KR20090069423A - 변이된 ｃＤＮＡ 클론으로부터 수득된 카텝신 Ｌ-유사시스테인 프로테아제 - Google Patents

변이된 ｃＤＮＡ 클론으로부터 수득된 카텝신 Ｌ-유사시스테인 프로테아제 Download PDF

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안상중
김무상
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부경대학교 산학협력단
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Abstract

본 발명은 카텝신 L-유사 시스테인 프로테아제(ScCtL)를 발현하는 서열번호: 1의 DNA 염기 서열 중 387∼389번째, 396∼398번째, 399∼401번째, 447∼449번째, 495∼497번째, 516∼518번째, 570∼572번째, 606∼608번째, 648∼650번째, 723∼725번째, 732∼734번째, 738∼740번째, 834∼836번째, 837∼839번째, 1077∼1079번째, 1119∼1121번째, 1266∼1268번째 잔기인 TAA 또는 TAG를 CAA 또는 CAG로 티아민(T)을 시토신(C)으로 자리-지정 돌연변이시킨 카텝신 L-유사 시스테인 프로테아제를 암호화하는 변이된 DNA 클론을 제공한다. 또한 본 발명은 상기 변이된 DNA 클론을 포함하는 형질전환 벡터를 대장균에서 발현시켜 제조된 서열번호: 2의 아미노산 서열을 지니는 카텝신 L-유사 시스테인 프로테아제를 제공한다.
Figure 112007092976330-PAT00001
변이된 DNA 클론, 형질전환, 벡터, 카텝신 L-유사 시스테인 프로테아제, 유로네마 마리눔, 자리-지정 돌연변이

Description

변이된 ｃＤＮＡ 클론으로부터 수득된 카텝신 Ｌ-유사 시스테인 프로테아제{Cathepsin L-like cysteine protease obtained from mutated cDNA clone}
본 발명은 변이된 cDNA 클론으로부터 수득된 카텝신 L-유사 시스테인 프로테아제 및 상기 변이된 cDNA 클론에 관한 것이다. 더욱 상세하게는 스쿠티카충의 일종인 유로네마 마리눔(Uronema marinum)으로부터 분리된 카텝신 L-유사 시스테인 프로테아제 유전자를 자리-지정 돌연변이시켜 대장균 내에서 효율적으로 발현시켜 제조된 카텝신 L-유사 시스테인 프로테아제 및 상기 자리-지정 돌연변이시켜 수득된 cDNA 클론에 관한 것이다.
스쿠티카병(Scuticociliatosis)은 유로네마(Uronema)속, 미아미엔시스(Miamiensis)속 및 필라스테리데스(Philasterides)속에 속하는 원충성 섬모충의 침입성 외부 또는 전신성 감염으로 정의된다. 본 질병은 해양 어류에서 치명적인 질병으로 확인되었다. 유로네마 마리눔(Uronema marinum)은 해양 어류에서 전신성 스쿠티카병을 유발하는 조직포식성 섬모충이다. 최근 유로네마 마리눔에 의해 발발된 스쿠티카병은 한국의 넙치인 파랄리크티스 올리바세우스(Paralichthys olivaceus)의 양식 집단의 심각한 손실을 유발하였다.
이러한 섬모충이 숙주 조직에 침입하는 과정뿐만 아니라 이러한 기생충이 숙주의 세포 방어 반응을 회피하는 메커니즘에 관해 현재 거의 알려져 있지 않으나 시스테인 및 메탈로프로테아제가 유로네마 마리눔의 침입 및 병원성 특성과 관련된다고 이론화되었다. 그러나 이들은 아직 완전하게 클론되고 분자 수준으로 특성화되지 않았다. 또한 광범위한 종(특히 파라메시움(Paramecium), 테트라히메나(Tetrahymena), 이크티오프티리우스(Ichthyophthirius), 옥시트리카(Oxytricha) 및 스틸로니키아(Stylonychia))에서 UAA 및 UAG 종결 코돈은 글루타민(Gln, Q)을 명기하고 TGA는 이들 종에서 유일한 종결 코돈이다. 따라서 이형성 단백질 발현 시스템 내의 섬모충 유전자의 발현은 다소 제한적이다.
기생 생물체에서 카텝신 B 이외에 카텝신 L-유사 시스테인 프로테아제는 세포내 단백질의 분해, 숙주-기생충 부착, 면역회피, 탈낭/피포형성 및 전구체 단백질의 정확한 처리를 포함한 주요한 생물학적 기능을 수행한다. 기생충 카텝신 L 시스테인 프로테아제 패밀리는 경첩 영역 내에서 정확하게 면역글로불린을 분해하고(따라서 Fc 영역으로부터 Fab를 분리시킴) 기생충의 표면으로의 호산구의 항체- 매개 부착을 방지하여 면역 공격으로부터 기생충을 보호하는 것이 가능하다. 원충 및 연충 내의 카텝신 L-유사 시스테인 프로테아제의 편재성 존재로 인해 이들의 저해제를 개발하는 것이 요구된다. 또한 카텝신 L-유사 시스테인 프로테아제는 신규한 항기생충 약물 및 백신의 유효성을 평가하기 위한 목적 단백질로 사용될 수 있다.
본 발명이 해결하고자 하는 과제는 원충 및 연충 내의 카텝신 L-유사 시스테인 프로테아제의 유전공학적 발현 제조 방법을 개발코자 한 것이다. 즉 스쿠티카충 내에서 분리된 유전자를 자리-지정 돌연변이시켜 대장균에서 카텝신 L-유사 시스테인 프로테아제를 대량 제조할 수 있는 방법을 개발코자 한 것이다.
