JP3407741B2 - タウ蛋白質のリン酸化方法 - Google Patents
タウ蛋白質のリン酸化方法Info
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- Y02P20/52—Improvements relating to the production of bulk chemicals using catalysts, e.g. selective catalysts
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- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、タウ蛋白質、その部分
ペプチドまたはそれらに類似したペプチドをリン酸化酵
素を触媒としてリン酸化する方法に関するものであり、
タウ蛋白質のリン酸化を阻害または促進する薬剤の探索
に利用できる。
ペプチドまたはそれらに類似したペプチドをリン酸化酵
素を触媒としてリン酸化する方法に関するものであり、
タウ蛋白質のリン酸化を阻害または促進する薬剤の探索
に利用できる。
【０００２】
【従来の技術】アルツハイマー病は初老期（４５〜６５
才）に発病する進行性の痴呆で、病理学的にはその脳内
に多数の老人斑と神経原線維変化が認められる。６５才
以上の老年期に発症するいわゆる自然老化による老年痴
呆も、病理学的に何ら本質的な差は認められないので、
アルツハイマー型老年痴呆と呼ばれている。この疾患の
患者数は、高齢者人口の増加とともに増え、社会的に重
要な疾患となっている。しかしこの疾患の原因は諸説あ
るものの結果的にはまだ不明であり、早期解明が望まれ
ている。
才）に発病する進行性の痴呆で、病理学的にはその脳内
に多数の老人斑と神経原線維変化が認められる。６５才
以上の老年期に発症するいわゆる自然老化による老年痴
呆も、病理学的に何ら本質的な差は認められないので、
アルツハイマー型老年痴呆と呼ばれている。この疾患の
患者数は、高齢者人口の増加とともに増え、社会的に重
要な疾患となっている。しかしこの疾患の原因は諸説あ
るものの結果的にはまだ不明であり、早期解明が望まれ
ている。
【０００３】アルツハイマー病およびアルツハイマー型
老年痴呆に特徴的な二つの病理変化の出現量は、知能障
害の程度とよく相関することが知られている。そこで、
この二つの病理変化を生ずる不溶性の蓄積物質を分子レ
ベルで解明し、この疾患の病因に到達しようという研究
が１９８０年代の前半頃から行われてきた。この病理変
化の一つである神経原線維変化は、神経細胞内にＰＨＦ
（ペアード・ヘリカル・フィラメント：ｐａｉｒｅｄ
ｈｅｌｉｃａｌ ｆｉｌａｍｅｎｔ）と呼ばれる二重ら
せん状の繊維状物質が蓄積してくるものである。近年、
その構成成分として、脳に特異的な微小管付随タンパク
質の一種であるタウ蛋白質とユビキチンが同定された
（井原ら，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，９９，１８０７−１
８１０（１９８６）；Ｇｒｕｎｄｋｅ−Ｉｑｂａｌら，
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８
３，４９１３−４９１７（１９８６））。このうちタウ
蛋白質（以下「タウ」と称することもある）は、通常Ｓ
ＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動で分子量４８〜６
５Ｋに数本のバンドを形成する一群の近縁タンパク質
で、微小管の形成を推進することが知られている。さら
に、ＰＨＦ中に組み込まれたタウは、通常のタウより強
くリン酸化されていることが、ＰＨＦに対するポリクロ
ーナル抗体（抗ｐｔａｕ抗体：井原ら，Ｊ．Ｂｉｏｃｈ
ｅｍ．，９９，１８０７−１８１０（１９８６））や、
タウに対するモノクローナル抗体（ｔａｕ−１抗体：Ｇ
ｒｕｎｄｋｅ−Ｉｑｂａｌら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａ
ｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８３，４９１３−４９１７
（１９８６））を用いて証明された。
老年痴呆に特徴的な二つの病理変化の出現量は、知能障
害の程度とよく相関することが知られている。そこで、
この二つの病理変化を生ずる不溶性の蓄積物質を分子レ
ベルで解明し、この疾患の病因に到達しようという研究
が１９８０年代の前半頃から行われてきた。この病理変
化の一つである神経原線維変化は、神経細胞内にＰＨＦ
（ペアード・ヘリカル・フィラメント：ｐａｉｒｅｄ
ｈｅｌｉｃａｌ ｆｉｌａｍｅｎｔ）と呼ばれる二重ら
せん状の繊維状物質が蓄積してくるものである。近年、
その構成成分として、脳に特異的な微小管付随タンパク
質の一種であるタウ蛋白質とユビキチンが同定された
（井原ら，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，９９，１８０７−１
８１０（１９８６）；Ｇｒｕｎｄｋｅ−Ｉｑｂａｌら，
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８
３，４９１３−４９１７（１９８６））。このうちタウ
蛋白質（以下「タウ」と称することもある）は、通常Ｓ
ＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動で分子量４８〜６
５Ｋに数本のバンドを形成する一群の近縁タンパク質
で、微小管の形成を推進することが知られている。さら
に、ＰＨＦ中に組み込まれたタウは、通常のタウより強
くリン酸化されていることが、ＰＨＦに対するポリクロ
ーナル抗体（抗ｐｔａｕ抗体：井原ら，Ｊ．Ｂｉｏｃｈ
ｅｍ．，９９，１８０７−１８１０（１９８６））や、
タウに対するモノクローナル抗体（ｔａｕ−１抗体：Ｇ
ｒｕｎｄｋｅ−Ｉｑｂａｌら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａ
ｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８３，４９１３−４９１７
（１９８６））を用いて証明された。
【０００４】本発明者らは、この異常なリン酸化を触媒
する酵素を単離し、タウプロテインキナーゼＩと命名し
た（内田ら，生化学，第６４巻，第５号，ｐ．３０８
（１９９２））。しかし、タウプロテインキナーゼＩの
一次構造は不明であり、またタウプロテインキナーゼＩ
の基質となりうる条件や、リン酸化の詳細については明
らかにされていないのが現状であった。
する酵素を単離し、タウプロテインキナーゼＩと命名し
た（内田ら，生化学，第６４巻，第５号，ｐ．３０８
（１９９２））。しかし、タウプロテインキナーゼＩの
一次構造は不明であり、またタウプロテインキナーゼＩ
の基質となりうる条件や、リン酸化の詳細については明
らかにされていないのが現状であった。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】本発明者らは、ＰＨＦ
の蓄積がアルツハイマー病脳でニューロンの変性、引き
続いて死を誘導しているものと考え、ＰＨＦの蓄積の原
因となるタウ蛋白の異常リン酸化に相当する反応を試験
官内（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）で遂行する方法を明らかにす
ることによって、アルツハイマー病の治療および予防の
手段を得ようとするものであり、さらにはこうしたリン
酸化の異常に起因するその他の疾患の治療および予防の
手段を得ようとするものである。
の蓄積がアルツハイマー病脳でニューロンの変性、引き
続いて死を誘導しているものと考え、ＰＨＦの蓄積の原
因となるタウ蛋白の異常リン酸化に相当する反応を試験
官内（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）で遂行する方法を明らかにす
ることによって、アルツハイマー病の治療および予防の
手段を得ようとするものであり、さらにはこうしたリン
酸化の異常に起因するその他の疾患の治療および予防の
手段を得ようとするものである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記目的
を達成するためにＰＨＦに組み込まれているリン酸化タ
ウと同一のエピトープを持つリン酸化タウのリン酸化部
位を決定し、そのリン酸化を触媒するリン酸化酵素の構
造を明らかにすることによって、かかるリン酸化反応の
必要条件を解明し、本発明に到達した。
を達成するためにＰＨＦに組み込まれているリン酸化タ
ウと同一のエピトープを持つリン酸化タウのリン酸化部
位を決定し、そのリン酸化を触媒するリン酸化酵素の構
造を明らかにすることによって、かかるリン酸化反応の
必要条件を解明し、本発明に到達した。
【０００７】即ち本発明の要旨は、下記理化学的性質を
有するリン酸化酵素Ｉの作用により、タウ蛋白質または
その部分ペプチドをリン酸化することを特徴とするタウ
蛋白質のリン酸化方法に存する。 （ａ）作用：ＡＴＰをリン酸供与体として、タウ蛋白質
中のセリンおよびスレオニンをリン酸化し、タウ蛋白質
１分子あたり４残基以下のリン酸基を導入する。 （ｂ）基質特異性：脳抽出液の蛋白質の中で、微小管付
随蛋白質であるタウ蛋白質およびＭＡＰ２を特異的にリ
ン酸化する。ヒストンをリン酸化しない。α−カゼイン
を少しリン酸化する。配列番号２に記載のアミノ酸配列
の１４１番目のセリン、１７３番目のスレオニン、３０
７番目のセリンおよび３２４番目のセリンから選ばれる
１以上のアミノ酸を特異的にリン酸化する。 （ｃ）至適ｐＨ：チューブリン非存在下での至適ｐＨは
６．５であり、チューブリン存在下での至適ｐＨは６．
０である。 （ｄ）作用適温：３７℃
有するリン酸化酵素Ｉの作用により、タウ蛋白質または
その部分ペプチドをリン酸化することを特徴とするタウ
蛋白質のリン酸化方法に存する。 （ａ）作用：ＡＴＰをリン酸供与体として、タウ蛋白質
中のセリンおよびスレオニンをリン酸化し、タウ蛋白質
１分子あたり４残基以下のリン酸基を導入する。 （ｂ）基質特異性：脳抽出液の蛋白質の中で、微小管付
随蛋白質であるタウ蛋白質およびＭＡＰ２を特異的にリ
ン酸化する。ヒストンをリン酸化しない。α−カゼイン
を少しリン酸化する。配列番号２に記載のアミノ酸配列
の１４１番目のセリン、１７３番目のスレオニン、３０
７番目のセリンおよび３２４番目のセリンから選ばれる
１以上のアミノ酸を特異的にリン酸化する。 （ｃ）至適ｐＨ：チューブリン非存在下での至適ｐＨは
６．５であり、チューブリン存在下での至適ｐＨは６．
０である。 （ｄ）作用適温：３７℃
【０００８】（ｅ）分子量：０．５Ｍ塩化ナトリウムの
存在下でのゲル濾過により求めた測定値は約５万であ
り、塩化ナトリウム非存在下ではタウ蛋白質と複合体を
作り、そのゲル濾過による測定値は約１０万である。Ｓ
ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により求めた測
定値は約４万５千である。 （ｆ）安定性：２５％グリセロールと０．０２％ポリオ
キシエチレンソルビタンモノラウレート中、ｐＨ６．
５、温度−２０℃において少なくとも一年間安定であ
る。 （ｇ）活性化：既知のキナーゼの活性化因子であるｃＡ
ＭＰ、ｃＧＭＰ、Ｃａ2+、カルモジュリンおよびリン脂
質等では活性化されない。チューブリンの重合条件で、
タウ蛋白質のリン酸化が活性化される。 （ｈ）阻害：９０ｍＭのＮａＣｌまたはＫＣｌで活性が
半減する。
存在下でのゲル濾過により求めた測定値は約５万であ
り、塩化ナトリウム非存在下ではタウ蛋白質と複合体を
作り、そのゲル濾過による測定値は約１０万である。Ｓ
ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により求めた測
定値は約４万５千である。 （ｆ）安定性：２５％グリセロールと０．０２％ポリオ
キシエチレンソルビタンモノラウレート中、ｐＨ６．
５、温度−２０℃において少なくとも一年間安定であ
る。 （ｇ）活性化：既知のキナーゼの活性化因子であるｃＡ
ＭＰ、ｃＧＭＰ、Ｃａ2+、カルモジュリンおよびリン脂
質等では活性化されない。チューブリンの重合条件で、
タウ蛋白質のリン酸化が活性化される。 （ｈ）阻害：９０ｍＭのＮａＣｌまたはＫＣｌで活性が
半減する。
【０００９】以下、本発明につき詳細に説明する。本発
明で使用するリン酸化酵素Ｉ（以下、「タウプロテイン
キナーゼＩ」と略記する）は、例えばラットやウシ等の
哺乳動物の脳抽出液から温度依存性の重合、脱重合等に
より微小管タンパク質画分を得、フォスフォセルロース
カラムクロマトグラフィー、ゲル濾過、ハイドロキシア
パタイトカラムクロマトグラフィー、Ｓ−セファロース
カラムクロマトグラフィー、ヘパリンカラムクロマトグ
ラフィー等の操作を組み合わせることによって精製する
ことができる（内田ら，生化学，第６４巻，第５号，
ｐ．３０８（１９９２））。精製されたタウプロテイン
キナーゼＩは、上記（ａ）〜（ｈ）に記載の理化学的性
質を有する。この精製蛋白の部分一次構造は、常法によ
りアミノ酸配列分析を行うことにより得ることができる
が、全一次構造は同蛋白のｃＤＮＡをクローニングする
ことにより知ることができる。ｃＤＮＡのクローニング
には、上記の部分一次構造の情報に基づく方法、同蛋白
に特異的な抗体を利用する方法、同蛋白に特異的な機能
や作用の検出を利用する方法等が応用できる。また、部
分アミノ酸配列に相当する合成ヌクレオチドオリゴマー
をプライマーとして、ラット等の脳のｍＲＮＡ画分から
遺伝子増幅法（ＰＣＲ法）を用いてかかるタウプロテイ
ンキナーゼＩをコードするｍＲＮＡのみを増幅し、対応
するｃＤＮＡをクローニングしてもよい。
明で使用するリン酸化酵素Ｉ（以下、「タウプロテイン
キナーゼＩ」と略記する）は、例えばラットやウシ等の
哺乳動物の脳抽出液から温度依存性の重合、脱重合等に
より微小管タンパク質画分を得、フォスフォセルロース
カラムクロマトグラフィー、ゲル濾過、ハイドロキシア
パタイトカラムクロマトグラフィー、Ｓ−セファロース
カラムクロマトグラフィー、ヘパリンカラムクロマトグ
ラフィー等の操作を組み合わせることによって精製する
ことができる（内田ら，生化学，第６４巻，第５号，
ｐ．３０８（１９９２））。精製されたタウプロテイン
キナーゼＩは、上記（ａ）〜（ｈ）に記載の理化学的性
質を有する。この精製蛋白の部分一次構造は、常法によ
りアミノ酸配列分析を行うことにより得ることができる
が、全一次構造は同蛋白のｃＤＮＡをクローニングする
ことにより知ることができる。ｃＤＮＡのクローニング
には、上記の部分一次構造の情報に基づく方法、同蛋白
に特異的な抗体を利用する方法、同蛋白に特異的な機能
や作用の検出を利用する方法等が応用できる。また、部
分アミノ酸配列に相当する合成ヌクレオチドオリゴマー
をプライマーとして、ラット等の脳のｍＲＮＡ画分から
遺伝子増幅法（ＰＣＲ法）を用いてかかるタウプロテイ
ンキナーゼＩをコードするｍＲＮＡのみを増幅し、対応
するｃＤＮＡをクローニングしてもよい。
【００１０】かくして得られるラット由来のタウプロテ
インキナーゼＩの全一次構造は、例えば、配列表の配列
番号１に記載のアミノ酸配列で表される。なお、かかる
ラット由来のタウプロテインキナーゼＩの全一次構造
は、ＧＳＫ−３β（グリコーゲンシンターゼ キナーゼ
３β）として知られる酵素（Ｊ．Ｒ．Ｗｏｏｄｇｅ
ｔ，Ｔｈｅ ＥＭＢＯ Ｊ．，９（８），２４３１−２
４３８（１９９０））と一致することが確認された。
インキナーゼＩの全一次構造は、例えば、配列表の配列
番号１に記載のアミノ酸配列で表される。なお、かかる
ラット由来のタウプロテインキナーゼＩの全一次構造
は、ＧＳＫ−３β（グリコーゲンシンターゼ キナーゼ
３β）として知られる酵素（Ｊ．Ｒ．Ｗｏｏｄｇｅ
ｔ，Ｔｈｅ ＥＭＢＯ Ｊ．，９（８），２４３１−２
４３８（１９９０））と一致することが確認された。
【００１１】タウプロテインキナーゼＩは、上記のよう
に哺乳動物の脳抽出液から精製することによって取得す
ることもできるが、より大量かつ安定して取得するため
には、クローニングにより得られたｃＤＮＡを適当なベ
クターに組み込み、そのベクターが作用しうる宿主にか
かるベクターを導入すればタウプロテインキナーゼＩの
産生細胞を作成することができ、その培養物から目的と
する蛋白を精製するのが好ましい。
に哺乳動物の脳抽出液から精製することによって取得す
ることもできるが、より大量かつ安定して取得するため
には、クローニングにより得られたｃＤＮＡを適当なベ
クターに組み込み、そのベクターが作用しうる宿主にか
かるベクターを導入すればタウプロテインキナーゼＩの
産生細胞を作成することができ、その培養物から目的と
する蛋白を精製するのが好ましい。
【００１２】本発明において基質となるタウ蛋白質は、
哺乳動物の脳組織から、例えば井原らの方法（Ｊ．Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ．，８６，５８７−５９０（１９７９））や
Ｇｒｕｎｄｋｅ−Ｉｑｂａｌらの方法（Ｊ．Ｂｉｏｌ．
Ｃｈｅｍ．，２６１，６０８４─６０８９（１９８
６））に従って抽出、精製することができる。さらにそ
の全一次構造は、上記タウプロテインキナーゼＩと同様
の手法により決定することができる。かくして得られる
タウ蛋白質の全一次構造は、ヒト由来のものとして例え
ば配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列で表される
もの等が挙げられる（Ｇｏｅｄｅｒｔ ｅｔ ａｌ，Ｐ
ｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５，
４０５１−４０５５（１９８８））。
哺乳動物の脳組織から、例えば井原らの方法（Ｊ．Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ．，８６，５８７−５９０（１９７９））や
Ｇｒｕｎｄｋｅ−Ｉｑｂａｌらの方法（Ｊ．Ｂｉｏｌ．
Ｃｈｅｍ．，２６１，６０８４─６０８９（１９８
６））に従って抽出、精製することができる。さらにそ
の全一次構造は、上記タウプロテインキナーゼＩと同様
の手法により決定することができる。かくして得られる
タウ蛋白質の全一次構造は、ヒト由来のものとして例え
ば配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列で表される
もの等が挙げられる（Ｇｏｅｄｅｒｔ ｅｔ ａｌ，Ｐ
ｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５，
４０５１−４０５５（１９８８））。
【００１３】脳組織から抽出精製したタウ蛋白質は既に
ある程度リン酸化されており、配列表の配列番号２に記
載のアミノ酸配列で１４４番目のセリンおよび／または
３１５番目のセリンが部分的にリン酸化されている（後
述の実施例１参照）。また、タウ蛋白質を下記の理化学
的性質を有する別種のリン酸化酵素ＩＩ（タウプロテイ
ンキナーゼＩＩ：内田ら，生化学，第６４巻，第５号，
ｐ．３０８（１９９２））で部分的にリン酸化すると、
上記の配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列で１４
４番目のセリン、３１５番目のセリン以外にも、１４７
番目のスレオニンおよび／または１７７番目のセリンが
リン酸化される（内田ら，生化学，第６４巻，第５号，
ｐ．３０８（１９９２）；石黒ら，Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅ
ｎｃｅＬｅｔｔｅｒｓ，１２８，１９５（１９９
１））。
ある程度リン酸化されており、配列表の配列番号２に記
載のアミノ酸配列で１４４番目のセリンおよび／または
３１５番目のセリンが部分的にリン酸化されている（後
述の実施例１参照）。また、タウ蛋白質を下記の理化学
的性質を有する別種のリン酸化酵素ＩＩ（タウプロテイ
ンキナーゼＩＩ：内田ら，生化学，第６４巻，第５号，
ｐ．３０８（１９９２））で部分的にリン酸化すると、
