JP2815222B2 - 細胞質外酵素と少なくとも１つの他のタンパク質とのハイブリッドタンパク質およびその製造方法 - Google Patents

細胞質外酵素と少なくとも１つの他のタンパク質とのハイブリッドタンパク質およびその製造方法

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Description

【発明の詳細な説明】 この発明は細胞質外タンパク質P1の断片、タンパク質
P2および細胞外酵素とのハイブリッドタンパク質類であ
って、そのタンパク質P2が特に抗原かまたは抗体の単一
連鎖の可変断片（Fv）であるハイブリッドタンパク質
類、その製造法、ならびにその用途の特に診断剤として
の用途および核酸ライブラリーのスクリーニングもしく
は組換え体クローンの選択の際の用途に関する。
またこの発明は、前記ハイブリッドタンパク質をコー
ドするDNA配列、前記配列を含有する発現ベクター、前
記ベクターで形成転換された細菌もしくは酵母の株、お
よびそれらの株の前記ハイブリッドタンパク質を産生し
分泌させる用途に関する。
文献には、いくつものハイブリッドタンパク質とその
製造法が記載されている。
特に、米国特許第4,411,994号と同4,338,397号が挙げ
られるが、これらには、プラスミドpBR322中のペニシリ
ナーゼ遺伝子を融合タンパク質の産生に用いることが記
載されているが、この融合タンパク質は、プラスミドpB
R322のPst I部位に挿入された、プレプロインスリンを
コードするcDNA配列を用いて、ペニシリナーゼ“リーダ
ー”配列によって、細胞周辺腔に輸送される。
また、ヨーロッパ特許願第196,864号には、アルカリ
ホスファターゼの“リーダー”配列の用途が記載され、
その下流と読み枠に所望のタンパク質をコードする配列
が続いている。
上記配列を発現するシステムは、前記ハイブリッドを
コードする配列に動作可能に連結された適切なプロモー
ター（例えばphoA遺伝子プロモーター）と、前記ハイブ
リッドをコードする配列から下流に適切なターミネータ
ー、特にphoAターミネーターをもっている。
このヨーロッパ特許願第196,864号には、いわゆる感
受性タンパク質だけがアルカリホスファターゼのＮ末端
部に融合して、放出されると記載されている。さらに、
タンパク質は、アルカリホスファターゼのリーダーの配
列と相互に作用して前記配列の分泌を起こすアミノ酸配
列をもっているときに感受性であるとみなされると述べ
られている。
また、このタンパク質の感受性は、そのアミノ酸配列
の、２つの配列を相互に作用させる性質によるものであ
ることは疑いのないところであるが、現在まだ解明され
ていないとも述べられている。しかし、いくつかの非相
同のタンパク質がいくつかの細菌の“リーダー”由来の
シグナル配列と相互に作用しうるが、他のタンパク質は
この相互作用ができないことは明らかである。
このヨーロッパ出願には、特に、hGHとTNFが感受性タ
ンパク質として記載されているが、一方IL−２は非感受
性タンパク質であり、つまり放出されないと記載されて
いる。この出願に述べられているハイブリッドタンパク
質は、特に遺伝子組換え法によってhGHもしくはTNFを工
業的量で生産するように設計され、そのアルカリホスフ
ァターゼシグナル配列は、異質タンパク質の輸送する働
きだけを行っている。
ヨーロッパ特許願第242,243号には、エピトープを含
有する酵素からなるハイブリッドタンパク質が記載され
ているが、そのエピトープはこれが暴露される酵素のペ
プチド連鎖に次のように挿入されている。すなわち、ハ
イブリッドタンパク質がエピトープに対する抗体と免疫
接触をしている時に、このハイブリッドタンパク質と前
記抗体とで複合体が形成され、前記酵素の酵素活性が、
非複合状態か複合状態であるかにかかわらず、保持され
るように挿入されている。このヨーロッパ出願に記載さ
れているハイブリッドタンパク質は、選択されたエピト
ープが細菌の表面で暴露されるようなしかたで細菌の外
膜に充填されている。また表面で暴露される上記ハイブ
リッドタンパク質を含有する改変されたλファージ受容
体を外表面にもっているイー・コリ菌株が、この出願に
は記載されている。この出願に記載されているハイブリ
ッドタンパク質は、適切な場合、アルカリホスファター
ゼ、ペルオキシダーゼまたはβ−ガラクトシダーゼを含
有してもよい。
所望の分泌もしくは放出される産物を得ることができ
る融合タンパク質について記載している文献はこの外に
もある。中でも、T.P.Hoppら、Biotechnol.、６巻、120
4−1210頁、1988年の報告が挙げられる。この報告には
組換え体タンパク質の同定と精製用の標識として使用さ
れる短いＮ末端融合配列が記載され、この標識を除く
と、融合タンパク質をつよく処理する必要がないという
利点があると述べられている。この報告でT.P.Hoppら
は、融合タンパク質の産生法には現在いくつもの欠点が
あると述べていることに留意すべきである。実際に、天
然タンパク質の四次構造に相当する四次構造を有し、安
定でかつ天然タンパク質の生物学的活性を保持する融合
タンパク質を得ることは自明なことではない。また、Bi
ochemical and Biophysical Research,1987年,149,2,60
7〜614には、連続的した、プロインスリンもしくはその
断片およびアルカリホスファターゼからなり、プロイン
スリン遺伝子とアルカリホスファターゼ遺伝子を連続し
て含有しているDNA（成熟phoAをコードする遺伝子の
５′末端を通じて結合している）から得られるハイブリ
ッドタンパク質が記載されている。
しかし、文献に記載されている融合および／または放
出されたタンパク質の説明は、特別の場合にのみ適用さ
れているだけで、一般化することができない。
したがって、本願の出願人は、細胞周辺腔に直接放出
されるかまたはそのハイブリッド形の細胞から分泌さ
れ、かつタンパク質P1の断片、タンパク質P2および酵素
からなる一群のハイブリッドタンパク質を提供すること
を目的としており、このハイブリツドタンパク質は、タ
ンパク質P2と上記酵素の特性を保持し、RA（受容体検定
法）もしくはEIA（酵素免疫検定法）色の検定法、特にE
LISA式の検定法における診断および／または検出用の試
薬、および組換え体クローンの選択もしくはDNAライブ
ラリーのスクリーニング用の試薬として用いることがで
きる。またこれらのハイブリッドタンパク質は、特に前
記の放出もしくは分泌されるハイリッドタンパク質が精
製工程なしで診断試薬として直接使用することができか
つ安定であるという点で、従来技術のハイブリッドタン
パク質よりも実用上の要求によく合致している。
さらにこのハイブリッドタンパク質によって、特に小
分子の検定が可能になる。小分子は通常、たとえ酵素に
化学的に結合できても、試薬として利用できないので、
従来特にRIA法によって検定されている。
この発明の目的は、前記ハイブリッドタンパク質を産
生する装置を提供することにある。
この発明の主題は、細菌と酵母からなる群から特に選
択される微生物によって、放出もしくは分泌される適切
なタンパク質P1に対する構造遺伝子のリーダー配列、前
記成熟タンパク質P1のNH2末端断片をコードする核酸配
列、タンパク質P2をコードする核酸配列、および適切な
細胞質外酵素の成熟配列の少なくとも１つの機能性断片
をコードする断片を連続して有するハイブリッド配列か
らなる核酸配列であり、これらの断片のアセンブリー
（集合体）は単一の読み枠内にあり、酵素の性質と、前
記のタンパク質P2のいくつかの性質の特に抗体、抗原も
しくは受容体と特異的に相互作用を行う性質を同時に有
するハイブリッドタンパク質をコードしている。
この発明において、核酸とは一重鎖もしくは二重鎖の
核酸配列を意味し、その核酸はDNAもしくはRNAであるこ
とは理解されるであろう。
この発明の配列の他の有利な態様によれば、酵素は、
特にアルカリホスファターゼ、酸性ホスファターゼ、酸
性グルコースホスファターゼ、サイクリックホスホジエ
ステラーゼおよびβ−ラクタマーゼからなる群から選択
される。
この発明の配列の他の有利な態様によれば、タンパク
質P2をコードする配列の断片は、特にペプチドホルモン