본 발명의 목적은 카텝신 L-유사 시스테인 프로테아제(ScCtL)를 발현하는 서열번호: 1의 DNA 염기 서열 중 387∼389번째, 396∼398번째, 399∼401번째, 447∼449번째, 495∼497번째, 516∼518번째, 570∼572번째, 606∼608번째, 648∼650번째, 723∼725번째, 732∼734번째, 738∼740번째, 834∼836번째, 837∼839번째, 1077∼1079번째, 1119∼1121번째, 1266∼1268번째 잔기인 TAA 또는 TAG를 CAA 또는 CAG로 티아민(T)을 시토신(C)으로 자리-지정 돌연변이시킨 카텝신 L-유사 시스테인 프로테아제를 암호화하는 변이된 DNA 클론을 제공하는 것이다.
또한 상기 변이된 DNA 클론 중 자리-지정 돌연변이된 염기 부위는 글루타민을 암호화함을 특징으로 한다.
한편 본 발명의 또다른 목적은 상기 변이된 DNA 클론을 포함하는 형질전환 벡터를 대장균에서 발현시켜 제조된 서열번호: 2의 아미노산 서열을 지니는 카텝신 L-유사 시스테인 프로테아제를 제공하는 것이다.
또한 본 발명의 또다른 목적은 서열번호: 2의 아미노산 서열을 지닌 스쿠티카충의 카텝신 L-유사 시스테인 프로테아제에 대한 결합친화성을 갖는 폴리클로날 항체를 제공하는 것이다.
또한 상기 카텝신 L-유사 시스테인 프로테아제는 최적 pH는 4.5이고, E-64 및 류펩틴(leupeptin)에 의해 저해됨을 특징으로 한다.
또한 본 발명은 상기 카텝신 L-유사 시스테인 프로테아제를 길항 저해시켜 스쿠티카충(Uronema marinum)으로부터 어류 숙주의 생장을 보호하는 방법을 제공한다.
본 발명의 효과는 원충 및 연충 내의 카텝신 L-유사 시스테인 프로테아제의 유전공학적 발현 제조 방법을 제공하는 것이다. 즉 스쿠티카충 내에서 분리된 유 전자를 자리-지정 돌연변이시켜 대장균에서 카텝신 L-유사 시스테인 프로테아제를 대량 제조할 수 있는 방법을 제공하는 것이다.
카넵신 L 유전자와 상동적인 시스테인 프로테아제 유전자(ScCtL)가 스쿠티카충의 cDNA 라이브러리에서 분리되었다. 이형성 시스템 내에서 ScCtL 재조합 단백질을 발현시키기 위해 17개 코돈이 재고안되어 PCR-기반 자리-지정 돌연변이유발을 이용한 표준 진핵성 유전자 코드가 확인되었다.
합성 유로네마 마리눔(Uronema marinum) 프로-카텝신 L(proScCtL)이 pGEX-4T-1 벡터를 지닌 E. coli BL21(DE3) 내에서 높은 수치로 발현되고 성공적으로 구조회복되고 기능적 및 효소적으로 활성적 형태로 정제되었다. 프로테아제 활성을 위한 최적 pH는 4.5인 것으로 나타났다. 일반적인 시스테인 프로테아제와 유사하게 효소는 E-64 및 류펩틴(leupeptin)에 의해 저해되었다.
스쿠티카충 유래 세포질 및 멤브레인 분획에 대한 항-proScCtL 폴리클론 항체의 반응 능력 및 민감도를 측정하기 위해 도트-블럿 면역에세이가 수행되었다. 본 발명은 재조합 섬모충 proScCtL 단백질의 생화학적 특성이 카텝신 L-유사 시스테인 프로테아제와 유사하고 PCR-기반 자리-지정 돌연변이화된 섬모충 유전자가 생 화학적으로 활성적인 형태로 성공적으로 발현되었음을 나타낸다.
본 발명은 스쿠티카충인 유로네마 마리눔 카텝신 L-유사 시스테인 프로테아제(ScCtL)의 클로닝, 자리-지정 돌연변이유발, 이형성 발현 및 생화학적 특성화에 관한 것이다. 본 발명은 섬모충 유로네마 마리눔의 시스테인 프로티나제의 뉴클레오타이드 서열에 관한 발명이다. 또한 본 발명은 E. coli 내 재조합 섬모충 시스테인 프로테아제 유전자의 PCR-기반 자리-지정 돌연변이 유발 발명, 발현 및 활성 분석이며 proScCtL 단백질은 시스테인 프로테아제 저해제에 의해 저해될 수 있는 생물학적 활성을 보유한 것으로 나타났다. 따라서 합성 ScCtL의 유용성은 신규한 면역학적 예방 또는 화학요법 기법의 개발을 위한 후보물질로서의 가능성을 제공한다.
이하 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.
스쿠티카충 카텝신 L-유사 시스테인 프로테아제 cDNA( ScCtL )
1476 bp ScCtL cDNA는 첫 번째 ATG 시작 코돈부터 TGA 종결 코돈까지 1002 bp의 오픈 리딩 프레임을 포함하고 및 5'-비번역된 영역(UTR)의 326 bp 및 3'-UTR의 148 bp가 인접되어 있다. ScCtL 서열은 GenBank 등록 번호 AY950577로 기탁되었다. ScCtL은 19-잔기 추정 신호 펩타이드, 99-잔기 프로펩타이드 및 215-잔기 성숙 효소를 포함하였다. ScCtL 의 추정 프리프로(prepro)-, 프로(pro)- 및 성숙-형태의 분자량은 하기와 같았다: 각각 36,427, 34,499 및 22,730 Da. 프리-영역은 신호 펩타이드의 특징인 소수성 잔기로 우세하게 구성되고, 이러한 영역은 류신(L) 잔기에 앞서는 페닐알라닌(F) 이후에 절단되는 것으로 추정되었다. 프리-영역과 성숙 프로테아제 사이에 위치한 절단 사이트는 호모 사피엔스(Homo sapiens) 유래 다른 카텝신의 서열과의 ScCtL의 정렬을 이용하여 확인되었다(도 1). 많은 파파인 패밀리 성분은 성숙 효소 내 위치 2에서 프롤린(P) 잔기를 포함한다. 이는 ScCtL 내에서도 관찰되었다(도 1B). 프롤린은 바람직하지 않은 N-말단 단백질분해을 방지하는 기능을 한다.