上記の配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列で１４
４番目のセリン、３１５番目のセリン以外にも、１４７
番目のスレオニンおよび／または１７７番目のセリンが
リン酸化される（内田ら，生化学，第６４巻，第５号，
ｐ．３０８（１９９２）；石黒ら，Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅ
ｎｃｅＬｅｔｔｅｒｓ，１２８，１９５（１９９
１））。
【００１４】（ｉ）作用：ＡＴＰをリン酸供与体とし
て、タウ蛋白質中の、Ｃ末端側の隣にプロリンのあるセ
リンおよびスレオニンをリン酸化し、タウ蛋白質１分子
あたり４残基のリン酸基を導入する。 （ｊ）基質特異性：脳抽出液の蛋白質の中で、微小管付
随蛋白質であるタウ蛋白質およびＭＡＰ２を特異的にリ
ン酸化する。ヒストンＨ１とニューロフィラメントＨサ
ブユニットもリン酸化する。β−カゼインを少しリン酸
化する。 （ｋ）至適ｐＨ：チューブリン非存在下での至適ｐＨは
６．５であり、チューブリン存在下での至適ｐＨは６．
０である。 （ｌ）作用適温：３７℃ （ｍ）分子量：０．５Ｍ塩化ナトリウムの存在下でのゲ
ル濾過により求めた測定値は約５万であり、塩化ナトリ
ウム非存在下ではタウ蛋白質と複合体を作り、そのゲル
濾過による測定値は約１０万である。ＳＤＳ−ポリアク
リルアミドゲル電気泳動により求めた測定値は約３万で
あり、その他に２．３万の蛋白質があり、この２種の蛋
白質が結合してゲル濾過では約５万になっている。 （ｎ）安定性：２５％グリセロールと０．０２％ポリオ
キシエチレンソルビタンモノラウレート中、ｐＨ６．
５、温度−２０℃において少なくとも一年間安定であ
る。（ｏ）活性化：既知のキナーゼの活性化因子である
ｃＡＭＰ、ｃＧＭＰ、Ｃａ2+、カルモジュリンおよびリ
ン脂質等では活性化されない。チューブリンの重合条件
で、タウ蛋白質のリン酸化が活性化される。 （ｐ）阻害：４０ｍＭのＮａＣｌまたはＫＣｌで活性が
半減する。
て、タウ蛋白質中の、Ｃ末端側の隣にプロリンのあるセ
リンおよびスレオニンをリン酸化し、タウ蛋白質１分子
あたり４残基のリン酸基を導入する。 （ｊ）基質特異性：脳抽出液の蛋白質の中で、微小管付
随蛋白質であるタウ蛋白質およびＭＡＰ２を特異的にリ
ン酸化する。ヒストンＨ１とニューロフィラメントＨサ
ブユニットもリン酸化する。β−カゼインを少しリン酸
化する。 （ｋ）至適ｐＨ：チューブリン非存在下での至適ｐＨは
６．５であり、チューブリン存在下での至適ｐＨは６．
０である。 （ｌ）作用適温：３７℃ （ｍ）分子量：０．５Ｍ塩化ナトリウムの存在下でのゲ
ル濾過により求めた測定値は約５万であり、塩化ナトリ
ウム非存在下ではタウ蛋白質と複合体を作り、そのゲル
濾過による測定値は約１０万である。ＳＤＳ−ポリアク
リルアミドゲル電気泳動により求めた測定値は約３万で
あり、その他に２．３万の蛋白質があり、この２種の蛋
白質が結合してゲル濾過では約５万になっている。 （ｎ）安定性：２５％グリセロールと０．０２％ポリオ
キシエチレンソルビタンモノラウレート中、ｐＨ６．
５、温度−２０℃において少なくとも一年間安定であ
る。（ｏ）活性化：既知のキナーゼの活性化因子である
ｃＡＭＰ、ｃＧＭＰ、Ｃａ2+、カルモジュリンおよびリ
ン脂質等では活性化されない。チューブリンの重合条件
で、タウ蛋白質のリン酸化が活性化される。 （ｐ）阻害：４０ｍＭのＮａＣｌまたはＫＣｌで活性が
半減する。
【００１５】これは、タウプロテインキナーゼＩＩがＳ
／Ｔ−Ｐ（セリン／スレオニン−プロリン）配列を認識
する酵素であり、プロリンのＮ末端側の隣位に位置する
セリンおよび／またはスレオニンを特異的にリン酸化す
る性質によるものである。ところが、こうして部分的に
リン酸化したタウ蛋白質は、前述の抗ｐｔａｕ抗体とは
反応しなかった。一方、上記のように脳組織から抽出、
精製されたタウ蛋白質をアルカリフォスファターゼで処
理することにより脱リン酸化してしまうと、本発明のリ
ン酸化反応は認められるほどには進行せず、これに対
し、脳組織から抽出、精製したタウ蛋白質またはタウプ
ロテインキナーゼＩＩを用いて部分的にリン酸化したタ
ウ蛋白質を基質とすると、本発明のリン酸化反応が進行
することが確認された（後述の実施例参照）。以上の事
実から、タウ蛋白質のリン酸化反応は以下のような経路
で進行しているものと考えられた。
／Ｔ−Ｐ（セリン／スレオニン−プロリン）配列を認識
する酵素であり、プロリンのＮ末端側の隣位に位置する
セリンおよび／またはスレオニンを特異的にリン酸化す
る性質によるものである。ところが、こうして部分的に
リン酸化したタウ蛋白質は、前述の抗ｐｔａｕ抗体とは
反応しなかった。一方、上記のように脳組織から抽出、
精製されたタウ蛋白質をアルカリフォスファターゼで処
理することにより脱リン酸化してしまうと、本発明のリ
ン酸化反応は認められるほどには進行せず、これに対
し、脳組織から抽出、精製したタウ蛋白質またはタウプ
ロテインキナーゼＩＩを用いて部分的にリン酸化したタ
ウ蛋白質を基質とすると、本発明のリン酸化反応が進行
することが確認された（後述の実施例参照）。以上の事
実から、タウ蛋白質のリン酸化反応は以下のような経路
で進行しているものと考えられた。
【００１６】
【化１】
本発明の基質としては、タウプロテインキナーゼＩの基
質となりうるタウ蛋白質またはその部分ペプチドであれ
ばいずれのものも使用できる。例えば、 一次構造が配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配
列で表されるもの、 スプライシングを受けた一次構造が配列表の配列番
号２に記載のアミノ酸配列で表されるもの、 配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列の部分ペ
プチド 等が挙げられ、セリンおよび／またはスレオニンが部分
的に、より好ましくは１〜４残基リン酸化されているも
のが挙げられる。タウ蛋白質の具体例としては、Ｇｏｅ
ｄｅｒｔ ｅｔ ａｌ のＮｅｕｒｏｎ，３，５１９−
５２６（１９８９）に記載の３５２アミノ酸残基〜４４
１アミノ酸残基の一次構造を有するタウ蛋白質等が挙げ
られる。一次構造が配列表の配列番号２に記載のアミノ
酸配列で表されるタウ蛋白質を基質として使用した場
合、同配列１４１番目のセリン、１７３番目のスレオニ
ン、３０７番目のセリンおよび３２４番目のセリンから
選ばれる１以上のアミノ酸がリン酸化される。従って本
発明で好ましく用いられるタウ蛋白質の部分ペプチドと
しては、配列表の配列番号３〜２９に記載のアミノ酸配
列を含有してなるものが好ましい。以下に好ましい基質
とそのリン酸化部位を示す。 配列表の配列番号３に記
載のアミノ酸配列を含有してなるペプチドについては、
４番目のセリン、７番目のスレオニン、３７番目のセリ
ンおよび１７５番目のセリンから選ばれる１以上のアミ
ノ酸が予めリン酸化されており、１番目のセリン、３３
番目のスレオニン、１６７番目のセリンおよび１８４番
目のセリンから選ばれる１以上のアミノ酸がリン酸化さ
れる。
質となりうるタウ蛋白質またはその部分ペプチドであれ
ばいずれのものも使用できる。例えば、 一次構造が配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配
列で表されるもの、 スプライシングを受けた一次構造が配列表の配列番
号２に記載のアミノ酸配列で表されるもの、 配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列の部分ペ
プチド 等が挙げられ、セリンおよび／またはスレオニンが部分
的に、より好ましくは１〜４残基リン酸化されているも
のが挙げられる。タウ蛋白質の具体例としては、Ｇｏｅ
ｄｅｒｔ ｅｔ ａｌ のＮｅｕｒｏｎ，３，５１９−
５２６（１９８９）に記載の３５２アミノ酸残基〜４４
１アミノ酸残基の一次構造を有するタウ蛋白質等が挙げ
られる。一次構造が配列表の配列番号２に記載のアミノ
酸配列で表されるタウ蛋白質を基質として使用した場
合、同配列１４１番目のセリン、１７３番目のスレオニ
ン、３０７番目のセリンおよび３２４番目のセリンから
選ばれる１以上のアミノ酸がリン酸化される。従って本
発明で好ましく用いられるタウ蛋白質の部分ペプチドと
しては、配列表の配列番号３〜２９に記載のアミノ酸配
列を含有してなるものが好ましい。以下に好ましい基質
とそのリン酸化部位を示す。 配列表の配列番号３に記
載のアミノ酸配列を含有してなるペプチドについては、
４番目のセリン、７番目のスレオニン、３７番目のセリ
ンおよび１７５番目のセリンから選ばれる１以上のアミ
ノ酸が予めリン酸化されており、１番目のセリン、３３
番目のスレオニン、１６７番目のセリンおよび１８４番
目のセリンから選ばれる１以上のアミノ酸がリン酸化さ
れる。
【００１７】配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列
を含有してなるペプチドについては、４番目のセリン、
７番目のスレオニン、３７番目のセリンおよび１７５番
目のセリンから選ばれる１以上のアミノ酸が予めリン酸
化されており、１番目のセリン、３３番目のスレオニン
および１６７番目のセリンから選ばれる１以上のアミノ
酸がリン酸化される。
を含有してなるペプチドについては、４番目のセリン、
７番目のスレオニン、３７番目のセリンおよび１７５番
目のセリンから選ばれる１以上のアミノ酸が予めリン酸
化されており、１番目のセリン、３３番目のスレオニン
および１６７番目のセリンから選ばれる１以上のアミノ
酸がリン酸化される。
【００１８】配列表の配列番号５に記載のアミノ酸配列
を含有してなるペプチドについては、４番目のセリン、
７番目のスレオニンおよび３７番目のセリンから選ばれ
る１以上のアミノ酸が予めリン酸化されており、１番目
のセリン、３３番目のスレオニンおよび１６７番目のセ
リンから選ばれる１以上のアミノ酸がリン酸化される。
配列表の配列番号６に記載のアミノ酸配列を含有してな
るペプチドについては、４番目のセリン、７番目のスレ
オニンおよび３７番目のセリンから選ばれる１以上のア
ミノ酸が予めリン酸化されており、１番目のセリンおよ
び／または３３番目のスレオニンがリン酸化される。
を含有してなるペプチドについては、４番目のセリン、
７番目のスレオニンおよび３７番目のセリンから選ばれ
る１以上のアミノ酸が予めリン酸化されており、１番目
のセリン、３３番目のスレオニンおよび１６７番目のセ
リンから選ばれる１以上のアミノ酸がリン酸化される。
配列表の配列番号６に記載のアミノ酸配列を含有してな
るペプチドについては、４番目のセリン、７番目のスレ
オニンおよび３７番目のセリンから選ばれる１以上のア
ミノ酸が予めリン酸化されており、１番目のセリンおよ
び／または３３番目のスレオニンがリン酸化される。
【００１９】配列表の配列番号７に記載のアミノ酸配列
を含有してなるペプチドについては、４番目のセリンお
よび／または７番目のスレオニンが予めリン酸化されて
おり、１番目のセリンおよび／または３３番目のスレオ
ニンがリン酸化される。また、配列表の配列番号８に記
載のアミノ酸配列を含有してなるペプチドについては、
４番目のセリンおよび／または７番目のスレオニンが予
めリン酸化されており、１番目のセリンがリン酸化され
る。
を含有してなるペプチドについては、４番目のセリンお
よび／または７番目のスレオニンが予めリン酸化されて
おり、１番目のセリンおよび／または３３番目のスレオ
ニンがリン酸化される。また、配列表の配列番号８に記
載のアミノ酸配列を含有してなるペプチドについては、
４番目のセリンおよび／または７番目のスレオニンが予
めリン酸化されており、１番目のセリンがリン酸化され
る。
【００２０】配列表の配列番号９に記載のアミノ酸配列
を含有してなるペプチドについては、４番目のセリンが
予めリン酸化されており、１番目のセリンがリン酸化さ
れる。また、配列表の配列番号１０に記載のアミノ酸配
列を含有してなるペプチドについては、１番目のセリ
ン、４番目のスレオニン、３４番目のセリンおよび１７
２番目のセリンから選ばれる１以上のアミノ酸が予めリ
ン酸化されており、３０番目のスレオニン、１６４番目
のセリンおよび１８１番目のセリンから選ばれる１以上
のアミノ酸がリン酸化される。
を含有してなるペプチドについては、４番目のセリンが
予めリン酸化されており、１番目のセリンがリン酸化さ
れる。また、配列表の配列番号１０に記載のアミノ酸配
列を含有してなるペプチドについては、１番目のセリ
ン、４番目のスレオニン、３４番目のセリンおよび１７
２番目のセリンから選ばれる１以上のアミノ酸が予めリ
ン酸化されており、３０番目のスレオニン、１６４番目
のセリンおよび１８１番目のセリンから選ばれる１以上
のアミノ酸がリン酸化される。
【００２１】配列表の配列番号１１に記載のアミノ酸配
列を含有してなるペプチドについては、１番目のセリ
ン、４番目のスレオニン、３４番目のセリンおよび１７
２番目のセリンから選ばれる１以上のアミノ酸が予めリ
ン酸化されており、３０番目のスレオニンおよび／また
は１６４番目のセリンがリン酸化される。さらに、配列
表の配列番号１２に記載のアミノ酸配列を含有してなる
ペプチドについては、１番目のセリン、４番目のスレオ
ニンおよび３４番目のセリンから選ばれる１以上のアミ
ノ酸が予めリン酸化されており、３０番目のスレオニン
および／または１６４番目のセリンがリン酸化される。
列を含有してなるペプチドについては、１番目のセリ
ン、４番目のスレオニン、３４番目のセリンおよび１７
２番目のセリンから選ばれる１以上のアミノ酸が予めリ
ン酸化されており、３０番目のスレオニンおよび／また
は１６４番目のセリンがリン酸化される。さらに、配列
表の配列番号１２に記載のアミノ酸配列を含有してなる
ペプチドについては、１番目のセリン、４番目のスレオ
ニンおよび３４番目のセリンから選ばれる１以上のアミ
ノ酸が予めリン酸化されており、３０番目のスレオニン
および／または１６４番目のセリンがリン酸化される。
【００２２】配列表の配列番号１３に記載のアミノ酸配
列を含有してなるペプチドについては、１番目のセリ
ン、４番目のスレオニンおよび３４番目のセリンから選
ばれる１以上のアミノ酸が予めリン酸化されており、３
０番目のスレオニンがリン酸化される。配列表の配列番
号１４に記載のアミノ酸配列を含有してなるペプチドに
ついては、１番目のセリンおよび／または４番目のスレ
オニンが予めリン酸化されており、３０番目のスレオニ
ンがリン酸化される。
列を含有してなるペプチドについては、１番目のセリ
ン、４番目のスレオニンおよび３４番目のセリンから選
ばれる１以上のアミノ酸が予めリン酸化されており、３
０番目のスレオニンがリン酸化される。配列表の配列番
号１４に記載のアミノ酸配列を含有してなるペプチドに
ついては、１番目のセリンおよび／または４番目のスレ
オニンが予めリン酸化されており、３０番目のスレオニ
ンがリン酸化される。
【００２３】配列表の配列番号１５に記載のアミノ酸配
列を含有してなるペプチドについては、１番目のスレオ
ニン、３１番目のセリンおよび１６９番目のセリンから
選ばれる１以上のアミノ酸が予めリン酸化されており、
２７番目のスレオニン、１６１番目のセリンおよび１７
８番目のセリンから選ばれる１以上のアミノ酸がリン酸
化される。
列を含有してなるペプチドについては、１番目のスレオ
ニン、３１番目のセリンおよび１６９番目のセリンから
選ばれる１以上のアミノ酸が予めリン酸化されており、
２７番目のスレオニン、１６１番目のセリンおよび１７
８番目のセリンから選ばれる１以上のアミノ酸がリン酸
化される。
【００２４】配列表の配列番号１６に記載のアミノ酸配
列を含有してなるペプチドについては、１番目のスレオ
ニン、３１番目のセリンおよび１６９番目のセリンから
選ばれる１以上のアミノ酸が予めリン酸化されており、
２７番目のスレオニンおよび／または１６１番目のセリ
ンがリン酸化される。また、配列表の配列番号１７に記
載のアミノ酸配列を含有してなるペプチドについては、
１番目のスレオニンおよび／または３１番目のセリンが
予めリン酸化されており、２７番目のスレオニンおよび
／または１６１番目のセリンがリン酸化される。
列を含有してなるペプチドについては、１番目のスレオ
ニン、３１番目のセリンおよび１６９番目のセリンから
選ばれる１以上のアミノ酸が予めリン酸化されており、
２７番目のスレオニンおよび／または１６１番目のセリ
ンがリン酸化される。また、配列表の配列番号１７に記
載のアミノ酸配列を含有してなるペプチドについては、
１番目のスレオニンおよび／または３１番目のセリンが
予めリン酸化されており、２７番目のスレオニンおよび
／または１６１番目のセリンがリン酸化される。
【００２５】配列表の配列番号１８に記載のアミノ酸配
列を含有してなるペプチドについては、１番目のスレオ
ニンおよび／または３１番目のセリンが予めリン酸化さ
れており、２７番目のスレオニンがリン酸化される。ま
た、配列表の配列番号１９に記載のアミノ酸配列を含有
してなるペプチドについては、１番目のスレオニンが予
めリン酸化されており、２７番目のスレオニンがリン酸
化される。
列を含有してなるペプチドについては、１番目のスレオ
ニンおよび／または３１番目のセリンが予めリン酸化さ
れており、２７番目のスレオニンがリン酸化される。ま
た、配列表の配列番号１９に記載のアミノ酸配列を含有
してなるペプチドについては、１番目のスレオニンが予
めリン酸化されており、２７番目のスレオニンがリン酸
化される。
【００２６】配列表の配列番号２０に記載のアミノ酸配
列を含有してなるペプチドについては、５番目のセリン
および／または１４３番目のセリンが予めリン酸化され
ており、１番目のスレオニン、１３５番目のセリンおよ
び１５２番目のセリンから選ばれる１以上のアミノ酸が
リン酸化される。また、配列表の配列番号２１に記載の
アミノ酸配列を含有してなるペプチドについては、５番
目のセリンおよび／または１４３番目のセリンが予めリ
ン酸化されており、１番目のスレオニンおよび／または
１３５番目のセリンがリン酸化される。
列を含有してなるペプチドについては、５番目のセリン
および／または１４３番目のセリンが予めリン酸化され
ており、１番目のスレオニン、１３５番目のセリンおよ
び１５２番目のセリンから選ばれる１以上のアミノ酸が
リン酸化される。また、配列表の配列番号２１に記載の
アミノ酸配列を含有してなるペプチドについては、５番
目のセリンおよび／または１４３番目のセリンが予めリ
ン酸化されており、１番目のスレオニンおよび／または
１３５番目のセリンがリン酸化される。
【００２７】配列表の配列番号２２に記載のアミノ酸配
列を含有してなるペプチドについては、５番目のセリン
が予めリン酸化されており、１番目のスレオニンおよび
／または１３５番目のセリンがリン酸化される。また、
配列表の配列番号２３に記載のアミノ酸配列を含有して
なるペプチドについては、５番目のセリンが予めリン酸
化されており、１番目のスレオニンがリン酸化される。
列を含有してなるペプチドについては、５番目のセリン
が予めリン酸化されており、１番目のスレオニンおよび
／または１３５番目のセリンがリン酸化される。また、
配列表の配列番号２３に記載のアミノ酸配列を含有して
なるペプチドについては、５番目のセリンが予めリン酸
化されており、１番目のスレオニンがリン酸化される。
【００２８】配列表の配列番号２４に記載のアミノ酸配
列を含有してなるペプチドについては、１番目のセリン
および／または１３９番目のセリンが予めリン酸化され
ており、１３１番目のセリンおよび／または１４８番目
のセリンがリン酸化される。また、配列表の配列番号２
５に記載のアミノ酸配列を含有してなるペプチドについ
ては、１番目のセリンおよび／または１３９番目のセリ
ンが予めリン酸化されており、１３１番目のセリンがリ
ン酸化される。
列を含有してなるペプチドについては、１番目のセリン
および／または１３９番目のセリンが予めリン酸化され
ており、１３１番目のセリンおよび／または１４８番目
のセリンがリン酸化される。また、配列表の配列番号２
５に記載のアミノ酸配列を含有してなるペプチドについ
