JP2009533058A - 変異体マルトース結合タンパク質に融合された標的タンパク質の可溶化及び精製 - Google Patents
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Abstract
Description
材料
制限酵素、β−アガラーゼ、DNAポリメラーゼ、T4リガーゼ、南極ホスファターゼ、Litmus38、pMAL−c2X及びpMAL−c2Gを含むpMALタンパク質融合及び精製系、アミロース樹脂(#E8021)、西洋ワサビペルオキシダーゼに連結された抗MBPモノクローナル抗体(#E8038)、USERFriendly Cloning キット、ベクターpKLAC1、宿主株TB1、ER1992、ER2502、ER2984、NEB5−α及びNEBTurboを含むK.ラクティスタンパク質発現キット並びに合成オリゴヌクレオチドは、New England Biolabs、 Inc.(NEB)、Ipswich、MAから取得した。フィルター底付きのUnifilter800マイクロタイターマイクロプレートは、Whatman、Brentford、Englandから購入した。Minelute DNA Extraction and Qiaprep Spinキットは、Qiagen、Valencia、CAから購入した。Mega10は、Dojindo、Gaithersburg、MDから購入した。ニワトリ卵白リゾチーム、クマシーブリリアントブルーR及び酸洗浄されたガラスビーズ(425から600ミクロン)は、Sigma−Aldrich、St.Louis、MOから購入した。Sea Plaque GTG低融点アガロースは、Cambrex、 E. Rutherford、 NJから購入した。使い捨てポリプロピレンカラム(#732−6008)は、BioRad、Hercules、CAから購入した。10から20%のグラジエントゲルは、Daiichi、Tokyo、Japan又はInVitrogen/Novex、Carlsbad、CAの何れかから購入した。CompleteTMプロテアーゼ阻害剤カクテルは、Roche、Basel、Switzerlandから購入した。SimplyBlue Safestainは、Invitrogen、Carlsbad、CAから購入した。ヒトジヒドロ葉酸還元酵素(DHFR)cDNAクローンpOTB7−DHFRは、Invitrogen(MGC:857)から購入した。GAPDH遺伝子は、pJF931から入手した(Fox et al.FEBS Lett.537:53−57(2003))。
セラチア・マルセッセンスヌクレアーゼは、PCT/US05/28739に記載されているとおりに取得した。プラスミドDNAのMiniprepは、Qiaprep Spinキットを用いて調製した。ランダムPCR突然変異導入は、「Fromant et al.Analytical Biochemistry 224, 347−353 (1995)」に記載されているとおりに実施した。PCRは、注記されていることを除き、Vent(R)DNAポリメラーゼを用いて行った。1%SeaPlaqueGTG低融点アガロース上で電気泳動を行い、バンドを切り出し、MineluteDNAExtractionキットを用いてDNAを精製し、又は75℃で5分間、DNAを融解させ、37℃まで冷却し、βアガロースで1から2時間消化することによって、DNA断片をゲル精製した。DNA配列決定は、BigDye標識された色素ターミネーター化学(ABI, Foster City, CA)を使用し、Applied Biosystemsの(ABIの)自動化されたDNASequencerモデル3100ABI上で行った。アクリルアミドゲルの供給者の指示書に従って、SDS−PAGEを実施し、別段の記載がある場合を除いて、クマシーブリリアントブルーRでの染色によって、タンパク質を可視化した。
精製後の改善された収率に対するスクリーニング:
pMAL−c2xから得られるmalE遺伝子のランダムな突然変異導入は、プライマー:オリゴ1:5’GGAGACAUGAATTCAATGAAAATCGAAGAA(配列番号9)及びオリゴ2:5’GGGAAAGUAAGCTTAATCCTTCCCTCGATC(配列番号10)を使用する変異性のPCRによって達成した。
増加した結合及び溶出特性を有するUSER中のライブラリーから得た2つの単離株を配列決定した(図2)。1つの単離株G8−1は、サイレント変異とともに、単一のミスセンス変異G1964Cを有することが見出された。G1964C変異は、MBP中のアミノ酸変化S146Tに対応する。他の単離株A9は、サイレント変異とともに、3つのミスセンス変異A1583G、A2419G及びC2465Tを有することが見出された。A1583G、A2419G及びC2465T変異は、それぞれ、アミノ酸変化N19S、K298E及びA313Vに対応する。
