JP2001513992A

JP2001513992A - 新規の組織特異的カルパイン、その製造およびその使用

Info

Publication number: JP2001513992A
Application number: JP2000507788A
Authority: JP
Inventors: ベームトーマス; ティーディアニール
Original assignee: BASF SE
Current assignee: BASF SE
Priority date: 1997-08-26
Filing date: 1998-08-19
Publication date: 2001-09-11
Also published as: BR9811365A; WO1999010480A2; NO20000961L; HUP0004027A2; KR20010023282A; CA2301815A1; NO20000961D0; ZA987660B; EP1009811A2; IL134361A0; DE19737105A1; CN1277634A; WO1999010480A3; AU9263598A

Abstract

(57)【要約】新規の組織特異的カルパインを明細書に記載のように製造する。新規のカルパインインヒビターのスクリーニング方法およびその使用を記載している。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明は新規の組織特異的カルパインおよびその製造に関する。

【０００２】更に、本発明は新規カルパインインヒビターをスクリーニングするための方法
およびその使用に関する。

【０００３】カルパインは、システインプロテアーゼグループの細胞内の非リソソーム酵素
の範疇である。これらは真核細胞におけるＣａ²⁺依存性のシグナルトランスダク
ションに関連している、すなわちＣａ²⁺濃度に依存して細胞機能を制御する。カ
ルパインは動物組織ならびに、例えばヒト、ニワトリ、ウサギもしくはラットの
細胞中に偏在している。また、カルパインは下等動物、例えばドロソフィラメラノガスター、住血吸虫またはケノルハビティスエレガンスにおいても見出されている。酵母、真菌もしくは細菌においてはカルパインはまだ検出されていな
い。

【０００４】最近では、これらの偏在カルパインの３種の主要なイソ型が知られ、かつその
インビトロでのカルシウムに依存する活性能によって分類されている。カルパイ
ンＩ（＝μカルパイン）はμＭのカルシウム濃度で活性化するが、カルパインＩ
Ｉ（＝ｍカルパイン）はｍＭ濃度のカルシウムで活性化する。両者のカルパイン
は２個のサブユニット（１個の約８０ｋＤａの大サブユニットおよび１個の約３
０ｋＤａの小サブユニット）で構成されている。活性なヘテロダイマーの両者の
サブユニットはカルシウムのための結合部位を有している。大サブユニットは以
下の４つのタンパク質ドメイン（＝Ｉ〜ＩＶ）：プロテアーゼドメイン（＝ドメ
インＩＩ）、カルシウム結合ドメイン（＝ドメインＩＶ）および２個の機能が明
らかでないドメイン（＝ドメインＩおよびＩＩＩ）から構成されている。３０Ｋ
の小サブユニットはカルシウム結合サブユニット（＝ＩＶ′）および機能が明ら
かでない別のサブユニット（＝Ｖ）から構成されている。前記の２つのタイプの
カルパインの他に、カルシウム活性化（calcium activation）に関する中間物質
である第３のタイプ（＝μ／ｍ８０Ｋ）がニワトリで見出されている（Wang K.
K.W. et al., TiPS, Vol. 15, 1994: 412-419, Suzuki, K et al., Biol. Chem.
Hoppe-Seyler, Vol. 376, 1995: 523-529）。

【０００５】前記の偏在するカルパインの他に、最近、２種の新規の組織特異的に発現する
カルパインが同定されている。ｎＣＬ−１（＝ｐ９４）はニワトリ、ラットおよ
びヒトに存在しており、かつモノマーとして活性化し、わずか８０ｋｄのサブユ
ニットからなることが想定されている筋肉特異的カルパインである。ｎＣＬ−１
の他に、２種のスプライシング変異体（splicing variant）のｎＣＬ−２および
ｎＣＬ−２′で存在することがある胃特異性カルパインがある。ｎＣＬ−２′は
カルシウム結合領域の不在によってｎＣＬ−２とは異なる（Sorimachi, H.S. et
al., J. Biol. Chem. Vol. 268, No. 26, 1993: 19476-19482, Sorimachi, H:S
: et al., FEBS Lett. 343, 1994: 1-5）。アクチンと相互作用し、かつ恐らく胚発生において重要な役割を担い、かつ２種の異なるスプライシング変異体を有
するカルパイン相同タンパク質（＝ＣａｌｐＡ）はショウジョウバエにおいて見
出されている（Mol. Cell. Biol. Vol. 15, No. 2, 1995: 824-834）。この場合
にも、より短い変異体はカルシウム結合部位が欠損している。

【０００６】カルパインは種々の生理学的プロセスにおいて重要な役割を担うと考えられて
いる。多数の細胞骨格タンパク質、膜結合タンパク質もしくは調節タンパク質、
例えばプロテインキナーゼＣ、ホスホリパーゼＣ、スペクトリン、細胞骨格タン
パク質、例えばＭＡＰ２、筋肉タンパク質、神経フィラメントおよび神経ペプチ
ド、血小板タンパク質、上皮成長因子、ＮＭＤＡ受容体および有糸分裂に関連す
るタンパク質ならびに他のタンパク質がカルパインの基質である（Barrett M.J.
et al., Life Sci. 48, 1991: 1659-69, Wang K.K. et al., Trends in Pharma
col. Sci., 15, 1994: 412-419）。しかしながら、カルパインの通常の生理学的
機能は依然として明確に理解されていない。これらは多数の生理学的プロセス、
例えばアポトーシス、細胞分裂および分化または胚発生に関連している。

【０００７】種々の病態生理学的プロセスおよび疾患、例えば：心臓の虚血（例えば心筋梗塞）、腎臓の虚血もしくは中枢神経系の虚血（例えば
発作）、炎症、筋ジストロフィー、眼の白内障（灰色白内障）、中枢神経系への
損傷（例えば外傷）、アルツハイマー病、ＨＩＶ誘導性神経疾患（HIV-induced
neuropathy）、パーキンソン病およびハンチントン病等（前記Wang K.K.参照）においてカルパイン濃度の上昇が測定されている。前記の疾患と上昇しかつ持続
する細胞内のカルシウム濃度との間には関連があると考えられている。このこと
により結果としてカルシウム依存性プロセスが過剰に活性化し、もはや生理学的
コントロールを行えなくなる。それに相応して、カルパインの過剰な活性化が病
態生理学的プロセスを引き起こすこともある。

【０００８】以上のことが、前記の疾患の治療のためにカルパイン酵素のインヒビターが有
用なことがあると想定された所以である。これは種々の調査によって立証されて
いる。このように、Ｓｅｕｎｇ−ＣｈｙｕｌＨｏｎｇ他（Stroke 1994, 25(3),
663-669）およびＢａｒｔｕｓＲ．Ｔ．他（Neurological Res. 1995, 17, 249
-258）は、カルパインインヒビターが発作の後に生じるような急性神経変性疾患
における神経保護効果を有すると示している。同様に、実験的な脳の損傷の後に
、カルパインインヒビターは記憶欠損（memory deficit）および神経支配障害（
neuromotor disturbance）の発生からの回復を改善した（Saatman K.E. et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93, 1996: 3428-3433）。ＥｄｅｌｓｔｅｉｎＣ．Ｌ．他（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92, 1995, 7662-7666）は、カルパインインヒビターが低酸素症によって損傷された腎臓に保護効果を有することを
見出した。ＹｏｓｈｉｄａＫ．Ｉ．他（Jap. Circ. J. 59(1), 1995, 40-48）は、カルパインインヒビターが虚血もしくは再潅流によって惹起される心臓のダ
メージの後に有用な効果を有すると示すことができた。カルパインインヒビター
はβ−ＡＰ４タンパク質の放出を阻害するので、アルツハイマー病の治療のため
の潜在的な使用が提案されている（Higaki J. et al., Neuron, 14, 1995: 651-
659）。同様に、インターロイキン−１αの放出もカルパインインヒビターによって阻害される（Watanabe N. et al., Cytokine, 6(6), 1994: 597-601）。更にカルパインインヒビターが腫瘍細胞に対して細胞傷害効果を有すると見出され
ている（Shiba E. et al., 20th Meeting Int.Ass.Breast Cancer Res., Sendai
Jp, 1994, 25.-28. Sept., Int. J. Onco. 5(Suppl.), 1994, 381）。またカル
パインは再狭窄および関節炎において重要な役割を担っており、かつカルパイン
インヒビターは該病理に有用な効果を有することがある（March K:L: et al. Ci
rc. Res. 72, 1993: 413-423, Suzuki K. et al., Biochem J., 285, 1992: 857
-862）。