ては、１番目のセリンおよび／または１３９番目のセリ
ンが予めリン酸化されており、１３１番目のセリンがリ
ン酸化される。
【００２９】配列表の配列番号２６に記載のアミノ酸配
列を含有してなるペプチドについては、１番目のセリン
が予めリン酸化されており、１３１番目のセリンがリン
酸化される。さらに、配列表の配列番号２７に記載のア
ミノ酸配列を含有してなるペプチドについては、９番目
のセリンが予めリン酸化されており、１番目のセリンお
よび／または１８番目のセリンがリン酸化される。
列を含有してなるペプチドについては、１番目のセリン
が予めリン酸化されており、１３１番目のセリンがリン
酸化される。さらに、配列表の配列番号２７に記載のア
ミノ酸配列を含有してなるペプチドについては、９番目
のセリンが予めリン酸化されており、１番目のセリンお
よび／または１８番目のセリンがリン酸化される。
【００３０】配列表の配列番号２８に記載のアミノ酸配
列を含有してなるペプチドについては、９番目のセリン
が予めリン酸化されており、１番目のセリンがリン酸化
される。また、配列表の配列番号２９に記載のアミノ酸
配列を含有してなるペプチドについては、１番目のセリ
ンが予めリン酸化されており、１０番目のセリンがリン
酸化される。さらに本発明においては、前記のようにタ
ウプロテインキナーゼＩＩでリン酸化された蛋白質また
はそのペプチドもタウプロテインキナーゼＩの基質とし
て使用し得る。
列を含有してなるペプチドについては、９番目のセリン
が予めリン酸化されており、１番目のセリンがリン酸化
される。また、配列表の配列番号２９に記載のアミノ酸
配列を含有してなるペプチドについては、１番目のセリ
ンが予めリン酸化されており、１０番目のセリンがリン
酸化される。さらに本発明においては、前記のようにタ
ウプロテインキナーゼＩＩでリン酸化された蛋白質また
はそのペプチドもタウプロテインキナーゼＩの基質とし
て使用し得る。
【００３１】具体的なタウ蛋白質の調製法としては、例
えばＪｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃ
ｈｅｍｉｓｔｒｙ，２６１，６０８４−６０８９（１９
８６）に記載の方法に従い、脳の微小管蛋白質に次の組
成の液を３倍容添加する。
えばＪｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃ
ｈｅｍｉｓｔｒｙ，２６１，６０８４−６０８９（１９
８６）に記載の方法に従い、脳の微小管蛋白質に次の組
成の液を３倍容添加する。
【表１】
１００ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ２．７） ０．７５Ｍ ＮａＣｌ
０．５ｍＭ ＭｇＣｌ2 ２ｍＭ ＤＴＴ
１ｍＭ ＥＧＴＡ ０．１ｍＭ ＰＭＳＦ
０．１ｍＭ ＥＤＴＡ
かかる液を９５℃で５分間加熱し、次いで０℃で１５分
間冷却した後、１００００Ｇで２０分間遠心分離して上
清を得る。この上清をアミコンＰＭ−１０膜等の限外濾
過装置で濃縮し、蛋白質濃度を約７mg/mlにしてＲＢに
透析する。この画分にはほぼ１００％の純度でタウ蛋白
質が含まれる。
間冷却した後、１００００Ｇで２０分間遠心分離して上
清を得る。この上清をアミコンＰＭ−１０膜等の限外濾
過装置で濃縮し、蛋白質濃度を約７mg/mlにしてＲＢに
透析する。この画分にはほぼ１００％の純度でタウ蛋白
質が含まれる。
【００３２】またタウ蛋白質の部分ペプチドは、メリフ
ィールドらの固相合成法（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏ
ｃ．，８５，２１４９−２１５４（１９６４））によ
り、Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ モデル９５００等のペプチド
合成機等を用いて合成することができる。タウ蛋白質を
脱リン酸化する方法としては、例えばｐＨ８．０の１Ｍ
トリス塩酸緩衝液中で、ウシ小腸アルカリフォスファタ
ーゼ（シグマ社 ｔｙｐｅＶＩＩ−ＮＴ）を添加して、
３７℃で５〜８時間程度反応させ、タウ蛋白質を脱リン
酸化することができる。アルカリフォスファターゼは、
反応終了後に１０分間程度の加熱処理して失活させれば
よい。
ィールドらの固相合成法（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏ
ｃ．，８５，２１４９−２１５４（１９６４））によ
り、Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ モデル９５００等のペプチド
合成機等を用いて合成することができる。タウ蛋白質を
脱リン酸化する方法としては、例えばｐＨ８．０の１Ｍ
トリス塩酸緩衝液中で、ウシ小腸アルカリフォスファタ
ーゼ（シグマ社 ｔｙｐｅＶＩＩ−ＮＴ）を添加して、
３７℃で５〜８時間程度反応させ、タウ蛋白質を脱リン
酸化することができる。アルカリフォスファターゼは、
反応終了後に１０分間程度の加熱処理して失活させれば
よい。
【００３３】次に、本発明のリン酸化反応について説明
する。本発明に使用する酵素（タウプロテインキナーゼ
Ｉ）は、至適ｐＨが６．４、至適温度が３７℃で、活性
化剤として既知のセカンドメッセンジャーは要求せず、
チューブリンによって活性化され、リン酸供与体として
ヌクレオシド三リン酸を要求する。また、高濃度の塩化
ナトリウムによって反応が阻害され、５０％阻害に相当
する塩化ナトリウム濃度は約１００ｍＭである。従っ
て、本発明におけるリン酸化の反応条件は、上記の性質
を考慮して定められた条件であれば特に制限はされず、
より好ましくは１００ｍＭの２−（Ｎ−モルフォリン）
エタンスルホン酸ナトリウム、０．９ｍＭ酢酸マグネシ
ウム、０．４ｍＭＡＴＰを含むｐＨ６．４の緩衝液に適
量の酵素と基質を添加して、３７℃でインキュベートす
る。かかる緩衝液の種類、ｐＨ、温度等の条件は、任意
に変更することが可能であり、例えばリン酸供与体とし
てＡＴＰの代わりにグアノシン三リン酸を用いても構わ
ない。即ち、ｐＨ３〜１０、温度０〜７０℃の範囲で、
ヌクレオシド三リン酸の存在下において前述した基質の
酵素を作用させることにより、本発明のリン酸化反応が
進行する。
する。本発明に使用する酵素（タウプロテインキナーゼ
Ｉ）は、至適ｐＨが６．４、至適温度が３７℃で、活性
化剤として既知のセカンドメッセンジャーは要求せず、
チューブリンによって活性化され、リン酸供与体として
ヌクレオシド三リン酸を要求する。また、高濃度の塩化
ナトリウムによって反応が阻害され、５０％阻害に相当
する塩化ナトリウム濃度は約１００ｍＭである。従っ
て、本発明におけるリン酸化の反応条件は、上記の性質
を考慮して定められた条件であれば特に制限はされず、
より好ましくは１００ｍＭの２−（Ｎ−モルフォリン）
エタンスルホン酸ナトリウム、０．９ｍＭ酢酸マグネシ
ウム、０．４ｍＭＡＴＰを含むｐＨ６．４の緩衝液に適
量の酵素と基質を添加して、３７℃でインキュベートす
る。かかる緩衝液の種類、ｐＨ、温度等の条件は、任意
に変更することが可能であり、例えばリン酸供与体とし
てＡＴＰの代わりにグアノシン三リン酸を用いても構わ
ない。即ち、ｐＨ３〜１０、温度０〜７０℃の範囲で、
ヌクレオシド三リン酸の存在下において前述した基質の
酵素を作用させることにより、本発明のリン酸化反応が
進行する。
【００３４】かかるリン酸化反応は、
（１）蛋白質を基質とする場合
（ａ）リン酸化された量の定量
リン酸化反応時に〔γ−32Ｐ〕ＡＴＰを０．５〜５μＣ
ｉ／mlを加えて、リン酸化された蛋白質を32Ｐで標識す
る。この反応液を２cm×２cmの正方形の濾紙に吸着さ
せ、５％ＴＣＡ−０．２５％Ｎａ2 ＷＯ4 −０．５％ピ
ロリン酸ナトリウム（ｐＨ２）に浸すことにより反応を
停止し、この液で充分洗浄して残存する〔γ−32Ｐ〕Ａ
ＴＰを除去し、濾紙に残る放射能をシンチレーションカ
ウンターで計測する。これによって蛋白質に取り込まれ
たリン酸基の量が定量できる。 （ｂ）リン酸化部位の決定 反応液をＬａｅｍｍｌｉの系で電気泳動し（Ｎａｔｕｒ
ｅ，２２７，６８０−６８５（１９７０））、ニトロセ
ルロース膜に蛋白質を転写し、特定のリン酸化ペプチド
に特異的に反応する抗体を用い、免疫ブロット法で染色
の有無を調べる。
ｉ／mlを加えて、リン酸化された蛋白質を32Ｐで標識す
る。この反応液を２cm×２cmの正方形の濾紙に吸着さ
せ、５％ＴＣＡ−０．２５％Ｎａ2 ＷＯ4 −０．５％ピ
ロリン酸ナトリウム（ｐＨ２）に浸すことにより反応を
停止し、この液で充分洗浄して残存する〔γ−32Ｐ〕Ａ
ＴＰを除去し、濾紙に残る放射能をシンチレーションカ
ウンターで計測する。これによって蛋白質に取り込まれ
たリン酸基の量が定量できる。 （ｂ）リン酸化部位の決定 反応液をＬａｅｍｍｌｉの系で電気泳動し（Ｎａｔｕｒ
ｅ，２２７，６８０−６８５（１９７０））、ニトロセ
ルロース膜に蛋白質を転写し、特定のリン酸化ペプチド
に特異的に反応する抗体を用い、免疫ブロット法で染色
の有無を調べる。
【００３５】（２）ペプチドを基質とする場合
（ａ）リン酸化された量の定量
リン酸化反応時に〔γ−32Ｐ〕ＡＴＰを０．５〜５μＣ
ｉ／mlを加えて、リン酸化されたペプチドを32Ｐで標識
する。この反応液にＴＣＡを添加して高分子量の蛋白質
を沈澱させた後、上清中のリン酸化ペプチドを円形の正
方形のフォスフォセルロースペーパーに吸着させ、リン
酸緩衝液で洗浄して残存する〔γ−32Ｐ〕ＡＴＰを除去
してから、濾紙に残った放射能をシンチレーションカウ
ンターで計測する。これにより、ペプチドに取り込まれ
たリン酸基の量が定量できる。
ｉ／mlを加えて、リン酸化されたペプチドを32Ｐで標識
する。この反応液にＴＣＡを添加して高分子量の蛋白質
を沈澱させた後、上清中のリン酸化ペプチドを円形の正
方形のフォスフォセルロースペーパーに吸着させ、リン
酸緩衝液で洗浄して残存する〔γ−32Ｐ〕ＡＴＰを除去
してから、濾紙に残った放射能をシンチレーションカウ
ンターで計測する。これにより、ペプチドに取り込まれ
たリン酸基の量が定量できる。
【００３６】（ｂ）リン酸化部位の決定反応液にＰＣＡ
を添加して高分子量の蛋白質を沈澱させた後、上清液を
逆相高速液体クロマトグラフィーにかける。その保持時
間が予め調整した標準リン酸化ペプチドの保持時間と一
致するか否かで、リン酸化部位の標準品との異同を判断
することができる。またピーク画分を分取し、Ｎｅｕｒ
ｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｌｅｔｔｅｒｓ，１２８，１９５−
１９８（１９９１）に石黒らが報告した方法に従って蛋
白化学的分析を行うことにより、リン酸化部位を決定す
ることができる。
を添加して高分子量の蛋白質を沈澱させた後、上清液を
逆相高速液体クロマトグラフィーにかける。その保持時
間が予め調整した標準リン酸化ペプチドの保持時間と一
致するか否かで、リン酸化部位の標準品との異同を判断
することができる。またピーク画分を分取し、Ｎｅｕｒ
ｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｌｅｔｔｅｒｓ，１２８，１９５−
１９８（１９９１）に石黒らが報告した方法に従って蛋
白化学的分析を行うことにより、リン酸化部位を決定す
ることができる。
【００３７】具体的には、ＲＢ緩衝液（下記参照）中
に、基質となるタウ蛋白質またはその部分ペプチドを２
００〜６００μｇ／ml、ＡＴＰ ０．１〜１ｍＭおよび
タウプロテインキナーゼを含有する組成物を、通常は３
７℃で１〜１６時間インキュベートし、ＴＣＡ処理ある
いは加熱処理によって反応を停止させる。その後上記の
方法により、リン酸化反応を確認する。なお、リン酸化
の量を定量する際には、〔γ−32Ｐ〕ＡＴＰを０．５〜
５μＣｉ／ml添加して反応を行うことが好ましい。 ま
た、本発明に用いられる基質（タウ蛋白質）をタウプロ
テインキナーゼＩＩ等で予め部分的にリン酸化するに
は、石黒らのＪ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０４，３１９
（１９８８）に記載の方法に準じて行うことができる。
に、基質となるタウ蛋白質またはその部分ペプチドを２
００〜６００μｇ／ml、ＡＴＰ ０．１〜１ｍＭおよび
タウプロテインキナーゼを含有する組成物を、通常は３
７℃で１〜１６時間インキュベートし、ＴＣＡ処理ある
いは加熱処理によって反応を停止させる。その後上記の
方法により、リン酸化反応を確認する。なお、リン酸化
の量を定量する際には、〔γ−32Ｐ〕ＡＴＰを０．５〜
５μＣｉ／ml添加して反応を行うことが好ましい。 ま
た、本発明に用いられる基質（タウ蛋白質）をタウプロ
テインキナーゼＩＩ等で予め部分的にリン酸化するに
は、石黒らのＪ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０４，３１９
（１９８８）に記載の方法に準じて行うことができる。
【００３８】なお、本発明の記載において、記号ＲＢ、
ＲＢＧ、ＭＥＳ、ＥＧＴＡ、ＥＤＴＡ、ＰＭＳＦ、ＰＴ
Ｈ−アミノ酸、ＡＴＰ、ＰＣ、ＳＢ、ＤＴＴ、Ｔｗｅｅ
ｎ２０、ＴＣＡ、ＫＬＨはそれぞれ以下の略号である。 ＲＢ：１００ｍＭ ＭＥＳ、０．５ｍＭ 酢酸マグネシ
ウムおよび１ｍＭＥＧＴＡからなる緩衝液（ｐＨ６．
５） ＲＢＧ：ＲＢに１ｍＭ ＧＴＰを添加した緩衝液 ＭＥＳ：２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸 ＥＧＴＡ：エチレングリコール−ビス（β−アミノエチ
ルエーテル）Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラ酢酸 ＥＤＴＡ：エチレンジアミンテトラ酢酸 ＰＭＳＦ：フェニルメチルスルホニルフルオリド ＰＴＨ−アミノ酸：フェニルチオヒダントインアミノ酸 ＡＴＰ：アデノシントリリン酸 ＰＣ：２０ｍＭ ＭＥＳ、０．５ｍＭ 酢酸マグネシウ
ムおよび１ｍＭ ＥＧＴＡからなる緩衝液（ｐＨ６．
８） ＳＢ：２０ｍＭ Ｎ−［２−ハイドロキシエチル］ピペ
ラジン−Ｎ’−［２−エタンスルホン酸］、０．５ｍＭ
酢酸マグネシウムおよび１ｍＭ ＥＧＴＡからなる緩
衝液（ｐＨ８．２） ＤＴＴ：ジチオスレイトール Ｔｗｅｅｎ２０：ポリオキシエチレンソルビタンモノラ
ウレート ＴＣＡ：トリクロロ酢酸 ＫＬＨ：キーホール・リンペットのヘモシアニン
ＲＢＧ、ＭＥＳ、ＥＧＴＡ、ＥＤＴＡ、ＰＭＳＦ、ＰＴ
Ｈ−アミノ酸、ＡＴＰ、ＰＣ、ＳＢ、ＤＴＴ、Ｔｗｅｅ
ｎ２０、ＴＣＡ、ＫＬＨはそれぞれ以下の略号である。 ＲＢ：１００ｍＭ ＭＥＳ、０．５ｍＭ 酢酸マグネシ
ウムおよび１ｍＭＥＧＴＡからなる緩衝液（ｐＨ６．
５） ＲＢＧ：ＲＢに１ｍＭ ＧＴＰを添加した緩衝液 ＭＥＳ：２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸 ＥＧＴＡ：エチレングリコール−ビス（β−アミノエチ
ルエーテル）Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラ酢酸 ＥＤＴＡ：エチレンジアミンテトラ酢酸 ＰＭＳＦ：フェニルメチルスルホニルフルオリド ＰＴＨ−アミノ酸：フェニルチオヒダントインアミノ酸 ＡＴＰ：アデノシントリリン酸 ＰＣ：２０ｍＭ ＭＥＳ、０．５ｍＭ 酢酸マグネシウ
ムおよび１ｍＭ ＥＧＴＡからなる緩衝液（ｐＨ６．
８） ＳＢ：２０ｍＭ Ｎ−［２−ハイドロキシエチル］ピペ
ラジン−Ｎ’−［２−エタンスルホン酸］、０．５ｍＭ
酢酸マグネシウムおよび１ｍＭ ＥＧＴＡからなる緩
衝液（ｐＨ８．２） ＤＴＴ：ジチオスレイトール Ｔｗｅｅｎ２０：ポリオキシエチレンソルビタンモノラ
ウレート ＴＣＡ：トリクロロ酢酸 ＫＬＨ：キーホール・リンペットのヘモシアニン
【００３９】
【実施例】以下、本発明につき参考例および実施例を挙
げて説明するが、その要旨を越えない限り以下に限定さ
れるものではない。 参考例１ タウプロテインキナーゼの調製 （１）微小管蛋白質の調製 成牛１５頭を断頭して直ちに脳を取り出し、血餅を素早
く除去し、脳１ｇに１mlの０．５ｍＭ ＭｇＣｌ2 、１
ｍＭ ＥＧＴＡ−ＮａＯＨ（ｐＨ７）を加え、ゆっくり
攪拌して液を捨て、血を洗い去った。
げて説明するが、その要旨を越えない限り以下に限定さ
れるものではない。 参考例１ タウプロテインキナーゼの調製 （１）微小管蛋白質の調製 成牛１５頭を断頭して直ちに脳を取り出し、血餅を素早
く除去し、脳１ｇに１mlの０．５ｍＭ ＭｇＣｌ2 、１
ｍＭ ＥＧＴＡ−ＮａＯＨ（ｐＨ７）を加え、ゆっくり
攪拌して液を捨て、血を洗い去った。
【００４０】次いで、脳１ｇに１mlのＲＢを加えてワー
リングブレンダー（１８０００ｒｐｍ）で５秒間、３回
ホモジナイズした後、３００００Ｇで１時間遠心分離し
て、上清を採取した。この上清（脳抽出液）に１／３容
のグリセロールとＧＴＰを加えて溶液中のＧＴＰ濃度を
合計で１ｍＭとして、３７℃に加温し３０分間保持し、
同温度において１０００００Ｇで３０分間遠心分離して
沈澱物を採取した。
リングブレンダー（１８０００ｒｐｍ）で５秒間、３回
ホモジナイズした後、３００００Ｇで１時間遠心分離し
て、上清を採取した。この上清（脳抽出液）に１／３容
のグリセロールとＧＴＰを加えて溶液中のＧＴＰ濃度を
合計で１ｍＭとして、３７℃に加温し３０分間保持し、
同温度において１０００００Ｇで３０分間遠心分離して
沈澱物を採取した。
【００４１】この沈澱物を、前記脳抽出液の１／５容の
ＲＢ中に懸濁させて０℃３０分間保持した後、４℃にお
いて１０００００Ｇで３０分間遠心分離し、得られた上
清に、１／４容の５０％グリセロールを含むＲＢを添加
し、更に１２．５ｍＭ フォスフォエノールピルビン
酸、１２．５μｇ／ml ピルビン酸キナーゼおよび２５
０μＭ ＧＴＰを１／２５容加えて３７℃で３０分間加
温した。次いで、この液を２５％グリセロールを含むＲ
Ｂ上に重層し、３０℃において、１０００００Ｇで３０
分間スウィングローターで遠心分離して沈澱物を採取し
た。沈澱物を脳抽出液の１／２５容のＲＢＧ中に懸濁さ
せて０℃で３０分間保持した後、１０００００Ｇで３０
分間遠心分離して微小管蛋白質を上清として得た。
ＲＢ中に懸濁させて０℃３０分間保持した後、４℃にお
いて１０００００Ｇで３０分間遠心分離し、得られた上
清に、１／４容の５０％グリセロールを含むＲＢを添加
し、更に１２．５ｍＭ フォスフォエノールピルビン
酸、１２．５μｇ／ml ピルビン酸キナーゼおよび２５
０μＭ ＧＴＰを１／２５容加えて３７℃で３０分間加
温した。次いで、この液を２５％グリセロールを含むＲ
Ｂ上に重層し、３０℃において、１０００００Ｇで３０
分間スウィングローターで遠心分離して沈澱物を採取し
た。沈澱物を脳抽出液の１／２５容のＲＢＧ中に懸濁さ
せて０℃で３０分間保持した後、１０００００Ｇで３０
分間遠心分離して微小管蛋白質を上清として得た。
【００４２】以下の操作は、０．０２％ Ｔｗｅｅｎ２
０、１０％グリセロールの存在下で行った。 （２）硫安分画 上記（１）で得た微小管蛋白質をＲＢで希釈して蛋白質
濃度を１０mg／mlとし、硫安の粉末を加えて３５％飽和
硫安液とし３０分間放置した後、２００００Ｇで２０分
間遠心分離して上清を採取した。この上清に再び硫安の
粉末を加えて５０％飽和硫安液として３０分間放置した
後、２００００Ｇで２０分間遠心分離して得られた沈澱
物をＲＢに溶解し、ＲＢに透析して硫安画分を得た。 （３）フォスフォセルロースカラムクロマトグラフィー 上記（２）で得た硫安画分に、５０％グリセロールを含
むＲＢを１／４容加えた。これを硫安画分の蛋白質３０
mg当たり１mlのＰ１１セルロース（ワットマン社製）を
含み、予めＰＣで平衡化した、Ｐ１１セルロースのカラ
ムにチャージし、カラムの５倍容の０．１Ｍ ＮａＣｌ
−ＰＣでカラムを洗い、引き続いて０．１から０．８Ｍ
ＮａＣｌ−ＰＣの直線濃度勾配の展開液をカラムに流
し、０．２から０．４Ｍ ＮａＣｌで溶出するＰＣ画分
を採取した。 （４）ゲル濾過 上記（３）で得たＰＣ画分を、アミコンＰＭ−１０膜の
限外濾過装置で蛋白質濃度５mg／ml以上に濃縮し、これ
を予め０．３Ｍ ＮａＣｌ−ＲＢ緩衝液で平衡化したＧ
３０００ＳＷカラム（東ソー社製；シリカゲルカラム、
