CN114908119A - 一种提高重组蛋白表达量的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种提高重组蛋白表达量的方法，该方法包括如下步骤：将编码FABP5蛋白的基因转入用于表达重组蛋白的细胞中，使FABP5蛋白瞬时或稳定表达；所述重组蛋白不为所述FABP5蛋白。本发明提供的方法可以显著提高重组蛋白的产量。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学领域，具体涉及一种提高CHO细胞蛋白表达量的方法。
背景技术
重组蛋白工业生产的常用哺乳动物作为宿主细胞，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞是最常用的宿主细胞。尽管CHO细胞已成功地用作制造宿主细胞系统超过30年，但这些细胞系在生长速度和重组蛋白生产能力方面仍然受到一定限制。改善宿主细胞的性能，提高宿主细胞的重组蛋白表达量，一直都是重组蛋白生产领域关注的重点。
通过生物分子学方法改造细胞系是常用的提高宿主细胞重组蛋白表达量的方法，现阶段应用于CHO细胞的细胞系改造方法包括：敲除、过表达特定基因以及使用非编码RNA等。这些特定基因涉及蛋白合成、细胞代谢、分泌以及细胞周期等各个细胞通路。例如，现有技术有报道通过敲除CHO细胞中的ATF6β提高了单抗的产量，通过在CHO细胞中过表达ERp57使TPO的产量提高了2.1倍，通过在CHO细胞中过表达GADD34使human AT-III的titer提高了40％，以及通过在CHO细胞中过表达MDH2，使存活细胞数目提高了1.9倍等。
脂肪酸结合蛋白(FABP)参与结合和存储疏水性配体(例如长链脂肪酸)，以及将其转运至细胞中适当的区室。脂肪酸结合蛋白5(fatty acid binding protein 5，FABP5)是一种细胞内结合长链脂肪酸和其他疏水性配体的小分子，在脂肪细胞和巨噬细胞中大量表达。
现有技术中暂无将FABP5作为目标基因改造用于表达重组蛋白的细胞，改善其性能的报道。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，利用FABP5改造用于表达重组蛋白的细胞，改善其性能。
第一方面，本发明提供一种提高重组蛋白表达量的方法，所述方法包括如下步骤：将编码FABP5蛋白的基因转入用于表达重组蛋白的细胞中，进行瞬时或稳定表达；所述重组蛋白不为所述FABP5蛋白。
本发明提供的方法通过在宿主细胞中过表达FABP5蛋白，从而提升重组蛋白产量。
在一些实施方式中，所述方法包括如下步骤：将具有编码FABP5蛋白的基因的载体转入用于表达重组蛋白的细胞中。
在一些实施方式中，所述基因经过了密码子优化。
在一些实施方式中，所述载体中还插入了蛋白标签，如Flag标签、Halo标签、SNAP标签、His-tag标签等，优选为组氨酸(His-tag)标签。
在一些实施方式中，所述载体为真核细胞表达载体。作为本发明的优选方案，所述载体为pcDNA3.1载体，如pcDNA3.1 Hygro(+)载体。
在一些实施方式中，所述细胞为哺乳动物细胞，可以选自CHO细胞(中国仓鼠卵巢细胞)、HEK293细胞、Vero细胞等。
在一些实施方式中，所述细胞为CHO细胞，具体可以选用CHO-K1、CHO-S、CHO-DXB11、CHO-DG44等细胞系。
在一些实施方式中，所述用于表达重组蛋白的细胞是能够稳定表达重组蛋白的单克隆细胞。
在一些实施方式中，所述用于表达重组蛋白的细胞是外源转入了重组蛋白表达载体的细胞，所述重组蛋白表达载体可以先于编码FABP5蛋白的基因或载体转入细胞，也可以与编码FABP5蛋白的基因或载体共同转入。
作为本发明的一种具体实施方式，所述方法包括如下步骤：合成CHO细胞的编码FABP5蛋白的基因并连接编码组氨酸标签的基因，优选合成如SEQ ID NO:1所示的基因序列，然后构建到pcDNA3.1载体中，将所得载体转染到能够表达重组蛋白的单克隆CHO细胞中，或者将所得载体与所述重组蛋白的表达载体共同转染到CHO细胞中。
在一些实施方式中，所述重组蛋白选自单克隆抗体(例如：曲妥珠单抗)和融合蛋白。
在一些实施方式中，所述融合蛋白为Fc融合蛋白，即利用基因工程等技术将某种具有生物活性的功能蛋白分子与免疫球蛋白(IgG、IgA等)的Fc片段融合而产生的蛋白，如TNFR-Fc融合蛋白等。
本发明进行瞬时表达的方法具体为：采用本领域常用的转染方法(例如采用聚醚酰亚胺(PEI)试剂)，将外源的基因或插入了所述外源基因的载体转染到宿主细胞。为了提高转染的效率和细胞的存活率，可以在转染时采用特定的转染培养基。
本发明进行稳定表达的方法具体为：将外源的基因序列插入具有某种抗性的载体上，采用本领域常用的转染方法(例如采用聚醚酰亚胺(PEI)试剂)，将该载体转染到宿主细胞并整合到宿主染色体中，然后用所述载体中所含的抗性筛选标志物如新霉素(neomycin)、潮霉素(hygromycin)、嘌呤霉素(puromycin)等进行筛选，直至细胞活率恢复至90％以上，得到稳定表达外源基因的细胞。为了提高转染的效率和细胞的存活率，可以在转染时采用特定的转染培养基。