ScCtL 의 서열의 다른 카텝신과의 서열 분석 및 계통발생적 관계
ScCtL의 아미노산 서열은 카텝신 L 패밀리 내에 해석되는 매우 보존된 모티프인 ERFNIN 모티프를 포함한다. ScCtL의 프로-영역은 시스테인 프로테아제의 ERFNIN 모티프(Phe(F) 및 Ile(I)에 대한 Tyr(Y) 및 Val(V) 치환이 다름) 특징을 포함한 6개 잔기 중 4개를 포함한다(도 1A). 더욱이 ScCtL은 파파인 수퍼패밀리의 대부분의 시스테인 프로테아제 내에 일반적으로 보존되는 프로-영역 내 GNFD 모티프를 포함한다. 종전 본 발명자들은 스쿠티카충 카텝신 B(ScCtB; GenBank 등록번호 AY450954)의 아미노산 서열이 ERFNIN 모티프를 포함하지 않고 GNFD 모티프 및 폐색 루프를 포함함을 보고하였다. 이는 카텝신 패밀리 중 카텝신 B 그룹의 독특 한 특징으로 측정되었다. ScCtL의 프로-영역 내 ERFNIN-GNFD 모티프의 검출은 카텝신 L 그룹에 대한 그의 관계를 나타내고 카텝신 B 수퍼패밀리로부터 이를 구분시킨다.
모든 파파인 프로테아제 수퍼패밀리 멤버와 유사하게 ScCtL에서 암호화된 단백질은 촉매와 관련한 보존 잔기 즉 Cys25, His159 및 Asn175(촉매 삼징후로도 알려짐)(파파인 번호, 도 1B)뿐만 아니라 이황 결합의 형성과 관련된다고 알려진 6개 시스테인 잔기를 포함한다. Cys25는 매우 보존된 펩타이드 서열인 CGSCWAFS 내에 포함되어 있다. His159는 글리신 또는 알라닌과 같은 작은 아미노산 잔기에 인접하고 Asn175는 Ans-Ser-Trp 모티프의 일부이다. 또한 ScCtL의 추론된 아미노산 서열은 4개 추정 N-당화 사이트를 포함하는 것으로 나타났고, 그중 하나는 프로-영역(Asn-Asn-Ser) 내에 위치하고, 3개는 성숙 영역(Asn-Ser-Ser; Asn-Ser-Thr; Asn-Arg-Ser) 내에 위치하였다.
ScCtL의 GenBank 내 서열 및 SWISS-PROT 데이터베이스 내 서열과의 비교시 본 발명은 ScCtL이 시스테인 프로테아제의 파파인-패밀리와 가장 유사함을 측정하였다. 특정하게는 유모충 시스테인 프로테아제는 다른 유모충 시스테인 프로테아제와 높은 정도의 동일성을 나타내지 않았다(31∼37%). 그러나 유모충 카텝신 B는 다른 종의 카텝신 B와 높은 정도의 동일성이 입증되었다(45∼60%). 대부분 카텝신 L-유사 시스테인 프로테아제는 다른 오르쏠로그 카텝신 L과 유사한 정도의 동 일성(30∼40%) 및 카텝신 B와의 낮은 정도의 동일성(19∼24%)이 입증되었다. 그러나 계통발생 분석은 ScCtL이 카텝신 B, Z, A, C 및 D 수퍼패밀리보다는 카텝신 L 수퍼패밀리(L, S, K 및 H)와 더욱 밀접하게 관련됨을 나타내었다.
proScCtL 의 자리-지정 돌연변이유발, 이형성 발현 및 시험관 내 재중첩
섬모충의 흥미로운 특징은 대안적 세포핵 유전자 코드의 이용이다. 이러한 코돈은 대응 트랜스유전자가 박테리아, 효모 또는 곤충 숙주 세포주 내에서 재조합 단백질로서 발현되는 경우 전-성숙 폴리펩타이드 사슬 종결을 유발한다. 종전 연구에서 PCR-기반 자리-지정 돌연변이유발은 UAA 및 UAG 삼중자에서 각각 CAA 및 CAG 삼중자로의 전환에 이용될 수 있었다. 유사하게 ScCtL은 17개의 UAA 및 UAG 보편적 종결 코돈을 포함하고, 이는 유로네마 마리눔에서 글루타티온(Q)을 암호화한다. E. coli 내 ScCtL의 과발현 및 넙치 파랄리크티스 올리바세우스의 스쿠티카병 예방접종에 사용하기 위한 합성 버전의 ScCtL DNA의 구축을 위해 돌연변이유발 올리고뉴클레오타이드가 PCR-기반 자리-지정 돌연변이유발에 의해 코딩 서열 내 17개의 UAA 및 UAG 종결 코돈을 CAA 및 CAG 글루타민 코돈으로 전환시키는데 이용되었다.(표 1)
Figure 112007092976330-PAT00002
종전 연구는 파파인-유사 시스테인 프로테아제의 박테리아 내 발현이 소수성 전-서열의 존재시 유의적으로 손상됨을 나타내었다. 전-서열은 리소좀-유사 분해 소포를 포함한 특정 세포 구획 내 또는 세포질막으로의 단백질의 타겟팅에 중요한 반면 프로(pro)-서열은 적당한 중첩 및 불활성 형태 내 효소의 유지에 중요하다. 따라서 프로-효소를 암호화하는 ScCtL에 대한 유전자 일부만이 E. coli 발현 벡터 pGEX-4T-1 내로 클론되었다. IPTG로 유도된 proScCtL-형질전환 E. coli 배양물 유래 세포 추출물은 SDS-PAGE 분석시 융합 단백질에 대해 예측된 크기와 일치하는 약 60 kDa의 주요 단백질 밴드를 나타내었다(도 2A, 레인 3). 융합 proScCtL 단백질은 8 M 요소 내에 용해되었고 구조회복되었다. 구조회복된 proScCtL 단백질은 융합 단백질을 특이적으로 보유하는 글루타티온-Sepharose 4B 컬럼 상에 적가되었다(도 2A, 레인 4). 중요하게는 이러한 정제된 단백질 제제는 효소적으로 활성인 것으로 나타났다.
