JP6316856B2 - 高収量の組換えタンパク質発現を得るためのmgmtに基づく方法 - Google Patents
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Description
昆虫細胞で用いられる最も汎用されている発現系は、バキュロウイルスベクターに基づくものである。バキュロウイルス発現ベクターは、バキュロウイルスの主構造タンパク質をコードするバキュロウイルスのポリヘドリン遺伝子を、強力な天然ポリヘドリンプロモーターの制御下、異種遺伝子に置き換えることにより構築される。培養昆虫宿主細胞に組換えウイルスを感染させ、それにより生産されたタンパク質は、細胞自体から、または好適な分泌シグナルを用いる場合には培養培地から回収することができる。
(A)Argで置換されたLys31、もしくはSerで置換されたMet32、もしくはAlaで置換されたCys93、もしくはAlaで置換されたLys156、もしくはThrで置換されたAla158、もしくはAlaで置換されたArg159、もしくはLysで置換されたGly162、もしくはThrで置換されたGly163、もしくはLeuで置換されたMet165、もしくはSerで置換されたArg166、もしくはSerで置換されたCys181、もしくはGlyで置換されたAsn188、もしくはGluで置換されたSer190、もしくはProで置換されたGly214、もしくはAlaで置換されたSer215、もしくはGlyで置換されたSer216、もしくはIleで置換されたGly217、もしくはGlyで置換されたLeu218、もしくはProで置換されたGly220、もしくはGlyで置換されたAla221、もしくはSerで置換されたTrp222、または
(B)Arg−Serで置換されたLys31−Met32、もしくはThr−Alaで置換されたAla158−Arg159、もしくはLys−Thrで置換されたGly162−Gly163、もしくはLeu−Serで置換されたMet165−Arg166、もしくはLys−Thr/Leu−Serで置換されたGly162−Gly163/Met165−Arg166、もしくはGly/Gluで置換されたAsn188/Ser190、もしくはPro−Ala−Gly−Ile−Glyで置換されたGly214−Ser215−Ser216−Gly217−Leu218、もしくはPro−Gly−Serで置換されたGly220−Ala221−Trp222、好ましくは(A)に挙げられた他の任意のアミノ酸置換との組合せ、または
(C)Leu223の後での末端切断(アミノ酸224〜238が欠失)、好ましくは、(A)または(B)に挙げられた他の任意のアミノ酸置換との組合せ
を含む。
従って、MGMT酵素は目的の異種タンパク質/ポリペプチドと直接的または間接的に連結され、好ましくは、目的の異種タンパク質/ポリペプチドのN末端に位置する。
同様に、目的の異種タンパク質/ポリペプチドの活性ドメインがそのN末端部分に位置する場合には、前記MGMT酵素をコードするDNA配列は、前記目的の異種タンパク質/ポリペプチドをコードするDNA配列の3’に位置することが特に好ましいと言える。
a)前記宿主細胞において機能的であるペプチド分泌シグナル、
b)6−メチルグアニン−DNA−メチルトランスフェラーゼ酵素(MGMT、EC2.1.1.63)、その突然変異体または触媒ドメイン、および
c)組換えタンパク質
をコードするヌクレオチド配列を含んでなるベクターに関する。
・細菌またはウイルス免疫原性タンパク質、より好ましくは、(感染性、病原性)ウイルスタンパク質、例えば、デング熱ウイルス、日本脳炎ウイルス、ダニ媒介脳炎ウイルス、黄熱ウイルス、ウスツウイルス、ロシオウイルス、マレー脳炎ウイルス、ベッセルブロンウイルス、ジカウイルスもしくは西ナイルウイルス由来のEDIIIタンパク質、またはリフトバレー熱ウイルスもしくはトスカナウイルス由来の核タンパク質N、またはチクングニアウイルス由来のE2エンベロープタンパク質の可溶型、または西ナイルウイルスのEエンベロープタンパク質の可溶型、
・血液因子、抗凝固因子、増殖因子、ホルモン、ワクチン、治療用酵素、モノクローナル抗体およびサイトカイン(IFNα、グランザイムMおよびFasLなど)、
・抗原、例えば、癌抗原(癌精巣抗原SSX2など)、またはERC/メソテリンのN末端領域(NERCMSL)、
・抗腫瘍タンパク質、例えば、FasL、またはヘパラン硫酸6−O−エンドスルファターゼ(hSULF)、
・微生物、ウイルスおよび/または寄生虫ポリペプチド、
・他の任意の有用タンパク質(例えば、コンタクチン)
からなる群から選択される。
本発明の好ましい態様では、ベクターは、配列番号14を有するヘキサヒスチジンタグをコードするDNAを含んでなる。
・ペプチドBiP昆虫シグナル(好ましくは、S2ショウジョウバエ細胞において機能的である)または上記で定義されたBiP様シグナル、
・配列番号4のMGMTタンパク質または配列番号2のSNAPタンパク質、
・目的組換えタンパク質、
・エンテロキナーゼペプチド切断部位または上記で定義されたproTEV切断部位、
・ポリヒスチジン標識、および
・アミノ酸配列グリシン−グリシン−グリシン−セリン(GGGS、配列番号63)を有する2つのスペーサー配列
