Ｂ）。予想通り、ＥＫＢは、共トランスフェクトした場合、合成ｍＲＮＡによるＩＦＮβ及びＯＡＳ１発現の誘導をダウンレギュレートすることができる。これは、Ｎ単独でもまた達成でき、ＩＦＮβ誘導の場合は更に良くなる。Ｎは、他のウイルスエスケープタンパク質（ＥＫＢ）と組み合わせて、細胞の合成ｍＲＮＡに対するＩＦＮ応答を最小限に低下させた。
ＨＦＦを６ウェル（１０００００細胞／ウェル）に播種し、６μｌのＲＮＡｉＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と１．４μｇの合成ｍＲＮＡを使用して、次の３日間連続してリポフェクションを行った。それにより、合成ｍＲＮＡ混合物は、図１Ｃに示されるように、ＩＦＮエスケープタンパク質Ｅ３（Ｅ）、Ｋ３（Ｋ）、Ｂ１８Ｒ（Ｂ）及び／又はＮＳｓ（Ｎ）の異なる混合物と共に０．８μｇのＧＦＰで構成されていた。各ＩＦＮエスケープタンパク質の０．２μｇの合成ｍＲＮＡを使用し、ルシフェラーゼ（Ｌｕｃ）をコードする合成ｍＲＮＡを利用して、混合物を１．４μｇにまとめた。リポフェクションは、製造業者の指示書に従って実施した。最後のリポフェクションの２４時間後、細胞増殖キットＩＩ（Ｒｏｃｈｅ）を使用して、トランスフェクトされたモック細胞に正規化して、細胞生存率をアッセイした。予想どおり、合成ｍＲＮＡで繰り返しトランスフェクトすると細胞は死ぬ。これは、ＥＫＢとの共トランスフェクションにより救済できる。予想外に、Ｎ単独でも細胞の生存率を高めることができ、従ってＥＫＢを置き換えることができた。Ｅ３と組み合わせると、僅かな増殖効果がまた観察された。
前の実験の細胞を最後のトランスフェクションの２４時間後にペレット化し、全ＲＮＡを単離し、ＩＦＮβとＯＡＳ１のｍＲＮＡ発現をｑＲＴ－ＰＣＲによって定量した（図１Ｄ）。図１Ｃの生存率分析によれば、ＥＫＢは合成ｍＲＮＡによるＩＦＮβとＯＡＳ１の誘導を有意に減少させる。これは、ＥＫＢがＮのみに置き換えられた場合にも達成することができた。Ｎが他のウイルスエスケープタンパク質と組み合わされると、細胞のＩＦＮ応答はほぼ消滅する。
データは、ＮＳｓがヒト線維芽細胞における合成ｍＲＮＡに対するＩＦＮ応答の阻害においてＥＫＢを置き換えることができることを示している。ＮＳｓのみが翻訳のダウンレギュレーションに対抗することができ、それがＩＦＮ応答遺伝子のアップレギュレーションを阻害し、細胞生存率の消失を防ぐ。
実施例２：ＮＳｓはＲＮＡベースのリプログラミングを可能にする
実施例１に示されるように、ＮＳｓは、ヒト線維芽細胞における合成ｍＲＮＡに対するＩＦＮ応答の阻害においてＥＫＢを置き換えることができる。前述のように、我々は、ウイルスエスケープタンパク質Ｅ３、Ｋ３及びＢ１８Ｒ（ＥＫＢ）を使用して細胞のＩＦＮ応答を打ち消し、ヒト線維芽細胞と血液成長内皮前駆細胞（ＥＰＣ）をヒト人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞に成功裡にリプログラミングすることを可能にするＲＮＡベースのリプログラミングアプローチを以前に開発した（Hum Gene Ther. 2015 Nov;26(11):751-66）。ここでは、我々は、ＮＳｓのみがＲＮＡに基づくヒト線維芽細胞のリプログラミングを促進できるかどうかを調査する。
