CN113009146A - 用于检测针对乙酰胆碱受体的自身抗体的方法 - Google Patents

用于检测针对乙酰胆碱受体的自身抗体的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及诊断上有用的承载体，其包含过表达成人ACh受体或其变体的真核细胞和过表达胎儿ACh受体或其变体的真核细胞，其中所述细胞被固定以用于免疫荧光，和包括使所述承载体与患者样品接触的步骤的方法，以及过表达成人ACh受体或其变体的真核细胞和过表达胎儿ACh受体或其变体的真核细胞的组合在增加用于检测针对ACh受体的自身抗体的测定(优选免疫荧光测定)的灵敏度中的用途。

Description

用于检测针对乙酰胆碱受体的自身抗体的方法
技术领域
本发明涉及诊断上有用的承载体，其包含过表达成人ACh受体或其变体的真核细胞和过表达胎儿ACh受体或其变体的真核细胞，其中所述细胞被固定以用于免疫荧光，和包括使所述承载体与患者样品接触的步骤的方法，以及过表达成人ACh受体或其变体的真核细胞和过表达胎儿ACh受体或其变体的真核细胞的组合在增加用于检测针对ACh受体的自身抗体的测定(优选免疫荧光测定)的灵敏度中的用途。
背景技术
在重症肌无力(MG)中，针对运动终板的乙酰胆碱(ACh)受体(AChR)的自身抗体会导致神经肌肉数据传输的功能障碍。这导致重要的肌肉无力，其可能是致命的。
MG分为不同的形式。这些包括获得性MG形式，广义MG或仅具有眼综合征和遗传形式的MG。在欧洲，MG的患病率估计为每1,000,000人中40至125例，在美国(USA)为50至200例。MG可发生于儿童早期至老年。妇女，特别是20至30岁的年轻妇女和50岁以上的男性比其他人更容易患上这种疾病。
如果在早期诊断，挽救生命的治疗是可能。因此，准确的诊断越早，成功治疗患者的机会就越高。
各种血清学测试可用于MG诊断，尤其是用于检测针对AChR的自身抗体，例如基于ELISA、放射免疫测定(RIA)和免疫荧光。
尽管RIA测定最灵敏，但是放射性同位素的使用阻止了许多实验室的实施。出于安全原因，其他人希望可以用足够灵敏的非放射性测定取代RIA测试。
基于免疫荧光的测定是一种方便且通常灵敏的方法。曾希望这种测定法可以取代RIA，但是先前的研究表明，这种测定法的灵敏度尚有待改进。
例如，George等人发现在13名患者中有一名患者的自身抗体没有被检测到(George,S.,Noack,M.,Vanek,M.,Rentzsch,J.,
Figure BDA0002845351780000021
N.,Conrad,K.,Roggenbuck,D.,和Küpper,J.H.(2015)Expression of nicotinic acetylcholine receptor subunits inHEp-2cells for immunodetection of autoantibodies specificities in sera fromMyasthenia gravis patients,Clin.Hamorheology and Microcirculation DOI10.3233/CH-15199)。表达成人ACh受体或胎儿ACh受体的活细胞用于测定，并在与样品孵育后固定。还公开了指示存在针对ACh受体的自身抗体的典型荧光图案。
Yang等人、Shi等人和Leite等人使用了一种用30kD荧光蛋白EGFP标记的乙酰胆碱受体，该受体与rapsyn融合，其是所用复合物的组分。通过检测该EGFP和与ACh受体自身抗体结合的荧光标记是否发出共定位的荧光信号来检测ACh受体自身抗体。(Yang,L.,Maxwell,S.,Leite,M.I.,Waters,P.,Clover,L.,Fan,X.,Zhang,D.,Yang,C.,Beeson,D.,和Vincent,A.(2011)J.Neurol.Sc.301,71-76；Shi,Q.G.,Wang,H.H.,Ma,X.W.,Zhang,D.Q.,Yang,C.S.,Shi,F.D.,Yang,L.(2012)Clinical significance of detection ofantibodies to fetal and adult acetylcholine receptors in myasthenia gravis,Neurosc.Bull.28(5),469-474；Leite,M.I,Jacob,S.,Viegas,S.,Cossins,J.,Clover,L.,Morgan,B.P.,Beeson,D.,Willcox,N.,Vincent,A.(2008)IgGI antibodies toacetylcholine receptors in seronegative myasthenia gravis(2008)Brain 131,1940-1952)。他们使用与患者样品孵育后固定的活细胞。
发明内容
本发明的基本问题是提供一种基于荧光标记的简单检测的免疫荧光测定，其具有增加的灵敏度并具有取代RIA的潜力。该测定的格式应允许制造商运送准备与样品和检测试剂孵育的试剂，而无需在孵育之前直接固定，该步骤可能会引入偏差，从而导致无法标准化和比较各个实验室的结果。
本发明的另一个基本问题是增加免疫荧光测试的诊断可靠性，特别是灵敏度和/或特异性。
通过所附独立权利要求和从属权利要求的主题解决本发明的基本问题。
在第一方面，通过诊断上有用的承载体解决所述问题，所述承载体包括过表达成人ACh受体或其变体的真核细胞和过表达胎儿ACh受体或其变体的真核细胞，其中所述细胞被固定用于免疫荧光。
在一个优选的实施方案中，任何过表达自身抗原的真核细胞是预固定的，所述自身抗原优选地选自成人ACh受体、胎儿ACh受体和Musk。
在一个优选的实施方案中，承载体还包含过表达Musk或其变体的真核细胞。
在一个优选的实施方案中，过表达成人ACh受体或其变体的细胞和过表达胎儿ACh受体或其变体的细胞分别永久地表达成人ACh受体和胎儿ACh受体。
在一个优选的实施方案中，承载体还包括对照，优选模拟转染(mock-transfected)的细胞。
在一个优选的实施方案中，细胞选自HEK293、HeLa、CHO和Jurkat细胞及其衍生物。
在承载体的一个优选的实施方案中，过表达选自成人ACh受体、胎儿ACh受体和Musk或其变体的自身抗原的至少一种真核细胞、优选所有真核细胞包含一种或多种载体，其中编码自身抗原的核酸处于通过添加诱导剂可诱导的启动子的控制下，并且其中对于每种细胞，存在另外的空间上分开的真核细胞，其包含缺少所述核酸的相同载体或包含相同载体但不表达所述自身抗原，优选是因为不存在诱导剂而不表达。
在第二方面，通过优选用于诊断重症肌无力、LEMS和OMD的方法解决所述问题，所述方法包括以下步骤：在样品中检测针对ACh受体的自身抗体，任选除了检测针对Musk的自身抗体之外，还包括以下步骤：
a)在允许复合物形成的条件下使样品与根据本发明的承载体接触，所述复合物包含选自针对ACh受体和Musk的自身抗体的自身抗体以及选自ACh受体和Musk的自身抗原，所述ACh受体优选成人ACh受体和/或胎儿ACh受体，
b)使步骤b)中形成的任何复合物与针对所述自身抗体的荧光配体接触，
c)去除任何未与自身抗体结合的荧光配体，和
d)检测所述荧光配体的存在或不存在。
在第三方面，通过试剂盒解决所述问题，所述试剂盒包含根据本发明的承载体和针对ACh受体的自身抗体的配体，任选也针对Musk的自身抗体的配体，其中所述配体是荧光配体，其中优选预固定任何过表达自身抗原的真核细胞。
在第四方面，通过过表达成人ACh受体或其变体的真核细胞和过表达胎儿ACh受体或其变体的真核细胞的组合在增加用于检测针对ACh受体的自身抗体的测定(优选免疫荧光测定)的灵敏度中的用途来解决所述问题。
在一个优选的实施方案中，与自身抗体结合的荧光配体的存在或不存在指示样品中是否存在自身抗体。
在一个优选的实施方案中，所述用途用于诊断自身免疫疾病，所述自身免疫疾病优选重症肌无力、Lambert-Eaton肌无力综合征(LEMS)和其他肌肉病症OMD。
在一个优选的实施方案中，表达成人ACh受体或其变体的真核细胞和过表达胎儿ACh受体或其变体的真核细胞以及任选地表达Musk或其变体的真核细胞在空间上是分开的。
在一个优选的实施方案中，过表达成人ACh受体或其变体的真核细胞和过表达胎儿ACh受体或其变体的真核细胞以及任选地表达Musk或其变体的真核细胞是共定位的。
在一个优选的实施方案中，样品包含来自患者的抗体，所述样品优选血液，更优选选自血清、液体、血浆和全血。在一个更优选的实施方案中，患者是人类患者。
本发明基于本发明人的令人惊讶的发现，即可以使用在同一承载体上的成人AChR和胎儿AChR的组合来增加灵敏度。在运输产品并将根据本发明的承载体与患者样品孵育之前，可以在批量生产过程中预固定细胞。
在一个优选的实施方案中，ACh受体含有两个α亚基和一个β和一个δ亚基。另外，胎儿ACh受体含有γ亚基，而成人ACh受体含有ε亚基。如果所需的所有亚基都存在于细胞中或体外，则复合物会自发组装。在一个优选的实施方案中，α亚基由SEQ ID NO：1或其变体表示。在一个优选的实施方案中，β亚基由SEQ ID NO：2或其变体表示。在一个优选的实施方案中，δ亚基由SEQ ID NO：3或其变体表示。在一个优选的实施方案中，ε亚基由SEQ ID NO：4或其变体表示。在一个优选的实施方案中，γ亚基由SEQ ID NO：5或其变体表示。
在一个优选的实施方案中，成人ACh受体或其变体和/或胎儿ACh受体或其变体与rapsyn或其变体缔合。据报道，Rapsyn有助于组装用于免疫诊断的ACh受体亚基(Leite,M.I,Jacob,S.,Viegas,S.,Cossins,J.,Clover,L.,Morgan,B.P.,Beeson,D.,Willcox,N.,Vincent,A.(2008)IgGI antibodies to acetylcholine receptors in seronegativemyasthenia gravis(2008)Brain 131,1940-1952)。在一个优选的实施方案中，rapsyn由SEQ ID NO：6或其变体表示。
在一个优选的实施方案中，承载体可以包含过表达Musk的真核细胞。在一个优选的实施方案中，Musk由SEQ ID NO：13或其变体表示。
在一个优选的实施方案中，诊断上有用的承载体旨在用于显微免疫荧光分析。这样的承载体可以是载玻片。载玻片上的细胞可以用含甘油的封固缓冲液覆盖，并且可以将盖玻片放在顶部。可以从EUROIMMUN Medizinische Labordiagnostika，AG获得带有盖玻片的载玻片(例如FD 1435-92、FD 1435-93、FD 1435-94和FD 1434-90)。然而，可以使用与荧光图案的显微镜分析兼容的任何承载体。承载体可以包含模拟转染的细胞，该细胞已经用与过表达感兴趣的自身抗原的细胞相同的载体转染，但是没有编码后者的核酸。这种模拟转染的细胞可以作为阴性对照。该承载体被配置用于使用免疫荧光显微镜进行分析。
在一个优选的实施方案中，使用经固定的真核，优选哺乳动物，更优选永生化的人类细胞。在一个优选的实施方案中，如本文所用的术语“经固定的”细胞是指已经用反应性化合物处理过的细胞，以使该细胞不再具有代谢活性，但仍呈现其表位用于用抗体进行免疫染色以及它们的随后检测，例如通过荧光。更优选地，反应性化合物选自丙酮、福尔马林、甲醇和乙醇或其混合物，优选全部这些。本领域技术人员熟悉可用于制备经固定的细胞的方案。基本上，通过使用洗涤缓冲液洗涤附着在固体支持物上的细胞，然后与反应性化合物接触，例如浸入。可以使用福尔马林或纯丙酮或反应性化合物的水性稀释液。
在一个优选的实施方案中，根据本发明的细胞过表达成人ACh受体或其变体和胎儿ACh受体或其变体，任选地其他自身抗原，例如Musk或其变体。在一个优选的实施方案中，如本文所用的术语“过表达”是指已经用核酸瞬时或稳定地转染细胞，后者是指核酸已经掺入细胞的基因组中，其包括处于启动子优选处于强启动子的控制下的编码包含人ACh受体或Musk或其变体的多肽的核酸序列。因此，通过定量蛋白质印迹判断，经转染的细胞比未经转染的相同类型的细胞通常表达更多的自身抗体识别的多肽，可能多至少10％、20％、30％、50％、100％、200％或500％。优选地，未经转染的细胞不表达可检测量的自身抗原。
此类载体的示例包括SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：14。
在一个优选的实施方案中，细胞包含一种或多种载体，所述载体包含处于启动子的功能控制下编码ACh受体亚基的核酸。
在一个优选的实施方案中，细胞包含由SEQ ID NO：7(ACh受体α亚基)、SEQ ID NO：8(ACh受体β亚基)、SEQ ID NO：9(ACh受体δ亚基)和SEQ ID NO：10(ACh受体ε亚基)和SEQ IDNO：11(ACh受体γ亚基)中的一个或两个代表的载体。另外，细胞可以包含由SEQ ID NO：12(rapsyn)代表的载体和/或由SEQ ID NO：14(Musk)代表的载体。
启动子可以是诱导型启动子，其允许通过添加诱导剂来诱导表达。本领域技术人员熟悉用于在真核细胞中瞬时过表达多肽的方案和载体，例如来自Novagen的pTriEx系统，以及用于稳定转染真核细胞的方案和载体，例如来自Invitrogen的pcDNATM4/TO载体。
在一个优选的实施方案中，承载体可以包括包含根据本发明的细胞的面板(panel)。另外，承载体可以包括附加的面板。所述面板优选地被疏水表面包围。
在一个优选的实施方案中，细胞与一个或多个自身抗体结合，每个自身抗体与选自胎儿ACh受体或成人ACh受体或Musk的自身抗原结合，并且第二抗体与该抗体结合。在一个更优选的实施方案中，第二抗体识别IgA、IgG和IgM类抗体或所有它们，优选IgG类抗体。可以使用具有结合特性的第二抗体或适配体或其他分子的片段或其他变体，可以对其进行改造，使得该分子特异性结合和/或识别自身抗体或IgA、IgG或IgM类抗体。对于免疫荧光分析，第二抗体可包含可检测的荧光配体。在一个优选的实施方案中，荧光配体是适用于真核细胞免疫荧光染色的荧光分子，优选选自荧光素及其衍生物，优选异硫氰酸酯混合异构体(FITC)、异硫氰酸四甲基罗丹明(TRITC)及其衍生物、罗丹明及其衍生物、4,6’-二脒基-2-苯吲哚盐酸(DAPI)及其衍生物、2’-(4-乙氧基苯基)-5-(4-甲基-1-哌嗪基)-2,5’-双-1H-苯并咪唑三盐酸盐三水合物及其衍生物(Hoechst 33342)，并且更优选荧光素或其衍生物。合适的荧光分子描述在Martynov,V.I.,Pakhomov,A.A.,Popva,N.V.,Dexev,I.E.和Petrenko,A.G.(2016)Synthetic Fluorophores for Visualizing Biomolecules inLiving Systems,Acta Naturae,4(31),33以及Thermo Scientific Pierce fluorescentProducts Guide,Thermo Scientific,2012中。
根据本发明的细胞优选与任何模拟转染的细胞或表达另一种自身抗原的细胞在空间上分开，从而可以将荧光信号分配给特定的自身抗原，例如胎儿ACh受体或成人ACh受体或Musk。
在一个优选的实施方案中，成人ACh受体和/或胎儿ACh受体在其不能发射在用于诊断性免疫荧光的普通荧光显微镜中可检测到的荧光信号的意义上是非荧光的。换句话说，通过免疫荧光分析不能检测到ACh受体。
在一个优选的实施方案中，诊断上有用的承载体上的两个或更多个，优选所有细胞，包括一个或多个过表达自身抗原(优选选自成人ACh受体、胎儿ACh受体和Musk)的细胞，以及任何作为对照的细胞在承载体上在空间上分开，但足够近使得所有细胞都可以在一锅反应(one-pot reaction)中与同一样品孵育，理想情况下与一滴样品孵育。例如，EUROIMMUN Medizinische Labordiagnostika AG的Mosaik系统基于微型面板，这些微型面板被布置成使得许多面板(例如四个或六个面板)与同一滴液体样品接触。
在另一个优选的实施方案中，使用过表达成人ACh受体的细胞和过表达胎儿ACh受体的细胞，任选过表达Musk的细胞，所述细胞共定位。这可以是表达成人ACh受体的细胞与表达胎儿ACh受体的细胞的混合物，或者可以是表达成人ACh受体和胎儿ACh受体二者以及任选地Musk的细胞。
本发明的教导不仅可以使用多肽(特别是包含多肽的天然序列的多肽，例如胎儿ACh受体或成人ACh受体)或具有本申请中明确或隐含地提及的(例如通过功能、名称、序列或登录号)确切序列的核酸来进行，而且可以使用此类多肽或核酸的变体。