をコードし得る。
・配列番号48のペプチドBiP昆虫シグナル、
・配列番号4のMGMTタンパク質または配列番号2のSNAPタンパク質、
・目的組換えタンパク質、
・配列番号62のエンテロキナーゼペプチド切断部位、
・ポリヒスチジン標識、および
・アミノ酸配列グリシン−グリシン−グリシン−セリン(GGGS)を有する2つのスペーサー配列
をコードする。
・配列番号51のBiP様ペプチドシグナル、
・配列番号4のMGMTタンパク質または配列番号2のSNAPタンパク質、
・目的組換えタンパク質、
・配列番号53のproTEVペプチド切断部位、
・ポリヒスチジン標識、および
・アミノ酸配列グリシン−グリシン−グリシン−セリン(GGGS)を有する2つのスペーサー配列
をコードする。
a)ペプチド分泌シグナル、
b)配列番号4のMGMTタンパク質または配列番号2のSNAPタンパク質、
c)少なくとも1つのペプチド切断部位、
d)ポリヒスチジン標識、および
e)少なくとも1つのスペーサー配列
をコードするヌクレオチド配列を含んでなるベクターを開示する。
a)ペプチド分泌シグナル、
b)配列番号4のMGMTタンパク質または配列番号2のSNAPタンパク質、
c)少なくとも1つのペプチド切断部位、
d)ポリヒスチジン標識、および
e)少なくとも1つのスペーサー配列
(各成分は上記で定義された通り)
をコードするヌクレオチド配列を含んでなる発現ベクターにより安定にトランスフェクトされた組換え細胞を対象とする。
Univを含んでなるもの(配列番号64など)または配列番号69のDeMGMT Univを含んでなるもの(配列番号71など)を増幅および精製するために使用される。
細胞密度は一般に106〜107細胞/mLの間に維持する。
・プラスミド配列番号64(DeSNAP Univを含むpUC57)、または2011年12月9日に、ブタペスト条約に従い、the Centre National de Culture et de Microorganismes(CNCM),パスツール研究所(フランス 75724 パリ セデックス 15 リュ デュ ドクトール ル 25)に番号CNCM I−4581として寄託された細胞にクローニングされたヌクレオチド配列、
・配列番号19、または2010年8月19日に、ブタペスト条約に従い、the Centre National de Culture et de Microorganismes(CNCM),パスツール研究所(フランス 75724 パリ セデックス 15 リュ デュ ドクトール ル 25)に番号CNCM I−4357として寄託された細胞にクローニングされたヌクレオチド配列を含んでなるベクター、
・配列番号22、または2010年10月27日に、the Centre National de Culture et de Microorganismes(CNCM),パスツール研究所に番号CNCM I−4381として寄託された細胞にクローニングされたヌクレオチド配列を含んでなる本発明のベクター、
・配列番号21、または2010年10月27日に、the Centre National de Culture et de Microorganismes(CNCM),パスツール研究所に番号CNCM I−4382として寄託された細胞にクローニングされたヌクレオチド配列を含んでなる本発明のベクター、
・配列番号9、または2010年9月29日に、the Centre National de Culture et de Microorganismes(CNCM),パスツール研究所に番号CNCM I−4368として寄託された細胞にクローニングされたヌクレオチド配列のベクター、
・配列番号20、または2010年9月29日に、the Centre National de Culture et de Microorganismes(CNCM),パスツール研究所に番号CNCM I−4369として寄託された細胞にクローニングされたヌクレオチド配列を含んでなる本発明のベクター、
・配列番号71のベクター、
・配列番号57もしくは72もしくは74(目的タンパク質がIFNαである場合)、配列番号77、79もしくは81(目的タンパク質が癌抗原SSX2である場合)、配列番号55(目的タンパク質がグランザイムMである場合)、配列番号89(目的タンパク質がFasLである場合)、配列番号84もしくは86(目的タンパク質が癌抗原NERCMSLである場合)、配列番号92(目的タンパク質がコンタクチンCNTN4である場合)、または配列番号96(目的タンパク質がhSULF−2ΔTMDである場合)を含んでなる本発明のベクター
からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含んでなる。
・2010年8月19日に、the Centre National de Culture et de Microorganismes(CNCM),パスツール研究所(フランス 75724 パリ セデックス 15 リュ デュ ドクトール ル 25)に番号CNCM I−4357として寄託された細胞、
