DE69723074T2

DE69723074T2 - Mch4 und mch5, apoptotische proteasen, dafür kodierende nukleinsäure und verfahren zur verwendung

Info

Publication number: DE69723074T2
Application number: DE69723074T
Authority: DE
Inventors: S. Emad ALNEMRI; Teresa Fernandes-Alnemri; Gerald Litwack; Robert Armstrong; Kevin Tomaselli
Original assignee: Thomas Jefferson University; Idun Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Thomas Jefferson University; Idun Pharmaceuticals Inc
Priority date: 1996-03-19
Filing date: 1997-03-19
Publication date: 2004-05-13
Anticipated expiration: 2017-03-20
Also published as: US20020035242A1; JP2001508284A; AU2333197A; ATE243753T1; EP0906434B1; AU730412B2; DE69723074D1; US6287795B1; CA2249233A1; US6730779B2; JP4350799B2; US6897296B2; JP2008017854A; CA2249233C; WO1997035020A1; US5786173A; US20040054148A1; EP0906434A1

Description

Diese Erfindung wurde mit Unterstützung der Regierung unter den Förderungen AI 35035-01 von den National Institutes of Health durchgeführt. Demgemäß hat die Regierung bestimmte Rechte an dieser Erfindung.
Durchgängig durch diese Erfindung werden verschiedene Veröffentlichungen in Klammern in Bezug genommen. Die Offenbarungen dieser Veröffentlichungen sind hierdurch durch Bezugnahme in diese Anmeldung in ihrer Gesamtheit aufgenommen, um den Stand der Technik vollständiger zu beschreiben, auf den sich diese Erfindung bezieht.
Hintergrund der Erfindung
Die vorliegende Erfindung bezieht sich allgemein auf die Apoptose oder den programmierten Zelltod und genauer auf neue Aspartat-spezifische Cystein-Proteasen, die verwendet werden können, um die Apoptose für die therapeutische Behandlung von menschlichen Krankheiten zu modulieren.
Die Apoptose ist ein normaler physiologischer Prozess des Zelltodes, der eine kritische Rolle in der Regulation der Homöostase von Gewebe dadurch spielt, dass die Rate der Ansammlung neuer Zellen, die durch Zellteilung erzeugt werden, durch eine entsprechende Rate des Zeltverlustes aufgrund von Absterben ausgeglichen wird. Es ist nun deutlich geworden, dass eine Störung der Apoptose, die auch als physiologischer Zelltod oder programmierter Zelltod in Bezug genommen wird, die die normale Zeltumsetzung verhütet oder verzögert, genauso wichtig wie die Pathogenese von Krankheiten sein kann, wie bekannte Anomalitäten in der Regulierung der Proliferation und des Zellzyklus. Ähnlich wie die Zellteilung, die durch komplexe Interaktionen zwischen regulatorischen Proteinen des Zellzyklus kontrolliert wird, ist die Apoptose unter normalen Umständen auf ähnliche Weise durch die Interaktion von Genprodukten reguliert, die den Zelltod entweder induzieren oder hemmen.
Die Anreize, die die Funktion dieser apoptotischen Genprodukte regulieren, schließen sowohl extra-zelluläre als auch intrazelluläre Signale ein. Entweder das Vorliegen oder das Entfernen eines besonderen Anreizes kann ausreichend sein, um ein positives oder negatives apoptotisches Signal hervorzurufen. Zum Beispiel schließen physiologische Anreize, die die Apoptose verhüten oder hemmen, zum Beispiel Wachstumsfaktoren, die extrazelluläre Matrix, den CD40-Liganden, virale Genprodukte, neutrale Aminosäuren, Zink, Östrogen und Androgene ein. Im Gegensatz dazu schließen Anreize, die die Apoptose fördern, Wachstumsfaktoren, so wie den Tumor-Nekrose-Faktor (TNF), Fas und den transformierenden Wachstumsfaktor β (TGFβ), Neurotransmitter, die Entfernung von Wachstumsfaktor, den Verlust der Anheftung der extrazellulären Matrix, intrazelluläres Calcium und Glukokorticoide als Beispiele ein. Andere Anreize einschließlich derjenigen von Umgebungs- und pathogenem Ursprung existieren auch, die den programmierten Zelltod entweder induzieren oder hemmen können. Obwohl die Apoptose durch verschiedene Signale und komplexe Interaktionen zellulärer Genprodukte vermittelt wird, münden die Ergebnisse dieser Interaktionen schließlich in einen Stoffwechselweg des Zelttodes, der evolutionär unter Menschen und Wirbellosen konserviert ist.
Mehrere Genprodukte, die den apoptotischen Prozess modulieren, sind nun identifiziert worden. Obwohl diese Produkte im allgemeinen in zwei grundlegende Kategorien getrennt werden können, können die Genprodukte jeder Kategorie arbeiten, um entweder den programmierten Zelltod zu hemmen oder zu induzieren. Eine Familie von Genprodukten sind diejenigen, die Mitglieder der Bcl-2-Familie von Proteinen sind. Bcl-2 ist das am besten charakterisierte Mitglied dieser Familie und hemmt die Apoptose, wenn es in Zellen überexprimiert wird. Andere Mitglieder dieser Genfamilie schließen zum Beispiel Bax, Bak, Bcl-x_L, Bcl-x_S und Bad ein. Während einige dieser Proteine die Apoptose verhüten können, verstärken andere die Apoptose (Zum Beispiel Bcl-x_S bzw. Bak).
Eine zweite Familie von Genprodukten, die Aspartat-spezifischen Cystein-Proteasen (ASCPs), sind genetisch mit dem ced-3-Genprodukt von C. elegans verwandt, von dem anfänglich gezeigt wurde, dass es für den programmierten Zelltod in dem Fadenwurm C. elegans erforderlich ist. Die ASCPs- Familie von Proteasen schließt das menschliche ICE (Interleukin-1-β konvertierendes Enzym), ICH-1_L, ICH-1_S, CPP32, Mch2, Mch3, ICH-2 und ICE_rel-III ein. Zu den gemeinsamen Eigenschaften dieser Genprodukte zählt, dass 1) sie Cystein-Proteasen mit Spezifität für die Spaltung des Substrates an Asp-x-Bindungen sind, 2) sie eine konservierte Pentapeptid-Sequenz (QACRG) innerhalb des aktiven Zentrums gemeinsam haben und 3) sie als Proenzyme synthetisiert werden, die eine proteolytische Spaltung an spezifischen Aspartatresten zur Aktivierung der Protease-Aktivität erfordern. Die Spaltung des Proenzymes erzeugt zwei Polypeptid-Protease-Untereinheiten von etwa 20 kD (p 20) und 10 kD (p 10), die sich im Falle von ICE nicht-kovalent kombinieren, um ein Tetramer zu bilden, das aus zwei p20 : p10-Heterodimeren besteht. Obwohl diese Proteasen, wenn sie in Zellen exprimiert werden, den Zelltod induzieren, arbeiten mehrere alternative strukturelle Formen dieser Proteasen, so wie ICEδ, ICD_e, ICH-1_S und Mch2β tatsächlich, um die Apoptose zu hemmen.
Zusätzlich zu den Genfamilien Bcl-2 und ASCP, die eine Rolle in der Apoptose in Säugetierzellen spielen, ist es zunehmend offensichtlich geworden, dass andere Genprodukte existieren, die beim Zelltod in Säugetieren bedeutend sind und die noch zu identifizieren sind. Zum Beispiel existiert zusätzlich zu Ced-3 ein weiteres Gen in C. elegans, das als Ced-4 bekannt ist, das auch für den programmierten Zelltod in C. elegans erforderlich ist. Jedoch bleiben Homologien dieses Proteins zu Säugetieren schwer definierbar und sind noch nicht identifiziert worden. Weiterhin ist es zweifelhaft, ob andere Gene existieren, die zu einer der beiden vorgenannten apoptotischen Genfamilien gehören oder welche Rolle sie in dem Stoffwechselweg des programmierten Zelltodes spielen können. Schließlich ist es unklar, welche physiologischen Kontrollmechanismen es sind, die den programmierten Zelltod regulieren oder wie die Stoffwechselwege des Zelltodes mit anderen physiologischen Prozessen innerhalb des Organismus in Interaktion treten. Zum Beispiel ist kürzlich vorgeschlagen worden, dass zytotoxische T-Lymphozyten ihre zerstörerische Funktion durch Induzieren der Apoptose in ihren Zielzellen vermitteln.
Die Apoptose funktioniert durch Beibehalten der Homöostase von Gewebe in einem Bereich von physiologischen Prozessen, so wie der embnonalen Ent wicklung, der Regulierung der Immunzellen und normalen Umsetzung von Zellen. Daher kann die Fehlfunktion oder der Verlust der regulierten Apoptose zu einer Vielzahl pathologischer Krankheitszustände führen. Zum Beispiel kann der Verlust der Apoptose zu der pathologischen Ansammlung von selbst-reaktiven Lymphozyten führen, so wie derjenigen, die bei vielen Autoimmunkrankheiten auftritt. Ein unangemessener Verlust der Apoptose kann auch zur Anhäufung von viral infizierten Zellen und von hyperproliferativen Zellen, so wie neoplastischen oder Tumorzellen führen. Auf ähnliche Weise kann die unangemessene Aktivierung der Apoptose auch zu einer Vielzahl pathologischer Krankheitszustände beitragen, einschließlich zum Beispiel des erworbenen Immundefizienz-Syndroms (Aids), neurodegenerativer Krankheiten und ischämischer Verletzungen. Behandlungen, die besonders ausgelegt sind, um die apoptotischen Stoffwechselwege in diesen und anderen pathologischen Zuständen zu modulieren, können das natürliche Fortschreiten vieler dieser Krankheiten verändern.
Die WO-A-97/03998 ist unter Regel 54 (3) EPÜ entgegenzuhalten und offenbart Modulatoren der Wirkung des FAS-Rezeptorliganden oder von TNF auf Zellen, die den FAS-Rezeptor oder den p55-Rezeptor tragen.
Daher besteht ein Bedarf, neue apoptotische Genfamilien und ihre Genprodukte zu identifizieren und nach Methoden zur Modulierung dieses Prozesses zur therapeutischen Behandlung von menschlichen Krankheiten. Die vorliegende Erfindung befriedigt diesen Bedarf und hält ebenso damit in Beziehung stehende Vorteile bereit.
Zusammenfassung der Erfindung
Die Erfindung stellt ein isoliertes Gen zur Verfügung, dass Mch4 kodiert oder ein isoliertes Gen, das Mch5 kodiert, sowie auch funktionelle Fragmente dieser. Es werden auch isolierte Nukleinsäuresequenzen bereitgestellt, die Mch4 oder Mch5 oder funktionelle Fragmente dieser kodieren. Die Gen- oder die Nukleinsäuresequenzen können einzel- oder doppelsträngige Nukleinsäuren sein, die den kodierenden oder den nicht-kodierenden Strängen der Nukleotidsequenzen von Mch4 oder Mch5 entsprechen. Es werden auch Gene und Nukleinsäuren bereitgestellt, die funktionelle Fragmente kodieren, so wie die FADD-ähnlichen Domänen Mch4A, Mch4B, Mch5A und Mch5B. Es werden auch isolierte Polypeptide Mch4 oder Mch5 oder funktionelle Fragmente davon einschließlich der FADD-ähnlichen Domänen Mch4A, Mch4B, Mch5A und Mch5B bereitgestellt.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 zeigt die Nukleotid- und die vorhergesagte Aminosäuresequenz von Mch4 (SEQ ID Nrn.: 1 bzw. 2).