在一个优选的实施方案中，如本文所用的术语“变体”可以指所指的全长序列的至少一个片段，更具体地说，是相对于全长序列而言的一个或多个氨基酸或核酸序列在一个或两个末端有一个或多个氨基酸截短。这样的片段包含或编码具有至少6、7、8、10、12、15、20、25、50、75、100、150、200、250、300、350或400个原始序列或其变体的连续氨基酸的肽。变体的总长度可以是至少6、7、8、9、10、11、12、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400，500、750、1000个或更多个氨基酸。
术语“变体”不仅涉及至少一个片段，而且涉及包含与所提及的参考氨基酸序列或其片段至少40、50、60、70、75、80、85、90、92、94、95、96、97、98或99％同一的氨基酸序列的多肽或其片段，其中除生物学活性所必需的氨基酸以外的氨基酸，例如抗原与(自身)抗体结合的能力，或多肽的折叠或结构被缺失或置换和/或以保守的方式取代一个或多个这样的必需氨基酸和/或添加氨基酸从而保持多肽的生物学活性。现有技术包括可以用于比对两个给定的核酸或氨基酸序列并计算同一性程度的各种方法，参见，例如，Arthur Lesk(2008),Introduction to bioinformatics,Oxford University Press,2008,第3版。在一个优选的实施方案中，ClustalW软件(Larkin,M.A.,Blackshields,G.,Brown,N.P.,Chenna,R.,McGettigan,P.A.,McWilliam,H.,Valentin,F.,Wallace,I.M.,Wilm,A.,Lopez,R.,Thompson,J.D.,Gibson,T.J.,Higgins,D.G.(2007).Clustal W and Clustal Xversion 2.0.Bioinformatics,23,2947-2948)使用默认设置进行使用。
在一个优选的实施方案中，多肽及其变体可另外包含化学修饰，例如同位素标记或共价修饰，例如糖基化、磷酸化、乙酰化、脱羧、瓜氨酸化、甲基化、羟基化等。本领域技术人员熟悉修饰多肽的方法。设计任何修饰以使其不消除变体的生物学活性。
此外，变体还可以通过多肽、其片段或变体与其他已知的多肽或其变体的N-或/和C-末端融合而产生，并包含活性部分或结构域，当与参考序列的活性部分进行比对时，优选具有至少70、75、80、85、90、92、94、95、96、97、98或99％的序列同一性，其中如本文所用的术语“活性部分”是指氨基酸序列，其小于全长氨基酸序列，或在核酸序列的情况下，分别编码为小于全长氨基酸序列，和/或为天然序列的变体，但保留至少一些生物学活性。选择任何融合部分，使得它们不干扰自身抗原和待检测的自身抗体之间的结合反应，并且不与其他自身抗体结合并且不产生假阳性或任何其他不需要的信号。
在一个优选的实施方案中，术语核酸的“变体”包括核酸，其互补链优选在严格条件下与参考或野生型核酸杂交。杂交反应的严格性可由本领域普通技术人员容易地确定，并且通常是取决于探针长度、洗涤温度和盐浓度的经验计算。通常，较长的探针需要较高的温度才能进行适当的退火，而较短的探针则需要较低的温度。杂交通常取决于变性DNA与低于其解链温度的环境中存在的互补链重新退火的能力：探针与可杂交序列之间所需的同源性程度越高，可使用的相对温度越高。结果，较高的相对温度倾向于使反应条件更严格，而较低的温度则不太严格。有关杂交反应的严格性的其他细节和解释，请参见Ausubel,F.M.(1995),Current Protocols in Molecular Biology.John Wiley&Sons,Inc。此外，关于如何通过杂交鉴定DNA序列，本领域技术人员可以遵循手册Boehringer Mannheim GmbH(1993)The DIG System Users Guide for Filter Hybridization,Boehringer MannheimGmbH,Mannheim,Germany和在Liebl,W.,Ehrmann,M.,Ludwig,W.,和Schleifer,K.H.(1991)International Journal of Systematic Bacteriology 41:255-260中给出的说明。在一个优选的实施方案中，严格条件适用于任何杂交，即，仅当探针与靶序列70％或更多同一时才发生杂交。相对于靶序列具有较低程度的同一性的探针可以杂交，但是这种杂交体是不稳定的，并且在严格条件下在洗涤步骤中将被去除，例如将盐浓度降低至2×SSC，或者任选地和随后降低至0.5×SSC，而温度按优先级增加的顺序为约50℃-68℃、约52℃-68℃、约54℃-68℃、约56℃-68℃、约58℃-68℃、约60℃-68℃、约62℃-68℃、约64℃-68℃、约66℃-68℃。在一个特别优选的实施方案中，温度为约64℃-68℃或约66℃-68℃。可以将盐的浓度调节为0.2×SSC或甚至0.1×SSC。可以分离相对于参考或野生型序列具有至少70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99％的同一性的核酸序列。在一个优选的实施方案中，如本文所用的术语核酸序列的变体是指根据遗传密码的简并性编码与参考核酸序列相同的氨基酸序列及其变体的任何核酸序列。
多肽的变体具有生物学活性。在一个优选的实施方案中，这样的生物学活性是特异性结合与哺乳动物ACh受体(优选人ACh受体)结合的自身抗体的能力，如在罹患与这种自身抗体相关的自身免疫疾病(优选重症肌无力、LEMS和OMG，更优选重症肌无力)的患者中发现的。例如，可以通过确定感兴趣的变体是否与来自患者的样品的自身抗体(该自身抗体与野生型人ACh受体结合)结合来检查多肽的变体是否具有这种生物学活性，优选如通过如本申请的实验部分描述的间接免疫荧光所确定的。
各种出版物可以帮助本领域技术人员设计免疫反应性变体并认识到哪些变体不会消除自身抗体的检测。已在胎儿和成人形式的所有五种AChR亚基上鉴定出B细胞表位，并且主要免疫原性区域位于结合乙酰胆碱的α1亚基上(Tzartos,S.J.,Barkas,T.,Cung,M.T.,Mamalaki,A.,Marraud,M.,Orlewski,P.,Papanastasiou,D.,Sakarellos,C.,Sakarellos-Daitsiotis,M.,Tsantili,P.,Tsikaris,V.Anatomy of the antigenicstructure of a large membrane autoantigen,the muscle-type nicotinicacetylcholine receptor.Immunol Rev.1998；163:89–120)。绘制抗AChR抗体结合位点的早期研究着眼于合成肽和识别包括人类在内的各种物种的AChR的大鼠单克隆抗体之间的结合。使用固相放射免疫测定，将AChR的主要免疫原性区域定位在α1亚基细胞外环上的aa67-76处，其中将14-20mers与不同的单克隆抗体孵育(Tzartos S.J.,Kokla A.,Walgrave S.L.,Conti-Tronconi,B.M.Localization of the main immunogenic regionof human muscle acetylcholine receptor to residues 67-76of the alphasubunit.Proc Natl Acad Sci U S A.1988；85:2899–2903)。然后，通过竞争结合放射免疫测定检查所选肽对这些单克隆抗体的吸附，从而证实了α1亚基的重要性。后来的研究结果表明，主要免疫原性环与N末端α-螺旋上aa1-14的相互作用在AChR上产生构象表位，从而显著增强了抗体结合的程度(Luo J,Taylor P,Losen M,de Baets MH,Shelton GD,Lindstrom J.Main immunogenic region structure promotes binding ofconformation-dependent myasthenia gravis autoantibodies,nicotinicacetylcholine receptor conformation maturation,and agonist sensitivity.JNeurosci.2009；29:13898–13908)。位置68和71处的氨基酸似乎是关键的接触位点，因为用L-丙氨酸取代这些残基几乎消除了单克隆抗体的结合(Papadouli I,Potamianos S,Hadjidakis I,Bairaktari E,Tsikaris V,Sakarellos C,Cung MT,Marraud M,TzartosSJ.Antigenic role of single residues within the main immunogenic region ofthe nicotinic acetylcholine receptor.Biochem J.1990；269:239–245；Wahlsten JL,Lindstrom JM,Ostlie N,Wu XD,Conti-Tronconi BM.Myasthenia gravis:effect onantibody binding of conservative substitutions of amino acid residues formingthe main immunogenic region of the nicotinic acetylcholine receptor.J ReceptRes.1993)。在MG患者中也已经检测到针对AchR的细胞内部分的自身抗体，其靶向多种亚基。迄今为止报道的细胞质表位包括α1亚基的aa373-380和β1亚基的aa354-359(Tzartos,S.J.,Remoundos,M.Detection of antibodies directed against the cytoplasmicregion of the human acetylcholine receptor in sera from myasthenia gravispatients.Clin Exp Immunol.1999；116:146-152)。
在一个更优选的实施方案中，细胞是预固定的细胞，如本文所用，该术语是指该细胞在与样品孵育之前已经用固定试剂(例如福尔马林)处理过。换句话说，当细胞被固定时，样品不存在于细胞或包含这样的一个或多个细胞的承载体中。这样的细胞在代谢上是无活性的，但是呈现自身抗原表位，使得它们与自身抗体反应。它是保守的并且可以随试剂盒装运。
在一个优选的实施方案中，瞬时转染细胞，这优选是指用包含编码自身抗原(例如胎儿ACh受体或成人ACh受体或Musk)的核酸的载体转染细胞，但是该核酸未整合到细胞的基因组中。因此，当长时间培养时，细胞可能失去载体，使其不再表达所述多肽。
在一个优选的实施方案中，细胞永久表达自身抗原，例如胎儿ACh受体或成人ACh受体或Musk，更优选由于编码所述自身抗原的多肽的核酸已经整合到基因组中。因此，细胞可能永久表达多肽。这也可以称为多肽的稳定转染或稳定表达。
在一个优选的实施方案中，通过一种方法解决所述问题，所述方法包括以下步骤：用过表达成人ACh受体或其变体的真核细胞和过表达胎儿ACh受体或其变体的真核细胞(任选过表达Musk或其变体的细胞)包被诊断上有用的承载体，并固定所述细胞以进行免疫荧光。
根据本发明的方法，优选地，诊断重症肌无力、LEMS和OMD包括在样品中检测针对ACh受体的自身抗体的步骤，任选地，除了针对Musk的自身抗体之外，提供了包括以下的步骤：在允许形成包含自身抗体和选自ACh受体和Musk的自身抗原的复合物的条件下，使样品与根据本发明的承载体接触。这可以通过将一滴适当稀释的待检查的样品与细胞接触并孵育(例如孵育30分钟)来完成。PBS Tween可用于稀释。液滴可优选包含20至100μl，优选25至50μl。样品可以1：1至1：100稀释，优选1：5至1：20稀释。然后可以去除样品，并可以洗涤承载体上的细胞。PBS Tween可用作洗涤缓冲液。如果承载体包含一个以上的细胞，则优选相同样品同时与两个或更多个细胞接触，更优选其中样品的相同部分与承载体上的两个或更多个细胞(优选所有细胞)在一锅反应中接触。
然后可以使细胞和在先前步骤中形成的任何复合物与针对所述自身抗体的荧光配体接触。这可以通过使承载体上的细胞(优选两个或更多个或所有细胞)与一滴或一部分包含含有一个或多个荧光标记的配体的溶液接触来完成。在一个特别优选的实施方案中，荧光标记是荧光素衍生物，优选FITC。
随后，可以去除任何未与自身抗体结合的荧光配体，例如通过在过量的洗涤缓冲液中洗涤承载体。最后，可以例如通过使用免疫荧光显微镜(例如EUROStar Bluelight系统)检查承载体是否包含荧光图案来检测自身抗体的存在或不存在。
在一个优选的实施方案中，通过检测荧光配体的存在或不存在来检测自身抗体，更具体地说是自身抗体的存在或不存在。无需检测与ACh受体复合物相关的荧光标记和荧光配体的共定位。优选地，ACh受体复合物不发荧光或具有与配体的荧光特性不同的荧光特性，使得由AChR发射的任何荧光信号都不能与荧光配体的荧光信号混淆。
根据本发明，一种用于检测针对ACh受体的自身抗体的方法，任选地，除了针对Musk的自身抗体之外，在允许形成包含自身抗体和选自ACh受体和Musk的自身抗原的复合物的条件下，使样品与根据本发明的承载体接触。在现有技术中描述了合适的缓冲液和条件，例如George等人。随后，去除任何过量的样品，并可以洗涤承载体。然后使承载体与荧光配体接触在第一步中形成的复合物中的自身抗体。这样的配体可以是与自身抗体结合并带有荧光标记的配体，所述荧光标记通过共价或非共价键任选通过接头分子连接。例如，配体可以是携带生物素标记的第二抗体，所述生物素标记与用荧光标记来标记的链霉亲和素结合。如果荧光配体包含一个以上的分子，更具体地说，第二抗体与自身抗体结合，并且通过非共价键，荧光分子与第二抗体结合，则可以任选地首先使自身抗体仅与第二抗体接触，然后与第二抗体孵育。然后可以例如通过洗涤将任何过量的配体与承载体分开。然后通过检查荧光配体是否存在来检测自身抗体的存在。在一个更优选的实施方案中，不需要检查荧光配体与另一种荧光配体的共定位。仅一种类型的荧光标记用于检测。
在一个优选的实施方案中，荧光配体特异性结合自身抗体，优选是在其识别自身抗体的Ig类、优选IgG的意义上，但基本上不结合任何其他Ig类。在一个优选的实施方案中，如本文所用的术语“特异性结合”是指结合比特征在于解离常数为1×10-5M，更优选为1×10-7M，更优选1×10-8M，更优选1×10-9M，更优选1×10-10M，更优选1×10-11M，更优选1×10- 12M的结合反应更强，如通过使用Biacore设备于25℃在pH 7的PBS缓冲液中进行的表面等离子体共振测定的。荧光配体可以是单克隆第二抗体或多克隆第二抗体。荧光配体可以是分离的和/或纯化的第二抗体。荧光配体可以携带单一类型的荧光标记。
根据本发明的承载体可以通过用表达一种或多种自身抗原的一个或多个细胞包被承载体(例如玻璃承载体)来制造。然后可以固定细胞。在一个优选的实施方案中，可以使用经固定的哺乳动物细胞。在一个优选的实施方案中，如本文所用的术语“经固定的”细胞是指已经用反应性化合物处理过的细胞，以使该细胞不再具有代谢活性，但仍呈现其表位用于用抗体进行免疫染色以及它们的随后检测，例如通过荧光。更优选地，反应性化合物选自丙酮、福尔马林、甲醇和乙醇或其混合物，优选福尔马林。本领域技术人员熟悉可用于制备经固定的细胞的方案。基本上，通过使用洗涤缓冲液洗涤附着在固体支持物上的细胞，然后与反应性化合物接触，例如浸入。
在一个优选的实施方案中，如本文所用的术语“自身抗体”是指特异性结合产生所述自身抗体的动物，优选哺乳动物，更优选人的内源性分子的抗体，其中此类抗体的水平更优选与一般健康受试者相比升高。在最优选的实施方案中，自身抗体是与哺乳动物(优选人)ACh受体结合的自身抗体。自身抗体可具有来自动物(优选人)的抗体恒定区的序列，使其成为动物的内源性分子，但可变区能够特异性结合动物的内源性分子，更具体地说是ACh受体。在一个优选的实施方案中，从动物(优选人)的样品(优选组织、血清、血浆、血液或CSF)中分离和/或纯化自身抗体。自身抗体是来自动物的多克隆天然抗体，而不是合成或重组抗体。优选地，它是人自身抗体。