・2010年10月27日に、the Centre National de Culture et de Microorganismes(CNCM),パスツール研究所(フランス 75724 パリ セデックス 15 リュ デュ ドクトール ル 25)に番号CNCM I−4381として寄託された細胞、
・2010年10月27日に、the Centre National de Culture et de Microorganismes(CNCM),パスツール研究所(フランス 75724 パリ セデックス 15 リュ デュ ドクトール ル 25)に番号CNCM I−4382として寄託された細胞、
・2010年9月29日に、the Centre National de Culture et de Microorganismes(CNCM),パスツール研究所(フランス 75724 パリ セデックス 15 リュ デュ ドクトール ル 25)に番号CNCM I−4368として寄託された細胞、
・2010年9月29日に、the Centre National de Culture et de Microorganismes(CNCM),パスツール研究所(フランス 75724 パリ セデックス 15 リュ デュ ドクトール ル 25)に番号CNCM I−4369として寄託された細胞、
・2011年12月5日に、the Centre National de Culture et de Microorganismes(CNCM),パスツール研究所(フランス 75724 パリ セデックス 15 リュ デュ ドクトール ル 25)に番号CNCM I−4565として寄託された細胞、
・2011年12月5日に、the Centre National de Culture et de Microorganismes(CNCM),パスツール研究所(フランス 75724 パリ セデックス 15 リュ デュ ドクトール ル 25)に番号CNCM I−4566として寄託された細胞、
・2011年12月5日に、the Centre National de Culture et de Microorganismes(CNCM),パスツール研究所(フランス 75724 パリ セデックス 15 リュ デュ ドクトール ル 25)に番号CNCM I−4567として寄託された細胞、
・2011年12月5日に、the Centre National de Culture et de Microorganismes(CNCM),パスツール研究所(フランス 75724 パリ セデックス 15 リュ デュ ドクトール ル 25)に番号CNCM I−4568として寄託された細胞、
・2011年12月5日に、the Centre National de Culture et de Microorganismes(CNCM),パスツール研究所(フランス 75724 パリ セデックス 15 リュ デュ ドクトール ル 25)に番号CNCM I−4569として寄託された細胞、
・2011年12月5日に、the Centre National de Culture et de Microorganismes(CNCM),パスツール研究所(フランス 75724 パリ セデックス 15 リュ デュ ドクトール ル 25)に番号CNCM I−4570として寄託された細胞、
・2011年12月5日に、the Centre National de Culture et de Microorganismes(CNCM),パスツール研究所(フランス 75724 パリ セデックス 15 リュ デュ ドクトール ル 25)に番号CNCM I−4571として寄託された細胞、
・2011年12月5日に、the Centre National de Culture et de Microorganismes(CNCM),パスツール研究所(フランス 75724 パリ セデックス 15 リュ デュ ドクトール ル 25)に番号CNCM I−4572として寄託された細胞、
・2011年12月8日に、the Centre National de Culture et de Microorganismes(CNCM),パスツール研究所(フランス 75724 パリ セデックス 15 リュ デュ ドクトール ル 25)に番号CNCM I−4576として寄託された細胞、
・2011年12月8日に、the Centre National de Culture et de Microorganismes(CNCM),パスツール研究所(フランス 75724 パリ セデックス 15 リュ デュ ドクトール ル 25)に番号CNCM I−4577として寄託された細胞、
・2011年12月8日に、the Centre National de Culture et de Microorganismes(CNCM),パスツール研究所(フランス 75724 パリ セデックス 15 リュ デュ ドクトール ル 25)にthe Centre National de Culture et de Microorganismes(CNCM),パスツール研究所(フランス 75724 パリ セデックス 15 リュ デュ ドクトール ル 25)に番号CNCM I−4578として寄託された細胞、
