EP1009811A2 - Neue gewebsspezifische calpaine, ihre herstellung und verwendung - Google Patents

Neue gewebsspezifische calpaine, ihre herstellung und verwendung

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Publication number
EP1009811A2
EP1009811A2 EP98945265A EP98945265A EP1009811A2 EP 1009811 A2 EP1009811 A2 EP 1009811A2 EP 98945265 A EP98945265 A EP 98945265A EP 98945265 A EP98945265 A EP 98945265A EP 1009811 A2 EP1009811 A2 EP 1009811A2
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EP
European Patent Office
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calpain
leu
capn6
thr
gly
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP98945265A
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English (en)
French (fr)
Inventor
Thomas Boehm
Neil T. Dear
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Abbott GmbH and Co KG
Original Assignee
BASF SE
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Filing date
Publication date
Application filed by BASF SE filed Critical BASF SE
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Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
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    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
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    • C12N9/6472—Cysteine endopeptidases (3.4.22)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
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    • G01N2333/964—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue
    • G01N2333/96425—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue from mammals
    • G01N2333/96427—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue from mammals in general
    • G01N2333/9643—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue from mammals in general with EC number
    • G01N2333/96466—Cysteine endopeptidases (3.4.22)

Definitions

  • the invention relates to new tissue-specific calpains and their production.
  • the invention further relates to methods for screening for new calpain inhibitors and their use.
  • Calpains belong to the intracellular, non-lysosomal enzymes from the group of cysteine proteases. They are involved in the Ca 2+ -dependent signal transduction in eukaryotic cells, ie they regulate cellular functions depending on the Ca 2+ concentration. Calpains occur ubiquitously in animal tissues or cells of, for example, humans, chickens, rabbits or in the rat. Calpains have also been found in lower animals such as Drosophila melanogaster, Schistosoma or Caenorhabditis elegans. No calpains have been found in yeasts, fungi or bacteria.
  • Calpain II mCalpain is only activated by millimolar concentrations of calcium ions.
  • Both Calpaine consist of two subunits, a large subunit with approx. 80 kDa and a small subunit of approx. 30 kDa. Both subunits of the active heterodimer have binding sites for calcium.
  • nCL-1 there is a stomach-specific calpain that can occur in two splicing variants, nCL-2 and nCL-2 '.
  • nCL-2 'differs from nCL-2 by the lack of the calcium-binding region Sorimachi, HS et al., J. Biol. Chem. Vol. 268, No.
  • CalpA calpain-homologous protein
  • Calpaine are believed to play important roles in various physiological processes.
  • a large number of cytoskeletal, membrane-binding or regulatory proteins such as protein kinase C, phospholipase C, spectrin, cytoskeleton proteins such as MAP2, muscle proteins, neurofilaments and neuropeptides, plate proteins, "epidermal growth factor", NMDA receptor and pro Teins involved in mitosis and other proteins are calpain substrates (Barrett MJ et al., Life Sei. 48, 1991: 1659-69, Wang KK et al., Trends in Pharmacol. Sei., 15, 1994: 412 - 419).
  • the normal physiological function of calpaine has not yet been clearly understood. They are involved in a variety of physiological processes such as apoptosis, cell division and differentiation or in embryonic development.
  • Increased calpain levels were measured in various pathophysiological processes and diseases, for example in: ischemia of the heart (e.g. heart attack), the kidney or the central nervous system (e.g. stroke), inflammation, muscle dystrophies, cataracts of the eyes (cataracts), injuries of the central nervous system (e.g. trauma), Alzheimer's disease, HIV-induced neuropathy, Parkinson's and Huntington's diseases, etc. (see Wang KK above). It is suspected that these diseases are related to an increased and persistent intracellular calcium level. As a result, calcium-dependent processes are overactivated and are no longer subject to physiological regulation. Accordingly, overactivation of calpains can also trigger pathophysiological processes.
  • Calpain also plays an important role in restenosis and arthritis, and calpain inhibitors can have a positive effect on the clinical picture (March K: L: et al. Circ. Res. 72, 1993: 413-423, Suzuki K. et al., Biochem
  • the most potent and selective calpain inhibitor is the naturally occurring intracellular protein calpastatin. It inhibits both calpain I and calpain II, but not other cysteine or thiol proteases such as cathepsin B, L or papain.
  • calpastatin which consists of approx. 700 amino acids, has the disadvantage that it is out of the question for therapeutic options due to the size and impassability of the cell membrane.
  • calpastatin which consists of approx. 700 amino acids, has the disadvantage that it is out of the question for therapeutic options due to the size and impassability of the cell membrane.
  • a number of non-peptide inhibitors have been identified. The disadvantage of these inhibitors is that they are unstable, are rapidly metabolized and some are toxic.
  • calpain inhibitors are also characterized by a lack of selectivity, ie they not only inhibit calpain I and II but also other cysteine proteases such as papain, chymotrypsin, elastase or cathepsin B and L. There is therefore still a need for selective, highly effective calpain inhibitors.
  • the screening for these selective, well-effective calpain inhibitors requires highly specific test systems that make it possible to identify selective inhibitors. The screening tests are usually carried out with the ubiquitous Calpainen Calpain I and Calpain II.
  • the invention relates to a new tissue-specific calpaingen with the sequence SEQ ID NO. 1 or SEQ ID NO. 3 and the designation CAPN6, its allelic variants, analogs or derivatives which have a homology of 60 to 100% at the derived amino acid level, the calpaingenes, their allelic variants, analogs or derivatives containing the following sequences:
  • X denotes any natural amino acid in the sequences mentioned.
  • the invention also relates to a method for identifying calpain inhibitors, in which a calpain, its allelic variants or analogs are isolated from tissues or cells and encoded by a sequence according to claim 1, and the inhibition of the cleavage of a substrate of the enzyme CAPN6 and in at least one further test measures the inhibition of the cleavage of a substrate of the enzymes Calpain I and / or II by test substances and selects the test substances which inhibit the enzyme CAPN6 and at least one other of the calpains.
  • the invention furthermore relates to a method for identifying calpain inhibitors, characterized in that the inhibition of the cleavage of a substrate of the enzyme CAPN6 or the calpains I and / or II is determined by test substances in cellular systems and such test substances are selected which select the Cross cell membrane and inhibit the intracellular activity of the enzyme CAPN6 and / or the Calpaine I and / or II, which do not inhibit the enzyme CAPN6, but which inhibit the enzyme Calpain I and / or II or which inhibit the enzyme CAPN6, but not the enzyme Calpain I and / or II. Substances which show an activity in vitro against the calpains without their cell mobility being tested are advantageously selected.
  • the amino acid sequence of the calpain CAPN6 can be found in the sequence SEQ ID NO: 2.
  • the amino acid sequence deduced taking into account an existing intron has a typical calpain signature, although an assignment to the known calpain subfamilies ⁇ Calpain, mCalpain, nCL-1 or nCL-2 is not possible due to the low homology.
  • the Calpain CAPN6 is a new, previously unknown Calpain.
  • the further investigations with this sequence from mice in the EST database also provided 4 human partial sequences (AA169715, C17331, C16980 and T39424) with a homology to the mouse CAPN6 sequence. These partial sequences could be assembled into a continuous sequence which codes for a 374 amino acid protein.
  • the protein sequence derived from the gene sequence SEQ ID N0: 1 shows the greatest homology to the known Caenorhabditis elegans gene tra-3 over the entire amino acid sequence.
  • the homology to the other known calpaines is between 20.9% (rats nCL-2) and 25.4% (mouse mCalpain).
  • Lipman-Pearson Ktupl 2, Gap Penalty 4, Gap Length Penalty 12
  • Both calpains have common properties that distinguish them from the other calpains.
  • CAPN5 and CAPN6 have, besides a shortened domain I, a modified C-terminal end which has no pronounced homology to domain IV of the other calpains.
  • the consensus sequence of the Ca 2 + _ binding site of the calpains lies in the domain IV.
  • This Ca 2+ binding site is missing in the case of CAPN5 and CAPN6, which means that no Ca 2+ may be bound to domain IV and the proteins are activated in another way. They are the only vertebrate calpains that lack the domain IV similar to calmodulin.
  • the amino acids alanine and threonine in positions 122 and 125 of the CAPNl have been changed to serine and alanine in positions 88 and 91 in the CAPN6.
  • the amino acids histidine, alanine, serine and tryptophan in positions 272, 273, 275 and 298 in the CAPNl have also been changed to tyrosine, threonine, threonine and leucine in positions 252, 253, 255 and 286 in the CAPN6.
  • the assignment of the amino acids at the different positions of the proteins CAPN1 and CAPN6 is done by sequence comparison and assignment of the conserved regions of the proteins to one another, so that there is maximum agreement between the proteins at the amino acid level. For example, the same sequences can be localized in different proteins of a protein family at very different sites or positions.
  • the human CAPN6 sequence shows an exchange of the tyrosine in position 254 for histidine (Table 1).
  • a possible explanation could be, for example, that CAPN6 has a changed substrate specificity compared to the other calpains or that the active center is not critical for the CAPN6 function, that it is an inhibitor of other calpains or that CAPN6 is a pseudo gene. This last possibility seems unlikely due to the large number of conserved amino acids.
  • the cysteine residue in position 89 can take over the function of the missing cysteine residue in position 81 in the catalytic reaction. Even if CAPN6 had no protease activity, which is very unlikely, it could be involved in regulatory processes, possibly by competing with other calpains for binding sites on cofactors or substrates.
  • Tra-3 is involved in sex determination of Caenorhabditis elegans. In a cascade of several genes and their gene products, tra-3 also decides whether caenorhabditis males or hermaphrodites develop (Kuwabara P.E. et al., TIG, Vol. 8, No.5, 1992: 164-168). Tra-3 appears to be involved in spermatogenesis.
  • the conservation of the amino acids in the different domains between mouse CAPN6 and tra3 is 39.2%; 42.0%; 30.9% and 22% for domains I, II, III and T.
  • SEQ ID No. 1 encodes a protein with 641 amino acids and a molecular weight of 74.6 kDa.
  • the start codon methionine is preceded by a typical sequence for the translation start.
  • Figure 3 shows the phylogenetic family tree of the different Calpaine.
  • the phylogenetic analyzes for the compilation of this family tree were carried out using the nearest neighboring method (Saitou et al. Mol. Biol. Evol. 4, 1987, 406-425), with the gaps being excluded.
  • the vertebrate calpains could be divided into six different groups ( Figure 3, right side).
  • the CAPN5 and CAPN6 genes each form a separate group of calpains that are more similar to calpaine invertebrates than calpaine vertebrates.
  • the length of the horizontal lines is proportional to the phylogenetic distance of the different calpains.
  • the length of the vertical lines is irrelevant.
  • the sequences used to compile the phylogenetic family tree have the following SWISSPROT and EMBL numbers ("accession numbers"): human m (P17655), ⁇ (P07384), p94 (P20807); Rats m (Q07009), nCL-2 (D14480), p94 (P16259); Mouse p94 (X92523); Chickens m (D38026), ⁇ (D38027), ⁇ / m (P00789), p94 (D38028); Nematodes tra-3 (U12921); Drosophila Calp A (Q11002) and Dm (X78555), Schistosoma (P27730).
  • the human nCL-2 part sequence corresponds to the translation of EST clone AA026030 (Hellier et al., 1995, The Wash U-Merck EST project).
  • the deduced amino acid sequence of the EST clone AA026030 shows 5 a higher than usual homology after this analysis to the rat nCL-2 sequence. Since only a partial sequence was used for the analysis here, the phylogenetic family tree obtained for nCL-2 has a higher inaccuracy.
  • the nematode CPL1 sequence is the corrected version as used by Barnes and Hodjkin 10 (EMBOJ., 1996, 15: 4477-4484).
  • the first 7 exons as can be seen from the EMBL database (Accession No. L25598), were used, while the last 5 exons by connecting nucleotides 8028-8133, 15 8182-8239, 8729-8818, 8865-8983 and 9087 was preserved until the end.
  • the derived N-terminal sequence is unusual for calpains because of its length and its many glycine residues.
  • the new tissue-specific calpain CAPN6 according to the invention is only expressed in the tissue from the placenta (FIG. 4).
  • the human placenta is a rapidly growing and rapidly differentiating organ. It is also called "premalignant tissue” because it is a highly invasive tissue similar to that of malignant tumors. 25
  • Proteases play a central role in the development and differentiation of cells and thus also in the placenta.
  • the placenta is rich in proteases and protease inhibitors, which enable the development of the placenta 30 in a balanced equilibrium.
  • CAPN6 appears to play an important role here as a protease and / or may be involved in the regulation of other calpain cysteine proteases.
  • preeclampsia pregnancy-induced high blood pressure
  • preeclampsia pregnancy-induced high blood pressure
  • preeclampsia pregnancy-induced high blood pressure
  • preeclampsia during pregnancy is an important cause of maternal and child death, premature birth or, in mild cases, malnutrition or growth disorders in the embryo.
  • CAPN6 Another possible function of CAPN6 could be the regulation of the breakdown of somatostatin, glucagon and growth hormone in the placenta and thus influence the growth of the fetus.
  • the breakdown of maternal serum proteins could also be influenced by CAPN6, which also stimulate the growth of the fetus.
  • CAPN6 may take part in the complex process of the placenta mucosa during embryogenesis and thus controls the through e.g. TNF ⁇ and IFN ⁇ induced apoptosis of the trophoblasts by regulating other calpains. CAPN6 appears to be involved in embryonic development.
  • test substances to be tested for their inhibitory activity can be, for example, chemical substances, microbial or plant extracts. They are usually tested in addition to the test for their inhibitory activity towards CAPN6, Calpain I and / or II for their activity against cathepsin B or other thiol proteases.
  • good inhibitors should have little or no activity against cathepsin B, L, elastase, papain, chymotypsin or other cysteine proteases, but should have good activity against calpaines I and II.
  • novel tissue-specific calpain CAPN6 can be used to identify inhibitors with the method according to the invention which, for their inhibitory effect, can discriminate between the different calpaines calpain I, II, nCL-1, nCL-2 and / or nCL-4.
  • the various inhibitor tests were carried out as follows:
  • Cathepsin B inhibition was determined analogously to a method by S. Hasnain et al., J. Biol. Chem. 1993, 268, 235-240.
  • cathepsin B human liver cathepsin B from Calbiochem, diluted to 5 units in 500 ⁇ M buffer
  • an inhibitor solution prepared from the chemical substance to be tested
  • a microbial or vegetable extract and DMSO final concentration: 100 ⁇ M up to 0.01 ⁇ M
  • the activity of the calpain inhibitors was investigated in a colorimetric test with casein according to Hammarsten (Merck, Darmstadt) as the substrate. The test was performed in microtiter plates, according to the publication by Buroker-Kilgore and Wang in Anal. Biochem. 208, 1993, 387-392. Calpain I (0.04 U / test) from erythrocytes and Calpain II (0.2 U / test) from kidneys, both from pigs, from Calbiochem, were used as enzymes. The substances to be tested were with the enzyme for
  • the activity of calpain inhibitors can also be determined with the substrate Suc-Leu-Tyr-AMC. This fluorometric method is described in Zhaozhao Li et al, J. Med. Chem. 1993, 36, 3472-3480.
  • Calpain inhibitors pass through the cell membrane to prevent the breakdown of intracellular proteins by calpain.
  • Calpain mediated protein degradation in platelets has been described by ZhaozhaoLi et al. , J. Med. Chem., 36, 1993, 3472-3480. Human platelets were isolated from fresh sodium citrate blood from donors and adjusted to 10 7 cells / ml in buffer (5 mM Hepes, 140 mM NaCl and 1 mg / ml BSA, pH 7.3).