をコードする配列、毒素をコードする配列、および免疫
グロブリン（組換え体免疫グロブリン）の可変ドメイン
に類似した単一連鎖断片をコードする配列からなる群か
ら選択される。
これらの断片は、特に、Proc.Natl,Acad,Sci,USA,85
巻,5879〜5883頁,1988年に記載されている。
この態様の構成によれば、毒素は神経毒が有利であ
る。
この発明によれば、タンパク質P1は、前記定義の酵素
と同一もしくは異なっていてもよい。
この発明の配列の他の有利な態様によれば、前記の核
酸の配列は、特に細菌と酵母とからなる群から選択され
る微生物により放出もしくは分泌される酵素の構造遺伝
子のリーダー断片、前記成長酵素のNH2−末端断片をコ
ードする核酸配列、タンパク質P2をコードする核酸配
列、および前記酵素の成熟配列の少なくとも１つの機能
性断片をコードする断片を、連続して有するハイブリッ
ド配列で構成され、これら断片のアセンブリーは、単一
の読み枠内にあり、酵素の性質および前記タンパク質の
いくつかの性質、特に、抗体、抗原もしくは受容体と特
異的に相互作用を行う性質を同時にもっているハイブリ
ッドタンパク質をコードしている。
上記態様の有利な構成によれば、前記ハイブリッド配
列は、アルカリホスファターゼに対する構造遺伝子のリ
ーダー配列、成熟アルカリホスファターゼの最大28個ま
でのＮ末端アミノ酸をコードする断片、タンパク質P2も
しくはその断片をコードするDNA配列、およびアルカリ
ホスファターゼの少なくとも422個のＣ末端アミノ酸残
基をコードする断片を、連続して含有し、これら断片の
アセンブリーは、単一の読み枠内にあり、アルカリホス
ファターゼの性質、特にその酵素活性と、タンパク質P2
の性質のいくつか、特に抗原、抗体もしくは受容体と特
異的に相互作用を行う性質を同時にもっているハイブリ
ッドタンパク質をコードするハイブリッドDNA配列を形
成している。
この構成の有利な変形によれば、前記ハイブリッドDN
Aの配列は、アルカリホスファターゼのリーダーペプチ
ドをコードする核酸配列、アルカリホスファターゼの28
個のＮ末端アミノ酸をコードする配列、成熟エラブトキ
シンａ（ea）をコードする配列、およびアルカリホスフ
ァターゼの422個のＣ末端アミノ酸をコードする配列
を、連続して含有している。
この変形によればエラブトキシンａをコードする配列
は、192の塩基対と、２つの追加のSau3AI制限部位とを
有する。
前記ハイブリッド配列は下記式で表される。
ホスファターゼの少なくとも422個のＣ末端アミノ酸
残基をコードする断片。なおこの配列はea/phoA28と呼
ぶ。
第１の矢印は、エラブトキシンａを含有する挿入断片
の開始部分を示し、第２の矢印はこの挿入断片の末端を
示す。
アルカリホスファターゼに対する構造遺伝子（phoA遺
伝子）の完全配列は、Gene,44巻、121−125頁、1986年
に記載されている。
この態様の他の有利な構成によれば、この発明のハイ
ブリッド核酸配列は、アルカリホスファターゼに対する
構造遺伝子のリーダー配列、成熟アルカリホスファター
ゼの６個のＮ末端アミノ酸をコードする断片、タンパク
質P2もしくはその断片をコードする核酸配列、およびア
ルカリホスファターゼの444個のＣ末端アミノ酸残基を
コードする断片を連続して含有し、さらにこのハイブリ
ッド核酸配列は、特にこれら断片のアセンブリーを単一
の読み枠内におくために、タンパク質P2をコードする断
片から下流および／または上流に適切な核酸断片を有
し、またハイブリッド核酸配列は単一の読み枠内にあ
り、アルカリホスファターゼの性質と該酵素と異なるタ
ンパク質のいくつかの性質、特に抗原、抗体もしくは受
容体と特異的に相互作用を行う性質を同時にもっている
ハイブリッドタンパク質をコードしている。
この発明のハイブリッド核酸配列には、タンパク質P2
をコードする配列が、成熟アルカリホスファターゼの６
番目のアミノ酸をコードするトリプレットの後に挿入さ
れているが、この発明のハイブリッド核酸配列は、特
に、アルカリホスファターゼをコードする配列中に少な
くとも１つのユニーク制限部位を挿入し、phoA遺伝子の
読み枠をフェーズからシフトし、アルカリホスファター
ゼの発現を防止することによって製造され、前記部位へ
タンパク質P2を挿入したことによって、この発明の条件
下、アルカリホスファターゼ遺伝子をフェーズにシフト
バックし、酵素を発現させることができる。
上記の構成の有利な変形によれば、前記ハイブリッド
DNA配列は、連続した、アルカリホスファターゼに対す
る構造遺伝子のリーダー配列、アルカリホスファターゼ
の６個のＮ末端アミノ酸をコードする配列、アンギオテ
ンシンＩをコードする核酸配列、配列AGG Ｇを有し、
アルカリホスファターゼ遺伝子をフェーズにシフトバッ
クさせることができる断片、およびアルカリホスファタ
ーゼの少なくとも444個のＣ末端アミノ酸残基をコード
する断片で構成されている。
前記ハイブリッド配列は以下の式（II）で表わされる
配列で構成されている。
式（II）のこの配列はアンギオ/PhoA6と命名する。
この式（II）において、負の番号をつけてあるのはア
ルカリホスファターゼのシグナルペプチドに相当し、正
の番号をつけてあるのは成熟アルカリホスファターゼの
アミノ酸に相当する。下線をつけてある配列は、アンギ
オテンシンＩの配列である。アルギニンの次のバリン＋
７を、phoA遺伝子のクローン化とフェーズへのシフトバ
ックが必要なために導入した。ホスファターゼ遺伝子に
導入された、上記定義のユニーク制限部位に相当するヌ
クレオチは小文字で示しているが、これらは、本願の場
合Sma I部位（ccc……ggg）に相当する。これによっ
て、前記部位の存在によって生じるphoA遺伝子のフェー
ズからのシフトと、アンギオテンシン配列を導入するこ
とによって生じたフェーズへのシフトバックとを実証す
ることができる。図示されていない（点線部分）ホスフ
ァターゼ配列の部分はChangらが発表した配列に相当す
る（Chang,C.N.,W.−J.Kuang,およびE.Y.Chen,Gene,44
巻、121−125頁、1986年）。
この構成の他の有利な変形によれば、前記ハイブリッ
ドDNA配列は、連続して、アルカリホスファターゼに対
する構造遺伝子のリーダー配列、アルカリホスファター
ゼの６個のＮ末端アミノ酸をコードする配列、配列GAT
CCCを有する断片、エラブトキシンａをコードする核
酸配列、配列GAT Ｃを有し、アルカリホスファターゼ
遺伝子をフェーズにシフトバックすることができる断
片、およびアルカリホスファターゼの少なくとも444個
のＣ末端アミノ酸残基をコードする断片をもっている。
上記ハイブリッド配列は以下の式（III）で表わされ
る。
式（III）のこの配列はea/pHoA6と命名する。
この式（III）において、負の番号を付けてあるの
は、アルカリホスファーターゼのジクナルペプチドのア
ミノ酸に相当し、正の番号を付けてあるのは、成熟アル
カリホスファターゼのアミノ酸に相当する。下線を引い
てあるいは、エラブトキシンａの配列である。エラブト
キシンの配列の両端のアミノ酸Asp−PreとAsp−Argはph
oA遺伝子をクローン化し、フェーズにシフトバックする
必要があるために導入したものである。ホスファーター
ゼ遺伝子に導入されたSma I制限部位に相当するヌクレ
オチドは小文字（ccc……ggg）で示してある。これによ
って、前記部位の存在によって起こるphoA遺伝子のフェ
ーズからのシフトと、エラブトキシン配列の導入によっ
て生じるフェーズへのシフトバックを例証することがで
きる。図示されていない（点線で示す）フォスァフター
ゼ配列の部分は、Changらの発表した配列に相当する（C
hang,C.N.,W.−J.KuangおよびE.Y.Chen,Gene,44巻、121
−125頁、1986年）。
また、この発明の主題は、特に細菌および酵母からな
る群から選択される微生物によって放出もしくは分泌さ
れるタンパク質P1の断片、適切なタンパク質P2もしくは
その断片、および適切な酵素の少なくとも１つの機能性
断片を、連続してもっているハイブリッド配列からなる
タンパク質であって、前記酵素の性質とタンパク質P2の
いくつの性質、特に抗体、抗原もしくは受容体と特異的
に相互作用を行う性質を同時にもっているハイブリッド