・2011年12月8日に、the Centre National de Culture et de Microorganismes(CNCM),パスツール研究所(フランス 75724 パリ セデックス 15 リュ デュ ドクトール ル 25)に番号CNCM I−4579として寄託された細胞、
・2011年12月8日に、the Centre National de Culture et de Microorganismes(CNCM),パスツール研究所(フランス 75724 パリ セデックス 15 リュ デュ ドクトール ル 25)に番号CNCM I−4580として寄託された細胞、
・2011年12月9日に、the Centre National de Culture et de Microorganismes(CNCM),パスツール研究所(フランス 75724 パリ セデックス 15 リュ デュ ドクトール ル 25)に番号CNCM I−4582として寄託された細胞、
・2011年12月9日に、the Centre National de Culture et de Microorganismes(CNCM),パスツール研究所(フランス 75724 パリ セデックス 15 リュ デュ ドクトール ル 25)に番号CNCM I−4583として寄託された細胞、
・2011年12月9日に、the Centre National de Culture et de Microorganismes(CNCM),パスツール研究所(フランス 75724 パリ セデックス 15 リュ デュ ドクトール ル 25)に番号CNCM I−4584として寄託された細胞、
・2011年12月9日に、the Centre National de Culture et de Microorganismes(CNCM),パスツール研究所(フランス 75724 パリ セデックス 15 リュ デュ ドクトール ル 25)に番号CNCM I−4585として寄託された細胞、および
・2011年12月9日に、the Centre National de Culture et de Microorganismes(CNCM),パスツール研究所(フランス 75724 パリ セデックス 15 リュ デュ ドクトール ル 25)に番号CNCM I−4586として寄託された細胞
からなる群から選択することもできる。
a)前記目的タンパク質をコードする本発明のヌクレオチド発現ベクターを提供する工程、
b)前記発現ベクターを宿主細胞、好ましくは無脊椎動物または脊椎動物宿主細胞に導入する工程、
c)前記宿主細胞内で導入されたヌクレオチドの発現を可能として前記目的組換えタンパク質を生産する工程
を含んでなる。
(a)目的組換えタンパク質をコードする異種DNA配列を取得する工程;
(b)前記異種DNA配列を本発明のヌクレオチド発現ベクターに挿入する工程(該ベクターは例えば配列番号9、配列番号10、配列番号64または配列番号71のDNA配列を有する);
(c)宿主細胞(好ましくは、昆虫細胞または哺乳動物細胞)を工程(b)で得られたポリヌクレオチドでトランスフェクトする工程;
(d)工程(c)で得られた前記ポリヌクレオチドの発現を可能として目的タンパク質を生産する工程;
(e)場合により、MGMTポリペプチドを切断する工程、
(f)目的タンパク質を回収する工程、
(g)場合により、目的タンパク質を精製する工程
を含んでなる。
U.S.A., 88:2726-2730, 1991参照)。
(a)本発明のウイルスベクターを好適な細胞株に導入する工程、
(b)前記細胞株を、前記感染性ウイルス粒子の生産を可能とするために好適な条件下で培養する工程、
(c)生産された感染性ウイルス粒子を前記細胞株の培養物から回収する工程、および
(d)場合により、前記の回収された感染性ウイルス粒子を精製する工程
を含んでなる方法によって生産される。
1.1.プラスミドpMT/BiP/V5−His Aを使用した。このプラスミドは3642ヌクレオチドを含み、下記の特徴を含む:
・メタロチオネインプロモーター:塩基412〜778、
・転写開始:塩基778、
・MTフォワードプライミング部位:塩基814〜831、
・BiPシグナル配列:塩基851〜904(配列番号11)、
・多重クローニング部位:塩基906〜999、
・V5エピトープタグ:塩基1003〜1044、
・ポリヒスチジン領域:塩基1054〜1074、
・BGHリバースプライミング部位:塩基1094〜1111、
・SV40後期ポリアデニル化シグナル:塩基1267〜1272、
・pUC起点:塩基1765〜2438(相補鎖)、
・blaプロモーター:塩基3444〜3542(相補鎖)、
・アンピシリン(bla)耐性遺伝子ORF:塩基2583〜3443(相補鎖)。
・独特なクローニング部位EcoRI、
・メタロチオネインプロモーター、
・西ナイルウイルスIS−98−ST1株由来ゲノムRNAの5’非コード領域、
・翻訳開始コドン(ATG)、
・西ナイルウイルスIS−98−ST1株由来エンベロープEタンパク質のシグナルペプチド(配列番号15)、
・2つのリピート配列と3’末端ステム−ループが削除された、西ナイルウイルスIS−98−ST1株由来ゲノムRNAの3’非コード領域、
・S40ポリAシグナルモチーフ、
・独特なクローニング部位ApaI。