以下のプライマー:オリゴ3:5’GACTCATATGAAAATCGAAGAAGGTAAACTGGTAATCTGGATTAACGGC(配列番号11)及びオリゴ4:5’ATATAAGCTTTCACCTTCCCTCGATCCCGAGGT(配列番号12)を用いて、各単離株をPCRによって増幅した。増幅されたDNAをエタノール沈殿し、NEBuffer4(NEB,Ipswich,MA)中のNdeI及びHindIIIで切断し、ゲル精製した。NdeI及びHindIIIでpSN1578を切断し、ベクター骨格をゲル精製した。G8−1及びA9断片をpSN1578断片と混合し、連結し、TB1を形質転換するために、この連結を使用した。各形質転換体から得たプラスミド調製物の配列を決定し、G8−1に関してはpIH1596と命名し、A9に関してはpIH1593と命名した。本実験における3’プライマーは、malE翻訳がpMALのlacZα断片中に進行するのを防ぐために、正しいリーディングフレーム中に停止コドンを有する。従って、これらのサブクローンは、ポリリンカーによってコードされるアミノ酸配列...IEGRの後で終了する修飾されたMBPを産生する。野生型malE遺伝子後に停止コドンを含有する対照プラスミドは、malEとlacZaの間のポリリンカー中のpMAL−c2XをXbaIで切断することによって構築された。DNAポリメラーゼI、巨大断片(Klenow)及び4つの全てのdNTPを用いて、XbaI突出部を充填し、次いで、T4リガーゼでの処理によって、プラスミドを再度環状化した。これは、malEと同じ読み枠中に停止コドンを導入し、この誘導体は、ポリリンカーによってコードされる8残基の伸長を除き、G8−1及びA9によって産生されるものと同等のMBPを産生する。この対照プラスミドは、pKO1483と名付けられた。LB+0.1%グルコース及び100μg/mLアンピシリンの500mL培養物中で、2×108細胞/mLになるまで、pKO1483、pIH1596及びpIH1593を含有するイー・コリTB1を増殖させ、0.3mMIPTGで誘導し、37℃で2時間増殖させ、次いで、採集した。カラム緩衝液25mL(10mMマルトース、10mMリン酸ナトリウム、0.2MNaCl、1mMEDTA、pH7.2の0.2mL)+10mMβ−メルカプトエタノール中に細胞を再懸濁し、次いで、音波処理によって溶解された。9000×gで30分間遠心することによって、抽出物を清澄化し、次いで、カラム緩衝液を用いて1:4希釈し、アミロース樹脂の15mLカラム上に搭載した。約125mLカラム緩衝液でカラムを洗浄し、カラム緩衝液+10mMマルトースで溶出した。3つの株の間で、MBPの収率を比較した(図3)。結果は、修飾されたMBPがアミロースへの増加した結合及び適切な緩衝液中への溶出を示したことを確認する。
A:MBP−Klenow
修飾されたMBPが、精製後に、融合タンパク質の収率を増加させることができるかどうかを検査するために、イー・コリDNAポリメラーゼIのKlenow断片をコードする遺伝子を、pMAL−c2X、pIH1619(S146T)及びpPR1610(A313V)中にクローニングした。アミロースカラムに対して本質的に低い親和性を有し、親和性精製の間に、MBP−Klenowタンパク質の幾つかは、結合せずに、アミロースカラムを流出するので、MBP−Klenow融合物を選択した。BglII及びHindIII部位間において、pBR322中にクローニングされたpolA遺伝子(GenbankecopolA:206−4127)のBglII−HindIII断片を含有するプラスミドpPolAから、DNAポリメラーゼIのKlenow部分にPCR反応を行った。プライマー:オリゴ9:5’CCAGAAGTGACGGCAACGGTGATT(配列番号17)及びオリゴ10:5’AAGTGCGGCGACGATAGTCATGCCCCGCGC(配列番号18)を用いて、PCRを実施した。
変異体MBPが親和性精製からの融合タンパク質の収率を増加させる能力が一般的な特性であるかどうかを検査するために、アミロースに対して本質的に低い親和性を有する別の融合タンパク質を検査した。バチラス・サーキュランス(Bacillus circulans)のキチン結合ドメインに融合されたMBP(MBP−CBD)は、プラスミドpMB50によってコードされる(図5)。MBP−Klenowと同様に、このMBP−CBD融合タンパク質のかなりの割合が、アフィニティー精製の間に、アミロースカラムから流出する傾向がある。MBP(A313V)をコードするpPR1610の一部を、HapI及びSacIを用いて、プラスミドから切断し、断片を精製した。同じ酵素でpMB50を切断し、骨格も精製し、2つの断片を連結し、ER2523中に形質転換した。得られたプラスミドは、pIH1660と名付けられた。