  • Platelets (0.1 ml) were preincubated for 5 minutes in 1 ⁇ l at various concentrations of potential inhibitors (dissolved in DMSO). This was followed by the addition of calcium ionophore A 23187 (1 ⁇ M in the test) and calcium (5 mM in the test) and a further incubation of 5 minutes at 37 ° C. After a centrifugation step, the platelets were taken up in SDS-Page sample buffer, boiled at 95 ° C. for 5 minutes and the proteins were separated in an 8% gel. The breakdown of the two proteins actin binding protein (- ABP) and talin was monitored by quantitative densitometry. After the addition of calcium and ionophore, these proteins disappeared and new bands of less than 200 Kd molecular weight were formed. From this, the half maximum enzyme activity is determined with or as a control without an inhibitor.
  • - ABP actin binding protein
  • Tissue parts such as brain sections or cell cultures are also suitable for testing membrane permeability.
  • CAPN6 Inhibition of CAPN6 is carried out in cells which express this protein and which can be detected with a specific antibody. Are cells with z. B: Calcium and the corresponding ionophore stimulated, this leads to an activation of CAPN6. Takaomi Saido described in 1992 in J. Biochem. Vol. 11, 81-86 the autolytic transition of ⁇ -calpain after activation and the detection with antibodies. Corresponding antibodies are generated for the detection of CAPN6. Calpain inhibitors prevent autolytic transition and a corresponding quantification is possible with antibodies.
  • calpaint tests known to the person skilled in the art are suitable, such as the test for inhibition of glutamate-induced cell death on cortical neurons (Maulucci-Gedde MA et al., J. Neurosci. 7, 1987: 357-368 ), calcium-mediated cell death in NT2 cells (Squier MKT et al., J. Cell. Physiol., 159, 1994: 229-237, Patel T.
  • the calpain CAPN6 or its animal or human homologue is derived from tissues or cells in which the enzyme is usually or artificially expressed (for example by recombinant expression), such as advantageously the placenta or from cells or microorganisms, which contain at least one gene copy and / or a vector with at least one gene copy of the CAPN6 gene, its allelic variants or analogs, purified and used as a crude extract or as a pure enzyme.
  • the various calpain inhibitor tests are advantageously combined with the test for inhibition of CAPN6 enzyme activity by potential
  • Inhibitors performed. Inhibitors are selected so that they either only inhibit the enzyme CAPN6 and not the other calpains or, conversely, only the other calpains and not the enzyme CAPN6 or the enzyme CAPN6 and at least one other calpain. Inhibitors against CAPN6 can advantageously be used in the case of gestosis.
  • the various inhibitor tests are carried out in such a way that, in addition to the test for the inhibitory effect of the test substance against CAPN6, Calpain I and / or II as a control, the tests are carried out without the test substance. With this test arrangement, the inhibitory effects of the test substances can be easily recognized.
  • Another method according to the invention uses CAPN6 or its allelic variants, analogs or synthetic derivatives advantageously for protection against the enzymatic action of other calpains.
  • Another method according to the invention uses the enzyme CAPN6 for screening for new calpain inhibitors, these inhibitors advantageously advantageously generally all calpains or one can inhibit individual calpains such as calpain I, II, nCL-1, nCL-2 or CAPN6.
  • the various test substances can be tested individually or in parallel in test systems.
  • the test substances are advantageously screened for their inhibitory effect in parallel, automated test systems.
  • All substances are generally suitable for the inhibitor tests.
  • the substances come from classic chemical synthesis, from combinatorics, from microbial, animal or vegetable extracts.
  • Microbial extracts are, for example, fermentation broths, cell disruption of microorganisms or substances after biotransformation. Cell fractions are also suitable for the tests.
  • All prokaryotic or eukaryotic expression systems which are suitable for isolating an enzymatically active gene product are suitable for cloning the CAPN6 gene or its animal homologues or its human homologue, its allelic variants or analogs. Expression systems are preferred which enable expression of the CAPN6 gene sequences in bacterial, fungal or animal cells, very particularly preferably in insect cells.
  • An enzymatically active gene product is to be understood as CAPN6 proteins which, directly after isolation from the expression organism, for example from a prokaryotic or eukaryotic cell, or after renaturation, give an active protein which is capable of at least one known calpain substrate such as those mentioned above or to split itself through auto-catalysis.
  • calpain tests known to the person skilled in the art, such as in vitro tests such as the tests described above for calpain I and II, or cellular tests such as the platelet test, are suitable for determining the enzymatic activity. Tests which are based on a colorimetric assay (Buroker-Kilgore M. et al., Anal. Biochem. 208, 1993: 387-392) or on the basis of a fluorescence assay can be used as the detection possibility.
  • Host organisms include all prokaryotic or eukaryotic organisms that are suitable as host organisms, for example bacteria such as Escherichia coli, Bacillus subtilis, Streptomyces lividans, Streptococcus carnosus, yeasts such as Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, fungi such as Aspergillus niger, insect cells such as Spodoptera frugiperda, Trichoplusia cells or all other insect cells which are suitable for viral expression, or animal cells such as CV12, COS, CV1, COS To understand 3T3 or CHO or human cells.
  • bacteria such as Escherichia coli, Bacillus subtilis, Streptomyces lividans, Streptococcus carnosus
  • yeasts such as Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe
  • fungi such as Aspergillus niger
  • insect cells such
  • Expression systems are to be understood as the combination of the expression organisms mentioned above by way of example and the vectors which match the organisms, such as plasmids, viruses or phages such as the T7 RNA polymerase / promoter system or vectors with regulatory sequences for the phage ⁇ .
  • expression systems should preferably be understood to mean the combination of Escherichia coli and its plasmids and phages or the baculovirus system and the corresponding insect cells such as Spodoptera frugiperda.
  • a further 3 'and / or 5' terminal regulatory sequences are also suitable for the advantageous expression of the CAPN6 gene according to the invention.
  • These regulatory sequences are intended to enable targeted expression of the CAPN6 gene. Depending on the host organism, this can mean, for example, that the gene is only expressed or overexpressed after induction, or that it is expressed and / or overexpressed immediately.
  • the regulatory sequences or factors can preferably positively influence and thereby increase CAPN6 gene expression.
  • the regulatory elements can advantageously be strengthened at the transcription level by using strong transcription signals such as promoters and / or "enhancers".
  • an increase in translation is also possible, for example, by improving the stability of the mRNA.
  • Enhancers are understood to mean, for example, DNA sequences which bring about increased CAPN6 gene expression via an improved interaction between RNA polymerase and DNA.
  • One or more DNA sequences can be connected upstream and / or downstream of the CAPN6 gene with or without an upstream promoter or with or without a regulator gene, so that the gene is contained in a gene structure.
  • the gene expression of the CAPN6 gene can also be increased by increasing the CAPN6 gene copy number.
  • the CAPN6 gene is amplified, for example, in a CHO expression vector.
  • Vectors of the pED series - dicistronic vectors - which also contain the amplifiable marker gene dihydrofolate reductase are also suitable as vectors. Details can be found in the Current Protocols in Molecular Biology Vol 2, 1994.
  • CAPN6 enzyme activity can be increased compared to the parent enzyme, for example, by altering the CAPN6 gene or its animal homologues through classic mutagenesis such as UV radiation or treatment with chemical mutants and / or through targeted mutagenesis such as site directed mutagenesis, deletion ( en), insertion (s) and / or substitution (s).
  • An increase in enzyme activity can be achieved, for example, by changing the catalytic center so that the substrate to be cleaved is converted more quickly.
  • increased enzyme activity can also be achieved by eliminating factors that repress enzyme synthesis and / or by synthesizing active instead of inactive CAPN6 proteins. In this way, increased amounts of enzyme can be made available for the in vitro tests.
  • CAPN6 or its animal homologues or its human homologue can advantageously be derived from genomic DNA or cDNA using, for example, the PCR technique (see Molecular Cloning, Sambrook, Fritsch and Maniatis, Cold Spring Harbor, Laboratory Press, Second Edition 1989, Chapter 14, 1-35, ISBN 0-87969-309-6 and Saiki et al., Science, 1988, vol. 239,
  • CAPN6 can be cloned using genomic DNA and particularly preferably using genomic DNA from mouse cells or human cells.
  • Suitable host organisms for cloning are, for example, all Escherichia coli strains, preferably the Escherichia coli strain DH10B.
  • Suitable vectors for cloning are all vectors which are suitable for expression in Escherichia coli (see Molecular Cloning, Sambrok, Fritsch and Maniatis, Cold Spring Harbor, Laboratory Press, Second Edition 1989, ISBN 0-87969-309-6) .
  • vectors which are derived from pBR or pUC or shuttle vectors are particularly suitable; pBluescript is very particularly suitable.
  • CAPN6 genes with nucleotide sequences are available which code for the amino acid sequence given in SEQ ID NO: 2 or its allele variants.
  • AI- All variants are to be understood as CAPN6 variants which have 60 to 100% homology at the amino acid level, preferably 70 to 100%, very particularly preferably 80 to 100%.
  • Allelic variants comprise, in particular, functional variants which can be obtained by deleting, inserting or substituting nucleotides from the sequence shown in SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3, but the CAPN6 activity is retained and the sequences (a ) Leu-Gly-Asn-Lys-Ala, (b) Ala-X-Ser-Cys-Leu-Ala, (c) Gly-Tyr-Thr- (His or Tyr) -Thr-X-Thr and (d) Arg-X-Arg-Asn-Pro-Leu-Gly as well as in the CAPN6 genes, analogs or derivatives are present.
  • Analogs of CAPN6 include, for example, its animal homologues, shortened sequences, single-stranded DNA or RNA of the coding and non-coding DNA sequence, particularly antisense RNA.
  • Derivatives of CAPN6 are, for example, those derivatives which are not or only difficult to cleave enzymatically, such as the nucleic acid phosphonates or phosphothioates, in which the phosphate group of the nucleic acids has been replaced by a phosphonate or thioate group.
  • the promoter which is connected upstream of the specified nucleotide sequence can also be changed by one or more nucleotide exchanges, by insertion (s) and / or deletion (s), but without the functionality or effectiveness of the promoter being impaired. Furthermore, the effectiveness of the promoter can also be increased by changing its sequence, or it can be completely replaced by more effective promoters of organisms of other species or of synthetic origin.
  • the calpain inhibitors identified by the method according to the invention are suitable for the manufacture of medicaments for the treatment of diseases in the case of calpain malfunctions, for example in diseases selected from the group of cardiovascular, immunological, inflammatory, allergic, neurological, neurodegenerative or oncological diseases such as restenosis, arthritis, ischemia Hearts, the kidney or the central nervous system (e.g. stroke), inflammation, muscular dystrophies, cataracts of the eyes (cataracts), injuries to the central nervous system (e.g. trauma), Alzheimer's disease, HIV-induced neuropathy, Parkinson's and Huntington's disease preferred for production of medicines for the treatment of diseases of the placenta such as gestosis or embryogenesis.
  • the CAPN6 gene sequences according to the invention are advantageously also suitable for diagnosing diseases or for gene therapy.
  • the mouse CAPN6 sequence (EMBL accession number Y12583) was cloned by the RACE method using day 17 mouse embryos and primer sequences derived from the sequence EST AA050030. A plasmid clone containing the corresponding EST sequences was obtained from the I.M.A.G.E consort ⁇ um (Research Genetics Inc.). The human CAPN6 homolog was obtained through a homology search in the EST database using the mouse protein sequence and the tblastn algorithm. The partial sequences found could be combined to form an incomplete sequence of the human CAPN6 with a length of 1083 nucleotides (SEQ ID NO: 3).
  • CAPN6 The expression of the CAPN6 gene in the different tissues was determined with the aid of a 32 P-labeled human cDNA fragment with a human RNA master blot from Clontech, which contains RNA from 50 different tissues. The hybridization and the highly stringent washing conditions were carried out according to the manufacturer's instructions. A 2.2 kb EcoRI / XhoI fragment which contains the EST AA050030 was used as the CAPN6 cDNA fragment for the expression experiments. CAPN6 was only expressed in placenta tissue (see FIG. 4). As a control, the blot was carried out with a human ubiquitin DNA sample in order to determine the RNA loading.
  • the gene was localized in humans using the NIGMS human / rodent somatic cell hybrid "mapping panel" (Coriell Cell Repositories).
  • the following primers were used as primer sequences for the PCR reaction: 5 '-gttgaaactgattggggtctg-3' and 5 '-ctgtcttcccaaggggtttctc-3'.
  • the PCR amplification was carried out at an "annealing" temperature of 58 ° C. and resulted in a 200 bp fragment. The results were examined for correspondence between the presence of human chromosomes and the PCR product.
  • the exact localization of the gene in the human chromosome was carried out with the aid of the "Stanford G3 RH Panel" (Research Genetics) and transmission of the PCR results to the Stanford Human Genome Center localization service (http://www-shgc.stanford.edu).
  • the human CAPN6 gene was found on the X chromosome coupled to the DXS7356 marker.
  • Cathepsin B inhibition was determined analogously to a method by S. Hasnain et al., J. Biol. Chem. 1993, 268, 235-40.
  • the activity of the calpain inhibitors was examined in a colorimetric test with casein according to Hammarsten (Merck, Darmstadt) as substrate. The test was performed in the microtiter plate, according to the publication by Buroker-Kilgore and Wang in Anal. Biochemistry 208, 387-392 (1993).
  • CAPN6 which was expressed in one of the systems described above and subsequently purified, was used as the enzyme. The substances were incubated with the enzyme for 60 minutes at room temperature, a concentration of 1% of the solvent DMSO not being exceeded. After adding the Bio-Rad color reagent, the optical density was measured at 595 nm in the Easy Reader EAR 400 from SLT. The 50% activity of the enzyme results from the optical densities, which were determined at the maximum activity of the enzyme without inhibitors and the activity of the enzyme without the addition of calcium.
  • Calpain-mediated protein degradation in platelets was performed as described by ZhaozhaoLi et al., J. Med. Chem., 1993, 36, 3472-3480. Human platelets were isolated from fresh sodium citrate blood from donors and adjusted to 10 7 cells / ml in buffer (5 mM Hepes, 140 mM NaCl and 1 mg / ml BSA, pH 7.3). Platelets (0.1ml) are mixed for 5 minutes with 1 ⁇ l
  • ABSP actin binding protein
  • the half maximum enzyme activity is determined from this.
  • MOLECULE TYPE DNA (genomic)
  • HYPOTHETICAL NO
  • ANTISENSE NO
  • ORGANISM Mus musculus
  • MOLECULE TYPE DNA (genomic)
  • HYPOTHETICAL NO
  • ANTISENSE NO

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Abstract

Die Erfindung betrifft neue gewebsspezifische Calpaine und ihre Herstellung. Weiterhin betrifft die Erfindung ein Verfahren zum Screening nach neuen Calpaininhibitoren und deren Verwendung.

Description

Neue gewebsspezifische Calpaine, ihre Herstellung und Verwendung
Beschreibung
Die Erfindung betrifft neue gewebsspezifische Calpaine und ihre Herstellung.
Weiterhin betrifft die Erfindung Verfahren zum Screening nach neuen Calpaininhibitoren und deren Verwendung.