２１mm×６０cm）にチャージし、２ml／分の流速で流通
させてゲル濾過を行った。タウプロテインキナーゼ画分
（分子量５万の画分）を採取し、アミコンＰＭ−１０膜
の限外濾過装置で濃縮した。 （５）ハイドロキシアパタイトカラムクロマトグラフィ
ー 上記（４）で得た画分を、予め１２ｍＭ リン酸ナトリ
ウム緩衝液（ｐＨ６．８）で平衡化したハイドロキシア
パタイトカラム（東燃社製；７．５mm×１００mm）にチ
ャージし、１２から４００ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝
液の直線濃度勾配１０mlで展開し、１５０ｍＭの濃度で
溶出するＨＡ画分を採取した。 （６）Ｓ−セファロースカラムクロマトグラフィー 上記（５）の画分をＰＣで透析し、予めＰＣで平衡化し
たＳ−セファロースカラム（ファルマシア社製；５mm×
２０mm）にチャージし、ＰＣとＳＢの直線勾配７．５m
l、続いてＳＢ中で０から２００ｍＭ ＮａＣｌの直線
濃度勾配５mlで展開し、１５０ｍＭの濃度で溶出するＳ
１画分および５０ｍＭの濃度で溶出するＳ２画分を採取
した。Ｓ２画分はＲＢで透析して、タウプロテインキナ
ーゼＩＩ画分とした。 （７）ヘパリンカラムクロマトグラフィー 上記Ｓ１の画分を２０ｍＭ リン酸ナトリウム緩衝液
（ｐＨ７．６）で平衡化したＴＳＫゲル ＡＦ−ヘパリ
ンカラム（東ソー社製；４mm×８mm）にチャージし、２
０ｍＭ リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．６）中で、
０から２００ｍＭＮａＣｌの直線濃度勾配４mlで展開
し、８０ｍＭ ＮａＣｌで溶出するヘパリン画分を採取
した。この画分をＲＢに透析して、タウプロテインキナ
ーゼＩ画分とした。
０、１０％グリセロールの存在下で行った。 （２）硫安分画 上記（１）で得た微小管蛋白質をＲＢで希釈して蛋白質
濃度を１０mg／mlとし、硫安の粉末を加えて３５％飽和
硫安液とし３０分間放置した後、２００００Ｇで２０分
間遠心分離して上清を採取した。この上清に再び硫安の
粉末を加えて５０％飽和硫安液として３０分間放置した
後、２００００Ｇで２０分間遠心分離して得られた沈澱
物をＲＢに溶解し、ＲＢに透析して硫安画分を得た。 （３）フォスフォセルロースカラムクロマトグラフィー 上記（２）で得た硫安画分に、５０％グリセロールを含
むＲＢを１／４容加えた。これを硫安画分の蛋白質３０
mg当たり１mlのＰ１１セルロース（ワットマン社製）を
含み、予めＰＣで平衡化した、Ｐ１１セルロースのカラ
ムにチャージし、カラムの５倍容の０．１Ｍ ＮａＣｌ
−ＰＣでカラムを洗い、引き続いて０．１から０．８Ｍ
ＮａＣｌ−ＰＣの直線濃度勾配の展開液をカラムに流
し、０．２から０．４Ｍ ＮａＣｌで溶出するＰＣ画分
を採取した。 （４）ゲル濾過 上記（３）で得たＰＣ画分を、アミコンＰＭ−１０膜の
限外濾過装置で蛋白質濃度５mg／ml以上に濃縮し、これ
を予め０．３Ｍ ＮａＣｌ−ＲＢ緩衝液で平衡化したＧ
３０００ＳＷカラム（東ソー社製；シリカゲルカラム、
２１mm×６０cm）にチャージし、２ml／分の流速で流通
させてゲル濾過を行った。タウプロテインキナーゼ画分
（分子量５万の画分）を採取し、アミコンＰＭ−１０膜
の限外濾過装置で濃縮した。 （５）ハイドロキシアパタイトカラムクロマトグラフィ
ー 上記（４）で得た画分を、予め１２ｍＭ リン酸ナトリ
ウム緩衝液（ｐＨ６．８）で平衡化したハイドロキシア
パタイトカラム（東燃社製；７．５mm×１００mm）にチ
ャージし、１２から４００ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝
液の直線濃度勾配１０mlで展開し、１５０ｍＭの濃度で
溶出するＨＡ画分を採取した。 （６）Ｓ−セファロースカラムクロマトグラフィー 上記（５）の画分をＰＣで透析し、予めＰＣで平衡化し
たＳ−セファロースカラム（ファルマシア社製；５mm×
２０mm）にチャージし、ＰＣとＳＢの直線勾配７．５m
l、続いてＳＢ中で０から２００ｍＭ ＮａＣｌの直線
濃度勾配５mlで展開し、１５０ｍＭの濃度で溶出するＳ
１画分および５０ｍＭの濃度で溶出するＳ２画分を採取
した。Ｓ２画分はＲＢで透析して、タウプロテインキナ
ーゼＩＩ画分とした。 （７）ヘパリンカラムクロマトグラフィー 上記Ｓ１の画分を２０ｍＭ リン酸ナトリウム緩衝液
（ｐＨ７．６）で平衡化したＴＳＫゲル ＡＦ−ヘパリ
ンカラム（東ソー社製；４mm×８mm）にチャージし、２
０ｍＭ リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．６）中で、
０から２００ｍＭＮａＣｌの直線濃度勾配４mlで展開
し、８０ｍＭ ＮａＣｌで溶出するヘパリン画分を採取
した。この画分をＲＢに透析して、タウプロテインキナ
ーゼＩ画分とした。
【００４３】かくして得られたタウプロテインキナーゼ
Ｉは、以下の理化学的性質を有するものであった。 （ａ）作用：ＡＴＰをリン酸供与体として、タウ蛋白質
中のセリンおよびスレオニンをリン酸化し、タウ蛋白質
１分子あたり４残基のリン酸基を導入する。 （ｂ）基質特異性：脳抽出液の蛋白質の中で、微小管付
随蛋白質であるタウ蛋白質およびＭＡＰ２を特異的にリ
ン酸化する。ヒストンをリン酸化しない。α−カゼイン
を少しリン酸化する。
Ｉは、以下の理化学的性質を有するものであった。 （ａ）作用：ＡＴＰをリン酸供与体として、タウ蛋白質
中のセリンおよびスレオニンをリン酸化し、タウ蛋白質
１分子あたり４残基のリン酸基を導入する。 （ｂ）基質特異性：脳抽出液の蛋白質の中で、微小管付
随蛋白質であるタウ蛋白質およびＭＡＰ２を特異的にリ
ン酸化する。ヒストンをリン酸化しない。α−カゼイン
を少しリン酸化する。
【００４４】（ｃ）至適ｐＨ：チューブリン非存在下で
の至適ｐＨは６．５であり、チューブリン存在下での至
適ｐＨは６．０である。 （ｄ）作用適温：３７℃ （ｅ）分子量：０．５Ｍ塩化ナトリウムの存在下でのゲ
ル濾過により求めた測定値は約５万であり、塩化ナトリ
ウム非存在下ではタウ蛋白質と複合体を作り、そのゲル
濾過による測定値は約１０万である。ＳＤＳ−ポリアク
リルアミドゲル電気泳動により求めた測定値は約４万５
千である。
の至適ｐＨは６．５であり、チューブリン存在下での至
適ｐＨは６．０である。 （ｄ）作用適温：３７℃ （ｅ）分子量：０．５Ｍ塩化ナトリウムの存在下でのゲ
ル濾過により求めた測定値は約５万であり、塩化ナトリ
ウム非存在下ではタウ蛋白質と複合体を作り、そのゲル
濾過による測定値は約１０万である。ＳＤＳ−ポリアク
リルアミドゲル電気泳動により求めた測定値は約４万５
千である。
【００４５】（ｆ）安定性：２５％グリセロールと０．
０２％ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート
中、ｐＨ６．５、温度−２０℃において少なくとも一年
間安定である。 （ｇ）活性化：既知のキナーゼの活性化因子であるｃＡ
ＭＰ、ｃＧＭＰ、Ｃａ2+、カルモジュリンおよびリン脂
質等では活性化されない。チューブリンの重合条件で、
タウ蛋白質のリン酸化が活性化される。
０２％ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート
中、ｐＨ６．５、温度−２０℃において少なくとも一年
間安定である。 （ｇ）活性化：既知のキナーゼの活性化因子であるｃＡ
ＭＰ、ｃＧＭＰ、Ｃａ2+、カルモジュリンおよびリン脂
質等では活性化されない。チューブリンの重合条件で、
タウ蛋白質のリン酸化が活性化される。
【００４６】（ｈ）阻害：９０ｍＭのＮａＣｌまたはＫ
Ｃｌで活性が半減する。また、タウプロテインキナーゼ
ＩＩは、以下の理化学的性質を有するものであった。 （ｉ）作用：ＡＴＰをリン酸供与体として、タウ蛋白質
中の、Ｃ末端側の隣にプロリンのあるセリンおよびスレ
オニンをリン酸化し、タウ蛋白質１分子あたり４残基の
リン酸基を導入する。
Ｃｌで活性が半減する。また、タウプロテインキナーゼ
ＩＩは、以下の理化学的性質を有するものであった。 （ｉ）作用：ＡＴＰをリン酸供与体として、タウ蛋白質
中の、Ｃ末端側の隣にプロリンのあるセリンおよびスレ
オニンをリン酸化し、タウ蛋白質１分子あたり４残基の
リン酸基を導入する。
【００４７】（ｊ）基質特異性：脳抽出液の蛋白質の中
で、微小管付随蛋白質であるタウ蛋白質およびＭＡＰ２
を特異的にリン酸化する。ヒストンＨ１とニューロフィ
ラメントＨサブユニットもリン酸化する。β−カゼイン
を少しリン酸化する。 （ｋ）至適ｐＨ：チューブリン非存在下での至適ｐＨは
６．５であり、チューブリン存在下での至適ｐＨは６．
０である。
で、微小管付随蛋白質であるタウ蛋白質およびＭＡＰ２
を特異的にリン酸化する。ヒストンＨ１とニューロフィ
ラメントＨサブユニットもリン酸化する。β−カゼイン
を少しリン酸化する。 （ｋ）至適ｐＨ：チューブリン非存在下での至適ｐＨは
６．５であり、チューブリン存在下での至適ｐＨは６．
０である。
【００４８】（ｌ）作用適温：３７℃
（ｍ）分子量：０．５Ｍ塩化ナトリウムの存在下でのゲ
ル濾過により求めた測定値は約５万であり、塩化ナトリ
ウム非存在下ではタウ蛋白質と複合体を作り、そのゲル
濾過による測定値は約１０万である。ＳＤＳ−ポリアク
リルアミドゲル電気泳動により求めた測定値は約３万で
あり、その他に２．３万の蛋白質があり、この２種の蛋
白質が結合してゲル濾過では約５万になっている。
ル濾過により求めた測定値は約５万であり、塩化ナトリ
ウム非存在下ではタウ蛋白質と複合体を作り、そのゲル
濾過による測定値は約１０万である。ＳＤＳ−ポリアク
リルアミドゲル電気泳動により求めた測定値は約３万で
あり、その他に２．３万の蛋白質があり、この２種の蛋
白質が結合してゲル濾過では約５万になっている。
【００４９】（ｎ）安定性：２５％グリセロールと０．
０２％ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート
中、ｐＨ６．５、温度−２０℃において少なくとも一年
間安定である。 （ｏ）活性化：既知のキナーゼの活性化因子であるｃＡ
ＭＰ、ｃＧＭＰ、Ｃａ2+、カルモジュリンおよびリン脂
質等では活性化されない。チューブリンの重合条件で、
タウ蛋白質のリン酸化が活性化される。
０２％ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート
中、ｐＨ６．５、温度−２０℃において少なくとも一年
間安定である。 （ｏ）活性化：既知のキナーゼの活性化因子であるｃＡ
ＭＰ、ｃＧＭＰ、Ｃａ2+、カルモジュリンおよびリン脂
質等では活性化されない。チューブリンの重合条件で、
タウ蛋白質のリン酸化が活性化される。
【００５０】（ｐ）阻害：４０ｍＭのＮａＣｌまたはＫ
Ｃｌで活性が半減する。参考例２ タウプロテインキナ
ーゼＩのクローニングウシ１５頭から精製したタウプロ
テインキナーゼＩ 約６０ｐｍｏｌｅｓをエンドプロ
テアーゼ Ｌｙｓ−Ｃ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎ
ｎｈｅｉｍ ＧｍｂＨ）で消化し、Ｃ8 のカラム（ＲＰ
−３００，Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉ
ｎｃ．）を用いて逆相高速液体クロマトグラフィーを行
った。０．１％トリフルオロ酢酸中、アセトニトリル０
％から７０％の濃度勾配溶出で以下の８個のペプチドを
分取し、一部は再度クロマトグラフィーにより精製し
て、シーケンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅ
ｍｓ Ｉｎｃ．，４７７Ａ）を用いてアミノ酸配列を決
定した。
Ｃｌで活性が半減する。参考例２ タウプロテインキナ
ーゼＩのクローニングウシ１５頭から精製したタウプロ
テインキナーゼＩ 約６０ｐｍｏｌｅｓをエンドプロ
テアーゼ Ｌｙｓ−Ｃ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎ
ｎｈｅｉｍ ＧｍｂＨ）で消化し、Ｃ8 のカラム（ＲＰ
−３００，Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉ
ｎｃ．）を用いて逆相高速液体クロマトグラフィーを行
った。０．１％トリフルオロ酢酸中、アセトニトリル０
％から７０％の濃度勾配溶出で以下の８個のペプチドを
分取し、一部は再度クロマトグラフィーにより精製し
て、シーケンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅ
ｍｓ Ｉｎｃ．，４７７Ａ）を用いてアミノ酸配列を決
定した。
【００５１】
２Ｋ０６：配列表の配列番号３０
２Ｋ１３：配列表の配列番号３１
２Ｋ１９：配列表の配列番号３２
２Ｋ２０：配列表の配列番号３３
２Ｋ３３：配列表の配列番号３４
２Ｋ３５：配列表の配列番号３５
２Ｋ３７：配列表の配列番号３６
上記８個のペプチドのうち、２Ｋ３５および２Ｋ３７の
アミノ酸配列をもとに、配列表の配列番号３７に記載の
センスプライマーおよび配列番号３８に記載のアンチセ
ンスプライマーを合成し、ウシの脳組織から調製したｃ
ＤＮＡをテンプレートとして、Ｓａｉｋｉらの開発した
ポリメラーゼ チェイン リアクション法（ＰＣＲ法：
Ｎａｔｕｒｅ，３２４，１２６（１９８６））に準じて
遺伝子増幅を行った。その結果、配列表の配列番号３９
に示す主要産物を得た。同産物において、二つのプライ
マーにはさまれた１５ヌクレオチドは、上記のペプチド
から期待される配列であった。
アミノ酸配列をもとに、配列表の配列番号３７に記載の
センスプライマーおよび配列番号３８に記載のアンチセ
ンスプライマーを合成し、ウシの脳組織から調製したｃ
ＤＮＡをテンプレートとして、Ｓａｉｋｉらの開発した
ポリメラーゼ チェイン リアクション法（ＰＣＲ法：
Ｎａｔｕｒｅ，３２４，１２６（１９８６））に準じて
遺伝子増幅を行った。その結果、配列表の配列番号３９
に示す主要産物を得た。同産物において、二つのプライ
マーにはさまれた１５ヌクレオチドは、上記のペプチド
から期待される配列であった。
【００５２】更に配列表の配列番号３９に示す配列をも
とに、新たに４１ヌクレオチドーのアンチセンスプライ
マー（配列表の配列番号４０）を合成し、５’末端を32
Ｐで標識してｃＤＮＡクローンをスクリーニングするた
めのプローブとした。ｃＤＮＡライブラリーは市販のも
の（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ社）を利用した。これはラット
大脳皮質のｍＲＮＡをランダムプライミング法で合成し
たｃＤＮＡをλｇｔ１１に挿入したものである。常法に
従い、４８℃でハイブリダイズし×１ＳＳＣ（０．３Ｍ
塩化ナトリウム および ０．０３Ｍ クエン酸ナト
リウムからなる緩衝液）、３５℃で洗浄することによ
り、約６０万のクローンから１個の陽性クローン（＃３
１）を得た。＃３１は約１．３ｋｂのインサートを持
ち、それをｐＵＣ１９にサブクローニングしてＤＮＡ配
列を求めた。この配列の同一フレーム上に上記８個のペ
プチド全てのアミノ酸配列が確認されたが、３’末端側
には終止コドンは存在しなかった。そこでこの配列の一
部をプローブとして用い、新たなクローン（＃１１）を
得た。＃１１のインサートは、クローン＃３１の配列の
途中から始まり、約１．２ｋｂの大きさであった。両者
の配列を連結し、約４２０アミノ酸残基のオープン リ
ーディング フレーム（ＯＲＦ）の存在を確認した。か
かるアミノ酸配列および塩基配列を配列表の配列番号１
に、制限酵素地図を図１に示す。
とに、新たに４１ヌクレオチドーのアンチセンスプライ
マー（配列表の配列番号４０）を合成し、５’末端を32
Ｐで標識してｃＤＮＡクローンをスクリーニングするた
めのプローブとした。ｃＤＮＡライブラリーは市販のも
の（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ社）を利用した。これはラット
大脳皮質のｍＲＮＡをランダムプライミング法で合成し
たｃＤＮＡをλｇｔ１１に挿入したものである。常法に
従い、４８℃でハイブリダイズし×１ＳＳＣ（０．３Ｍ
塩化ナトリウム および ０．０３Ｍ クエン酸ナト
リウムからなる緩衝液）、３５℃で洗浄することによ
り、約６０万のクローンから１個の陽性クローン（＃３
１）を得た。＃３１は約１．３ｋｂのインサートを持
ち、それをｐＵＣ１９にサブクローニングしてＤＮＡ配
列を求めた。この配列の同一フレーム上に上記８個のペ
プチド全てのアミノ酸配列が確認されたが、３’末端側
には終止コドンは存在しなかった。そこでこの配列の一
部をプローブとして用い、新たなクローン（＃１１）を
得た。＃１１のインサートは、クローン＃３１の配列の
途中から始まり、約１．２ｋｂの大きさであった。両者
の配列を連結し、約４２０アミノ酸残基のオープン リ
ーディング フレーム（ＯＲＦ）の存在を確認した。か
かるアミノ酸配列および塩基配列を配列表の配列番号１
に、制限酵素地図を図１に示す。
【００５３】実施例１
ウシの脳から抽出精製したタウ蛋白質をタウプロテイン
キナーゼＩＩでリン酸化した後、１Ｍ尿素、２０ｍＭメ
チルアミンおよび５０ｍＭリン酸ナトリウムを含むｐＨ
８．５の緩衝液中で、タウ蛋白質の１／２０（重量比）
のエンドプロテアーゼＬｙｓ−Ｃ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅ
ｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ ＧｍｂＨ）を添加して、３７℃
で２時間酵素消化した。生成したペプチドは、逆相高速
カラムクロマトグラフィーで分離した。このときカラム
はＣ4 カラム（Ｂａｋｅｒｂｏｎｄ，４．６mm×５cm）
を使用し、溶出液としては０．１％トリフルオロ酢酸
中、アセトニトリルとイソプロパノールの混合溶媒（混
合比３：７）を全溶媒の０％から７０％まで直線勾配で
増加させた。
キナーゼＩＩでリン酸化した後、１Ｍ尿素、２０ｍＭメ
チルアミンおよび５０ｍＭリン酸ナトリウムを含むｐＨ
８．５の緩衝液中で、タウ蛋白質の１／２０（重量比）
のエンドプロテアーゼＬｙｓ−Ｃ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅ
ｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ ＧｍｂＨ）を添加して、３７℃
で２時間酵素消化した。生成したペプチドは、逆相高速
カラムクロマトグラフィーで分離した。このときカラム
はＣ4 カラム（Ｂａｋｅｒｂｏｎｄ，４．６mm×５cm）
を使用し、溶出液としては０．１％トリフルオロ酢酸
中、アセトニトリルとイソプロパノールの混合溶媒（混
合比３：７）を全溶媒の０％から７０％まで直線勾配で
増加させた。
【００５４】次にタウ蛋白質を〔γ−32Ｐ〕ＡＴＰ共存
下でリン酸化した。32Ｐで標識されたペプチドのピーク
は３つ検出され、溶出順にｐＫ１、ｐＫ２およびｐＫ３
と名付けた（「ｐ」はリン酸化されたことを示す）。非
放射性のＡＴＰを用いても同様にタウ蛋白質をリン酸化
した。分取されたｐＫ１、ｐＫ２およびｐＫ３のそれぞ
れの画分は、気相プロテインシーケンサー（Ａｐｐｌｉ
ｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ４７７Ａ）を用いてペプ
チドのアミノ酸配列を分析した。その結果、Ｋ１は配列
表の配列番号２に記載のヒト由来の蛋白質のアミノ酸配
列で１６８番目のバリンから１８２番目のリジンに至る
ペプチド、Ｋ２は１３３番目のセリンから１６６番目の
リジンに至るペプチド、Ｋ３は３０７番目のセリンから
３４９番目のリジンに至るペプチドであり（Ｇｏｅｄｅ
ｒｔら、Ｎｅｕｒｏｎ、３、５１９−５２６（１９８
９））、ｐＫ１、ｐＫ２およびｐＫ３のそれぞれについ
てリン酸化部位も以下のように決定された。すなわち、
アミノ酸配列分析においてリン酸化セリンはＤＴＴ存在
下でＰＴＨ−デヒドロアラニンを経由してＤＴＴ付加物
を生成し、ＰＴＨ−セリンを生じないことが知られてい