配列番号2のSNAPタンパク質配列をコードするDNAの増幅を、5’−SNAPプライマーと3’−MCSプライマーの組合せを用い、PCRにより、pMT/BiP/CHIK.sE2+SNAPタグを鋳型として行った。
プライマー5’−SNAP:
プライマー3’−MCS:
・配列番号11の昆虫ssBiP配列、
・配列番号1のSNAP DNA配列、
・配列番号12のエンテロキナーゼ切断部位、
・EcoRV−SmaI制限部位、
・制限部位の下流に位置する、His6タグをコードするDNA(配列番号14)、・i)エンハンサー配列とEcoRV−SmaI制限部位の間、およびii)EcoRV−SmaI制限部位とHis6タグをコードするDNAの間に位置する、配列番号13の2つのDNAスペーサー配列。
・独特なクローニング部位EcoRI、
・メタロチオニン(Methallothionin)プロモーター、
・西ナイルウイルスIS−98−ST1株由来ゲノムRNAの5’非コード領域、
・翻訳開始コドン、
・配列番号15の、西ナイルウイルスIS−98−ST1株由来エンベロープEタンパク質のシグナルペプチド、
・配列番号47のSNAP DNA配列、
・外来配列をインフレームで挿入するためのSmaI/XmaIにおける独特なクローニング部位EcoRV、
・SNAPエンハンサーDNAとクローニング部位の間に位置する、配列番号12のエンテロキナーゼ切断部位、
・ヘキサヒスチジンタグ配列をコードするDNA(配列番号14)、
・エンハンサー配列とEcoRV−SmaI制限部位の間、およびii)EcoRV−SmaI制限部位とHis6タグをコードするDNAの間に位置する、配列番号13の2つのDNAスペーサー配列、
・2つの翻訳停止コドン、
・2つのリピート配列と3’末端ステム−ループが削除された、西ナイルウイルスIS−98−ST1株由来ゲノムRNAの3’非コード領域、
・S40ポリAシグナルモチーフ、および
・独特なクローニング部位ApaI。
・独特なクローニング部位EcoRI、
・メタロチオニン(Methallothionin)プロモーター、
・西ナイルウイルスIS−98−ST1株由来ゲノムRNAの5’非コード領域、
・翻訳開始コドン、
・配列番号15の、西ナイルウイルスIS−98−ST1株由来エンベロープEタンパク質のシグナルペプチド、
・配列番号47のSNAP DNA配列、
・外来配列をインフレームで挿入するための独特なクローニング部位BamHI、EcoRV、ApaIおよびXmaI、
・SNAPエンハンサーDNAとHisタグの間に位置する、配列番号52の2つのproTEV切断部位、
・ヘキサヒスチジンタグ配列をコードするDNA(配列番号14)、
・i)エンハンサー配列とEcoRV−SmaI制限部位の間、およびii)ApaI制限部位とHis6タグをコードするDNAの間に位置する、配列番号13の2つのDNAスペーサー配列、
・2つの翻訳停止コドン、
・2つのリピート配列と3’末端ステム−ループが削除された、西ナイルウイルスIS−98−ST1株由来ゲノムRNAの3’非コード領域、
・S40ポリAシグナルモチーフ、および
・独特なクローニング部位ApaI。
1.3.1.リフトバレー熱ウイルスの核タンパク質N(RVF−N)
RFV−Nタンパク質配列をコードするcDNAに対する突然変異誘発を、下記に挙げた5’−Nプライマーと3’−N’プライマーの組合せを用いてPCRにより行った。
プライマー5’−N:
プライマー3’−N:
配列番号32のヒトIFNα1タンパク質配列も使用可能である。
1.4.1.RVF.N
1.3.1.項で得られたPCR産物をBssHIIおよびAgeIで消化し、1.2.項で得られた線状化プラスミドp/MT/BiP/SNAP−Hisタグの、独特なBssHII(SNAP遺伝子の3’末端)部位とAgeI(シャトルベクターのMCSの3’末端)の間に挿入した。
組換えフラビウイルス抗原に基づくELISAまたは免疫ブロット試験の特異性を高めるために、Eタンパク質の抗原ドメインIII(EDIII)は有望なアプローチであると思われる(Ludolfs et al. 2007)。西ナイル(WN)ウイルス、ウスツ(USU)ウイルス、日本脳炎(JE)ウイルス、ダニ媒介脳炎(TBE)ウイルス、デング熱血清型1〜4(DEN−1、−2、−3、−4)ウイルスおよび黄熱(YF)ウイルスからの組換えEDIIIの製造に関して、本発明の方法を用いて試験した。
プラスミドpMT/BiP/SNAP−IFN−Hisタグ(図4参照)およびpMT/BiP様/SNAP−IFN−Hisタグ(図8の詳細を参照)を得た。
プラスミドpMT/BiP/SNAP−GrM−Hisタグを得た(図6の詳細を参照)。
2.1.S2細胞へのトランスフェクション
得られたプラスミドpMT/BiP/SNAP−タンパク質−Histag(Histagで終わる分泌融合タンパク質としてのSNAPタグを有するタンパク質の生産を可能とする)は、選択マーカーpCo−BlastとともにS2細胞に同時トランスフェクトし、アンピシリン耐性を示す安定なS2/sSNAP−タンパク質−Histag細胞株を作出した。
このプラスミドpMT/BiP様/SNAP−IFN−HistagをHeLa細胞にトランスフェクトした。
細胞外の、HisタグおよびSNAPタグを有するタンパク質を、金属キレート樹脂およびHLPC法を用いて精製した。