タンパク質である。
前記ハイブリッドタンパク質の有利な態様によれば、
タンパク質P1は上記酵素と異なる。
前記ハイブリッドタンパク質の他の有利な態様によれ
ば、タンパク質P1は上記酵素と同一である。
この態様の有利な構成によれば、前記ハイブリッドタ
ンパク質は、特に細菌と酵母からなる群から選択された
微生物によって放出もしくは分泌される酵素を含有し、
適切なタンパク質P2が挿入されている。
この態様の他の有利な構成によれば、前記のハイブリ
ッドタンパク質は、特に細菌と酵母からなる群から選択
される微生物によって放出もしくは分泌される酵素の断
片、適切なタンパクP2、および前記酵素の完全成熟配列
を連続してもっている。
この発明によるハイブリッドタンパク質の他の有利な
態様によれば、このタンパク質は、ペプチドホルモン
類、および特にアルカリホスファターゼ、酸性ホスファ
ターゼ、酸性グルコースホスファターゼ、サイクリック
ホスファターゼおよびβ−ラクタマーゼからなる群から
選択される酵素に挿入された免疫グロブリンと毒素の可
変断片に類似の単一連鎖の断片からなる群から選択され
るタンパク質P2を含有している。
この態様の構成によれば、前記のハイブリッドタンパ
ク質は、アルカリホスファターゼに挿入された神経毒で
構成されたものが好ましい。
この構成の有利な変形によれば、神経毒はエラプトキ
シンａ（ea）であり、そのハイブリッドタンパク質は、
上記式（Ｉ）もしくは（III）によって表される配列を
もっている。
この態様の他の構成によれば、前記ハイブリッドタン
パク質は、アルカリホスファターゼに挿入されたアンギ
オテンシンＩで構成されたものが有利であり、上記式II
によって示される配列をもっている。
この発明は、特に、機能性タンパク質P2が、酵素中に
挿入されるかまたはタンパク質P1と前記酵素との間にサ
ンドイッチされているかにかかわらず予想外にも酵素と
機能性タンパク質P2の両方を発現し、しかも非常に安定
であるという利点をもっている。
また、この発明は小さな機能性タンパク質を発現する
という利点をもっている。従来、小さな機能性タンパク
は、たとえ酵素と化学的に結合させることができても試
薬としては利用できなかったので、EIAタイプもしくはE
LISAタイプの検定には利用できず、実施するのが非常に
やっかいなRIAタイプの検定にしか使えなかったもので
ある。
この発明の主題は、この発明によるハイブリッドタン
パク質を発現および／またはクローン化するための一群
のベクターである。この各ベクターは、以下のような構
成の発現システムをもっている。すなわち 適切なプロモーター； リボソーム結合部位； タンパク質P1の構造遺伝子のリーダー配列、前記成熟
タンパク質P1のNH2末端断片をコードする配列、天然の
制限部位に挿入されたタンパク質P2をコードする配列、
および酵素もしくはその断片をコードする成熟配列を含
有し、この発明のハイブリッド配列に相当する核酸配
列；ならびに 転写ターミネーター：からなる発現システムであり、
この発現システムは、特に、プラスミド、ファージ、コ
スミドもしくは適切な染色体からなる群から選択された
適切な遺伝子構造に挿入される。
前記ベクターの有利な態様によれば、その遺伝子構造
はプラスミドであり、タンパク質P1はその酵素と同一で
ある。
このベクターの有利な構成によれば、P2が有利にエラ
ブトキシンａである場合、下記の特性をもったプラスミ
ドが得られる。すなわち、 そのプラスミドは6.1kbで構成され； このプラスミドは、アルカリホスファターゼに対する
構造遺伝子を有するプラスミドpJC2431とアンピシリン
耐性の遺伝子（ApR）とを連結することによって得られ
る。上記のプラスミドpJC2431はBcl I部位が直線化さ
れ、アルカリホスファターゼに対する前記構造遺伝子の
コドン28の位置にエラブトキシンａをコードする192塩
基対のSau 3AI−Sau 3AI断片をもっている。
この発明の発明者らは、このプラスミドをpEP1726と
命名した。
プラスミドpJC2431は、J.C.Lazzaroniら、J.Bacterio
l.164巻、1376−1380頁、1985年に記載されている。
この発明の主題は、この発明によるハイブリッドタン
パク質の発現および／またはクローン化を行う他の１群
のベクターである。その各ベクターは以下のような構成
の発現システムをもっている。すなわち、 適切なプローモーター； リボソーム結合部位； タンパク質P1の構造遺伝子のリーダー配列、 前記成熟タンパク質P1のNH2末端断片をコードする配
列、細胞質外酵素またはその断片をコードする配列、お
よびタンパク質P1をコードする配列の断片と上記酵素を
コードする配列との連結部に位置し、タンパク質P2をコ
ードする配列を受けることができる１つ以上のユニーク
制限部位を含有する核酸配列；ならびに 転写ターミネーター；からなる発現システムであり、
この発現システムは、特にプラスミド、ファージ、コス
ミドもしくは適切な染色体からなる群から選択された適
切な遺伝子構造に挿入される。
前記ベクターの有利な態様によれば、導入されたユニ
ーク制限部位の少なくとも１つが、酵素に対する遺伝子
をフェーズからシフトさせ、この遺伝子のフェーズへの
シフトバックは、タンパク質P2に対する配列を導入する
ことで行われる。
この態様の有利な構成によれば、下記の特性を有する
プラスミドが得られる。すなわち、 そのプラスミドは約5.9kbで構成され； このプラスミドは、プラスミドpJC2431が持っているp
hoA遺伝子の突然変位を誘発して、成熟タンパク質の＋
６の位置に対応するユニークSma I制限部位を導入する
ことによって得られる。
この発明の発明者らは上記のプラスミドをpLIPlと命
名し、このプラスミドは無負荷であるといわれている。
タンパク質P2をコードする配列が、phoAに対する構造
遺伝子中に天然に存在する制限部位に挿入されている場
合か、またはタンパク質P2をコードする配列がphoAに対
する構造遺伝子に予め導入されたユニーク制限部位に挿
入されている場合に、かようなベクターがこの発明のハ
イブリッド配列を含有し、かつ適切な微生物中に存在し
ている時ハイブリッドタンパク質を直接発現する。そし
てかようなベクターは負荷されているといわれる。一方
pLIPlと呼ばれているベクターは、タンパク質P2を受け
ることができるが、その部分については、負荷されてい
ないといわれている。
またこの発明の主題は、遺伝子の形質転換で得られる
微生物であり、この微生物は、イー・コリの適切な菌株
を、この発明のベクターで適切に修飾することによって
得られ、特に前記ベクターがプラスミドである場合の形
質転換によって得られる。
この発明の態様によれば、前記の微生物としては、プ
ラスミドpEP1726で形質転換されたイー・コリ菌部CC118
が有利である。
前記プラスミドで形質転換された上記の菌株は、パス
ツール研究所に所属するCollection Nationale des Cul
tures de Microorganismesに寄託番号Ｉ−862で1989年
６月２日に寄託された。
この菌株を、発明者らはSEP 1726と呼称している。
この発明の他の態様によれば、前記微生物としては、
プラスミドpLIPlで形質転換されたイー・コリ菌株CC118
が有利である。
前記プラスミドで形質転換された上記菌株は、パスツ
ール研究所に所属するCollection Nationale des Cultu
res de Microorganismesに寄託番号Ｉ−954で1990年６
月７日に寄託された。
かような無負荷のベクターは、タンパク質をコードす
るいずれの配列もこのユニーク制限部位に挿入できると
いう利点がある。
アルカリホスファターゼに対する構造遺伝子の上記の
修飾によって、さらに、下流に位置するヌクレオチド配
列にフレームシフトが導入され、この配列はphoAの機能
性部分の特徴である。
この無負荷ベクターは、上記定義のプラスミドPLIPl
に相当するものであり、アルカリホスファターゼ活性を
発現しない。
以下の式（IV）は、天然のphoA遺伝子（Ａ）、無負荷
ベクターpLIPlがもっている修飾phoA遺伝子（Ｂ）およ
び負荷ベクターがもっているハイブリッドphoA遺伝子
（Ｃ）に対応するヌクレオチドの配列とタンパク質の配