根据本发明的方法优选是体外方法。
根据本发明，提供了一种试剂盒，其包含细胞或承载体，并且还包含一种或多种(优选所有)选自以下的试剂：针对ACh受体的自身抗体的配体(优选第二抗体，优选用荧光标记来标记)、洗涤缓冲液、阳性对照、阴性对照、洗涤剂、盖玻片、封固剂和生理盐溶液(优选PBS)或制备它所需的盐。在一个优选的实施方案中，阳性对照是经稀释的样品，优选来自罹患与ACh受体自身抗体或针对人ACh受体的单克隆抗体有关的疾病的患者的血清。阴性对照可以是来自健康受试者(例如献血者)的稀释的样品。试剂盒可包含如何进行测定的说明。
在一个优选的实施方案中，如本文所用的术语“免疫荧光测定”是指通过荧光检测自身抗体，更优选通过检测与所述自身抗体结合的荧光配体的存在或不存在来检测自身抗体，而所述自身抗体与其结合的所述自身抗原结合。自身抗原可以被细胞过表达，并且配体的存在或不存在可以通过使用荧光显微镜检测是否存在或不存在通过自身抗原在细胞上的位置确定的荧光信号(优选荧光模式)来确定。
在一个优选的实施方案中，根据本发明的任何细胞、方法、试剂盒、多肽、用途或承载体用于诊断自身免疫疾病，所述自身免疫疾病优选选自重症肌无力、LEMS和OMD。
在一个优选的实施方案中，如本文所用的术语“诊断”将以其最广泛的可能意义使用，并且可以是指旨在获得有助于评估患者是否罹患或可能或更可能比一般或比较受试者(后者优选具有相似的症状)在过去、诊断时或将来罹患某种疾病或病症的信息的任何种类的程序，以查明疾病如何进展或可能在将来进展或以评估一个或多个患者对于某种治疗(例如免疫抑制药物或免疫治疗的施用)总体上的反应性，或以查明样品是否来自此类患者。这样的信息可以用于临床诊断，但是也可以由实验和/或研究实验室出于一般研究目的而获得，例如以确定患者队列或群体中罹患该疾病的受试者的比例。换句话说，术语“诊断”不仅包括诊断，而且还包括诊断和/或监测疾病或病症的病程，包括监测一个或多个患者对药物或候选药物的施用的反应，例如以确定其功效。尽管可以将结果分配给特定患者以进行临床诊断应用，并且可以将结果传达给治疗所述患者的医生或机构，但对于其他应用(例如在出于研究目的的诊断中，其中足以将结果分配给来自匿名患者的样品)则不一定如此。在一个优选的实施方案中，根据本发明的方法和产品可以用于相互作用研究，包括确定候选药物或其他化合物是否可能干扰自身抗体与人ACh受体的结合或可能影响任何下游过程或它们与它们的靶标结合的强度。在优选的实施方案中，在施用诸如免疫抑制药物的药物后，它们可用于监测免疫应答，更优选监测针对人ACh受体的人自身抗体的自身抗体的出现和/或滴度。
在许多情况下，仅检测自身抗体，优选确定样品中是否存在可检测水平的抗体，就足以进行诊断。如果可以检测到自身抗体，这将是有助于临床医生诊断的信息，并表明患者罹患疾病的可能性增加。
本领域技术人员将理解，临床医生通常不会仅基于单个诊断参数就得出患者是否罹患或可能罹患疾病、病况或病症的结论，但需要考虑其他方面，例如其他自身抗体、标志物的存在，血液参数，患者症状的临床评估或医学成像或其他非侵入性方法(例如多导睡眠描记法)的结果以得出最终诊断。参见Baenkler H.W.(2012),General aspects ofautoimmune diagnostics，在Renz,H.,Autoimmune diagnostics,2012,de Gruyter,第3页。诊断剂或方法的价值也可能存在于排除一种疾病的可能性，从而允许间接诊断另一种疾病。在一个优选的实施方案中，本申请通篇提及的任何症状或疾病的含义与本领域技术人员截至申请日或优选地本申请的最早优先权日的理解相一致，如教科书和科学出版物所证明的那样。应该提到的是，单独使用本发明的方法或用途或产品不能用于得出明确的最终诊断。
在一个优选的实施方案中，术语“诊断”还可以指用于为患者选择最有希望的治疗方案的方法或药剂。换句话说，该方法或试剂可以涉及为受试者选择治疗方案。例如，自身抗体的检测可以指示要选择的免疫抑制疗法，其可以包括向患者施用一种或多种免疫抑制药物。
在一个优选的实施方案中，可将证明自身抗体的存在或不存在的任何信息或数据传达给患者或治疗该患者的医生，优选通过电话、书面形式或通过互联网(例如以电子邮件或短信的形式)。
在一个优选的实施方案中，根据本发明的任何方法或用途可以预期用于非诊断用途，即确定结合人ACh受体的自身抗体的存在以用于诊断患者以外的用途。例如，该方法或用途可用于体外测试设计用于从患者血液中去除自身抗体的医疗设备的效率，其中该测试是在除患者血液以外的液体上进行的。在患者使用医疗设备后，可以使包含针对人ACh受体的抗体的溶液运行通过设备来检查其去除自身抗体的能力，然后使用根据本发明的方法来确认很少或没有抗体存在于已通过设备的溶液中，即表明该设备仍具有从溶液中去除抗体的能力。
在一个优选的实施方案中，本发明提供了一种用于分析来自患者的样品以检测针对人ACh受体的自身抗体的装置，所述自身抗体指示疾病或发展疾病的增加的可能性，所述装置包括：
a)承载体，其包含当样品与承载体接触时用于从样品中捕获自身抗体的工具，其中所述工具是细胞并且所述承载体是根据本发明的承载体，
b)当可检测工具与承载体接触时，能够与承载体捕获的抗体结合的可检测工具，其中所述可检测工具优选是能够与承载体上捕获的自身抗体结合的荧光配体，
c)任选地，用于从承载体和可检测工具中去除任何样品的工具，优选通过洗涤；
d)检测设备，其用于检测可检测工具的存在或不存在并将结果转换为电信号，例如荧光读取器，其与能够在通过荧光读取器或照相机拍摄的细胞图像中识别根据本发明的承载体上的染色细胞的图案特征的软件连接，以及
任选地，用于从检测设备接收电子信号并通过与野生型或未染色的细胞(优选模拟转染的细胞或未被与同一承载体上的与人ACh受体结合的自身抗体阳性染色的细胞)的图案特征进行比较或与从健康受试者的样品中获得的输入参考值进行比较或将用一个样品获得的信号水平与用在较晚的时间点(优选至少一个月后)获得的第二样品获得的信号水平进行比较来确定该信号的水平是否指示患有疾病或发展疾病的可能性增加的工具。
附图说明
图1显示了代表性的生物芯片马赛克(Biochip mosaik)，其包含在十个区域中的每一个中的四个单独的面板中的细胞，更具体地，表达包含ε亚基的ACh受体的经固定的HEK293细胞(左上图)和表达包含γ亚基的ACh受体的经固定的HEK293细胞(左下图)。用包含ε亚基的ACh受体转染但不诱导表达的经固定的HEK293细胞(右上图)和用包含γ亚基的ACh受体转染但不诱导表达的经固定的HEK293细胞(左下图)作为阴性对照。
图2显示了在与包含针对包含ε亚基的ACh受体和包含γ亚基的ACh受体两者的自身抗体的样品孵育后，包含四个面板的角的荧光图像。面板包括(A)表达包含ε亚基的ACh受体的经固定的HEK293细胞(左上图)和(B)表达包含γ亚基的ACh受体的经固定的HEK293细胞(左下图)。(C)用包含ε亚基的ACh受体转染但不诱导表达的经固定的HEK293细胞(右上图)和(D)用包含γ亚基的ACh受体转染但不诱导表达的经固定的HEK293细胞(左下图)作为阴性对照。
序列
本发明包括一系列新的核酸和多肽序列，更具体地说：
SEQ ID NO：1CHRNA1(同种型1,UniProt:P02708-2)
Mepwpllllfslcsaglvlgsehetrlvaklfkdyssvvrpvedhrqvvevtvglqliqlinvdevnqivttnvrlkqqwvdynlkwnpddyggvkkihipsekiwrpdlvlynnadgdfaivkftkvllqytghitwtppaifksyceiivthfpfdeqncsmklgtwtydgsvvainpesdqpdlsnfmesgewvikesrgwkhsvtysccpdtpyldityhfvmqrlplyfivnviipcllfsfltglvfylptdsgekmtlsisvllsltvfllvivelipstssavpligkymlftmvfviasiiitvivinthhrspsthvmpnwvrkvfidtipnimffstmkrpsrekqdkkiftedidisdisgkpgpppmgfhsplikhpevksaiegikyiaetmksdqesnnaaaewkyvamvmdhillgvfmlvciigtlavfagrlielnqqg
SEQ ID NO：2CHRNB1(同种型1,UniProt:P11230-1)
Mtpgallmllgalgaplapgvrgseaegrlreklfsgydssvrparevgdrvrvsvglilaqlislnekdeemstkvyldlewtdyrlswdpaehdgidslritaesvwlpdvvllnnndgnfdvaldisvvvssdgsvrwqppgiyrsscsiqvtyfpfdwqnctmvfssysydssevslqtglgpdgqghqeihihegtfiengqweiihkpsrliqppgdprggregqrqevifyliirrkplfylvnviapcilitllaifvfylppdagekmglsifalltltvflllladkvpetslsvpiiikylmftmvlvtfsvilsvvvlnlhhrsphthqmplwvrqifihklplylrlkrpkperdlmpepphcsspgsgwgrgtdeyfirkppsdflfpkpnrfqpelsapdlrrfidgpnravallpelrevvssisyiarqlqeqedhdalkedwqfvamvvdrlflwtfiiftsvgtlvifldatyhlpppdpfp
SEQ ID NO：3CHRND(同种型1,UniProt:Q07001-1)
Megpvltlgllaalavcgswglneeerlirhlfqekgynkelrpvahkeesvdvalaltlsnlislkeveetlttnvwiehgwtdnrlkwnaeefgnisvlrlppdmvwlpeivlennndgsfqisyscnvlvyhygfvywlppaifrsscpisvtyfpfdwqncslkfsslkytakeitlslkqdakenrtypvewiiidpegftengeweivhrparvnvdprapldspsrqditfyliirrkplfyiinilvpcvlisfmvnlvfylpadsgektsvaisvllaqsvfllliskrlpatsmaipligkfllfgmvlvtmvvvicvivlnihfrtpsthvlsegvkklfletlpellhmsrpaedgpspgalvrrssslgyiskaeeyfllksrsdlmfekqserhglarrlttarrppasseqaqqelfnelkpavdganfivnhmrdqnnyneekdswnrvartvdrlclfvvtpvmvvgtawiflqgvynqpppqpfpgdpysynvqdkrfi
SEQ ID NO：4CHRNE(同种型1,UniProt:Q04844-1)
Maraplgvllllgllgrgvgkneelrlyhhlfnnydpgsrpvrepedtvtislkvtltnlislnekeetlttsvwigidwqdyrlnyskddfggietlrvpselvwlpeivlennidgqfgvaydanvlvyeggsvtwlppaiyrsvcavevtyfpfdwqncslifrsqtynaeeveftfavdndgktinkididteaytengewaidfcpgvirrhhggatdgpgetdviysliirrkplfyviniivpcvlisglvllayflpaqaggqkctvsinvllaqtvflfliaqkipetslsvpllgrflifvmvvatlivmncvivlnvsqrtptthamsprlrhvllellprllgsppppeapraaspprrassvglllraeelilkkprselvfegqrhrqgtwtaafcqslgaaapevrccvdavnfvaestrdqeatgeevsdwvrmgnaldnicfwaalvlfsvgssliflgayfnrvpdlpyapciqp
SEQ ID NO：5CHRNG(同种型1,UniProt:P07510-1)
mhggqgplllllllavclgaqgrnqeerlladlmqnydpnlrpaerdsdvvnvslkltltnlislnereealttnvwiemqwcdyrlrwdprdyeglwvlrvpstmvwrpdivlennvdgvfevalycnvlvspdgciywlppaifrsacsisvtyfpfdwqncslifqsqtystneidlqlsqedgqtiewifidpeaftengewaiqhrpakmlldpaapaqeaghqkvvfylliqrkplfyviniiapcvlissvailihflpakaggqkctvainvllaqtvflflvakkvpetsqavpliskyltfllvvtilivvnavvvlnvslrsphthsmargvrkvflrllpqllrmhvrplapaavqdtqsrlqngssgwsittgeevalclprsellfqqwqrqglvaaaleklekgpelglsqfcgslkqaapaiqacveacnliacarhqqshfdngneewflvgrvldrvcflamlslficgtagiflmahynrvpalpfpgdprpylpspd
SEQ ID NO：6Rapsyn(同种型1,Uni-Prot:Q13702-1)
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SEQ ID NO：7pTriEx-1-CHRNA1
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SEQ ID NO：9 pTriEx-1-CHRND
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SEQ ID NO：11 pTriEx-1-CHRNG
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SEQ ID NO：12 pTriEx-1-RAPSyn
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SEQ ID NO：13>MuSK
MRELVNIPLVHILTLVAFSGTEKLPKAPVITTPLETVDALVEEVATFMCAVESYPQPEISWTRNKILIKLFDTRYSIRENGQLLTILSVEDSDDGIYCCTANNGVGGAVESCGALQVKMKPKITRPPINVKIIEGLKAVLPCTTMGNPKPSVSWIKGDSPLRENSRIAVLESGSLRIHNVQKEDAGQYRCVAKNSLGTAYSKVVKLEVEVFARILRAPESHNVTFGSFVTLHCTATGIPVPTITWIENGNAVSSGSIQESVKDRVIDSRLQLFITKPGLYTCIATNKHGEKFSTAKAAATISIAEWSKPQKDNKGYCAQYRGEVCNAVLAKDALVFLNTSYADPEEAQELLVHTAWNELKVVSPVCRPAAEALLCNHIFQECSPGVVPTPIPICREYCLAVKELFCAKEWLVMEEKTHRGLYRSEMHLLSVPECSKLPSMHWDPTACARLPHLAFPPMTSSKPSVDIPNLPSSSSSSFSVSPTYSMTVIISIMSSFAIFVLLTITTLYCCRRRKQWKNKKRESAAVTLTTLPSELLLDRLHPNPMYQRMPLLLNPKLLSLEYPRNNIEYVRDIGEGAFGRVFQARAPGLLPYEPFTMVAVKMLKEEASADMQADFQREAALMAEFDNPNIVKLLGVCAVGKPMCLLFEYMAYGDLNEFLRSMSPHTVCSLSHSDLSMRAQVSSPGPPPLSCAEQLCIARQVAAGMAYLSERKFVHRDLATRNCLVGENMVVKIADFGLSRNIYSADYYKANENDAIPIRWMPPESIFYNRYTTESDVWAYGVVLWEIFSYGLQPYYGMAHEEVIYYVRDGNILSCPENCPVELYNLMRLCWSKLPADRPSFTSIHRILERMCERAEGTVSV
SEQ ID NO：14>pTriEx-1-MuSK