2 zeigt die Nukleotid- und vorhergesagte Aminosäuresequenz von Mch5 (SEQ ID Nrn.: 3 bzw. 4).
3 zeigt die Aminosäuresequenzen von Mch4 und Mch5 und ihre Homologie zu anderen ASCP-Sequenzen.

A) Die co-lineare Ausrichtung von menschlichem FADD mit den zwei FADD-ähnlichen Domänen in sowohl Mch4 als auch in Mch5. Diese Domänen sind als Mch4A (Aminosäurereste 18–105), Mch4B (Aminosäure 112–189), Mch5A (Aminosäure 4–77) und Mch5B (Aminosäure 128–205) bezeichnet worden. Die erste Domäne von Mch4 (Mch4A) hat die größte Homologie mit der N-terminalen, 79 Aminosäuren langen FADD- (gb-Zugangs-Nr. U24231) Effektor-Domäne für das Absterben (37% Identität, 57% Ähnlichkeit) als die zweite Domäne (Mch4B) (22% Identität, 53% Ähnlichkeit). Mch4A zeigt auch eine hohe Homologie zu den Proteinen PEA-15 (gb-Zugangs-Nr. X86694) und KIAA0179 (gb-Zugangs-Nr. D80001). Mch4B zeigt etwas Homologie zu den Proteinen SRB7 (gb-Zugangs-Nr. U46837) und Hefe-cdc4 (gb-Zugangs-Nr. Z46255).
B) Die mehrfache Ausrichtung von Sequenzen aller bekannten menschlichen ASCPs und des Ced-3 ASCP von Nematoden. Das Pentapeptid des aktiven Zentrums QACRG/QACQG ist gerahmt. Auf Grundlage der Kristallstruktur von ICE sind die numerierten Reste innerhalb der ICE-Sequenz an der Katalyse (leere Kästen) und der Bindung des Substrat-Carboxylates von P1-Asp (leere Kreise) beteiligt. Die Reste, die an die Aminosäuren P2-P4 des Substrates angrenzen, sind durch gefüllte Dreiecke angedeutet. D/X zeigt bekannte und potentielle Prozessierungsstellen zwischen der kleinen und der großen Untereinheit der ASCPs an. Die römischen Ziffern der rechten Seite zeigen die drei ASCP-Unterfamilien an, die Ced-ähnliche-Unterfamilie (1), die ICE-ähnliche Unterfamilie (II) und die Nedd2/Ich1-Unterfamilie (III). Der Stern zeigt die konservative Substitution von Arg zu Gln in Mch4 und Mch5 an.

4 zeigt die Spaltung des CPP32-Proenzymes durch Mch4 und Granzym B. (A) Wirkung der Mutation von Asp175 auf die Spaltung von proCPP32. Mit ³⁵S markiertes Wildtyp-proCPP32 (Mut-D175, -Spuren) oder Asp175-mutiertes proCPP32 (Mut -D175, +Spuren) wurden mit rekombinantem Mch4 (Mch4, +Spuren), Granzym B (GraB, +Spuren) oder Puffer (Mch4 und GraB, -Spuren) für eine Stunde bei 37°C inkubiert. Die Reaktionsprodukte wurden dann durch SDS-PAGE und Autoradiographie analysiert. (B) Wirkung der Asp9-Mutation und des Inhibitors DEVD-CHO auf die Spaltung des Propeptides von proCPP32. Mit ³⁵S markiertes Wildtyp-proCPP32 (mut-D9 und Mut-175, - Spuren) oder Asp9-mutiertes (mut-D9, +Spuren) oder Asp175-mutiertes (Mut-D175, +Spuren) proCPP32 wurde mit Granzym B (GraB, +Spuren) oder Puffer (GraB, -Spuren) in Gegenwart (+Spuren) oder Abwesenheit (-Spuren) des Inhibitors DEVD-CHO inkubiert. Die Reaktionsprodukte wurden wie oben analysiert. SS zeigt die kleine Untereinheit an, LS zeigt die große Untereinheit an.
5 zeigt die Spaltung von Mch3- und Mch4-Proenzymen durch Mch4 und Granzym B. (A) Die Wirkung von Aspartat-Mutationen auf die Spaltung von proMch3 (A) oder Mch4 (B). Mit ³⁵S markiertes Wildtyp-proMch3 (mit den Spuren), Asp198-mutiertes proMch3 (M-Suren), verkürztes Mch4-M134 (T1-Spuren), verkürztes Mch4-M235 (T2-Spuren) oder Asp372-mutiertes Mch4-M134 (MT-Spuren) wurden mit rekombinantem Mch4 (Mch4, +Spuren), Granzym B (GraB, +Spuren) oder Puffer (Mch4 und GraB, -Spuren) für eine Stunde bei 37°C inkubiert. Die Reaktionsprodukte wurden dann durch SDS-PAGE und Autoradiographie analysiert. SS zeigt die kleine Untereinheit an, LS zeigt die große Untereinheit an.
6 zeigt die Aktivität von CPP32 und Mch3 gegenüber dem Mch4-Proenzym. Mit ³⁵S markiertes Wildtyp-Mch4 (Mut, -Spuren) oder Asp239-mutiertes Mch4 (Mut, +Spuren) wurden mit rekombinantem CPP32 (CPP32, +Spuren), Mch3 (Mch3, +Spuren) oder Puffer (CPP32 und Mch3, -Spuren) für eine Stunde bei 37°C inkubiert. Die Reaktionsprodukte wurden dann durch SDS-PAGE und Autoradiographie analysiert.
7 zeigt potentielle apoptotische Proteasekaskaden, die die Aktivierung mehrfacher ASCP-Familienmitglieder betrifft.
8 zeigt MCF7-Zellen, die mit entweder Plasmid pcDNA3 oder Mch5B und pCMV-SPORT-βgal cotransfiziert sind. Nach 24 Stunden im Anschluß an die Transfektion wurden die Zellen fixiert und mit X-gal angefärbt. Der Prozentgehalt blauer Zellen, die nicht-apoptotisch sind, ist gezeigt (d. h. lebensfähige Zellen). Nicht-apoptotische Zellen wurden unter dem Mikroskop von apoptotischen Zellen durch ihre abgeflachte, ausgebieitete Morphologie unter Verwendung der Phasenkontrast-Optik unterschieden (im Gegensatz zu einer abgerundeten, pyknischen oder apoptotischen Morphologie).
Genaue Beschreibung der Erfindung
Diese Erfindung bezieht sich auf neue, für den Zelltod spezifische Proteasen, die Mch4 und Mch5 genannt werden. Diese Proteasen sind Mitglieder der Aspartat-spezifischen Cystein-Protease-(ASCP) Familie von Proteasen, die zum Beispiel ICE, ICH-1_L, ICH-1_S, CPP32, Mch2, Mch3, ICH-2 und ICH-_rel-III enthält. Ähnlich wie andere ASCPs werden Mch4 und Mch5 als ein größeres Proenzym synthetisiert und werden im Anschluss an die proteolytische Spaltung in zwei Untereinheiten aktiv, eine große Untereinheit von annähernd 17– 27 kD und eine kleine Untereinheit von etwa 10–12 kD. Die zwei Untereinheiten bilden Heterodimere, die miteinander zu einem aktiven Komplex assoziieren. Die Substratspezifität erfordert einmalig einen Asp-Rest in der P-1-Position der Substrat-Bindungsstelle mit einem kleinen, vorzugsweise hydrophoben Rest in der P1'-Position. Überdies enthält der N-Terminus von sowohl Mch4 als auch Mch5 FADD-ähnliche Effektordomänen für das Absterben, was ihre Interaktion mit FADD anzeigt. Diese Interaktion zeigt weiterhin an, dass durch diese FADD-ähnlichen Domänen Mch4 und Mch5 in dem durch fas vermittelten apoptotischen Stoffwechselweg funktionieren.
In einer Ausführungsform ist die Erfindung auf Nukleinsäuren gerichtet, die die apoptotischen Cystein-Proteasen Mch4 oder Mch5 kodieren. Die Nukleinsäuren werden verwendet, um rekombinante Mch4- oder Mch5-Proteasen zu erzeugen, deren Aktivität enzymatisch gemessen werden kann. Die rekombinanten Polypeptide werden verwendet, um nach für Mch4 oder Mch5 inhibitorischen Verbindungen zu screenen. Für Mch4 oder Mch5 inhibitorische Verbindungen schließen diejenigen ein, die die Proteaseaktivität inhibieren, als auch Verbindungen, die das Binden von Mch4 oder Mch5 an andere Polypeptide durch FADD-ähnliche Domänen inhibieren. Solche pharmazeutischen Verbindungen sind für die Behandlung oder Vorbeugung von Krankheiten geeignet, die durch den apoptotischen Zelltod gekennzeichnet sind. Auch eine andere Weise können die Mch4- oder Mch5-Polypeptide verwendet werden, um nach pharmazeutischen Verbindungen zu screenen, die Mch4 oder Mch5 aktivieren oder als deren Agonisten wirken, so wie durch Induzieren der Spaltung des Proenzymes in seine aktiven Untereinheiten oder durch Verändern der polypeptidischen Interaktionen durch seine FADD-ähnlichen Domänen. Solche Verbindungen sind zur Behandlung oder zur Vorbeugung von Krankheiten geeignet, die durch den Verlust des apoptotischen Zelttodes gekennzeichnet sind.
Wie hier verwendet, ist es beabsichtigt, dass sich der Ausdruck "im wesentlichen", wenn er sich auf eine Nukleotid- oder Aminosäuresequenz von Mch4 oder Mch5 bezieht, auf den Grad bezieht, zu welchem die Sequenzen von etwa 15–30 oder mehr Nukleotiden in der Länge identisch oder ähnlich sind, so wie es von den Fachleuten gesehen würde, dass sie funktionell äquivalent sind. Zum Beispiel, wenn die Mch4- oder Mch5-Nukleinsäuren der Erfindung eine Nukleotidsequenz im wesentlichen gleich derjenigen haben, die in den 1 und 2 und als SEQ ID Nrn. 1 bzw. 3 gezeigt sind. Falls daher eine zweite Sequenz im wesentlichen die gleiche wie diejenige ist, die als SEQ ID Nrn. 1 und 3 gezeigt ist, dann wird sie von den Fachleuten als funktionell ä quivalent betrachtet werden. Verfahren zum Sequenzvergleich und Bestimmen der Ähnlichkeit sind bekannt und in dem Fachgebiet Routine.
Funktionell äquivalente Nukleinsäuresequenzen schließen zum Beispiel Sequenzen ein, die verwandt sind, jedoch verschieden, und das gleiche Mch4- oder Mch5-Polypeptid auf Grund der Degeneriertheit des genetischen Kodes kodieren, als auch Sequenzen, die verwandt sind, jedoch verschieden, und ein verschiedenes Mch4- oder Mch5-Polypeptid kodieren, das eine ähnliche funktionelle Aktivität aufweist. In beiden Fällen kodieren die Nukleinsäuren funktionell äquivalente Genprodukte. Funktionelle Fragmente von Mch4 oder Mch5, die Nukleinsäuren kodieren, so wie Oligonucleotide, Polyoligonucleotide, Primer und dergleichen, werden auch als innerhalb der Definition des Ausdrucks und der Erfindung, wie beansprucht, angesehen. Funktionelle Äquivalenz ist auch für Mch4- oder Mch5-Nukleinsäuren relevant, die keine Genprodukte kodieren, jedoch zum Beispiel statt dessen funktionelle Elemente an sich und aus sich sind. Spezifische Beispiele für solche funktionellen Nukleinsäuren schließen zum Beispiel Promotoren, Verstärkersequenzen und andere regulatorische Elemente der Genexpression ein.