列を示す。
A.天然のホスファターゼ B.Sma I部位の導入（無負荷ベクターpLIPl） C.ホスファターゼハイブリッドを得ることができるよう
になる、挿入と、フェーズへのシフトバック（負荷され
たベクター） 天然のphoA遺伝子由来のヌクレオチドは大文字で示し
てある。番号は、成熟アルカリホスファターゼのアミノ
酸に対応する。点線は、図示していない配列部分に対応
する。phoA遺伝子の導入されたSma I制限部位に対応す
るヌクレオチドは小文字で示してある（cccggg）
（Ｂ）。その結果導入されたフレームシフトが49のアミ
ノ酸の異常タンパク質を合成することになる（Ｂ）。終
止コドンを含んでいない3n＋１塩基対の配列（挿入断
片）をSma I部位に導入することによって、phoA遺伝子
をフェーズにシフトバックし、ハイブリッドタンパク質
を得ることがてきるようになる（Ｃ）。さらに、その反
対の配向の3n＋１配列が終止コドンをもっている場合、
この配列を所望の配向に導入することでしか、ホスファ
ターゼ活性を有するタンパク質を得ることができない。
この発明によれば、プロモーターは、phoA遺伝子プロ
モーターおよびpho遺伝子プロモーターより強力なプロ
モーターからなる群から選択される。
phoA遺伝子プロモーターは、特に、細菌の培地中のホ
スファターゼの濃度が非常に低くなった時に活性化され
る誘発性プロモーターである。
このようなプロモーターは、特に、ハイブリッドタン
パク質を、リン酸含量の低い培地で産生させることがで
きる。細菌の培養中、培地中にリン酸分がない場合、細
菌の集団が増大した後に、ハイブリッドタンパク質の合
成を誘発することができる。このような誘発システムの
利点は、抽出されるタンパク質は培養の末期に合成され
るので、産生中にタンパク質が分解する危険が低くな
る。その結果ハイブリッドの均一性が増大する。
また、この発明の主題は、この発明の微生物中に上記
定義の発現ベクターを用いる、この発明のハイブリッド
タンパク質を発現する方法である。
この発明のハイブリッドタンパク質の下記の２つの特
性は強調しなければならない。
（１）その生産が極めて簡単で、かつ長くてむずかしい
精製工程がない。
（２）酵素活性が基質の存在下24時間以上も持続するの
で、細菌による生産、むづかしい条件下での貯蔵および
酵素の試験中、安定である。
またこの発明の主題は、この発明のハイブリッドタン
パク質からなる診断剤である。
このような試薬には、特に、受容体を検出する免疫酵
素検定法への用途または組織化学的標識としての用途が
ある。
またこの発明の主題は、タンパク質を含有する生物学
的流体をこの発明の診断剤と接触させることによって、
前記生物学的流体中の前記タンパク質を検出することか
らなり、複合体形もしくは遊離形での前記試薬の存在が
適切な比色反応で目視可能である、タンパク質の免疫酵
素学的検出法である。
前記方法の有利な態様によれば、前記タンパク質は抗
原である。
前記の方法の有利な態様によれば、前記タンパク質は
抗体である。
さらにこの発明の主題は、前記検定法を実施するのに
有利な緩衝剤と試薬の適切な量とは別に、この発明の試
薬の適切な量からなる、前記の免疫酵素学的検出法や実
施するためのすぐに使用できるのキットである。
この発明の試薬は、直接に使用できるという利点があ
るが、一方、通常EIA検定法もしくはELISA検定法では、
抗原もしくは抗体が酵素に対して共有結合し、その結合
は化学的に行われている。有効に結合させるには、この
結合を、２つの高度に精製された成分を用いて実施しな
ければならない。
またこの発明の主題は、cDNAもしくはゲノム核酸のラ
イブラリーのスクリーニング法または組換え体クローン
の選択法であり、この方法によって、この発明のハイブ
リッド核酸配列を含有する試験中のプラスミド、ファー
ジ、コスミドもしくは組換え染色体を、適切な時に組込
んだ細菌もしくは真核細胞のクローンから放出もしくは
分泌される酵素の存在の有無が、比色反応もしくは、適
切な培地で選択することによって目視可能である。
上記の方法の有利な態様によれば、酵素がアルカリホ
スファターゼの場合、放出もしくは分泌される酵素はそ
の酵素の適切な基質を用いて目視可能である。
上記の方法の他の有利な態様によれば、酵素がβ−ラ
クタマーゼである場合、放出もしくは分泌される酵素の
存在はアンピシリンを含有する培地を用いて目視可能で
ある。
挿入されたタンパク質P2に対する配列から下流に、β
−ラクタマーゼを指定する遺伝子を有する発現系は、実
際には、開放した読み枠を有効かつ排他的にクローン化
することができる。これらの構築法によって、所望のペ
プチドを含有し、これに続いて機能性β−ラクタマーゼ
を含有するハイブリッドタンパク質が合成されるように
なる。次いでかようなタンパク質を発現する細菌は、ア
ンピシリンに対する耐性によって選択される。
上記の態様とは別に、またこの発明は、この発明の主
題の方法の実施例を参照する下記の説明から明らかにな
る他の態様も含むものである。
さらに、これらの実施例は、この発明の主題を例証す
るだけであって、この発明を限定するものではないこと
は、明確に理解されるであろう。
実施例1:プラスミドpEP1726の製法 エラブトキシンａをコードするSau3AI−Sau3AI断片の
製造： エラブトキシンをコードする、シグナル配列のない19
2の塩基対のSau3AI−Sau3AI制限断片を、３コードンに
関して変異を有するEa遺伝子を含有するファージM13mp1
9（−2GAT,−1CCC、＋63GAT）eaの複製型から作った。
これらの一時変異によって、遺伝子に２つの新しいSauS
AI制限部位が生成する。：すなわち−2TAC（Tyr）はGAT
（Asp）になり、−1ACC（Thr）はCCC（Pro）に、＋63TA
G（AMB）はGAT（Asp）になる（式Ｉ参照）。この断片
は、Bc1 IとDNAリガーゼで部分開裂によって開かれたベ
クターpJC2431に挿入される。50mMトリスーHClpH7.4、1
0mMMgCl2、10mM DTT、0.5mM ATP及び100μg/mlBSA緩衝
液中で、1UのファージT4 DNAリガーゼと1:10のベクター
／挿入断片濃度比で、連結を行った。ベクターの脱リン
酸化はManiatisらの方法に従って行った。
第１図は、その自身のプロモーターのコントロール下
でアルカリホスファターゼの構造遺伝子を保持するプラ
スミドpJC2431を示す（Lazzaroniら、1985）。このプラ
スミドは３つのBcl I制限部位、即ちphoAプロモーター
の上流に位置するBcl I1、およびphoA遺伝子のコードン
＋28と＋363のそれぞれに位置するBcl I2とBcl I3を有
する。eaをBcl I2部位へ挿入すると、この発明によるハ
イブリッドタンパク質の産生に重要なプラスミドpEP172
6を得ることができる。
酵素Bcl Iはダム・メチラーゼでメチル化された制限
部位でDNAをカットできないので、非メチル化プラスミ
ドを作るためダム種GM2163はpJC2431で形質転換され
る。次いで、Bcl Iと脱リン酸化によってpJC2431の部分
消化が行われる。次にオープンプラスミドに対応するDN
A（３つの可能なカット法からBcl Iによる単一カット）
が、Maniatisら（1982）の原理に従って低融点アガロー
スで単離される。
実施例2:ハイブリッドタンパク質ea/phoA28の発現 （アルカリホスファターゼのaa28への挿入） 株CC118（ΔphoA20）を実施例１記載の連結混合物で
形質転換した。得られたApr（アンピシリン耐性）形質
転換株をXPとアンピシリンを含むアルカリホスファター
ゼ誘導培地で精製した。
この誘導培地は、TES［2g/の（NH4）2SO4、0.5mg/
のFeSO4・7H2O、75mg/のKCl、7.5g/のトリエタノ
ールアミン、pH7.5に調整］である。色素産生基質（chr
omogenic substrate）の５−ブロモ−４−クロロ−３−
インドリルリン酸塩（XP0.4g/）をこの培地に加える
と、ペトリ皿でアルカリホスファターゼ活性を目視する
ことができる。すなわちXPは、これを加水分解するコロ
ニーを青色に呈色させる。
３つのタイプの形質転換体が、そのXP加水分解能によ