る（Ｍｅｙｅｒら，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，２０４，６
１−６６（１９８６））。同様にリン酸化スレオニンで
もＤＴＴ付加物を生ずるが、ＰＴＨ−スレオニンを生成
しない。これによってｐＫ１では配列表の配列番号２に
記載のアミノ酸配列における１７７番目のセリンが、ｐ
Ｋ２では１４４番目のセリンと１４７番目のスレオニン
が、ｐＫ３では３１５番目のセリンがリン酸化されてい
ることが判明した。
下でリン酸化した。32Ｐで標識されたペプチドのピーク
は３つ検出され、溶出順にｐＫ１、ｐＫ２およびｐＫ３
と名付けた（「ｐ」はリン酸化されたことを示す）。非
放射性のＡＴＰを用いても同様にタウ蛋白質をリン酸化
した。分取されたｐＫ１、ｐＫ２およびｐＫ３のそれぞ
れの画分は、気相プロテインシーケンサー（Ａｐｐｌｉ
ｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ４７７Ａ）を用いてペプ
チドのアミノ酸配列を分析した。その結果、Ｋ１は配列
表の配列番号２に記載のヒト由来の蛋白質のアミノ酸配
列で１６８番目のバリンから１８２番目のリジンに至る
ペプチド、Ｋ２は１３３番目のセリンから１６６番目の
リジンに至るペプチド、Ｋ３は３０７番目のセリンから
３４９番目のリジンに至るペプチドであり（Ｇｏｅｄｅ
ｒｔら、Ｎｅｕｒｏｎ、３、５１９−５２６（１９８
９））、ｐＫ１、ｐＫ２およびｐＫ３のそれぞれについ
てリン酸化部位も以下のように決定された。すなわち、
アミノ酸配列分析においてリン酸化セリンはＤＴＴ存在
下でＰＴＨ−デヒドロアラニンを経由してＤＴＴ付加物
を生成し、ＰＴＨ−セリンを生じないことが知られてい
る（Ｍｅｙｅｒら，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，２０４，６
１−６６（１９８６））。同様にリン酸化スレオニンで
もＤＴＴ付加物を生ずるが、ＰＴＨ−スレオニンを生成
しない。これによってｐＫ１では配列表の配列番号２に
記載のアミノ酸配列における１７７番目のセリンが、ｐ
Ｋ２では１４４番目のセリンと１４７番目のスレオニン
が、ｐＫ３では３１５番目のセリンがリン酸化されてい
ることが判明した。
【００５５】この結果に基づいて、配列表の配列番号２
に記載のアミノ酸配列で１４０番目のセリンから１５１
番目のアルギニンに至るペプチドにおいて１４４番目の
セリンのみ、１４７番目のスレオニンのみ、および１４
４番目のセリンと１４７番目のスレオニンの両者にリン
酸基を導入した３つのペプチド（それぞれ配列表の配列
番号４１、４２および４３）と、３０６番目のリジンか
ら３１７番目のアルギニンに至るペプチドにおいて３１
５番目のセリンにリン酸基を導入したペプチド（配列表
の配列番号４４）を合成し、それぞれをＫＬＨに結合し
た後ウサギに免役し、得られた抗血清を精製して特異性
を調べることによって、１４４番目のセリンを特異的に
認識する抗ＰＳ１４４抗体、１４７番目のスレオニンを
特異的に認識する抗ＰＴ１４７抗体および３１５番目の
セリンを特異的に認識する抗ＰＳ３１５抗体を取得し
た。
に記載のアミノ酸配列で１４０番目のセリンから１５１
番目のアルギニンに至るペプチドにおいて１４４番目の
セリンのみ、１４７番目のスレオニンのみ、および１４
４番目のセリンと１４７番目のスレオニンの両者にリン
酸基を導入した３つのペプチド（それぞれ配列表の配列
番号４１、４２および４３）と、３０６番目のリジンか
ら３１７番目のアルギニンに至るペプチドにおいて３１
５番目のセリンにリン酸基を導入したペプチド（配列表
の配列番号４４）を合成し、それぞれをＫＬＨに結合し
た後ウサギに免役し、得られた抗血清を精製して特異性
を調べることによって、１４４番目のセリンを特異的に
認識する抗ＰＳ１４４抗体、１４７番目のスレオニンを
特異的に認識する抗ＰＴ１４７抗体および３１５番目の
セリンを特異的に認識する抗ＰＳ３１５抗体を取得し
た。
【００５６】一方、タウ蛋白質を脱リン酸化処理したも
の、それをさらにタウプロテインキナーゼＩＩでリン酸
化したものを未処理のものと、電気泳動およびイムノブ
ロッティング（Ｔｏｕｂｉｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７６，４３５０−４３５４
（１９７９））で比較した。その結果、電気泳動では脱
リン酸化タウ蛋白質、未処理のタウ蛋白質、タウプロテ
インキナーゼＩＩでリン酸化したタウ蛋白質の順に移動
度が小さかった。また抗ＰＳ１４４抗体、抗ＰＴ１４７
抗体および抗ＰＳ３１５抗体との反応性については、脱
リン酸化したタウ蛋白質はいずれの抗体とも反応せず、
タウプロテインキナーゼＩＩでリン酸化したタウ蛋白質
はいずれの抗体とも反応し、未処理のタウ蛋白質は抗Ｐ
Ｓ１４４抗体および抗ＰＳ３１５抗体と比較的弱いなが
らも充分に認められる反応を示した。
の、それをさらにタウプロテインキナーゼＩＩでリン酸
化したものを未処理のものと、電気泳動およびイムノブ
ロッティング（Ｔｏｕｂｉｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７６，４３５０−４３５４
（１９７９））で比較した。その結果、電気泳動では脱
リン酸化タウ蛋白質、未処理のタウ蛋白質、タウプロテ
インキナーゼＩＩでリン酸化したタウ蛋白質の順に移動
度が小さかった。また抗ＰＳ１４４抗体、抗ＰＴ１４７
抗体および抗ＰＳ３１５抗体との反応性については、脱
リン酸化したタウ蛋白質はいずれの抗体とも反応せず、
タウプロテインキナーゼＩＩでリン酸化したタウ蛋白質
はいずれの抗体とも反応し、未処理のタウ蛋白質は抗Ｐ
Ｓ１４４抗体および抗ＰＳ３１５抗体と比較的弱いなが
らも充分に認められる反応を示した。
【００５７】これらの各種タウ蛋白質を基質としてタウ
プロテインキナーゼＩによるリン酸化を以下のように試
みた。まず未処理のタウ蛋白質、脱リン酸化処理したタ
ウ蛋白質および脱リン酸化後にタウプロテインキナーゼ
ＩＩでリン酸化したタウ蛋白質に〔γ−32Ｐ〕ＡＴＰ存
在下および非存在下でタウプロテインキナーゼＩを作用
させたところ、脱リン酸化処理したタウ蛋白質の場合は
電気泳動の移動度に変化はなく、32Ｐの取り込みも極め
てわずかであったが、他の２つのタウ蛋白質の場合は電
気泳動の移動度が小さくなり、32Ｐが多量に取り込まれ
てリン酸化が進行したことが明らかであった。次にタウ
プロテインキナーゼＩとＩＩの作用を比較するため、そ
れぞれのキナーゼで未処理のタウ蛋白質をリン酸化した
後に、抗体との反応性をイムノブロッティング法で調べ
た。ここで使用したｔａｕ−１抗体は脳内に存在する正
常なタウ蛋白質との反応は強く、ＰＨＦ中の異常にリン
酸化されたタウ蛋白質との反応は弱いとされている抗体
であり、一方抗ｐｔａｕ抗体はＰＨＦ中の異常リン酸化
タウ蛋白質に特異的に反応する抗体である。イムノブロ
ッティングの結果、ｔａｕ−１抗体との反応性はリン酸
化していないタウ蛋白質で最も強く、タウプロテインキ
ナーゼＩまたはＩＩでリン酸化すると反応が弱くなり、
特にタウプロテインキナーゼＩでリン酸化して電気泳動
の移動度が最も小さくなったバンドは、ｔａｕ−１抗体
と反応しなかった。これに対し抗ｐｔａｕ抗体との反応
性はタウプロテインキナーゼＩによるリン酸化によって
初めて観察された。
プロテインキナーゼＩによるリン酸化を以下のように試
みた。まず未処理のタウ蛋白質、脱リン酸化処理したタ
ウ蛋白質および脱リン酸化後にタウプロテインキナーゼ
ＩＩでリン酸化したタウ蛋白質に〔γ−32Ｐ〕ＡＴＰ存
在下および非存在下でタウプロテインキナーゼＩを作用
させたところ、脱リン酸化処理したタウ蛋白質の場合は
電気泳動の移動度に変化はなく、32Ｐの取り込みも極め
てわずかであったが、他の２つのタウ蛋白質の場合は電
気泳動の移動度が小さくなり、32Ｐが多量に取り込まれ
てリン酸化が進行したことが明らかであった。次にタウ
プロテインキナーゼＩとＩＩの作用を比較するため、そ
れぞれのキナーゼで未処理のタウ蛋白質をリン酸化した
後に、抗体との反応性をイムノブロッティング法で調べ
た。ここで使用したｔａｕ−１抗体は脳内に存在する正
常なタウ蛋白質との反応は強く、ＰＨＦ中の異常にリン
酸化されたタウ蛋白質との反応は弱いとされている抗体
であり、一方抗ｐｔａｕ抗体はＰＨＦ中の異常リン酸化
タウ蛋白質に特異的に反応する抗体である。イムノブロ
ッティングの結果、ｔａｕ−１抗体との反応性はリン酸
化していないタウ蛋白質で最も強く、タウプロテインキ
ナーゼＩまたはＩＩでリン酸化すると反応が弱くなり、
特にタウプロテインキナーゼＩでリン酸化して電気泳動
の移動度が最も小さくなったバンドは、ｔａｕ−１抗体
と反応しなかった。これに対し抗ｐｔａｕ抗体との反応
性はタウプロテインキナーゼＩによるリン酸化によって
初めて観察された。
【００５８】以上の結果から、配列表の配列番号２に記
載のアミノ酸配列において１４４番目のセリン、１４７
番目のスレオニン、１７７番目のセリンおよび３１５番
目のセリンから選ばれる１以上のアミノ酸がリン酸化さ
れたタウ蛋白質を基質としてタウプロテインキナーゼＩ
を作用させると、ＰＨＦ中の異常リン酸化と同様なリン
酸化が進行することがわかった。
載のアミノ酸配列において１４４番目のセリン、１４７
番目のスレオニン、１７７番目のセリンおよび３１５番
目のセリンから選ばれる１以上のアミノ酸がリン酸化さ
れたタウ蛋白質を基質としてタウプロテインキナーゼＩ
を作用させると、ＰＨＦ中の異常リン酸化と同様なリン
酸化が進行することがわかった。
【００５９】実施例２
一次構造が配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列で
表されるタウ蛋白質をタウプロテインキナーゼＩＩでリ
ン酸化した後、さらに〔γ−32Ｐ〕ＡＴＰ存在下でタウ
プロテインキナーゼＩでリン酸化してから、エンドプロ
テアーゼ Ｌｙｓ−Ｃで酵素消化した。実施例１と同様
にして32Ｐを取り込んだペプチド・ピークを同定し、さ
らに実施例１と同様にして相当する非標識ペプチドを分
取した。これらのペプチドはアミノ酸配列分析により、
実施例１のｐＫ１、ｐＫ２およびｐＫ３に相当すること
が確認され、これらがタウプロテインキナーゼＩによっ
てさらにリン酸化されたものであると結論した。これら
のペプチドを、それぞれｐｐＫ１、ｐｐＫ２およびｐｐ
Ｋ３と呼ぶ。それぞれのアミノ酸配列分析において、実
施例１と同様にＰＴＨ−アミノ酸がセリンまたはスレオ
ニンの脱水物のＰＴＨ誘導体のＤＴＴ付加物であるか否
かでリン酸化部位を判定したところ、ｐｐＫ１において
は配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列における１
７３番目のスレオニン、ｐｐＫ２では１４１番目のセリ
ン、ｐｐＫ３では３０７番目のセリンと３２４番目のセ
リンがタウプロテインキナーゼＩによってリン酸化され
たアミノ酸であることが判明した。
表されるタウ蛋白質をタウプロテインキナーゼＩＩでリ
ン酸化した後、さらに〔γ−32Ｐ〕ＡＴＰ存在下でタウ
プロテインキナーゼＩでリン酸化してから、エンドプロ
テアーゼ Ｌｙｓ−Ｃで酵素消化した。実施例１と同様
にして32Ｐを取り込んだペプチド・ピークを同定し、さ
らに実施例１と同様にして相当する非標識ペプチドを分
取した。これらのペプチドはアミノ酸配列分析により、
実施例１のｐＫ１、ｐＫ２およびｐＫ３に相当すること
が確認され、これらがタウプロテインキナーゼＩによっ
てさらにリン酸化されたものであると結論した。これら
のペプチドを、それぞれｐｐＫ１、ｐｐＫ２およびｐｐ
Ｋ３と呼ぶ。それぞれのアミノ酸配列分析において、実
施例１と同様にＰＴＨ−アミノ酸がセリンまたはスレオ
ニンの脱水物のＰＴＨ誘導体のＤＴＴ付加物であるか否
かでリン酸化部位を判定したところ、ｐｐＫ１において
は配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列における１
７３番目のスレオニン、ｐｐＫ２では１４１番目のセリ
ン、ｐｐＫ３では３０７番目のセリンと３２４番目のセ
リンがタウプロテインキナーゼＩによってリン酸化され
たアミノ酸であることが判明した。
【００６０】実施例３
配列表の配列番号４５に記載のアミノ酸配列で表される
ペプチドを合成し、〔γ−32Ｐ〕ＡＴＰ存在下でタウプ
ロテインキナーゼＩでリン酸化したが、該ペプチドには
32Ｐは取り込まれなかった。しかし、このペプチドをタ
ウプロテインキナーゼＩＩで予めリン酸化することによ
り、タウプロテインキナーゼＩでリン酸化することがで
きた。タウプロテインキナーゼＩによるリン酸化の前後
のペプチドのアミノ酸配列分析を比較したところ、配列
表の配列番号４５に記載のアミノ酸配列において６番目
のスレオニンに相当するＰＴＨ−アミノ酸がリン酸化前
ではＰＴＨ−スレオニンであったのに対し、リン酸化後
ではＰＴＨ−デヒドロ−α−アミノ酪酸のＤＴＴ付加物
であった。なお、同配列において１０番目のセリンに相
当するＰＴＨ−アミノ酸は、いずれもＰＴＨ−デヒドロ
アラニンのＤＴＴ付加物であった。
ペプチドを合成し、〔γ−32Ｐ〕ＡＴＰ存在下でタウプ
ロテインキナーゼＩでリン酸化したが、該ペプチドには
32Ｐは取り込まれなかった。しかし、このペプチドをタ
ウプロテインキナーゼＩＩで予めリン酸化することによ
り、タウプロテインキナーゼＩでリン酸化することがで
きた。タウプロテインキナーゼＩによるリン酸化の前後
のペプチドのアミノ酸配列分析を比較したところ、配列
表の配列番号４５に記載のアミノ酸配列において６番目
のスレオニンに相当するＰＴＨ−アミノ酸がリン酸化前
ではＰＴＨ−スレオニンであったのに対し、リン酸化後
ではＰＴＨ−デヒドロ−α−アミノ酪酸のＤＴＴ付加物
であった。なお、同配列において１０番目のセリンに相
当するＰＴＨ−アミノ酸は、いずれもＰＴＨ−デヒドロ
アラニンのＤＴＴ付加物であった。
【００６１】この結果から、配列表の配列番号４５に記
載のアミノ酸配列で表されるペプチドのタウプロテイン
キナーゼＩによるリン酸化には、タウプロテインキナー
ゼＩＩによる１０番目のセリンのリン酸化が必要であ
り、かつタウプロテインキナーゼＩによるリン酸化の部
位は６番目のスレオニンであることがわかった。
載のアミノ酸配列で表されるペプチドのタウプロテイン
キナーゼＩによるリン酸化には、タウプロテインキナー
ゼＩＩによる１０番目のセリンのリン酸化が必要であ
り、かつタウプロテインキナーゼＩによるリン酸化の部
位は６番目のスレオニンであることがわかった。
【００６２】実施例４
配列表の配列番号４６に記載のアミノ酸配列で表される
ペプチドを合成し、〔γ−32Ｐ〕ＡＴＰ存在下でタウプ
ロテインキナーゼＩでリン酸化したが、該ペプチドには
32Ｐは取り込まれなかった。しかし、このペプチドをタ
ウプロテインキナーゼＩＩで予めリン酸化することによ
り、タウプロテインキナーゼＩでリン酸化することがで
きた。タウプロテインキナーゼＩによるリン酸化の前後
のペプチドのアミノ酸配列分析を比較したところ、配列
表の配列番号４６に記載のアミノ酸配列において９番目
のセリンに相当するＰＴＨ−アミノ酸がリン酸化前では
ＰＴＨ−セリンであったのに対し、リン酸化後ではＰＴ
Ｈ−デヒドロアラニンのＤＴＴ付加物であった。なお、
同配列において１２番目のセリンに相当するＰＴＨ−ア
ミノ酸は、いずれもＰＴＨ−デヒドロアラニンのＤＴＴ
付加物であり、１５番目のスレオニンに相当するＰＴＨ
−アミノ酸は、いずれもＰＴＨ−デヒドロ−α−アミノ
酪酸のＤＴＴ付加物であった。
ペプチドを合成し、〔γ−32Ｐ〕ＡＴＰ存在下でタウプ
ロテインキナーゼＩでリン酸化したが、該ペプチドには
32Ｐは取り込まれなかった。しかし、このペプチドをタ
ウプロテインキナーゼＩＩで予めリン酸化することによ
り、タウプロテインキナーゼＩでリン酸化することがで
きた。タウプロテインキナーゼＩによるリン酸化の前後
のペプチドのアミノ酸配列分析を比較したところ、配列
表の配列番号４６に記載のアミノ酸配列において９番目
のセリンに相当するＰＴＨ−アミノ酸がリン酸化前では
ＰＴＨ−セリンであったのに対し、リン酸化後ではＰＴ
Ｈ−デヒドロアラニンのＤＴＴ付加物であった。なお、
同配列において１２番目のセリンに相当するＰＴＨ−ア
ミノ酸は、いずれもＰＴＨ−デヒドロアラニンのＤＴＴ
付加物であり、１５番目のスレオニンに相当するＰＴＨ
−アミノ酸は、いずれもＰＴＨ−デヒドロ−α−アミノ
酪酸のＤＴＴ付加物であった。
【００６３】この結果から、配列表の配列番号４６に記
載のアミノ酸配列で表されるペプチドのタウプロテイン
キナーゼＩによるリン酸化には、タウプロテインキナー
ゼＩＩによるリン酸化が必要であり、かつタウプロテイ
ンキナーゼＩによるリン酸化の部位は９番目のセリンで
あることがわかった。 実施例５ 配列表の配列番号４７に記載のアミノ酸配列で表される
ペプチドを合成し、次いでそれをタウプロテインキナー
ゼＩＩでリン酸化したペプチドを合成した。それぞれの
ペプチドについて〔γ−32Ｐ〕ＡＴＰ存在下でタウプロ
テインキナーゼＩでリン酸化を試みたところ、32Ｐの取
り込みはリン酸化ペプチドの場合にのみ認められた。
載のアミノ酸配列で表されるペプチドのタウプロテイン
キナーゼＩによるリン酸化には、タウプロテインキナー
ゼＩＩによるリン酸化が必要であり、かつタウプロテイ
ンキナーゼＩによるリン酸化の部位は９番目のセリンで
あることがわかった。 実施例５ 配列表の配列番号４７に記載のアミノ酸配列で表される
ペプチドを合成し、次いでそれをタウプロテインキナー
ゼＩＩでリン酸化したペプチドを合成した。それぞれの
ペプチドについて〔γ−32Ｐ〕ＡＴＰ存在下でタウプロ
テインキナーゼＩでリン酸化を試みたところ、32Ｐの取
り込みはリン酸化ペプチドの場合にのみ認められた。
【００６４】
【発明の効果】本発明のリン酸化方法は、タウ蛋白質に
対し特異的に作用するものであり、アルツハイマー病お
よびアルツハイマー型老年痴呆の病因の解明、さらには
これを予防または治療する薬物の探索への応用が期待さ
れる。
対し特異的に作用するものであり、アルツハイマー病お
よびアルツハイマー型老年痴呆の病因の解明、さらには
これを予防または治療する薬物の探索への応用が期待さ
れる。
【００６５】
【配列表】配列番号：１
配列の長さ：１９３２
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ｃＤＮＡ ｔｏ ｇｅｎｏｍｉｃ ＲＮＡ
起源
生物名：ラット
配列
GGCCAAGAGA ACGAAGTCTT TTTTTTTTTT TTCTTGCGGG AGAACTTAAT GCTGCATTTA 60
TTATTAACCT AGTACCCTAA CATAAAACAA AAGGAAGAAA AGGATTAAGG AAGGAAAAGG 120
TGAATCGAGA AGAGCCATC ATG TCG GGG CGA CCG AGA ACC ACC TCC TTT GCG 172
Met Ser Gly Arg Pro Arg Thr Thr Ser Phe Ala
1 5 10
GAG AGC TGC AAG CCA GTG CAG CAG CCT TCA GCT TTT GGT AGC ATG AAA 220
Glu Ser Cys Lys Pro Val Gln Gln Pro Ser Ala Phe Gly Ser Met Lys
15 20 25
GTT AGC AGA GAT AAA GAT GGC AGC AAG GTA ACC ACA GTG GTG GCA ACT 268
Val Ser Arg Asp Lys Asp Gly Ser Lys Val Thr Thr Val Val Ala Thr
30 35 40
CCT GGA CAG GGT CCT GAC AGG CCA CAG GAA GTC AGT TAC ACA GAC ACT 316
Pro Gly Gln Gly Pro Asp Arg Pro Gln Glu Val Ser Tyr Thr Asp Thr
45 50 55
AAA GTC ATT GGA AAT GGG TCA TTT GGT GTG GTA TAT CAA GCC AAA CTT 364
Lys Val Ile Gly Asn Gly Ser Phe Gly Val Val Tyr Gln Ala Lys Leu