GGGGAATTGTGAGCGGATAACAATTCCCCGGAGTTAATCCGGGACCTTTAATTCAACCCAACACAATATATTATAGTTAAATAAGAATTATTATCAAATCATTTGTATATTAATTAAAATACTATACTGTAAATTACATTTTATTTACAATCAAAGGAGATATACCATGAGAGAGCTCGTCAACATTCCACTGGTACATATTCTTACTCTGGTTGCCTTCAGCGGAACTGAGAAACTTCCAAAAGCTCCTGTCATCACCACTCCTCTTGAAACAGTGGATGCCTTAGTTGAAGAAGTGGCTACTTTCATGTGTGCAGTGGAATCCTACCCCCAGCCTGAGATTTCCTGGACTAGAAATAAAATTCTCATTAAACTCTTTGACACCCGGTACAGCATCCGGGAGAATGGGCAGCTCCTCACCATCCTGAGTGTGGAAGACAGTGATGATGGCATTTACTGCTGCACGGCCAACAATGGTGTGGGAGGAGCTGTGGAGAGTTGTGGAGCCCTGCAAGTGAAGATGAAACCTAAAATAACTCGTCCTCCCATAAATGTGAAAATAATAGAGGGATTAAAAGCAGTCCTACCATGTACTACAATGGGTAATCCCAAACCATCAGTGTCTTGGATAAAGGGAGACAGCCCACTCAGGGAAAATTCCCGAATTGCAGTTCTTGAATCTGGGAGCTTGAGGATTCATAACGTACAAAAGGAAGATGCAGGACAGTATCGATGTGTGGCAAAAAACAGCCTCGGGACAGCATATTCCAAAGTGGTGAAGCTGGAAGTTGAGGTTTTTGCCAGGATCCTGCGGGCTCCTGAATCCCACAATGTCACCTTTGGCTCCTTTGTGACCCTGCACTGTACAGCAACAGGCATTCCTGTCCCCACCATCACCTGGATTGAAAACGGAAATGCTGTTTCTTCTGGGTCCATTCAAGAGAGTGTGAAAGACCGAGTGATTGACTCAAGACTGCAGCTGTTTATCACCAAGCCAGGACTCTACACATGCATAGCTACCAATAAGCATGGGGAGAAGTTCAGTACTGCCAAGGCTGCAGCCACCATCAGCATAGCAGAATGGAGTAAACCACAGAAAGATAACAAAGGCTACTGCGCCCAGTACAGAGGGGAGGTGTGTAATGCAGTCCTGGCAAAAGATGCTCTTGTTTTTCTCAACACCTCCTATGCGGACCCTGAGGAGGCCCAAGAGCTACTGGTCCACACGGCCTGGAATGAACTGAAAGTAGTGAGCCCAGTCTGCCGGCCAGCTGCTGAGGCTTTGTTGTGTAACCACATCTTCCAGGAGTGCAGTCCTGGAGTAGTGCCTACTCCTATTCCCATTTGCAGAGAGTACTGCTTGGCAGTAAAGGAGCTCTTCTGCGCAAAAGAATGGCTGGTAATGGAAGAGAAGACCCACAGAGGACTCTACAGATCCGAGATGCATTTGCTGTCCGTGCCAGAATGCAGCAAGCTTCCCAGCATGCATTGGGACCCCACGGCCTGTGCCAGACTGCCACATCTAGCATTCCCACCAATGACGTCCTCAAAGCCAAGTGTGGACATTCCAAACCTGCCTTCCTCCTCCTCTTCTTCCTTCTCTGTCTCACCTACATACTCCATGACTGTAATAATCTCCATCATGTCCAGCTTTGCAATATTTGTGCTTCTTACCATAACTACTCTCTATTGCTGCCGAAGAAGAAAACAATGGAAAAATAAGAAAAGAGAATCAGCAGCAGTAACCCTCACCACACTGCCTTCTGAGCTCTTACTAGATAGACTTCATCCCAACCCCATGTACCAGAGGATGCCGCTCCTTCTGAACCCCAAATTGCTCAGCCTGGAGTATCCAAGGAATAACATTGAATATGTGAGAGACATCGGAGAGGGAGCGTTTGGAAGGGTGTTTCAAGCAAGGGCACCAGGCTTACTTCCCTATGAACCTTTCACTATGGTGGCAGTAAAGATGCTCAAAGAAGAAGCCTCGGCAGATATGCAAGCGGACTTTCAGAGGGAGGCAGCCCTCATGGCAGAATTTGACAACCCTAACATTGTGAAGCTATTAGGAGTGTGTGCTGTCGGGAAGCCAATGTGCCTGCTCTTTGAATACATGGCCTATGGTGACCTCAATGAGTTCCTCCGCAGCATGTCCCCTCACACCGTGTGCAGCCTCAGTCACAGTGACTTGTCTATGAGGGCTCAGGTCTCCAGCCCTGGGCCCCCACCCCTCTCCTGTGCTGAGCAGCTTTGCATTGCCAGGCAGGTGGCAGCTGGCATGGCTTACCTCTCAGAACGTAAGTTTGTTCACCGAGATTTAGCCACCAGGAACTGCCTGGTGGGCGAGAACATGGTGGTGAAAATTGCCGACTTTGGCCTCTCCAGGAACATCTACTCAGCAGACTACTACAAAGCTAATGAAAACGACGCTATCCCTATCCGTTGGATGCCACCAGAGTCCATTTTTTATAACCGCTACACTACAGAGTCTGATGTGTGGGCCTATGGCGTGGTCCTCTGGGAGATCTTCTCCTATGGCCTGCAGCCCTACTATGGGATGGCCCATGAGGAGGTCATTTACTACGTGCGAGATGGCAACATCCTCTCCTGCCCTGAGAACTGCCCCGTGGAGCTGTACAATCTCATGCGTCTATGTTGGAGCAAGCTGCCTGCAGACAGACCCAGTTTCACCAGTATTCACCGAATTCTGGAACGCATGTGTGAGAGGGCAGAGGGAACTGTGAGTGTCTAACTCGAGCACCACCATCACCATCACCATCACTAAGTGATTAACCTCAGGTGCAGGCTGCCTATCAGAAGGTGGTGGCTGGTGTGGCCAATGCCCTGGCTCACAAATACCACTGAGATCGATCTTTTTCCCTCTGCCAAAAATTATGGGGACATCATGAAGCCCCTTGAGCATCTGACTTCTGGCTAATAAAGGAAATTTATTTTCATTGCAATAGTGTGTTGGAATTTTTTGTGTCTCTCACTCGGAAGGACATATGGGAGGGCAAATCATTTAAAACATCAGAATGAGTATTTGGTTTAGAGTTTGGCAACATATGCCCATATGTAACTAGCATAACCCCTTGGGGCCTCTAAACGGGTCTTGAGGGGTTTTTTGCTGAAAGCATGCGGAGGAAATTCTCCTTGAAGTTTCCCTGGTGTTCAAAGTAAAGGAGTTTGCACCAGACGCACCTCTGTTCACTGGTCCGGCGTATTAAAACACGATACATTGTTATTAGTACATTTATTAAGCGCTAGATTCTGTGCGTTGTTGATTTACAGACAATTGTTGTACGTATTTTAATAATTCATTAAATTTATAATCTTTAGGGTGGTATGTTAGAGCGAAAATCAAATGATTTTCAGCGTCTTTATATCTGAATTTAAATATTAAATCCTCAATAGATTTGTAAAATAGGTTTCGATTAGTTTCAAACAAGGGTTGTTTTTCCGAACCGATGGCTGGACTATCTAATGGATTTTCGCTCAACGCCACAAAACTTGCCAAATCTTGTAGCAGCAATCTAGCTTTGTCGATATTCGTTTGTGTTTTGTTTTGTAATAAAGGTTCGACGTCGTTCAAAATATTATGCGCTTTTGTATTTCTTTCATCACTGTCGTTAGTGTACAATTGACTCGACGTAAACACGTTAAATAGAGCTTGGACATATTTAACATCGGGCGTGTTAGCTTTATTAGGCCGATTATCGTCGTCGTCCCAACCCTCGTCGTTAGAAGTTGCTTCCGAAGACGATTTTGCCATAGCCACACGACGCCTATTAATTGTGTCGGCTAACACGTCCGCGATCAAATTTGTAGTTGAGCTTTTTGGAATTATTTCTGATTGCGGGCGTTTTTGGGCGGGTTTCAATCTAACTGTGCCCGATTTTAATTCAGACAACACGTTAGAAAGCGATGGTGCAGGCGGTGGTAACATTTCAGACGGCAAATCTACTAATGGCGGCGGTGGTGGAGCTGATGATAAATCTACCATCGGTGGAGGCGCAGGCGGGGCTGGCGGCGGAGGCGGAGGCGGAGGTGGTGGCGGTGATGCAGACGGCGGTTTAGGCTCAAATGTCTCTTTAGGCAACACAGTCGGCACCTCAACTATTGTACTGGTTTCGGGCGCCGTTTTTGGTTTGACCGGTCTGAGACGAGTGCGATTTTTTTCGTTTCTAATAGCTTCCAACAATTGTTGTCTGTCGTCTAAAGGTGCAGCGGGTTGAGGTTCCGTCGGCATTGGTGGAGCGGGCGGCAATTCAGACATCGATGGTGGTGGTGGTGGTGGAGGCGCTGGAATGTTAGGCACGGGAGAAGGTGGTGGCGGCGGTGCCGCCGGTATAATTTGTTCTGGTTTAGTTTGTTCGCGCACGATTGTGGGCACCGGCGCAGGCGCCGCTGGCTGCACAACGGAAGGTCGTCTGCTTCGAGGCAGCGCTTGGGGTGGTGGCAATTCAATATTATAATTGGAATACAAATCGTAAAAATCTGCTATAAGCATTGTAATTTCGCTATCGTTTACCGTGCCGATATTTAACAACCGCTCAATGTAAGCAATTGTATTGTAAAGAGATTGTCTCAAGCTCGGAACGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCAATGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGGACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGTCCGCGCGTTTCCTGCATCTTTTAATCAAATCCCAAGATGTGTATAAACCACCAAACTGCCAAAAAATGAAAACTGTCGACAAGCTCTGTCCGTTTGCTGGCAACTGCAAGGGTCTCAATCCTATTTGTAATTATTGAATAATAAAACAATTATAAATGTCAAATTTGTTTTTTATTAACGATACAAACCAAACGCAACAAGAACATTTGTAGTATTATCTATAATTGAAAACGCGTAGTTATAATCGCTGAGGTAATATTTAAAATCATTTTCAAATGATTCACAGTTAATTTGCGACAATATAATTTTATTTTCACATAAACTAGACGCCTTGTCGTCTTCTTCTTCGTATTCCTTCTCTTTTTCATTTTTCTCTTCATAAAAATTAACATAGTTATTATCGTATCCATATATGTATCTATCGTATAGAGTAAATTTTTTGTTGTCATAAATATATATGTCTTTTTTAATGGGGTGTATAGTACCGCTGCGCATAGTTTTTCTGTAATTTACAACAGTGCTATTTTCTGGTAGTTCTTCGGAGTGTGTTGCTTTAATTATTAAATTTATATAATCAATGAATTTGGGATCGTCGGTTTTGTACAATATGTTGCCGGCATAGTACGCAGCTTCTTCTAGTTCAATTACACCATTTTTTAGCAGCACCGGATTAACATAACTTTCCAAAATGTTGTACGAACCGTTAAACAAAAACAGTTCACCTCCCTTTTCTATACTATTGTCTGCGAGCAGTTGTTTGTTGTTAAAAATAACAGCCATTGTAATGAGACGCACAAACTAATATCACAAACTGGAAATGTCTATCAATATATAGTTGCTCTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGACTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGCATGGTCGAGGTGAGCCCCACGTTCTGCTTCACTCTCCCCATCTCCCCCCCCTCCCCACCCCCAATTTTGTATTTATTTATTTTTTAATTATTTTGTGCAGCGATGGGGGCGGGGGGGGGGGGGGGGCGCGCGCCAGGCGGGGCGGGGCGGGGCGAGGGGCGGGGCGGGGCGAGGCGGAGAGGTGCGGCGGCAGCCAATCAGAGCGGCGCGCTCCGAAAGTTTCCTTTTATGGCGAGGCGGCGGCGGCGGCGGCCCTATAAAAAGCGAAGCGCGCGGCGGGCGGGAGTCGCTGCGACGCTGCCTTCGCCCCGTGCCCCGCTCCGCCGCCGCCTCGCGCCGCCCGCCCCGGCTCTGACTGACCGCGTTACTCCCACAGGTGAGCGGGCGGGACGGCCCTTCTCCTTCGGGCTGTAATTAGCGCTTGGTTTAATGACGGCTTGTTTCTTTTCTGTGGCTGCGTGAAAGCCTTGAGGGGCTCCGGGAGGGCCCTTTGTGCGGGGGGAGCGGCTCGGGGCTGTCCGCGGGGGGACGGCTGCCTTCGGGGGGGACGGGGCAGGGCGGGGTTCGGCTTCTGGCGTGTGACCGGCGGCTCTAGAGCCTCTGCTAACCATGTTCATGCCTTCTTCTTTTTCCTACAGCTCCTGGGCAACGTGCTGGTTATTGTGCTGTCTCATCATTTTGGCAAAGAATTGGATCGGACCGAAATTAATACGACTCACTATA
实施例
实施例：增强间接免疫荧光测试对直接检测针对ACh受体的自身抗体的灵敏度
如通过RIA(EUROIMMUN Medizinische Labordiagnostika AG,RA 1435-1，根据制造商的说明进行)所证明的60个样品包含针对ACh受体的自身抗体，对这些样品进行免疫荧光分析。
制备了一种生物芯片马赛克，其包含具有表达包含ε亚基的ACh受体的经固定的HEK293细胞的面板和包被有表达包含γ亚基的ACh受体的经固定的HEK293细胞的面板(图1)。通过用质粒pTriEx-1-CHRNA1(SEQ ID NO：7，α亚基)、pTriEx-1-CHRNB1(SEQ ID NO：8，β亚基)、pTriEx-1-CHRND(SEQ ID NO：9，δ亚基)、pTriEx-1-RAPSyn(SEQ ID NO：12)和pTriEx-1-CHRNE(SEQ ID NO：10，ε亚基)或pTriEx-1-CHRNG(SEQ ID NO：11，γ亚基))转染根据标准实验方案培养的HEK293细胞来制备细胞。Invitrogen为T-RexTM系统(目录号K1020-01，2011年)提供的方案用于稳定转染。但是，使用ExGen500(目录号12783652，Thermofisher)而不是Lipofectamin。根据制造商的说明，然后将包被的细胞浸入福尔马林中来进行固定，然后洗涤。使用等量的所有载体。
随后使用FA_112d-1_A_DE_C13手册中用合适的试剂描述的Titerplane技术，并进行了少量修改。基本上将人血清样品在SAMPLE BUFFER中以1:10稀释，然后将30μl经稀释的样品置于生物芯片上并孵育30分钟。使用PBS 0.2％Tween洗去未结合的IgG。通过将底物与25-30μl CONJUGATE_1(生物素化的山羊抗人IgG，EUROIMMUN)孵育，用PBS-Tween洗涤以及将底物与25μl CONJUGATE_2(荧光素标记的extravidin，EUROIMMUN)孵育来检测任何结合的IgG。一个示例如图2所示。然后，根据制造商的说明，使用EUROStar Bluelight显微镜(EUROIMMUN Medizinische Labordiagnostika AG,Lübeck)对样品进行分析。