り、無色クローン、青色クローンと最後に濃紺クローン
に区別されている。従って後者の２つは、それらを含有
するプラスミドによるアルカリホスファターゼ活性を有
する。
これらの異なる形質転換体のプラスミドDNAの制限断
片を分析すると、各場合について、ea遺伝子の挿入の部
位と配向を決めることができる。
濃紺クローンは、Bcl I1部位すなわちphoA遺伝子とそ
のプロモーターの上流に１つ又は２つのSau3AI−Sau3AI
断片が挿入されていることに相当する。これらのクロー
ンのアルカリホスファターゼ活性は、株CC118（pJC243
1）と同じである。
あまり顕著でない青色クローンは、Bcl I2部位へのea
遺伝子のコピーのインフレーム挿入に対応する（pEP172
6）。
無色クローンはBcl I2部位へのea遺伝子の挿入による
が、phoA遺伝子のそれとは反対配向である。
浸透圧ショツクによるペリプラズムタンパク質の抽出
に用いられる原理はDvorakら（1967）の報告に記載され
た方法である。
実施例3:プラスミドpLIp1（未負荷発現ベクター）とプ
ラスミドpLIpl/P2（負荷発現ベクター）を得る方法 1.クローニング部位のphoA遺伝子への導入 プラスミドpJC2431が保持するphoA遺伝子（E.コリ
アルカリホスファターゼ）を、成熟タンパク質の第６番
目のアミノ酸に対応するコードンの後にユニークSma I
制限部位を導入するために、直接の突然変異誘発により
修飾した。この遺伝子は、次の２つの理由で選択した。
−その酵素活性を大きく損うことなく、ホスファター
ゼのＮ末端領域を修飾することができる。
−第1N末端アミノ酸の存在が、シグナルペプチドの開
裂を行うために必要である。
この部位は、phoA遺伝子中のフレームシフトがもたら
されるように導入した。その結果、この修飾遺伝子は機
能性タンパク質を発現することはできない。
2.外因性DNA配列のphoA遺伝子への導入phoA遺伝子のSma
I部位に導入するためのDNA断片は、ヌクレオチド合成
で得られるか又はクローン遺伝子配列から生ずる。これ
らは次の要件に合うように作られる。
（１）それらの５′末端と３′末端は平滑でなければな
らなず、Sma I部位は平滑端を発生する。
（２）所望の配向でそれらを導入することによって、挿
入部位から下流のphoA遺伝子配列をフェーズにシフトバ
ックさせることができ、ホスファターゼ活性を有するハ
イブリッドタンパク質を合成することができるかつ （３）所望配向と反対の配向のそれら配列は、リーディ
ングフレームを持つフェースに終止コードを所有しなけ
ればならない。このため、この配向を挿入した場合に
は、ハイブリッド遺伝子の機能がなくなる。
遺伝子構築は遺伝子工学の古典的技法で行われる。
正しい方向に外因性配列を挿入したベクターのみが、
挿入した配列でコードされたポリペプチドとアルカリホ
スファターゼとからなるハイブリッドタンパク質の発現
を許すオープンリーディングフレーム（読み枠）を有す
る。
3.ハイブリッド遺伝子の選択 ベクターpLIP1に所望のDNA断片を連結した後、組換え
体プラスミドは、細菌株CC118（アルカリホスファター
ゼを発現しないイー・コリ変異体）を形質転換うるのに
使用される。予想した遺伝子構成を含有する細菌クロー
ンのみが、ホスファターゼ活性を回復することができ
る。この活性は、ホスファターゼ用色素産生基質を含む
適当な選択培地で細菌を培養することにより目視でき
る。正のクローンは青色を呈する。
青色の呈色は、細菌がホスファターゼ活性を有するタ
ンパク質を発現していることを示し、次のことを意味す
る。
−外因性DNA断片が適当な配向で正しく挿入され、ホ
スファターゼをコードする配列をフェーズにシフトバッ
クさせることができる。
−ハイブリッドタンパク質、すなわち組換え体遺伝子
の産物が細菌のペリプラズムに正しく放出される。
−ハイブリッドタンパク質がホスファターゼの活性型
に相当するホモダイマーを形成するためにダイマーを産
生する。
−かつ従って外因性タンパク質の配列をホスファター
ゼに挿入してもその酵素活性を大きくそこなわない。
実施例4:ハイブリッドタンパク質ea/phoA6とアンギオ/p
hoA6の発現 1.タンパク質P2のアルカリホスファターゼへの導入 成
熟ホスファターゼの６と７のアミノ酸の間に行った。得
られたハイブリッドタンパク質は次のもので構成されて
いる。
−ホスファターゼのシグナルペプチドの21のアミノ
酸。このペプチドが細菌の細胞周辺腔にタンアパク質を
放出させる。この局材化は、ホスファターゼ活性の獲得
とハイブリッドタンパク質の簡便な抽出に必須である。
−ホスファターゼの6N−末端アミノ酸。これの存在に
より、細胞周辺腔へ継代中にシグナルペプチドが分裂さ
れる（cleave）。
−ホスファターゼに挿入された外因性タンパク質のア
ミノ酸配列。クローニングの要求が、適当な場合に、こ
の配列の端部に１以上の付加アミノ酸が導入できる。お
よび −ホスファターゼのラストの444のアミノ酸。
2.ハイブリッドタンパク質の産生 細菌をリン酸が少ない液体培地で培養する。リン酸塩
が消費されると、ホスファターゼプロモーターが活性化
されハイブリッド遺伝子の転写をする。この誘導現象の
利点は、培養の終り（４〜５時間の培養）にハイブリッ
ドタンパク質の急速な合成をさせ、かつそのためタンパ
ク質分解の危険を制限をすることである。細菌の細胞周
辺腔のタンパク質を浸透ショック法で抽出する。このタ
ンパク質ハイブリッド（例えば試薬として）を使用する
際には更に精製を必要としない。
3.毒素／ホスファターゼハイブリッド（ea/phoA6）−遺
伝子構築： 実施例１で詳述したSau3AL部位の５′と３′の末端に
隣接するエラブトキシンａコーディング配列からなる19
6塩基対断片をクレノーポリメラーゼで修復し、プラス
ミドpLIP1のSma I部位に導入した。反対配向の断片中
の、フェーズの終止コードンの存在により実施例２に記
載の原理によって探索した組換えクローンの視覚選択が
できる。そこで得られたプラスミドはpLIPl/eaと呼称す
る。所期のポリペプチド鎖（ea/phoA6）は、ホスファタ
ーゼシグナルペプチド、ホスファターゼの最初の６つの
アミノ酸、クローニングが必要なため導入された２つの
付加アミノ酸（Asp,Pro）、エラブトキシンａの62のア
ミノ酸、クローニングが必要なため導入された２つの付
加付アミノ酸（Asp,Arg）およびホスファターゼのラス
トの444のアミノ酸を、連続して含有している。シグナ
ルペプチドは、細胞周辺腔へ継代（passage）中に分裂
される。
−ハイブリッドタンパク質ea/phoA6の特性 ハイブリッドタンパク質ea/phoA6は上記の方法によっ
て作られた。
このハイブリッドの３つの特性すなわち、（１）酵素
活性、（２）エラブトキシンに対して特異的な抗原決定
因子の存在および（３）遊離トキシンの検定をおこなう
ためのハイブリッドの使用可能性について研究した。
これらの特性は、ハイブリッドea/phoA28（実施例
２）、（phoA遺伝子の前修飾をすることなく、位置28の
後でホスファターゼにエラブトキシンを導入して得られ
たプラスミドpEp1726の産生物）の特性と、予め存在す
る制限部位を用いて比較した。
a.ハイブリッドの酵素活性は、産生と同じ条件下で得
た天然アルカリホスファターゼの活性と比較して評価し
た。異なるタンパク質を含有し、浸透ショック法で得た
細菌の細胞周辺腔の抽出物の比活性が測定された。抽出
物のタンパク質濃度は、465mにおける吸光度とブラッド
フォード法（Bradford,1976年）によるタンパク質検定
法により作られた標準カーブとから測定した。酵素活性
は、20μの抽出物で測定される。25mMp−ニトロフェ
ニルホスファート（pNPP）の存在下37℃で15分培養後
に、1mlの1M NaOHを加えて反応を中止させる。410nmに
おけるサンプルの吸光度を（pNPOHの生成による黄色呈
色）を読みとる。１分間に1mgのタンパク質当り加水分
解されたpNPPのnmol中の比酸素活性（SA）は次式で算出
される。
ハイブリッドの活性は、天然ホスファターゼに対応す
る比活性の％として表される。
天然ホスファターゼ＝100％（SA） ea/phoA6 ＝50％ ea/phoA28 ＝30％ b.ハイブリッドタンパク質ea/phoA6とea/phoA28がも