재조합 proScCtL 의 효소적 특성
재조합 proScCtL의 단백질 분해 활성은 형광원 기질(Z-Phe-Arg-AMC) 및 젤라틴 효소도를 이용하여 측정되었다. 정제된 proScCtL은 pH 4.5에서 0.1% 젤라틴을 가수분해하는 것이 가능하나(도 2C) 우혈청 알부민 및 우헤모글로빈과 같은 단백질 기질을 가수분해할 수 없었다. 그러나 합성 기질인 Z-Phe-Arg-AMC를 이용하여 재조합 proScCtL은 pH 4.5에서 발생하는 최적 활성과 함께 광범위한 pH 범위(pH 3.0∼5.5)에서의 활성이 입증되었다(도 2D). pH 7.0에서는 활성이 관찰되지 않았다. 유사한 pH 활성 프로파일은 우진드기 카텝신 L 및 간흡충 카텝신 L에서 정제된 시스테인 프로테아제에서도 관찰되었다. 기생충 시스테인 프로테아제와 관련하여 관찰되는 이러한 pH 프로파일은 많은 리소좀-외 기능에 의한 것일 수 있고 proScCtL의 pH 프로파일은 기생충 생물체 유래의 다른 카텝신과 일치하는 것으로 보인다.
기질로서 Z-Phe-Arg-AMC를 이용한 proScCtL의 프로테아제 활성 상의 저해제 효과는 표 2에 나타나 있다.
Figure 112007092976330-PAT00003
세린, 아스파르트산 또는 메탈로-프로티나제를 특이적으로 저해하는 것으로 알려진 시약은 proScCtL의 활성 상에 검출 가능한 영향을 미치지 않았다. 이와 대조적으로 proScCtL의 효소 활성은 E64 및 류펩틴을 포함한 시험된 모든 시스테인 프로테아제 저해제로 크게 감소되거나 완전히 차단되었다. 류펩틴은 100 μM로 100% 이상의 저해를 나타내어 시험된 저해제 중 가장 유력한 저해제이었다. 시스테인 프로테아제-특이적 저해제인 E-64 50 μM 존재시 100% 저해가 관찰되었다. 이들 민감도는 우진드기 카텝신 L과 유사하였다. 이들 결과는 proScCtL이 시스테인 프로티나제 활성을 나타낸다는 결론을 지지한다.
proScCtL -특이적 폴리클론 항체의 생성 및 도트-블럿 면역에세이
토끼 항체를 이용하여 도트-블럿 면역에세이 및 웨스턴 블럿이 재조합 proScCtL 단백질 및 고유 스쿠티카충 카텝신 L 단백질의 검출을 위해 수행되었다. 웨스턴 블럿은 토끼 폴리클론 항체가 재조합 proScCtL 단백질의 민감한 검출을 가능하게 함을 나타내었다(도 2B).
도트-블럿 면역에세이는 토끼 proScCtL-특이적 폴리클론 항체가 유로네마 마리눔 카텝신 L 단백질의 민감한 검출을 가능하게 함을 나타내었다. 결과는 유로네마 마리눔 카텝신 L 단백질이 고유의 유로네마 마리눔 세포질 단백질 약 10 ng의 농도에서 검출 가능함을 나타내었다. 또한 가장 강한 신호는 스쿠티카충 유래 세포질 및 멤브레인의 레인 C 및 D에서 관찰되었다. 이와 대조적으로 음성 대조군에서는 신호가 관찰되지 않았다(도 3). 이들 데이터는 proScCtL-특이적 폴리클론 항체를 이용한 도트-블럿 검출 시스템이 스쿠티카충의 민감하고 특이적인 검출에 유용한 방법임을 입증함을 나타낸다.
이하 실시예를 통해 본 발명을 더욱 상세히 설명한다. 그러나 이러한 실시예들로 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
(기생충)
섬모충은 한국의 일부 지방 양어장에서 채취된 넙치 파랄리크티스 올리바세우스의 뇌에서 분리되었다. 유로네마 마리눔의 동정 및 시험관 내 양식은 Jee BY et al., Dis Aquat Org 47:49-55, 2001에 나타난 바와 같이 수행되었다.
(실시예 1) 전체-길이 ScCtL의 클로닝
스쿠티카충 카텝신 L-유사 시스테인 프로테아제(ScCtL)를 암호화하는 일부 cDNA가 유로네마 마리눔 cDNA 라이브러리 유래 유전자 벡터 프라이머 T7과 함께 2개의 센스 프라이머인 Cys-For1(5'-TGYGGTKCWTGCTGGRSYTT-3')(서열번호: 3) 및 Cys-For2(5'-TCTGARYAABAWYTBGTTYTG-3')(서열번호: 4)를 이용한 PCR에 의해 증폭되었다. ScCtL의 전체-길이 카피를 수득하기 위해 cDNA 말단 5'-신속 증폭(RACE) PCR이 제조사의 지침에 따라 GeneRacerTM Kit(Invitrogen)를 이용하여 수행되었다. 5'RACE-PCR 생성물은 ScCtL-특이적 프라이머(안티센스 프라이머: 5'GSP1, 5'-TAACGCAAATAACTCTTTCACTTTAGG-3'(서열번호: 5) 및 5'GSP 5'-TGGAAATAAAATCACAACCTAGTCTAC-3'(서열번호: 6)) 및 GeneRacerTM 프라이머(Invitrogen)를 이용한 PCR에 의해 증폭되었다. 각각의 최종 PCR 생성물은 제조사의 지침에 따라 형질전환되고 ABI 377 자동화 서열 분석기(Applied BiosystemsTM) 상에서 서열 분석된 DH5αMCR 경쟁 세포를 이용하여 pGEM-T Easy vector(Promega) 내로 클론되었다. 서열 분석 후 3'-cDNA 라이브러리 및 5'RACE PCR 생성물 각각은 그들의 중복을 이용하여 융합되었다.