第二方面，本发明提供一种高表达重组蛋白的细胞，所述细胞能够瞬时或稳定过表达FABP5蛋白，所述重组蛋白不为所述FABP5蛋白。
本发明提供的细胞能够过表达FABP5蛋白，可以显著提高重组蛋白的表达量。
在一些实施方式中，所述细胞中外源转入了编码FABP5蛋白的基因。
在一些实施方式中，所述细胞中外源转入了具有编码FABP5蛋白的基因的载体。
在一些实施方式中，所述基因进行了密码子优化。
在一些实施方式中，所述载体中还具有蛋白标签，如Flag标签、Halo标签、SNAP标签、His-tag标签等，优选为组氨酸(His-tag)标签。
在一些实施方式中，所述载体为真核细胞表达载体。作为本发明的优选方案，所述载体为pcDNA3.1载体，如pcDNA3.1 Hygro(+)载体。
在一些实施方式中，所述细胞为哺乳动物细胞，可以选自CHO细胞、HEK293细胞、Vero细胞等。
在一些实施方式中，所述细胞为CHO细胞，具体可以选用CHO-K1、CHO-S、CHO-DXB11、CHO-DG44等细胞系。
在一些实施方式中，所述细胞为能够稳定表达重组蛋白的单克隆细胞。
在一些实施方式中，所述细胞为外源转入了重组蛋白表达载体的细胞，所述重组蛋白表达载体可以先于编码FABP5蛋白的基因或载体转入细胞，也可以与编码FABP5蛋白的基因或载体共同转入。
作为本发明的一种具体实施方式，所述细胞为表达重组蛋白的单克隆CHO细胞，其中外源转入了pcDNA3.1载体；所述pcDNA3.1载体中插入了CHO细胞的编码FABP5蛋白的基因和编码组氨酸标签的基因，优选插入了如SEQ ID NO:1所示的基因序列。
作为本发明的一种具体实施方式，所述细胞为CHO细胞，其中外源转入了重组蛋白表达载体和pcDNA3.1载体；所述pcDNA3.1载体中插入了CHO细胞的编码FABP5蛋白的基因和编码组氨酸标签的基因，优选插入了如SEQ ID NO:1所示的基因序列。
在一些实施方式中，所述重组蛋白选自单克隆抗体(例如：曲妥珠单抗)和融合蛋白。所述融合蛋白优选为Fc融合蛋白，如TNFR-Fc融合蛋白等。
附图说明
图1为在Herceptin克隆中的瞬时表达48h的胞内检测结果；
图2为瞬时转染FABP5后Herceptin单克隆的活细胞密度；
图3为瞬时转染FABP5后Herceptin单克隆的细胞活率；
图4为瞬时转染FABP5后Herceptin单克隆的抗体产量；
图5为瞬时转染FABP5后TNFR-Fc单克隆的活细胞密度；
图6为瞬时转染FABP5后TNFR-Fc单克隆的细胞活率；
图7为瞬时转染FABP5后TNFR-Fc单克隆的蛋白产量；
图8为在Herceptin克隆中的稳定表达细胞池的胞内检测结果；
图9为在Herceptin单克隆中稳定表达FABP5后的活细胞密度；
图10为在Herceptin单克隆中稳定表达FABP5后的细胞活率；
图11为在Herceptin单克隆中稳定表达FABP5后的抗体产量。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1：质粒构建
将CHO细胞(中国仓鼠卵巢细胞)的FABP5基因序列的编码区结尾加上组氨酸标签(His-Taq)进行序列合成，即合成如SEQ ID NO:1所示的基因序列，构建到pcDNA3.1 Hygro(+)载体中，得到pcDNA-FABP5载体。
所述SEQ ID NO:1具体为：
ATGGGTGCTATGGCCAAACCAGACTGCATCATTACTTGTGACGGCAACAATATCACCATTAAAACTGAGAGCACTTTGAAGACGACGCAGTTTTCTTGTACCCTGGGGGAGAAGTTTGATGAAACTACAGCCGATGGCAGAAAAACTCAGACGGTCTGCACCTTCACTGATGGCGCCCTGGTTCAGCACCAGAACTGGGATGGGAAGGAAAGCACAATAACAAGAAGAGTTAAGGATGGGAAGCTAGTGGTGGATTGTGTCATGAACAACGTGACCTGTACTCGGGTCTATGAAAAGGTGGAGCATCATCACCACCACCACTGATAA
所述pcDNA3.1 Hygro(+)载体具有如SEQ ID NO:2所示的序列。
实施例2：瞬时转染
1、实验材料：
表达Herceptin单抗的CHO-K1单克隆细胞，培养基：EX-Cell Advanced CHO Fed-batch medium(sigma)；
表达TNFR-Fc融合蛋白的CHO-K1单克隆细胞，培养基BalanCD CHO Growth A(Irvine),添加4mM谷氨酰胺；
实验前两种细胞均已复苏后传代一周以上，接种密度0.3-0.5×106个/ml，每3天传代一次，于180rpm，5％CO2细胞培养摇床中培养。
24深孔板及三明治硅胶盖(Htslabs)。
转染培养基：BlanCD transfectory CHO(Irvine)
2、步骤：