っているアルブトキシンに対して特異的な抗原決定因子
の存在を、ELISAテスト法で試験した。これらのタンパ
ク質は、天然トキシンがもっている抗原決定因子に特異
的なモノクローナル抗体Ｍα２−３に結合する能力を有
する。その上、ea/phoA又はea/phoA28と天然トキシンの
間の結合に競合がある。ハイブリッド中のトキシンの構
築レベルを評価するため、ELISAテスト法を用い、天然
トキシンに対する血清と、変性トキシンに対する血清に
よるその認識性を比較した。ハイブリッドea/phoA6の60
％の程度でトキシンは正しく構築され、一方この比率
は、ハイブリッドea/phoA28についてはわずかに32％で
ある。
c.第２図は、ハイブリッドea/phoA6を用いてのELISA
テスト法によるエラブトキシンａの検定結果を示す。
ELISAテスト法で、ea/phoA6と遊離トキシン間のモノ
クローナル抗体Ｍα２−３への結合の競合を試験した。
ELISAプレート上に抗体を吸着させた後に、ea/phoA6
（浸透シロック法10倍希釈）を、異なる量のトキシンの
存在下で加える。
は、遊離トキシンの量として表される。このテスト法の
感度（B/Bo比＝0.5の際のトキシンの量で評価）は、2.5
pmolで17ngに相当する。この感度はトリチウム化トキシ
ンの使用するRIAテストの感度に等しい。
4.アンギオテンシンI/オスファターゼハイブリッド（ア
ンギオ/phoA6） −遺伝子構築 アンギオテンシンＩをコードしうる31塩基対の断片
を、２つの相補合成オリゴヌクレオチドのハイブリッド
化で得た。この断片を、プラスミドpLIP1のSma I部位に
導入した。この断片の配列は、組込みが所望したのた反
対の配向で行われたとき、フェーズの終止コードン、ホ
スファターゼのリーディングフレームをもつフェーズに
導入できるように決めた。ホスファターゼ活性を発現す
るように（青色クローン）選択された数種のクローンの
配列を決定した後、これらを全て所望の構築に対応させ
た。そこで得られたプラスミドはpLIP1/アンギオと称
呼。所期のポリペプチド鎖（アンギオ/phoA6）は、ホス
ファターゼシグナルペプチド、ホスファターゼの最初の
６つのアミノ酸、アンギオテンシンＩの10のアミノ酸、
クローン化する必要があるため導入した１つの付加アミ
ノ酸（Arg）およびホスファターゼのラストの444のアミ
ノ酸の連続したもので構成されている。シグナルペプチ
ドは細胞周辺腔内に継代中に分裂される。
−ハイブリッドタンパク質のアンギオ/phoA6の特性 ハイブリッドタンパク質アンギオphoA6を上記の方法
で作り、その３つの特性、（１）酵素活性、（２）アン
ギオテンシンＩに対する血清によるその認識と（３）ホ
ルモン検定を行うためのハイブリッドの使用可能性につ
いて試験した。
a.ハイブリッドアンギオ/phoA6の酵素活性はハイブリ
ッドea/phoA6について上記の方法に従って評価した。こ
の測定結果は、天然ホスファターゼに対応する比活性の
％で示す。
天然ホスファターゼ＝100％（SA） アンギオphoA6 ＝93％ b.ハイブリッドタンパク質アンギオ/phoA6の、アンギ
オテンシンＩに対する血清による認識は、ELISAテスト
法で試験した。兎免疫グロブリンに対する豚血清をELIS
Aプレートに吸着させた。ウシ血清アルブミンと結合さ
せたアンギオテンシンＩに対する兎血清を上記豚血清と
結合させた。最後に、浸透ショック法で作ったハイブリ
ッドタンパク質アンギオ/phoA6をその系に加えた。アン
ギオテンシンに対する抗体へのその結合が、酵素の色素
産生用基質を加えることによって、ホスファターゼ活性
を通じて目視することができた。この認識の特異性は、
ハイブリッドと遊離ホルモン間の結合の競合存在するこ
とを示すものである。
c.第３図は、ハイブリッドアンギオ/phoA6を使用しての
ELISA法によるアンギオテンシンＩの検定結果を示す。
アンギオ/phoA6と遊離アンギオテンシンＩの間のこの
ホルモンに対する兎血清への結合の競合をELISA法で試
験した。兎血清は、ELISAプレートに吸着させた豚抗兎
免疫グロブリンと予め結合させる。ハイブリッドアンギ
オ/phoA6（浸透ショック法20倍希釈）を、異なる量のア
ンギオテンシンＩの存在下で加える。
は遊離ホルモンの量で表わされる。このテストの感度
（B/Bo比＝0.5のホルモン量で評価）は0.09pmolで0.12n
gに相当する。この感度は通常の診断実務で用いられるR
IAテスト法（COMPAGNIE ORIS INDUSTRIE.FRANCEからの
市販キット）の感度に等しい。
実施例5:ホスファターゼハイブリッドタンパク質の安定
性 1.ホスファターゼハイブリッドの合成誘発 産生した発現ベクター、pLIP1中に、phoA遺伝子プロ
モーターが、ハイブリッド遺伝子を発現できるように保
持された。このプロモーターは、細菌の培地中のリン酸
の濃度が非常に低くなった際に活性化される誘導プロモ
ーターである。
選定した条件下で（実施例4.2参照）、ハイブリッド
タンパク質の合成（ホスファターゼ活性の出現で測定）
は、培養３時間半後に始まる。ハイブリッドが最大蓄積
量に到達した時、すなわち、４時間30分〜５時間後に抽
出を行う。
2.ハイブリッドタンパク質の安定性 ハイブリッドタンパク質の安定性は、３つの状況すな
わち（１）産生中の安定性、（２）使用中の安定性、
（３）貯蔵操作中の安定性について評価した。
ａ）ハイブリッド及び天然ホスファターゼの安定性
を、［35S］メチオニンで標識をつけた後、免疫沈澱法
とポリアクリルアミドゲル電気泳動法とでその完全性を
目視可能にして試験した。細菌を通常の生産条件下で培
養する。30分間の合成誘導時間に、ハイブリッドの［35
S］メチオニンによるラベル化を行う。アルカリホスフ
ァターゼに特異的なモノクロナール抗体で免疫沈澱させ
たタンパク質は、単一の分子種の型で現れる。観察され
た分子マスは予期の理論値に非常に近いものでホスファ
ターゼに対して約46,000、ea/phoA6に対して約52,000及
びアンギオ/phoA6に対し約47,000である。標識をつけて
から４時間まで細菌培養を続けても（chase）、標識を
つけたタンパク質の分解は全く観察されない。この結果
は、ホスファターゼハイブリッドタンパク質は、その産
生中タンパク質分解作用を受けないことを示す。このよ
うなことは、スタフィロコッカスのプロティンＡもしく
はE.コリβ−ガラクトシダーズの融合で得たハイブリッ
ドタンパク質には決してみられないことである。これら
の系では、所期のハイブリッドタンパク質の大部分がタ
ンパク質分解作用を受ける。
b.ELISAテスト法の目視可能条件下で24時間培養した
後、ハイブリッドの酵素活性の著しい低下はみられな
い。これは、その試薬が使用中安定であることを示す。
その結果、ELISAテストの検視時間は、その感度を増加
さすために延長できる。
c.−180℃で凍結させ37℃での解凍を10回くり返した
後、すなわちきびしい条件下でもハイブリッドのホスフ
ァターゼ活性の95％が保持される。予備試験では、凍結
乾燥で同様の結果を得た。従って、ホスファターゼハイ
ブリッドは通常の包装条件下で完全に安定のままで保持
できることは明らかである。
実施例6:この発明によるcDNA又はゲノムライブラリーの
スクリーニング法 市販のクローン化−発現を組合せたシステムをバクテ
リオファージ又はプラスミドにインテグレートする。こ
れらの本質的に共通する特性は次の通りである。１つ又
はしばしばそれ以上、一連のユニーク制限部位を含むよ
うに修飾されたE.コリのlacZ遺伝子の部分（β−ラクト
シダーゼ）を有するということである。この部位のDNA
断片の挿入は一般にβ−ガラクトシダーゼ活性の損失を
まねく。この性質は、組換えクローンの認識を可能に
し、無色のコロニー又は溶菌プラークを形成し、一方挿
入断片なしのクローンはＸ−ガルの存在下ブルーとな
る。その上、挿入されたDNA配列は、β−ガラクトシダ
ーゼとの断片との融合タンパク質の形で発現させること
ができる。次いで、それらの検出は、所望のタンパク質
に特異的な抗体を使用することで可能である、目視は、
異なる方法、すなわちヨード125でのラベル化、又は抗