Mch4- oder Mch-5-Polypeptide der Erfindung haben eine Aminosäuresequenz im wesentlichen ähnlich derjenigen, die in den 1, 2 und 3 bzw. in SEQ-ID Nrn. 2 und 4 gezeigt sind. Funktionell äquivalente Mch4-Aminosäuresequenzen schließen auf ähnliche Weise zum Beispiel verwandte, jedoch verschiedene Sequenzen ein, solange das verschiedene Polypeptid wenigstens eine funktionelle Aktivität von Mch4 oder Mch5 aufweist. Solche verwandten, jedoch verschiedenen Polypeptide schließen zum Beispiel Ersetzungen von konservierten und nicht-essentiellen Aminosäuren ein. Fragmente und funktionelle Domänen von Mch4 oder Mch5 sind auf ähnliche Weise in der Definition des Ausdruckes und der beanspruchten Erfindung eingeschlossen.
Daher ist es zu verstehen, dass beschränkte Abweichungen gemacht werden können, ohne die biologische Funktion des Mch4- oder Mch5-Polypeptides zu zerstören, und dass nur ein Abschnitt der gesamten Primärstruktur erforderlich sein könnte, um die Aktivität zu bewirken. Zum Beispiel sollen auch kleinere Modifikationen der Mch4- oder Mch-5-Aminosäuresequenzen (SEQ ID Nrn: 2 und 4), die ihre Aktivität nicht zerstören, auch in die Definition von Mch4 oder Mch5 und in die Definition der Polypeptide fallen, die als solche beansprucht sind. Auch fallen zum Beispiel genetisch veränderte Fragmente von Mch4 oder Mch5, entweder alleine oder mit heterologen Proteinen fusioniert, so wie Fusionsproteine, die die messbare enzymatische oder andere biologische Aktivität erhalten, in die Definition der Polypeptide, die als solche beansprucht sind.
Es ist zu verstehen, dass kleinere Abweichungen der primären Aminosäuresequenz zu Polypeptiden führen können, die im wesentlichen äquivalente o- der verstärkte Funktionen aufweisen, im Vergleich mit den Sequenzen, die in 1 und 2 (SEQ ID Nrn: 2 und 4) dargelegt sind. Diese Modifikationen können willkürlich sein, wie durch ortsgerichtete Mutagenese, oder können zufällig sein, so wie durch Mutation in Wirten, die Erzeuger von Mch4 oder Mch5 sind. Alle diese Abweichungen sind eingeschlossen, solange die biologische Funktion von Mch4 oder Mch5 beibehalten wird. Weiterhin können verschiedene Moleküle an Mch4 oder Mch5 angehängt werden, zum Beispiel andere Proteine, Kohlenhydrate, Fette oder chemische Reste. Solche Modifikationen sind in die Definition der Mch4- oder Mch5-Polypeptide eingeschlossen.
Die Erfindung stellt ein Gen, das Mch4 oder Mch5 oder ein Fragment davon kodiert, bereit. Die Erfindung stellt auch eine isolierte Nukleinsäuresequenz bereit, die Mch4 oder Mch5 oder ein Fragment davon kodiert. Die Gen- und Nukleinsäuresequenzen kodieren im wesentlichen die Sequenz, wie sie in SEQ ID Nrn.: 1 und 3 gezeigt wird. Fragmente der Gen- oder Nukleinsäuresequenz sind bereitgestellt, die einzel- oder doppelsträngige Nukleinsäuresequenzen umfassen, welche im wesentlichen die Sequenzen aufweisen, die in SEQ ID Nrn. 1 und 3 dargestellt sind.
Die Mch4- oder Mch5-Nukleinsäuren der vorliegenden Erfindung wurden durch eine neue Herangehensweise des Durchsuchens einer menschlichen Datenbank von exprimierten Sequenzsignalen (ESTs) unter verschiedenen Stringenzen identifiziert und isoliert, um potentielle neue Sequenzfragmente zu identifizieren, die eine Homologie mit der ICE-Familie von Cystein-Proteasen aufweisen können. Wie unterhalb beschrieben, identifizierte eine solche Suche die Nukleinsäuren Mch4 und Mch5 der vorliegenden Erfindung und führte auch zur Neuklassifizierung der Protease-Familie für den Zelltod. Zuvor wurden diese Proteasen als die ICE-Familie von Proteasen in Bezug genommen und daher war das anfängliche Suchkriterium auf die "ICE-Familie" von Proteasen des Zelltodes gerichtet. Mit der Identifizierung von Mch4 und Mch5 jedoch können die Proteasen nun in drei Unterfamilien unterteilt werden, die hier als Ced-ähnliche, ICE-ähnliche und Nedd2/ICH-1-ähnliche Unterfamilien der Proteasen des Zelltodes in Bezug genommen werden (siehe 3B).
Mit Bezug auf die Suche nach potentiellen neuen Sequenzen mit Homologie zu der zuvor in Bezug genommenen ICE-Familie von Proteasen werden dann neue Sequenzen, die aus der Suche identifiziert wurden, dass sie eine Homologie mit der ICE-Familie von Proteasen für den Zelltod aufweisen, verwendet, um Primen zu gestalten, um die Vervielfältigung durch PCR und Klonieren der tatsächlichen cDNA zu versuchen. Der zweite Primen für die Amplifizierung wird gestaltet, um homologe Regionen in den Nukleinsäuresequenzen zu umfassen, die bekannte Mitglieder der ICE-Protease-Familie kodieren. In diesem spezifischen Fall war der Primer auf die Pentapeptid-Sequenz GSWFI/GSWYI gerichtet, die in einer Anzahl der ICE/Ced-3-Familie von Proteasen konserviert ist. Die Gestaltung des Primers sollte die vorhergesagte Strängigkeit von sowohl dem EST-Sequenz-Primen als auch dem bekannten Primen berücksichtigen. Daher wird eine solche Vorgehensweise nur, falls die Bedingungen für die Homologie-Suche und die Primerhybridisierung erfolgreich bestimmt wurden, die PCR-Vervielfältigung eines Fragmentes der cDNA der mutmaßlichen neuen Protease erlauben.
Da das Durchsuchen einer genetischen Datenbank homologe Sequenzübereinstimmungen zu jeder abgefragten Nukleotidsequenz ergeben wird, müssen zusätzliche Kriterien verwendet werden, um das authentische Homologe der ICE-Unterfamilie unter den nichtspezifischen Übereinstimmungen der Homologie zu identifizieren. Die Mitglieder der ICE-Familie teilen den höchsten Grad der Homologie im aktiven Zentrum und katalytisch wichtigen Aminosäureresten.
Ein gegebenes EST, das durch die Suche ausgegeben wird, mag einige dieser hochhomologen Stellen nicht enthalten, mag jedoch viel eher nur einen Bereich innerhalb der Protease mit kryptischer Homologie enthalten. Das Bestätigen eines EST als eine neue ICE-Protease bringt das Translatieren aller der positiven EST-Treffer in drei verschiedenen Leserahmen und die nachfolgende Identifizierung von Sequenzmotiven von Aminosäuren des konservativen aktiven Zentrums oder katalytisch bedeutender mit sich. Unter Verwendung herkömmlicher cDNA-Klonierung kann dann eine Volllängen-cDNA der mutmaßlichen neuen Protease erhalten werden und 1) hinsichtlich der gesamten strukturellen Homologie zu Mitgliedern der ICE-Familie analysiert werden, 2) rekombinant exprimiert und auf die Aktivität der Cystein-Protease analysiert und 3) auf die Induktion des programmierten Zelttodes durch heterologe Expression der cDNA in geeigneten Zellen analysiert werden.
Alternative Verfahren zu denjenigen, die oben zum Isolieren der Nukleinsäuren, die Mch4 oder Mch5 kodieren, beschrieben wurden, können auf ähnliche Weise verwendet werden. Zum Beispiel können die Fachleute unter Verwendung der hier beschriebenen Lehre routinemäßig Mch4- oder Mch5-Nukleinsäuren isolieren und unter Verwendung von im Fachgebiet gut bekannten Verfahren manipulieren. Alles, was erforderlich ist, ist die Sequenz der Nukleinsäuren, die Mch4 oder Mch5 kodieren (1 und 2 und SEQ ID Nrn: 1 und 3) oder ihre Aminosäuresequenzen (1 und 2 und SEQ ID Nrn: 2 und 4). Solche Verfahren schließen zum Beispiel das Sceenen einer cDNA- oder genomischen Bibliothek unter Verwendung synthetischer Oligonukleotide, von Nukleinsäurefragmenten oder Primern als die Hybridisierungssonden ein. Auf eine andere Weise können Antikörper gegen die Aminosäuresequenz von Mch4 oder Mch5 oder Fragmente dieser erzeugt werden und verwendet werden, um einer Expressionsbibliothek zu screenen, um Mch4 oder Mch5 kodierende Nukleinsäuren zu isolieren. Andere Bindungsreagenzien für Mch4- oder Mch5-Polypeptide können auf ähnliche Weise verwendet werden, um Mch4- oder Mch5-Polypeptide zu isolieren, die im wesentlichen die in 1 und 2 gezeigte Aminosäuresequenz aufweisen.
Auf ähnliche Weise können Substratreagenzien, so wie nicht-spaltbare Peptidanaloga von Cystein-Proteasen und an FADD-ähnliche Domänen bindende Polypeptide verwendet werden, um Mch4- oder Mch5-Polypeptide zu screenen und zu isolieren.
Überdies schließen rekombinante DNA-Verfahren, die gegenwärtig von den Fachleuten verwendet werden, die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) ein, die, kombiniert mit Mch4 oder Mch5-Nukleotid- und Aminosäuresequenzen, die hier beschrieben sind, die Reproduktion von Sequenzen, die Mch4 oder Mch5 kodieren, ermöglicht. Erwünschte Sequenzen können ausgehend von so wenig wie einer einzelnen Genkopie mittels der PCR exponentiell vervielfältigt werden. Die PCR-Technologie ist der Gegenstand der US-amerikanischen Patente Nr. 4 683 195, 4 800 159, 4 754 065 und 4 683 202, von. denen alle durch Bezugnahme hier enthalten sind.
Die oben beschriebenen Verfahren sind den Fachleuten bekannt und zum Beispiel in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laborstory, New York (1992) und den verschiedenen darin zitierten Bezugnahmen und in Ansubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Baltimore, MD (1989) und in Harlow et al., Antibodies: A Laborstory Manual, Cold Spring Harbor Laborstory, New York (1989) beschrieben. Diese Bezugnahmen und die darin zitierten Veröffentlichungen sind hierdurch durch Bezugnahme ausdrücklich enthalten.