转染前一天将单克隆细胞传代至1.0×106个/ml，转染当天计数，用转染培养基BlanCD transfectory CHO调整密度至2.0×106个/ml，分装到24深孔板中，每孔2.2ml。分别在细胞中加入实施例1构建的pcDNA-FABP5质粒4μg/孔,pcDNA3.1质粒4μg/孔，PEI(聚醚酰亚胺)12μl/孔(1mg/ml)，每种质粒3个复孔。转染后，分别在24h，48h，72h，96h计数及留样用于滴度检测。在48h留取0.4×106个细胞用于免疫印迹，用His-Tag Antibody,mouse(proteintech)作为一抗，4℃过夜，二抗HRP Goat Anti-Mouse IgG HCS(Abbkine)室温1h后显色。
3、Herceptin克隆中的瞬时转染结果如图1至图4所示。
如图1所示，瞬时转染48h后，可见FABP5能检测到大小正确条带，证明pcDNA-FABP5载体在宿主细胞中瞬时转染能够表达。
如图2所示，瞬时转染FABP5后，Herceptin单克隆的活细胞密度较对照组pcDNA3.1有提升，在96h提升了206％。
如图3所示，瞬时表达FABP5后，Herceptin单克隆的活率较对照组pcDNA3.1也有12个百分点的提升。
如图4所示，瞬时转染FABP5后，Herceptin单克隆的产量在96h提升了195％。
由以上结果可知，瞬时转染FABP5对Herceptin单克隆的细胞生长有促进作用，并且活率提升，抗体产量也有提升。
4、TNFR-Fc克隆中的瞬时转染结果如图5至图7所示。
如图5所示，瞬时转染FABP5后，TNFR-Fc单克隆的活细胞密度较对照组pcDNA3.1有提升，在96h提升了31％。
如图6所示，瞬时转染FABP5后，TNFR-Fc单克隆的活率略有提升，提升了9个百分点。
如图7所示，瞬时转染FABP5后，TNFR-Fc单克隆的蛋白产量提升了60％。
由以上结果可知，瞬时转染FABP5对TNFR-Fc单克隆的细胞生长有促进作用，融合蛋白产量也有提升。
实施例3：稳定表达
本实施例检测稳定表达FABP5对Herceptin单克隆的影响。
1、实验材料：
表达Herceptin单抗的CHO-K1单克隆，培养基：EX-Cell Advanced CHO Fed-batchmedium(sigma)；转染培养基：BlanCD transfectory CHO(Irvine)。实验前两种克隆均已复苏后传代一周以上，接种密度0.3-0.5×106个/ml，每3天传代一次，于180rpm，5％CO2细胞培养摇床中培养。
2、实验方法：
转染前一天将Herceptin单克隆细胞传代至1.0×106个/ml，转染当天计数，用转染培养基BlanCD transfectory CHO调整密度至2.0×106个/ml，在摇管中进行瞬时转染，pcDNA-FABP5和pcDNA3.1质粒，按照质粒9μg，PEI:27μl(1mg/ml)，进行转染。
转染48h后通过离心换液(200g,5分钟)的方式将细胞密度调整至0.5×106个/ml，培养基：EX-Cell Advanced CHO Fed-batch medium，并加入筛选试剂hygromycin(潮霉素)，终浓度：1500μg/ml，每3-4天计数，通过离心换液以0.5×106个/ml传代，直至细胞活率恢复至90％以上。(注：筛选过程中，pcDNA3.1空载的细胞未能在1500μg/ml恢复活率，全部死亡)
将FABP5筛选后的细胞池与未处理的Herceptin单克隆一起以0.5×106个/ml的密度接种在无抗生素的培养基中进行补料批培养，第三天开始加入补料Cell Boost 7aliquid feed(Hyclone)3％，Cell Boost 7b liquid feed(Hyclone)0.3％，并检测葡萄糖浓度，低于4g/L则补充到8g/L。在培养第4天留取0.5×106个细胞用于免疫印迹，用His-TagAntibody,mouse(Proteintech)作为一抗，4℃过夜，二抗HRP Goat Anti-Mouse IgG HCS(Abbkine)室温1h后显色。培养过程中计数和取样进行抗体产量检测(Fortebio octet)。
3、结果：
如图8所示，FABP5筛选后的细胞池补料批培养4天的细胞中可检测到FABP5的表达。
如图9和图10所示，与未处理组(NC)的Herceptin单克隆相比，Herceptin单克隆稳定表达FABP5后活细胞密度提升了33％，活率提升了3个百分点。
如图11所示，与未处理组(NC)相比，Herceptin单克隆稳定表达FABP5后抗体产量提升了20％。
由以上结果可知，稳定表达FABP5对Herceptin单克隆的细胞生长和抗体产量有提升作用。
虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 佛山汉腾生物科技有限公司；广州汉腾生物科技有限公司；
佛山普津生物技术有限公司
<120> 一种提高重组蛋白表达量的方法
<130> RYP2010800.1
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 327
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FABP5-His
<400> 1