体−酵素の接合体（Molecular Cloning,1989年,12〜1
4）を使用することで行われる。特にプラスミドpLIP1で
記載したように、修飾lacZ遺伝子の系における修飾phoA
遺伝子による置換によって、XPの存在下、青色及び無色
のクローンが出現する。この場合、この事情は、β−ガ
ラクトシダーゼを使用する系で生ずるのと反対であり、
比色基質すなわちこの場合のXPを変換しうるクローン
は、組換え体クローンである。その上、クローンが簡単
に着色するのは数種の性質を示す。すなわち ｉ）DNA断片がphoA遺伝子に挿入された、ii）この断片
はオープンリーディングフレームをコードする、iii）
挿入によって、phoA遺伝子をフェーズにシフトバックす
ることが可能になり、ハイブリッドタンパク質の形で発
現することが可能になる、iv）このハイブリッドタンパ
ク質は細胞周辺腔へ放出される、およびｖ）組換えアル
カリホスファターゼは二量化し、その基質、特に比色基
質を加水分解する活性酵素を形成する。従って、比色テ
ストで現れる情報は、β−ガラクトシダーゼの場合よ
り、より広範である。後者の酵素を使用すると、挿入断
片を有するクローンと挿入断片をもっていないクローン
との区別を組換えタンパク質の存在又は性質に頼ること
なく行うことができ、一方、アルカリホスファターゼを
使用すると、構築しかつ酵素的に活性なphoAドメインを
有する放出しうる活性ハイブリッドタンパク質を合成し
うるクローンを直接に同定することが可能になる。その
上、ハイブリッドタンパク質の細胞周辺腔への放出を可
能とする能力は、phoAに挿入されたポリペプチドの構築
に対して必ず影響する。エラブトキシンａの場合には、
その放出には、ジスルフィド架橋の形成をともなう。従
って、それはトキシンの構築型に対して特異的な抗体に
よって認識しうる構造をとる。ほとんどの抗体は、この
タイプの構造依存性特異性を有し、正しく構築されたタ
ンパク質のみを認識する。最後に、挿入されたタンパク
質に特異的な抗体との相互作用をごく簡単に証明するた
めに、合成したハイブリッドタンパク質の酵素活性を活
用することが可能になる。組換えタンパク質を合成する
コロニーを、予め特異的抗体溶液で飽和したニトロセル
ロースフィルターに簡単にブロットし、ホスファターゼ
用比色試薬で検視することにより、抗体と反応しうるハ
イブリッドタンパク質を分泌するクローンを目視するこ
とができる。
この方法は、ある明白なタンパク質のエピトープを同
定するのに非常に効果的である。このタンパク質をコー
ドする断片は、合成、全遺伝子に対する制限酵素の作
用、又はPCR（Polymerase chain reaction）技法の使
用、例えばphoA遺伝子への組入れのような他の方法で得
ることができる。全タンパク質に対する血清又はモノク
ロナール抗体での構築で得られる組換えDNAの相互作用
の研究により、エピトープを有するタンパク質の領域を
同定することが可能になる。
実施例7:この発明による組換えクローンの選定法 β−ラクタマーゼ（それを発現する細菌でアンピシリ
ン耐性を与える酵素）をコードするbla遺伝子を使用す
ることによって、抗生物質の存在下で単独で生育しうる
組換えクローンの選定が可能となる。この種の選定によ
って、非常に稀なコーディング配列を試験することがで
きる。
この発明は以上のごとき上記の説明によって限定され
るべきでなく、この発明の範囲を離れることなく、当業
者によってなしうる変形もこの発明に包含される。
【図面の簡単な説明】
第１図はアルカリホスファターゼに対する構造遺伝子を
もっているプラスミドpJC2431と、このプラスミドからp
EP1726、pL1P1およびpL1P1/Eaの各プラスミドを得る過
程を示す図； 第２図はハイブリッドea/phoA6を用い、ELISAテスト法
でエラプトキシンａを検定した結果を示すグラフ図；お
よび 第３図はハイブリッドアンギオ/phoA6を用い、ELISAテ
スト法でアンギオテンシンＩを検定した結果を示すグラ
フ図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 フレデリック デユカンセル フランス、75012 パリ、ブールバール ド ルイィ 56 (72)発明者 ダニエル、ジレ フランス、75020 パリ、リユー ド ベルビル 154 (72)発明者 アンドレ ムネ フランス、78470 サン レミー レ シユブルーズ、マニー レザモー、アブ ニユー クロード ニコラ ルドゥ 109 (56)参考文献 特開 昭62−282589（ＪＰ，Ａ) Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒ ｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．149（２）ｐ．607 −614（1987) (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C12P 21/02 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (34)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】連続的に少なくとも４つの核酸配列：大腸
    菌の成熟アルカリホスファターゼの分泌シグナル配列を
    コードする第1DNA、適当な読み枠で、前記第1DNAが機能
    的に結合する前記アルカリホスファターゼのＮ末端の６
    〜28個のアミノ酸をコードする第2DNA、タンパク質又は
    ポリペプチドP2又はその断片をコードする第3DNA、及び
    前記アルカリホスファターゼのＣ末端の422〜444個のア
    ミノ酸に対応するアミノ酸をコードする第4DNAからな
    り、順に大腸菌の成熟アルカリホスファターゼのＮ末端
    の６〜28個のアミノ酸が、タンパク質P2に結合し、前記
    アルカリホスファターゼ、異なるアルカリホスファター
    ゼならびにそのいずれかの酵素的に活性な断片のＣ末端
    のアミノ酸残基からなる群の一つに結合することからな
    る安定な成熟ハイブリッドの３部構成のタンパク質をコ
    ードするハイブリッドDNA配列。
  2. 【請求項２】ポリペプチドP2が、ペプチドホルモンをコ
    ードする配列、毒素をコードする配列及び免疫グロブリ
    ンの可変断片に類似の単一連鎖断片をコードする配列、
    ホルモン、神経毒又は免疫グロブリンの可変ドメインの
    単一連鎖からなる群から選択される請求項１に記載のDN
    A配列。
  3. 【請求項３】毒素が神経毒である請求項１又は２に記載
    のDNA配列。
  4. 【請求項４】成熟アルカリホスファターゼの28個のＮ末
    端アミノ酸をコードする配列、前記ポリペプチドP2とし
    て成熟エラブトキシンａをコードする配列、及びアルカ
    リホスファターゼの422個のＣ末端のアミノ酸残基をコ
    ードする配列からなる請求項１〜３に記載のDNA配列。
  5. 【請求項５】エラブトキシンａをコードする配列が、19
    2個の塩基対と、２つの追加のSau3AI制限部位からなる
    請求項４に記載のDNA配列。
  6. 【請求項６】下記配列（Ｉ）： ホスファターゼの少なくとも422個のＣ末端アミノ酸残
    基をコードする断片を含む請求項５に記載のDNA配列。
  7. 【請求項７】成熟アルカリホスファターゼの分泌シグナ
    ル配列をコードするDNAが、該成熟アルカリホスファタ
    ーゼの６個のＮ末端アミノ酸をコードする配列に結合
    し、ポリペプチドP2をコードする該配列が、アンギオテ
    ンシンＩをコードする配列であり、それが該アルカリホ
    スファターゼの444個のＣ末端アミノ酸残基をコードす
    る配列に結合する請求項１又は２項に記載のDNA配列。
  8. 【請求項８】下記配列（II）： を含む請求項７に記載のDNA配列。
  9. 【請求項９】成熟アルカリホスファターゼの分泌シグナ
    ル配列をコードするDNAが、該成熟アルカリホスファタ
    ーゼの６個のＮ末端アミノ酸をコードする配列に結合
    し、ポリペプチドP2をコードする該配列が、エラブトキ