【０００９】カルパインインヒビターの他の可能な使用はＷａｎｇＫ．Ｋ（Trends in Pha
rmacol. Sci., 15, 1994: 412-419）に見出せる。

【００１０】最も強力でありかつ選択的なカルパインインヒビターは天然産生の細胞内タン
パク質カルパスタチンである。これはカルパインＩおよびカルパインＩＩの両者
を阻害するが、他のシステインプロテアーゼおよびチオールプロテアーゼ、例え
ばカテプシンＢ、Ｌもしくはパパインは阻害しない。しかしながら、カルパスタ
チンは約７００アミノ酸からなる大きさならびに細胞膜を通過できないことから
予想される治療のためには不適であるという欠点を有する。低分子量のカルパイ
ン阻害タンパク質の他に、非ペプチド性インヒビターも幾つか同定されている。
これらのインヒビターの欠点は、これらが不安定であり、迅速に代謝され、かつ
これらの幾つかが毒性を有することである。多くのカルパインインヒビターは更
に不十分な選択性を有する、即ちこれらはカルパインＩおよびＩＩだけでなく、
他のシステインプロテアーゼ、例えばパパイン、キモトリプシン、エラスターゼ
もしくはカテプシンＢおよびＬも阻害する。

【００１１】従って、選択的および非常に効果的なカルパインインヒビターが必要とされ続
けている。選択的なインヒビターの同定を可能にする前記の選択的および非常に
効果的なカルパインインヒビターをスクリーニングするために非常に特異的な試
験系が必要である。通常、スクリーニング試験は偏在するカルパインＩおよびカ
ルパインＩＩを使用して実施される。

【００１２】選択的なインヒビターを見出すためには、試験のためにできる限り組織特異的
に発現する他のカルパインを提供することが必要かつ望ましく、その結果、イン
ヒビターを個々のカルパイン間でその選択性に関して試験することができる。

【００１３】更に、他の新規カルパインが探索されている。それというのも、これらは恐ら
く種々の病理において別々に発現しかつ前記の疾患に重要な役割を担っているタ
ンパク質だからである。

【００１４】本発明の課題は、一方で１種だけのカルパインに対して阻害効果を有し、かつ
／または他方で複数のカルパインに阻害効果を有するカルパインインヒビターを
同定し、かつこれらを治療ターゲットとして提供することを可能にするカルパイ
ンインヒビターの識別および同定のための手段を提供することである。

【００１５】前記課題は配列ＳＥＱＩＤＮＯ：１またはＳＥＱＩＤＮＯ：３を有しかつ名称
がＣＡＰＮ６であり、カルパイン遺伝子、その対立変異体（allelic variant）、類似体もしくは誘導体が以下の配列：（ａ）Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ａｌａ、該配列は、カルパインＩの位置１１５を占めるヒトのカルパインＩのアミノ酸シ
ステインを配列ＳＥＱＩＤＮＯ：１およびＳＥＱＩＤＮＯ：３の位置８１である
リシンに変えたヒトのカルパインＩの相応の配列と異なる；（ｂ）Ａｌａ−Ｘ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ−Ｌｅｕ−Ａｌａ、ヒトのカルパインＩの相応の配列と比較して位置１２２および１２５のアミノ酸
のアラニンおよびトレオニンが配列ＳＥＱＩＤＮＯ：１およびＳＥＱＩＤＮＯ：
３の位置８８および９１のセリンおよびアラニンに変わっている；（ｃ）Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−（ＨｉｓまたはＴｙｒ）−Ｔｈｒ−Ｘ−Ｔｈｒ
、ヒトのカルパインＩの相応の配列と比較して、位置２７２、２７３および２７５
のアミノ酸のヒスチジン、アラニンおよびセリンが配列ＳＥＱＩＤＮＯ：１およ
びＳＥＱＩＤＮＯ：３の位置２５２、２５３および２５５のチロシン、トレオニ
ンおよびトレオニンに変わっており、更にＳＥＱＩＤＮＯ：３においてカルパイ
ンＩの位置２７４のチロシン残基がＳＥＱＩＤＮＯ：３の位置２５４のヒスチジ
ンに変わっている；（ｄ）Ａｒｇ−Ｘ−Ａｒｇ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ、該配列は、カルパインＩの位置２９８を占拠しているヒトのカルパインＩのアミ
ノ酸トリプトファンが配列ＳＥＱＩＤＮＯ：１およびＳＥＱＩＤＮＯ：３の位置
２８６であるロイシンと変わっているヒトのカルパインＩの相応の配列とは異な
り、かつ前記の配列中のＸは任意の天然アミノ酸である；を有する新規の組織特異的カルパイン遺伝子、得られるアミノ酸のレベルでホモ
ロジー６０〜１００％を有するその対立変異体、類似体もしくは誘導体によって
達成されると判明した。

【００１６】また本発明は、カルパインインヒビターを同定するにあたり、請求項１記載の
配列によってコードされるカルパイン、その対立変異体もしくは類似体を組織も
しくは細胞から単離し、酵素ＣＡＰＮ６の基質の分解の阻害ならびに、少なくと
も１種の他の試験で試験物質による酵素カルパインＩおよび／またはＩＩの基質
の分解の阻害を測定し、酵素ＣＡＰＮ６および少なくとも１種の他のカルパイン
を阻害する試験物質を選択する方法に関する。

【００１７】更に本発明はカルパインインヒビターを同定するにあたり、酵素ＣＡＰＮ６ま
たはカルパインＩおよび／またはＩＩの基質の分解の細胞系における試験物質に
よる阻害を測定し、細胞膜を通過しかつ酵素ＣＡＰＮ６および／またはカルパイ
ンＩおよび／またはＩＩの細胞内活性を阻害するか、酵素ＣＡＰＮ６を阻害しな
いが酵素カルパインＩおよび／またはＩＩを阻害するか、または酵素ＣＡＰＮ６
を阻害するが酵素カルパインＩおよび／またはＩＩを阻害しない試験物質を選択
する方法に関する。細胞に入る能力の試験なしに、カルパインに対するインビト
ロの活性を示す物質も有利には選択される。後のアッセイにより前記の物質が細
胞内に入ることができないか、または僅かに細胞内に入ることができるかが示さ
れる場合に、その細胞透過性は誘導化によって改善することが可能である。

【００１８】ヒトのμおよびｍのカルパインタンパク質遺伝子配列をＢＬＡＳＴメソッドプ
ログラム（BLAST method program）を使用する生物学情報に関する国営センター
（the National Center for Biotechnology Information）のＥＳＴデータバンク（http://www.ncbi.nlm.nih.gov）におけるホモロジーの検索のために使用した。カルパインの典型的な配列を有するＥＳＴＡＡ０５００３０と呼ばれる配列を見出した。該配列を使用して、新規遺伝子産物が新規のカルパインとしてＣ
ＡＰＮ６と呼ばれる遺伝子をコードするマウスのクローン（＝ｎＣＬ−４）を作
成することが可能である。該クローンｎＣＬ−４の核酸配列はＳＥＱＩＤＮＯ：
１である。カルパインＣＡＰＮ６の得られるアミノ酸配列はＳＥＱＩＤＮＯ：２
である。イントロンの存在を考慮して推測されるアミノ酸配列は典型的なカルパ
インの特徴を示すが、ホモロジーが低いためμカルパイン、ｍカルパイン、ｎＣ
Ｌ−１もしくはｎＣＬ−２の公知のカルパインサブファミリーに割り当てること
はできない。カルパインＣＡＰＮ６は新規の今まで知られていなかったカルパイ
ンである。マウスからの該配列を使用するＥＳＴデータバンクにおける更なる調
査は更にマウスのＣＡＰＮ６配列とホモロジーを有する４種のヒトの部分配列（
ＡＡ１６９７１５、Ｃ１７３３１、Ｃ１６９８０およびＴ３９４２４）が提供さ
れた。これらの部分配列は３７４アミノ酸長を有するタンパク質をコードする連
続配列中に集めることができた。該配列はメチオニンのための典型的な開始コド
ンおよび停止コドンの両者を欠損している。従って該配列は恐らくクローニング
したマウスの配列に対するヒトのオーソログ（ortholog）の配列の単なる部分に
すぎない。３７４アミノ酸の２配列のホモロジーは９４．９％である（第１図）
。