Die Erfindung stellt ein isoliertes Mch4- oder Mch5-Polypeptid bereit, das im wesentlichen die Aminosäuresequenz umfaßt, wie die in 1 und 2 gezeigte (SEQ-ID Nrn: 2 und 4). Es werden auch funktionelle Fragmente von Mch4 oder Mch5 bereitgestellt. Spezifische Beispiele von funktionellen Fragmenten von Mch4 oder Mch5 sind zum Beispiel die katalytische Domäne, die die Aminosäuresequenz des aktiven Zentrums QACQG enthält, und die FADD-ähnlichen Domänen Mch4A, Mch4B; Mch5A und Mch5B. Im Vergleich mit der Aminosäuresequenz des aktiven Zentrums anderer Familienmitglieder von ASCP, QACRG, ist diese Sequenz des aktiven Zentrums ähnlich, weicht jedoch in Position 4 ab, wo R durch Q substituiert ist.
Isolierte Mch4- oder Mch5-Polypeptide der Erfindung können durch eine Vielzahl von Verfahren erhalten werden, die im Fachgebiet bekannt sind. Zum Beispiel können die isolierten Peptide durch biochemische Verfahren aufgereinigt werden, einschließlich zum Beispiel der Affinitätschromatographie. Die Affinitätsmatrices, die für die Isolierung von Mch4 oder Mch5 verwendet werden können, können anti-Mch4- oder anti-Mch5-monoklonale oder polyklonale Antikörper sein, die gegen die in 1 und 2 (SEQ ID Nrn: 2 und 4) gezeigten Sequenzen hergestellt wurden, oder Fragmente davon, so wie synthetische Peptide. Überdies können Polypeptide, die die FADD-ähnliche Domäne binden, die in der Lage sind, die FADD-ähnlichen Domänen am N-Terminus von Mch4 und Mch5 zu binden, auch als Affinitätsmatrices verwendet werden. Auf eine andere Weise können Substratanaloga oder enzymatische Inhibitoren von Mch4 oder Mch5 auf eine ähnliche Weise wie Affinitätsmatrices verwendet werden, um im wesentlichen reine Mch4- oder Mch5-Polypeptide der Erfindung zu isolieren.
Mch4- oder Mch5-Polypeptide können auch durch rekombinante Verfahren produziert werden, die den Fachleuten bekannt sind. Rekombinante Mch4- oder Mch5-Polypeptide schließen zum Beispiel eine Aminosäuresequenz ein, die im wesentlichen die Gleiche ist, wie die in 1 und 2 gezeigte (SEQ ID Nrn: 2 und 4), sowie auch Fusionsproteine und Fragmente davon. Die für Mch4 oder Mch5 kodierenden Nukleinsäuren können in die geeigneten Vektoren zur Vervielfältigung, Manipulierung und Expression kloniert werden. Solche Vektoren sind bekannt oder können von den Fachleuten konstruiert werden und sollten alle Expressionselemente enthalten, die für die Transkription, Translation, Regulation, und falls erwünscht, Sortieren der Mch4- oder Mch5-Polypeptide enthalten. Die Vektoren können auch zur Verwendung in entweder prokanotischen oder eukanotischen Wirtssystemen sein, solange die Expressions- und regulatorischen Elemente einen kompatiblen Ursprung haben. Ein durchschnittlicher Fachmann wird wissen, welche Wirtssysteme mit einem bestimmten Vektor kompatibel sind. Die rekombinanten Polypeptide können durch die oben beschriebenen Verfahren isoliert werden.
Die Apoptose spielt bei vielzähligen pathologischen Zuständen eine bedeutende Rolle dadurch, dass der programmierte Zelltod entweder inhibiert ist, was zu einer erhöhten Überlebensrate der Zellen führt, oder verstärkt ist, was zu einem Verlust der Lebensfähigkeit der Zellen führt. Beispiele von patholo gischen Zuständen, die sich aus der erhöhten Überlebensrate der Zellen ergeben, schließen Krebse, sowie Lymphome, Karzinome und hormonabhängige Tumoren ein. Solche hormonabhängige Tumoren schließen zum Beispiel Brust-, Prostata- und Eierstockkrebs ein. Autoimmunkrankheiten, wie systemischer Lupus erythematosus und immunvermittelte Glomerulonephritis sowie vitale Infektionen, wie Herpesvirus, Pockenvirus und Adenovirus ergeben sich auch aus der erhöhten Überlebensfähigkeit der Zellen oder der Hemmung der Apoptose.
Im Gegensatz dazu schließen apoptotische Krankheiten, bei denen der verstärkte programmierte Zelltod ein vorherrschender Grund ist, zum Beispiel allgemein degenerative Störungen, wie die Alzheimersche Krankheit, die Parkinsonsche Krankheit, die Myatrophische Lateralsklerose, Retinitis Pigmentosa und die Kleinhirndegeneration ein. Andere Krankheiten, die mit verstärkter Apoptose in Beziehung stehen, schließen zum Beispiel myelodysplastische Syndrome, so wie die aplastische Anämie und Schädigung durch Ischämie einschließlich des myocardialen Infarkts, Schlaganfall und Verletzung durch Wiederdurchblutung ein.
Die für Mch4 oder Mch5 kodierenden Nukleinsäuren und Polypeptide der Erfindung können verwendet werden, um die Schwere der durch Zelltod vermittelten Krankheiten zu diagnostizieren, zu behandeln oder zu vermindern, so wie die diejenigen, die oben beschrieben sind, als auch andere Krankheiten, die durch entweder verstärkten oder abgeschwächten programmierten Zelltod vermittelt werden. Des weiteren können die für Mch4 oder Mch5 kodierenden Nukleinsäuren und Polypeptide der Erfindung verwendet werden, um nach pharmazeutischen Verbindungen und Makromolekülen zu screenen, welche die durch Mch4 oder Mch5 vermittelte Apoptose hemmen oder fördern. "
Zum Beispiel können die für Mch4 oder Mch5 kodierenden Nukleinsäuren, Polypeptide und funktionellen Fragmente dieser verwendet werden, um Krankheiten zu diagnostizieren, die durch den programmierten Zelltod vermittelt oder gekennzeichnet sind, oder um Reagenzien zum Diagnostizieren dieser zu erzeugen. Die Diagnose kann durch Hybridisierung von Nukleinsäuresonden mit Mch4 oder Mch5 enthaltenden Nukleotidsequenzen, durch den durch Antikörper oder Liganden vermittelten Nachweis von mit Mch4- oder Mch5-bindenden Agenzien oder durch Enzymkatalyse nachweisbarer Mch4- oder Mch5-Substrate durchgeführt werden. Solche Verfahren sind den Fachleuten Routine. Der Nachweis kann ex vivo durchgeführt werden, zum Beispiel durch Entfernen eine Zell- oder Gewebsprobe aus einem Individuum, das eine durch Zelltod vermittelte Krankheit aufweist oder verdächtig ist, diese aufzuweisen. Die Korrelierung der erhöhten Expression oder Aktivität von Mch4 oder Mch5 ist ein Zeichen für Krankheiten, die durch den erhöhten programmierten Zelltod gekennzeichnet sind, wohingegen die Korrelierung der verminderten Expression oder Aktivität von Mch4 oder Mch5 ein Anzeichen für Krankheiten ist, die durch die Hemmung des programmierten Zelttodes gekennzeichnet sind.
Die obigen Mch4- oder Mch5-Polypeptide können auch zu pharmazeutischen Zusammensetzungen formuliert werden, die im Fachgebiet für die Behandlung von durch Zelltod vermittelten Krankheiten bekannt sind, die durch erhöhte Überlebensrate von Zellen und Proliferation gekennzeichnet sind. Funktionelle Fragmente und Peptide, so wie die FADD-ähnlichen Domänen und die katalytische Domäne von Mch4 oder Mch5, können auf ähnliche Weise für die Behandlung von solchen Krankheiten formuliert werden, die mit erhöhtem Überleben der Zellen und der Proliferation in Beziehung stehen. Zusätzlich können Moleküle, die mit Mch4 und Mch5 in Interaktion treten, zusätzlich verwendet werden, um die durch Mch4 und Mch5 vermittelte Apoptose zu induzieren. Solche Moleküle können zum Beispiel FADD und FADD- oder fas-Aktivatoren einschließen. Die Verabreichung von Mch4 oder Mch5- Polypeptiden und funktionellen Fragmenten dieser wird die Apoptose in behandelten Zellen induzieren und diejenigen Zellen eliminieren, die durch eine erhöhte Überlebensrate der Zellen oder Proliferation gekennzeichnet sind. Die Verabreichung von Mch4- oder Mch5-Polypeptiden, die nicht direkt auf Mch4- oder Mch5-Substrate einwirken, jedoch die Aktivierung der Mch4- oder Mch5-Protease induzieren, können auf ähnliche Weise zur Behandlung von Krankheiten verwendet werden, die durch eine erhöhte Überlebensrate der Zellen und Proliferation gekennzeichnet sind.
Um wirksam zu sein, müssen die Mch4- oder Mch5-Polypeptide in die Zellen eingeführt werden, die durch eine erhöhte Überlebensrate der Zellen gekennzeichnet sind. Das Einführen kann durch eine Vielzahl von Mitteln erreicht werden, die im Fachgebiet bekannt sind, einschließlich zum Beispiel flüssiger Vesikel und der durch Rezeptor vermittelten Endozytose. Das Abzielen auf den geeigneten Zelltyp kann auf ähnliche Weise durch Konjugation an spezifische Rezeptor-Liganden, spezifische Antikörper für die Zielzelle und dergleichen erreicht werden.
Die Mch4- oder Mch5-Polypeptide werden durch herkömmliche Verfahren verabreicht, in Dosierungen, die ausreichend sind, um die Apoptose in Zellen zu induzieren, die durch eine erhöhte Überlebensrate der Zellen oder Proliferation gekennzeichnet sind. Solche Dosierungen sind bekannt oder können auf einfache Weise durch die Fachleute bestimmt werden. Die Verabreichung kann zum Beispiel durch intravenöse, interperitonale oder subkutane Injektion verabreicht werden. Die Verabreichung kann in einer Vielzahl verschiedener Kuren durchgeführt werden, die die Verabreichung einer einzelnen hohen Dosis oder die wiederholte Verabreichung kleiner Dosen oder eine Kombination von beiden einschließen. Die Dosierung wird von dem Zelltyp, dem Fortschritt der Krankheit und der Gesamtgesundheit des Individuums abhängen und wird den Fachleuten bekannt sein oder kann von ihnen bestimmt werden.
Im Gegensatz zur Induktion der durch Mch4 oder Mch5 vermittelten Apoptose zur Behandlung pathologischer Zustände, die durch eine erhöhte Überlebensrate der Zellen oder Proliferation gekennzeichnet sind, können Inhibitoren von Mch4 oder Mch5 verwendet werden, um Krankheiten zu behandeln, die durch einen verstärkten programmierten Zelttod gekennzeichnet sind. Solche Inhibitoren können zum Beispiel Inhibitoren der Mch4- oder Mch5-Proteaseaktivität sein oder Inhibitoren der Umwandlung des inaktiven proMch4 oder proMch5 zu den aktiven Proteasen Mch4 und Mch5 oder alternativ Inhibitoren der Bindungsaktivität der FADD-ähnlichen Domänen. Spezifische Beispiele solcher Inhibitoren können zum Beispiel anti-Mch4 oder anti-Mch5-Antikörper, Proteine oder kleine Peptidyl-Protease-Inhibitoren oder kleine, nicht-peptidische organische, molekulare Inhibitoren einschließen, die in einem Medium formuliert sind, das die Einführung in den erwünschten Zelltyp ermöglicht. Auf eine andere Weise können solche Inhibitoren an Zielliganden zur Einführung durch die zeltvermittelte Endozytose oder andere, durch Rezeptor vermittelte Ereignisse gebunden sein. Spezifische Beispiele für Peptidyl-Inhibitoren von Mch4 oder Mch5 sind in Tabelle 1 von Beispiel III beschrieben und schließen zum Beispiel Suizid-Inhibitoren und Substrat-Analoga, wie das Tetrapeptid DEVD-Aldehyd und CrmA des Kuhpockenvirus, ein.