    シンａをコードする配列であり、それが該アルカリホス
    ファターゼの444個のＣ末端アミノ酸残基をコードする
    配列に結合する請求項１〜４に記載のDNA配列。
  10. 【請求項１０】下記配列（III）： を含む請求項９に記載のDNA配列。
  11. 【請求項１１】タンパク質P2に結合し、大腸菌の成熟ア
    ルカリホスファターゼのＣ末端の422〜444個のアミノ酸
    に対応するアミノ酸に結合する前記アルカリホスファタ
    ーゼの６〜28個のＮ末端アミノ酸からなる担体タンパク
    質に挿入された外来タンパク質P2断片を含むハイブリッ
    ド配列からなり、アルカリホスファターゼの性質とタン
    パク質P2の幾つかの性質、特に抗体、抗原又は受容体と
    特異的に相互作用を行う性質を同時に有するハイブリッ
    ドタンパク質。
  12. 【請求項１２】タンパク質P2が、ペプチドホルモン、毒
    素及び免疫グロブリンの可変ドメインに類似の単一連鎖
    断片からなる群から選択される請求項11に記載のハイブ
    リッドタンパク質。
  13. 【請求項１３】アルカリホスファターゼに挿入された神
    経毒を含有する請求項12に記載のハイブリッドタンパク
    質。
  14. 【請求項１４】神経毒がエラブトキシンａ（ea）であ
    り、請求項６又は請求項10に記載の配列（Ｉ）又は（II
    I）に由来する配列を有する請求項11〜13に記載のハイ
    ブリッドタンパク質。
  15. 【請求項１５】アルカリホスファターゼに挿入されたア
    ンギオテンシンＩを含有し、請求項８に記載の配列（I
    I）に由来する配列を有する請求項11及び12に記載のハ
    イブリッドタンパク質。
  16. 【請求項１６】各ベクターが、 −適切なプロモーター、 −リボソーム結合部位、 −請求項１〜10に記載のDNA配列、及び −転写ターミネーター からなる発現システムを含み、 その発現システムが、プラスミド、ファージ、コスミド
    もしくは適切な染色体からなる群に特に選択される適切
    な遺伝子構造に挿入されている、 請求項11〜15のいずれか１つに記載のハイブリッドタン
    パク質の発現及び／又はクローン化のための一群のベク
    ター。
  17. 【請求項１７】遺伝子構造がプラスミドである請求項16
    に記載のベクター。
  18. 【請求項１８】P2がエラブトキシンａであるとき、下記
    の性質： −6.1kbを有し、 −アルカリホスファターゼに対する構造遺伝子を有する
    プラスミドpJC2431とアンピシリン耐性の遺伝子（ApR）
    を連結することによって得られ、BclI部位で直線化さ
    れ、アルカリホスファターゼに対する前記構造遺伝子の
    コドン28の位置にエラブトキシンａをコードする192塩
    基対のSau3AI−Sau3AI断片を有する、 pEP1726と呼ばれるプラスミドが得られる請求項16又は1
    7に記載のベクター。
  19. 【請求項１９】各ベクターが、 −適切なプロモーター、 −リボソーム結合部位、 −大腸菌の成熟アルカリホスファターゼの分泌シグナル
    配列をコードするDNA、該アルカリホスファターゼのＮ
    末端の６〜28個のアミノ酸をコードするDNA、該アルカ
    リホスファターゼのＣ末端の422〜444個のアミノ酸に対
    応するアミノ酸をコードするDNAを含み、かつアルカリ
    ホスファターゼの６〜28個のＮ末端アミノ酸をコードす
    る配列の断片とアルカリホスファターゼの422〜444個の
    Ｃ末端アミノ酸残基をコードする配列との連結部分に位
    置し、タンパク質P2をコードする配列を受けることがで
    きる１以上のユニーク制限部位を有する核酸配列、なら
    びに −転写ターミネーター からなる発現システムを含み、 その発現システムが、プラスミド、ファージ、コスミド
    もしくは適切な染色体からなる群から特に選択される適
    切な遺伝子構造に挿入されている、 請求項11〜15のいずれか１つに記載のハイブリッドタン
    パク質の発現及び／又はクローン化のための一群のベク
    ター。
  20. 【請求項２０】導入されるユニーク制限部位の少なくと
    も１つが、酵素に対する遺伝子をフェーズからシフトさ
    せ、この遺伝子のフェーズへのシフトバックが、タンパ
    ク質P2に対する配列の導入によって行われる請求項19に
    記載のベクター。
  21. 【請求項２１】下記の性質： −約5.9kbを有し、かつ −プラスミドpJC2431がもっているphoA遺伝子の突然変
    異を誘発させて、成熟タンパク質の＋６位置に対応する
    ユニークSma I制限部位を導入することによって得られ
    る、 pLIP1と呼ばれるプラスミドが得られる請求項19又は20
    に記載のベクター。
  22. 【請求項２２】イー・コリの適切な菌株を、請求項16〜
    21項のいずれか１つに記載のベクターで適切に修飾する
    ことによって得られる、遺伝子形質転換で得られる微生
    物。
  23. 【請求項２３】請求項18に記載のベクターpEP1726で形
    質転換されたイー・コリCC118菌株である請求項22に記
    載の微生物。
  24. 【請求項２４】パスツール研究所に所属するthe Collec
    tion Nationale des Cultures de Microorganismesに、
    寄託番号Ｉ−862で1989年６月２日に寄託されたSEP 172
    6と呼ばれる請求項23に記載の微生物。
  25. 【請求項２５】請求項21に記載のプラスミドpLIP1で形
    質転換されたイー・コリCC118菌株である請求項22に記
    載の微生物。
  26. 【請求項２６】パスツール研究所に所属するthe Collec
    tion Nationale des Cultures de Microorganismesに、
    寄託番号Ｉ−954で1990年６月７日に寄託された請求項2
    5に記載の微生物。
  27. 【請求項２７】請求項22〜26のいずれか１つに記載の微
    生物で、請求項16〜21のいずれか１つに記載の発現ベク
    ターを利用する、請求項11〜15のいずれか１つに記載の
    ハイブリッドタンパク質の発現方法。
  28. 【請求項２８】請求項11〜15のいずれか１つに記載のハ
    イブリッドタンパク質からなる診断試薬。
  29. 【請求項２９】請求項28に記載の診断試薬と接触させる
    ことによって生物流体中に存在するタンパク質を検出す
    ることからなり、複合体もしくは遊離形の前記試薬の存
    在が適切な比色反応で目視可能であるタンパク質の免疫
    酵素学的検定法。
  30. 【請求項３０】タンパク質が抗原である請求項29に記載
    の検定法。
  31. 【請求項３１】タンパク質が抗体である請求項29に記載
    の検定法。
  32. 【請求項３２】検定を実施するのに有用な緩衝液と試薬
    の適切な量の外に、請求項28に記載の試薬の適切な量か
    らなる、請求項29〜31のいずれか１つに記載の免疫酵素
    学的検定法を実施するためのすぐに使用できるキット。
  33. 【請求項３３】請求項１〜10のいずれか１つに記載のハ
    イブリッド核酸配列を含有する、試験中のプラスミド、
    ファージ、コスミドもしくは組み換え染色体を適切に組
    み込んだ細菌もしくは真核細胞のクローンから放出もし
    くは分泌される酵素の存在の有無を、比色反応もしくは
    適切な培地での選択によって目視可能である、cDNAもし
    くはゲノム核酸のライブラリーのスクリーニング又は組
    み換え体クローンの選択方法。
  34. 【請求項３４】酵素がアルカリホスファターゼである場
    合に、放出もしくは分泌される酵素の存在が、該酵素の
    適切な基質を用いて目視可能である請求項33に記載の方
    法。
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