図２Ａは、初代ヒト皮膚線維芽細胞（ＨＤＦｓ，Ｉｎｎｏｐｒｏｔ）のリプログラミングのタイムラインを示している。４００００個の細胞を１２ウェルプレートに播種し、４時間培養した後、０．０８μｇの各Ｂ１８Ｒ、Ｅ３及びＫ３（ＥＫＢ）又は０．２４μｇのＮＳｓ（Ｎ）単独と共に、かつ両方の場合においてｍｉＲＮＡ ３０２ａ－ｄ及び３６７（１：１：１：１：１）から構成される０．１７μｇのｍｉＲＮＡ混合物と共にリプログラミング転写因子（ＴＦ）ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、ｃＭＹＣ、ＮＡＮＯＧ及びＬＩＮ２８（Ｏ３ＳＫＭＮＬ）（３：１：１：１：１：１）をコードする０．３３μｇの非修飾合成ｍＲＮＡで構成された合成ｍＲＮＡ混合物で４日間連続してリポフェクションした。細胞をヒト胚性幹（ｈＥＳ）細胞培地（ＮｕｔｒｉＳｔｅｍ培地，Ｓｔｅｍｇｅｎｔ）で培養し、１２ウェル当たり２．５μＬのＲＮＡｉＭＡＸ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用してリポフェクションを製造業者の指示書に従って実施した。９日目から、コロニー形成が観察され、ｄ１０でコロニーの分析が実施された。
樹立されたコロニーは、１０日目にＡＰ染色キット（ＳＢＩ）を使用し、製造業者の指示書に従ってアルカリホスファターゼ（ＡＰ）で染色した。概要については、代表的な染色を図２Ｂに示す。ＥＫＢ又はＮのみを使用すると、ＡＰ陽性コロニーの形成（赤／暗）が非常に類似していることが明らかになった。
二つの独立した実験からのＡＰ陽性コロニーをカウントし、平均コロニー数±ＳＤ（ｎ＝２）として図２Ｃに示す。データは、ヒト線維芽細胞のｉＰＳ細胞へのＲＮＡベースのリプログラミングは、類似のリプログラミング効率でＥＫＢ又はＮＳのみで実施されうるという、概要からの結果を確認する。
ＥＫＢの代わりにＮＳのみを使用した場合に得られたｉＰＳ細胞コロニーのコロニー形態は、別個のコロニーと明確な境界に密に詰まった小細胞を含む類似のｈＥＳ細胞のようであった（図２Ｄ）。これらのコロニーは、ＡＰ（図２Ｅ）（赤／黒）及びｈＥＳ細胞表面マーカーＴＲＡ－１－８１（図２Ｆ）（緑／白）についても陽性に染色できた。ＴＲＡ－１－８１ライブ染色を、製造業者の指示書に従って、Ｓｔａｉｎ－Ａｌｉｖｅ ＴＲＡ－１－８１抗体（Ｓｔｅｍｇｅｎｔ）を用いて実施した。コロニーの代表的な写真を示す。
コロニーの多能性を更に評価するために、細胞をペレット化し、全ＲＮＡを単離し、ｈＥＳマーカーＯＣＴ４（内因性）、ＮＡＮＯＧ（内因性）、ＬＩＮ２８（内因性）、ＴＥＲＴ及びＲＥＸ１のｍＲＮＡ発現をｑＲＴ－ＰＣＲによって定量した。ｍＲＮＡ発現をＨＰＲＴの発現に対して正規化し、インプット細胞の転写産物レベルと比較して平均倍率誘導±ＳＤ（ｎ＝２）として示す。解析された全てのマーカーは、インプット細胞と比較して高度に発現され、リプログラムされた細胞の多能性を示す。繰り返すが、ヒト線維芽細胞のＲＮＡベースのリプログラミングを促進するためにＥＫＢの代わりにＮＳのみを使用した場合に、有意差は観察されなかった（図２Ｇ）。