atgggtgcta tggccaaacc agactgcatc attacttgtg acggcaacaa tatcaccatt 60
aaaactgaga gcactttgaa gacgacgcag ttttcttgta ccctggggga gaagtttgat 120
gaaactacag ccgatggcag aaaaactcag acggtctgca ccttcactga tggcgccctg 180
gttcagcacc agaactggga tgggaaggaa agcacaataa caagaagagt taaggatggg 240
aagctagtgg tggattgtgt catgaacaac gtgacctgta ctcgggtcta tgaaaaggtg 300
gagcatcatc accaccacca ctgataa 327
<210> 2
<211> 5597
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pcDNA3.1 Hygro(+)
<400> 2
gacggatcgg gagatctccc gatcccctat ggtgcactct cagtacaatc tgctctgatg 60
ccgcatagtt aagccagtat ctgctccctg cttgtgtgtt ggaggtcgct gagtagtgcg 120
cgagcaaaat ttaagctaca acaaggcaag gcttgaccga caattgcatg aagaatctgc 180
ttagggttag gcgttttgcg ctgcttcgcg atgtacgggc cagatatacg cgttgacatt 240
gattattgac tagttattaa tagtaatcaa ttacggggtc attagttcat agcccatata 300
tggagttccg cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc 360
cccgcccatt gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc 420
attgacgtca atgggtggag tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt 480
atcatatgcc aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt 540
atgcccagta catgacctta tgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca 600
tcgctattac catggtgatg cggttttggc agtacatcaa tgggcgtgga tagcggtttg 660
actcacgggg atttccaagt ctccacccca ttgacgtcaa tgggagtttg ttttggcacc 720
aaaatcaacg ggactttcca aaatgtcgta acaactccgc cccattgacg caaatgggcg 780
gtaggcgtgt acggtgggag gtctatataa gcagagctct ctggctaact agagaaccca 840
ctgcttactg gcttatcgaa attaatacga ctcactatag ggagacccaa gctggctagc 900
gtttaaactt aagcttggta ccgagctcgg atccactagt ccagtgtggt ggaattctgc 960
agatatccag cacagtggcg gccgctcgag tctagagggc ccgtttaaac ccgctgatca 1020
gcctcgactg tgccttctag ttgccagcca tctgttgttt gcccctcccc cgtgccttcc 1080
ttgaccctgg aaggtgccac tcccactgtc ctttcctaat aaaatgagga aattgcatcg 1140
cattgtctga gtaggtgtca ttctattctg gggggtgggg tggggcagga cagcaagggg 1200
gaggattggg aagacaatag caggcatgct ggggatgcgg tgggctctat ggcttctgag 1260
gcggaaagaa ccagctgggg ctctaggggg tatccccacg cgccctgtag cggcgcatta 1320
agcgcggcgg gtgtggtggt tacgcgcagc gtgaccgcta cacttgccag cgccctagcg 1380
cccgctcctt tcgctttctt cccttccttt ctcgccacgt tcgccggctt tccccgtcaa 1440