60 65 70 75
TGT GAC TCA GGA GAA CTG GTG GCC ATC AAG AAA GTT CTT CAG GAC AAG 412
Cys Asp Ser Gly Glu Leu Val Ala Ile Lys Lys Val Leu Gln Asp Lys
80 85 90
CGA TTT AAG AAC CGA GAG CTC CAG ATC ATG AGA AAG CTA GAT CAC TGT 460
Arg Phe Lys Asn Arg Glu Leu Gln Ile Met Arg Lys Leu Asp His Cys
95 100 105
AAC ATA GTC CGA TTG CGG TAT TTC TTC TAC TCG AGT GGC GAG AAG AAA 508
Asn Ile Val Arg Leu Arg Tyr Phe Phe Tyr Ser Ser Gly Glu Lys Lys
110 115 120
GAT GAG GTC TAC CTT AAC CTG GTG CTG GAC TAT GTT CCG GAA ACA GTG 556
Asp Glu Val Tyr Leu Asn Leu Val Leu Asp Tyr Val Pro Glu Thr Val
125 130 135
TAC AGA GTC GCC AGA CAC TAT AGT CGA GCC AAG CAG ACA CTC CCT GTG 604
Tyr Arg Val Ala Arg His Tyr Ser Arg Ala Lys Gln Thr Leu Pro Val
140 145 150 155
ATC TAT GTC AAG TTG TAT ATG TAC CAG CTG TTC AGA AGT CTA GCC TAT 652
Ile Tyr Val Lys Leu Tyr Met Tyr Gln Leu Phe Arg Ser Leu Ala Tyr
160 165 170
ATC CAT TCC TTT GGG ATC TGC CAT CGA GAC ATT AAA CCA CAG AAC CTC 700
Ile His Ser Phe Gly Ile Cys His Arg Asp Ile Lys Pro Gln Asn Leu
175 180 185
TTG CTG GAT CCT GAT ACA GCT GTA TTA AAA CTC TGC GAC TTT GGA AGT 748
Leu Leu Asp Pro Asp Thr Ala Val Leu Lys Leu Cys Asp Phe Gly Ser
190 195 200
GCA AAG CAG CTG GTC CGA GGA GAG CCC AAT GTT TCA TAT ATC TGT TCT 796
Ala Lys Gln Leu Val Arg Gly Glu Pro Asn Val Ser Tyr Ile Cys Ser
205 210 215
CGG TAC TAC AGG GCA CCA GAG CTG ATC TTT GGA GCC ACC GAT TAC ACG 844
Arg Tyr Tyr Arg Ala Pro Glu Leu Ile Phe Gly Ala Thr Asp Tyr Thr
220 225 230 235
TCT AGT ATA GAT GTA TGG TCT GCA GGC TGT GTG TTG GCT GAA TTG TTG 892
Ser Ser Ile Asp Val Trp Ser Ala Gly Cys Val Leu Ala Glu Leu Leu
240 245 250
CTA GGA CAA CCA ATA TTT CCT GGG GAC AGT GGT GTG GAT CAG TTG GTG 940
Leu Gly Gln Pro Ile Phe Pro Gly Asp Ser Gly Val Asp Gln Leu Val
255 260 265
GAA ATA ATA AAG GTC CTA GGA ACA CCA ACA AGG GAG CAA ATT AGA GAA 988
Glu Ile Ile Lys Val Leu Gly Thr Pro Thr Arg Glu Gln Ile Arg Glu
270 275 280
ATG AAC CCA AAT TAT ACA GAA TTC AAA TTC CCC CAA ATC AAG GCA CAT 1036
Met Asn Pro Asn Tyr Thr Glu Phe Lys Phe Pro Gln Ile Lys Ala His
285 290 295
CCT TGG ACG AAG GTC TTT CGG CCC CGA ACT CCA CCA GAG GCA ATC GCA 1084
Pro Trp Thr Lys Val Phe Arg Pro Arg Thr Pro Pro Glu Ala Ile Ala
300 305 310 315
CTG TGT AGC CGT CTC CTG GAG TAC ACG CCG ACC GCC CGG CTA ACA CCA 1132
Leu Cys Ser Arg Leu Leu Glu Tyr Thr Pro Thr Ala Arg Leu Thr Pro
320 325 330
CTG GAA GCT TGT GCA CAT TCA TTT TTT GAT GAA TTA CGG GAC CCA AAT 1180
Leu Glu Ala Cys Ala His Ser Phe Phe Asp Glu Leu Arg Asp Pro Asn
335 340 345
GTC AAA CTA CCA AAT GGG CGA GAC ACA CCT GCC CTC TTC AAC TTT ACC 1228
Val Lys Leu Pro Asn Gly Arg Asp Thr Pro Ala Leu Phe Asn Phe Thr
350 355 360
ACT CAA GAA CTG TCA AGT AAC CCA CCT CTG GCC ACC ATC CTT ATC CCT 1276
Thr Gln Glu Leu Ser Ser Asn Pro Pro Leu Ala Thr Ile Leu Ile Pro
365 370 375
CCT CAC GCT CGG ATT CAG GCA GCT GCT TCA CCG CCT GCA AAC GCC ACA 1324
Pro His Ala Arg Ile Gln Ala Ala Ala Ser Pro Pro Ala Asn Ala Thr
380 385 390 395
GCA GCC TCA GAT ACT AAT GCT GGA GAC CGT GGA CAG ACC AAT AAC GCC 1372
Ala Ala Ser Asp Thr Asn Ala Gly Asp Arg Gly Gln Thr Asn Asn Ala
400 405 410
GCT TCT GCA TCA GCC TCC AAC TCT ACC TGA ACAG CCCCAAGTAG CCAGCTGCGC1426
Ala Ser Ala Ser Ala Ser Asn Ser Thr Stop
415 420
AGGGAAGACC AGCACTTACT TGAGTGCCAC TCAGCAACAC TGGTCACGTT TGGAAAGAAA 1486
ATTAAAAAGA GGAAAACAAA AACAAAAACA AAAAACCCCG GCTTTGGTTT GTTTCTTCTT 1546
TCTTCTTTTC CTCTATTTTC TTTTTTAAAA ATCTGTTTCT CCTTTTAAAA AAATTAAGAT 1606
GAAGTCAAGT CTGATGTCAT GGGTAACCCC ACCTACTTGG AAGGCTGAGT CTAGAGGTTT 1666
ACAGCTCAAG CCCATGCTGG ACTACAGTGG GAGTCCAAGG CCAGCNTGGG CAACTTAAAA 1726
AGAACTTGTT TCAAAAACGA CAAAGTTGGC TGATAATATG GCTCTCCAAG AGCCACAATA 1786
AATAAATATG TAAATAAACT CAAATAAGTC TTGTAATTTA AATTACACTA AACTAGGTTA 1846
ACTTTTAAAC TCTCATCTTT AAGAACTACA GGTTTAAAAA CCCAACGGTT GTTTTATGTA 1906
TTAGGGAAAA ATGAAAAATC TAATATAAAA AGAAGCAGCA ACAGCAGCAG GAGCCAACCA 1966
AAGGAT 1972
N : 未同定
【００６６】配列番号：２
配列の長さ：３５２
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：タンパク質
起源
生物名：ヒト
配列
Met Ala Glu Pro Arg Gln Glu Phe Glu Val Met Glu Asp His Ala Gly
1 5 10 15
Thr Tyr Gly Leu Gly Asp Arg Lys Asp Gln Gly Gly Tyr Thr Met His
20 25 30
Gln Asp Gln Glu Gly Asp Thr Asp Ala Gly Leu Lys Ala Glu Glu Ala
35 40 45
Gly Ile Gly Asp Thr Pro Ser Leu Glu Asp Glu Ala Ala Gly His Val
50 55 60
Thr Gln Ala Arg Met Val Ser Lys Ser Lys Asp Gly Thr Gly Ser Asp
65 70 75 80
Asp Lys Lys Ala Lys Gly Ala Asp Gly Lys Thr Lys Ile Ala Thr Pro
85 90 95
Arg Gly Ala Ala Pro Pro Gly Gln Lys Gly Gln Ala Asn Ala Thr Arg
100 105 110
Ile Pro Ala Lys Thr Pro Pro Ala Pro Lys Thr Pro Pro Ser Ser Gly
115 120 125
Glu Pro Pro Lys Ser Gly Asp Arg Ser Gly Tyr Ser Ser Pro Gly Ser
130 135 140
Pro Gly Thr Pro Gly Ser Arg Ser Arg Thr Pro Ser Leu Pro Thr Pro
145 150 155 160
Pro Thr Arg Glu Pro Lys Lys Val Ala Val Val Arg Thr Pro Pro Lys
165 170 175
Ser Pro Ser Ser Ala Lys Ser Arg Leu Gln Thr Ala Pro Val Pro Met
180 185 190
Pro Asp Leu Lys Asn Val Lys Ser Lys Ile Gly Ser Thr Glu Asp Leu
195 200 205
Lys His Gln Pro Gly Gly Gly Lys Val Gln Ile Val Tyr Lys Pro Val
210 215 220
Asp Leu Ser Lys Val Thr Ser Lys Cys Gly Ser Leu Gly Asn Ile His
225 230 235 240
His Lys Pro Gly Gly Gly Gln Val Glu Val Lys Ser Glu Lys Leu Asp
245 250 255
Phe Lys Asp Arg Val Gln Ser Lys Ile Gly Ser Leu Asp Asn Ile Thr
260 265 270
His Val Pro Gly Gly Gly Asn Lys Lys Ile Glu Thr His Lys Leu Thr
275 280 285
Phe Arg Glu Asn Ala Lys Ala Lys Thr Asp His Gly Ala Glu Ile Val
290 295 300
Tyr Lys Ser Pro Val Val Ser Gly Asp Thr Ser Pro Arg His Leu Ser
305 310 315 320
Asn Val Ser Ser Thr Gly Ser Ile Asp Met Val Asp Ser Pro Gln Leu
325 330 335
Ala Thr Leu Ala Asp Glu Val Ser Ala Ser Leu Ala Lys Gln Gly Leu
340 345 350
【００６７】配列番号：３
配列の長さ：１８４
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列
Ser Pro Gly Ser Pro Gly Thr Pro Gly Ser Arg Ser Arg Thr Pro Ser
1 5 10 15
Leu Pro Thr Pro Pro Thr Arg Glu Pro Lys Lys Val Ala Val Val Arg
20 25 30
Thr Pro Pro Lys Ser Pro Ser Ser Ala Lys Ser Arg Leu Gln Thr Ala
35 40 45
Pro Val Pro Met Pro Asp Leu Lys Asn Val Lys Ser Lys Ile Gly Ser
50 55 60
Thr Glu Asp Leu Lys His Gln Pro Gly Gly Gly Lys Val Gln Ile Val
65 70 75 80
Tyr Lys Pro Val Asp Leu Ser Lys Val Thr Ser Lys Cys Gly Ser Leu
85 90 95
Gly Asn Ile His His Lys Pro Gly Gly Gly Gln Val Glu Val Lys Ser
100 105 110
Glu Lys Leu Asp Phe Lys Asp Arg Val Gln Ser Lys Ile Gly Ser Leu
115 120 125
Asp Asn Ile Thr His Val Pro Gly Gly Gly Asn Lys Lys Ile Glu Thr
130 135 140
His Lys Leu Thr Phe Arg Glu Asn Ala Lys Ala Lys Thr Asp His Gly
145 150 155 160
Ala Glu Ile Val Tyr Lys Ser Pro Val Val Ser Gly Asp Thr Ser Pro
165 170 175
Arg His Leu Ser Asn Val Ser Ser
180
【００６８】配列番号：４
配列の長さ：１７６
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列
Ser Pro Gly Ser Pro Gly Thr Pro Gly Ser Arg Ser Arg Thr Pro Ser
1 5 10 15
Leu Pro Thr Pro Pro Thr Arg Glu Pro Lys Lys Val Ala Val Val Arg
20 25 30
Thr Pro Pro Lys Ser Pro Ser Ser Ala Lys Ser Arg Leu Gln Thr Ala
35 40 45
Pro Val Pro Met Pro Asp Leu Lys Asn Val Lys Ser Lys Ile Gly Ser
50 55 60
Thr Glu Asp Leu Lys His Gln Pro Gly Gly Gly Lys Val Gln Ile Val
65 70 75 80
Tyr Lys Pro Val Asp Leu Ser Lys Val Thr Ser Lys Cys Gly Ser Leu
85 90 95
Gly Asn Ile His His Lys Pro Gly Gly Gly Gln Val Glu Val Lys Ser
100 105 110
Glu Lys Leu Asp Phe Lys Asp Arg Val Gln Ser Lys Ile Gly Ser Leu
115 120 125
Asp Asn Ile Thr His Val Pro Gly Gly Gly Asn Lys Lys Ile Glu Thr
130 135 140
His Lys Leu Thr Phe Arg Glu Asn Ala Lys Ala Lys Thr Asp His Gly
145 150 155 160
Ala Glu Ile Val Tyr Lys Ser Pro Val Val Ser Gly Asp Thr Ser Pro
165 170 175
【００６９】配列番号：５
配列の長さ：１６７
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列
Ser Pro Gly Ser Pro Gly Thr Pro Gly Ser Arg Ser Arg Thr Pro Ser
1 5 10 15
Leu Pro Thr Pro Pro Thr Arg Glu Pro Lys Lys Val Ala Val Val Arg
20 25 30
Thr Pro Pro Lys Ser Pro Ser Ser Ala Lys Ser Arg Leu Gln Thr Ala
35 40 45
Pro Val Pro Met Pro Asp Leu Lys Asn Val Lys Ser Lys Ile Gly Ser
50 55 60
Thr Glu Asp Leu Lys His Gln Pro Gly Gly Gly Lys Val Gln Ile Val
65 70 75 80
Tyr Lys Pro Val Asp Leu Ser Lys Val Thr Ser Lys Cys Gly Ser Leu
85 90 95
Gly Asn Ile His His Lys Pro Gly Gly Gly Gln Val Glu Val Lys Ser
100 105 110
Glu Lys Leu Asp Phe Lys Asp Arg Val Gln Ser Lys Ile Gly Ser Leu
115 120 125
Asp Asn Ile Thr His Val Pro Gly Gly Gly Asn Lys Lys Ile Glu Thr
130 135 140
His Lys Leu Thr Phe Arg Glu Asn Ala Lys Ala Lys Thr Asp His Gly
145 150 155 160
Ala Glu Ile Val Tyr Lys Ser
165
【００７０】配列番号：６
配列の長さ：３８
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列
Ser Pro Gly Ser Pro Gly Thr Pro Gly Ser Arg Ser Arg Thr Pro Ser
1 5 10 15
Leu Pro Thr Pro Pro Thr Arg Glu Pro Lys Lys Val Ala Val Val Arg
20 25 30
Thr Pro Pro Lys Ser Pro
35
【００７１】配列番号：７
配列の長さ：３３
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列
Ser Pro Gly Ser Pro Gly Thr Pro Gly Ser Arg Ser Arg Thr Pro Ser
1 5 10 15
Leu Pro Thr Pro Pro Thr Arg Glu Pro Lys Lys Val Ala Val Val Arg
20 25 30
Thr
【００７２】配列番号：８
配列の長さ：８
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列
Ser Pro Gly Ser Pro Gly Thr Pro
1 5
【００７３】配列番号：９