MBP融合物の構築
修飾されたMBPがMBPに融合されたタンパク質の溶解度を増強する能力を保持するかどうかを調べるために、イー・コリ中で不溶性である傾向がある2つのタンパク質であるジヒドロ葉酸還元酵素(DHFR)及びグリセルアルデヒド−3−リン酸脱水素酵素(GAPDH)を、pIH1619(S146T)及びpIH1610(A313V)中にクローニングした。対照として、「MBP−DM」と名付けられた、Telmerらの修飾されたMBP中に変異を含有するpMAL−c2X及びpMAL−c2G誘導体中に、同じ2つのタンパク質をクローニングした。MBP−DMをコードするベクターを、以下のように構築した。まず、4プライマー位置指定PCRによって、ヌクレオチド2030に翻訳的にサイレントなNsiI部位を有するpMAL−c2G誘導体を構築した。N末端及びC末端断片の両方に対するテンプレートは、pMAL−c2Xであった。N末端断片を作製するために、プライマーオリゴ13:5’CCATAGCATATGAAAATCGAAGAAG(配列番号21)及びオリゴ14:5’CTTGAATGCATAACCCCCGTCAGCAGC(配列番号22)を使用し、C末端断片を作製するために、プライマーオリゴ15:5’GGTTATGCATTCAAGTATGAAAACGGCAAG(配列番号23)及びオリゴ8を使用した。PCR断片をゲル精製し、次いで、プライマーオリゴ13及びオリゴ8を用いた集合工程中でのテンプレートとして使用した。最終PCR断片をエタノール沈殿し、NdeI及びEcoRIで切断し、ゲル精製した。NdeI及びEcoRIでpMAL−c2Xを切断し、ゲル精製し、2つの断片を混合し、連結した。ER2502を形質転換するために、連結物を使用し、培養物を一晩増殖させ、ミニプレプDNAを調製した。NsiI部位を獲得した、正しいサイズの幾つかの形質転換体を取得したが、予想に反して、それらの全てはEcoRI部位を欠如していた。この組の代表(pPR1629と名付けられた。)をNdeI及びAvaIで切断し、malE断片をゲル精製した。同じ2つの酵素でpSN1578を切断し、プラスミド骨格をゲル精製した。これら2つのDNA断片を連結し、ER2502を形質転換するためにこの連結物を使用し、1つの形質転換体から得られるプラスミドDNAを配列決定し、pPR1633と名付けた。次に、Telmer及びShiltonによってDMと称される修飾されたMBPに対する遺伝子を、以下のように、4プライマーのPCR部位指定突然変異生成によって構築した。両N及びC末端断片に対するテンプレートは、pMAL−c2Xであった。N末端断片に対して使用されたプライマーは、オリゴ16:5’TATGCATTCAAATACGGTGACATTAAAGACGTGGGCGTGGAT(配列番号24)及びオリゴ17:5’GCGGCGTTTTCCGCAGTGGCGGCAATACGTGGATCTTTC(配列番号25)であった。C末端断片は、プライマーオリゴ18:5’GCGGAAAACGCCGCGAAAGGTGAAATCATGCCGAACATC(配列番号26)及びオリゴ8を用いて作製された。オリゴ16及びオリゴ8をプライマーとして使用し、精製されたN末端及びC末端断片を用いて集合PCRを実行した。PCR断片をエタノール沈殿し、EcoRVで直鎖化されたLitmus38に連結し、南極ホスファターゼで処理した。NEB5−α(Ipswich,MA)を形質転換するために連結物を使用し、構築物を確認するために1つの形質転換体から得られたプラスミドDNAを配列決定し、pPR1638と名付けた。プラスミドDNApPR1633及びpPR1638をNsiI及びAvaIで切断し、pPR1633由来のプラスミド骨格及びpPR1638由来のmalE断片をゲル精製し、連結し、NEBTurboを形質転換するために連結物を使用した。配列決定のために、1つの形質転換体由来のプラスミドDNAを選択し、pPR1639と名付けた。