结果：
55/60个样品可显示含有针对AchR的自身抗体。仅当包含ε亚基的ACh受体用作抗原时，才将3/60鉴定为阳性。仅当使用包含γ亚基的ACh受体时，2/60才能被鉴定为阳性。
结论：
包含针对ACh受体的自身抗体的一些样品仅在对组装的受体中的ε或γ亚基是单特异性时包含自身抗体。
仅当使用包含胎儿亚基的ACh受体时，某些样品甚至可显示为阳性。这与George等人(George,S.,Noack,M.,Vanek,M.,Rentzsch,J.,
Figure BDA0002845351780000371
N.,Conrad,K.,Roggenbuck,D.,和Küpper,J.H.(2015)Expression of nicotinic acetylcholine receptor subunitsin HEp-2cells for immunodetection of autoantibodies specificities in serafrom Myasthenia gravis patients,Clin.Hamorheology and Microcirculation DOI10.3233/CH-15199)完全相反。
RIA中一定数量的阳性样品不能被鉴定为阳性。但是，还应该记住，据报道RIA偶尔会产生假阳性结果(Maddison,P.,Sadalage,G.,Ambrose,P.A.,Jacob,S.,和Vincent,A.(2019)False-positive acetylcholine receptor antibody results in patientswithout myasthenia gravis,J.Neuroimm.332,69-72)。
因此，至少在检测自身抗体的存在或不存在而非共定位时，应将两种受体的组合用于免疫荧光分析。
序列表
<110> 欧蒙医学实验诊断股份公司
<120> 用于检测针对乙酰胆碱受体的自身抗体的方法
<130> 19PP166EP1
<160> 14
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 457
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 1
Met Glu Pro Trp Pro Leu Leu Leu Leu Phe Ser Leu Cys Ser Ala Gly
1 5 10 15
Leu Val Leu Gly Ser Glu His Glu Thr Arg Leu Val Ala Lys Leu Phe
20 25 30
Lys Asp Tyr Ser Ser Val Val Arg Pro Val Glu Asp His Arg Gln Val
35 40 45
Val Glu Val Thr Val Gly Leu Gln Leu Ile Gln Leu Ile Asn Val Asp
50 55 60
Glu Val Asn Gln Ile Val Thr Thr Asn Val Arg Leu Lys Gln Gln Trp
65 70 75 80
Val Asp Tyr Asn Leu Lys Trp Asn Pro Asp Asp Tyr Gly Gly Val Lys
85 90 95
Lys Ile His Ile Pro Ser Glu Lys Ile Trp Arg Pro Asp Leu Val Leu
100 105 110
Tyr Asn Asn Ala Asp Gly Asp Phe Ala Ile Val Lys Phe Thr Lys Val
115 120 125
Leu Leu Gln Tyr Thr Gly His Ile Thr Trp Thr Pro Pro Ala Ile Phe
130 135 140
Lys Ser Tyr Cys Glu Ile Ile Val Thr His Phe Pro Phe Asp Glu Gln
145 150 155 160
Asn Cys Ser Met Lys Leu Gly Thr Trp Thr Tyr Asp Gly Ser Val Val
165 170 175
Ala Ile Asn Pro Glu Ser Asp Gln Pro Asp Leu Ser Asn Phe Met Glu
180 185 190
Ser Gly Glu Trp Val Ile Lys Glu Ser Arg Gly Trp Lys His Ser Val
195 200 205
Thr Tyr Ser Cys Cys Pro Asp Thr Pro Tyr Leu Asp Ile Thr Tyr His
210 215 220
Phe Val Met Gln Arg Leu Pro Leu Tyr Phe Ile Val Asn Val Ile Ile
225 230 235 240
Pro Cys Leu Leu Phe Ser Phe Leu Thr Gly Leu Val Phe Tyr Leu Pro
245 250 255
Thr Asp Ser Gly Glu Lys Met Thr Leu Ser Ile Ser Val Leu Leu Ser
260 265 270
Leu Thr Val Phe Leu Leu Val Ile Val Glu Leu Ile Pro Ser Thr Ser
275 280 285
Ser Ala Val Pro Leu Ile Gly Lys Tyr Met Leu Phe Thr Met Val Phe
290 295 300
Val Ile Ala Ser Ile Ile Ile Thr Val Ile Val Ile Asn Thr His His
305 310 315 320
Arg Ser Pro Ser Thr His Val Met Pro Asn Trp Val Arg Lys Val Phe
325 330 335
Ile Asp Thr Ile Pro Asn Ile Met Phe Phe Ser Thr Met Lys Arg Pro
340 345 350
Ser Arg Glu Lys Gln Asp Lys Lys Ile Phe Thr Glu Asp Ile Asp Ile
355 360 365
Ser Asp Ile Ser Gly Lys Pro Gly Pro Pro Pro Met Gly Phe His Ser
370 375 380
Pro Leu Ile Lys His Pro Glu Val Lys Ser Ala Ile Glu Gly Ile Lys
385 390 395 400
Tyr Ile Ala Glu Thr Met Lys Ser Asp Gln Glu Ser Asn Asn Ala Ala
405 410 415
Ala Glu Trp Lys Tyr Val Ala Met Val Met Asp His Ile Leu Leu Gly
420 425 430
Val Phe Met Leu Val Cys Ile Ile Gly Thr Leu Ala Val Phe Ala Gly
435 440 445
Arg Leu Ile Glu Leu Asn Gln Gln Gly
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<212> PRT
<213> 智人
<400> 2
Met Thr Pro Gly Ala Leu Leu Met Leu Leu Gly Ala Leu Gly Ala Pro
1 5 10 15
Leu Ala Pro Gly Val Arg Gly Ser Glu Ala Glu Gly Arg Leu Arg Glu
20 25 30
Lys Leu Phe Ser Gly Tyr Asp Ser Ser Val Arg Pro Ala Arg Glu Val
35 40 45
Gly Asp Arg Val Arg Val Ser Val Gly Leu Ile Leu Ala Gln Leu Ile
50 55 60
Ser Leu Asn Glu Lys Asp Glu Glu Met Ser Thr Lys Val Tyr Leu Asp
65 70 75 80
Leu Glu Trp Thr Asp Tyr Arg Leu Ser Trp Asp Pro Ala Glu His Asp
85 90 95
Gly Ile Asp Ser Leu Arg Ile Thr Ala Glu Ser Val Trp Leu Pro Asp
100 105 110
Val Val Leu Leu Asn Asn Asn Asp Gly Asn Phe Asp Val Ala Leu Asp
115 120 125
Ile Ser Val Val Val Ser Ser Asp Gly Ser Val Arg Trp Gln Pro Pro
130 135 140
Gly Ile Tyr Arg Ser Ser Cys Ser Ile Gln Val Thr Tyr Phe Pro Phe
145 150 155 160
Asp Trp Gln Asn Cys Thr Met Val Phe Ser Ser Tyr Ser Tyr Asp Ser
165 170 175
Ser Glu Val Ser Leu Gln Thr Gly Leu Gly Pro Asp Gly Gln Gly His
180 185 190
Gln Glu Ile His Ile His Glu Gly Thr Phe Ile Glu Asn Gly Gln Trp
195 200 205
Glu Ile Ile His Lys Pro Ser Arg Leu Ile Gln Pro Pro Gly Asp Pro
210 215 220
Arg Gly Gly Arg Glu Gly Gln Arg Gln Glu Val Ile Phe Tyr Leu Ile
225 230 235 240
Ile Arg Arg Lys Pro Leu Phe Tyr Leu Val Asn Val Ile Ala Pro Cys
245 250 255
Ile Leu Ile Thr Leu Leu Ala Ile Phe Val Phe Tyr Leu Pro Pro Asp
260 265 270
Ala Gly Glu Lys Met Gly Leu Ser Ile Phe Ala Leu Leu Thr Leu Thr
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Val Phe Leu Leu Leu Leu Ala Asp Lys Val Pro Glu Thr Ser Leu Ser
290 295 300
Val Pro Ile Ile Ile Lys Tyr Leu Met Phe Thr Met Val Leu Val Thr
305 310 315 320
Phe Ser Val Ile Leu Ser Val Val Val Leu Asn Leu His His Arg Ser
325 330 335
Pro His Thr His Gln Met Pro Leu Trp Val Arg Gln Ile Phe Ile His
340 345 350
Lys Leu Pro Leu Tyr Leu Arg Leu Lys Arg Pro Lys Pro Glu Arg Asp
355 360 365
Leu Met Pro Glu Pro Pro His Cys Ser Ser Pro Gly Ser Gly Trp Gly
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Arg Gly Thr Asp Glu Tyr Phe Ile Arg Lys Pro Pro Ser Asp Phe Leu
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Phe Pro Lys Pro Asn Arg Phe Gln Pro Glu Leu Ser Ala Pro Asp Leu
405 410 415
Arg Arg Phe Ile Asp Gly Pro Asn Arg Ala Val Ala Leu Leu Pro Glu
420 425 430
Leu Arg Glu Val Val Ser Ser Ile Ser Tyr Ile Ala Arg Gln Leu Gln
435 440 445
Glu Gln Glu Asp His Asp Ala Leu Lys Glu Asp Trp Gln Phe Val Ala
450 455 460
Met Val Val Asp Arg Leu Phe Leu Trp Thr Phe Ile Ile Phe Thr Ser
465 470 475 480
Val Gly Thr Leu Val Ile Phe Leu Asp Ala Thr Tyr His Leu Pro Pro
485 490 495
Pro Asp Pro Phe Pro
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<212> PRT
<213> 智人
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Phe Gln Glu Lys Gly Tyr Asn Lys Glu Leu Arg Pro Val Ala His Lys
35 40 45
Glu Glu Ser Val Asp Val Ala Leu Ala Leu Thr Leu Ser Asn Leu Ile
50 55 60
Ser Leu Lys Glu Val Glu Glu Thr Leu Thr Thr Asn Val Trp Ile Glu
65 70 75 80
His Gly Trp Thr Asp Asn Arg Leu Lys Trp Asn Ala Glu Glu Phe Gly
85 90 95
Asn Ile Ser Val Leu Arg Leu Pro Pro Asp Met Val Trp Leu Pro Glu
100 105 110
Ile Val Leu Glu Asn Asn Asn Asp Gly Ser Phe Gln Ile Ser Tyr Ser
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Cys Asn Val Leu Val Tyr His Tyr Gly Phe Val Tyr Trp Leu Pro Pro
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Ala Ile Phe Arg Ser Ser Cys Pro Ile Ser Val Thr Tyr Phe Pro Phe
145 150 155 160
Asp Trp Gln Asn Cys Ser Leu Lys Phe Ser Ser Leu Lys Tyr Thr Ala
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Gly Glu Trp Glu Ile Val His Arg Pro Ala Arg Val Asn Val Asp Pro
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Arg Ala Pro Leu Asp Ser Pro Ser Arg Gln Asp Ile Thr Phe Tyr Leu
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Ile Ile Arg Arg Lys Pro Leu Phe Tyr Ile Ile Asn Ile Leu Val Pro
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Cys Val Leu Ile Ser Phe Met Val Asn Leu Val Phe Tyr Leu Pro Ala