Andere Inhibitoren von Mch4 oder Mch5 schließen zum Beispiel kleine Moleküle und organische Verbindungen ein, die Mch4 oder Mch5 durch eine Mechanismus vom kompetitiven oder nicht-kompetitiven Typ binden und inaktivieren. Moleküle oder Verbindungen, die den Stoffwechselweg von Mch4 oder Mch5 indirekt hemmen, können auch als Inhibitoren von Mch4 verwendet werden. Inhibitoren von Mch4 oder Mch5 können durch Screenen nach Molekülen identifiziert werden, die spezifische oder nützliche inhibitorische Aktivität auf Mch4 oder Mch5 aufweisen. Solche Verfahren sind weiter unten beschrieben und können durch die Fachleute ausgeführt werden, wenn die Nukleotid- und Aminosäuresequenzen für Mch4 oder Mch5, die hier beschrieben sind, gegeben sind.
Dominante/Negative Inhibitoren von Mch4 oder Mch5 können auch verwendet werden, um die Schwere von Krankheiten zu behandeln oder zu vermindern, die durch einen verstärkten programmierten Zelttod gekennzeichnet sind. In dieser Hinsicht können große Untereinheiten von Mch4 oder Mch5 verwendet werden, denen das aktive Zentrum QACQG fehlt, um die kleine Untereinheit von Mch4 oder Mch5 zu binden und zu verhüten, dass sich aktive Proteasekomplexe bilden. Solch ein Mechanismus der dominanten negativen Inhibierung von Mch4 ist ähnlich der dominanten negativen Inhibierung von Ich-1_L durch Ich-1_S. Untereinheiten anderer ASCPs können auf ähnliche Weise als dominante/negative Inhibitoren der Aktivität von Mch4 oder Mch5 verwendet werden und daher Krankheiten behandeln, die durch den programmierten Zelttod vermittelt werden. Solche Untereinheiten können ausgewählt werden, so dass sie entweder das p17- oder p12-Mch4- oder -Mch5-Polypeptid binden und ihre Zusammenfügung zu aktiven tetrameren Proteasekomplexen verhindern. Weiterhin können auch Mch4- oder Mch5-Untereinheiten, die modifiziert worden sind, so dass sie katalytisch inaktiv sind, als dominante negative Inhi bitoren von Mch4 verwendet werden. Solche Modifikationen schließen zum Beispiel die Mutation des Cysteinrestes des aktiven Zentrums ein, um Alanin oder Glycin einzuschließen, jedoch nicht darauf beschränkt.
Substrat-Antagonisten von Mch4 oder Mch5 können auf ähnliche Weise verwendet werden, um von Krankheiten, die durch den verstärkten programmierten Zelltod vermittelt sind, zu behandeln oder deren Schwere zu mindern. Solche Substratantagonisten können an Mch4 binden und die Spaltung durch dieses hemmen. Die Hemmung der Substratspaltung verhütet das einhergehende Fortschreiten des programmierten Zelttodes. Substrat-Antagonisten schließen zum Beispiel Liganden und Verbindungen kleiner Moleküle ein.
Die Behandlung oder Minderung der Schwere der durch Zelltod vermittelten Krankheiten kann auch durch Einführen von exprimierbaren Nukleinsäuren erreicht werden, die Mch4- oder Mch5-Polypeptide oder funktionelle Fragmente dieser kodieren, in Zellen, die durch solche Krankheiten gekennzeichnet sind. Zum Beispiel können erhöhte Syntheseraten von Mch4 oder Mch5 zum Beispiel durch die Verwendung rekombinanter Expressionsvektoren und der Technik zum Gentransfer erzielt werden. Auf ähnliche Weise kann die Behandlung oder Verminderung der Schwere von durch Zelltod vermittelten Krankheiten auch durch Einführen und Exprimieren. von Nukleinsäuren im Antisense zu Mch4 oder Mch5 erreicht werden, um so die Syntheseraten von Mch4 oder Mch5 zu hemmen. Solche Verfahren sind im Fachgebiet gut bekannt und werden unterhalb mit Bezugnahme auf rekombinante vitale Vektoren beschrieben werden. Andere Vektoren, die mit der geeigneten Zielzelle kompatibel sind, können das gleiche Ziel erreichen und können daher in einem Verfahren an Stelle rekombinanter vitaler Vektoren ersetzt werden, die hier beschrieben werden.
Rekombinante vitale Vektoren sind zur in vivo Expression einer gewünschten Nukleinsäure geeignet, da sie Vorteile wie eine laterale Infektion und Zielspezifität bieten. Die laterale Infektion ist dem Lebenszyklus von Retroviren inhärent und ist der Vorgang, durch welchen eine einzelne infizierte Zelle viele Nachkommen-Virionen erzeugt, die sich abknospen und benachbarte Zellen infizieren. Das Ergebnis ist ein großes Gebiet, das schnell infiziert wird, wobei das meiste davon nicht durch die ursprünglichen viralen Partikel infiziert wird. Dieses steht im Gegensatz zu dem vertikalen Typ der Infektion, bei welchem sich das infizierende Agens nur durch Tochter-Nachkommen ausbreitet. Virale Vektoren können auch so erzeugt werden, dass sie nicht in der Lage sind, sich lateral auszubreiten. Diese Eigenschaft kann hilfreich sein, falls es der gewünschte Zweck ist, ein spezifiziertes Gen nur in eine lokalisierte Anzahl von Zielzellen einzuführen.
Typischerweise infizieren Viren spezifische Zelltypen und pflanzen sich darin fort. Daher verwendet die Zielspezifität von viralen Vektoren diese natürliche Spezifität, um wiederum spezifisch ein erwünschtes Gen in vorbestimmte Zelltypen einzuführen. Der in dem Verfahren der Erfindung zu verwendende Vektor wird von dem ins Ziel zu nehmenden erwünschten Zelltyp abhängen. Zum Beispiel sollte dann, wenn neurogenerative Krankheiten durch Vermindern der Mch4- oder Mch5-Aktivität von betroffenen neuronalen Zellen behandelt werden sollen, ein Vektor verwendet werden, der für Zellen der neuronalen Zelllinie spezifisch ist. Auf ähnliche Weise sollte dann ein viraler Vektor, der für Blutzellen und ihre Vorläufer spezifisch ist, vorzugsweise für die spezifische Art der hematopoietischen Zelle, verwendet werden, falls Krankheiten oder pathologische Zustände des hematopoietischen Systems zu behandeln sind. Überdies können solche Vektoren zusätzlich mit spezifischen Rezeptoren oder Liganden und dergleichen modifiziert werden, um die Zielspezifität durch Rezeptor-vermittelte Ereignisse zu modifizieren oder abzuändern. Diese Modifikations-verfahren können zum Beispiel durch rekombinante DNA-Verfahren oder synthetische chemische Verfahren durchgeführt werden. Der spezifische Vektortyp wird von der beabsichtigten Anwendung abhängen. Die tatsächlichen Vektoren sind auch bekannt und innerhalb des Fachgebietes bereitwillig verfügbar oder können durch einen Fachmann unter Verwendung gut bekannter Vorgehensweisen konstruiert werden.
Virale Vektoren, die Mch4- oder Mch5-Nukleinsäuren oder Inhibitoren von Mch4 oder Mch5, so wie Antisense-Nukleinsäuren kodieren, können auf mehrere Arten verabreicht werden, um die Expression solcher Sequenzen zu erhalten und dadurch die Aktivität von Mch4 oder Mch5 in den Zellen entweder zu erhöhen oder zu vermindern, die durch die Krankheit oder den pathologi scheu Zustand betroffen sind. Falls virale Vektoren verwendet werden, kann das Verfahren zum Beispiel den Vorteil ihrer Zielspezifität ausnutzen und muß in der Folge nicht lokal an der kranken Stelle verabreicht werden. Jedoch kann eine lokale Verabreichung eine schnellere und wirksamere Behandlung bereitstellen. Die Verabreichung kann auch zum Beispiel durch intravenöse oder subkutane Injektion in das Subjekt durchgeführt werden. Die Injektion von viralen Vektoren in die Spinatflüssigkeit kann auch als eine Art der Verabreichung verwendet werden, insbesondere in dem Fall neurodegenerativer Krankheiten. Im Anschluss an die Injektion werden virale Vektoren zirkulieren, bis sie Wirtszellen mit der geeigneten Zielspezifität zur Infektion erkennen.
Wie oben beschrieben ist, kann eine Art der Verabreichung von Mch4 oder Mch5 kodierenden Vektoren durch die direkte Inokulation lokal an der Stelle der Krankheit oder des pathologischen Zustandes sein. Die lokale Verabreichung ist vorteilhaft, da es keinen Verdünnungseffekt gibt und daher eine kleinere Dosis erforderlich ist, um die Expression von Mch4 oder Mch5 in einer Mehrheit der Zielzellen zu erreichen. Zusätzlich kann die lokale Inokulierung das Erfordernis des Abzielens, das bei anderen Formen der Verabreichung erforderlich ist, abmildern, da ein Vektor verwendet werden kann, der alle Zellen in dem inokulierten Gebiet infiziert. Falls die Expression nur bei einer spezifischen Untergruppe von Zellen innerhalb des inokulierten Bereiches erwünscht ist, können Promotor- und Expressionselemente, die für die erwünschte Untergruppe spezifisch sind, verwendet werden, um dieses Ziel zu erreichen. Solche nicht-zielgerichteten Vektoren können zum Beispiel virale Vektoren, virale Genome, Plasmide, Phagemide und dergleichen sein. Transfektions-Vehikula, so wie Liposomen, können verwendet werden, um die nichtviralen Vektoren, die oben beschrieben wurden, in Empfängerzellen innerhalb des inokulierten Bereiches einzuführen. Solche Transfektions-Vehikel sind dem Fachmann bekannt. Auf eine andere Weise jedoch können nichtzielgerichtete Vektoren direkt in ein Gewebe eines Individuums verabreicht werden. Solche Verfahren sind im Fachgebiet bekannt und sind zum Beispiel von Wolff et al. beschrieben (Science 247: 1465–1468 (1990).
Zusätzliche Eigenschaften können den Vektoren zugegeben werden, um die Sicherheit sicherzustellen und/oder um die therapeutische Wirksamkeit zu verstärken. Solche Eigenschaften schließen zum Beispiel Macker ein, die verwendet werden können, um negativ gegen Zellen zu selektieren, die mit dem rekombinanten Virus infiziert sind. Ein Beispiel eines solchen negativen Selektionsmarkers ist das TK-Gen, das oben beschrieben wurde, das die Sensitivität gegenüber dem Antibiotikum Gancyclovir überträgt. Die negative Selektion ist daher ein Mittel, durch welches die Infektion kontrolliert werden kann, da sie einen induzierbaren Suizid durch die Zugabe des Antibiotikums bereitstellt. Ein solcher Schutz stellt sicher, dass zum Beispiel, falls Mutationen auftreten, die Mutantenformen von Mch4 oder Mch5 erzeugen, eine Fehlfunktion der Apoptose nicht auftreten wird.