(실시예 2) 서열 및 계통발생 분석
DNA 및 추정 단백질 서열은 윈도우용 DNAsis 버전 2.5(Hitachi Software Engineering)를 이용하여 분석되었다. 서열 분석 자료는 BLAST 프로그램(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)를 이용하여 데이터베이스와 비교되었다. 추론된 단백질 서열은 SignalP 3.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP)으로 신호 펩타이드에 대해 분석되었다. 다중 서열 정렬은 CLUSTALW 버전 1.8을 이용하여 수행되었고 BioEdit Sequence Alignment Editor 버전 5.0.9를 이용하여 조정되었다. 계통수는 이웃-인접 방법을 이용하여 구축되었고 MEGA 버전 3.0으로 플롯되었다.
(실시예 3) ScCtL의 자리-지정 돌연변이유발
E. coli 내 ScCtL의 과발현을 위해 PCR-매개 자리-지정 돌연변이유발을 이용하여 암호화 서열 내 17개의 UAA 또는 UAG 종결 코돈을 CAA 또는 CAG 글루타민 코돈으로 전환시키도록 돌연변이유발 올리고뉴클레오타이드가 이용되었다(표 1).
먼저 Cys-FBamHI(*1-3) 및 Cys-R(*17)이 위치 1-3 및 17에서 종결 코돈의 전환을 위해 프라이머 세트로 이용되었고, Cys-F(*4) 및 Cys-RXhoⅠ이 위치 4에서 종결 코돈의 전환을 위해 이용되었다. 첫 번째 단계는 50 ㎕ 최종 부피 내 2.5 단위의 pfu DNA 중합효소(Bioneer)를 이용하여 Cys-FBamHI와 Cys-R 프라이머 및 Cys-F와 Cys-RXhoI 프라이머로 변성(94℃, 30초), 어닐링(55℃, 30초) 및 연장(72℃, 50초) 35 사이클의 GeneAmp 2400 PCR 시스템(Perkin-Elmer) 내에서 수행되었다. PCR 생성물은 AccuPrep PCR Purification Kit(Bioneer)로 정제되었다. 2 ㎕의 정제된 PCR 생성물이 다음 단계 내 효율적인 어닐링 및 연장을 위해 이용되었다. 어닐링 및 연장을 위한 두 번째 단계는 하기와 같이 수행되었다: 60℃에서 30초간 어닐링, 72℃에서 50초간 연장 및 94℃에서 20초간 변성, 프라이머를 제외하고 20 사이클. 이후 수득된 생성물은 세 번째 단계에서 이용되었다. 세 번째 단계는 상기와 동일한 프라이머 세트로 변성(94℃, 30초), 어닐링(55℃, 30초) 및 연장(72℃, 50초) 35 사이클로 수행되었고 PCR 생성물은 또다른 어닐링 및 연장 단계를 통과하였다. 이러한 방식으로 유로네마 마리눔 카텝신 L의 종결 코돈 *1-4 및 *7이 전환되었고 이후의 돌연변이유발의 주형으로 이용가능하게 되었다. 상기 첫 번째 단계 내지 세 번째 단계의 방법은 잔여 종결 코돈의 전환을 위해 순서대로 반복되었다. 최종적으로 이러한 방법은 합성 대립유전자를 생성하였고 스쿠티카충 전-카텝신 L을 돌연변화하였다. 증폭된 생성물은 Taq 중합효소의 3' A-테일링 이후 pCR-2.1 TOPO 벡터(Invitrogen) 내로 클론되고 서열 분석되었다.
(실시예 4) E. coli 유래 재조합 proScCtL의 발현, 재중첩 및 정제
돌연변이화된 유로네마 마리눔 전-카텝신 L이 절단된 후 pGEX-4T-1(Amersham Pharmacia Biotech) 내로 클론되었다. proScCtL/pGEX-4T-1로 명명된 재조합 플라스미드가 E. coli BL21(DE3) 내로 형질전환되었고 단백질 발현은 0.4 mM까지의 IPTG 첨가에 의해 유도되었고 37℃에서 추가 3시간 동안 상기 박테리아를 생장시켰다. 세포는 20,000 × g로 20분간 원심분리에 의해 채취되었다. 수집된 포함체는 4℃에서 1시간 동안 교반함으로서 0.1 M Tris/pH 8.0 및 1 mM DTT를 함유한 8 M 요소 용액 내에 용해되고 20,000 × g로 20분간 원심분리되었다. 재중첩은 4℃에서 13시간 동안 1 M 요소, 0.1 M Tris/pH 8.0, 1 mM DTT, 5 mM EDTA, 5 mM DL-시스테인, 0.05 mM L-시스테인, 5% 글리세롤에 대한 투석에 의해 수행되었다. 또한 용해된 단백질은 4℃에서 8시간 동안 0.1 M Tris/pH 8.0, 1 mM DTT, 5 mM EDTA에 대해 투석되고 최종적으로 4℃에서 밤새 PBS에 대해 투석되었다. 침전된 단백질을 제거하기 위해 12,000 × g에서 10분간 원심분리 후 재중첩된 단백질(proScCtL)은 제조사의 지침에 기술된 바와 같이 글루타티온-Sepharose 4B 컬럼(Pharmacia Biotech Co., USA) 상에서 친화력 정제되고 Centricon 10 농축기(Amicon)를 이용하여 농축되었다. 정제된 proScCtL 효소는 SDS-PAGE에 의해 분석되고 쿠마시 블루로 염색되었고 단백질 농도는 BioRad 단백질 분석 시약을 이용하여 측정되었다.