【００１９】遺伝子配列ＳＥＱＩＤＮＯ：１から得られるタンパク質配列は公知のケノルハ
ビティスエレガンス遺伝子ｔｒａ−３と全アミノ酸配列にわたり最も優れたホモロジーである３０％のホモロジーを示す。他の公知のカルパインとのホモロジ
ーは２０．９％（ラットのｎＣＬ−２）から２５．４％（マウスのｍカルパイン
）である。Ｌｉｐｍａｎ−Ｐｅａｒｓｏｎ法（Ktupl 2, Gap Penalty 4, Gap Le
ngth Penalty 12）によるＣＡＰＮ６とヒトのＣＡＰＮ１（=CAN1_HUMAN, Aoki e
t al., FEBS Lett. 205, 1986: 313-317）、ヒトのＣＡＰＮ２（=CAN2_HUMAN, A
oki et al., Biochemistry 27, 1988: 8122-8128）、ラットのＣＡＰＮ２（=CAN
2_RAT, Deluca et al., Biochim. Biophys. Acta 1216, 1993: 81-93）、ヒトの
ＣＡＰＮ３（=CAN3_HUMAN, Richard et al., Cell 81, [lacuna] 27-40）、ラッ
トのＣＡＰＮ３（=CAN3_RAT, Sorimachi et al., J. Biol. Chem. 264, 1989: 2
0106-20111）ならびにショウジョウバエのカルパイン（=DMCLPNOCM_1）との２３
０〜５２０アミノ酸の部分配列にわたる配列比較において、僅かにより優れてい
るホモロジー３２．８〜３９．５％が見出されたが、これらの全てはｔｒａ−３
（Figure 1, alignment, Clustal method with PAM25 residue weight tabl.）とのホモロジーより低い。ｔｒａ−３の他に、ＣＡＰＮ６は最近記載されている
ＣＡＰＮ５カルパインとの顕著なホモロジー（44.2% homology, File No. P 19
718 248.8）を示す。

【００２０】マウスＣＡＰＮ６とヒトＣＡＰＮ６配列間の広範なデータバンクにおける配列
比較はＣａｌｐＡ、Ｔｒａ−３ならびに機能についての情報が提供されていない
Ｃ１６９８０、Ｔ３９４２４、ＡＡ１６９７１、Ｒ９３３３１およびＧ１７３３
１と呼ばれるヒトの配列とのホモロジーを示した。配列比較は遺伝子バンクＥＳ
Ｔおよび生物学的情報に関する国営センター（http:Hwww.ncbi.nlm.nih.yor）で
のデータバンクおよびＷａｓｈ−Ｕデータバンク（ホモサピエンス）を使用して
実施した。またデータバンクにおいて名称ＡＡ０５００３０を有しカルパインと
してデザインされたマウスのＥＳＴ配列が見出された。更なる情報はデータバン
クから得られなかった。ＡＡ１６９７１Ｔ、Ｒ９３３３１、Ｃ１７３３１および
ＡＡ０５００３０の完全な遺伝子配列は知られていない。

【００２１】２種のカルパイン（ＣＡＰＮ５およびＣＡＰＮ６）は共通して他のカルパイン
と区別される特性を有している。ＣＡＰＮ５およびＣＡＰＮ６は他のカルパイン
との比較によって欠損ドメインＩ（trancated domain I）だけでなく他のカルパ
インのドメインＩＶと広範なホモロジーを有さない改変Ｃ−末端（modified C-t
erminal end）を有する。カルパインのＣａ²⁺−結合部位（ＥＦハンドと呼ばれる）のコンセンサス配列はドメインＩＶの領域に位置している。該Ｃａ²⁺−結合
部位はＣＡＰＮ５およびＣＡＰＮ６の場合には存在せず、これはドメインＩＶに
はＣａ²⁺が結合せず、該タンパク質は別の方法で活性化することを意味している
。このようにカルモジュリン様ドメインＩＶを欠損している唯一の脊椎動物のカ
ルパインである。

【００２２】得られるＣＡＰＮ６アミノ酸配列は変性した触媒中心の形において別の特性を
有する。位置２８４のＡｓｎ残基だけが保存されている。位置８１のシステイン
および位置２５２のヒスチジン残基はマウスのＣＡＰＮ６配列においてはそれぞ
れリシンとチロシンで置換されている。更に、他の置換されたアミノ酸はＣＡＰ
Ｎ６配列ＳＥＱＩＤＮＯ：１およびＳＥＱＩＤＮＯ：３とヒトのカルパインＩ（
=CAPN1, Aoki et al., FEBS Lett. 205, 1986: 313-317）との比較によって触媒
中心の領域に見られる。このようにＣＡＰＮ１中の位置１２２および１２５のア
ミノ酸アラニンおよびトレオニンをＣＡＰＮ６の位置８８および９１でセリンと
アラニンに変更する。同様にＣＡＰＮ１の位置２７２、２７３、２７５および２
９８のアミノ酸ヒスチジン、アラニン、セリンおよびトリプトファンをＣＡＰＮ
６の位置２５２、２５３、２５５および２８６でチロシン、トレオニン、トレオ
ニンおよびロイシンに変更する。タンパク質ＣＡＰＮ１およびＣＡＰＮ６の種々
の位置へのアミノ酸の割り当ては配列比較ならびにアミノ酸レベルでのタンパク
質間の最大の一致に関する互いに相対的なタンパク質の保存された領域の割り当
てによって実施する。このように例えば同じ配列がタンパク質ファミリー中の異
なるタンパク質中の非常に異なる部位または位置に位置させることが可能である
。

【００２３】ヒトのＣＡＰＮ６配列はシステイン残基の置換の他に位置２５４のチロシンの
ヒスチジンによる置換を有している（第１表）。ＣＡＰＮ６が他のカルパインと
異なる基質特異性を有するか、または活性中心がＣＡＰＮ６の機能に重要でない
か、または他のカルパインのインヒビターであるか、またはＣＡＰＮ６が偽遺伝
子であると説明ができる。保存されているアミノ酸が多数であるため最後の可能
性は考えられない。位置８９のシステイン残基を触媒反応で失われる位置８１の
システイン残基の機能を引き継ぐことができると説明できる。非常に見込みは薄
いがＣＡＰＮ６がプロテアーゼ活性を有していなくても、補因子もしくは基質の
結合部位に関して他のカルパインと競合することによって調節プロセスに関連す
ることがある。

【００２４】第１表：ＣＡＰＮ６ゲノム配列

【００２５】

【表１】

【００２６】^* 活性中心のアミノ酸（Arthur et al., FEBS Lett. 368, 1995: 397-400）¹ ｍカルパインにロイシンを有さないと活性が低くなる（Arthur et al., FEBS L
ett. 368, 1995: 397-400）Ｔｒａ−３はケノルハビティスエレガンスにおける性決定に関連している。ｔｒａ−３に関連する幾つかの遺伝子およびその遺伝子産物のカスケードはケノ
ルハビティスの雄または雌雄同体発生のいずれかを決定する（Kuwabara P.E. et
al., TIG, Vol.8, No.5, 1992: 164-168）。Ｔｒａ−３は精子形成に関連すると考えられる。マウスのＣＡＰＮ６とｔｒａ３間の種々のドメインのアミノ酸の
保存はドメインＩ、ＩＩ、ＩＩＩおよびＴに関してそれぞれ３９．２％、４２．
０％、３０．９％および２２％である。

【００２７】（１ａ）１７のマウス胎児ｍＲＮＡから得られるｃＤＮＡから出発して、Ｆｒ
ｏｈｍａｎ他（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 1988, 8998-9002）およびＥｄ
ｗａｒｄｓ他（Nucl. Acids Res. 19, 1991, 5227-5232）の改良ＲＡＣＥ（modi
fied RACE method）（＝ｃＤＮＡ末端の高速増幅）法を使用し、かつ前記のプラ
イマー（Ｃａｌ６およびＣａｌ９）およびＥＳＴＡＡ０５００３０から得られた配列を使用して、クローニングしたＣＡＰＮ６の完全な配列をクローニングす
ることが可能である。ＳＥＱＩＤＮＯ：１は６４１アミノ酸を有し、分子量７４
．６ｋＤａを有するタンパク質をコードする。メチオニン開始コドンの上流に翻
訳開始のための典型的な配列を有する。該配列の正確性は前記配列を有する幾つ
かのｃＤＮＡクローンを配列決定することによって確認した。

【００２８】第２図はマウスのＣＡＰＮ５（＝ｎＣＬ−３）、ヒトのＣＡＰＮ５（＝ｎＣＬ
−３）、マウスのＣＡＰＮ６（＝ｎＣＬ−４）およびヒトのＣＡＰＮ６（＝ｎＣ
Ｌ−４）間のホモロジーを示している。また第２図はケノルハビティスのｔｒａ
−３、ヒトのｐ９４、マウスのｍカルパイン、ヒトのμカルパインおよびラット
のｎＣＬ−２の配列も示している。種々のカルパインおよびＣＡＰＮ６間で一致
しているアミノ酸は黒い四角によって示されている。ダッシュは配列の最大の一
致を達成するために導入されたギャップを示している。明確にするために、２つ
の配列をヒトのｐ９４配列から欠失させている。前記の配列は＝によって示され
ている。触媒中心で保存されているアミノ酸は矢印でマークした。ＣＡＬ６およ
びＣＡＬ９に相当するアミノ酸配列は下線を引いた。ドメイン名は関連の配列セ
グメント上に示した。