Calpaine gehören zu den intrazellulären, nicht-lysosomalen Enzymen aus der Gruppe der Cystein-Proteasen. Sie sind an der Ca2+-abhängigen Signaltransduktion in eukaryontisehen Zellen be- teiligt, d.h. sie regulieren abhängig von der Ca2+ Konzentration zelluläre Funktionen. Calpaine kommen ubiquitär in tierischen Geweben bzw. Zellen von beispielsweise Mensch, Hühnern, Kaninchen oder in der Ratte vor. Auch in niederen Tieren wie beispielsweise in Drosophila melanogaster, Schistosoma oder Caenorhabditis elegans wurden Calpaine gefunden. In Hefen, Pilzen oder Bakterien konnten bisher keine Calpaine nachgewiesen werden.
Bisher sind drei Hauptisoformen dieser ubiquitären Calpaine bekannt, die sich in vitro durch ihre Kalzium-abhängige Aktivier- barkeit unterscheiden. Calpain I ( = μCalpain ) wird durch μ-molare Kalziumion-Konzentrationen aktiviert, während Calpain II (= mCalpain ) erst durch millimolare Konzentrationen an Kalziumionen aktiviert wird. Beide Calpaine bestehen aus zwei Untereinheiten, einer großen Untereinheit mit ca. 80 kDa und einer kleinen Untereinheit von ca. 30 kDa. Beide Untereinheiten des aktiven Heterodimers besitzen Bindungsstellen für Kalzium. Die große Untereinheit wird aus folgenden vier Proteindomänen (= I - IV) aufgebaut: einer Proteasedomäne (= Domäne II) , einer Kalzium-bindenden Domäne (= Domäne IV) und zwei weiterer Domänen (= Domäne I und III) , deren Funktion unklar ist. Die kleine 30 K-Untereinheit besteht aus einer Kalzium-bindenden Untereinheit (= IV ) und einer weiteren Untereinheit (= V) , deren Funktion unklar ist. Zusätzlich zu diesen beiden Calpaintypen wurde ein dritter bezüglich der Kalziumaktivierung intermediärer Typ (= μ/m 80K) im Huhn gefunden (Wang K.K.W, et al . , TiPS, Vol. 15, 1994: 412 - 419, Suzuki, K et al., Biol. Chem. Hoppe-Seyler, Vol. 376, 1995: 523 - 529 ) .
Neben diesen ubiquitär vorkommenden Calpainen wurden in letzter Zeit zwei neue gewebespezifisch exprimierte Calpaine identifiziert. nCL-1 (= p94) ist ein in Hühnern, Ratten und Menschen vorkommendes, Muskel-spezifisches Calpain, das vermutlich als Mono- mer aktiv sein könnte und nur aus der 80 kd Untereinheit besteht. Neben nCL-1 gibt es ein Magen-spezifische Calpain, das in zwei Splicing-Varianten nCL-2 und nCL-2' vorkommen kann. nCL-2' unterscheidet sich gegenüber nCL-2 durch das Fehlen der Kalzium-bin- denden Region (Sorimachi, H.S. et al., J. Biol. Chem. Vol. 268, No. 26, 1993: 19476 - 19482, Sorimachi, H:S: et al . , FEBS Lett. 343, 1994: 1 - 5) . Auch in Drosophila wurde ein Calpain-homologes Protein (= CalpA) , das mit Actin interagiert und vermutliche eine wichtige Rolle in der Embryonalentwicklung spielt, gefunden, daß zwei verschiedene Splicing-Varianten aufweist (Mol. Cell. Biol. Vol. 15, No. 2, 1995: 824 - 834) . Auch hier fehlt der kürzeren Variante die Kalziumbindestelle.
Man vermutet, daß Calpaine bei verschiedenen physiologischen Prozessen eine wichtige Rollen spielen. Eine Vielzahl von cytos- keletalen, membrangebundenden oder regulatorischen Proteinen wie Proteinkinase C, Phospholipase C, Spectrin, Cytoskelett-Proteine wie MAP2, Muskelproteine, Neurofilamente und Neuropeptide, Platt - chenproteine, -"Epidermal Growth Factor"-, NMDA-Rezeptor und Pro- teine, die an der Mitose beteiligt sind, sowie weitere Proteine sind Calpainsubstrate (Barrett M.J. et al . , Life Sei. 48, 1991: 1659 - 69, Wang K.K. et al., Trends in Pharmacol . Sei., 15, 1994: 412 - 419) . Die normale physiologische Funktion der Calpaine ist bis heute jedoch noch nicht klar verstanden. Sie sind bei einer Vielzahl von physiologischen Prozessen wie beispielsweise der Apoptose, der Zellteilung und -differenzierung oder an der Embryonalentwicklung beteiligt.
Bei verschiedenen pathophysiologischen Prozessen und Krankheiten wurden erhöhte Calpain-Spiegel gemessen, zum Beispiel bei: Ischämien des Herzen (z.B. Herzinfarkt), der Niere oder des Zentralnervensystems (z.B. Hirnschlag), Entzündungen, Muskel - dystrophien, Katarakten der Augen (Grauer Star) , Verletzungen des Zentralnervensystems (z.B. Trauma), Alzheimer Krankheit, HIV- induzierte Neuropathy, Parkinsonsche- und Huntingtonsche Krankheit usw. (siehe Wang K.K. oben) . Man vermutet einen Zusammenhang dieser Krankheiten mit einem erhöhten und anhaltenden intrazellulären Kalziumspiegel. Dadurch werden Kalzium-abhängige Prozesse überaktiviert und unterliegen nicht mehr der physiologischen Regelung. Dementsprechend kann eine Überaktivierung von Calpainen auch pathophysiologische Prozesse auslösen.
Daher wurde postuliert, daß Inhibitoren der Calpain-Enzyme für die Behandlung dieser Krankheiten nützlich sein können. Ver- schiedene Untersuchungen bestätigten dies. So haben Seung-Chyul Hong et al . (Stroke 1994, 25 (3), 663 - 669) und Bartus R.T. et al. (Neurological Res . 1995, 17, 249 - 258) eine neuroprotektive Wirkung von Calpaininhibitoren bei akuten neurodegenerativen Störungen, wie sie nach Hirnschlag auftreten, gezeigt. Ebenso verbesserten nach experimentellen Gehirntraumata Calpaininhibitoren die Erholung der auftretenden Gedächtnisleistungsdefizite 5 und neuromotorischen Störungen (Saatman K.E. et al . , Proc . Natl. Acad. Sei. USA, 93, 1996: 3428 - 3433). Edelstein C.L. et al . (Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 92, 1995, 7662 - 7666) fand eine protektive Wirkung von Calpaininhibitoren auf durch Hypoxie geschädigten Nieren. Yoshida K.I. et al . (Jap. Circ. J. 59 (1),
10 1995, 40 - 48) konnten günstige Effekte von Calpaininhibitoren nach cardialen Schädigungen aufzeigen, die durch Ischämie oder Reperfusion erzeugt wurden. Da Calpaininhibitoren die Freisetzung von ß-AP4-Protein hemmen, wurde eine potentielle Anwendung als Therapeutikum der Alzheimer Krankheit vorgeschlagen (Higaki
15 J. et al., Neuron, 14, 1995: 651 - 659). Die Freisetzung von Interleukin-lα wird ebenfalls durch Calpaininhibitoren gehemmt (Watanabe N. et al . , Cytokine, 6 (6), 1994: 597 - 601). Weiterhin wurde gefunden, daß Calpaininhibitoren cytotoxische Effekte an Tumorzellen zeigen (Shiba E. et al . , 20th Meeting Int. Ass.
20 Breast Cancer Res . , Sendai Jp, 1994, 25. - 28. Sept., Int. J. Onco. 5 (Suppl.), 1994, 381). Auch bei der Restenose und bei Arthritis spielt Calpain eine wichtige Rolle und Calpaininhibitoren können das Krankheitsbild positiv beeinflussen (March K:L: et al. Circ. Res. 72, 1993: 413 - 423, Suzuki K. et al . , Biochem
25 J. , 285, 1992: 857 - 862) .
Weitere mögliche Anwendungen von Calpaininhibitoren sind Wang K.K (Trends in Pharmacol . Sei., 15, 1994: 412 - 419) zu entnehmen.
30 Der potenteste und selektivste Calpaininhibitor ist das natürlich vorkommende intrazelluläre Protein Calpastatin. Es hemmt sowohl Calpain I als auch Calpain II, nicht jedoch andere Cystein- bzw. Thiolproteasen wie Cathepsin B, L oder Papain. Das aus ca. 700 Aminosäuren bestehende Calpastatin hat jedoch den Nachteil, 5 daß es für therapeutische Möglichkeiten aufgrund der Größe und der Unpassierbarkeit der Zellmembran nicht in Frage kommt. Neben niedermolekularen peptidischen Calpaininhibitoren wurden eine Reihe nicht-peptidischer Inhibitoren identifiziert. Nachteil dieser Inhibitoren ist, daß sie instabil sind, rasch metaboli- 0 siert werden und zum Teil toxisch sind. Viele Calpaininhibitoren zeichnen sich außerdem durch eine mangelnde Selektivität aus, d.h. sie hemmen nicht nur Calpain I und II sondern auch andere Cysteinproteasen wie Papain, Chymotrypsin, Elastase oder Cathepsin B und L. Es besteht daher nach wie vor ein Bedarf nach selektiven, hoch wirksamen Calpaininhibitoren. Für das Screening nach diesen selektiven, gut wirksamen Calpaininhibitoren sind hochspezifische Testsysteme erforderlich, die es ermöglichen selektive Inhibito- ren zu identifizieren. Üblicherweise werden die Screeningtests mit den ubiquitär vorkommenden Calpainen Calpain I und Calpain II durchgeführt .
Für das Auffinden selektiver Inhibitoren ist es notwendig und wünschenswert weitere Calpaine zur Testung zur Verfügung zu stellen, die möglichst gewebespezifisch exprimiert werden, so daß die Inhibitoren auf ihre Selektivität zwischen den einzelnen Calpainen geprüft werden können.
Darüber hinaus sind weitere neue Calpaine gesuchte Proteine, da sie mit hoher Wahrscheinlichkeit bei den verschiedenen Krankheitsbildern bzw. Krankheiten unterschiedlich exprimiert werden und eine wichtige Rolle bei diesen Krankheiten spielen.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es, Mittel zur Profilierung und Identifizierung von Calpaininhibitoren zur Verfügung zu stellen, die es ermöglichen Calpaininhibitoren zu identifizieren, die einerseits nur gegenüber einem Calpain inhibierende Wirkung aufweisen, und/oder anderseits gegenüber mehreren Calpainen inhibierende Wirkung aufweisen und diese als therapeutisches Target zur Verfügung zu stellen.
Gegenstand der Erfindung ist ein neues gewebsspezifisches Calpaingen mit der Sequenz SEQ ID NO. 1 oder SEQ ID NO. 3 und der Bezeichnung CAPN6 , seine allelischen Varianten, Analoge oder Derivate, die auf der abgeleiteten Aminosäureebene eine Homologie von 60 bis 100 % aufweisen, wobei die Calpaingene, ihre allelischen Varianten, Analoge oder Derivate folgende Sequenzen enthalten:
(a) Leu-Gly-Asn-Lys-Ala, wobei sich diese Sequenz von der entsprechenden Sequenz im humanen Calpain I dadurch unterscheidet, daß die Aminosäure Cystein im humanen Calpain I, die die Position 115 im Calpain I besitzt, gegen Lysin, das an Position 81 der Sequenzen SEQ ID No. 1 und SEQ ID No. 3 liegt, verändert ist;
(b) Ala-X-Ser-Cys-Leu-Ala, wobei gegenüber der entsprechenden Sequenz im humanen Calpain I die Aminosäuren Alanin und Threonin in den Positionen 122 und 125 gegen Serin und Alanin in den Positionen 88 und 91 in den Sequenzen SEQ ID No . 1 und SEQ ID No . 3 verändert sind; ( c ) Gly-Tyr-Thr- (His oder Tyr) -Thr-X-Thr , wobei gegenüber der entsprechenden Sequenz im humanen Calpain I die Aminosäuren Histidin, Alanin und Serin in den Positionen 272, 273 und 275 gegen Tyrosin, Threonin und Threonin in den Positionen 252, 253 und 255 in den Sequenzen SEQ ID No . 1 und SEQ ID No. 3 verändert sind und in der SEQ ID No. 3 zusätzlich der Tyrosinrest in Position 274 im Calpain I gegen Histidin in Position 254 in der SEQ ID No . 3 verändert ist;
(d) Arg-X-Arg-Asn-Pro-Leu-Gly wobei sich diese Sequenz von der entsprechenden Sequenz im humanen Calpain I dadurch unterscheidet, daß die Aminosäure Tryptophan im humanen Calpain I, die die Position 298 im Calpain I besitzt, gegen Leucin, das an Position 286 der Sequenzen SEQ ID No. 1 und SEQ ID No . 3 liegt, verändert ist und
X in den genannten Sequenzen eine beliebige natürliche Aminosäure bedeutet.
Gegenstand der Erfindung ist auch ein Verfahren zur Identifizierung von Calpaininhibitoren, wobei man ein Calpain, seine allelischen Varianten oder Analoge codiert durch eine Sequenz gemäß Anspruch 1 aus Geweben oder Zellen isoliert und die Inhibierung der Spaltung eines Substrats des Enzyms CAPN6 und in mindestens einem weiteren Test die Inhibierung der Spaltung eines Substrats der Enzyme Calpain I und/oder II durch Testsubstanzen mißt und die Testsubstanzen auswählt, die das Enzym CAPN6 und mindestens ein weiteres der Calpaine hemmen.
Weiterhin ist Gegenstand der Erfindung ein Verfahren zur Identifizierung von Calpaininhibitoren, dadurch gekennzeichnet, daß man die Inhibierung der Spaltung eines Substrates des Enzyms CAPN6 bzw. der Calpaine I und/oder II durch Testsubstanzen in zellu- lären Systemen bestimmt und solche Testsubstanzen auswählt, die die Zellmembran passieren und die intrazelluläre Aktivität des Enzyms CAPN6 und/oder der Calpaine I und/oder II hemmen, die das Enzym CAPN6 nicht hemmen, jedoch die Enzyme Calpain I und/oder II oder die das Enzym CAPN6 hemmen, nicht jedoch die Enzyme Calpain I und/oder II. Auch Substanzen, die eine Aktivität in vitro gegenüber den Calpainen zeigen, ohne daß ihre Zellgängigkeit getestet wurden, werden vorteilhafterweise ausgewählt. Zeigt sich in einem anschließenden Assay, das diese Substanzen nicht oder nur schlecht zellgängig sind, so kann durch Derivatisierung ihre Zellpermeabilität verbessert werden. Humane μ- und m-Calpainproteinsequenzen wurden für eine Homologiesuche in der EST-Datenbank des National Center for Bio- technology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) unter Verwendung des BLAST Verfahrensprogramms verwendet . Es wurde eine Sequenz mit der Bezeichnung EST AA050030 gefunden, die eine für Calpaine typische Sequenz aufweist. Mit Hilfe dieser Sequenz ließ sich ein Klon aus der Maus darstellen, der für ein Gen kodiert, dessen erfindungsgemäße Genprodukt als neues Calpain die Bezeichnung CAPN6 (= nCL-4) erhielt. Die Nucleinsäuresequenz des Klons nCL-4 ist Sequenz SEQ ID NO: 1 zu entnehmen. Die abgeleitete
Aminosäuresequenz des Calpains CAPN6 ist der Sequenz SEQ ID NO: 2 zu entnehmen. Die unter Berücksichtigung eines vorhandenen Introns deduzierte Aminosäuresequenz weist eine typische Calpain- signatur auf, wobei eine Zuordnung zu den bekannten Calpain-Sub- familien μCalpain, mCalpain, nCL-1 oder nCL-2 aufgrund der geringen Homologie nicht möglich ist. Es handelt sich bei dem Calpain CAPN6 um ein neues bisher unbekanntes Calpain. Die weiteren Untersuchungen mit dieser Sequenz aus Mäusen in der EST-Datenbank lieferte darüberhinaus noch 4 humane Teilsequenzen (AA169715, C17331, C16980 und T39424) mit einer Homology zur Maus CAPN6- Sequenz. Diese Teilsequenzen konnten zu einer fortlaufenden Sequenz, die für ein 374 Aminosäuren langes Protein kodiert, zusammengesetzt werden. Dieser Sequenz fehlt sowohl das typische Startcodon für Methionin als auch das Stopcodon. Bei dieser Sequenz handelt es sich deshalb wohl nur um eine Teilsequenz des humanen Orthologue zur klonierten Maussequenz. Die Homologie beider Sequenzen über die 374 Aminosäuren liegt bei 94,9 % (Figur 1) .