(실시예 5) 재조합 proScCtL의 SDS-PAGE 및 효소도
SDS-PAGE는 Laemmli의 방법 (Laemmli UK. Nature 227:680-685, 1970)에 의해 수행되었다. 젤라티나제 활성 및 재조합 proScCtL의 분자량의 측정을 의해 젤라틴(0.1%) 기질 효소도가 수행되었다. 4℃에서의 전기영동 후 실온에서 1시간 동안 2.5% Triton X-100 내에서 이를 인큐베이트시킴으로서 겔에서 SDS가 제거되었다. 이후 겔은 37℃에서 18시간 동안 5 mM DTT를 지닌 0.1 M 아세트산나트륨 완충액(pH 4.5) 내에서 인큐베이트되었다.
(실시예 6) 효소 활성 및 저해의 분석
재조합 proScCtL의 형광측정 분석은 하기 기질 및 반응 혼합물의 변화를 제외하고는 Lim SU et al., Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol 142:283-292, 2005에 기술된 바와 같이 수행되었다. 간단하게는 AMC(7-아미노-4-메틸쿠마린) 형광단을 포함한 기질의 가수분해는 Microplate Fluorometer(Packard Co., USA) (여기 파장: 380 nm 및 방출 파장: 460 nm)를 이용한 미량 역가판 포맷 내에서 수행되었다. 합성 기질인 카르보벤즈옥시-페닐알라닐-아르기닐-AMC(Z-Phe-Arg-AMC), 카르보벤즈옥시-글리시닐-글리시닐-아르기닐-AMC(ZGly-Gly-Arg-AMC) 및 카르보벤즈옥시-아르기닐-아르기닐-AMC(Z-Arg-Arg-AMC) (Sigma)가 활성 분석용 또는 카텝신 L 프로테아제의 저해 분석용 기질로 사용되었다. 분석은 100 ㎕의 총 부피(25 mM 아세트산나트륨/pH 4.5(또는 필요시 다른 pH) 및 0.2 mM DTT) 내에서 37℃로 수행되었다. 기질은 0.1 mM의 최종 농도 또는 필요시 다른 농도로 첨가되었다. 다양한 저해제의 효과는 Lim SU et al., Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol 142:283-292, 2005에 기술된 바와 같이Z-Phe-Arg-AMC를 이용하여 잔여 효소 활성을 측정함으로서 조사되었다. 모든 분석은 3반복으로 수행되었다.
(실시예 7) 재조합 proScCtL의 항혈청의 생성 및 웨스턴 블럿팅
proScCtL 단백질은 1차 주입용 완전 Freund 보강제 및 3회 추가 접종용 불완전 Freund 보강제로 뉴질랜드 토끼를 면역화시키는데 이용되었다. 이후 혈청은 단백질 A-Sepharose 컬럼(Amersham Bioscience)으로 통과되고 IgG 분획이 용출되고 웨스턴 블럿팅 및 도트-블럿 면역에세이에 이용되었다. E. coli에서 발현된 정제된 proScCtL은 12% SDS-PAGE에 의해 분리되고 니트로셀룰로즈(NC) 멤브레인(Schleicher & Schuell Co., USA)으로 옮겨졌다. 멤브레인은 TTBS(200 mM Tris/pH 7.0, 1.37 M NaCl, 1% Tween-20) 내 3% BSA로 차단되고 1:200 희석된 토끼 항-proScCtL 폴리항체로 4℃에서 18시간 동안 프로브되었다. 멤브레인은 0.05% Tween-20을 함유한 PBS(PBS-T)로 3회 세척되고 1:1000 희석된 포스파타제 표지된 염소 항-토끼 IgG 항체(Kirkegaard Perry Laboratories Co., USA) 내에서 실온에서 90분간 더욱 인큐베이트되었다. 면역반응 밴드는 AP 접합 키트(Bio-Rad Co., USA)에 의해 가시화되었다.
(실시예 8) 하위 세포 분획화 및 도트-블럿 면역에세이
하위 세포 분획화를 위해 정상 파랄리크티스 올리바세우스 및 유로네마 마리눔이 20 mM Tris 완충액(pH 7.5, 1 mM EGTA 및 1mM DTT) 내에서 용해된 후 4℃에서 10분간 1000 × g로 원심분리되었다. 상청액(전체)이 수집되고 4℃에서 1시간 동안 100,000 × g로 재원심분리되었다. 세포질 분획은 재원신분리 상청액에서 수집되었고 잔존 펠렛(천연 멤브레인)은 Triton X-100을 함유한 용해 완충액 내에 재현탁된 후 4℃에서 1시간 동안 100,000 ㅧ g로 원심분리되었다. 단백질 농도는 Bradford 방법으로 측정되었고 모든 분획은 사용 전까지 -80℃에서 보관되었다.
proScCtL 항체의 민감도 및 특이성은 도트-블럿 면역에세이에 의해 분석되었다. 도트-블럿 면역에세이는 Kim YI et al., Process Biochem 42:134-140, 2007에 기술된 바와 같이 수행되었다. 유로네마 마리눔 유래 전체, 멤브레인 및 세포질 분획 및 넙치 유래 전체, 세포질 및 멤브레인 단백질이 이용된 후 재조합 proScCtL 단백질이 양성 대조군으로 이용되었다. PBS 내에서 1 ㎍에서 0.1 ng으로 희석된 단백질 표본이 NC 멤브레인(Schleicher & Schuell Co., USA) 상에 점 찍히고 1:1000 희석된 토끼 항-proScCtL 폴리항체로 프로브되었다.