RVF−N
Plate-Forme 5 Production de Proteines recombinantes et d'Anticorps (Institut Pasteur)との共同研究において、2リットルのS2/sSNAP−RVFV.N−Histag細胞上清から、Cd2+刺激の10日後に、精製度の高い、SNAPタグを有するRVF.Nタンパク質が97mgもの量で得られた。
Plate-Forme 5 Production de Proteines recombinantes et d'Anticorps (Institut Pasteur)との共同研究において、2リットルのS2/sSNAP−TOS.N−Histag細胞上清から、Cd2+刺激の10日後に、精製度の高い、SNAPタグを有するRVF.Nタンパク質が41mgもの量で得られた。
可溶性IFNα1タンパク質は、エンテロキナーゼ酵素(Novagenキット)を用いて切断することにより、SNAPタグから遊離させた。
3.3.種々のフラビウイルス由来の抗原
・RVF由来N遺伝子:リフトバレー熱ウイルスの核タンパク質N(主要ウイルス抗原)・TOS由来N遺伝子:トスカナウイルスの核タンパク質N(主要ウイルス抗原)
・WN由来sE:西ナイルウイルス由来エンベロープEタンパク質の可溶型
・CHIK由来sE2:チクングニアウイルス由来エンベロープE2タンパク質の可溶型・SNAP−IFNΑI:SNAPと融合したインターフェロン−α1
7日で、1リットルの培養上清当たり10mgのSNAP−GrMタンパク質が回収された。
特異的抗体(目的タンパク質および/またはHisタグ標識を認識する)を用いた免疫ブロットアッセイは、細胞外の、SNAPタグを有するタンパク質の実質的生産を検出した:
免疫ブロットアッセイは、ヤギ血清抗Histagを用いて、細胞外の、SNAPタグを有するRVF.Nタンパク質を検出した(図2B)。RVF.Nに対するヒトおよびマウス免疫血清は、組換え型の、SNAPタグを有するRVF.Nタンパク質を特異的に認識する。
・誘導を受けたS2/SNAP−IFNα1細胞から分泌された可溶性組換えSNAP−IFNα1はCHIKVに対して強い抗ウイルス効果を示す
誘導10日後に、Cd2+刺激S2/SNAP−IFNα1(5×106細胞/ml)の上清(5ml)を回収した。細胞上清に対して、抗Hisタグ抗体を用いた免疫ブロットにより、可溶性SNAP−IFNα1タンパク質の蓄積が見られた(下記参照)。SNAP−IFNα1の抗ウイルス活性を、ルシフェラーゼ(Luc)遺伝子を発現するチクングニアウイルスに感染させたHeLa細胞で評価した。感染6時間後にLuc活性を測定した。HeLa細胞における、CHIKVに対するその強力な抗ウイルス作用が知られるIFNαcon1(インファゲン)を内部アッセイとして使用した。Cd2+刺激S2/SNAP−Tos.N(トスカナウイルス由来Nタンパク質)の上清を陰性対照として用いた。図4Cに示されたグラフは、1μlの分泌SNAP−IFNα1または0.1μgのインファゲンが感染宿主細胞内でのCHIKV複製を抑制できたことを示す。このグラフには、SNAP−IFNαの用量依存効果が示される。0.1μlの可溶性SNAP−IFNα1または0.01μgのインファゲンでなお20%のLuc活性が見られた。
SNAP−TOS−Nを用いた場合には、試験したより高い用量でも抗ウイルス作用は見られなかった。
これまでに述べたように、ベクターpMT/BiP/SNAP−GrM−HisタグでトランスフェクトされたS2細胞の上清では、3つの形態のSNAP−GrMが検出された(図6C参照)。
組換えプラスミドpcDNA3/De SNAPuniv−hSULF−2ΔTMDでトランスフェクトされたHEK−293細胞からhSULF−2ΔTMDが発現および精製された(図13A参照)。
驚くことに、SNAPペプチドを含んでなる融合タンパク質はその不在の場合よりもin vitroにおいてはるかに安定であることが見出された。
上述のプロトコールに従って産生されたSNAP−RVF.N融合タンパク質を、感染ヒツジの血清中の抗RVF.N抗体を検出するための診断ツールとして用いた。
本発明において、体液中のアルボウイルスに対する抗体の迅速かつ同時検出のためにマルチプレックスビーズに基づくイムノアッセイが開発された。この系はxMAP技術(Luminex corporation)に基づくものであり、特異的ヒト免疫グロブリンの捕捉試薬として抗原をコーティングしたマイクロスフェアの混合物を使用する。異なるマイクロスフェアセット(Magplex、Luminex corporation)を精製MGMT融合タンパク質、すなわち、第3.3節に記載のSNAPタグを有するウイルス組換えタンパク質:sSNAP−DV1.EDIII、sSNAP−DV2.EDIII、sSNAP−DV3.EDIII、sSNAP−DV4.EDIII、sSNAP−WN.EDIII、sSNAP−JE.EDIII、sSNAP−USU.EDIII、sSNAP−TBE.EDIII、sSNAP−YF.EDIII、sSNAP−MVE.EDIII、sSNAP−ロシオ.EDIII、sSNAP−WSL.EDIII、sSNAP−ジカ.EDIII、SNAP−DV1ectoM、sSNAP−N.RVF、sSNAP−N.TOS、およびCHIK.sE2−SNAPと連結した。組換え抗原は、MGMTタンパク質の基質をリンカーとして用いてカルボキシルマイクロスフェア表面に共有結合させ(BG−PEG−NH2、New England Biolabs)、それにより、標準的アミンカップリング手順に比べて抗体捕捉効率を高めた。