【００２９】第３図は種々のカルパインの系統的系図を示している。この系図を構成するた
めの系統的分析を隣接個体法（Saitou et al. Mol. Biol. Evol. 4, 1987, 406-
425）を使用してギャップを除いて実施した。前記の系統的分析を使用して脊椎動物のカルパインを６種の異なる群に分類することができた（第３図の右側）。
無脊椎動物のカルパインは隣接個体としてＣＡＰＮ５群（＝ｎＣＬ−３群）およ
びＣＡＰＮ６群（＝ｎＣＬ−４群）に割り当てることができ、それ自体の群を形
成する。このようにＣＡＰＮ５およびＣＡＰＮ６遺伝子はぞれぞれ脊椎動物のカ
ルパインより無脊椎動物のカルパインにより高い類似性を有するカルパインのそ
れ自体の群を形成する。水平線の長さは種々のカルパイン間の系統的距離に比例
している。垂線は重要性を有していない。該系図を構成するために使用される配
列は以下のＳＷＩＳＳＰＲＯＴおよびＥＭＢＬの番号（accession number）を有
している：ヒトのｍ（P17655）、μ（P07384）、ｐ９４（P20807）；ラットのｍ（Q07009）
、ｎＣＬ−２（D14480）、ｐ９４（P16259）；マウスのｐ９４（X92523）；ニワ
トリのｍ（D38026）、μ（D38027）、μ／ｍ（P00789）、ｐ９４（D38028）；線
虫のｔｒａ−３（U12921）；ショウジョウバエのＣａｌｐＡ（Q11002）およびＤ
ｍ（X78555）、住血吸虫（P27730）。ヒトのｎＣＬ−２の部分配列はＥＳＴクロ
ーンＡＡ０２６０３０（Hellier et al., 1995, The Wash U-Merck EST project
）の翻訳に相当する。

【００３０】ＥＳＴクローンＡＡ０２６０３０の得られるアミノ酸配列は通常より高い前記
の分析によるラットのｎＣＬ−２配列とのホモロジーを示す。該分析には一部分
が使用されるにすぎないので、ｎＣＬ−２に関して得られる系統的系図はより不
正確である。線虫のＣＰＬ１配列はＢａｒｎｅｓおよびＨｏｄｊｋｉｎ（EMBOJ.
, 1996, 15: 4477-4484）によって使用された訂正されたものである。

【００３１】最初の７個のエキソンはＥＭＢＬデータバンク（Accession No. L25598）から
得られるので使用できるが、最後の５個のエキソンをヌクレオチド８０２８〜８
１３３、８１８２〜８２３９、８７２９〜８８１８、８８６５〜８９８３および
９０８７〜最後（end）を連結することによって得ることができた。得られるＮ −末端配列はその長さおよびその多くのグリシン残基のためカルパインのために
は変わっている。

【００３２】新規の組織特異的カルパインＣＡＰＮ６は胎盤組織でのみ発現する（第４図）
。ヒトの胎盤は迅速な生育および迅速な分化を示す器官である。従ってまた、“
前癌組織”とも呼ばれる。それというのも悪性腫瘍のそれに類似した侵襲性の組
織だからである。

【００３３】プロテアーゼは細胞の発生および分化、従ってまた胎盤においても中心的な役
割を担っている。胎盤は平衡を保って胎盤の発育を可能にするプロテアーゼおよ
びプロテアーゼインヒビターが豊富である。ＣＡＰＮ６は前記のことにおいてプ
ロテアーゼとして重要な役割を担っていると考えられ、かつ／または恐らく他の
カルパインシステインプロテアーゼの調節に関連している。

【００３４】これは恐らく胎盤の病理的プロセス、例えば全妊婦の５〜７％に起こる妊娠中
毒症（＝子癇前症）に関連している。子癇前症（＝妊娠により誘発される高血圧
）は最も一般的な妊婦の合併症であり、屡々過剰の浮腫および幾つかの環境にお
いては痙攣と合併する高血圧および蛋白尿を特徴としている。妊娠中の子癇前症
は母子の死、未熟出生もしくは緩慢なケースにおいては胎児の栄養不良もしくは
成長傷害の重大な原因である。これは、例えば遺伝因子（劣性または優性遺伝子
）、母体の免疫寛容、血管拡張剤／血管収縮剤のインバランスならびに恐らくＣ
ＡＰＮ６にも関連がある多因子性の状況である。

【００３５】子癇前症に悩む女性は、ＣＡＰＮ６による調節に恐らく影響を与えるバソプレ
シナーゼおよびアンギオテンシナーゼのレベルを変更している。

【００３６】ＣＡＰＮ６の別の予想される機能は胎盤中のソマトスタチン、グルカゴンおよ
び成長ホルモンの破壊の制御であり、従って胎児の成長に影響する。同様に胎児
の成長を刺激する母体の血清タンパク質の破壊もＣＡＰＮ６によって影響される
ことがある。

【００３７】ＣＡＰＮ６は胚発生の間の胎盤粘液中の複雑な状況に関連し、このように、例
えば他のカルパインによる制御によって栄養膜のＴＮＦαおよびＩＦＮγにより
誘導されるアポトーシスをコントロールする。従ってＣＡＰＮ６は胚発生に関連
していると思われる。

【００３８】選択的なカルパインインヒビターを同定するために、インヒビター同定のため
にできるだけ特異的な方法が必要である。この点において、選択したインヒビタ
ーが所望のカルパインだけを阻害するが、他のシステインプロテアーゼを阻害せ
ず、このように生理学的プロセスに介入することが重要である。

【００３９】その阻害活性に関して調査すべき試験物質は、例えば化学物質、微生物もしく
は植物エキスであってよい。ＣＡＰＮ６、カルパインＩおよび／またはＩＩによ
るその阻害活性のための試験の他に、これらは通常カテプシンＢもしくは他のチ
オールプロテアーゼに対するその活性に関しても試験される。理論的には良好な
インヒビターはカテプシンＢ、Ｌ、エラスターゼ、パパイン、キモトリプシンも
しくは他のシステインプロテアーゼに対して殆ど活性を有さないか、または活性
を有さないが、カルパインＩおよびＩＩに対しては良好な活性を示すべきである
。

【００４０】新規の組織特異的カルパインＣＡＰＮ６と一緒に本発明による方法を、カルパ
インＩ、ＩＩ、ｎＣＬ−１、ｎＣＬ−２および／またはｎＣＬ−４を含む種々の
カルパイン間のその阻害作用において識別可能なインヒビターを同定するために
使用することが可能である。

【００４１】種々のインヒビター試験を前記の目的のために以下のように実施した：カテプシンＢ試験カテプシンＢ阻害はハスナイン他（S.Hasnain et al., J. Biol. Chem. 268,
1993, 235-240）の方法に類似の方法によって測定した。

【００４２】試験すべき化学物質、微生物もしくは植物のエキスおよびＤＭＳＯ（最終濃度
：１００μＭ〜０．０１μＭ）から製造したインヒビター溶液２μｌをカテプシ
ンＢ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社のヒトの肝臓由来のカテプシンＢ、５００μＭ緩
衝液中５ユニットに希釈した）８８μｌに添加した。この混合物を室温（＝２５
℃）で６０分間プレインキュベートし、次いで１０ｍＭのＺ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−
ｐＮＡ（１０％ＤＭＳＯを有する緩衝液中）１０μｌの添加によって反応を開始
させた。引き続き反応をマイクロタイタープレートリーダー中で４０５ｎｍで３
０分間実施した。次いでＩＣ₅₀値を最大の傾き（maximum slope）から決定した。