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Ala Ile Pro Leu Ile Gly Lys Phe Leu Leu Phe Gly Met Val Leu Val
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Asn Asn Tyr Asp Pro Gly Ser Arg Pro Val Arg Glu Pro Glu Asp Thr
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Val Thr Ile Ser Leu Lys Val Thr Leu Thr Asn Leu Ile Ser Leu Asn
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<211> 517
<212> PRT
<213> 智人
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ggcaaatcat ttaaaacatc agaatgagta tttggtttag agtttggcaa catatgccca 1860
tatgtaacta gcataacccc ttggggcctc taaacgggtc ttgaggggtt ttttgctgaa 1920
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cagacgcacc tctgttcact ggtccggcgt attaaaacac gatacattgt tattagtaca 2040
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ataattcatt aaatttataa tctttagggt ggtatgttag agcgaaaatc aaatgatttt 2160
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ggggaattgt gagcggataa caattccccg gagttaatcc gggaccttta attcaaccca 60
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ggtgcaggcg ctgctgggtg tggccaagtg ctgggtggcc aggaaggcgc tggacaaggc 1080
tctggatgcc atcgagagag cccaggatct ggccgaggag gtggggaaca agctgagcca 1140
gctcaagctg cactgtctga gcgagagcat ttaccgcagc aaagggctgc agcgggaact 1200
gcgggcgcac gttgtgaggt tccacgagtg cgtggaggag acggagctct actgcggcct 1260
gtgcggcgag tccataggcg agaagaacag ccggctgcag gccctacctt gctcccacat 1320
cttccacctc aggtgcctgc agaacaacgg gacccggagc tgtcccaact gccgccgctc 1380
atccatgaag cctggctttg tataactcga gcaccaccat caccatcacc atcactaagt 1440
gattaacctc aggtgcaggc tgcctatcag aaggtggtgg ctggtgtggc caatgccctg 1500
gctcacaaat accactgaga tcgatctttt tccctctgcc aaaaattatg gggacatcat 1560
gaagcccctt gagcatctga cttctggcta ataaaggaaa tttattttca ttgcaatagt 1620
gtgttggaat tttttgtgtc tctcactcgg aaggacatat gggagggcaa atcatttaaa 1680
acatcagaat gagtatttgg tttagagttt ggcaacatat gcccatatgt aactagcata 1740
accccttggg gcctctaaac gggtcttgag gggttttttg ctgaaagcat gcggaggaaa 1800
ttctccttga agtttccctg gtgttcaaag taaaggagtt tgcaccagac gcacctctgt 1860
tcactggtcc ggcgtattaa aacacgatac attgttatta gtacatttat taagcgctag 1920
attctgtgcg ttgttgattt acagacaatt gttgtacgta ttttaataat tcattaaatt 1980
tataatcttt agggtggtat gttagagcga aaatcaaatg attttcagcg tctttatatc 2040
tgaatttaaa tattaaatcc tcaatagatt tgtaaaatag gtttcgatta gtttcaaaca 2100
agggttgttt ttccgaaccg atggctggac tatctaatgg attttcgctc aacgccacaa 2160
aacttgccaa atcttgtagc agcaatctag ctttgtcgat attcgtttgt gttttgtttt 2220
gtaataaagg ttcgacgtcg ttcaaaatat tatgcgcttt tgtatttctt tcatcactgt 2280
cgttagtgta caattgactc gacgtaaaca cgttaaatag agcttggaca tatttaacat 2340
cgggcgtgtt agctttatta ggccgattat cgtcgtcgtc ccaaccctcg tcgttagaag 2400
ttgcttccga agacgatttt gccatagcca cacgacgcct attaattgtg tcggctaaca 2460
cgtccgcgat caaatttgta gttgagcttt ttggaattat ttctgattgc gggcgttttt 2520
gggcgggttt caatctaact gtgcccgatt ttaattcaga caacacgtta gaaagcgatg 2580
gtgcaggcgg tggtaacatt tcagacggca aatctactaa tggcggcggt ggtggagctg 2640
atgataaatc taccatcggt ggaggcgcag gcggggctgg cggcggaggc ggaggcggag 2700
gtggtggcgg tgatgcagac ggcggtttag gctcaaatgt ctctttaggc aacacagtcg 2760
gcacctcaac tattgtactg gtttcgggcg ccgtttttgg tttgaccggt ctgagacgag 2820
tgcgattttt ttcgtttcta atagcttcca acaattgttg tctgtcgtct aaaggtgcag 2880
cgggttgagg ttccgtcggc attggtggag cgggcggcaa ttcagacatc gatggtggtg 2940
gtggtggtgg aggcgctgga atgttaggca cgggagaagg tggtggcggc ggtgccgccg 3000
gtataatttg ttctggttta gtttgttcgc gcacgattgt gggcaccggc gcaggcgccg 3060
ctggctgcac aacggaaggt cgtctgcttc gaggcagcgc ttggggtggt ggcaattcaa 3120
tattataatt ggaatacaaa tcgtaaaaat ctgctataag cattgtaatt tcgctatcgt 3180
ttaccgtgcc gatatttaac aaccgctcaa tgtaagcaat tgtattgtaa agagattgtc 3240
tcaagctcgg aacgctgcgc tcggtcgttc ggctgcggcg agcggtatca gctcactcaa 3300
aggcggtaat acggttatcc acagaatcag gggataacgc aggaaagaac atgtgagcaa 3360
aaggccagca aaaggccagg aaccgtaaaa aggccgcgtt gctggcgttt ttccataggc 3420
tccgcccccc tgacgagcat cacaaaaatc gacgctcaag tcagaggtgg cgaaacccga 3480
caggactata aagataccag gcgtttcccc ctggaagctc cctcgtgcgc tctcctgttc 3540
cgaccctgcc gcttaccgga tacctgtccg cctttctccc ttcgggaagc gtggcgcttt 3600
ctcaatgctc acgctgtagg tatctcagtt cggtgtaggt cgttcgctcc aagctgggct 3660
gtgtgcacga accccccgtt cagcccgacc gctgcgcctt atccggtaac tatcgtcttg 3720
agtccaaccc ggtaagacac gacttatcgc cactggcagc agccactggt aacaggatta 3780
gcagagcgag gtatgtaggc ggtgctacag agttcttgaa gtggtggcct aactacggct 3840
acactagaag gacagtattt ggtatctgcg ctctgctgaa gccagttacc ttcggaaaaa 3900
gagttggtag ctcttgatcc ggcaaacaaa ccaccgctgg tagcggtggt ttttttgttt 3960
gcaagcagca gattacgcgc agaaaaaaag gatctcaaga agatcctttg ttaccaatgc 4020
ttaatcagtg aggcacctat ctcagcgatc tgtctatttc gttcatccat agttgcctga 4080
ctccccgtcg tgtagataac tacgatacgg gagggcttac catctggccc cagtgctgca 4140
atgataccgc gagacccacg ctcaccggct ccagatttat cagcaataaa ccagccagcc 4200
ggaagggccg agcgcagaag tggtcctgca actttatccg cctccatcca gtctattaat 4260
tgttgccggg aagctagagt aagtagttcg ccagttaata gtttgcgcaa cgttgttgcc 4320
attgctacag gcatcgtggt gtcacgctcg tcgtttggta tggcttcatt cagctccggt 4380
tcccaacgat caaggcgagt tacatgatcc cccatgttgt gcaaaaaagc ggttagctcc 4440
ttcggtcctc cgatcgttgt cagaagtaag ttggccgcag tgttatcact catggttatg 4500
gcagcactgc ataattctct tactgtcatg ccatccgtaa gatgcttttc tgtgactggt 4560
gagtactcaa ccaagtcatt ctgagaatag tgtatgcggc gaccgagttg ctcttgcccg 4620
gcgtcaatac gggataatac cgcgccacat agcagaactt taaaagtgct catcattgga 4680
aaacgttctt cggggcgaaa actctcaagg atcttaccgc tgttgagatc cagttcgatg 4740
taacccactc gtgcacccaa ctgatcttca gcatctttta ctttcaccag cgtttctggg 4800
tgagcaaaaa caggaaggca aaatgccgca aaaaagggaa taagggcgac acggaaatgt 4860
tgaatactca tactcttcct ttttcaatat tattgaagca tttatcaggg ttattgtctc 4920
atgtccgcgc gtttcctgca tcttttaatc aaatcccaag atgtgtataa accaccaaac 4980
tgccaaaaaa tgaaaactgt cgacaagctc tgtccgtttg ctggcaactg caagggtctc 5040
aatcctattt gtaattattg aataataaaa caattataaa tgtcaaattt gttttttatt 5100
aacgatacaa accaaacgca acaagaacat ttgtagtatt atctataatt gaaaacgcgt 5160
agttataatc gctgaggtaa tatttaaaat cattttcaaa tgattcacag ttaatttgcg 5220
acaatataat tttattttca cataaactag acgccttgtc gtcttcttct tcgtattcct 5280
tctctttttc atttttctct tcataaaaat taacatagtt attatcgtat ccatatatgt 5340
atctatcgta tagagtaaat tttttgttgt cataaatata tatgtctttt ttaatggggt 5400
gtatagtacc gctgcgcata gtttttctgt aatttacaac agtgctattt tctggtagtt 5460
cttcggagtg tgttgcttta attattaaat ttatataatc aatgaatttg ggatcgtcgg 5520
ttttgtacaa tatgttgccg gcatagtacg cagcttcttc tagttcaatt acaccatttt 5580
ttagcagcac cggattaaca taactttcca aaatgttgta cgaaccgtta aacaaaaaca 5640
gttcacctcc cttttctata ctattgtctg cgagcagttg tttgttgtta aaaataacag 5700
ccattgtaat gagacgcaca aactaatatc acaaactgga aatgtctatc aatatatagt 5760
tgctctagtt attaatagta atcaattacg gggtcattag ttcatagccc atatatggag 5820
ttccgcgtta cataacttac ggtaaatggc ccgcctggct gaccgcccaa cgacccccgc 5880
ccattgacgt caataatgac gtatgttccc atagtaacgc caatagggac tttccattga 5940
cgtcaatggg tggactattt acggtaaact gcccacttgg cagtacatca agtgtatcat 6000
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ctccccaccc ccaattttgt atttatttat tttttaatta ttttgtgcag cgatgggggc 6240
gggggggggg ggggggcgcg cgccaggcgg ggcggggcgg ggcgaggggc ggggcggggc 6300