Wie zuvor beschrieben ist, können die für Mch4 oder Mch5 kodierenden Nukleinsäuren und die Mch4- oder Mch5-Polypeptide der Erfindung verwendet werden, um nach Verbindungen zu screenen, die die Expression der durch Mch4 oder Mch5 vermittelten apoptotischen Aktivität hemmen oder verstärken. Die durch Mch4 oder Mch5 vermittelte apoptotische Aktivität schließt zum Beispiel sowohl die Protease-Aktivität dieser ASCPs und/oder die Bindungsaktivität der FADD-ähnlichen Domäne ein. Solche Screeningverfahren sind den Fachleuten bekannt und können entweder durch in vitro oder in vivo Verfahren durchgeführt werden. Zum Beispiel ist in Beispiel II ein spezifischer in vitro Test für die Mch4- oder Mch5-Protease-Aktivität beschrieben. Dieser Test verwendet Mch4- oder Mch5-Polypeptid, das in einer aktiven, prozessierten Form rekombinant in E. coli exprimiert ist, dessen Protease-Aktivität durch Inkubation mit einem fluoreszierenden Substrat (DEVD-AMC) gemessen wird. Darin sind auch Peptid- und Polypeptid-Inhibitoren von Mch4 beschrieben. Dieser Test kann verwendet werden, um die Bibliotheken von synthetischen oder natürlich auftretenden Verbindungen zu screenen, einschließlich Makromolekülen, nach Agenzien, die die Aktivität von Mch4 oder Mch5 entweder hemmen oder verstärken. Die Mch4- oder Mch5-Polypeptide, die in dem Test zu verwenden sind, können zum Beispiel durch in vitro Translation, rekombinante Expression oder biochemische Verfahren erhalten werden. Andere Verfahren als diejenigen, die im Beispiel II beschrieben sind, können auch verwendet werden, um Verbindungen, die Mch4 oder Mch5 hemmen, zu screenen und zu identifizieren. Solche Verfahren können zum Beispiel Bindetests einschließen, so wie ELISA und RIAs unter Verwendung der die FADD- ähnliche Domäne bindenden Proteine. Ein spezifisches Beispiel sind Peptid-Bibliotheken im Phagen-Display, wo mehr als 10⁸ Peptidsequenzen in einer einzelnen Runde des Waschens gescreent werden können. Solche Verfahren und andere sind im Fachgebiet bekannt und können eingesetzt werden, um Verbindungen zu identifizieren, die die Mch4- oder Mch5-Aktivität hemmen oder verstärken.
Es ist zu verstehen, dass Abweichungen, die die Aktivität der verschiedenen Ausführungsformen dieser Erfindung nicht wesentlich beeinflussen, auch in der Definition der hier bereitgestellten Erfindung enthalten sind. Entsprechend sind die folgenden Beispiele dazu gedacht, die vorliegende Erfindung zu erläutern, jedoch nicht einzuschränken.
Beispiel I
Klonierung und Charakterisierung von Mch4
Dieses Beispiel zeigt die Klonierung, Sequenzanalyse und Gewebsverteilung von Mch4 und Mch5. Die hier beschriebenen Ergebnisse zeigen an, dass Mch4 und Mch5 neue Mitglieder der Familie der Aspartat-spezifischen Cystein-Proteasen für den Zelttod sind.
Um potentielle neue Mitglieder der ICE-Familie von Cystein-Proteasen zu identifizieren, wurde eine Vorgehensweise eingesetzt, die die Information aus der Datenbank GenBank exprimierter menschlicher Sequenzsignale (ESTs) und PCR kombiniert. Anfänglich wurden Ced-3/ICE-ähnliche apoptotische Cystein-Proteasen aus Jurkat T-Lymphozyten durch Amplifikation einer menschlichen Jurkat cDNA-Bibliothek unter Verwendung degenerierter PCR-Primer angereichert, die die konservierten Pentapeptide GSWFI/GSWYI kodieren (Fernandes-Alnermi et al., Cancer Res, 55: 2737–2742 (1995 a)). Für diese Aminosäuresequenz ist gefunden worden, dass sie unter ICE-Familienmitgliedern konserviert ist. Kurz gesagt, es wird ein 10 μL Aliquot einer menschlichen Jurkat λ Uni-Zap^TMXR cDNA-Bibliothek, die annähernd 10⁸ PBE enthielt, bei 99°C für fünf Minuten denaturiert und als ein Substrat für die PCR-Amplifikation mit einem degenerierten Primen, der das Pentapeptid GSWFI/GSWYI kodiert, und einem für den T3 Vektor spezifischen Primen (Stratagene) verwendet.
Die angereicherte Bibliothek wurde dann mit einem Primer amplifiziert, der von einer EST-Sequenz abgeleitet war, die in einer Homologie-Suche der Datenbank GenBank unter Verwendung einer abfragenden Nukleotidsequenz entsprechend der kodierenden Sequenz für Mch2 und CPP32 identifiziert wurde. Die sekundäre Amplifizierung wurde ausgehend von einem 10 μL Aliquot der oben amplifizierten Sequenzen durchgeführt, kombiniert mit einem Primer, der von der Sequenz T96912 der GenBank abgeleitet war (Primer T96-pr1: TCAGCCTCGGCAGGAATAC, SEQ ID Nr: 5), und einem zweiten, für den Vektor spezifischen Primer (SK-Zap: CAGGAATTCGGCACGAG, SEQ ID Nr: 6). Die sekundären Amplifikationsprodukte wurden in einem mit Sma I geschnittenen Bluescript II KS⁺-Vektor kloniert. Alle Klone wurden durch PCR unter Verwendung eines degenerierten Oligonucleotides, das der konservierten Aminosäuresequenz QACRG des aktiven Zentrums entsprach, und des SK-Zap-Primers gescreent. Klone, die für das Vorliegen der QACRG kodierenden Sequenz positiv waren, wurden dann einer DNA-Sequenzierung unter Verwendung der T3- und T7-Sequenzierprimer (Stratagene) unterworfen. Diese Amplifizierung und das Screenen führten zur Identifizierung einer Ced-3/ICE-ähnlichen partiellen cDNA mit großer Homologie zu CPP32 und Ced-3.
Die partielle cDNA, die aus den QACRG-Screenen identifiziert wurde, wurde dann aus dem Vektor ausgeschnitten, radioaktiv markiert und verwendet, um die originale Jurkat λ Uni-Zap^TMXR cDNA-Bibliothek auf Volllängen-cDNA-Klone zu screenen. Positive λ-Klone wurden aufgereinigt, in einen pBluescript II SK-Plasmidvector gerettet und sequenziert.
Das obige Screenen identifizierte einen cDNA-Klon von 3,6 kb aus der menschlichen Jurkat T-Lymphozyten-cDNA-Bibliothek. Diese cDNA enthält einen offenen Leserahmen von 1.437 bp, der ein Protein von 479 Aminosäuren kodiert, das Mch4 genannt wird (SEQ ID Nrn: 1 bzw. 2). Wie in 1 und 3A gezeigt ist, ist proMch4 ein Polypeptid von 479 Aminosäureresten mit einer vorhergesagten Molekülmasse von 55 kDa. Obwohl mit Blick auf die Gewebsverteilung unten vollständiger beschrieben, wird das Polypeptid Mch4 von einer annähernd 4,0 kb mRNA kodiert. Diese Größe zeigt zusammen mit dem Vorliegen eines Stop-Codons im Leserahmen 12 bp stromaufwärts von dem Initiator-Methionin, dass die klonierte cDNA für Mch4 (SEQ ID Nr: 1) die kodierende Region in Volllänge enthält.
Im Anschluss an die Identifizierung und das Klonieren von Mch4 führte eine nachfolgende Recherche in der Datenbank GenBank zur Identifizierung einer zweiten neuen EST-Sequenz (N42544) mit ausführlicher Homologie zu Mch4. Kurz gesagt, eine Homologie-Suche der Datenbank GenBank von menschlichen expremierten Sequenzsignalen (ESTs) nach Sequenzen ähnlich zu Mch4 ergab eine EST-Sequenz von 449 bp (N 42544) mit einer Identität von 64% zu Mch4. Unter Verwendung von PCR-Primern, die von dieser EST-Sequenz abgeleitet waren (Mch5-pr1, GACAGAGCGAGATTCTGT; Mch5-pr 2, GCACCATCAATCAGAAGG (SEQ ID Nrn: 7 bzw. 8) und den für den Vektor spezifischen Primern T3 und SK-Zap wurde die cDNA in vollständiger Länge, die diesem Gen entsprach, durch PCR aus der Jurkat cDNA-Bibliothek amplifiziert und in den KS-Vektor kloniert. Um diese Amplifizierung durchzuführen, wurden die Mch5-pr1- und T3-Vektor-Primer für den primären PCR-Amplifikationsschritt verwendet, um die 5'-Sequenzen von Mch5 zu amplifizieren, während der Mch5-pr2 und der für den SK-Zap-Vektor spezifische Primen für den sekundären Amplifizierungsschritt verwendet wurden. Die Volllängen-cDNA wurde sequenziert und ihr Genprodukt wurde Mch5 (SEQ ID Nr: 3) genannt.
Die Mch5-cDNA kodiert ein Protein von etwa 496 Aminosäuren (SEQ ID Nr: 4) mit dem höchsten Grad an Homologie zu Mch4 im Vergleich mit anderen Familienmitgliedern. Ausschließlich der Prodomäne beträgt die Gesamtidentität der Sequenz zwischen Mch4 und Mch5 etwa 46%. Ein Vergleich der Identitäten der Aminosäuresequenz zwischen FADD und der FADD-ähnlichen Domäne innerhalb von Mch4 und Mch5 ist in 3A gezeigt, während eine mehrfache Ausrichtung von Aminosäuresequenzen aller bekannter ASCPs in 3B gezeigt ist. Obwohl die Sequenzvergleiche von Mch4 und Mch5 weiter unten diskutiert werden. Diese Ergebnisse zeigen an, dass Mch4 und Mch5 in der Tat unterschiedliche ASCPs sind und nicht Varianten eines einzelnen Genproduktes.
Die Identifizierung und Sequenzanalyse der neuen apoptotischen Proteasen, die hier beschrieben wurden, hat nun ergeben, dass sowohl Mch4 als auch Mch5 zu der Ced-3-ähnlichen Unterfamilie von ASCPs gehören. Kurz gesagt können zuvor identifizierte ASCPs phylogenetisch in drei Unterfamilien unterteilt werden. Die Ced-3-ähnliche ASCP-Unterfamilie enthält Ced-3, CPP32, Mch2 und Mch 3 (SEQ ID Nrn: 9–12). Die ICE-ähnliche ASCP-Unterfamilie enthält ICE, TX (ICH2, ICEreI-II, Mih1) und ICEreI III (SEQ ID Nrn: 13–15). Die NEDD-ähnliche Unterfamilie enthält ICH-1 und ihr Gegenstück der Maus NEDD2 (SEQ ID Nr: 16). Die Sequenzausrichtung von Mch4 und Mch5 mit diesen bekannten ASCPs ist in 3B gezeigt und zeigt, dass beide dieser neuen ASCPs zu der Ced-3-ähnlichen Unterfamilie von ASCPs gehören.