【００４３】カルパインＩおよびＩＩの試験カルパインインヒビターの活性を基質としてハマルステンカゼイン（メルク、
ダルムシュタット）を使用する比色試験で調査した。文献（the publication by
Broker-Kilgore and Wang in Anal. Biochem. 208, 1993, 387-392）に従ってマイクロタイタープレート中で試験を実施した。使用した酵素は、Ｃａｌｂｉｏ
ｃｈｅｍによって供給される両者ともブタ由来の赤血球からのカルパインＩ（０
．０４Ｕ／試験）および腎臓からのカルパインＩＩ（０．２Ｕ／試験）である。
試験すべき物質を酵素と一緒に室温で６０分間インキュベートする、その際、溶
剤ＤＭＳＯの濃度は１％を上回らない。バイオラッドのカラー試薬（color reag
ent）の添加後に、光学密度をＳＬＴＥａｓｙＲｅａｄｅｒＥＡＲ４００において５９５ｎｍで測定した。酵素の５０％の活性はインヒビターなしでの酵素
の最大活性ならびにカルシウムの添加なしでの酵素の活性で決定される光学密度
から明らかである。

【００４４】更にカルパインインヒビターの活性を基質Ｓｕｃ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−ＡＭＣを
使用して決定できる。該蛍光定量法はチャオチャオリー他（Zhaozhao Li et al
., J. Med. Chem. 36, 1993, 3472-3480）によって記載されている。

【００４５】カルパインは細胞内システインプロテアーゼなので、カルパインインヒビター
はカルパインによる細胞内タンパク質の破壊を回避するために細胞膜を透過する
必要がある。幾つかの公知のカルパインインヒビター、例えばＥ６４およびロイ
ペプチンは細胞膜透過が非常に乏しく、従ってこれらは良好なカルパインインヒ
ビターであるが細胞に対して僅かな効果しか示さない。従って可能なカルパイン
インヒビターの膜透過の能力の付加的な試験、例えばヒトの血小板試験（platel
et test）を実施するのが有利である。

【００４６】カルパインインヒビターの細胞活性を決定するための血小板試験血小板中のタンパク質のカルパインに媒介される分解をチャオチャオリー他（Zhaozhao Li et al., J. Med. Chem., 36, 1993, 3472-3480）によって記載さ
れるように実施した。ヒトの血小板をドナーからの新鮮なクエン酸ナトリウム添
加血から単離し、緩衝液（5mM hepes, 140mM NaCl および 1mg/ml BSA, pH 7.3 ）中で１０7細胞／ｍｌに調整した。

【００４７】血小板（０．１ｍｌ）を種々の濃度の可能なインヒビター（ＤＭＳＯ中に溶解
した）１μｌ中で５分間プレインキュベートした。次いでカルシウムイオノホア
Ａ２３１８７（試験において１μＭ）およびカルシウム（試験において５ｍＭ）
を添加し、更に３７℃で５分間インキュベートした。遠心分離工程の後に、血小
板をＳＤＳ−ｐａｇｅサンプルバッファー中に取り、９５℃で５分間煮沸し、タ
ンパク質を８％ゲルで分割した。引き続き２種のタンパク質のアクチン結合タン
パク質（＝ＡＢＰ）およびタリンの破壊を定量的に濃度測定した。カルシウムお
よびイオノホアの添加後に、前記のタンパク質は消失し、２００ｋｄより小さな
分子量を有する新しいバンドが現れた。そこからインヒビターを使用するか、ま
たはコントロールとしてインヒビターを使用せずに半分の最大酵素活性を測定し
た。

【００４８】同様に組織の部分、例えば脳切片もしくは細胞培養は膜透過の能力を試験する
ために適当である。

【００４９】ＣＡＰＮ６の阻害のための試験を、該タンパク質を発現し、特異抗体を使用し
てこれを検出可能な細胞中で実施した。細胞を、例えばカルシウムおよび適当な
イオノホアで刺激する場合、これはＣＡＰＮ６の活性化を惹起する。タカオミサイド（Takaomi saido）は、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１，１９９２，８１−８６において活性化および抗体を使用する検出後のμカルパインの自己融解転移（
autolytic transition）を記載している。ＣＡＰＮ６を検出するために適当な抗
体を作成した。カルパインインヒビターは自己融解転移を妨げ、相応の定量は抗
体を使用して可能である。

【００５０】前記のインビトロ試験および細胞の血小板試験の他に、当業者に公知の他のカ
ルパイン試験、例えば皮質のニューロンにおけるグルタミン酸誘導性細胞死（gl
utamate-induced cell death）の阻害（Maulucci-Gedde M.A. et al., J. Neuro
sci. 7, 1987: 357-368）、ＮＴ２細胞におけるカルシウムに媒介される細胞死（Squier M.K.T. et al., J. Cell. Physiol., 159, 1994: 229-237, Patel T.
et al., Faseb Journal 590, 1996: 587-597）の試験、またはタンパク質、例え
ばスペクトリン、ＭＡＰ２もしくはｔａｕの分解生成物に関する組織試料の分析
（Ami Arai et al., Brain Research, 1991, 555, 276-280, James Brorson et
al., Stroke, 1995, 26, 1259-1267）が適当である。

【００５１】ＣＡＰＮ６のインビトロ試験のために、カルパインまたはその動物もしくはヒ
トの同族体を、酵素を普通にもしくは人工的に（例えば組換体発現により）発現
する組織または細胞、例えば有利には胎盤または少なくとも１コピーの遺伝子お
よび／または少なくとも１コピーのＣＡＰＮ６遺伝子、その対立変異体もしくは
類似体を有するベクターを有する細胞または微生物から精製し、粗製抽出物また
は純粋な酵素として使用する。

【００５２】本発明による方法のために、種々のカルパインインヒビター試験を、可能なイ
ンヒビターによるＣＡＰＮ６酵素活性の阻害のための試験と組み合わせて実施す
る。これにより酵素ＣＡＰＮ６だけを阻害し、他のカルパインを阻害しないか、
または反対に他のカルパインだけを阻害し、酵素ＣＡＰＮ６を阻害しないか、ま
たは酵素ＣＡＰＮ６および少なくとも１種の他のカルパインを阻害するインヒビ
ターが選択される。ＣＡＰＮ６の阻害は有利には妊娠中毒の状況において使用す
ることができる。

【００５３】種々のインヒビター試験は更に、ＣＡＰＮ６、カルパインＩおよび／またはＩ
Ｉによる試験物質の阻害効果に関する試験の他に、コントロールとして試験物質
を使用せずに試験する方法で実施する。この試験法は試験物質の阻害効果の検出
を容易にする。

【００５４】本発明による別の方法は有利には他のカルパインの酵素作用からの保護のため
にＣＡＰＮ６またはその対立変異体、類似体もしくは合成誘導体を使用する。

【００５５】本発明による別の方法は新規のカルパインインヒビターのスクリーニングのた
めに酵素ＣＡＰＮ６を使用し、その際、有利には前記のインヒビターは一般に全
てのカルパインまたは個々のカルパイン、例えばカルパインＩ、ＩＩ、ｎＣＬ−
１、ｎＣＬ−２もしくはＣＡＰＮ６を阻害することが可能である。更に種々の試
験物質を単独にまたは試験系においてパラレルに試験することができる。試験物
質は有利には並行する自動の試験系においてその阻害作用に関してスクリーニン
グされる。

【００５６】一般に、全ての物質がインヒビター試験のために適当である。従って物質は古
典的化学合成、組合せ化学（combinatorial chemistry）または微生物エキス、動物エキスもしくは植物エキスから得られる。微生物エキスは、例えば発酵ブロ
ス、微生物の破砕細胞または生体内変化後の物質を意味する。細胞分画も試験の
ために適当である。

【００５７】酵素的に活性な遺伝子産物の単離に適当な全ての原核または真核の発現システ
ムはＣＡＰＮ６遺伝子またはその動物同族体もしくはそのヒトの同族体、その対
立変異体または類似体をクローニングするために適当である。有利な発現システ
ムは細菌、真菌または動物の細胞、より特に有利には昆虫細胞でＣＡＰＮ６遺伝
子配列の発現を可能にする発現システムである。酵素的に活性な遺伝子産物は、
直接発現生物、例えば原核または真核の細胞からの単離後に、または復元後に、
前記のような少なくとも１種の公知のカルパインを分解可能であるか、またはそ
れ自体が自触作用によって分解可能な活性タンパク質を提供するＣＡＰＮ６タン
パク質を意味する。

【００５８】カルパインの酵素活性の測定のために適当な試験は当業者に公知の全ての試験
、例えばカルパインＩおよびＩＩのために前記した試験のようなインビトロ試験
または細胞試験、例えば血小板試験である。比色アッセイ（Buroker-Kilgore M.
et al., Anal. Biochem. 208, 1993: 387-392）または蛍光アッセイに基づく試
験を検出のために使用することができる。

【００５９】更に、ＣＡＰＮ６の酵素的に活性な遺伝子産物は、ＣＡＰＮ６遺伝子の触媒中
心および／またはＣＡＰＮ６遺伝子の他の配列および／または他のカルパイン遺
伝子配列および／または他の配列を含み、かつ酵素活性を示す全ての部分配列を
意味する。