Die von der Gensequenz SEQ ID N0:1 abgeleitete Proteinsequenz zeigt mit 30 % Homologie die größte Homologie zum bekannten Caenorhabditis elegans Gen tra-3 über die gesamte Aminosäure - sequenz. Die Homologie zu den anderen bekannten Calpainen liegt zwischen 20,9 % (Ratten nCL-2) bis zu 25,4 % (Maus mCalpain) . In einem Sequenzvergleich nach Lipman-Pearson (Ktupl 2, Gap Penalty 4, Gap Length Penalty 12) zwischen CAPN6 und humanen CAPN1 (= CAN1_HUMAN, Aoki et al . , FEBS Lett. 205, 1986: 313 - 317), humanen CAPN2 (= CAN2_HUMAN, Aoki et al., Biochemistry 27, 1988: 8122 - 8128), Ratten-CAPN2 (= CAN2_RAT, Deluca et al . , Biochim. Biophys. Acta 1216, 1993: 81 - 93), humanen CAPN3 (= CAN3_HUMAN, Richard et al . , Cell 81, 27 - 40) Ratten-CAPN3 (= CAN3_RAT, Sorimachi et al . , J. Biol. Chem. 264, 1989: 20106 - 20111) und Drosophila Calpain (= DMCLPN0CM_1) über Teilsequenzen von 230 - 520 Aminosäuren wurden leicht größere Homologien von 32.8 bis 39,5 % gefunden, die aber insgesamt geringer als die Homologien zu tra-3 liegen (Figur 1, Alignment, Clustal method with PAM25 residue weight tabl . ) . Neben tra-3 weist CAPN6 eine ausgeprägte Homologie zum kürzlich beschriebenen CAPN5 -Calpain auf (44,2 %
Homologie Aktenzeichen P 19 718 248.8).
Sequenzvergleiche zwischen der Maus und humanen CAPN6-Sequenz in verschiedensten Datenbanken ergaben Homologien zu CalpA, Tra-3 und humanen Sequenzen mit den Bezeichnungen C16980, T39424, AA16971, R93331 und G17331 über deren Funktionen keine Angaben gemacht wurden. Die Sequenzvergleiche wurden mit der Genbank EST- und Datenbanken am National Center for Biotechnology Information (http: Hwww.ncbi .nlm.nih.yor) und der Wash-U-Datenbank durchgeführt (Homo sapiens) . In den Datenbanken wurde außerdem eine Maus EST-Sequenz mit der Bezeichnung AA050030 und der Bezeichnung als Calpain gefunden. Weitere Angaben konnten den Datenbanken nicht entnommen werden. Die vollständigen Gensequenzen von AA16971T, R93331, C17331 und AA050030 sind unbekannt.
Beide Calpaine (CAPN5 und CAPN6) weisen gemeinsame Eigenschaften auf, die sie von den anderen Calpainen unterscheiden. CAPN5 und CAPN6 weisen im Vergleich zu den anderen Calpainen neben einer verkürzten Domäne I ein verändertes C-terminales Ende auf, das keine ausgeprägte Homologie zur Domäne IV der anderen Calpaine hat. Im Bereich der Domäne IV liegt die Konsensussequenz der Ca2+_Bindungsstelle der Calpaine (sog. "EF-hand"). Diese Ca2+_ Bindungsstelle fehlt im Falle von CAPN5 und CAPN6 , daß heißt möglicherweise wird kein Ca2+ an der Domäne IV gebunden und die Proteine werden auf anderem Wege aktiviert. Sie sind damit die einzigen Vertebraten-Calpaine, denen die Calmodulin ähnliche Domäne IV fehlt.
Die abgeleitete CAPN6 -Aminosäuresequenz besitzt als weitere Besonderheit ein verändertes katalytisches Zentrum. Nur der Asn-Rest in Position 284 ist konserviert. Der Cysteinrest in Position 81 und der Histidinrest in Position 252 wurden jeweils gegen Lysin bzw. Tyrosin in der Maus CAPN6-Sequenz ausgetauscht. Darüberhinaus wurden weitere ausgetauschte Aminosäuren beim Vergleich der CAPN6 Sequenzen SEQ ID No. 1 und SEQ ID No. 3 mit dem humanen Calpain I (= CAPNl, Aoki et al . , FEBS Lett. 205, 1986: 313 -317) im Bereich des katalytischen Zentrums identifiziert. So sind die Aminosäuren Alanin und Threonin in den Positionen 122 und 125 des CAPNl gegen Serin und Alanin in den Positionen 88 und 91 im CAPN6 verändert. Ebenfalls verändert sind die Aminosäuren Histidin, Alanin, Serin und Tryptophan in den Positionen 272, 273, 275 und 298 im CAPNl zu Tyrosin, Threonin, Threonin und Leucin in den Positionen 252, 253, 255 und 286 im CAPN6. Die Zuordnung der Aminosäuren an den verschiedenen Positionen der Proteine CAPNl und CAPN6 erfolgt durch Sequenzvergleich und Zuordnung der konservierten Regionen der Proteine zueinander, so daß eine maximale Übereinstimmung zwischen den Proteinen auf Aminosäureebene erfolgt. So können beispielsweise dieselben Sequenzen in unterschiedlichen Proteinen einer Proteinfamilie an sehr unterschiedlichen Stellen bzw. Positionen lokalisiert wer- den.
Die humane CAPN6- Sequenz weist zusätzlich zum Austausch des Cysteinrestes einen Austausch des Tyrosins in Position 254 gegen Histidin auf (Tabelle 1) . Eine mögliche Erklärung könnte beispielsweise sein, daß CAPN6 eine gegenüber den anderen Calpainen geänderte Substratspezifität hat oder das aktive Zentrum nicht kritisch für die CAPN6- Funktion ist, daß es ein Hemmstoff anderer Calpaine ist oder daß CAPN6 ein Pseudo.gen ist. Diese letzte Möglichkeit scheint aufgrund der Vielzahl der konservier - ten Aminosäuren unwahrscheinlich zu sein. Wahrscheinlich kann der Cysteinrest in Position 89 in der Katalysereaktion die Funktion des fehlenden Cysteinrestes in Position 81 übernehmen. Selbst wenn CAPN6 keine Proteaseaktivität hätte, was sehr unwahrscheinlich ist, so könnte es an regulatorischen Prozessen beteiligt sein, möglicherweise indem es mit anderen Calpainen um Bindungs- plätze an Cofaktoren oder Substraten konkurriert.
Tabelle 1: CAPN6 genomische Sequenzen
* Aminosäuren des aktiven Zentrums (Arthur et al., FEBS Lett. 368, 1995: 397 - 400) 1 niedrige Aktivität ohne Leucin in m-Calpain (Arthur et al . , FEBS Lett. 368, 1995: 397 - 400)
Tra-3 ist an der Geschlechtsbestimmung von Caenorhabditis elegans beteiligt. In einer Kaskade von mehreren Genen und deren Genprodukten entscheidet tra-3 mit darüber, ob sich Caenorhabditis Männchen oder Hermaphroditen entwickeln (Kuwabara P.E. et al., TIG, Vol. 8, No.5, 1992: 164 - 168). Tra-3 scheint an der Sper- matogenese beteiligt zu sein. Die Konservierung der Aminosäuren in den verschiedenen Domänen zwischen Maus CAPN6 und tra3 beträgt 39,2 %; 42,0 %; 30,9 % und 22 % jeweils für die Domänen I, II, III und T.
Ausgehend von aus (Ia) 17 Mausembryo mRNA abgeleiteten cDNA konnte mit Hilfe einer modifizierten RACE-Methode (= rapid ampli- fication of cDNA ends) nach Frohman et al . (Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85, 1988, 8998 - 9002) bzw. Edwards et al . (Nucl. Acids
Res. 19, 1991, 5227 - 5232) unter Verwendung der oben genannten
Primer (Cal6 und Cal9) sowie Sequenzen, die sich vom EST AA050030 ableiten, die Gesamtsequenz des Klones CAPN6 kloniert werden. Die
SEQ ID No. 1 kodiert für ein Protein mit 641 Aminosäuren und einem Molekulargewicht von 74,6 kDa. Dem Startcodon Methionin ist eine typische Sequenz für den Translationsstart vorgelagert. Die
Richtigkeit der Sequenz wurde durch Sequenzierung mehrerer cDNA-
Klone mit der genannten Sequenz bestätigt.
Figur 2 gibt die Homologien zwischen Maus CAPN5 (= nCL-3), human CAPN5 (= nCL-3) , Maus CAPN6 (= nCL-4) und humanen CAPN6 (= nCL-4) wieder. Figur 2 zeigt außerdem die Sequenzen von Caenorhabditis tra-3, humanen p94, Maus m-Calpain, humanen μ-Calpain und Ratten nCL-2. Aminosäuren, die zwischen den verschiedenen Calpainen und CAPN6 übereinstimmen sind durch dunkle Kästchen gekennzeichnet. Striche deuten Lücken an, die um eine maximale Übereinstimmung der Sequenzen zu erreichen, eingeführt wurden. Aus der humanen p94 -Sequenz wurden zwei Sequenzen der Übersichtlichkeit wegen entfernt. Diese Bereiche wurden mit = gekennzeichnet. Die konservierten Aminosäuren des katalytischen Zentrums wurden mit Pfeilen markiert. Die CAL6 und CAL9 entsprechenden Aminosäure -Sequenzen wurden unterstrichen. Die Domänenbezeichnungen wurden über den relevanten Sequenzsegmenten angegeben.
Figur 3 gibt den phylogenetischen Stammbaum der verschiedenen Calpaine wieder. Die phylogenetischen Analysen zur Aufstellung dieses Stammbaums wurden unter Verwendung der nächsten Nachbar-Methode (Saitou et al . Mol. Biol. Evol . 4, 1987, 406 - 425) unter Ausschluß der Lücken durchgeführt. Mit Hilfe dieser phylogenetischen Analysen konnten die Vertebraten-Calpaine in sechs verschiedene Gruppen aufgeteilt werden (Figur 3, rechte Seite). Die Nicht-Vertebraten-Calpaine lassen sich der CAPN5- (= nCL-3-) und CAPN6- (= nCL - 4 -) Gruppe als nächste Nachbarn zuordnen und stehen in einer eigenen Gruppe. Die CAPN5 und CAPN6 Gene bilden damit je eine eigene Gruppe von Calpainen, die eine größere Ähnlichkeit zu Invertebraten Calpaine haben als zu Vertebraten Calpaine. Die Länge der horizontalen Linien ist proportional zur phylogenetischen Entfernung der verschiedenen Calpaine. Die Länge der vertikalen Linien ist ohne Bedeutung. Die für die Aufstellung des phylogenetischen Stammbaums verwendeten Sequenzen haben die folgenden SWISSPROT- und EMBL-Nummern ("accession numbers"): Mensch m (P17655) , μ (P07384) , p94 (P20807) ; Ratten m (Q07009), nCL-2 (D14480), p94 (P16259); Maus p94 (X92523); Hühner m (D38026) , μ (D38027), μ/m (P00789), p94 (D38028); Nematoden tra-3 (U12921) ; Drosophila Calp A (Q11002) und Dm (X78555) , Schistosoma (P27730) . Die humane nCL- 2 -Teilsequenz entspricht der Tranlation des EST-Klon AA026030 (Hellier et al . , 1995, The Wash U-Merck EST-Projekt) .
-Die abgeleitete Aminosäuresequenz des EST-Klon AA026030 weist 5 eine höhere als übliche Homologie nach dieser Analyse zur Ratten nCL-2 -Sequenz auf. Da hier nur eine Teilsequenz für die Analyse verwendet wurde, hat der für nCL-2 erhaltene phylogenetische Stammbaum eine höhere Ungenauigkeit . Die Nematoden CPL1- Sequenz ist die korrigierte Version wie sie von Barnes und Hodjkin 10 (EMBOJ., 1996, 15:4477-4484) verwendet wurde .
Die ersten 7 Exons wurden, wie sie aus der EMBL- Datenbank (Accession No . L25598) zu entnehmen sind, verwendet, während die letzten 5 Exons durch Verbindung der Nucleotide 8028-8133, 15 8182-8239, 8729-8818, 8865-8983 und 9087 bis zum Ende erhalten wurde. Die abgeleitete N-terminale Sequenz ist aufgrund ihrer Länge und ihrer vielen Glycinreste für Calpaine ungewöhnlich.
Das erfindungsgemäße neue gewebsspezifische Calpain CAPN6 wird 20 nur im Gewebe aus der Placenta exprimiert (Figur 4) . Die menschliche Placenta ist ein rasch wachsendes und sich schnell aus- differenzierendes Organ. Sie wird deshalb auch als "premalignes Gewebe" bezeichnet, da sie ein hochinvasives Gewebe ähnlich dem von malignen Tumoren ist. 25
Proteasen spielen ein zentrale Rolle bei der Entwicklung und Differenzierung von Zellen und damit auch in der Plazenta. Die Plazenta ist reich an Proteasen und Proteaseinhibitoren, die in einem ausgewogenen Gleichgewicht die Entwicklung der Plazenta 30 ermöglichen. CAPN6 scheint hier eine wichtige Rolle als Protease zu spielen und/oder ist möglicherweise an der Regulation anderer Calpain-Cystein-Proteasen beteiligt .
Dort spielt es möglicherweise bei Krankheitsprozessen der 35 Placenta wie der Gestose (= Präeklampsie) eine Rolle, die in 5 bis 7 % aller Schwangerschaften auftritt. Präeklampsie (= schwangerschaftsinduzierter Bluthochdruck) ist eine der häufigsten schwangerschaftsbedingten Komplikationen, charakterisiert durch Hypertonie und Proteinurie, häufig kombiniert 40 mit exzessiven Ödemen und unter Umständen mit Krampfanfällen. Präeklampsie während der Schwangerschaft ist eine wichtige Ursache für den Tod von Mutter und Kind, von Frühgeburten oder in leichteren Fällen von Unterernährung oder WachstumsStörungen des Embryos. Es handelt sich um ein multifaktorielles Geschehen 45 an dem beispielsweise genetische Faktoren (rezessive oder dominante Gene) , die mütterliche Immuntoleranz, Vasodilator/ Vasoconstriktorungleichgewichte und vermutlich auch CAPN6 beteiligt ist.
Frauen, die an Präeklampsie erkrankt sind, zeigen einen veränder- ten Vasopressinase- und Angiotensinasespiegel, der möglicherweise durch CAPN6 regulativ beeinflußt wird.