gctctaaatc gggggctccc tttagggttc cgatttagtg ctttacggca cctcgacccc 1500
aaaaaacttg attagggtga tggttcacgt agtgggccat cgccctgata gacggttttt 1560
cgccctttga cgttggagtc cacgttcttt aatagtggac tcttgttcca aactggaaca 1620
acactcaacc ctatctcggt ctattctttt gatttataag ggattttgcc gatttcggcc 1680
tattggttaa aaaatgagct gatttaacaa aaatttaacg cgaattaatt ctgtggaatg 1740
tgtgtcagtt agggtgtgga aagtccccag gctccccagc aggcagaagt atgcaaagca 1800
tgcatctcaa ttagtcagca accaggtgtg gaaagtcccc aggctcccca gcaggcagaa 1860
gtatgcaaag catgcatctc aattagtcag caaccatagt cccgccccta actccgccca 1920
tcccgcccct aactccgccc agttccgccc attctccgcc ccatggctga ctaatttttt 1980
ttatttatgc agaggccgag gccgcctctg cctctgagct attccagaag tagtgaggag 2040
gcttttttgg aggcctaggc ttttgcaaaa agctcccggg agcttgtata tccattttcg 2100
gatctgatca gcacgtgatg aaaaagcctg aactcaccgc gacgtctgtc gagaagtttc 2160
tgatcgaaaa gttcgacagc gtctccgacc tgatgcagct ctcggagggc gaagaatctc 2220
gtgctttcag cttcgatgta ggagggcgtg gatatgtcct gcgggtaaat agctgcgccg 2280
atggtttcta caaagatcgt tatgtttatc ggcactttgc atcggccgcg ctcccgattc 2340
cggaagtgct tgacattggg gaattcagcg agagcctgac ctattgcatc tcccgccgtg 2400
cacagggtgt cacgttgcaa gacctgcctg aaaccgaact gcccgctgtt ctgcagccgg 2460
tcgcggaggc catggatgcg atcgctgcgg ccgatcttag ccagacgagc gggttcggcc 2520
cattcggacc gcaaggaatc ggtcaataca ctacatggcg tgatttcata tgcgcgattg 2580
ctgatcccca tgtgtatcac tggcaaactg tgatggacga caccgtcagt gcgtccgtcg 2640
cgcaggctct cgatgagctg atgctttggg ccgaggactg ccccgaagtc cggcacctcg 2700
tgcacgcgga tttcggctcc aacaatgtcc tgacggacaa tggccgcata acagcggtca 2760
ttgactggag cgaggcgatg ttcggggatt cccaatacga ggtcgccaac atcttcttct 2820
ggaggccgtg gttggcttgt atggagcagc agacgcgcta cttcgagcgg aggcatccgg 2880
agcttgcagg atcgccgcgg ctccgggcgt atatgctccg cattggtctt gaccaactct 2940
atcagagctt ggttgacggc aatttcgatg atgcagcttg ggcgcagggt cgatgcgacg 3000
caatcgtccg atccggagcc gggactgtcg ggcgtacaca aatcgcccgc agaagcgcgg 3060
ccgtctggac cgatggctgt gtagaagtac tcgccgatag tggaaaccga cgccccagca 3120
ctcgtccgag ggcaaaggaa tagcacgtgc tacgagattt cgattccacc gccgccttct 3180
atgaaaggtt gggcttcgga atcgttttcc gggacgccgg ctggatgatc ctccagcgcg 3240
gggatctcat gctggagttc ttcgcccacc ccaacttgtt tattgcagct tataatggtt 3300
acaaataaag caatagcatc acaaatttca caaataaagc atttttttca ctgcattcta 3360