ＮＳｓは、合成ｍＲＮＡに対するヒト線維芽細胞のＩＦＮ応答を、三種のウイルスエスケープタンパク質Ｅ３、Ｋ３、及びＢ１８Ｒの使用と同程度に低下させることができる。これにより、ＲＮＡベースのリプログラミングカクテルの複数のトランスフェクションが可能になり、ヒト線維芽細胞のヒトｉＰＳ細胞へのリプログラミングが達成される。ＥＫＢの代わりにＮＳｓのみを使用した細胞のリプログラミングの成功は、それによって、ｈＥＳ細胞様形態、ＡＰ活性、及び得られたｉＰＳ細胞コロニーのｈＥＳ細胞表面及び内因性マーカーの発現によって確認された。リプログラミング効率とＮＳｓを使用するリプログラミングの品質は、ＥＫＢが可能にしたＲＮＡベースのリプログラミングと同じ程度に良いことが示された。
実施例３：ＮＳｓはＳＦＶ自己複製ＲＮＡに対するＩＦＮ応答を阻害し、プロテインキナーゼＲ活性化を防止する
ヒト包皮線維芽細胞を６ウェルプレートに播種し、翌日トランスフェクトした。この目的のために、自己複製ＲＮＡ（ウイルス起源セムリキ森林ウイルス）をコードする２．５μｇのＧＦＰ、又は１．２５μｇの自己複製ＲＮＡを、ワクシニアウイルスＥ３又はトスカーナウイルスＮＳｓの何れかをコードする１．２５μｇのｍＲＮＡと共にＭｅｓｓｅｎｇｅｒＭａｘと複合化し、細胞に加えた。トランスフェクションの１７時間後に細胞を収集し、ｑＰＣＲ（ＩＦＮβ及びＯＡＳ１のアップレギュレーション）によるインターフェロン応答、及び全ＰＫＲ及び自己リン酸化ＰＫＲ（ｐ－ＰＫＲ）に対する免疫ブロットによるＰＫＲ分解及び活性化を決定するために使用した。ＮＳｓは、Ｅ３よりもＩＦＮ応答のより顕著な減少をもたらした（図３Ａ）。ＮＳｓの過剰発現は、未トランスフェクト（ｕｎｔｒ．）細胞、レプリコンのみ、又はレプリコン＋Ｅ３でトランスフェクトされた細胞と比較して、ＰＫＲ発現を減少させた。しかし、残留ＰＫＲの活性化を妨げない（図３Ｂ）。図３Ｃは、ＰＫＲブロットのバンド強度のデンシトメトリー定量化を示している。
実施例４：ＮＳｓはＶＥＥＶ自己複製ＲＮＡでトランスフェクション率を増加させ、翻訳を増加させ、ＩＦＮ応答を遮断する
ヒト包皮線維芽細胞を６ウェルプレートに播種し、翌日トランスフェクトした。この目的のために、自己複製ＲＮＡ（ウイルス起源ベネズエラウマ脳炎ウイルス）をコードするＧＦＰ１．１μｇと、赤外蛍光タンパク質（ｉＲＦＰ）又はワクシニアウイルスＥ３又はトスカーナウイルスＮＳｓの何れかをコードするｍＲＮＡ１．４μｇをＭｅｓｓｅｎｇｅｒＭａｘと複合化し、細胞に添加した。２４時間後、細胞を回収して、フローサイトメトリーによるトランスフェクション率とｑＰＣＲによるインターフェロン応答（ＩＦＮｂ及びＯＡＳ１のアップレギュレーション）を決定した。フローサイトメトリー分析では、Ｅ３とＮＳｓの共トランスフェクション時のトランスフェクション率の増加が示されている（ｕｎｔｒ．＝非トランスフェクション細胞）（図４Ａ、Ｂ）。ＮＳｓの共転移は、Ｅ３の共転移よりもＩＦＮ応答のより顕著な減少をもたらした（図４Ｃ）。
実施例５：ＮＳｓはＶＥＥＶトランスレプリコンの発現を改善し、ＩＦＮ応答を阻害する
ヒト包皮線維芽細胞に、ＶＥＥＶレプリカーゼをコードする１．４μｇのｍＲＮＡ、ＧＦＰをコードする０．３μｇのトランス複製ＲＮＡ、及びルシフェラーゼをコードする０．３μｇのトランス複製ＲＮＡをエレクトロポレーションした。インターフェロン応答を阻害するために、サンプルに２μｇのＮＳｓ ｍＲＮＡ、Ｅ３ ｍＲＮＡ、又はＥ３及びＢ１８ ｍＲＮＡ（各１μｇ）を補充した。２４時間後、細胞を回収して、フローサイトメトリーによりＧＦＰ発現（図５Ａ）を、ｑＰＣＲによりインターフェロン応答（ＩＦＮｂ及びＯＡＳ１のアップレギュレーション）（図５Ｂ）を分析した。更に、ルシフェラーゼ発現を、図５Ｃに示された時点で５日間測定した。