【００６０】宿主生物は宿主生物として適当な全ての原核または真核の生物、例えば細菌、
例えばエシェリキアコリ、バシラスサチリス、ストレプトマイセスリビダンス、ストレプトコッカスカルノサス、酵母、例えばサッカロマイセスセレビシ
エ、シゾサッカロマイセスポンベ、真菌、例えばアスペルギルスニガー、昆虫
細胞、例えばスポドプテラフルギペルダ、トリコプルシア細胞またはウイルス発現のために適当な他の昆虫細胞、または動物細胞、例えばＣＶ１、ＣＯＳ、Ｃ
１２７、３Ｔ３もしくはＣＨＯまたはヒトの細胞を意味する。

【００６１】発現システムは例として前記した発現生物およびその生物に適当なベクター、
例えばプラスミド、ウイルスもしくはファージの組合せ、例えばＴ７ＲＮＡポリ
メラーゼ／プロモーターシステムまたはファージλのための調節配列を有するベ
クターを意味する。

【００６２】有利には発現システムという用語はエシェリキアコリおよびそのプラスミドおよびファージの組合せまたはバキュロウイルスシステムおよび相応の昆虫細胞
、例えばスポドプテラフルギペルダを意味する。

【００６３】更に、本発明によるＣＡＰＮ６遺伝子の有利な発現のために、他の３′および
／または５′末端調節配列が適当である。

【００６４】これらの調節配列はＣＡＰＮ６の特異的発現を可能にする目的である。これは
、例えば宿主生物に依存して遺伝子を誘導後にのみ発現もしくは過剰発現させる
か、または直ちに発現および／または過剰発現させることを意味することがある
。

【００６５】調節配列および調節因子は更に有利にはＣＡＰＮ６遺伝子発現に有用な効果を
有し、これを増大させることができる。従って調節エレメントを、強力な転写シ
グナル、例えばプロモーターおよび／またはエンハンサーを使用することによっ
て、有利には転写のレベルで高めることができる。しかしながらまた、前記のこ
と以外に、例えばｍＲＮＡの安定化の改善により翻訳を高めることも可能である
。

【００６６】エンハンサーは、例えばＲＮＡポリメラーゼおよびＤＮＡ間の改善された相互
作用の改善によってＣＡＰＮ６遺伝子発現の増大をもたらすＤＮＡ配列を意味す
る。

【００６７】１つ以上のＤＮＡ配列は、該遺伝子が遺伝子構造中に存在するように、上流に
プロモーターを有するかまたは有さず、かつ調節遺伝子を有するかまたは有さず
にＣＡＰＮ６遺伝子の上流および／または下流に存在してよい。

【００６８】更に、ＣＡＰＮ６遺伝子の発現をＣＡＰＮ６遺伝子のコピー数を増やすことに
よって増大することができる。ＣＡＰＮ６遺伝子のコピー数は、例えばＣＨＯ発
現ベクター中での増幅によって増大させる。また適当なベクターはｐＥＤ系のベ
クター（２シストロン性ベクター）であり、これはジヒドロ葉酸レダクターゼの
増幅可能なマーカー遺伝子を有する。詳細は分子生物学の現行のプロトコール（
Current Protocols in Molecular Biology Vol. 2, 1994）に見られる。

【００６９】出発酵素と比較したＣＡＰＮ６酵素活性の増加を、例えばＣＡＰＮ６遺伝子も
しくはその動物の同族体を古典的な突然変異誘発、例えばＵＶ照射もしくは化学
的変異原による処理ならびに／または特異的突然変異誘発、例えば部位特異的突
然変異誘発、欠失、挿入および／または置換によって改変することによって達成
することができる。酵素活性は、例えば分解すべき基質をより迅速に変換するよ
うに活性中心を改変することによって増加させることができる。また増加された
触媒活性は、前記の遺伝子増幅の他に、酵素の生合成を抑制する因子を排除し、
かつ／または不活性なＣＡＰＮ６タンパク質の代わりに活性に合成することによ
って達成することもできる。

【００７０】ＣＡＰＮ６または動物の同族体またはそのヒトの同族体は有利には、例えばＰ
ＣＲ技術（Molekular Cloning, Sambrook, Fritsch and Maniatis, Cold Spring
Harbor, Laboratory Press, Second Edition 1989, Chapter 14, 1-35, ISBN 0
-87969-309-6 および Saiki et al., Science, 239, 1988, 487 et seq参照）を
使用してゲノムＤＮＡもしくはｃＤＮＡから出発してクローニングすることがで
き、有利にはＣＡＰＮ６はゲノムＤＮＡ、特に有利にはマウス細胞もしくはヒト
細胞からのゲノムＤＮＡを使用してクローニングすることができる。

【００７１】クローニングのための宿主生物としては、例えば全てのエシェリキアコリ株、有利にはエシェリキアコリＤＨ１０Ｂ株が適当である。クローニングのために適当なベクターはエシェリキアコリでの発現に適当な全てのベクターである（Molecular Cloning, Sambrook, Fritsch and Maniatis, Cold Spring Harbor,
Laboratory Press, Second Edition 1989, ISBN 0-87969-309-6参照）。特に適
当な例はｐＢＲまたはｐＵＣから得られるベクター、またはシャトルベクターで
あり、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔがより特に適当である。ＳＥＱＩＤＮＯ：２に示
されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を有するＣＡＰＮ６遺伝子、
またはその対立変異体を単離および配列決定後に得ることができる。対立変異体
はアミノ酸レベルでホモロジー６０〜１００％、有利には７０〜１００％、特に
有利には８０〜１００％を有するＣＡＰＮ６変異体を意味する。対立変異体は、
特にＳＥＱＩＤＮＯ：１またはＳＥＱＩＤＮＯ：３に示される配列からヌクレオ
チドの欠失、挿入もしくは置換によって得られる機能的変異体を含み、その際Ｃ
ＡＰＮ６活性は保持され、かつ配列（ａ）Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ａ
ｌａ、（ｂ）Ａｌａ−Ｘ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ−Ｌｅｕ−Ａｌａ、（ｃ）Ｇｌｙ−Ｔ
ｙｒ−Ｔｈｒ−（ＨｉｓまたはＴｙｒ）−Ｔｈｒ−Ｘ−Ｔｈｒおよび（ｄ）Ａｒ
ｇ−Ｘ−Ａｒｇ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−ＧｌｙはＣＡＰＮ６遺伝子、類似体
または誘導体においても存在する。

【００７２】ＣＡＰＮ６の類似体は、例えばその動物の同族体、欠損配列（truncated sequ
ence）、コードしているＤＮＡ配列およびコードしていないＤＮＡ配列の一本鎖
ＤＮＡもしくはＲＮＡ、特にアンチセンスＲＮＡを意味する。

【００７３】ＣＡＰＮ６誘導体の例は、例えば可能であれば核酸のホスフェート基がホスホ
ネートまたはチオエート基によって置換されている核酸のホスホネートまたはホ
スホチオエートを酵素により僅かに困難を伴って分解可能なこれらの誘導体であ
る。

【００７４】規定のヌクレオチド配列の上流に存在するプロモーターを、１個以上のヌクレ
オチド変換、挿入および／または欠失によって、プロモーターの機能性または活
性を減ずることなく改変することができる。更にプロモーターは該配列の改変に
より増大された活性を有してよいか、または異種生物からかまたは合成由来のよ
り活性なプロモーターで完全に置き換えてよい。

【００７５】本発明による方法によって同定されたカルパインインヒビターはカルパイン機
能障害に関連する疾患、例えば心臓血管性、免疫性、炎症性、アレルギー性、神
経性、神経変性性または腫瘍性傷害、例えば再狭窄、関節炎、心臓、腎臓もしく
は中枢神経系の虚血（例えば発作）、炎症、筋ジストロフィー、眼の白内障（例
えば灰色白内障）、中枢神経系の損傷（例えば外傷）、アルツハイマー病、ＨＩ
Ｖ誘発神経障害、パーキンソン病およびハンチントン病の群から選択される疾患
の治療用の薬剤の製造のために、有利には胎盤の疾患、例えば妊娠中毒または胚
発生の疾患の治療用の薬剤の製造ために適当である。