Sowohl Mch4 als auch Mch5 enthalten N-terminale FADD-ähnliche Effektordomänen des Absterbens. Die N-terminale Effektordomäne des Absterbens von FADD (Hsu at al. Cell, 84: 299–308 (1996) kann eine von zwei FADD-ähnlichen Domänen in entweder Mch4 oder Mch5 zur Aktivierung und Rekrutierung für den Fas-apoptotischen Stoffwechselweg binden. Die Aktivierung von Mch4 oder Mch5 durch FADD kann zum Beispiel zur Aktivierung von Proteasen stromabwärts, so wie CPP32 und Mch3, führen. In 3A ist eine mehrfache Sequenzausrichtung der Aminosäuren von FADD und jeder der FADD-ähnlichen Domänen innerhalb Mch4 (Mch4A und Mch4B) und innerhalb Mch5 (Mch5A und Mch5B) gezeigt.
In 3B ist eine mehrfache Sequenzausrichtung der Aminosäuren von relativ konservierten Bereichen innerhalb der ASCPs gezeigt. Diese Regionen enthalten zum Beispiel (1) das Pentapeptid QACRG des aktiven Zentrums, (2) die Reste für die Substratbindung P1-P4 und (3) die mutmaßlichen Prozessierungsstellen zwischen der großen und kleinen Untereinheit. Relevant Sequenzvergleiche für jede dieser Regionen und auch andere beachtenswerte Unterscheidungen sind vollständiger unten diskutiert.
Zum Beispiel in der Region, die nicht die Propeptid-Domäne enthält, sind Mch4 und Mch5 gleichermaßen mit Ced-3 (SEQ ID Nr: 9) verwandt und weisen eine gesamt Aminosäureidentität von 32% und eine Sequenzähnlichkeit von 54% auf. Im Vergleich mit den anderen Mitgliedern der menschlichen Ced-3-ähnlichen Unterfamilie ist Mch4 mehr mit Mch2 und Mch 3 (SEQ ID Nrn: 11 bzw. 12) 38–40% Sequenzidentität und einer Ähnlichkeit von 56–58% verwandt, als es dies mit CPP32 (SEQ ID Nr: 10) ist. Der letztere Vergleich offenbart eine Identität der Aminosäuren von 35% und eine Ähnlichkeit der Aminosäuresequenz von 57%. Auf der anderen Seite ist Mch5 gleichermaßen mit CPP32, Mch2 und Mch3 mit einer Identität der Aminosäuresequenz von 39–40% und einer Ähnlichkeit der Sequenz von 60–62% verwandt.
Der Vergleich von Mch4 und Mch4 offenbart einen signifikanten Grad der Homologie mit einer gesamten Sequenzidentität von 52% und Ähnlichkeit von 67% auf der Ebene der primären Aminosäuren, ausschließlich der Propeptid-Domäne. Wie in 3B gezeigt, ist die Homologie zwischen den zwei Proteinen am höchsten innerhalb der Region der kleinen Untereinheit. Eine ähnliche Beziehung wurde mit anderen Familienmitgliedern beobachtet, so wie CPP32/Mch3 und ICE/TX. Diese Sequenzähnlichkeiten zeigen an, dass Mch4 und Mch5 ähnlich wahrscheinlich miteinander wechselwirken, wie dies ihre verwandten Familienmitglieder CPP32 und Mch3 tun (Fernandes-Alnemri et al., Cancer Res. 55: 6045–6052 (1995b). Zum Beispiel heterodimerisieren Mch4 und Mch5 wahrscheinlich miteinander, um funktionelle Protease-Heterokomplexe zu bilden, wie dies CPP32 und Mch3 tun.
Die Sequenzausrichtung hat auch offenbart, dass, obwohl unterschiedlich, Mch4 und Mch5 strukturell ähnlich mit anderen bekannten ASCPs sind. Die aktiven Enzyme von Mch4 und Mch5 sind aus zwei Untereinheiten aufgebaut, die von Vorläufer-Proenzymen (Mch4 und Mch5) durch Spaltung an hochkonservierten Asp-Resten (Asp239 in Mch4 und Asp284 in Mch5) abgeleitet sind, die zwischen den zwei Untereinheiten lokalisiert sind (als D/X in 3B angedeutet). In Übereinstimmung mit anderen ASCPs werden Mch4 und Mch5 wahrscheinlich weiterprozessiert, um die Propeptid-Domänen zu entfernen. Mehrere Aspartat-Spaltungsstellen liegen in der Region der Prodomäne von sowohl Mch4 als auch Mch5 (3A) vor.
Ohne Rücksicht auf die obigen Ähnlichkeiten ist es ein hauptsächlicher Unterschied zwischen Mch4 und Mch5 und anderen Familienmitgliedern, dass das Pentapeptid des aktiven Zentrums eine nicht-konservative Substituierung von Arg zu Gln enthält. Diese Substitution verändert die zuvor konservierte Pentapeptid-Sequenz von QACRG zu QACQG. Solch eine Substitution könnte bedeutende Auswirkungen auf die Enzym- und Substratspezifitäten haben. Das Vorliegen von QACQG an Stelle von QACRG in diesen zwei Enzymen liegt nahe, dass andere unbekannte Familienmitglieder mit einer ähnlichen Substitution existieren könnten. Dieses Ergebnis vergrößert weiter die Komplexität der ASCP-Familie.
Ein weiterer Hauptunterschied zwischen Mch4 und Mch5 und anderen Mitgliedern der ASCP-Familie ist der Einschluß mehrfacher FADD-ähnlicher Domänen an ihren Amino-Termini. Der Einschluß dieser Domänen zeigt an, dass sie früh innerhalb des fas-vermittelten apoptotischen Stoffwechselweges mit FADD interagieren können, um den programmierten Zelttod zu regulieren. In der Folge kann FADD die FADD-ähnlichen Domänen in Mch4 oder Mch5 zur Aktivierung und Rekrutierung für den fas-apoptotischen Stoffwechselweg binden. Dieses Rekrutieren tritt auf, da FADD-ähnliche Domänen zu sowohl homotypen als heterotypen Interaktionen fähig sind (Gold et al., J. Biol. Chem. 270: 7795–7798 (1995); Chinnaiyan et al., Cell 81: 505–512 (1995) Hsu et al., a. a. O.(1996).
In Bezug auf spezifische Aminosäurereste, von denen angedeutet wurde, dass sie funktionelle Rollen spielen, hat die Kristallstruktur von ICE aufgezeigt, dass die Aminosäurereste His237, Gly238 und Cys285 an der Katalyse beteiligt sind, während Arg179, Gln283, Arg341 und Ser347 an der Bindung der Carboxylat-Seitenkette des P1-Aspartates des Substrates beteiligt sind. Mit der Ausnahme von Ser347 in Mch5 sind alle diese anderen Reste in allen Familienmitgliedern absolut konserviert. Nichtsdestotrotz ist die Substitution von Ser zu Thr in Mch5 entsprechend Ser347 eine konservative Substitution und ist die einzige unter all den Familienmitgliedern (3B). Eine andere konservative Substitution von Ser zu Thr kann auch bei Mch4 in der Region entsprechend dem Ser236 gesehen werden. Dieser Rest ist einer, der an der Bindung der P2-P4-Reste des Substrates beteiligt ist. Jedoch sind andere Reste, die an der Bindung der P2-P4-Reste des Substrates beteiligt sein können, nicht weithin konserviert. Dieses Ergebnis zeigt an, dass diese anderen Reste wahrscheinlich die Substratspezifität bestimmen.
Beispiel II
Gewebsverteilung und chromosomale Lokalisierung von Mch4
Dieses Beispiel zeigt das Expressionsmuster von Mch4, wie es durch eine RNA-Blotanalyse gemessen wurde und den genetischen Ort des Mch4-Genes.
Die Gewebsverteilung von Mch4 wurde durch RNA-Blotanalyse von poly-A⁺-RNA analysiert, die aus verschiedenen menschlichen Geweben isoliert wurde. Kurz gesagt, wurde die Analyse der Gewebsverteilung von Mch4-mRNA auf RNA-Blots durchgeführt, die von Clontech (San Diego, Kalifornien) hergestellt wurden, die zwei μg/Spur an poly-A⁺-RNA von jedem Ursprungsgewebe enthielten. Eine radioaktive Mch4-Ribosonde wurde unter Verwendung von Mch4-cDNA als eine Matrize für T7-RNA-Polymerase in Gegenwart von [α³²P]-ATP hergestellt. Die Blots wurden hybridisiert, gewaschen und dann durch Autoradiographie visualisiert.
Die Ergebnisse der RNA-Blots zeigten, dass eine bedeutende Mch4-Nachricht von 3,7 kb in den meisten untersuchten Geweben nachweisbar war. Die niedrigste Expression von Mch4-mRNA wurde im Gesamthirn, Niere, Prostata, Testis und Darm gesehen. Die Größe der Mch4-mRNA stimmt mit der Länge der klonierten Mch4-cDNA (3,6 kb) überein. Andere mRNA-Spezies von höherem Molekulargewicht können auch in einigen Geweben gesehen werden, so wie zum Beispiel Skelettmuskel, und könnten unprozessierte Mch4-mRNA oder eine mRNA eines verwandten Familienmitgliedes darstellen.
Um die chromosomale Lokalisierung des Mch4-Genes zu bestimmen, wurde eine Palette somatischer Nagetier-Mensch-Zellhybriden durch PCR mit für Mch4 spezifischen Primern gescreent. Kurz gesagt, es wurde eine Palette von DNAs aus somatischen Nagetier-Mensch-Zellhybriden mit PCR mit den zuvor beschriebenen, für Mch4 spezifischen Primern t96-pr1 (SEQ ID Nr. 5) und einem zweiten, für Mch4 spezifischen Primer, t96-pr5 genannt (CGGGAGAT-CATGTCTCAC, SEQ ID Nr. 17) gescreent. Diese Primen wurden auch verwendet, um die CEPH A- und B-YAC-Bibliotheken durch PCR zu screenen.
Die Ergebnisse dieser Suchen identifizierten zwei YAC -Klone (756A9 und 80004), die für Mch4 positiv waren. Eine Computer-Recherche in den Datenbanken des Whitehead-Institutes und CEPH zeigte, dass beide YACs Teil der WI-Contigs WC-630 und Wc2.16 und des CEPH-Contigs an Position 2,08 von Chromosom 2 waren. Andere YAC s (741 D10, 76X12, 809H8 und 828E8), die von den Datenbanken so ausgegeben wurden, dass sie mit 756A9 und/oder 80004 überlappten, wurden durch PCR auf das Vorliegen von Mch4-Gensequenzen getestet. Von den Klonen 76X12 und 828E8 wurde gefunden, dass sie für Mch4 positiv waren. Diese Analyse führte zu der Zuordnung von Mch4 zu Chromosom 2p12-qter. Um diese Kartierungsergebnisse zu bestätigen und um eine definitive physikalische Lokalisierung für das Mch4-Gen zu erhalten, wurde das nicht-chimäre YAC 828E8 in einer FISH-Analyse verwendet, um normale Metaphasen menschlicher Lymphozyten zu sondieren. Die chromosomale Lokalisierung von Mch4 wurde auf Chromosom 2g33-34 unter Verwendung dieser letzteren Analyse eingeengt. Dieses plaziert das Mch4-Gen innerhalb einer Region von 4 cM, die von den Zentromer-Marker D2S374 und dem Telomer-Marken D2S346 (Chumakov et al., Nature 377 (supp.): 175–183 (1995)) flankiert wird.