ＮＳｓはＥ３とＢ１８の組み合わせと同じく良好に発現を改善し、ＩＦＮ応答を同等に阻害する。
実施例６：ＮＳｓは免疫細胞におけるトランスレプリコン発現を改善する
休止末梢ＣＤ８陽性ヒトＴ細胞に、ＶＥＥＶレプリカーゼをコードする５μｇのｍＲＮＡとルシフェラーゼをコードする５μｇのトランス複製ＲＮＡをエレクトロポレーションした。インターフェロン応答を阻害するために、サンプルに５μｇのＮＳｓ ｍＲＮＡ又はＥ３ ｍＲＮＡを補充した。ルシフェラーゼ発現を、図６Ａに示された時点で評価した。
ヒト末梢未成熟樹状細胞に、ＶＥＥＶレプリカーゼをコードする１．４μｇのｍＲＮＡ、ルシフェラーゼをコードする０．３μｇのトランス複製ＲＮＡ及びＧＦＰをコードする０．３μｇのトランス複製ＲＮＡをエレクトロポレーションした。インターフェロン応答を阻害するために、サンプルに２μｇのＮＳｓ ｍＲＮＡ又はＥ３ ｍＲＮＡを補充した。ルシフェラーゼ発現を、図６Ｂに示された時点で評価した。
実施例７：ＮＳｓは免疫細胞におけるＶＥＥＶトランス複製及び自己複製ＲＮＡの発現を改善し、細胞死を防ぐ
（Ａ）ヒト末梢未熟樹状細胞を、１ウェル当たり２５ｎｇの全ＲＮＡを含む９６ウェルプレートでＭｅｓｓｅｎｇｅｒＭａｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）でリポフェクションした。ルシフェラーゼをコードする３ｎｇのトランス複製ＲＮＡを、ＶＥＥＶレプリカーゼ（＋Ｒｅｐ）をコードする１２ｎｇのｍＲＮＡと、示されているＧＦＰ（＋ＧＦＰ）又は阻害剤ＮＳｓ（＋ＮＳ）をコードする１０ｎｇのｍＲＮＡで、又はそれらなしに、共トランスフェクトした。示された時点でルシフェラーゼ発現を評価した（ＢｒｉｇｈｔＧｌｏ Ａｓｓａｙ；Ｐｒｏｍｅｇａ）。（Ｂ）トランスフェクト細胞の生存率をまた評価し（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒＧｌｏアッセイ；Ｐｒｏｍｅｇａ）、非トランスフェクト細胞の生存率に対してプロットした。（Ｃ，Ｄ）並行して、ルシフェラーゼをコードする１０ｎｇのＶＥＥＶ－レプリコンと、ＧＦＰ又はＮＳｓの何れかを細胞にまたトランスフェクトした。ルシフェラーゼ発現（Ｃ）及び生存率（Ｄ）は、リポフェクション後７２時間追跡した。
樹状細胞では、ＮＳｓは自己複製及びトランス複製ＲＮＡの発現を延長し、細胞死を阻害する。

Claims (44)

  1. 細胞においてペプチド又はタンパク質を発現させるためのインビトロでの方法であって、（ｉ）ペプチド又はタンパク質をコードするＲＮＡを細胞に導入する工程と、
    （ｉｉ）トスカーナウイルスＮＳｓタンパク質を細胞に提供する工程と
    を含む、方法。
  2. ＲＮＡが細胞に繰り返し導入される、請求項１に記載の方法。
  3. ＲＮＡが、エレクトロポレーション又はリポフェクションによって細胞に導入される、請求項１又は２に記載の方法。
  4. ＲＮＡがインビトロ転写されたＲＮＡである、請求項１から３の何れか一項に記載の方法。
  5. トスカーナウイルスＮＳｓタンパク質を細胞に提供することが、トスカーナウイルスＮＳｓタンパク質をコードするＲＮＡを細胞に導入することを含む、請求項１から４の何れか一項に記載の方法。