도 1은 스쿠티카충 카텝신 L-유사 시스테인 프로테아제의 추정 아미노산 서열과 호모 사피엔스 카텝신 L의 프리-프로(pre-pro)-영역(A) 및 성숙 효소(B)와의 비교를 나타낸 것이다. 동일한 아미노산 잔기는 흑색으로 나타나 있고, 유사한 아미노은 회색으로 나타나 있고, 관련 잔기는 백색 바탕이고, 아미노산수는 우측에 나타나 있다. 프로-영역 내 보존된 사이-공간 모티프인 Glu, X3, Arg, X2, (Ile/Val), Phe, X2, Asn, X3, Ile, X3, Asn('ERFNIN': 아미노산의 단문자 코드로 명명됨; X는 임의의 아미노산) 및 GNFD 모티프는 (A)의 정렬의 상단에 나타나 있다. 화살표는 ScCtL 내 추정 신호 절단 사이트를 나타낸다. ScCtL의 시스테인 잔기는 매우 보존된 펩타이드 서열인 CGSCWAFS 내 매몰되어 있다. 시스테인 프로티나제 촉매 삼조체 잔기(C, H 및 N은 별표(*)로 표시되어 있다. 정렬은 Clustal W 알고리즘을 이용한 BioEdit Sequence Alignment Editor, 버전 5.0.9를 이용하여 생성되었다. GenBank/EMBL/DDBJ 데이터베이스(괄호 내 등록번호)에서 추출된 정렬된 아미노산 서열은 HsCtL, 호모 사피엔스 카텝신 L(NP 001903); HsCtS, 호모 사피엔스 카텝신 S(AAC37592); HsCtK, 호모 사피엔스 카텝신 K(NP 000387); HsCtH, 호모 사피엔스 카텝신 H(P09668); HsCtV, 호모 사피엔스 카텝신 V(B001928); HsCL2, 호모 사피엔스 카텝신 L2 (CAI15053).
도 2는 재조합 proScCtL의 발현, 정제 및 특성을 나타낸 것이다. 도 2(A) 는 SDS-PAGE 후 쿠마시 블루 염색을 나타낸다. 레인 M, 표준 크기 마커; 레인 1, 과발현된 GST 단백질; 레인 2, 비-유도된 GST-융합 proScCtL 유래 전체 단백질; 레인 3, IPTG-유도된 proScCtL 유래 단백질; 레인 4, 글루타티온-Sepharose 4B 친화성 컬럼 정제된 proScCtL. 도 2(B)는 proScCtL에 대한 항-proScCtL 폴리클론 항체와의 반응 능력을 측정하기 위해 수행된 웨스턴 블럿을 나타낸다. 레인 M, 전염색된 단백질 크기 마커; 레인 1, 항-proScCtL 폴리클론 항체와 반응하는 proScCtL의 발현 단백질. 도 2(C)는 proScCtL의 젤라틴 효소도를 나타낸다. 단백질 분해 영역은 겔 내 투명 영역을 나타낸다. 화살표는 추정된 proScCtL을 나타낸다. 레인 1, 정제된 GST 단백질(4 ㎍); 레인 2, 정제된 proScCtL 단백질(4 ㎍). 도 2(D)는 proScCtL의 pH 의존도를 나타내다. 최대 단백질 분해 활성은 100%로 간주되었다. 점 및 막대는 각각 3회 독립 실험의 평균 수치 및 S.D.를 나타낸다.
도 3은 도트-블럿 면역에세이 내 항-proScCtL의 민감도를 나타낸 것이다. 레인 A, 양성 대조군, 정제된 proScCtL 단백질; 레인 B, 유로네마 마리눔의 전체 단백질; 레인 C; 유로네마 마리눔의 세포질 분획; 레인 D, 유로네마 마리눔의 멤브레인 분획; 레인 E, 정상 파랄리크티스 올리바세우스의 전체 단백질; 레인 F, 정상 파랄리크티스 올리바세우스의 세포질 분획; 레인 G, 정상 파랄리크티스 올리바세우스의 멤브레인 분획; 레인 1∼5, 실험 단백질의 10-배 희석(10 ㎍∼1 ng).
<110> Pukyong National University Industry-University Cooperation Foundation <120> Cathepsin L-like cysteine protease obtained from mutated cDNA clone <160> 6 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1476 <212> DNA <213> Uronema marinum <400> 1 ggacactgac atggactaag gagtagaaaa aacataaata aattaaataa acaaacaaat 60 aattcaatat gcctcccaaa gtcgacccca acgaaattaa atacatcaga attaaagtct 120 tcggaggaga aggaggaccc gccgccacct tagcccctaa attaggtccc ttaggtctta 180 acgcaaataa ctctttcact ttagggaaca cgaaggagta gagcgactgg agcacgagga 240 cactgacatg gactgaagga gtagaaacga ctggagcacg aggacactga catggactga 300 agggtagaaa aaaaaaaaaa aaaaaaatga aaacagccgc tatcttgtta gttttgttgg 360 ccttagccgg aacatctctc ttcttctaag aaaattaata gacctcttta gaagctactg 420 cattcggaaa attcaaagaa tggaaataaa atcacaacct agtctactct tcaagtgaag 480 atgcctatag attctaagtt tattttgaaa atttctaatt tgtcgaagaa tttaacgcaa 540 ataactcttt cactttagga gttgaaaatt aattcgctgc catgaccaat gaagaattca 600 aagcctaatt tactagtgaa attattagcg aaggatacaa ttatcaataa gttgacagaa 660 atgtttatga agccgttaat gcccctagtg gatctgttaa ctgggtttct aaaggagctg 720 tttaaggagt ttaaaattag ggagtttgtg ggtcttgttg ggctttctct gctgtttgct 780 ctttggaaag actttacaaa atcaacactg gaaaattgct cagcttctct gagtaataac 840 ttgtttcttg tgaacctaaa tcttacggat gtgacggagg atggcctgaa gctgcctttg 900 cttactcagc tacccacgga ttagaatctt ccgcctctta cccctacgtt caacaaaaaa 960 atggaaaaac cgcctcttgc caatacaatt cttctaaagc caccaaagga attaacaaat 1020 catacaaaaa tgtcgccgcc aatagccctg actccattta caatgcctta gttaaataac 1080 ctctttccat tttagttgat gccagttctt cagtctttta gcactacggt tctggggtta 1140 ttaactctac tgcctgtgga