gttgtggttt gtccaaactc atcaatgtat cttatcatgt ctgtataccg tcgacctcta 3420
gctagagctt ggcgtaatca tggtcatagc tgtttcctgt gtgaaattgt tatccgctca 3480
caattccaca caacatacga gccggaagca taaagtgtaa agcctggggt gcctaatgag 3540
tgagctaact cacattaatt gcgttgcgct cactgcccgc tttccagtcg ggaaacctgt 3600
cgtgccagct gcattaatga atcggccaac gcgcggggag aggcggtttg cgtattgggc 3660
gctcttccgc ttcctcgctc actgactcgc tgcgctcggt cgttcggctg cggcgagcgg 3720
tatcagctca ctcaaaggcg gtaatacggt tatccacaga atcaggggat aacgcaggaa 3780
agaacatgtg agcaaaaggc cagcaaaagg ccaggaaccg taaaaaggcc gcgttgctgg 3840
cgtttttcca taggctccgc ccccctgacg agcatcacaa aaatcgacgc tcaagtcaga 3900
ggtggcgaaa cccgacagga ctataaagat accaggcgtt tccccctgga agctccctcg 3960
tgcgctctcc tgttccgacc ctgccgctta ccggatacct gtccgccttt ctcccttcgg 4020
gaagcgtggc gctttctcat agctcacgct gtaggtatct cagttcggtg taggtcgttc 4080
gctccaagct gggctgtgtg cacgaacccc ccgttcagcc cgaccgctgc gccttatccg 4140
gtaactatcg tcttgagtcc aacccggtaa gacacgactt atcgccactg gcagcagcca 4200
ctggtaacag gattagcaga gcgaggtatg taggcggtgc tacagagttc ttgaagtggt 4260
ggcctaacta cggctacact agaagaacag tatttggtat ctgcgctctg ctgaagccag 4320
ttaccttcgg aaaaagagtt ggtagctctt gatccggcaa acaaaccacc gctggtagcg 4380
gtttttttgt ttgcaagcag cagattacgc gcagaaaaaa aggatctcaa gaagatcctt 4440
tgatcttttc tacggggtct gacgctcagt ggaacgaaaa ctcacgttaa gggattttgg 4500
tcatgagatt atcaaaaagg atcttcacct agatcctttt aaattaaaaa tgaagtttta 4560
aatcaatcta aagtatatat gagtaaactt ggtctgacag ttaccaatgc ttaatcagtg 4620
aggcacctat ctcagcgatc tgtctatttc gttcatccat agttgcctga ctccccgtcg 4680
tgtagataac tacgatacgg gagggcttac catctggccc cagtgctgca atgataccgc 4740
gagacccacg ctcaccggct ccagatttat cagcaataaa ccagccagcc ggaagggccg 4800
agcgcagaag tggtcctgca actttatccg cctccatcca gtctattaat tgttgccggg 4860
aagctagagt aagtagttcg ccagttaata gtttgcgcaa cgttgttgcc attgctacag 4920
gcatcgtggt gtcacgctcg tcgtttggta tggcttcatt cagctccggt tcccaacgat 4980
caaggcgagt tacatgatcc cccatgttgt gcaaaaaagc ggttagctcc ttcggtcctc 5040
cgatcgttgt cagaagtaag ttggccgcag tgttatcact catggttatg gcagcactgc 5100
ataattctct tactgtcatg ccatccgtaa gatgcttttc tgtgactggt gagtactcaa 5160
ccaagtcatt ctgagaatag tgtatgcggc gaccgagttg ctcttgcccg gcgtcaatac 5220