配列の長さ：５
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列
Ser Pro Gly Ser Pro
1 5
【００７４】配列番号：１０
配列の長さ：１８１
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列
Ser Pro Gly Thr Pro Gly Ser Arg Ser Arg Thr Pro Ser Leu Pro Thr
1 5 10 15
Pro Pro Thr Arg Glu Pro Lys Lys Val Ala Val Val Arg Thr Pro Pro
20 25 30
Lys Ser Pro Ser Ser Ala Lys Ser Arg Leu Gln Thr Ala Pro Val Pro
35 40 45
Met Pro Asp Leu Lys Asn Val Lys Ser Lys Ile Gly Ser Thr Glu Asp
50 55 60
Leu Lys His Gln Pro Gly Gly Gly Lys Val Gln Ile Val Tyr Lys Pro
65 70 75 80
Val Asp Leu Ser Lys Val Thr Ser Lys Cys Gly Ser Leu Gly Asn Ile
85 90 95
His His Lys Pro Gly Gly Gly Gln Val Glu Val Lys Ser Glu Lys Leu
100 105 110
Asp Phe Lys Asp Arg Val Gln Ser Lys Ile Gly Ser Leu Asp Asn Ile
115 120 125
Thr His Val Pro Gly Gly Gly Asn Lys Lys Ile Glu Thr His Lys Leu
130 135 140
Thr Phe Arg Glu Asn Ala Lys Ala Lys Thr Asp His Gly Ala Glu Ile
145 150 155 160
Val Tyr Lys Ser Pro Val Val Ser Gly Asp Thr Ser Pro Arg His Leu
165 170 175
Ser Asn Val Ser Ser
180
【００７５】配列番号：１１
配列の長さ：１７３
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列
Ser Pro Gly Thr Pro Gly Ser Arg Ser Arg Thr Pro Ser Leu Pro Thr
1 5 10 15
Pro Pro Thr Arg Glu Pro Lys Lys Val Ala Val Val Arg Thr Pro Pro
20 25 30
Lys Ser Pro Ser Ser Ala Lys Ser Arg Leu Gln Thr Ala Pro Val Pro
35 40 45
Met Pro Asp Leu Lys Asn Val Lys Ser Lys Ile Gly Ser Thr Glu Asp
50 55 60
Leu Lys His Gln Pro Gly Gly Gly Lys Val Gln Ile Val Tyr Lys Pro
65 70 75 80
Val Asp Leu Ser Lys Val Thr Ser Lys Cys Gly Ser Leu Gly Asn Ile
85 90 95
His His Lys Pro Gly Gly Gly Gln Val Glu Val Lys Ser Glu Lys Leu
100 105 110
Asp Phe Lys Asp Arg Val Gln Ser Lys Ile Gly Ser Leu Asp Asn Ile
115 120 125
Thr His Val Pro Gly Gly Gly Asn Lys Lys Ile Glu Thr His Lys Leu
130 135 140
Thr Phe Arg Glu Asn Ala Lys Ala Lys Thr Asp His Gly Ala Glu Ile
145 150 155 160
Val Tyr Lys Ser Pro Val Val Ser Gly Asp Thr Ser Pro
165 170
【００７６】配列番号：１２
配列の長さ：１６４
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列
Ser Pro Gly Thr Pro Gly Ser Arg Ser Arg Thr Pro Ser Leu Pro Thr
1 5 10 15
Pro Pro Thr Arg Glu Pro Lys Lys Val Ala Val Val Arg Thr Pro Pro
20 25 30
Lys Ser Pro Ser Ser Ala Lys Ser Arg Leu Gln Thr Ala Pro Val Pro
35 40 45
Met Pro Asp Leu Lys Asn Val Lys Ser Lys Ile Gly Ser Thr Glu Asp
50 55 60
Leu Lys His Gln Pro Gly Gly Gly Lys Val Gln Ile Val Tyr Lys Pro
65 70 75 80
Val Asp Leu Ser Lys Val Thr Ser Lys Cys Gly Ser Leu Gly Asn Ile
85 90 95
His His Lys Pro Gly Gly Gly Gln Val Glu Val Lys Ser Glu Lys Leu
100 105 110
Asp Phe Lys Asp Arg Val Gln Ser Lys Ile Gly Ser Leu Asp Asn Ile
115 120 125
Thr His Val Pro Gly Gly Gly Asn Lys Lys Ile Glu Thr His Lys Leu
130 135 140
Thr Phe Arg Glu Asn Ala Lys Ala Lys Thr Asp His Gly Ala Glu Ile
145 150 155 160
Val Tyr Lys Ser
【００７７】配列番号：１３
配列の長さ：３５
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列
Ser Pro Gly Thr Pro Gly Ser Arg Ser Arg Thr Pro Ser Leu Pro Thr
1 5 10 15
Pro Pro Thr Arg Glu Pro Lys Lys Val Ala Val Val Arg Thr Pro Pro
20 25 30
Lys Ser Pro
35
【００７８】配列番号：１４
配列の長さ：３０
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列
Ser Pro Gly Thr Pro Gly Ser Arg Ser Arg Thr Pro Ser Leu Pro Thr
1 5 10 15
Pro Pro Thr Arg Glu Pro Lys Lys Val Ala Val Val Arg Thr
20 25 30
【００７９】配列番号：１５
配列の長さ：１７８
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列
Thr Pro Gly Ser Arg Ser Arg Thr Pro Ser Leu Pro Thr Pro Pro Thr
1 5 10 15
Arg Glu Pro Lys Lys Val Ala Val Val Arg Thr Pro Pro Lys Ser Pro
20 25 30
Ser Ser Ala Lys Ser Arg Leu Gln Thr Ala Pro Val Pro Met Pro Asp
35 40 45
Leu Lys Asn Val Lys Ser Lys Ile Gly Ser Thr Glu Asp Leu Lys His
50 55 60
Gln Pro Gly Gly Gly Lys Val Gln Ile Val Tyr Lys Pro Val Asp Leu
65 70 75 80
Ser Lys Val Thr Ser Lys Cys Gly Ser Leu Gly Asn Ile His His Lys
85 90 95
Pro Gly Gly Gly Gln Val Glu Val Lys Ser Glu Lys Leu Asp Phe Lys
100 105 110
Asp Arg Val Gln Ser Lys Ile Gly Ser Leu Asp Asn Ile Thr His Val
115 120 125
Pro Gly Gly Gly Asn Lys Lys Ile Glu Thr His Lys Leu Thr Phe Arg
130 135 140
Glu Asn Ala Lys Ala Lys Thr Asp His Gly Ala Glu Ile Val Tyr Lys
145 150 155 160
Ser Pro Val Val Ser Gly Asp Thr Ser Pro Arg His Leu Ser Asn Val
165 170 175
Ser Ser
【００８０】配列番号：１６
配列の長さ：１７０
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列
Thr Pro Gly Ser Arg Ser Arg Thr Pro Ser Leu Pro Thr Pro Pro Thr
1 5 10 15
Arg Glu Pro Lys Lys Val Ala Val Val Arg Thr Pro Pro Lys Ser Pro
20 25 30
Ser Ser Ala Lys Ser Arg Leu Gln Thr Ala Pro Val Pro Met Pro Asp
35 40 45
Leu Lys Asn Val Lys Ser Lys Ile Gly Ser Thr Glu Asp Leu Lys His
50 55 60
Gln Pro Gly Gly Gly Lys Val Gln Ile Val Tyr Lys Pro Val Asp Leu
65 70 75 80
Ser Lys Val Thr Ser Lys Cys Gly Ser Leu Gly Asn Ile His His Lys
85 90 95
Pro Gly Gly Gly Gln Val Glu Val Lys Ser Glu Lys Leu Asp Phe Lys
100 105 110
Asp Arg Val Gln Ser Lys Ile Gly Ser Leu Asp Asn Ile Thr His Val
115 120 125
Pro Gly Gly Gly Asn Lys Lys Ile Glu Thr His Lys Leu Thr Phe Arg
130 135 140
Glu Asn Ala Lys Ala Lys Thr Asp His Gly Ala Glu Ile Val Tyr Lys
145 150 155 160
Ser Pro Val Val Ser Gly Asp Thr Ser Pro
165 170
【００８１】配列番号：１７
配列の長さ：１６１
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列
Thr Pro Gly Ser Arg Ser Arg Thr Pro Ser Leu Pro Thr Pro Pro Thr
1 5 10 15
Arg Glu Pro Lys Lys Val Ala Val Val Arg Thr Pro Pro Lys Ser Pro
20 25 30
Ser Ser Ala Lys Ser Arg Leu Gln Thr Ala Pro Val Pro Met Pro Asp
35 40 45
Leu Lys Asn Val Lys Ser Lys Ile Gly Ser Thr Glu Asp Leu Lys His
50 55 60
Gln Pro Gly Gly Gly Lys Val Gln Ile Val Tyr Lys Pro Val Asp Leu
65 70 75 80
Ser Lys Val Thr Ser Lys Cys Gly Ser Leu Gly Asn Ile His His Lys
85 90 95
Pro Gly Gly Gly Gln Val Glu Val Lys Ser Glu Lys Leu Asp Phe Lys
100 105 110
Asp Arg Val Gln Ser Lys Ile Gly Ser Leu Asp Asn Ile Thr His Val
115 120 125
Pro Gly Gly Gly Asn Lys Lys Ile Glu Thr His Lys Leu Thr Phe Arg
130 135 140
Glu Asn Ala Lys Ala Lys Thr Asp His Gly Ala Glu Ile Val Tyr Lys
145 150 155 160
Ser
【００８２】配列番号：１８
配列の長さ：３２
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列
Thr Pro Gly Ser Arg Ser Arg Thr Pro Ser Leu Pro Thr Pro Pro Thr
1 5 10 15
Arg Glu Pro Lys Lys Val Ala Val Val Arg Thr Pro Pro Lys Ser Pro
20 25 30
【００８３】配列番号：１９
配列の長さ：２７
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列
Thr Pro Gly Ser Arg Ser Arg Thr Pro Ser Leu Pro Thr Pro Pro Thr
1 5 10 15
Arg Glu Pro Lys Lys Val Ala Val Val Arg Thr
20 25
【００８４】配列番号：２０
配列の長さ：１５２
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列
Thr Pro Pro Lys Ser Pro Ser Ser Ala Lys Ser Arg Leu Gln Thr Ala
1 5 10 15
Pro Val Pro Met Pro Asp Leu Lys Asn Val Lys Ser Lys Ile Gly Ser
20 25 30
Thr Glu Asp Leu Lys His Gln Pro Gly Gly Gly Lys Val Gln Ile Val
35 40 45
Tyr Lys Pro Val Asp Leu Ser Lys Val Thr Ser Lys Cys Gly Ser Leu
50 55 60
Gly Asn Ile His His Lys Pro Gly Gly Gly Gln Val Glu Val Lys Ser
65 70 75 80
Glu Lys Leu Asp Phe Lys Asp Arg Val Gln Ser Lys Ile Gly Ser Leu
85 90 95
Asp Asn Ile Thr His Val Pro Gly Gly Gly Asn Lys Lys Ile Glu Thr
100 105 110
His Lys Leu Thr Phe Arg Glu Asn Ala Lys Ala Lys Thr Asp His Gly
115 120 125
Ala Glu Ile Val Tyr Lys Ser Pro Val Val Ser Gly Asp Thr Ser Pro
130 135 140
Arg His Leu Ser Asn Val Ser Ser
145 150
【００８５】配列番号：２１
配列の長さ：１４４
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列
Thr Pro Pro Lys Ser Pro Ser Ser Ala Lys Ser Arg Leu Gln Thr Ala
1 5 10 15
Pro Val Pro Met Pro Asp Leu Lys Asn Val Lys Ser Lys Ile Gly Ser
20 25 30
Thr Glu Asp Leu Lys His Gln Pro Gly Gly Gly Lys Val Gln Ile Val
35 40 45
Tyr Lys Pro Val Asp Leu Ser Lys Val Thr Ser Lys Cys Gly Ser Leu
50 55 60
Gly Asn Ile His His Lys Pro Gly Gly Gly Gln Val Glu Val Lys Ser
65 70 75 80
Glu Lys Leu Asp Phe Lys Asp Arg Val Gln Ser Lys Ile Gly Ser Leu
85 90 95
Asp Asn Ile Thr His Val Pro Gly Gly Gly Asn Lys Lys Ile Glu Thr
100 105 110
His Lys Leu Thr Phe Arg Glu Asn Ala Lys Ala Lys Thr Asp His Gly
115 120 125
Ala Glu Ile Val Tyr Lys Ser Pro Val Val Ser Gly Asp Thr Ser Pro
130 135 140
【００８６】配列番号：２２
配列の長さ：１３５
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列
Thr Pro Pro Lys Ser Pro Ser Ser Ala Lys Ser Arg Leu Gln Thr Ala
1 5 10 15
Pro Val Pro Met Pro Asp Leu Lys Asn Val Lys Ser Lys Ile Gly Ser
20 25 30
Thr Glu Asp Leu Lys His Gln Pro Gly Gly Gly Lys Val Gln Ile Val
35 40 45
Tyr Lys Pro Val Asp Leu Ser Lys Val Thr Ser Lys Cys Gly Ser Leu
50 55 60
Gly Asn Ile His His Lys Pro Gly Gly Gly Gln Val Glu Val Lys Ser
65 70 75 80
Glu Lys Leu Asp Phe Lys Asp Arg Val Gln Ser Lys Ile Gly Ser Leu
85 90 95
Asp Asn Ile Thr His Val Pro Gly Gly Gly Asn Lys Lys Ile Glu Thr
100 105 110
His Lys Leu Thr Phe Arg Glu Asn Ala Lys Ala Lys Thr Asp His Gly
115 120 125
Ala Glu Ile Val Tyr Lys Ser
130 135
【００８７】配列番号：２３
配列の長さ：６
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列
Thr Pro Pro Lys Ser Pro
1 5
【００８８】配列番号：２４
配列の長さ：１４８
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列
Ser Pro Ser Ser Ala Lys Ser Arg Leu Gln Thr Ala Pro Val Pro Met
1 5 10 15
Pro Asp Leu Lys Asn Val Lys Ser Lys Ile Gly Ser Thr Glu Asp Leu
20 25 30
Lys His Gln Pro Gly Gly Gly Lys Val Gln Ile Val Tyr Lys Pro Val
35 40 45