【００７６】有利には本発明によるＣＡＰＮ６遺伝子配列は疾患の診断または遺伝子治療の
ためにも適当である。

【００７７】実施例例１：ＣＡＰＮ６遺伝子のクローニングマウスのＣＡＰＮ６配列（EMBL accession number Y12583）を胎齢１７日の胚
および配列ＥＳＴＡＡ０５００３０から得られたプライマー配列を使用するＲＡＣＥ法によってクローニングした。相応のＥＳＴ配列を有するプラスミドクロ
ーンはＩ．Ｍ．Ａ．Ｇ．Ｅ共同体（I.M.A.G.E consortium）（Research Genetic
s Inc.）から得た。ヒトのＣＡＰＮ６同族体は、マウスタンパク質配列およびｔ
ｂｌａｓｔｎアルゴリズムを使用してＥＳＴデータバンクにおいてホモロジーを
検索することによって得た。見出された部分配列を連結して１０８３ヌクレオチ
ド（ＳＥＱＩＤＮＯ：３）長を有するヒトのＣＡＰＮ６の不完全な配列を得るこ
とが可能である。

【００７８】例２：種々の組織におけるＣＡＰＮ６遺伝子の発現種々の組織におけるＣＡＰＮ６遺伝子の発現を、５０種の異なる組織からのＲ
ＮＡを有するクロンテック社（Clontech）のヒトＲＮＡマスターブロット（huma
n RNA master blot）によって³²Ｐ−標識したヒトｃＤＮＡ断片を使用して検出した。ハイブリダイゼーションおよび非常にストリンジェントな洗浄条件を製造
者の解説書に従って実施した。発現実験のために使用されたＣＡＰＮ６ｃＤＮＡ
断片はＥＳＴＡＡ０５００３０を有する２．２ｋｂのＥｃｏＲＩ／ＸｈｏＩ断片であった。ＣＡＰＮ６は胎盤組織でのみ発現した（第４図参照）。コントロー
ルとして、ＲＮＡローディングを測定するためにヒトユビキチンＤＮＡ試料を使
用してブロットを実施した。

【００７９】例３：染色体上のＣＡＰＮ６遺伝子の位置ヒトの遺伝子を、ＮＩＧＭＳヒト／齧歯類の体細胞ハイブリッドの“マッピン
グパネル”（NIGMS human/rodent somatic cell hybrid“mapping panel”(Cori
ell Cell Repositories)）を使用して位置決めした。ＰＣＲのために使用したプ
ライマー配列は以下の通りである：５′−ｇｔｔｇａａａｃｔｇａｔｔｇｇｇｇｔｃｔｇ−３′および５′−ｃｔｇ
ｔｃｔｔｃｃｃａａｇｇｇｇｔｔｔｃｔｃ−３′。ＰＣＲ増幅をアニーリング温
度５８℃で実施し、２００ｂｐ断片が得られた。ヒト染色体およびＰＣＲ産物の
存在間の一致に関して結果を検討した。スタンフォードＧ３ＲＨパネル（Stanf
ord G3 RH Panel(Research Genetics)）を使用し、ＰＣＲの結果をスタンフォー
ドヒトゲノムセンター（http://www-shgc.stanford.edc）の位置決めサービス（
localization service of the Stanford Human Genome Center）に伝送すること
によってヒト染色体中の該遺伝子の正確な位置を見出した。ヒトＣＡＰＮ６遺伝
子はＤＸＳ７３５６マーカーに結合されているＸ染色体上であると判明した。

【００８０】例４：カテプシンＢ試験カテプシンＢ阻害をハスナイン他（S. Hasnain et al., J. Biol. Chem. 268,
1993, 235-240）の方法に類似の方法によって検証した。

【００８１】インヒビターおよびＤＭＳＯから製造したインヒビター溶液２μｌ（最終濃度
：１００μＭ〜０．０１μＭ）をカテプシンＢ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社のヒト
肝臓由来のカテプシンＢ、５００μＭ緩衝液中の５ユニットに希釈した）８８μ
ｌに添加した。この混合物を室温（＝２５℃）で６０分間プレインキュベートし
、次いで１０ｍＭのＺ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−ｐＮＡ（１０％ＤＭＳＯを有する緩衝
液中）１０μｌの添加によって反応を開始させた。引き続きマイクロタイタープ
レートリーダーにおいて４０５ｎｍで３０分間反応させた。次いでＩＣ₅₀値を最
大の傾きから決定した。

【００８２】例５：カルパイン試験カルパインインヒビターの活性を基質としてハマルステンカゼイン（メルク、
ダルムシュタット）を使用して比色試験で調査した。Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ
．２０８，１９９３，３８７−３９２中のＢｕｒｏｋｅｒ−Ｋｉｌｇｏｒｅおよ
びＷａｎｇによる文献に従ってマイクロタイタープレート中で試験を実施した。
使用した酵素は前記のシステムの１つで発現させ、次いで精製したＣＡＰＮ６で
あった。物質を酵素と一緒に室温で６０分間インキュベートするが、その際溶剤
ＤＭＳＯの濃度は１％を上回らない。バイオラッドのカラー試薬の添加後に、光
学密度をＳＬＴＥＡＳＹＲｅａｄｅｒＥＡＲ４００中で５９５ｎｍで測定し
た。酵素の５０％活性はインヒビター不含の際の酵素の最大活性およびカルシウ
ム無添加の際の酵素活性で測定した光学密度から明らかである。

【００８３】例６：カルパインインヒビターの細胞活性を測定するための血小板試験血小板のタンパク質のカルパインに媒介される分解をチャオチャオリー他（Z
haozhao Li et al., J. Med. Chem., 36, 1993, 3472-3480）によって記載されるように実施した。ヒトの血小板をドナーからの新鮮なクエン酸ナトリウム添加
血から単離し、緩衝液（5mM Hepes, 140mM NaCl および 1mg/ml BSA, pH 7.3）で１０⁷細胞／ｍｌに調整した。

【００８４】血小板（０．１ｍｌ）を種々の濃度のインヒビター（ＤＭＳＯで希釈した）１
μｌ中で５分間プレインキュベートした。カルシウムイオノホアＡ２３１８７（
試験において１μＭ）およびカルシウム（試験において５ｍＭ）を添加し、更に
３７℃で５分間インキュベートを実施した。遠心分離工程後に、血小板をＳＤＳ
−ｐａｇｅサンプルバッファー中に取り、９５℃で５分間煮沸し、タンパク質を
８％ゲル中で分割した。２つのタンパク質のアクチン結合タンパク質（＝ＡＢＰ
）およびタリンの破壊を引き続き定量的に濃度測定した。それというのもカルシ
ウムとイオノホアの添加後にこれらのタンパク質は消失し、２００Ｋｄ分子量の
領域に新たなバンドが現れるからである。これから半分の最大酵素活性を測定し
た。

【００８５】

【配列表】

（１）一般的情報：（ｉ）出願人：（Ａ）名称：ＢＡＳＦアクチエンゲゼルシャフト（Ｂ）町：カールボッシュシュトラーセ（Ｃ）市：ルドヴィヒスハーヘン（Ｄ）州：ラインラント−プファルツ（Ｅ）国：ドイツ（Ｆ）郵便コード：Ｄ−６７０５６（ｉｉ）発明の名称：新規の組織特異的カルパイン、その製造およびその使用（ｉｉｉ）配列の数：４（ｉｖ）コンピューター読み取り可能形：（Ａ）媒体型：フロッピーディスク（Ｂ）コンピューター：ＩＢＭＰＣコンパチブル（Ｃ）オペレーティングシステム：ＰＣ−ＤＯＳ／ＭＳ−ＤＯＳ（Ｄ）ソフトウェア：パテントインリリース＃１．０、バージョン＃１
．２５（ＥＰＯ）（２）ＳＥＱＩＤＮＯ：１に関する情報：（ｉ）配列特徴：（Ａ）長さ：２０６９塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ（ｉｉｉ）アンチセンス：ＮＯ（ｖｉ）起源：（Ａ）生物名：Ｍｕｓｍｕｓｃｕｌｕｓ（ｖｉｉ）直接の起源：（Ｂ）クローン名：ＣＡＰＮ６（ｉｘ）配列の特徴：（Ａ）ＮＡＭＥ／ＫＥＹ：５′ＵＴＲ（Ｂ）ＬＯＣＡＴＩＯＮ：１．．１２９（ｉｘ）配列の特徴：（Ａ）ＮＡＭＥ／ＫＥＹ：ＣＤＳ（Ｂ）ＬＯＣＡＴＩＯＮ：１３０．．２０５５（ｉｘ）配列の特徴：（Ａ）ＮＡＭＥ／ＫＥＹ：３′ＵＴＲ（Ｂ）ＬＯＣＡＴＩＯＮ：２０５６．．２０６９（ｘｉ）配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：１：