Eine weitere mögliche Funktion von CAPN6 könnte die Regulation des Abbaus von Somatostatin, Glucagon und Wachstumshormon in der Placenta sein und damit das Wachstum des Foetus beeinflussen.
Auch der Abbau von mütterlichem Serumproteinen könnte durch CAPN6 beeinflußt werden, die ebenfalls das Wachstum des Foetus stimulieren.
Möglicherweise nimmt CAPN6 am komplexen Geschehen der Plazenta - Schleimhaut während der Embryogenese teil und steuert so die durch z.B. TNFα und IFNγ induzierte Apoptose der Trophoblasten, in dem es andere Calpaine reguliert. CAPN6 scheint damit an der Embryonalentwicklung beteiligt zu sein.
Für die Identifizierung von selektiven Calpaininhibitoren sind möglichst spezifische Verfahren zur Identifizierung der Inhibitoren erforderlich. Wichtig dabei ist, daß die selektierten Inhibitoren nur das gewünschte oder die gewünschten Calpaine hemmen, nicht jedoch andere Cystein-Proteasen und damit in physiologische Prozesse eingreifen.
Die auf ihre inhibitorische Aktivität hin zu prüfenden Test- substanzen können beispielsweise chemische Substanzen, mikro- bielle oder pflanzliche Extrakte sein. Sie werden üblicherweise neben den Test auf ihre Inhibitoraktivität gegenüber CAPN6, Calpain I und/oder II auf ihre Aktivität gegenüber Cathepsin B oder andere Thiolproteasen getestet.
Idealerweise sollten gute Inhibitoren keine oder nur geringe Aktivität gegenüber Cathepsin B, L, Elastase, Papain, Chymo- trypsin oder andere Cystein-Proteasen aufweisen, aber eine gute Aktivität gegenüber den Calpainen I und II aufweisen.
Durch das erfindungsgemäße neue gewebsspezifische Calpain CAPN6 können mit den erfindungsgemäßen Verfahren Inhibitoren identifiziert werden, die zu ihrer inhibitorischen Wirkung zwischen den verschiedenen Calpainen Calpain I, II, nCL-1 nCL-2 und/oder nCL-4 diskriminieren können. Die verschiedenen Inhibitortests wurden dabei wie folgt durchgeführt:
Cathepsin B-Test
Die Cathepsin B-Hemmung wurde analog einer Methode von S. Hasnain et al., J. Biol. Chem. 1993, 268, 235 - 240 bestimmt.
Zu 88 μl Cathepsin B (Cathepsin B aus menschlicher Leber von der Firma Calbiochem, verdünnt auf 5 Units in 500μM Puffer) werden 2 μl einer Inhibitorlösung, hergestellt aus der zu testenden chemischen Substanz, einem mikrobiellen oder pflanzlichen Extrakt und DMSO (Endkonzentration: 100 μM bis 0,01 μM) zugegeben. Dieser Ansatz wird für 60 Minuten bei Raumtemperatur (= 25 °C) vor- inkubiert und anschließend die Reaktion durch Zugabe von 10 μl 10 mM Z-Arg-Arg-pNA (in Puffer mit 10 % DMSO) gestartet. Die Reaktion wird 30 Minuten bei 405 nm im Mikrotiterplattenreader verfolgt. Aus den maximalen Steigungen werden anschließend die IC5o's bestimmt.
Calpain I und II-Test
Die Aktivität der Calpaininhibitoren wurde in einem colori- metrischen Test mit Casein nach Hammarsten (Merck, Darmstadt) als Substrat untersucht. Der Test wurde in Mikrotiterplatten, entsprechend der Veröffentlichung von Buroker-Kilgore und Wang in Anal. Biochem. 208, 1993, 387 - 392, durchgeführt. Als Enzyme wurde Calpain I (0,04 U/Test) aus Erythrozyten und Calpain II (0,2 U/Test) aus Nieren, beide vom Schwein, der Firma Calbiochem, benutzt. Die zu testenden Substanzen wurden mit dem Enzym für
60 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert, wobei eine Konzentration von 1 % des Lösungsmittels DMSO nicht überschritten wurde. Nach Zugabe des Bio-Rad Farbreagenz erfolgte die Messung der optischen Dichte bei 595 nm in dem Easy Reader EAR 400 der Firma SLT. Die 50 %ige Aktivität des Enzyms ergibt sich aus den optischen Dichten, die bei der maximalen Aktivität des Enzyms ohne Inhibitoren und der Aktivität des Enzyms ohne Zugabe von Kalzium bestimmt wurden.
Die Aktivität von Calpaininhibitoren kann ferner mit dem Substrat Suc-Leu-Tyr-AMC bestimmt werden. Diese fluorimetrische Methode ist bei Zhaozhao Li et al , J. Med. Chem. 1993, 36, 3472-3480 beschrieben.
Da Calpaine intrazelluläre Cysteinproteasen sind, müssen
Calpaininhibitoren die Zellmembran passieren, um den Abbau von intrazellulären Proteinen durch Calpain zu verhindern. Einige bekannte Calpaininhibitoren, wie zum Beispiel E 64 und Leupeptin, überwinden die Zellmembranen nur schlecht und zeigen dementsprechend, obwohl sie gute Calpaininhibitoren darstellen nur schlechte Wirkung an Zellen. Es ist deshalb vorteilhaft einen zusätzlichen Test für die Membrangängigkeit von potentiellen Calpaininhibitoren wie den humanen Plättchentest durchzuführen.
Plättchen-Test zur Bestimmung der zellulären Aktivität von Calpaininhibitoren
Der Calpain vermittelte Abbau von Proteinen in Plättchen wurde, wie von ZhaozhaoLi et al . , J. Med. Chem., 36, 1993, 3472- 3480 beschrieben, durchgeführt. Humane Plättchen wurden aus frischem Natrium-Citrat-Blut von Spendern isoliert und in Puffer ( 5 mM Hepes, 140 mM NaCl und 1 mg/ml BSA, pH 7,3) auf 107 Zellen/ml eingestellt.
Plättchen (0,1 ml) wurden für 5 Minuten in 1 μl an verschiedenen Konzentrationen an potentiellen Inhibitoren (gelöst in DMSO) vor- inkubiert. Danach erfolgte die Zugabe von Kalziumionophor A 23187 (1 μM im Test) und Kalzium (5 mM im Test) und eine weitere Inkubation von 5 Minuten bei 37 °C. Nach einem Zentrifugations - schritt wurden die Plättchen in SDS-Page Probenpuffer aufgenommen, 5 Minuten bei 95 °C gekocht und die Proteine in einem 8%igen Gel aufgetrennt. Der Abbau der beiden Proteine Actin bindendes Protein (- ABP) und Talin wurde durch quantitative Densitometrie verfolgt. Nach der Zugabe von Kalzium und Ionophor verschwanden diese Proteine und es entstanden neue Banden von kleiner 200 Kd Molekulargewicht. Daraus wird die halb maximale Enzymaktivität mit oder als Kontrolle ohne Inhibitor bestimmt.
Ebenfalls geeignet für die Testung der Membrangängigkeit sind Gewebsteile wie Gehirnschnitte oder Zellkulturen.
Test auf Hemmung gegenüber CAPN6 wird in Zellen durchgeführt, die dieses Protein exprimieren und sich dieses mit einem spezifischen Antikörper nachweisen läßt. Werden Zellen mit z. B: Kalzium und dem entsprechenden Ionophor stimuliert, führt dies zu einer Aktivierung von CAPN6. Takaomi Saido beschrieb 1992 im J. Bio- chem. Vol. 11, 81-86 die autolytische Transition von μ-Calpain nach Aktivierung und der Nachweis mit Antikörpern. Entsprechende Antikörper werden für den Nachweis von CAPN6 erzeugt. Calpaininhibitoren verhindern die autolytische Transition und eine entsprechende Quantifizierung ist mit Antikörpern möglich. Neben den beschriebenen in vitro Tests sowie dem zellulären Plättchentest eignen sich alle weiteren dem Fachmann bekannten Calpaintests wie der Test auf Hemmung des Glutamat induzierten Zelltods an corticalen Neuronen (Maulucci-Gedde M.A. et al . , J. Neurosci. 7, 1987: 357 - 368), der Kalzium-vermittelte Zelltod in NT2-Zellen (Squier M.K.T. et al . , J. Cell. Physiol., 159, 1994: 229 - 237, Patel T. et al . , Faseb Journal 590, 1996: 587 - 597) oder die Analyse in Gewebsproben nach Abbauprodukten von Proteinen wie Spectrin, MAP2 oder Tau (Ami Arai et al . , Brain Research, 1991, 555, 276 - 280, James Brorson et al . , Stroke, 1995, 26, 1259 - 1267) .
Für die in vitro-Tests von CAPN6 wird das Calpain CAPN6 oder seine tierischen oder sein humanes Homologes aus Geweben oder Zellen in denen das Enzym üblicherweise oder artifiziell (z.B. durch rekombinante Expression) exprimiert wird wie vorteilhafter - weise das Placenta oder aus Zellen oder Mikroorganismen, die mindestens eine Genkopie und/oder einen Vektor mit mindestens einer Genkopie des CAPN6-Gens, seiner allelischen Varianten oder Analoge enthalten, aufgereinigt und als Rohextrakt oder als reines Enzym verwendet.
Für die erfindungsgemäßen Verfahren werden die verschiedenen Calpaininhibitortests vorteilhafterweise in Kombination mit dem Test auf Hemmung der CAPN6-Enzymaktivi ät durch potentielle
Inhibitoren durchgeführt. Dabei werden Inhibitoren so ausgewählt, daß sie entweder nur das Enzym CAPN6 hemmen und nicht die anderen Calpaine oder umgedreht nur die anderen Calpaine und nicht das Enzym CAPN6 oder das Enzym CAPN6 und mindestens ein weiteres Calpain. Inhibitoren gegen CAPN6 können vorteilhafterweise im Falle von Gestose verwendet werden.
Die verschiedenen Inhibitortests werden dabei so ausgeführt, das neben dem Test auf die inhibierende Wirkung der Testsubstanz gegenüber CAPN6, Calpain I und/oder II als Kontrolle die Tests ohne die Testsubstanz durchgeführt wird. Durch diese Testanordnung lassen sich einfach die inhibitorischen Wirkungen der Test- substanzen erkennen.
Ein weiteres erfindungsgemäßes Verfahren verwendet CAPN6 oder dessen allelische Varianten, Analoge oder synthetischen Derivate vorteilhafterweise zum Schutz vor der enzymatischen Wirkung anderer Calpaine.
Ein weiteres erfindungsgemäßes Verfahren verwendet das Enzym CAPN6 zum Screening nach neuen Calpaininhibitoren, wobei diese Inhibitoren vorteilhafterweise generell alle Calpaine oder ein- zelne Calpaine wie Calpain I, II, nCL-1, nCL-2 oder CAPN6 hemmen können. Die verschiedenen Testsubstanzen können dabei einzeln oder parallel in Testsystemen getestet werden. Vorteilhafterweise werden die Testsubstanzen in parallelen, automatisierten Test- Systemen auf ihre inhibitorische Wirkung hin gescreent.
Für die Inhibitortests sind generell alle Substanzen geeignet. So stammen die Substanzen beispielsweise aus der klassischen chemischen Synthese, aus der Kombinatorik, aus mikrobiellen, tierischen oder pflanzlichen Extrakten. Unter mikrobiellen Extrakten sind beispielsweise Fermentationsbrühen, Zellaufschlüsse von Mikroorganismen oder Substanzen nach Biotransformation zu verstehen. Auch Zellfraktionen sind für die Tests geeignet.
Für die Klonierung des CAPN6-Gens oder seiner tierischen Homologen oder seines humanen Homologen, seiner allelischen Varianten oder Analogen eignen sich alle prokaryontischen oder eukaryonti- schen Expressionssysteme, die zur Isolierung eines enzymatisch aktiven Genprodukts geeignet sind. Bevorzugt werden Expressions - Systeme, die eine Expression der CAPN6-Gensequenzen in bakteriellen, pilzlichen oder tierischen Zellen ganz besonders bevorzugt in Insektenzellen ermöglicht. Unter enzymatisch aktivem Genprodukt sind CAPN6-Proteine zu verstehen, die direkt nach Isolierung aus dem Expressionsorganismus wie beispielsweise aus einer pro- karyotischen oder eukaryotischen Zelle oder nach Renaturierung ein aktives Protein ergeben, das in der Lage ist mindestens ein bekanntes Calpainsubstrat wie die oben genannten oder über Auto- katalyse sich selbst zu spalten.
Für die Bestimmung der enzymatischen Aktivität sind alle dem Fachmann bekannten Calpaintests wie in vitro-Tests wie die oben beschriebenen Tests für Calpain I und II oder zelluläre Tests wie der Plättchentest geeignet. Dabei können als Detektionsmöglich- keit Tests verwendet werden, die auf Basis eines colorimetrischen Assays (Buroker-Kilgore M. et al., Anal. Biochem. 208, 1993: 387 - 392) oder auf Basis eines Fluoreszenz-Assays beruhen.
Außerdem sind auch alle Teilsequenzen, die das katalytische Zentrum des CAPN6 Gens und/oder weitere Sequenzen des CAPN6 Gens und/oder andere Calpaingensequenzen und/oder andere Sequenzen enthalten und enzymatische Aktivität zeigen, unter enzymatisch aktivem Genprodukt von CAPN6 zu verstehen.
Unter Wirtsorganismen sind alle prokaryotischen oder eukaryon- tischen Organismen, die als Wirtsorganismen geeignet sind, beispielsweise Bakterien wie Escherichia coli, Bacillus subtilis, Streptomyces lividans, Streptococcus carnosus, Hefen wie Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Pilze wie Aspergillus niger, Insektenzellen wie Spodoptera frugiperda, Trichoplusia-Zellen oder alle anderen Insektenzellen, die für eine virale Expression geeignet sind, oder tierische Zellen wie CV1, COS, C127, 3T3 oder CHO oder humane Zellen zu verstehen.
Unter Expressionssysteme sind die Kombination aus den oben beispielhaft genannten Expressionsorganismen und den zu den Organismen passenden Vektoren wie Plasmide, Viren oder Phagen wie das T7 RNA Polymerase/Promoter System oder Vektoren mit regulatorischen Sequenzen für den Phagen λ zu verstehen.
Bevorzugt sind unter dem Begriff Expressionssysteme die Kombina- tion aus Escherichia coli und seinen Plasmiden und Phagen oder das Baculovirus-System und die entsprechenden Insektenzellen wie Spodoptera frugiperda zu verstehen.
Für die vorteilhafte erfindungsgemäße Expression des CAPN6-Gens sind außerdem weitere 3' und/oder 5' Terminale regulatorische Sequenzen geeignet.
Diese regulatorischen Sequenzen sollen die gezielte Expression des CAPN6 Gens ermöglichen. Dies kann beispielsweise je nach Wirtsorganismus bedeuten, daß das Gen erst nach Induktion exprimiert oder überexprimiert wird, oder daß es sofort exprimiert und/oder überexprimiert wird.
Die regulatorischen Sequenzen bzw. Faktoren können dabei Vorzugs - weise die CAPN6 Genexpression positiv beeinflussen und dadurch erhöhen. So kann eine Verstärkung der regulatorischen Elemente vorteilhafterweise auf der Transkriptionsebene erfolgen, indem starke Transkriptionssignale wie Promotoren und/oder "Enhancer" verwendet werden. Daneben ist aber auch eine Verstärkung der Translation möglich, indem beispielsweise die Stabilität der mRNA verbessert wird.