actactttga accacgctat taatgttgtt gggtatagtg 1200 ggagtgtttg gactttgaga aattcttggg gaactacttg gggagaaaaa gggtatgcaa 1260 gagtttaata ttctacagga gctggatatt gtggtatgaa cagatcagcc tcatatccca 1320 ctaactgata aatttgaaaa acatataatt tagcaatttt tattaaaaat tatatcataa 1380 aaacaaatta atagtgtaat attttttaaa atatttacat aatttaatca aatattcatc 1440 acacacttat ttatttaaaa taaaaaaaaa aaaaaa 1476 <210> 2 <211> 333 <212> PRT <213> Uronema marinum <400> 2 Met Lys Thr Ala Ala Ile Leu Leu Val Leu Leu Ala Leu Ala Gly Thr 1 5 10 15 Ser Leu Phe Phe Gln Glu Asn Gln Gln Thr Ser Leu Glu Ala Thr Ala 20 25 30 Phe Gly Lys Phe Lys Glu Trp Lys Gln Asn His Asn Leu Val Tyr Ser 35 40 45 Ser Ser Glu Asp Ala Tyr Arg Phe Gln Val Tyr Phe Glu Asn Phe Gln 50 55 60 Phe Val Glu Glu Phe Asn Ala Asn Asn Ser Phe Thr Leu Gly Val Glu 65 70 75 80 Asn Gln Phe Ala Ala Met Thr Asn Glu Glu Phe Lys Ala Gln Phe Thr 85 90 95 Ser Glu Ile Ile Ser Glu Gly Tyr Asn Tyr Gln Gln Val Asp Arg Asn 100 105 110 Val Tyr Glu Ala Val Asn Ala Pro Ser Gly Ser Val Asn Trp Val Ser 115 120 125 Lys Gly Ala Val Gln Gly Val Gln Asn Gln Gly Val Cys Gly Ser Cys 130 135 140 Trp Ala Phe Ser Ala Val Cys Ser Leu Glu Arg Leu Tyr Lys Ile Asn 145 150 155 160 Thr Gly Lys Leu Leu Ser Phe Ser Glu Gln Gln Leu Val Ser Cys Glu 165 170 175 Pro Lys Ser Tyr Gly Cys Asp Gly Gly Trp Pro Glu Ala Ala Phe Ala 180 185 190 Tyr Ser Ala Thr His Gly Leu Glu Ser Ser Ala Ser Tyr Pro Tyr Val 195 200 205 Gln Gln Lys Asn Gly Lys Thr Ala Ser Cys Gln Tyr Asn Ser Ser Lys 210 215 220 Ala Thr Lys Gly Ile Asn Lys Ser Tyr Lys Asn Val Ala Ala Asn Ser 225 230 235 240 Pro Asp Ser Ile Tyr Asn Ala Leu Val Lys Gln Pro Leu Ser Ile Leu 245 250 255 Val Asp Ala Ser Ser Ser Val Phe Gln His Tyr Gly Ser Gly Val Ile 260 265 270 Asn Ser Thr Ala Cys Gly Thr Thr Leu Asn His Ala Ile Asn Val Val 275 280 285 Gly Tyr Ser Gly Ser Val Trp Thr Leu Arg Asn Ser Trp Gly Thr Thr 290 295 300 Trp Gly Glu Lys Gly Tyr Ala Arg Val Gln Tyr Ser Thr Gly Ala Gly 305 310 315 320 Tyr Cys Gly Met Asn Arg Ser Ala Ser Tyr Pro Thr Asn 325 330 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 3 tgyggtkcwt gctggrsytt 20 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 4 tctgaryaab awytbgttyt g 21 <210> 5 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 5 taacgcaaat aactctttca ctttagg 27 <210> 6 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 6 tggaaataaa atcacaacct agtctac 27

Claims (5)

  1. 카텝신 L-유사 시스테인 프로테아제(ScCtL)를 발현하는 서열번호: 1의 DNA 염기 서열 중 387∼389번째, 396∼398번째, 399∼401번째, 447∼449번째, 495∼497번째, 516∼518번째, 570∼572번째, 606∼608번째, 648∼650번째, 723∼725번째, 732∼734번째, 738∼740번째, 834∼836번째, 837∼839번째, 1077∼1079번째, 1119∼1121번째, 1266∼1268번째 잔기인 TAA 또는 TAG를 CAA 또는 CAG로 티아민(T)을 시토신(C)으로 자리-지정 돌연변이시킨 카텝신 L-유사 시스테인 프로테아제를 암호화하는 변이된 DNA 클론
  2. 제 1항에 있어서, 상기 변이된 DNA 클론 중 자리-지정 돌연변이된 염기 부위는 글루타민을 암호화함을 특징으로 하는 변이된 DNA 클론
  3. 제 1항의 변이된 DNA 클론을 포함하는 형질전환 벡터를 대장균에서 발현시켜 제조된 서열번호: 2의 아미노산 서열을 지니는 카텝신 L-유사 시스테인 프로테아제
  4. 서열번호: 2의 아미노산 서열을 지닌 스쿠티카충의 카텝신 L-유사 시스테인 프로테아제에 대한 결합친화성을 갖는 폴리클로날 항체
  5. 제 3항의 카텝신 L-유사 시스테인 프로테아제를 길항 저해시켜 스쿠티카충(Uronema marinum)으로부터 어류 숙주의 생장을 보호하는 방법
KR1020070137077A 2007-12-26 2007-12-26 변이된 ｃＤＮＡ 클론으로부터 수득된 카텝신 Ｌ-유사시스테인 프로테아제 KR20090069423A (ko)

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* Cited by examiner, † Cited by third party
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