ビーズコーティングその後の抗体捕捉には任意のペプチドまたはポリペプチドが使用可能であるので、この適用はウイルス抗原に限定されない。
Claims (5)
- −昆虫細胞において機能的であるペプチド分泌シグナル、および
−6−メチルグアニン−DNA−メチルトランスフェラーゼ酵素(MGMT、EC2.1.1.63)、その機能的MGMT突然変異体または触媒ドメイン、および
−前記MGMT酵素、その機能的MGMT突然変異体または触媒ドメインのC末端に、組換えタンパク質
を含んでなり、
前記機能的MGMT突然変異体の配列が配列番号4と少なくとも90%同一であるか、または配列番号2のSNAP突然変異体と少なくとも90%同一である、
融合ポリペプチド。 - 前記MGMT突然変異体が配列番号2のSNAPタンパク質である、請求項1に記載の融合ポリペプチド。
- 前記MGMT酵素が配列番号4のタンパク質である、請求項1に記載の融合ポリペプチド。
- 前記組換えタンパク質のC末端に位置する標識をさらに含んでなる、請求項3に記載の融合ポリペプチド。
- 前記標識がポリヒスチジン標識である、請求項4に記載の融合ポリペプチド。
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Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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GB2125047B (en) | 1982-08-09 | 1986-02-19 | Ciba Geigy Ag | Yeast hybrid vectors and their use for the production of polypeptides |
EP0118551A1 (en) | 1982-09-15 | 1984-09-19 | Collaborative Research Inc. | Production of interferon in yeast by use of invertase promoter |
US4758512A (en) | 1984-03-06 | 1988-07-19 | President And Fellows Of Harvard College | Hosts and methods for producing recombinant products in high yields |
WO1987002670A1 (en) | 1985-10-25 | 1987-05-07 | Mackay Vivian L | Method of using bar1 for secreting foreign proteins |
US5681713A (en) | 1987-05-08 | 1997-10-28 | Smithkline Beecham Corporation | Expression of heterologous proteins in Drosophila cells |
US5550043A (en) | 1987-05-08 | 1996-08-27 | Smithkline Beecham Corporation | Expression of heterologous proteins in Drosophila cells |
US5879926A (en) | 1989-03-31 | 1999-03-09 | Transgene S.A. | Yeast strains for the production of mature heterologous proteins, especially hirudin |
US5264618A (en) | 1990-04-19 | 1993-11-23 | Vical, Inc. | Cationic lipids for intracellular delivery of biologically active molecules |
DK82893D0 (da) | 1993-07-08 | 1993-07-08 | Novo Nordisk As | Peptid |
FR2714830B1 (fr) | 1994-01-10 | 1996-03-22 | Rhone Poulenc Rorer Sa | Composition contenant des acides nucléiques, préparation et utilisations. |
FR2715847B1 (fr) | 1994-02-08 | 1996-04-12 | Rhone Poulenc Rorer Sa | Composition contenant des acides nucléiques, préparation et utilisations. |