Unter "Enhancer" sind beispielsweise DNA-Sequenzen zu verstehen, die über eine verbesserte Wechselwirkung zwischen RNA-Polymerase und DNA eine erhöhte CAPN6-Genexpression bewirken.
Dem CAPN6-Gen mit oder ohne vorgeschaltetem Promotor bzw. mit oder ohne Regulatorgen können ein oder mehrere DNA-Sequenzen vor- und/oder nachgeschaltet sein, so daß das Gen in einer Genstruktur enthalten ist. Die Genexpression des CAPN6-Gens läßt sich darüber hinaus auch durch Erhöhen der CAPN6-Genkopienzahl erhöhen. Zur Erhöhung der Genkopienzahl wird das CAPN6-Gen beispielsweise in einem CHO- Expressionsvektor amplifiziert . Als Vektoren eignen sich auch Vektoren der pED-Reihe - dicistronische Vektoren -, die auch das amplifizierbare Markergen Dihydrofolat Reduktase enthalten. Details können den Current Protocols in Molecular Biology Vol 2, 1994 entnommen werden.
Eine Steigerung der CAPN6-Enzymaktivität läßt sich zum Beispiel gegenüber dem Ausgangsenzym durch Veränderung des CAPN6-Gens oder seiner tierischen Homologen durch klassische Mutagenese wie UV- Bestrahlung oder Behandlung mit chemischen Mut.agentien und/oder durch gezielte Mutagenese wie site directed mutagenesis, Deletion (en) , Insertion (en) und/oder Substitution (en) erzielen. Eine Erhöhung der Enzymaktivität kann beispielsweise erreicht werden, indem das katalytische Zentrum so verändert wird, daß das zu spaltende Substrat rascher umgesetzt wird. Auch kann eine erhöhte Enzymaktivität neben der beschriebenen Genamplifikation durch Ausschaltung von Faktoren, die die Enzymbiosynthese reprimieren und/oder durch Synthese aktiver statt inaktiver CAPN6-Proteine erreicht werden. Auf diesem Weg können erhöhte Enzymmengen für die in vitro-Tests zur Verfügung gestellt werden.
CAPN6 oder seine tierischen Homologen oder sein humanes Homolog lassen sich vorteilhafterweise ausgehend von genomischer DNA oder cDNA unter Verwendung beispielsweise der PCR-Technik (siehe Molekular Cloning, Sambrook, Fritsch and Maniatis, Cold Spring Harbor, Laboratory Press, Second Edition 1989, Kapitel 14, 1 - 35, ISBN 0-87969-309-6 und Saiki et al., Science, 1988, Vol. 239,
487ff) klonieren, bevorzugt läßt sich CAPN6 unter Verwendung von genomischer DNA und besonders bevorzugt unter Verwendung von genomischer DNA aus Mauszellen oder humanen Zellen klonieren.
Als Wirtsorganismus für die Klonierung eignen sich beispielsweise alle Escherichia coli-Stämme, bevorzugt der Escherichia coli Stamm DH10B. Als Vektoren für die Klonierung sind alle Vektoren geeignet, die für die Expression in Escherichia coli geeignet sind (siehe Molecular Cloning, Sambrok, Fritsch and Maniatis, Cold Spring Harbor, Laboratory Press, Second Edition 1989, ISBN 0-87969-309-6) . Besonders geeignet sind beispielsweise Vektoren, die sich von pBR oder pUC ableiten oder shuttle-Vektoren, ganz besonders geeignet ist pBluescript.
Nach Isolierung und Sequenzierung sind CAPN6-Gene mit Nukleotid- sequenzen erhältlich, die für die in SEQ ID NO: 2 angegebene Aminosäuresequenz oder deren Allelvarianten kodieren. Unter AI- lelvarianten sind CAPN6-Varianten zu verstehen, die 60 bis 100 % Homologie auf Aminosäureebene, bevorzugt 70 bis 100 %, ganz besonders bevorzugt 80 bis 100 % aufweisen. Allelvarianten umfassen _ insbesondere funktionelle Varianten, die durch Deletion, Inser- tion oder Substitution von Nukleotiden aus der in SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 3 dargestellten Sequenz erhältlich sind, wobei die CAPN6-Aktivität aber erhalten bleibt und die Sequenzen (a) Leu-Gly-Asn-Lys-Ala, (b) Ala-X-Ser-Cys-Leu-Ala, (c) Gly-Tyr- Thr-(His oder Tyr) -Thr-X-Thr und (d) Arg-X-Arg-Asn-Pro-Leu-Gly wie auch in den CAPN6-Genen, Analogen oder Derivaten vorhanden sind.
Unter Analoge von CAPN6 sind beispielsweise seine tierischen Homologen, verkürzte Sequenzen, Einzelstrang-DNA oder RNA der codierenden und nichtcodierenden DNA-Sequenz besonders antisense RNA zu verstehen.
Derivate von CAPN6 sind beispielsweise solche Derivate, die enzymatisch nicht oder nur schwer spaltbar sind wie die Nucleinsäure- phosphonate oder -phosphothioate, bei denen die Phospatgruppe der Nucleinsäuren gegen eine Phosphonat- bzw Thioatgruppe ersetzt wurde .
Auch der Promotor, der der angegebenen Nukleotidsequenz vor- geschalten ist, kann durch ein oder mehrere Nukleotidaustausche, durch Insertion (en) und/oder Deletion (en) verändert sein, ohne daß aber die Funktionalität bzw. Wirksamkeit des Promotors beeinträchtigt ist. Des weiteren kann der Promotor auch durch Veränderung seiner Sequenz in seiner Wirksamkeit erhöht oder komplett durch wirksamere Promotoren auch artfremder Organismen oder synthetischen Ursprungs ausgetauscht werden.
Die nach den erfindungsgemäßen Verfahren identifizierten Calpaininhibitoren eignen sich zur Herstellung von Medikamenten zur Behandlung von Krankheiten bei Calpainfehlfunktionen beispielsweise bei Krankheiten ausgewählt aus der Gruppe der kardiovaskulären, immunologischen, entzündlichen, allergischen, neurologischen, neurodegenerativen, oder onkologischen Erkrankungen wie beispielsweise Restenose, Arthritis, Ischämien des Herzen, der Niere oder des Zentralnervensystems (z.B. Hirnschlag), Entzündungen, Muskeldystrophien, Katarakten der Augen (Grauer Star) , Verletzungen des Zentralnervensystems (z.B. Trauma), Alzheimer Krankheit, HlV-induzierte Neuropathy, Parkinsonsche- und Hunting- tonsche Krankheit bevorzugt zur Herstellung von Medikamenten zur Behandlung von Krankheiten der Plazenta wie z.B. Gestose oder der Embryogenese . Die erfindungsgemäßen CAPN6-Gensequenzen eignen sich vorteilhafterweise auch zur Diagnose von Krankheiten oder zur Gentherapie.
Beispiele
Beispiel 1: Klonierung des CAPN6-Gens
Die Maus CAPN6 Sequenz (EMBL accession number Y12583) wurde mit der RACE Methode unter Verwendung von Tag 17 Mäuseembryonen und Primersequenzen, die von der Sequenz EST AA050030 abgeleitet wurden, cloniert. Ein Plasmidklon, der die entsprechenden EST- Sequenzen enthielt wurde vom I.M.A.G.E consortάum (Research Genetics Inc.) erhalten. Das humane CAPN6-Homologe wurde über eine Homologierecherche in der EST-Datenbank unter Verwendung der Mausproteinsequenz und des tblastn-Algorithmus erhalten. Die gefundenen Teilsequenzen konnten zu einer unvollständigen Sequenz des humanen CAPN6 mit einer Länge von 1083 Nukleotiden zusammengefügt werden (SEQ ID NO: 3) .
Beispiel 2: Expression des CAPN6-Gens in verschiedenen Geweben
Die Expression des CAPN6-Gens in den verschiedenen Geweben wurden mit Hilfe eines 32 P-markierten humane cDNA- Fragments mit einem humanen RNA Master Blot der Firma Clontech, welcher RNA 50 verschiedener Gewebe enthält, ermittelt. Die Hybridisierung und die hochstringenten Waschbedingungen wurden entsprechend den Vorschriften des Herstellers durchgeführt. Als CAPN6 cDNA-Fragment wurde eine 2,2 kb EcoRI/XhoI- Fragment, das das EST AA050030 beinhaltet für die Expressionsexperimente verwendet. CAPN6 wurde nur in Gewebe aus der Placenta exprimiert (siehe Figur 4) . Als Kontrolle wurde der Blot mit einer humanen Ubiquitin DNA Probe, um die RNA Beladung zu ermitteln, durchgeführt.
3. Beispiel: Lokalisierung des CAPN6 Gens auf dem Chromosom
Die Lokalisierung des Gens im Mensch erfolgte mit Hilfe des NIGMS Mensch/Nager somatischen Zellhybrid "mapping panel" (Coriell Cell Repositories) . Als Primer-Sequenzen für die PCR-Reaktion wurden folgende Primer verwendet : 5' -gttgaaactgattggggtctg-3 ' und 5 ' -ctgtcttcccaaggggtttctc-3 ' . Die PCR-Amplification wurde mit einer "Annealing" -Temperatur von 58 °C durchgeführt und führte zu einem 200 bp Fragment. Die Ergebnisse wurden auf Übereinstimmung zwischen der Anwesenheit von menschlichen Chromosomen und dem PCR-Produkt untersucht. Die genaue Lokalisierung des Gens im menschlichen Chromosom erfolgte mit Hilfe des "Stanford G3 RH Panel" (Research Genetics) und Übermittelung der PCR-Ergebnisse an den Lokalisierungsservice des Stanford Human Genome Center (http://www-shgc.stanford.edu) . Das Mensch CAPN6-Gen wurde auf dem X-Chromosom gekoppelt mit dem Marker DXS7356 gefunden.
4. Beispiel: Cathepsin B-Test
Die Cathepsin B-Hemmung wurde analog einer Methode von S. Hasnain et al., J. Biol. Chem. 1993, 268, 235-40 bestimmt.
Zu 88μL Cathepsin B (Cathepsin B aus menschlicher Leber
(Calbiochem) , verdünnt auf 5 Units in 500 μM Puffer) werden 2 μL einer Inhibitor-Lösung, hergestellt aus Inhibitor und DMSO (Endkonzentrationen: 100 μM bis 0,01 μM) . Dieser Ansatz wird für 60 Minuten bei Raumtemperatur (25°C) vorinkubiert und anschließend die Reaktion durch Zugabe von 10 μL lOmM Z-Arg-Arg-pNA (in Puffer mit 10 % DMSO) gestartet. Die Reaktion wird 30 Minuten bei 405 nm im Mikrotiterplattenreader verfolgt. Aus den maximalen Steigungen werden anschließend die IC50 bestimmt.
5. Beispiel: Calpain-Test
Die Aktivität der Calpain Inhibitoren wurde in einem colorimetrischen Test mit Casein nach Hammarsten (Merck, Darmstadt) als Substrat untersucht. Der Test wurde in der Mikrotiterplatte, entsprechend der Veröffentlichung von Buroker-Kilgore und Wang in Anal. Biochemistry 208, 387-392 (1993), durchgeführt. Als Enzym wurde CAPN6 , welches in einem der oben beschriebenen Systemen exprimiert und anschließend gereinigt wurde, verwendet. Die Substanzen wurden mit dem Enzym für 60 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert, wobei eine Konzentration von 1% des Lösungsmittels DMSO nicht überschritten wurde. Nach Zugabe des Bio-Rad Farb- reagenz erfolgte die Messung der optischen Dichte bei 595 nm in dem Easy Reader EAR 400 der Firma SLT. Die 50%ige Aktivität des Enzyms ergibt sich aus den optischen Dichten, die bei der maxi- malen Aktivität des Enzyms ohne Inhibitoren und der Aktivität des Enzyms ohne Zugabe von Kalzium bestimmt wurden.
6. Beispiel: Plättchen-Test zur Bestimmung der zellulären Aktivität von Calpain-Inhibitoren
Der Calpain-vermittelte Abbau von Proteinen in Plättchen wurde, wie von ZhaozhaoLi et al., J. Med. Chem., 1993, 36, 3472-3480 beschrieben, durchgeführt. Humane Plättchen wurden aus frischem Natrium-Citrat-Blut von Spendern isoliert und in Puffer (5 mM Hepes, 140 mM NaCl und 1 mg/ml BSA, pH 7,3) auf 107 Zellen/ml eingestellt. Plättchen (0,1ml) werden für 5 Minuten mit 1 μl an verschiedenen
Konzentrationen an Inhibitoren (gelöst in DMSO) vorinkubiert .
Danach erfolgte die Zugabe von Kalziumionophor A 23187 (1 μM im
Test) und Kalzium (5 mM im Test) und eine weitere Inkubation von 5 Minuten bei 37°C. Nach einem Zentrifugationsschritt wurden die
Plättchen in SDS-Page Probenpuffer aufgenommen, 5 Minuten bei 95°C gekocht und die Proteine in einem 8% igen Gel aufgetrennt. Der
Abbau der beiden Proteine Actin bindendes Protein (ABP) und Talin wurde durch quantitative Densitometrie verfolgt, da nach der Zugabe von Kalzium und Ionophor diese Proteine verschwanden und eine neue Bande im Bereich von 200 Kd Molekulargewicht entstand.
Daraus wird die halb maximale Enzymaktivität bestimmt.