【００８６】

【化１】

【００８７】

【化２】

【００８８】

【化３】

【００８９】

【化４】

【００９０】（２）ＳＥＱＩＤＮＯ：２に関する情報：（ｉ）配列特徴：（Ａ）長さ：６４１アミノ酸（Ｂ）型：アミノ酸（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）配列の種類：タンパク質（ｘｉ）配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：２：

【００９１】

【化５】

【００９２】

【化６】

【００９３】

【化７】

【００９４】（２）ＳＥＱＩＤＮＯ：３に関する情報：（ｉ）配列特徴：（Ａ）長さ：１１２５塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ（ｉｉｉ）アンチセンス：ＮＯ（ｖｉ）起源：（Ａ）生物名：Ｈｏｍｏｓａｐｉｅｎｓ（ｖｉｉ）直接の起源：（Ｂ）クローン名：ＣＡＰＮ６（ｉｘ）配列の特徴：（Ａ）ＮＡＭＥ／ＫＥＹ：ＣＤＳ（Ｂ）ＬＯＣＡＴＩＯＮ：２．．１１２５（ｘｉ）配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：３：

【００９５】

【化８】

【００９６】

【化９】

【００９７】

【化１０】

【００９８】（２）ＳＥＱＩＤＮＯ：４に関する情報：（ｉ）配列特徴：（Ａ）長さ：３７４アミノ酸（Ｂ）型：アミノ酸（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）配列の種類：タンパク質（ｘｉ）配列：ＳＥＱＩＤＮＯ：４：

【００９９】

【化１１】

【０１００】

【化１２】

【図面の簡単な説明】

【図１】第１図はＣＡＰＮ６とヒトのＣＡＰＮ１、ヒトのＣＡＰＮ２、ラットのＣＡＰ
Ｎ２、ヒトのＣＡＰＮ３、ラットのＣＡＰＮ３ならびにショウジョウバエのカル
パインとの配列比較を示す。

【図２】第２図はマウスのＣＡＰＮ５（＝ｎＣＬ−３）、ヒトのＣＡＰＮ５（＝ｎＣＬ
−３）、マウスのＣＡＰＮ６（＝ｎＣＬ−４）およびヒトのＣＡＰＮ６（＝ｎＣ
Ｌ−４）間のホモロジーを示している。

【図３】第３図は種々のカルパインの系統的系図を示している。

【図４】第４図は種々の組織におけるＣＡＰＮ６遺伝子の発現の³²Ｐ−標識したヒトｃ
ＤＮＡ断片による検出結果を表す。

【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書

【提出日】平成１２年２月２５日（２０００．２．２５）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】特許請求の範囲

【補正方法】変更

【補正内容】

【特許請求の範囲】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｐ 9/00 Ａ６１Ｐ 25/28 25/00 29/00 25/28 35/00 29/00 37/00 35/00 37/08 37/00 Ｃ１２Ｎ 9/64 Ｚ 37/08 Ｃ１２Ｑ 1/37 Ｃ１２Ｎ 9/64 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡＣ１２Ｑ 1/37 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＵ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＺ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＪＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＫ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＲ，ＵＡ，ＵＳ

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】配列ＳＥＱＩＤＮＯ：１またはＳＥＱＩＤＮＯ：３を有し、
その際カルパイン遺伝子、その対立変異体、類似体または誘導体が以下の配列：（ａ）Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ａｌａ、該配列は、カルパインＩの位置１１５を占めるヒトのカルパインＩのアミノ酸シ
ステインを配列ＳＥＱＩＤＮＯ：１およびＳＥＱＩＤＮＯ：３の位置８１である
リシンに変えたヒトのカルパインＩの相応の配列と異なる；（ｂ）Ａｌａ−Ｘ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ−Ｌｅｕ−Ａｌａ、ヒトのカルパインＩの相応の配列と比較して位置１２２および１２５のアラニン
およびトレオニンが配列ＳＥＱＩＤＮＯ：１およびＳＥＱＩＤＮＯ：３の位置８
８および９１のセリンおよびアラニンに変わっている；（ｃ）Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−（ＨｉｓまたはＴｙｒ）−Ｔｈｒ−Ｘ−Ｔｈｒ
、ヒトのカルパインＩの相応の配列と比較して、位置２７２、２７３および２７５
のアミノ酸のヒスチジン、アラニンおよびセリンが配列ＳＥＱＩＤＮＯ：１およ
びＳＥＱＩＤＮＯ：３の位置２５２、２５３および２５５のチロシン、トレオニ
ンおよびトレオニンに変わっており、更にＳＥＱＩＤＮＯ：３においてカルパイ
ンＩの位置２７４のチロシン残基がＳＥＱＩＤＮＯ：３の位置２５４のヒスチジ
ンに変わっている；（ｄ）Ａｒｇ−Ｘ−Ａｒｇ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ、該配列は、カルパインＩの位置２９８を占めるヒトのカルパインＩのアミノ酸ト
リプトファンが配列ＳＥＱＩＤＮＯ：１およびＳＥＱＩＤＮＯ：３の位置２８６
であるロイシンと変わっているヒトのカルパインＩの相応の配列とは異なり、か
つ前記の配列中のＸは任意の天然アミノ酸である；を有するＣＡＰＮ６カルパイン遺伝子、得られるアミノ酸レベルで６０〜１００
％のホモロジーを有するその対立変異体、類似体または誘導体。
【請求項２】請求項１記載のＣＡＰＮ６カルパイン遺伝子、その対立変異
体または類似体を有し、かつ１個以上の調節シグナルに機能的に結合して遺伝子
発現を増大させた遺伝子構築物。
【請求項３】請求項１記載のＣＡＰＮ６遺伝子、その対立変異体または類
似体によってコードされるアミノ酸。
【請求項４】酵素的に活性なタンパク質の配列である、請求項３記載のア
ミノ酸配列。
【請求項５】カルパインインヒビターを同定する方法において、請求項１
記載の配列によってコードされるカルパイン、その対立変異体または類似体を組
織または細胞から単離し、酵素ＣＡＰＮ６の基質の分解の阻害ならびに、少なく
とも１種の試験において試験物質による酵素カルパインＩおよび／またはＩＩの
分解の阻害を測定し、酵素ＣＡＰＮ６および少なくとも１種の他のカルパインを
阻害する試験物質を選択する、カルパインの同定方法。
【請求項６】酵素ＣＡＰＮ６を阻害しないが、酵素カルパインＩおよび／
またはＩＩを阻害する試験物質を選択する、請求項５記載の方法。
【請求項７】酵素ＣＡＰＮ６を阻害するが、酵素カルパインＩおよび／ま
たはＩＩを阻害しない試験物質を選択する、請求項５記載の方法。
【請求項８】細胞系における細胞膜を透過する試験物質を選択する、請求
項５から７までのいずれか１項記載の方法。
【請求項９】酵素ＣＡＰＮ６およびその対立変異体または類似体を製造す
るための方法において、請求項１記載のＣＡＰＮ６、その対立変異体または類似
体のための少なくとも１コピーの遺伝子配列をベクター中にクローニングし、酵
素ＣＡＰＮ６、その対立変異体または類似体のための遺伝子をベクターのために
適当な宿主生物中で発現させ、引き続き酵素を宿主生物から単離することを特徴
とする製造方法。
【請求項１０】遺伝子、対立変異体または類似体が原核細胞または真核細
胞において発現可能なベクターを使用する、請求項９記載の方法。
【請求項１１】宿主生物として細菌、真菌または動物細胞を使用する、請
求項９記載の方法。
【請求項１２】ベクターとしてバキュロウイルスを使用し、かつ宿主生物
として昆虫細胞を使用する、請求項９記載の方法。
【請求項１３】請求項５から８までのいずれか１項記載のように同定でき
るカルパインインヒビターのカルパイン機能障害が存在する疾患の治療用の薬剤
の製造のための使用。
【請求項１４】心臓血管性障害、免疫性障害、炎症性障害、アレルギー性
障害、神経性障害、神経変性性障害または癌性障害の群から選択される疾患の治
療用の薬剤を製造するための請求項１３記載のカルパインインヒビターの使用。
【請求項１５】試験系における請求項３記載のアミノ酸配列の使用。
【請求項１６】抗体を製造するための請求項３記載のアミノ酸配列の使用
。
【請求項１７】アンチセンスｍＲＮＡを製造するための請求項１記載の遺
伝子配列、その対立変異体または類似体の使用。
【請求項１８】カルパイン機能障害が存在する疾患の治療用の薬剤を製造
するための請求項１７記載のアンチセンスｍＲＮＡの使用。
【請求項１９】疾患の診断または遺伝子治療における請求項１記載のカル
パイン遺伝子およびその対立変異体または類似体の使用。