FR2727679B1 (fr) | 1994-12-05 | 1997-01-03 | Rhone Poulenc Rorer Sa | Nouveaux agents de transfection et leurs applications pharmaceutiques |
FR2730637B1 (fr) | 1995-02-17 | 1997-03-28 | Rhone Poulenc Rorer Sa | Composition pharmaceutique contenant des acides nucleiques, et ses utilisations |
US5837520A (en) | 1995-03-07 | 1998-11-17 | Canji, Inc. | Method of purification of viral vectors |
US5919682A (en) | 1995-08-24 | 1999-07-06 | Board Of Regents, University Of Texas System | Overproduction of neuronal nitric oxide synthase |
IL127692A0 (en) | 1996-07-01 | 1999-10-28 | Rhone Poulenc Rorer Sa | Method for producing recombinant adenovirus |
AU722624B2 (en) | 1996-09-06 | 2000-08-10 | Trustees Of The University Of Pennsylvania, The | An inducible method for production of recombinant adeno-associated viruses utilizing T7 polymerase |
WO1998017684A2 (en) * | 1996-10-25 | 1998-04-30 | Advanced Research & Technology Institute | Dna sequences encoding fusions of dna repair proteins and uses thereof |
AU732703B2 (en) | 1996-11-20 | 2001-04-26 | Crucell Holland B.V. | An improved method for the production and purification of adenoviral vectors |
WO1998026048A1 (en) | 1996-12-13 | 1998-06-18 | Schering Corporation | Methods for purifying viruses |
FR2777909B1 (fr) | 1998-04-24 | 2002-08-02 | Pasteur Institut | Utilisation de sequences d'adn de structure triplex pour le tranfert de sequences de nucleotides dans des cellules, vecteurs recombinants contenant ces sequences triplex |
JP3864610B2 (ja) | 1998-05-21 | 2007-01-10 | 旭硝子株式会社 | 水分散型撥水撥油剤組成物およびその製造方法 |
DE69940785D1 (de) | 1998-11-20 | 2009-06-04 | Fuso Pharmaceutical Ind | Proteinexpressionsvektor und benutzung desselbigen |
HUP0104794A3 (en) | 1998-12-31 | 2006-03-28 | Centelion | Method for separating viral particles |
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DK2169073T3 (da) | 1999-10-11 | 2014-02-10 | Pasteur Institut | Vektor til fremstilling af immunterapeutiske præparater |
EP1266018B1 (en) * | 2000-03-24 | 2008-05-07 | Genencor International, Inc. | Production of secreted proteins by recombinant eukaryotic cells |
US8022172B2 (en) * | 2001-08-28 | 2011-09-20 | Allergan, Inc. | Luminescence resonance energy transfer (LRET) assays for clostridial toxin activity |
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