gaggcggaga ggtgcggcgg cagccaatca gagcggcgcg ctccgaaagt ttccttttat 6360
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gtaattagcg cttggtttaa tgacggcttg tttcttttct gtggctgcgt gaaagccttg 6600
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ggctgccttc gggggggacg gggcagggcg gggttcggct tctggcgtgt gaccggcggc 6720
tctagagcct ctgctaacca tgttcatgcc ttcttctttt tcctacagct cctgggcaac 6780
gtgctggtta ttgtgctgtc tcatcatttt ggcaaagaat tggatcggac cgaaattaat 6840
acgactcact ata 6853
<210> 13
<211> 861
<212> PRT
<213> 智人
<400> 13
Met Arg Glu Leu Val Asn Ile Pro Leu Val His Ile Leu Thr Leu Val
1 5 10 15
Ala Phe Ser Gly Thr Glu Lys Leu Pro Lys Ala Pro Val Ile Thr Thr
20 25 30
Pro Leu Glu Thr Val Asp Ala Leu Val Glu Glu Val Ala Thr Phe Met
35 40 45
Cys Ala Val Glu Ser Tyr Pro Gln Pro Glu Ile Ser Trp Thr Arg Asn
50 55 60
Lys Ile Leu Ile Lys Leu Phe Asp Thr Arg Tyr Ser Ile Arg Glu Asn
65 70 75 80
Gly Gln Leu Leu Thr Ile Leu Ser Val Glu Asp Ser Asp Asp Gly Ile
85 90 95
Tyr Cys Cys Thr Ala Asn Asn Gly Val Gly Gly Ala Val Glu Ser Cys
100 105 110
Gly Ala Leu Gln Val Lys Met Lys Pro Lys Ile Thr Arg Pro Pro Ile
115 120 125
Asn Val Lys Ile Ile Glu Gly Leu Lys Ala Val Leu Pro Cys Thr Thr
130 135 140
Met Gly Asn Pro Lys Pro Ser Val Ser Trp Ile Lys Gly Asp Ser Pro
145 150 155 160
Leu Arg Glu Asn Ser Arg Ile Ala Val Leu Glu Ser Gly Ser Leu Arg
165 170 175
Ile His Asn Val Gln Lys Glu Asp Ala Gly Gln Tyr Arg Cys Val Ala
180 185 190
Lys Asn Ser Leu Gly Thr Ala Tyr Ser Lys Val Val Lys Leu Glu Val
195 200 205
Glu Val Phe Ala Arg Ile Leu Arg Ala Pro Glu Ser His Asn Val Thr
210 215 220
Phe Gly Ser Phe Val Thr Leu His Cys Thr Ala Thr Gly Ile Pro Val
225 230 235 240
Pro Thr Ile Thr Trp Ile Glu Asn Gly Asn Ala Val Ser Ser Gly Ser
245 250 255
Ile Gln Glu Ser Val Lys Asp Arg Val Ile Asp Ser Arg Leu Gln Leu
260 265 270
Phe Ile Thr Lys Pro Gly Leu Tyr Thr Cys Ile Ala Thr Asn Lys His
275 280 285
Gly Glu Lys Phe Ser Thr Ala Lys Ala Ala Ala Thr Ile Ser Ile Ala
290 295 300
Glu Trp Ser Lys Pro Gln Lys Asp Asn Lys Gly Tyr Cys Ala Gln Tyr
305 310 315 320
Arg Gly Glu Val Cys Asn Ala Val Leu Ala Lys Asp Ala Leu Val Phe
325 330 335
Leu Asn Thr Ser Tyr Ala Asp Pro Glu Glu Ala Gln Glu Leu Leu Val
340 345 350
His Thr Ala Trp Asn Glu Leu Lys Val Val Ser Pro Val Cys Arg Pro
355 360 365
Ala Ala Glu Ala Leu Leu Cys Asn His Ile Phe Gln Glu Cys Ser Pro
370 375 380
Gly Val Val Pro Thr Pro Ile Pro Ile Cys Arg Glu Tyr Cys Leu Ala
385 390 395 400
Val Lys Glu Leu Phe Cys Ala Lys Glu Trp Leu Val Met Glu Glu Lys
405 410 415
Thr His Arg Gly Leu Tyr Arg Ser Glu Met His Leu Leu Ser Val Pro
420 425 430
Glu Cys Ser Lys Leu Pro Ser Met His Trp Asp Pro Thr Ala Cys Ala
435 440 445
Arg Leu Pro His Leu Ala Phe Pro Pro Met Thr Ser Ser Lys Pro Ser
450 455 460
Val Asp Ile Pro Asn Leu Pro Ser Ser Ser Ser Ser Ser Phe Ser Val
465 470 475 480
Ser Pro Thr Tyr Ser Met Thr Val Ile Ile Ser Ile Met Ser Ser Phe
485 490 495
Ala Ile Phe Val Leu Leu Thr Ile Thr Thr Leu Tyr Cys Cys Arg Arg
500 505 510
Arg Lys Gln Trp Lys Asn Lys Lys Arg Glu Ser Ala Ala Val Thr Leu
515 520 525
Thr Thr Leu Pro Ser Glu Leu Leu Leu Asp Arg Leu His Pro Asn Pro
530 535 540
Met Tyr Gln Arg Met Pro Leu Leu Leu Asn Pro Lys Leu Leu Ser Leu
545 550 555 560
Glu Tyr Pro Arg Asn Asn Ile Glu Tyr Val Arg Asp Ile Gly Glu Gly
565 570 575
Ala Phe Gly Arg Val Phe Gln Ala Arg Ala Pro Gly Leu Leu Pro Tyr
580 585 590
Glu Pro Phe Thr Met Val Ala Val Lys Met Leu Lys Glu Glu Ala Ser
595 600 605
Ala Asp Met Gln Ala Asp Phe Gln Arg Glu Ala Ala Leu Met Ala Glu
610 615 620
Phe Asp Asn Pro Asn Ile Val Lys Leu Leu Gly Val Cys Ala Val Gly
625 630 635 640
Lys Pro Met Cys Leu Leu Phe Glu Tyr Met Ala Tyr Gly Asp Leu Asn
645 650 655
Glu Phe Leu Arg Ser Met Ser Pro His Thr Val Cys Ser Leu Ser His
660 665 670
Ser Asp Leu Ser Met Arg Ala Gln Val Ser Ser Pro Gly Pro Pro Pro
675 680 685
Leu Ser Cys Ala Glu Gln Leu Cys Ile Ala Arg Gln Val Ala Ala Gly
690 695 700
Met Ala Tyr Leu Ser Glu Arg Lys Phe Val His Arg Asp Leu Ala Thr
705 710 715 720
Arg Asn Cys Leu Val Gly Glu Asn Met Val Val Lys Ile Ala Asp Phe
725 730 735
Gly Leu Ser Arg Asn Ile Tyr Ser Ala Asp Tyr Tyr Lys Ala Asn Glu
740 745 750
Asn Asp Ala Ile Pro Ile Arg Trp Met Pro Pro Glu Ser Ile Phe Tyr
755 760 765
Asn Arg Tyr Thr Thr Glu Ser Asp Val Trp Ala Tyr Gly Val Val Leu
770 775 780
Trp Glu Ile Phe Ser Tyr Gly Leu Gln Pro Tyr Tyr Gly Met Ala His
785 790 795 800
Glu Glu Val Ile Tyr Tyr Val Arg Asp Gly Asn Ile Leu Ser Cys Pro
805 810 815
Glu Asn Cys Pro Val Glu Leu Tyr Asn Leu Met Arg Leu Cys Trp Ser
820 825 830
Lys Leu Pro Ala Asp Arg Pro Ser Phe Thr Ser Ile His Arg Ile Leu
835 840 845
Glu Arg Met Cys Glu Arg Ala Glu Gly Thr Val Ser Val
850 855 860
<210> 14
<211> 8200
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pTriEx-1-MuSK
<400> 14
ggggaattgt gagcggataa caattccccg gagttaatcc gggaccttta attcaaccca 60
acacaatata ttatagttaa ataagaatta ttatcaaatc atttgtatat taattaaaat 120
actatactgt aaattacatt ttatttacaa tcaaaggaga tataccatga gagagctcgt 180
caacattcca ctggtacata ttcttactct ggttgccttc agcggaactg agaaacttcc 240
aaaagctcct gtcatcacca ctcctcttga aacagtggat gccttagttg aagaagtggc 300
tactttcatg tgtgcagtgg aatcctaccc ccagcctgag atttcctgga ctagaaataa 360
aattctcatt aaactctttg acacccggta cagcatccgg gagaatgggc agctcctcac 420
catcctgagt gtggaagaca gtgatgatgg catttactgc tgcacggcca acaatggtgt 480
gggaggagct gtggagagtt gtggagccct gcaagtgaag atgaaaccta aaataactcg 540
tcctcccata aatgtgaaaa taatagaggg attaaaagca gtcctaccat gtactacaat 600
gggtaatccc aaaccatcag tgtcttggat aaagggagac agcccactca gggaaaattc 660
ccgaattgca gttcttgaat ctgggagctt gaggattcat aacgtacaaa aggaagatgc 720
aggacagtat cgatgtgtgg caaaaaacag cctcgggaca gcatattcca aagtggtgaa 780
gctggaagtt gaggtttttg ccaggatcct gcgggctcct gaatcccaca atgtcacctt 840
tggctccttt gtgaccctgc actgtacagc aacaggcatt cctgtcccca ccatcacctg 900
gattgaaaac ggaaatgctg tttcttctgg gtccattcaa gagagtgtga aagaccgagt 960
gattgactca agactgcagc tgtttatcac caagccagga ctctacacat gcatagctac 1020
caataagcat ggggagaagt tcagtactgc caaggctgca gccaccatca gcatagcaga 1080
atggagtaaa ccacagaaag ataacaaagg ctactgcgcc cagtacagag gggaggtgtg 1140
taatgcagtc ctggcaaaag atgctcttgt ttttctcaac acctcctatg cggaccctga 1200
ggaggcccaa gagctactgg tccacacggc ctggaatgaa ctgaaagtag tgagcccagt 1260
ctgccggcca gctgctgagg ctttgttgtg taaccacatc ttccaggagt gcagtcctgg 1320
agtagtgcct actcctattc ccatttgcag agagtactgc ttggcagtaa aggagctctt 1380
ctgcgcaaaa gaatggctgg taatggaaga gaagacccac agaggactct acagatccga 1440
gatgcatttg ctgtccgtgc cagaatgcag caagcttccc agcatgcatt gggaccccac 1500
ggcctgtgcc agactgccac atctagcatt cccaccaatg acgtcctcaa agccaagtgt 1560
ggacattcca aacctgcctt cctcctcctc ttcttccttc tctgtctcac ctacatactc 1620
catgactgta ataatctcca tcatgtccag ctttgcaata tttgtgcttc ttaccataac 1680
tactctctat tgctgccgaa gaagaaaaca atggaaaaat aagaaaagag aatcagcagc 1740
agtaaccctc accacactgc cttctgagct cttactagat agacttcatc ccaaccccat 1800
gtaccagagg atgccgctcc ttctgaaccc caaattgctc agcctggagt atccaaggaa 1860
taacattgaa tatgtgagag acatcggaga gggagcgttt ggaagggtgt ttcaagcaag 1920
ggcaccaggc ttacttccct atgaaccttt cactatggtg gcagtaaaga tgctcaaaga 1980
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gcccccaccc ctctcctgtg ctgagcagct ttgcattgcc aggcaggtgg cagctggcat 2280