  6. ワクシニアウイルスＢ１８Ｒ及び／又はワクシニアウイルスＥ３を細胞に提供することを更に含む、請求項１から５の何れか一項に記載の方法。
  7. ワクシニアウイルスＢ１８Ｒ及び／又はワクシニアウイルスＥ３を細胞に提供することが、ワクシニアウイルスＢ１８ＲをコードするＲＮＡ及び／又はワクシニアウイルスＥ３をコードするＲＮＡを細胞に導入することを含む、請求項６に記載の方法。
  8. トスカーナウイルスＮＳｓタンパク質を細胞に提供することが、細胞におけるＲＮＡの安定性及び／又は発現を増強する、請求項１から７の何れか一項に記載の方法。
  9. 細胞におけるＲＮＡの発現の増強が、細胞におけるＲＮＡの発現レベルの増加及び／又は発現の持続時間の増加を含む、請求項８に記載の方法。
  10. トスカーナウイルスＮＳｓタンパク質を細胞に提供することが、細胞生存率を高める、請求項１から９の何れか一項に記載の方法。
  11. 細胞がバリア機能を有する細胞である、請求項１から１０の何れか一項に記載の方法。
  12. 細胞が線維芽細胞、ケラチノサイト、上皮細胞、又は内皮細胞である、請求項１から１１の何れか一項に記載の方法。
  13. 細胞がＴ細胞又は抗原提示細胞である、請求項１から１０の何れか一項に記載の方法。
  14. 細胞がヒト細胞である、請求項１から１３の何れか一項に記載の方法。
  15. 幹細胞特性を有する細胞を提供するためのインビトロでの方法であって、
    （ｉ）体細胞を含む細胞集団を提供する工程、
    （ｉｉ）トスカーナウイルスＮＳｓタンパク質を体細胞に提供する工程、
    （ｉｉｉ）一又は複数のリプログラミング因子をコードするＲＮＡを体細胞に導入する工程、及び
    （ｉｖ）幹細胞特性を有する細胞の発生を可能にする工程
    を含む、方法。
  16. トスカーナウイルスＮＳｓタンパク質を体細胞に提供することが、トスカーナウイルスＮＳｓタンパク質をコードするＲＮＡを細胞に導入することを含む、請求項１５に記載の方法。
  17. 幹細胞特性を有する細胞への体細胞のリプログラミングを増強するｍｉＲＮＡを体細胞に導入することを更に含む、請求項１５又は１６に記載の方法。
  18. 一又は複数のリプログラミング因子がＯＣＴ４及びＳＯＸ２を含む、請求項１５から１７の何れか一項に記載の方法。
  19. 一又は複数のリプログラミング因子が、ＫＬＦ４及び／又はｃ－ＭＹＣを更に含む、請求項１８に記載の方法。
  20. 一又は複数のリプログラミング因子が、ＮＡＮＯＧ及び／又はＬＩＮ２８を更に含む、請求項１８又は１９に記載の方法。
  21. 一又は複数のリプログラミング因子が、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４及びｃ－ＭＹＣを含む、請求項１５から１９の何れか一項に記載の方法。
  22. 一又は複数のリプログラミング因子が、ＬＩＮ２８を更に含む、請求項２１に記載の方法。
  23. 一又は複数のリプログラミング因子は、ＮＡＮＯＧを更に含む、請求項２２に記載の方法。
  24. 一又は複数のリプログラミング因子が、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ及びＬＩＮ２８を含む、請求項１５から１８の何れか一項に記載の方法。