SEQUENZPROTOKOLL
(1) ALGEMEINE INFORMATION:
( i ) ANMELDER :
(A) NAME: BASF Aktiengesellschaft
(B) STRASSE: Carl Bosch Strasse
(C) ORT: Ludwigshafen
(D) BUNDESLAND: Rheinland-Pfalz
(E) LAND : Germany
(F) POSTLEITZAHL: D-67056
(ii) ANMELDETITEL: Neue gewebsspezifische Calpaine, ihre Herstellung und Verwendung
(iii) ANZAHL DER SEQUENZEN: 4
(iv) COMPUTER-LESBARE FORM:
(A) DATENTRÄGER: Floppy disk
(B) COMPUTER: IBM PC compatible
(C) BETRIEBSSYSTEM: PC-DOS/MS-DOS
(D) SOFTWARE: Patentin Release #1.0, Version #1.25 (EPA)
(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 1:
(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 2069 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNS (genomisch) (iii) HYPOTHETISCH: NEIN (iii) ANTISENSE: NEIN
(vi) URSPRÜNLICHE HERKUNFT:
(A) ORGANISMUS: Mus musculus
(vii) UNMITTELBARE HERKUNFT:
(B) CLON: CAPN6
(ix) MERKMALE:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: 5 ' UTR
(B) LAGE: 1..129
(ix) MERKMALE:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: CDS
(B) LAGE: 130..2055 ( ix) MERKMALE :
(A) NAME/SCHLÜSSEL: 3 'UTR
(B) LAGE: 2056..2069
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO : 1:
GGGGTTACCT GGCTAAGAGC AGCAGCAGCA GCAGCAGCAG CAGCAGCAGT AGCAGCAGCA 60
GCAGCAGCAG CAGCAGCAGC AGCAGCAGCA GCAGGGTTCC TGAGCTAACT CAGACCTAGT 120
TTGATAGCA ATG GGT CCT CCT CTG AAG CTC TTC AAA AAC CAG AAG TAC 168
Met Gly Pro Pro Leu Lys Leu Phe Lys Asn Gin Lys Tyr 1 5 10
CAA GAA CTG AAG CAG GAG TGC ATG AAG GAT GGC CGC CTT TTC TGT GAC 216 Gin Glu Leu Lys Gin Glu Cys Met Lys Asp Gly Arg Leu Phe Cys Asp 15 20 25
CCA ACC TTC CTA CCG GAG AAT GAT TCT CTG TTT TTC AAC CGG CTG CTT 264 Pro Thr Phe Leu Pro Glu Asn Asp Ser Leu Phe Phe Asn Arg Leu Leu 30 35 40 45
CCT GGG AAG GTG GTG TGG AAG CGT CCA CAG GAC ATT TCT GAT GAC CCC 312 Pro Gly Lys Val Val Trp Lys Arg Pro Gin Asp Ile Ser Asp Asp Pro
50 55 60
CAC CTG ATT GTG GGC AAC ATC AGC AAC CAC CAG CTG ATC CAG GGC AGA 360 His Leu Ile Val Gly Asn Ile Ser Asn His Gin Leu Ile Gin Gly Arg 65 70 75
TTG GGG AAC AAG GCA ATG ATC TCT GCA TTT TCC TGT TTG GCT GTT CAG 408 Leu Gly Asn Lys Ala Met Ile Ser Ala Phe Ser Cys Leu Ala Val Gin 80 85 90
GAG TCA CAC TGG ACA AAG GCA ATT CCC AAC CAC AAG GAT CAG GAA TGG 456 Glu Ser His Trp Thr Lys Ala Ile Pro Asn His Lys Asp Gin Glu Trp 95 100 105
GAT CCT CGA AAG CCA GAG AAA TAC GCT GGA ATC TTT CAC TTC CGC TTC 504 Asp Pro Arg Lys Pro Glu Lys Tyr Ala Gly Ile Phe His Phe Arg Phe 110 115 120 125
TGG CAT TTT GGA GAA TGG ACC GAG GTG GTG ATT GAT GAC TTG CTT CCC 552 Trp His Phe Gly Glu Trp Thr Glu Val Val Ile Asp Asp Leu Leu Pro 130 135 140
ACC ATC AAC GGA GAT CTG GTC TTC TCA TTC TCC ACC TCC ATG AAT GAG 600 Thr Ile Asn Gly Asp Leu Val Phe Ser Phe Ser Thr Ser Met Asn Glu 145 150 155
TTT TGG AAT GCT CTA CTG GAA AAA GCG TAT GCA AAG CTG CTG GGC TGT 648 Phe Trp Asn Ala Leu Leu Glu Lys Ala Tyr Ala Lys Leu Leu Gly Cys 160 165 170 TAT GAG GCT TTG GAT GGT CTG ACC ATC ACT GAT ATC ATC ATG GAC TTC 696
Tyr Glu Ala Leu Asp Gly Leu Thr Ile Thr Asp Ile Ile Met Asp Phe
175 180 185
ACT GGC ACA CTG GCT GAA ATC ATT GAC ATG CAG AAA GGA CGA TAC ACT 744 Thr Gly Thr Leu Ala Glu Ile Ile Asp Met Gin Lys Gly Arg Tyr Thr 190 195 200 205
GAT CTT GTT GAG GAG AAG TAC AAG CTG TTT GGA GAA CTG TAC AAA ACG 792 Asp Leu Val Glu Glu Lys Tyr Lys Leu Phe Gly Glu Leu Tyr Lys Thr 210 215 220
TTC ACC AAA GGA GGT CTA ATT TGC TGC TCC ATT GAG TCT CCC AGC CAG 840 Phe Thr Lys Gly Gly Leu Ile Cys Cys Ser Ile Glu Ser Pro Ser Gin 225 230 ' 235
GAG GAA CAA GAA GTT GAA ACA GAC TGG GGA CTA CTG AAG GGT TAT ACC 888 Glu Glu Gin Glu Val Glu Thr Asp Trp Gly Leu Leu Lys Gly Tyr Thr 240 245 250
TAC ACC ATG ACT GAT ATT CGC AAG CTC CGT CTC GGA GAA AGA CTT GTG 936 Tyr Thr Met Thr Asp Ile Arg Lys Leu Arg Leu Gly Glu Arg Leu Val 255 260 265
GAA GTC TTC AGT ACT GAG AAG CTG TAT ATG GTT CGC CTA AGG AAC CCA 984 Glu Val Phe Ser Thr Glu Lys Leu Tyr Met Val Arg Leu Arg Asn Pro 270 275 280 285
TTG GGA AGA CAG GAA TGG AGT GGC CCC TGG AGT GAA ATT TCA GAG GAG 1032 Leu Gly Arg Gin Glu Trp Ser Gly Pro Trp Ser Glu Ile Ser Glu Glu 290 295 300
TGG CAG CAA CTG ACT GTA ACA GAT CGC AAG AAC CTA GGA CTT GTT ATG 1080 Trp Gin Gin Leu Thr Val Thr Asp Arg Lys Asn Leu Gly Leu Val Met 305 310 315
TCT GAT GAT GGA GAA TTT TGG ATG AGT CTG GAA GAT TTT TGC CAC AAC 1128 Ser Asp Asp Gly Glu Phe Trp Met Ser Leu Glu Asp Phe Cys His Asn 320 325 330
TTT CAC AAA CTG AAT GTC TGC CGC AAT GTG AAT AAT CCT GTT TTT GGC 1176 Phe His Lys Leu Asn Val Cys Arg Asn Val Asn Asn Pro Val Phe Gly 335 340 345
CGC AAG GAG CTG GAA TCA GTG GTG GGA TGT TGG ACT GTG GAT GAT GAC 1224 Arg Lys Glu Leu Glu Ser Val Val Gly Cys Trp Thr Val Asp Asp Asp 350 355 360 365
CCT CTG ATG AAC CGA TCA GGA GGT TGC TAT AAC AAC CGT GAT ACC TTC 1272 Pro Leu Met Asn Arg Ser Gly Gly Cys Tyr Asn Asn Arg Asp Thr Phe 370 375 380 TTG CAG AAT CCT CAG TAC ATT TTC ACT GTG CCC GAG GAT GGC CAT AAA 1320
Leu Gin Asn Pro Gin Tyr Ile Phe Thr Val Pro Glu Asp Gly His Lys
385 390 395
GTC ATC ATG TCA CTG CAA CAG AAG GAC CTA CGC ACT TAC CGC CGA ATG 1368 Val Ile Met Ser Leu Gin Gin Lys Asp Leu Arg Thr Tyr Arg Arg Met 400 405 410
GGA AGA CCT GAT AAT TAC ATC ATT GGT TTT GAG CTC TTC AAG GTG GAG 1416 Gly Arg Pro Asp Asn Tyr Ile Ile Gly Phe Glu Leu Phe Lys Val Glu 415 420 425
ATG AAC CGA AGG TTC CGT CTT CAC CAT CTG TAT ATT CAG GAG CGT GCT 1464 Met Asn Arg Arg Phe Arg Leu His His Leu Tyr Ile Gin Glu Arg Ala 430 435 440 ' 445
GGG ACT TCC ACT TAT ATC GAC ACC CGT ACT GTG TTT CTG AGC AAG TAT 1512 Gly Thr Ser Thr Tyr Ile Asp Thr Arg Thr Val Phe Leu Ser Lys Tyr 450 455 460
CTG AAG AAG GGC AGC TAC GTG CTT GTT CCA ACC ATG TTC CAA CAT GGC 1560 Leu Lys Lys Gly Ser Tyr Val Leu Val Pro Thr Met Phe Gin His Gly 465 470 475
CGT ACC AGT GAA TTT CTG CTG AGG ATC TTC TCT GAA GTG CCC GTC CAG 1608 Arg Thr Ser Glu Phe Leu Leu Arg Ile Phe Ser Glu Val Pro Val Gin 480 485 490
CTC AGG GAA CTG ACC TTG GAC ATG CCC AAG ATG TCT TGC TGG AAC CTG 1656 Leu Arg Glu Leu Thr Leu Asp Met Pro Lys Met Ser Cys Trp Asn Leu 495 500 505
GCA CGT GGC TAC CCA AAG GTG GTT ACC CAG ATC ACT GTC CAC AGT GCT 1704 Ala Arg Gly Tyr Pro Lys Val Val Thr Gin Ile Thr Val His Ser Ala 510 515 520 525
GAG GGC CTG GAG AAG AAG TAT GCC AAT GAA ACT GTC AAT CCA TAT CTG 1752 Glu Gly Leu Glu Lys Lys Tyr Ala Asn Glu Thr Val Asn Pro Tyr Leu 530 535 540
ATC ATC AAA TGT GGA AAG GAG GAA GTC CGT TCC CCT GTC CAG AAG AAT 1800 Ile Ile Lys Cys Gly Lys Glu Glu Val Arg Ser Pro Val Gin Lys Asn 545 550 555
ACT GTG CAT GCC ATT TTT GAC ACG CAG GCC GTT TTC TAC AGA AGG ACC 1848 Thr Val His Ala Ile Phe Asp Thr Gin Ala Val Phe Tyr Arg Arg Thr 560 565 570
ACT GAC ATT CCT ATT ATC ATC CAG GTG TGG AAC AGC AGA AAA TTC TGT 1896 Thr Asp Ile Pro Ile Ile Ile Gin Val Trp Asn Ser Arg Lys Phe Cys 575 580 585 GAT CAG TTC CTG GGG CAG GTT ACT CTC GAT GCT GAC CCC AGC GAC TGC 1944
Asp Gin Phe Leu Gly Gin Val Thr Leu Asp Ala Asp Pro Ser Asp Cys
590 595 600 605
CGT GAT CTG AAA TCT CTG TAC CTG CGT AAG AAG GGT GGT CCT ACT GCC 1992 Arg Asp Leu Lys Ser Leu Tyr Leu Arg Lys Lys Gly Gly Pro Thr Ala 610 615 620
AAA GTC AAG CAA GGT CAC ATC AGC TTC AAA GTT ATC TCT AGC GAT GAT 2040 Lys Val Lys Gin Gly His Ile Ser Phe Lys Val Ile Ser Ser Asp Asp 625 630 635
CTC ACT GAG CTC TAAGTAGTCA TCATCAG 2069
Leu Thr Glu Leu 640
(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO : 2:
(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 641 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure (D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Protein
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 2:
Met Gly Pro Pro Leu Lys Leu Phe Lys Asn Gin Lys Tyr Gin Glu Leu 1 5 10 15
Lys Gin Glu Cys Met Lys Asp Gly Arg Leu Phe Cys Asp Pro Thr Phe 20 25 30
Leu Pro Glu Asn Asp Ser Leu Phe Phe Asn Arg Leu Leu Pro Gly Lys 35 40 45
Val Val Trp Lys Arg Pro Gin Asp Ile Ser Asp Asp Pro His Leu Ile 50 55 60
Val Gly Asn Ile Ser Asn His Gin Leu Ile Gin Gly Arg Leu Gly Asn 65 70 75 80
Lys Ala Met Ile Ser Ala Phe Ser Cys Leu Ala Val Gin Glu Ser His
85 90 95
Trp Thr Lys Ala Ile Pro Asn His Lys Asp Gin Glu Trp Asp Pro Arg 100 105 110
Lys Pro Glu Lys Tyr Ala Gly Ile Phe His Phe Arg Phe Trp His Phe 115 120 125
Gly Glu Trp Thr Glu Val Val Ile Asp Asp Leu Leu Pro Thr Ile Asn 130 135 140 Gly Asp Leu Val Phe Ser Phe Ser Thr Ser Met Asn Glu Phe Trp Asn
145 150 155 160
Ala Leu Leu Glu Lys Ala Tyr Ala Lys Leu Leu Gly Cys Tyr Glu Ala 165 170 175
Leu Asp Gly Leu Thr Ile Thr Asp Ile Ile Met Asp Phe Thr Gly Thr 180 185 190
Leu Ala Glu Ile Ile Asp Met Gin Lys Gly Arg Tyr Thr Asp Leu Val 195 200 205
Glu Glu Lys Tyr Lys Leu Phe Gly Glu Leu Tyr Lys Thr Phe Thr Lys 210 215 220
Gly Gly Leu Ile Cys Cys Ser Ile Glu Ser Pro Ser Gin Glu Glu Gin 225 230 235 240
Glu Val Glu Thr Asp Trp Gly Leu Leu Lys Gly Tyr Thr Tyr Thr Met 245 250 255
Thr Asp Ile Arg Lys Leu Arg Leu Gly Glu Arg Leu Val Glu Val Phe 260 265 270
Ser Thr Glu Lys Leu Tyr Met Val Arg Leu Arg Asn Pro Leu Gly Arg 275 280 285
Gin Glu Trp Ser Gly Pro Trp Ser Glu Ile Ser Glu Glu Trp Gin Gin 290 295 300
Leu Thr Val Thr Asp Arg Lys Asn Leu Gly Leu Val Met Ser Asp Asp 305 310 315 320
Gly Glu Phe Trp Met Ser Leu Glu Asp Phe Cys His Asn Phe His Lys 325 330 335
Leu Asn Val Cys Arg Asn Val Asn Asn Pro Val Phe Gly Arg Lys Glu 340 345 350
Leu Glu Ser Val Val Gly Cys Trp Thr Val Asp Asp Asp Pro Leu Met 355 360 365
Asn Arg Ser Gly Gly Cys Tyr Asn Asn Arg Asp Thr Phe Leu Gin Asn 370 375 380
Pro Gin Tyr Ile Phe Thr Val Pro Glu Asp Gly His Lys Val Ile Met 385 390 395 400
Ser Leu Gin Gin Lys Asp Leu Arg Thr Tyr Arg Arg Met Gly Arg Pro 405 410 415
Asp Asn Tyr Ile Ile Gly Phe Glu Leu Phe Lys Val Glu Met Asn Arg 420 425 430 Arg Phe Arg Leu His His Leu Tyr Ile Gin Glu Arg Ala Gly Thr Ser
435 440 445
Thr Tyr Ile Asp Thr Arg Thr Val Phe Leu Ser Lys Tyr Leu Lys Lys 450 455 460
Gly Ser Tyr Val Leu Val Pro Thr Met Phe Gin His Gly Arg Thr Ser 465 470 475 480
Glu Phe Leu Leu Arg Ile Phe Ser Glu Val Pro Val Gin Leu Arg Glu 485 490 495
Leu Thr Leu Asp Met Pro Lys Met Ser Cys Trp Asn Leu Ala Arg Gly 500 505 510
Tyr Pro Lys Val Val Thr Gin Ile Thr Val His Ser Ala Glu Gly Leu 515 520 525
Glu Lys Lys Tyr Ala Asn Glu Thr Val Asn Pro Tyr Leu Ile Ile Lys 530 535 540
Cys Gly Lys Glu Glu Val Arg Ser Pro Val Gin Lys Asn Thr Val His 545 550 555 560
Ala Ile Phe Asp Thr Gin Ala Val Phe Tyr Arg Arg Thr Thr Asp Ile 565 570 575
Pro Ile Ile Ile Gin Val Trp Asn Ser Arg Lys Phe Cys Asp Gin Phe 580 585 590
Leu Gly Gin Val Thr Leu Asp Ala Asp Pro Ser Asp Cys Arg Asp Leu 595 600 605
Lys Ser Leu Tyr Leu Arg Lys Lys Gly Gly Pro Thr Ala Lys Val Lys 610 615 620
Gin Gly His Ile Ser Phe Lys Val Ile Ser Ser Asp Asp Leu Thr Glu 625 630 635 640
Leu
(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO : 3:
(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 1125 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNS (genomisch) (iii) HYPOTHETISCH: NEIN (iii) ANTISENSE: NEIN
(vi) URSPRÜNLICHE HERKUNFT:
(A) ORGANISMUS: Homo sapiens
(vii) UNMITTELBARE HERKUNFT:
(B) CLON: CAPN6
(ix) MERKMALE:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: CDS