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aacatatgcc catatgtaac tagcataacc ccttggggcc tctaaacggg tcttgagggg 3120
ttttttgctg aaagcatgcg gaggaaattc tccttgaagt ttccctggtg ttcaaagtaa 3180
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gttattagta catttattaa gcgctagatt ctgtgcgttg ttgatttaca gacaattgtt 3300
gtacgtattt taataattca ttaaatttat aatctttagg gtggtatgtt agagcgaaaa 3360
tcaaatgatt ttcagcgtct ttatatctga atttaaatat taaatcctca atagatttgt 3420
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ctaatggatt ttcgctcaac gccacaaaac ttgccaaatc ttgtagcagc aatctagctt 3540
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cgtcgtccca accctcgtcg ttagaagttg cttccgaaga cgattttgcc atagccacac 3780
gacgcctatt aattgtgtcg gctaacacgt ccgcgatcaa atttgtagtt gagctttttg 3840
gaattatttc tgattgcggg cgtttttggg cgggtttcaa tctaactgtg cccgatttta 3900
attcagacaa cacgttagaa agcgatggtg caggcggtgg taacatttca gacggcaaat 3960
ctactaatgg cggcggtggt ggagctgatg ataaatctac catcggtgga ggcgcaggcg 4020
gggctggcgg cggaggcgga ggcggaggtg gtggcggtga tgcagacggc ggtttaggct 4080
caaatgtctc tttaggcaac acagtcggca cctcaactat tgtactggtt tcgggcgccg 4140
tttttggttt gaccggtctg agacgagtgc gatttttttc gtttctaata gcttccaaca 4200
attgttgtct gtcgtctaaa ggtgcagcgg gttgaggttc cgtcggcatt ggtggagcgg 4260
gcggcaattc agacatcgat ggtggtggtg gtggtggagg cgctggaatg ttaggcacgg 4320
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ctataagcat tgtaatttcg ctatcgttta ccgtgccgat atttaacaac cgctcaatgt 4560
aagcaattgt attgtaaaga gattgtctca agctcggaac gctgcgctcg gtcgttcggc 4620
tgcggcgagc ggtatcagct cactcaaagg cggtaatacg gttatccaca gaatcagggg 4680
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tgtaggtcgt tcgctccaag ctgggctgtg tgcacgaacc ccccgttcag cccgaccgct 5040
gcgccttatc cggtaactat cgtcttgagt ccaacccggt aagacacgac ttatcgccac 5100
tggcagcagc cactggtaac aggattagca gagcgaggta tgtaggcggt gctacagagt 5160
tcttgaagtg gtggcctaac tacggctaca ctagaaggac agtatttggt atctgcgctc 5220
tgctgaagcc agttaccttc ggaaaaagag ttggtagctc ttgatccggc aaacaaacca 5280
ccgctggtag cggtggtttt tttgtttgca agcagcagat tacgcgcaga aaaaaaggat 5340
ctcaagaaga tcctttgtta ccaatgctta atcagtgagg cacctatctc agcgatctgt 5400
ctatttcgtt catccatagt tgcctgactc cccgtcgtgt agataactac gatacgggag 5460
ggcttaccat ctggccccag tgctgcaatg ataccgcgag acccacgctc accggctcca 5520
gatttatcag caataaacca gccagccgga agggccgagc gcagaagtgg tcctgcaact 5580
ttatccgcct ccatccagtc tattaattgt tgccgggaag ctagagtaag tagttcgcca 5640
gttaatagtt tgcgcaacgt tgttgccatt gctacaggca tcgtggtgtc acgctcgtcg 5700
tttggtatgg cttcattcag ctccggttcc caacgatcaa ggcgagttac atgatccccc 5760
atgttgtgca aaaaagcggt tagctccttc ggtcctccga tcgttgtcag aagtaagttg 5820
gccgcagtgt tatcactcat ggttatggca gcactgcata attctcttac tgtcatgcca 5880
tccgtaagat gcttttctgt gactggtgag tactcaacca agtcattctg agaatagtgt 5940
atgcggcgac cgagttgctc ttgcccggcg tcaatacggg ataataccgc gccacatagc 6000
agaactttaa aagtgctcat cattggaaaa cgttcttcgg ggcgaaaact ctcaaggatc 6060
ttaccgctgt tgagatccag ttcgatgtaa cccactcgtg cacccaactg atcttcagca 6120
tcttttactt tcaccagcgt ttctgggtga gcaaaaacag gaaggcaaaa tgccgcaaaa 6180
aagggaataa gggcgacacg gaaatgttga atactcatac tcttcctttt tcaatattat 6240
tgaagcattt atcagggtta ttgtctcatg tccgcgcgtt tcctgcatct tttaatcaaa 6300
tcccaagatg tgtataaacc accaaactgc caaaaaatga aaactgtcga caagctctgt 6360
ccgtttgctg gcaactgcaa gggtctcaat cctatttgta attattgaat aataaaacaa 6420
ttataaatgt caaatttgtt ttttattaac gatacaaacc aaacgcaaca agaacatttg 6480
tagtattatc tataattgaa aacgcgtagt tataatcgct gaggtaatat ttaaaatcat 6540
tttcaaatga ttcacagtta atttgcgaca atataatttt attttcacat aaactagacg 6600
ccttgtcgtc ttcttcttcg tattccttct ctttttcatt tttctcttca taaaaattaa 6660
catagttatt atcgtatcca tatatgtatc tatcgtatag agtaaatttt ttgttgtcat 6720
aaatatatat gtctttttta atggggtgta tagtaccgct gcgcatagtt tttctgtaat 6780
ttacaacagt gctattttct ggtagttctt cggagtgtgt tgctttaatt attaaattta 6840
tataatcaat gaatttggga tcgtcggttt tgtacaatat gttgccggca tagtacgcag 6900
cttcttctag ttcaattaca ccatttttta gcagcaccgg attaacataa ctttccaaaa 6960
tgttgtacga accgttaaac aaaaacagtt cacctccctt ttctatacta ttgtctgcga 7020
gcagttgttt gttgttaaaa ataacagcca ttgtaatgag acgcacaaac taatatcaca 7080
aactggaaat gtctatcaat atatagttgc tctagttatt aatagtaatc aattacgggg 7140
tcattagttc atagcccata tatggagttc cgcgttacat aacttacggt aaatggcccg 7200
cctggctgac cgcccaacga cccccgccca ttgacgtcaa taatgacgta tgttcccata 7260
gtaacgccaa tagggacttt ccattgacgt caatgggtgg actatttacg gtaaactgcc 7320
cacttggcag tacatcaagt gtatcatatg ccaagtacgc cccctattga cgtcaatgac 7380
ggtaaatggc ccgcctggca ttatgcccag tacatgacct tatgggactt tcctacttgg 7440
cagtacatct acgtattagt catcgctatt accatgcatg gtcgaggtga gccccacgtt 7500
ctgcttcact ctccccatct cccccccctc cccaccccca attttgtatt tatttatttt 7560
ttaattattt tgtgcagcga tgggggcggg gggggggggg gggcgcgcgc caggcggggc 7620
ggggcggggc gaggggcggg gcggggcgag gcggagaggt gcggcggcag ccaatcagag 7680
cggcgcgctc cgaaagtttc cttttatggc gaggcggcgg cggcggcggc cctataaaaa 7740
gcgaagcgcg cggcgggcgg gagtcgctgc gacgctgcct tcgccccgtg ccccgctccg 7800
ccgccgcctc gcgccgcccg ccccggctct gactgaccgc gttactccca caggtgagcg 7860
ggcgggacgg cccttctcct tcgggctgta attagcgctt ggtttaatga cggcttgttt 7920
cttttctgtg gctgcgtgaa agccttgagg ggctccggga gggccctttg tgcgggggga 7980
gcggctcggg gctgtccgcg gggggacggc tgccttcggg ggggacgggg cagggcgggg 8040
ttcggcttct ggcgtgtgac cggcggctct agagcctctg ctaaccatgt tcatgccttc 8100
ttctttttcc tacagctcct gggcaacgtg ctggttattg tgctgtctca tcattttggc 8160
aaagaattgg atcggaccga aattaatacg actcactata 8200

Claims (15)

1.一种诊断上有用的承载体，其包含过表达成人ACh受体或其变体的真核细胞和过表达胎儿ACh受体或其变体的真核细胞，其中将所述细胞固定以用于免疫荧光。
2.根据权利要求1所述的承载体，其中任何过表达自身抗原的真核细胞是预固定的。
3.根据权利要求1至2中任一项所述的诊断上有用的承载体，其中所述承载体还包含过表达Musk或其变体的真核细胞。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的诊断上有用的承载体，其中过表达成人ACh受体或其变体的细胞和过表达胎儿ACh受体或其变体的细胞分别永久表达成人ACh受体和胎儿ACh受体。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的诊断上有用的承载体，其中所述承载体还包含对照，优选模拟转染的细胞。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的诊断上有用的承载体，其中所述细胞选自HEK293、HeLa、CHO和Jurkat细胞及其衍生物。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的诊断上有用的承载体，
其中过表达选自成人ACh受体、胎儿ACh受体和Musk或其变体的自身抗原的至少一种真核细胞、优选所有真核细胞包含一种或多种载体，其中编码自身抗原的核酸处于通过添加诱导剂可诱导的启动子的控制下，
并且其中对于每种细胞，存在另外的空间上分开的真核细胞，其包含缺少所述核酸的相同载体或包含相同载体但不表达所述自身抗原，优选是因为不存在诱导剂而不表达。
8.一种用于检测针对ACh受体的自身抗体的方法，任选除了检测针对Musk的自身抗体之外，其还包括以下步骤：
a)在允许复合物形成的条件下使样品与根据权利要求1至7中任一项所述的承载体接触，所述复合物包含选自针对ACh受体和Musk的自身抗体的自身抗体以及选自ACh受体和Musk的自身抗原，所述ACh受体优选成人ACh受体和/或胎儿ACh受体，
b)使步骤b)中形成的任何复合物与针对所述自身抗体的荧光配体接触，
c)去除任何未与自身抗体结合的荧光配体，和
d)检测所述荧光配体的存在或不存在。
9.一种试剂盒，其包含根据权利要求1至7中任一项所述的承载体和针对ACh受体、任选还针对Musk的自身抗体的配体，其中所述配体是荧光配体，其中任何过表达自身抗原的真核细胞优选是预固定的。
10.过表达成人ACh受体或其变体的真核细胞和过表达胎儿ACh受体或其变体的真核细胞的组合在增加用于检测针对ACh受体的自身抗体的免疫荧光测定的灵敏度中的用途。
11.根据权利要求10所述的用途，其中结合至所述自身抗体的荧光配体的存在或不存在指示样品中是否存在所述自身抗体。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的承载体、方法或用途，其中所述表达成人ACh受体或其变体的真核细胞和所述过表达胎儿ACh受体或其变体的真核细胞以及任选地表达Musk或其变体的真核细胞在空间上是分开的。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的承载体、方法或用途，其中所述过表达成人ACh受体或其变体的真核细胞和过表达胎儿ACh受体或其变体的真核细胞以及任选地表达Musk或其变体的真核细胞是共定位的。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的承载体、方法或用途，其中所述样品包含来自患者的抗体，所述样品优选血液，更优选选自血清、液体、血浆和全血。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的承载体、方法或用途，其中所述承载体、方法或用途用于诊断重症肌无力、LEMS和OMD。
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