  25. 少なくとも一種のヒストンデアセチラーゼ阻害剤の存在下で体細胞を培養する工程を更に含む、請求項１５から２４の何れか一項に記載の方法。
  26. 少なくとも一種のヒストンデアセチラーゼ阻害剤がバルプロ酸を含む、請求項２５に記載の方法。
  27. 幹細胞特性を有する細胞の発生を可能にする工程が、胚性幹細胞培養条件下で体細胞を培養することを含む、請求項１５から２６の何れか一項に記載の方法。
  28. 幹細胞特性が胚性幹細胞形態を含む、請求項１５から２７の何れか一項に記載の方法。
  29. 幹細胞特性を有する細胞が、正常な核型を有し、テロメラーゼ活性を発現し、胚性幹細胞に特徴的な細胞表面マーカーを発現し、及び／又は胚性幹細胞に特徴的な遺伝子を発現する、請求項１５から２８の何れか一項に記載の方法。
  30. 幹細胞特性を有する細胞が多能性状態を示す、請求項１５から２９の何れか一項に記載の方法。
  31. 幹細胞の特徴を有する細胞が、三つ全ての一次胚葉の高度な派生物に分化する発生能を有する、請求項１５から３０の何れか一項に記載の方法。
  32. 体細胞が、線維芽細胞、ケラチノサイト及び内皮前駆細胞からなる群から選択される、請求項１５から３１の何れか一項に記載の方法。
  33. 線維芽細胞が肺線維芽細胞、包皮線維芽細胞又は皮膚繊維芽細胞である、請求項３２に記載の方法。
  34. 体細胞がヒト細胞である、請求項１５から３３の何れか一項に記載の方法。
  35. 分化した細胞型を提供するための方法であって、（ｉ）請求項１５から３４の何れか一項に記載の方法を使用して、幹細胞特性を有する細胞を提供する工程と、（ｉｉ）分化した細胞型への部分的又は完全な分化を誘導し又は方向付ける条件下で幹細胞特性を有する細胞を培養する工程を含む、方法。
  36. （ｉ）ペプチド又はタンパク質をコードするＲＮＡ及び
    （ｉｉ）トスカーナウイルスＮＳｓタンパク質を細胞に提供するための剤
    を含む、細胞においてペプチド又はタンパク質を発現させるための組成物であって、
    前記トスカーナウイルスＮＳｓタンパク質を細胞に提供するための剤は、トスカーナウイルスＮＳｓタンパク質をコードするＲＮＡを含む、
    組成物。
  37. ＲＮＡは、インビトロ転写されたＲＮＡである、請求項３６に記載の組成物。
  38. ワクシニアウイルスＢ１８Ｒ及び／又はワクシニアウイルスＥ３を提供するための剤をさらに含み、
    ワクシニアウイルスＢ１８Ｒ及び／又はワクシニアウイルスＥ３を細胞に提供するための剤は、ワクシニアウイルスＢ１８ＲをコードするＲＮＡ及び／又はワクシニアウイルスＥ３をコードするＲＮＡを含む、請求項３６に記載の組成物。
  39. 細胞がバリア機能を有する細胞である、請求項３６から３８の何れか一項に記載の組成物。
  40. 細胞が、線維芽細胞、ケラチノサイト、上皮細胞、又は内皮細胞である、請求項３６から３８の何れか一項に記載の組成物。
  41. 細胞がＴ細胞又は抗原提示細胞である、請求項３６から３８の何れか一項に記載の組成物。
  42. 細胞がヒト細胞である、請求項３６から３８の何れか一項に記載の組成物。
  43. 請求項３６から４２の何れか一項に記載の組成物を含む、キット。
  44. 医薬の製造における、請求項３６から４２の何れか一項に記載の組成物の使用。
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