(B) LAGE: 2..1125
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 3:
G CTT GTT GAG GAG AAG TAC AAG CTA TTC GGA GAA CTG -TAC AAA ACA 46
Leu Val Glu Glu Lys Tyr Lys Leu Phe Gly Glu Leu Tyr Lys Thr 1 5 10 15
TTT ACC AAA GGT GGT CTG ATC TGC TGT TCC ATT GAG TCT CCC AAT CAG 94 Phe Thr Lys Gly Gly Leu Ile Cys Cys Ser Ile Glu Ser Pro Asn Gin
20 25 30
GAG GAG CAA GAA GTT GAA ACT GAT TGG GGT CTG CTG AAG GGC CAT ACC 142 Glu Glu Gin Glu Val Glu Thr Asp Trp Gly Leu Leu Lys Gly His Thr 35 40 45
TAT ACC ATG ACT GAT ATT CGC AAA ATT CGT CTT GGA GAG AGA CTT GTG 190 Tyr Thr Met Thr Asp Ile Arg Lys Ile Arg Leu Gly Glu Arg Leu Val 50 55 60
GAA GTC TTC AGT GCT GAG AAG CTG TAT ATG GTT CGC CTG AGA AAC CCC 238 Glu Val Phe Ser Ala Glu Lys Leu Tyr Met Val Arg Leu Arg Asn Pro 65 70 75
TTG GGA AGA CAG GAA TGG AGT GGC CCC TGG AGT GAA ATT TCT GAA GAG 286 Leu Gly Arg Gin Glu Trp Ser Gly Pro Trp Ser Glu Ile Ser Glu Glu 80 85 90 95
TGG CAG CAA CTG ACT GCA TCA GAT CGC AAG AAC CTG GGG CTT GTT ATG 334 Trp Gin Gin Leu Thr Ala Ser Asp Arg Lys Asn Leu Gly Leu Val Met 100 105 110
TCT GAT GAT GGA GAG TTT TGG ATG AGC TTG GAG GAC TTT TGC CGC AAC 382 Ser Asp Asp Gly Glu Phe Trp Met Ser Leu Glu Asp Phe Cys Arg Asn 115 120 125
TTT CAC AAA CTG AAT GTC TGC CGC AAT GTG AAC AAC CCT ATT TTT GGC 430 Phe His Lys Leu Asn Val Cys Arg Asn Val Asn Asn Pro Ile Phe Gly 130 135 140
CGA AAG GAG CTG GAA TCG GTG TTG GGA TGC TGG ACT GTG GAT GAT GAT 478 Arg Lys Glu Leu Glu Ser Val Leu Gly Cys Trp Thr Val Asp Asp Asp 145 150 155 CCC CTG ATG AAC CGC TCA GGA GGC TGC TAT AAC AAC CGT GAT ACC TTC 526 Pro Leu Met Asn Arg Ser Gly Gly Cys Tyr Asn Asn Arg Asp Thr Phe 160 165 170 175
CTG CAG AAT CCC CAG TAC ATC TTC ACT GTG CCT GAG GAT GGG CAC AAG 574 Leu Gin Asn Pro Gin Tyr Ile Phe Thr Val Pro Glu Asp Gly His Lys 180 185 190
GTC ATT ATG TCA CTG CAG CAG AAG GAC CTG CGC ACT TAC CGC CGA ATG 622 Val Ile Met Ser Leu Gin Gin Lys Asp Leu Arg Thr Tyr Arg Arg Met 195 200 205
GGA AGA CCT GAC AAT TAC ATC ATT GGC TTT GAG CTC TTC AAG GTG GAG 670 Gly Arg Pro Asp Asn Tyr Ile Ile Gly Phe Glu Leu Phe Lys Val Glu 210 215 220
ATG AAC CGC AAA TTC CGC CTC CAC CAC CTC TAC ATC CAG GAG CGT GCT 718 Met Asn Arg Lys Phe Arg Leu His His Leu Tyr Ile Gin Glu Arg Ala 225 230 235
GGG ACT TCC ACC TAT ATT GAC ACC CGC ACA GTG TTT CTG AGC AAG TAC 766 Gly Thr Ser Thr Tyr Ile Asp Thr Arg Thr Val Phe Leu Ser Lys Tyr 240 245 250 255
CTG AAG AAG GGC AAC TAT GTG CTT GTC CCA ACC ATG TTC CAG CAT GGT 814 Leu Lys Lys Gly Asn Tyr Val Leu Val Pro Thr Met Phe Gin His Gly 260 265 270
CGC ACC AGC GAG TTT CTC CTG AGA ATC TTC TCT GAA GTG CCT GTC CAG 862 Arg Thr Ser Glu Phe Leu Leu Arg Ile Phe Ser Glu Val Pro Val Gin 275 280 285
CTC AGG GAA CTG ACT CTG GAC ATG CCC AAA ATG TCC TGC TGG AAC CTG 910 Leu Arg Glu Leu Thr Leu Asp Met Pro Lys Met Ser Cys Trp Asn Leu 290 295 300
GCT CGT GGC TAC CCG AAA GTA GTT ACT CAG ATC ACT GTT CAC AGT GCT 958 Ala Arg Gly Tyr Pro Lys Val Val Thr Gin Ile Thr Val His Ser Ala 305 310 315
GAG GAC CTG GAG AGG AGG TAT GCC AAT GGA ACT GTA AAC CCA TAT TTG 1006 Glu Asp Leu Glu Arg Arg Tyr Ala Asn Gly Thr Val Asn Pro Tyr Leu 320 325 330 335
GTC ATC AAA TGT GGA AAG GAG GAA GTC CGT TCT CCT GTC CAG AAA AAT 1054 Val Ile Lys Cys Gly Lys Glu Glu Val Arg Ser Pro Val Gin Lys Asn 340 345 350
ACA GTT CAT GCC ATT TTT GAC ACC CAT GCC ATT TTC TAC AGA AGG ACC 1102 Thr Val His Ala Ile Phe Asp Thr His Ala Ile Phe Tyr Arg Arg Thr 355 360 365 ACG GAC ATT CCT ATT ATA GTA CA 1125
Thr Asp Ile Pro Ile Ile Val 370
(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 4:
(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 374 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure (D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Protein
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 4:
Leu Val Glu Glu Lys Tyr Lys Leu Phe Gly Glu Leu Tyr Lys Thr Phe 1 5 10 15
Thr Lys Gly Gly Leu Ile Cys Cys Ser Ile Glu Ser Pro Asn Gin Glu 20 25 30
Glu Gin Glu Val Glu Thr Asp Trp Gly Leu Leu Lys Gly His Thr Tyr 35 40 45
Thr Met Thr Asp Ile Arg Lys Ile Arg Leu Gly Glu Arg Leu Val Glu 50 55 60
Val Phe Ser Ala Glu Lys Leu Tyr Met Val Arg Leu Arg Asn Pro Leu 65 70 75 80
Gly Arg Gin Glu Trp Ser Gly Pro Trp Ser Glu Ile Ser Glu Glu Trp
85 90 95
Gin Gin Leu Thr Ala Ser Asp Arg Lys Asn Leu Gly Leu Val Met Ser 100 105 110
Asp Asp Gly Glu Phe Trp Met Ser Leu Glu Asp Phe Cys Arg Asn Phe 115 120 125
His Lys Leu Asn Val Cys Arg Asn Val Asn Asn Pro Ile Phe Gly Arg 130 135 140
Lys Glu Leu Glu Ser Val Leu Gly Cys Trp Thr Val Asp Asp Asp Pro 145 150 155 160
Leu Met Asn Arg Ser Gly Gly Cys Tyr Asn Asn Arg Asp Thr Phe Leu 165 170 175
Gin Asn Pro Gin Tyr Ile Phe Thr Val Pro Glu Asp Gly His Lys Val 180 185 190
Ile Met Ser Leu Gin Gin Lys Asp Leu Arg Thr Tyr Arg Arg Met Gly 195 200 205 Arg Pro Asp Asn Tyr Ile Ile Gly Phe Glu Leu Phe Lys Val Glu Met
210 215 220
Asn Arg Lys Phe Arg Leu His His Leu Tyr Ile Gin Glu Arg Ala Gly 225 230 235 240
Thr Ser Thr Tyr Ile Asp Thr Arg Thr Val Phe Leu Ser Lys Tyr Leu 245 250 255
Lys Lys Gly Asn Tyr Val Leu Val Pro Thr Met Phe Gin His Gly Arg 260 265 270
Thr Ser Glu Phe Leu Leu Arg Ile Phe Ser Glu Val Pro Val Gin Leu 275 280 285
Arg Glu Leu Thr Leu Asp Met Pro Lys Met Ser Cys Trp Asn Leu Ala 290 295 300
Arg Gly Tyr Pro Lys Val Val Thr Gin Ile Thr Val His Ser Ala Glu 305 310 315 320
Asp Leu Glu Arg Arg Tyr Ala Asn Gly Thr Val Asn Pro Tyr Leu Val 325 330 335
Ile Lys Cys Gly Lys Glu Glu Val Arg Ser Pro Val Gin Lys Asn Thr 340 345 350
Val His Ala Ile Phe Asp Thr His Ala Ile Phe Tyr Arg Arg Thr Thr 355 360 365
Asp Ile Pro Ile Ile Val 370

Claims

Patentansprüche
1. CAPN6-Calpaingen mit der Sequenz SEQ ID NO. 1 oder
SEQ ID NO. 3, seine allelischen Varianten, Analoge oder Derivate, die auf der abgeleiteten Aminosäureebene eine Homologie von 60 bis 100 % aufweisen, wobei die Calpaingene, ihre allelischen Varianten, Analoge oder Derivate folgende Sequenzen enthalten:
(a) Leu-Gly-Asn-Lys-Ala, wobei sich diese Sequenz von der entsprechenden Sequenz im humanen Calpain I dadurch unterscheidet, daß die Aminosäure Cystein im humanen Calpain I, die die Position 115 im Calpain I besitzt, gegen Lysin, das an Position 81 der Sequenzen SEQ ID No . 1 und SEQ ID No. 3 liegt, verändert ist;
(b) Ala-X-Ser-Cys-Leu-Ala, wobei gegenüber der entsprechenden Sequenz im humanen
Calpain I die Aminosäuren Alanin und Threonin in den Positionen 122 und 125 gegen Serin und Alanin in den Positionen 88 und 91 in den Sequenzen SEQ ID No . 1 und SEQ ID No. 3 verändert sind;
(c) Gly-Tyr-Thr- (His oder Tyr) -Thr-X-Thr, wobei gegenüber der entsprechenden Sequenz im humanen Calpain I die Aminosäuren Histidin, Alanin und Serin in den Positionen 272, 273 und 275 gegen Tyrosin, Threonin und Threonin in den Positionen 252, 253 und 255 in den
Sequenzen SEQ ID No. 1 und SEQ ID No. 3 verändert sind und in der SEQ ID No. 3 zusätzlich der Tyrosinrest in Position 274 im Calpain I gegen Histidin in Position 254 in der SEQ ID No. 3 verändert ist;
(d) Arg-X-Arg-Asn-Pro-Leu-Gly wobei sich diese Sequenz von der entsprechenden Sequenz im humanen Calpain I dadurch unterscheidet, daß die Aminosäure Tryptophan im humanen Calpain I, die die Position 298 im Calpain I besitzt, gegen Leucin, das an Position 286 der Sequenzen SEQ ID No. 1 und SEQ ID No. 3 liegt, verändert ist und
X in den genannten Sequenzen eine beliebige natürliche Aminosäure bedeutet.
Zeichn.
2. Genkonstrukt enthaltend ein CAPN6-Calpaingen, seine allelischen Varianten oder Analoge gemäß Anspruch 1, das funktioneil mit einem oder mehreren Regulationssignalen zur Erhöhung der Genexpression verknüpft ist.
3. Aminosäuresequenzen codiert durch CAPN6-Gene, allelischen Varianten oder Analoge gemäß Anspruch 1.
4. Aminosäuresequenzen nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß es sich um enzymatisch aktive Proteine handelt.
5. Verfahren zur Identifizierung von Calpaininhibitoren, wobei man ein Calpain, seine allelischen Varianten oder Analoge codiert durch eine Sequenz gemäß Anspruch 1 aus Geweben oder Zellen isoliert und die Inhibierung der Spaltung eines Substrats des Enzyms CAPN6 und in mindestens einem weiteren Test die Inhibierung der Spaltung eines Substrats der Enzyme Calpain I und/oder II durch Testsubstanzen mißt und die Testsubstanzen auswählt, die das Enzym CAPN6 und mindestens ein weiteres der Calpaine hemmen.
6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß man die Testsubstanzen auswählt, die das Enzym CAPN6 nicht hemmen, jedoch die Enzyme Calpain I und/oder II.
7. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß man die Testsubstanzen auswählt, die das Enzym CAPN6 hemmen, nicht jedoch die Enzyme Calpain I und/oder II.
8. Verfahren nach den Ansprüchen 5 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß man die Testsubstanzen auswählt, die in zellulären Systemen die Zellmembran passieren.
9. Verfahren zur Herstellung des Enzyms CAPN6 sowie seiner alle- lischen Varianten oder Analoge, dadurch gekennzeichnet, daß man mindestens eine Kopie der Gensequenzen für CAPN6, seine allelischen Varianten oder Analoge gemäß Anspruch 1 in einen Vektor kloniert und in einem dem Vektor entsprechenden Wirtsorganismus das Gen für das Enzym CAPN6, seine allelischen Varianten oder Analoge exprimiert und anschließend das Enzym aus dem Wirtsorganismus isoliert.
10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Vektor verwendet der in prokaryontischen oder eukaryon- tischen Zellen die Expression der Gene, der allelischen Varianten oder Analoge ermöglicht.
11. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß man als Wirtsorganismus Bakterien, pilzliche oder tierische
Zellen verwendet.
5 12. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß man als Vektor Baculoviren und als Wirtsorganismus Insektenzellen verwendet .
13. Verwendung eines Calpaininhibitors identifizierbar gemäß 10 den Ansprüchen 5 bis 8 zur Herstellung von Medikamenten zur
Behandlung von Krankheiten bei denen eine Calpainfehlfunktion vorliegt.
14. Verwendung eines Calpaininhibitors nach Anspruch 13 zur Her- 15 Stellung von Medikamenten zur Behandlung von Krankheiten ausgewählt aus der Gruppe der kardiovaskulären, immunologischen, entzündlichen, allergischen, neurologischen, neurodegenerati - ven oder onkologischen Erkrankungen.
20 15. Verwendung einer Aminosäuresequenz gemäß Anspruch 3 in Test- systemen.
16. Verwendung einer Aminosäuresequenz gemäß Anspruch 3 zur Herstellung von Antikörpern.
25
17. Verwendung einer Gensequenz, seiner allelischen Varianten oder Analoge gemäß Anspruch 1 zur Herstellung von antisense mRNA.
30 18. Verwendung der antisense mRNA nach Anspruch 17 zur Herstellung von Medikamenten zur Behandlung von Krankheiten bei denen eine Calpainfehlfunktion vorliegt.
19. Verwendung eines Calpaingens sowie seiner allelischen 35 Varianten oder Analoge gemäß Anspruch 1 zur Diagnose von Krankheiten oder in der Gentherapie.
40
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