8つのpMALプラスミド(pMAL−c2X、pIH1619(S146Tを担持する。)及びpPR1610(A313Vを担持する。)、各プラスミドは、DHFR又はGApDHをコードするDNJAをさらに含有する。)を含有するTB1の20mL培養物を、LBamp中で、2×108/mlまで増殖させ、0.3mMIPTGを用いて誘導し、さらに2時間温置し、次いで、微量遠心管中にて、3000×gでの遠心によって、細胞を採集した。50mMTris−Cl、pH7.9、50mMNaCl、0.75mMEDTA、0.6%Mega10、150μg/mLリゾチーム及び20Kunitz単位/mLセラチア・マルセッセンスヌクレアーゼ2mL中に各ペレットを再懸濁し、室温で10分間温置した。再懸濁されたペレットは、全細胞抽出物と表記した。125μLの試料を取り出し、14,000×gで、2分間遠心した。上清を取り出し、可溶性画分と表記した。同じ緩衝液125μL中にペレットを再懸濁し、不溶性画分と表記した。各株に対して、SDS−PAGE上に各画分の試料(5μL)を走行させた(図5)。ゲルを乾燥させ、走査し、遠心前の細胞可溶化液中に存在するタンパク質に対する可溶性タンパク質の比として、各レーン中のMBP融合タンパク質の量を定量した(表2)。DHFR及びGAPDH融合物の両者に関して、A313V及びS146T修飾されたMBPは、野生型MBPに比べて、融合タンパク質の溶解度を増強した。DMによって修飾されたMBPを用いて作製された融合物は、予想通り、野生型MBPと比べて、低下した溶解度を示した。
K.ラクティスMBP(A313V)−融合発現ベクターの構築
それぞれ、フォワード及びリバースプライマー:
以下のプライマーを用いて、パラミオシンの切断型をコードする遺伝子(Steel et al., J. Immunol.145:3917−3923(1990))をPCRによって増幅した。
Claims (25)
- 修飾されたマルトース結合タンパク質(MBP)であり、タンパク質に融合された場合に、前記修飾されたMBPが(i)マルトデキストリン基質に対する結合親和性及び(ii)前記タンパク質が限定された溶解度を有する場合における溶解度のうち少なくとも1つの増加を有するようにする変異を有するMBPアミノ酸配列を含む、前記修飾されたマルトース結合タンパク質。
- 変異が、タンパク質のへリックスXIとXIIの間のヒンジ領域中に位置し、又はA313の10オングストローム内の領域中に位置する、請求項1に記載の修飾されたMBP。
- 変異が、タンパク質のCドメイン中に位置し、又はβシートFの先頭のS146の10オングストローム以内の領域中に位置する、請求項1に記載の修飾されたMBP。
- 変異がA313Vである、請求項1に記載の修飾されたMBP。
- 変異がS146Tである、請求項1に記載の修飾されたMBP。
- 融合タンパク質を形成するために標的タンパク質に融合された、請求項1に記載の修飾されたMBP。
- 融合タンパク質が、標的タンパク質に融合された修飾されていないMBPタンパク質の溶解度より大きな溶解度を有する、請求項6に記載の修飾されたMBP。
- 配列番号4又は配列番号6を含む、請求項1に記載された修飾されたMBP。
- 配列番号3又は配列番号5を含む、修飾されたMBPをコードする単離されたDNA。
- 請求項9に記載のDNAを含むベクター。
- 請求項10に記載のベクターで形質転換された宿主細胞。
- 形質転換された宿主細胞が形質転換されたイー・コリ宿主細胞である、請求項11に記載の宿主細胞。
- 形質転換された宿主細胞が形質転換されたクルイベロミセス宿主細胞である、請求項11に記載の宿主細胞。
- ベクターがpKIMF2である、請求項11に記載の宿主細胞。
- 請求項1に記載の修飾されたMBPと標的タンパク質を含む融合タンパク質を宿主細胞中で発現させること、
修飾されたMBP融合タンパク質をマトリックスに結合させること、及び
精製されたタンパク質を取得するために、選択された緩衝液中のマトリックスから融合タンパク質を溶出することを含む、
タンパク質を精製する方法。 - マトリックスが多糖である、請求項15に記載の方法。
- 炭水化物がマルトデキストリンである、請求項15に記載の方法。
- 修飾されたMBPがA313V及びS146Tから選択される変異を有する、請求項15に記載の方法。
- 修飾されたMBPが配列番号4を含む、請求項15に記載の方法。
- 修飾されたMBPが配列番号6を含む、請求項15に記載の方法。
- 修飾されたMBPが配列番号3又は配列番号5によってコードされる、請求項15に記載の方法。
- 宿主細胞がクルイベロミセス又はイー・コリである、請求項15に記載の方法。
- インビボにおいて、融合タンパク質が、変異体MBPの不存在下で観察できるより大きな程度まで、及び変異されていないMBPを用いて観察されるより大きな程度まで可溶化されるように、標的タンパク質に融合された修飾されたMBPを発現させることを含む、標的タンパク質を可溶化する方法。
- 修飾されたMBPがA313V変異又はS146T変異を有する、請求項23に記載の方法。
- 修飾されたMBPがA313V変異及びS146T変異を有する、請求項24に記載の方法。
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