Asp Leu Ser Lys Val Thr Ser Lys Cys Gly Ser Leu Gly Asn Ile His
50 55 60
His Lys Pro Gly Gly Gly Gln Val Glu Val Lys Ser Glu Lys Leu Asp
65 70 75 80
Phe Lys Asp Arg Val Gln Ser Lys Ile Gly Ser Leu Asp Asn Ile Thr
85 90 95
His Val Pro Gly Gly Gly Asn Lys Lys Ile Glu Thr His Lys Leu Thr
100 105 110
Phe Arg Glu Asn Ala Lys Ala Lys Thr Asp His Gly Ala Glu Ile Val
115 120 125
Tyr Lys Ser Pro Val Val Ser Gly Asp Thr Ser Pro Arg His Leu Ser
130 135 140
Asn Val Ser Ser
145
【００８９】配列番号：２５
配列の長さ：１４０
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列
Ser Pro Ser Ser Ala Lys Ser Arg Leu Gln Thr Ala Pro Val Pro Met
1 5 10 15
Pro Asp Leu Lys Asn Val Lys Ser Lys Ile Gly Ser Thr Glu Asp Leu
20 25 30
Lys His Gln Pro Gly Gly Gly Lys Val Gln Ile Val Tyr Lys Pro Val
35 40 45
Asp Leu Ser Lys Val Thr Ser Lys Cys Gly Ser Leu Gly Asn Ile His
50 55 60
His Lys Pro Gly Gly Gly Gln Val Glu Val Lys Ser Glu Lys Leu Asp
65 70 75 80
Phe Lys Asp Arg Val Gln Ser Lys Ile Gly Ser Leu Asp Asn Ile Thr
85 90 95
His Val Pro Gly Gly Gly Asn Lys Lys Ile Glu Thr His Lys Leu Thr
100 105 110
Phe Arg Glu Asn Ala Lys Ala Lys Thr Asp His Gly Ala Glu Ile Val
115 120 125
Tyr Lys Ser Pro Val Val Ser Gly Asp Thr Ser Pro
130 135 140
【００９０】配列番号：２６
配列の長さ：１３１
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列
Ser Pro Ser Ser Ala Lys Ser Arg Leu Gln Thr Ala Pro Val Pro Met
1 5 10 15
Pro Asp Leu Lys Asn Val Lys Ser Lys Ile Gly Ser Thr Glu Asp Leu
20 25 30
Lys His Gln Pro Gly Gly Gly Lys Val Gln Ile Val Tyr Lys Pro Val
35 40 45
Asp Leu Ser Lys Val Thr Ser Lys Cys Gly Ser Leu Gly Asn Ile His
50 55 60
His Lys Pro Gly Gly Gly Gln Val Glu Val Lys Ser Glu Lys Leu Asp
65 70 75 80
Phe Lys Asp Arg Val Gln Ser Lys Ile Gly Ser Leu Asp Asn Ile Thr
85 90 95
His Val Pro Gly Gly Gly Asn Lys Lys Ile Glu Thr His Lys Leu Thr
100 105 110
Phe Arg Glu Asn Ala Lys Ala Lys Thr Asp His Gly Ala Glu Ile Val
115 120 125
Tyr Lys Ser
130
【００９１】配列番号：２７
配列の長さ：１８
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列
Ser Pro Val Val Ser Gly Asp Thr Ser Pro Arg His Leu Ser Asn Val
1 5 10 15
Ser Ser
【００９２】配列番号：２８
配列の長さ：１０
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列
Ser Pro Val Val Ser Gly Asp Thr Ser Pro
1 5 10
【００９３】配列番号：２９
配列の長さ：１０
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列
Ser Pro Arg His Leu Ser Asn Val Ser Ser
1 5 10
【００９４】配列番号：３０
配列の長さ：６
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
起源
生物名：ウシ
配列
Ala His Pro Trp Thr Lys
1 5
【００９５】配列番号：３１
配列の長さ：２５
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
起源
生物名：ウシ
配列
Val Thr Thr Val Val Ala Thr Pro Gly Gln Gly Pro Asp Arg Pro Gln
1 5 10 15
Glu Val Ser Tyr Thr Asp Xaa Xaa Xaa
20 25
Xaa : 未同定のアミノ酸
【００９６】配列番号：３２
配列の長さ：１４
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
起源
生物名：ウシ
配列
Val Ile Gly Asn Gly Ser Phe Gly Val Val Tyr Gln Ala Lys
1 5 10
【００９７】配列番号：３３
配列の長さ：２１
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
起源
生物名：ウシ
配列
Xaa Thr Leu Pro Val Ile Tyr Val Xaa Xaa Xaa Tyr Gln Xaa Xaa Xaa
1 5 10 15
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
20
Xaa : 未同定のアミノ酸
【００９８】配列番号：３４
配列の長さ：２５
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
起源
生物名：ウシ
配列
Leu Pro Asn Gly Arg Asp Thr Pro Ala Leu Phe Asn Xaa Thr Thr Gln
1 5 10 15
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Pro Xaa Xaa Xaa
20 25
Xaa : 未同定のアミノ酸
【００９９】配列番号：３５
配列の長さ：２９
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
起源
生物名：ウシ
配列
Val Phe Arg Pro Arg Thr Pro Pro Glu Ala Ile Ala Leu Leu Xaa Arg
1 5 10 15
Xaa Leu Glu Tyr Thr Xaa Xaa Ala Xaa Xaa Thr Pro Xaa
20 25
Xaa : 未同定のアミノ酸
【０１００】配列番号：３６
配列の長さ：３０
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
起源
生物名：ウシ
配列
Val Phe Arg Pro Arg Thr Pro Pro Glu Ala Ile Ala Leu Xaa Xaa Xaa
1 5 10 15
Leu Leu Glu Tyr Thr Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
20 25 30
Xaa : 未同定のアミノ酸
【０１０１】配列番号：３７
配列の長さ：２３
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（センスプライマー）
配列
ACN CCN CCN GAG GCN ATH GCN YT 23
N : イノシン H : A or C or T Y : C or T
【０１０２】配列番号：３８
配列の長さ：２０
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（アンチセンスプライマー）
配列
CKN GCN GGN GGN GTR TAY TC 20
N : イノシン Y : T or C R : A or G K : G or T
【０１０３】配列番号：３９
配列の長さ：５６
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸
配列
ACG CCG CCG GAG GCA GTC GCG CTT TGT AGC CGT CTG CTG GAG TAT ACC 48
CCC CCG GC 56
【０１０４】配列番号：４０
配列の長さ：４１
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（アンチセンスプライマー）
配列
CTY CGN TAG CGN GAA ACA TCG GCA GAC GAC CTC ATA TGN GG 41
N : イノシン Y : T or C
【０１０５】配列番号：４１
配列の長さ：１２
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列の特徴
特徴を表す記号：ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ（リン酸化）
存在位置：５
特徴を決定した方法：Ｅ
配列
Ser Ser Pro Gly Ser Pro Gly Thr Pro Gly Ser Arg
1 5 10
【０１０６】配列番号：４２
配列の長さ：１２
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列の特徴
特徴を表す記号：ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ（リン酸化）
存在位置：８
特徴を決定した方法：Ｅ
配列
Ser Ser Pro Gly Ser Pro Gly Thr Pro Gly Ser Arg
1 5 10
【０１０７】配列番号：４３
配列の長さ：１２
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列の特徴
特徴を表す記号：ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ（リン酸化）
存在位置：５，８
特徴を決定した方法：Ｅ
配列
Ser Ser Pro Gly Ser Pro Gly Thr Pro Gly Ser Arg
1 5 10
【０１０８】配列番号：４４
配列の長さ：１２
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列の特徴
特徴を表す記号：ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ（リン酸化）
存在位置：１０
特徴を決定した方法：Ｅ
配列
Lys Ser Pro Val Val Ser Gly Asp Thr Ser Pro Arg
1 5 10
【０１０９】配列番号：４５
配列の長さ：１５
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列
Val Ala Val Val Arg Thr Pro Pro Lys Ser Pro Ser Ser Ala Lys
1 5 10 15
【０１１０】配列番号：４６
配列の長さ：３４
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列
Ser Gly Asp Arg Ser Gly Tyr Ser Ser Pro Gly Ser Pro Gly Thr Pro
1 5 10 15
Gly Ser Arg Ser Arg Thr Pro Ser Leu Pro Thr Pro Pro Thr Arg Glu
20 25 30
Pro Lys
【０１１１】配列番号：４７
配列の長さ：５５
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列
Ala Lys Thr Asp His Gly Ala Glu Ile Val Tyr Lys Ser Pro Val Val
1 5 10 15
Ser Gly Asp Thr Ser Pro Arg His Leu Ser Asn Val Ser Ser Thr Gly
20 25 30
Ser Ile Asp Met Val Asp Ser Pro Gln Leu Ala Thr Leu Ala Asp Glu
35 40 45
Val Ser Ala Ser Leu Ala Lys
50 55
【図１】タウプロテインキナーゼＩの制限酵素地図を表
す図面である。
す図面である。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(72)発明者 今堀 和友
東京都町田市南大谷11号 株式会社三菱
化学生命科学研究所内
(56)参考文献 ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，Ｖｏｌ．289,
Ｎｏ．１（1991），ｐ．37−43
(58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名)
C07K 14/47
C12P 21/02
C12N 9/12
C12Q 1/48
ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (7)
- 【請求項１】 下記の理化学的性質を有するリン酸化酵
素Ｉの作用により、タウ蛋白質またはその部分ペプチド
をリン酸化することを特徴とするタウ蛋白質のリン酸化
方法。 リン酸化酵素Ｉ （ａ）作用：ＡＴＰをリン酸供与体として、タウ蛋白質
中のセリンおよびスレオニンをリン酸化し、タウ蛋白質
１分子あたり４残基以下のリン酸基を導入する。 （ｂ）基質特異性：脳抽出液の蛋白質の中で、微小管付
随蛋白質であるタウ蛋白質およびＭＡＰ２を特異的にリ
ン酸化する。ヒストンをリン酸化しない。α−カゼイン
を少しリン酸化する。配列番号２に記載のアミノ酸配列
の１４１番目のセリン、１７３番目のスレオニン、３０
７番目のセリンおよび３２４番目のセリンから選ばれる
１以上のアミノ酸を特異的にリン酸化する。 （ｃ）至適ｐＨ：チューブリン非存在下での至適ｐＨは
６．５であり、チューブリン存在下での至適ｐＨは６．
０である。 （ｄ）作用適温：３７℃ （ｅ）分子量：０．５Ｍ塩化ナトリウムの存在下でのゲ
ル濾過により求めた測定値は約５万であり、塩化ナトリ
ウム非存在下ではタウ蛋白質と複合体を作り、そのゲル
濾過による測定値は約１０万である。ＳＤＳ−ポリアク
リルアミドゲル電気泳動により求めた測定値は約４万５
千である。 （ｆ）安定性：２５％グリセロールと０．０２％ポリオ
キシエチレンソルビタンモノラウレート中、ｐＨ６．
５、温度−２０℃において少なくとも一年間安定であ
る。 （ｇ）活性化：既知のキナーゼの活性化因子であるｃＡ
ＭＰ、ｃＧＭＰ、Ｃａ2+、カルモジュリンおよびリン脂
質等では活性化されない。チューブリンの重合条件で、
タウ蛋白質のリン酸化が活性化される。 （ｈ）阻害：９０ｍＭのＮａＣｌまたはＫＣｌで活性が
半減する。 - 【請求項２】 リン酸化酵素Ｉの一次構造が、配列表の
配列番号１に記載のアミノ酸配列で表されるか、または
活性を損なわない範囲で１ないし数個のアミノ酸が欠
失、置換、付加された配列で表されることを特徴とする
請求項１記載の方法。 - 【請求項３】 タウ蛋白質またはその部分ペプチドのセ
リンおよび／またはスレオニンが部分的にリン酸化され
ていることを特徴とする請求項１記載の方法。 - 【請求項４】 スプライシングを受けたタウ蛋白質の一
次構造が、配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列で
表されることを特徴とする請求項１記載の方法。 - 【請求項５】 タウ蛋白質の部分ペプチドが、配列表の
配列番号２に記載のアミノ酸配列の１４１番目のセリ
ン、１７３番目のスレオニン、３０７番目のセリンおよ
び３２４番目のセリンから選ばれる１以上のアミノ酸を
含むものであり、かつ１４４番目のセリン、１４７番目
のスレオニン、１７７番目のセリンおよび３１５番目の
セリンから選ばれる１以上のアミノ酸が予めリン酸化さ
れていることを特徴とする請求項１記載の方法。 - 【請求項６】 リン酸化されるタウ蛋白質またはその部
分ペプチドのアミノ酸が、配列表の配列番号２に記載の
アミノ酸配列の１４１番目のセリン、１７３番目のスレ
オニン、３０７番目のセリンおよび３２４番目のセリン
から選ばれる１以上のアミノ酸であることを特徴とする
請求項１に記載の方法。 - 【請求項７】 タウ蛋白質またはその部分ペプチドが、
配列表の配列番号３〜２９に記載のアミノ酸配列を含有
してなることを特徴とする請求項１記載の方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2002129146A JP3407741B2 (ja) | 2002-04-30 | 2002-04-30 | タウ蛋白質のリン酸化方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2002129146A JP3407741B2 (ja) | 2002-04-30 | 2002-04-30 | タウ蛋白質のリン酸化方法 |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP17724192A Division JP3324611B2 (ja) | 1992-07-03 | 1992-07-03 | タウ蛋白質のリン酸化方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2002335983A JP2002335983A (ja) | 2002-11-26 |
| JP3407741B2 true JP3407741B2 (ja) | 2003-05-19 |
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2002129146A Expired - Fee Related JP3407741B2 (ja) | 2002-04-30 | 2002-04-30 | タウ蛋白質のリン酸化方法 |
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-
2002
- 2002-04-30 JP JP2002129146A patent/JP3407741B2/ja not_active Expired - Fee Related
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|---|
| ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，Ｖｏｌ．２８９，Ｎｏ．１（１９９１），ｐ．３７−４３ |
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