gggataatac cgcgccacat agcagaactt taaaagtgct catcattgga aaacgttctt 5280
cggggcgaaa actctcaagg atcttaccgc tgttgagatc cagttcgatg taacccactc 5340
gtgcacccaa ctgatcttca gcatctttta ctttcaccag cgtttctggg tgagcaaaaa 5400
caggaaggca aaatgccgca aaaaagggaa taagggcgac acggaaatgt tgaatactca 5460
tactcttcct ttttcaatat tattgaagca tttatcaggg ttattgtctc atgagcggat 5520
acatatttga atgtatttag aaaaataaac aaataggggt tccgcgcaca tttccccgaa 5580
aagtgccacc tgacgtc 5597
Claims (10)
1.一种提高重组蛋白表达量的方法，其特征在于，包括如下步骤：将编码FABP5蛋白的基因转入用于表达重组蛋白的细胞中，使FABP5蛋白瞬时或稳定表达；所述重组蛋白不为所述FABP5蛋白。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：将具有编码FABP5蛋白的基因的载体转入用于表达重组蛋白的细胞中；
优选地，所述基因经过了密码子优化；和/或，所述载体中还插入了蛋白标签，优选为组氨酸标签；和/或，所述载体为真核细胞表达载体，优选为pcDNA3.1载体。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述细胞为哺乳动物细胞；
优选地，所述哺乳动物细胞选自CHO细胞、HEK293细胞和Vero细胞。
4.根据权利要求1～3任意一项所述的方法，其特征在于，所述细胞为表达重组蛋白的单克隆细胞，或为外源转入了重组蛋白表达载体的细胞；
优选地，所述重组蛋白选自单克隆抗体和融合蛋白；所述融合蛋白优选为Fc融合蛋白。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，包括如下步骤：合成CHO细胞的编码FABP5蛋白的基因并连接编码组氨酸标签的基因，优选合成如SEQ ID NO:1所示的基因序列，然后构建到pcDNA3.1载体中，将所得载体转染到能够表达重组蛋白的单克隆CHO细胞中，或者将所得载体与所述重组蛋白的表达载体共同转染到CHO细胞中。
6.高表达重组蛋白的细胞，其特征在于，所述细胞还能够瞬时或稳定过表达FABP5蛋白，所述重组蛋白不为所述FABP5蛋白；
优选地，所述细胞中外源转入了编码FABP5蛋白的基因。
7.根据权利要求6所述的细胞，其特征在于，所述细胞中外源转入了具有编码FABP5蛋白的基因的载体；
优选地，所述基因经过了密码子优化；和/或，所述载体中还具有蛋白标签，优选为组氨酸标签；和/或，所述载体为真核细胞表达载体，优选为pcDNA3.1载体。
8.根据权利要求6所述的细胞，其特征在于，所述细胞为哺乳动物细胞；
优选地，所述哺乳动物细胞选自CHO细胞、HEK293细胞和Vero细胞。
9.根据权利要求6～8任意一项所述的细胞，其特征在于，所述细胞为表达重组蛋白的单克隆细胞，或为外源转入了重组蛋白表达载体的细胞；
优选地，所述重组蛋白选自单克隆抗体和融合蛋白；所述融合蛋白优选为Fc融合蛋白。
10.根据权利要求6所述的细胞，其特征在于，所述细胞为表达重组蛋白的单克隆CHO细胞，其中外源转入了pcDNA3.1载体；所述pcDNA3.1载体中插入了CHO细胞的编码FABP5蛋白的基因和编码组氨酸标签的基因，优选插入了如SEQ ID NO:1所示的基因序列；
或者，所述细胞为CHO细胞，其中外源转入了重组蛋白表达载体和pcDNA3.1载体；所述pcDNA3.1载体中插入了CHO细胞的编码FABP5蛋白的基因和编码组氨酸标签的基因，优选插入了如SEQ ID NO:1所示的基因序列。
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2021
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- 2021-05-28 WO PCT/CN2021/096893 patent/WO2022170695A1/zh active Application Filing
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN115850517A (zh) * | 2022-11-14 | 2023-03-28 | 沈阳药科大学 | 一种提高GLP-1 Fc融合蛋白产量的方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2022170695A1 (zh) | 2022-08-18 |
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