Beispiel III
Kinetische Werte von Mch4
Dieses Beispiel charakterisiert die Protease-Aktivität und Substrat-Spezifität der ASCP Mch4.
Die genetischen Eigenschaften von bakteriell exprimiertem rekombinantem Mch4 wurden unter Verwendung der Tetrapeptid-Substrate DEVD-AMC und YVAD-AMC in einem kontinuierlichen fluorometrischen Test (Tabelle 1) bestimmt. Das DEVD-AMC und das YVAD-AMC stellen die Spaltstellen für die poly- (ADP-Ribose) Polymerase (PARP) bzw. die P1-P4-Substrattetrapeptide von IL1 β dar (Nicholson et al., Nature 376: 37–43 (1995)). Kurz gesagt, wurde cDNA von Mch4, der der größte Teil der für das Propeptid kodierenden Sequenz (Aminosäuren 61–346) fehlte, im Leserahmen in die BamHI/Xhol-Stellen des bakteriellen Expressionsvektors pGEX-5X-3 (Pharmacia Biotech Inc.) subkloniert. Dieser Vektor erzeugt Mch4 als ein Fusionsprotein mit Glutathion S-Transferase (GST) und wurde im wesentlichen verwendet, wie beschrieben in Fernandez-Alnemri et al., a. a. O. (1995a). Der Expressionsvektor GST-Mch4 wurde konstruiert und in DH5α-Bakterien unter Verwendung routinemäßiger Verfahren der Molekularbiologie transformiert, die den Fachleuten bekannt sind. Nach Induktion mit IPTG wurden bakterielle Extrakte von E. coli, die die rekombinanten Fusionsproteine exprimierten, hergestellt. Die Extrakte wurden auf ein Glutathion-Sepharoseharz adsorbiert, mehrere Male gewaschen und dann durch SDS-PAGE analysiert. Die Präparation von Mch4 enthielt ein Protein, das als eine Doppelbande von annähernd 50 kDa (Fusion GST-große Untereinheit) und 12 kDa (kleine Untereinheit) wanderte.
Das gereinigte Fusionsprotein Mch4-GST wurde dann für weitere enzymatische Analysen verwendet. Die Aktivität von Mch4 wurde unter Verwendung bakterieller Lysate gemessen, die mit ICE-Puffer (25 mM HEPES, 1 mM ED-TA, 5 mM DTT, 0,1% CHAPS, 10% Saccharose, pH 7,5) bei Raumtemperatur (24–25° C) hergestellt wurden. Die K_i's wurden aus der Hydrolyserate von 50 μM DEVD-AMC im Anschluss an eine 30 min Präinkubation des Enzymes mit den Inhibitoren DEVD-CHO und rekombinantem CrmA-Protein bestimmt. Vor der Inkubation mit dem Enzym wurde gereinigtes CrmA durch Inkubation mit 5 mM DTT für 10 min bei 37°C aktiviert.
Wie die Tabelle 1 zeigt, sind die K_m-Werte für Mch4 für die zwei Peptidsubstrate DEVD-AMC und YVAD-AMC ähnlich. Diese Werte kontrastieren diejenigen für CPP32, wo der K_M für das Substrat YVAD-AMC > 35-fach höher als der K_M für das Substrat DEVD-AMC ist (Fernandez-Alnemri et al., a. a. O. (1995b)). Diese kinetischen Bezugnahmen sind weiter durch das Verhältnis von Vmax/Km für das Substrat DEVD-AMC erläutert. Insbesondere CPP32 besitzt eine > 500-fache höhere Spezifität für dieses Substrat im Vergleich mit Mch4 (V_max/K_mCPP32 = 9200 und V_max/K_mMch4 = 18). Ähnlich zu CPP32 und Mch3α jedoch ist Mch4 stark durch das Peptid DEVD-CHO (K_iMch4 = 14 nM) inhibiert und schwach durch CrmA (K_iMech4 = 0,75 μM) inhibiert (Fernandez-Alnemri et al., a. a. O. (1995)). Da DEVD-CHO auch das Absterben der Zelle blockiert, zeigt dieses Ergebnis weiterhin an, dass Mch4 ein ASCP ist, welches eine Rolle in dem Stoffwechselweg des Absterbens der Zelle spielt.
Beispiel IV
Granzym B aktiviert vielfache Mitglieder der CED-3-Unterfamilie im Säugetier.
Dieses Beispiel zeigt, dass die zytotoxische T-Zell-Protease, die für die Induktion der Apoptose in Zielzellen wesentlich ist, ASCP-Mitglieder der Ced-3-Unterfamilie direkt durch Spaltung in die große und kleine Untereinheit der Protease aktiviert.
Für Granzym B ist gezeigt worden, dass es CPP32 spaltet, um ein Spaltprodukt von ~20 kDa zu erzeugen, von dem angenommen wird, dass es die große Untereinheit von CPP32 ist (Darmon et al., Nature 377: 446–448 (1995)). Dieses Spaltereignis hat den Gedanken aufgebracht, dass die Spaltung durch Granzym B an der Prozessierungssequenz IETD-S zwischen den zwei Untereinheiten von CPP32 (3B) auftritt. Der Sequenzvergleich der ASCPs Mch4 und Mch5, die hier beschrieben sind, hat ergeben, dass die potentiellen Prozessierungssequenzen zwischen den zwei Untereinheiten von Mch3 und Mch4 sehr ähnlich derjenigen von CPP32 (3B) sind. Diese zwei Sequenzen enthalten identische P1-Reste (CPP32-D175, Mch3-D198, Mch4-D239) und P4-Reste (CPP32-1172, Mch3-1195, Mch4-1236) in allen drei Proenzymen und einen konservierten P3-Rest (CPP32-E173, Mch3-Q197, Mch4-E237), was nahelegt, dass die Prozessierungsstelle in CPP32 tatsächlich durch Granzym B gespalten wird, dann können auch diese anderen Mitglieder der Unterfamilie auf ähnliche Weise Substrate für die Spaltung sein.
Um zu bestimmen, ob Granzym B diese Proenzyme an den vorgeschlagenen Prozessierungsstellen spalten kann, wurden mutierte Proenzyme mit einer P1-Substitutionsmutation, die D zu A in CPP32 und Mch3 oder D zu G in Mch4 umsetzten, erzeugt. Kurz gesagt, es wurden potentielle Aspartat-Prozessierungsstellen zwischen den zwei Untereinheiten dieser ASCPs zu Alanin (CPP32 und Mch3) oder Glycin (Mch4) durch ortsgerichtete Mutagenese unter Verwendung überlappender mutagener PCR-Oligonukleotide mutiert. Zwei interne mutagene überlappende Oligonukleotid-Primen, die die D/A- oder die D/G-Mutation kodierten und zwei externe Oligonukleotide, die die ersten sechs N-terminalen Aminosäuren bzw. die letzten sechs C-terminalen Aminosäuren kodierten, wurden in einer PCR-Reaktion mit den cDNAs von CPP32, Mch3 und Mch4 verwendet. Das Asp9 von proCPP32 wurde durch PCR zu Ala mutiert, unter Verwendung eines 5''-mutagenen Oligonukleotides, das die D zu A Mutation kodierte und eines 3''- Primers, der von der 3''-nichtkodierenden Sequenz von der cDNA von CPP32 abgeleitet war. Die resultierenden PCR-Produkte wurden in den Vektor pBluescript II KS⁺ unter den T7-Promotor subkloniert und ihre Sequenz wurde durch Sequenzieren der DNA verifiziert.
Wildtyp- und mutierte cDNAs wurden in vitro in Gegenwart von ³⁵S-Methionin unter Verwendung eines gekoppelten Transkriptions-/Translations-TNT-Testkits von Promega gemäß den Empfehlungen des Herstellers transkribiert und translatiert. Zwei Mikroliter der Translations-Reaktionen wurden mit gereinigten Enzymen (100–200 ng) oder bakteriellen Lysaten, die rekombinante ASCPs exprimieren, in ICE-Puffer in einem Endvolumen von 10 μL inkubiert. Die Reaktion wurde bei 37°C bei 1–2 Stunden inkubiert und dann durch SDS-PAGE und Autoradiographie analysiert.
Im Anschluss an die in vitro Translation wurden die elterlichen und mutierten Proenzyme mit Granzym B inkubiert und dann durch SDS-PAGE und Autora diographie analysiert. Wie in 4A gezeigt, erzeugte die in vitro Translation von Wildtyp- (Spur 1) oder Asp175-mutierten (Spuren 2 und 3) CPP32-Proenzymen identische Muster von Translationsprodukten. Die bedeutenden Translationsprodukte fingen mit Met27 bzw. Met39 an. Die Inkubation dieser Translationsprodukte mit Granzym B resultierte in der Spaltung des WildtypproCPP32 bei Asp175 (Spur 5), um die zwei Untereinheiten des aktiven CPP32 zu erzeugen. Die kleine C-terminale Untereinheit wandert als eine einzelne Bande von ~12 kDa und die große N-terminale Untereinheit wandert als drei Banden (~21, ~19 und ~17 kDa).
Mit Bezug auf die Identitäten der Banden, die die große Untereinheit umfassen, ist die schwache Bande von ~21 kDa am wahrscheinlichsten ein Spaltprodukt des proCPP32 vollständiger Länge. Die große Intensität der Bande von ~19 kDa legt jedoch nahe, dass diese von der Bande von ~21 kDa durch weitere Prozessierung an der Propeptid-Domäne erzeugt wurde. Dieser Hinweis wird durch die Beobachtung gestützt, dass die Inkubation von proCPP32 mit Granzym B in Gegenwart des CPP32-Peptid-Inhibitors DEVD-CHO eine bedeutende Bande von ~21 kDa erzeugte, die nicht weiter zu der Bande von 19 kDa (4B, Spur 8) prozessiert wurde. Die weitere Prozessierung der Bande von ~21 kDa zu der Bande von ~19 kDa wurde nur in Abwesenheit des Peptidinhibitors DEVD-CHO (4A, Spur 5, und 4B, Spur 9) beobachtet. Dieses Ergebnis zeigt an, dass die zusätzliche Prozessierung der Propeptid-Domäne, die mit dem Wildtyp-proCPP32 beobachtet wird, an der autokatalytischen Aktivität des durch Granzym B aktivierten CPP32 liegt. Es wurde keine Spaltung mit der Pufferkontrolle oder dem Asp175-mutierten CPP32 (4A, Spuren 1 bzw. 3) beobachtet.
Überdies gab es keine Spaltung an der Propeptid-Domäne des Asp175-mutierten CPP32 (4A, Spur 2, und 4B, Spur 3), was eine weitere Stütze für unsere frühere Schlussfolgerung anzeigt, dass die Spaltung des Propeptids eine autokatalytische Aktivität des aktivierten CPP32 ist. Weiterhin tritt die autokatalytische Prozessierung innerhalb der Propeptid-Domäne bei Asp9 und nicht bei Asp28 auf. Die Mutation von Asp9 zu Ala inhibierte die Prozessierung der Bande von ~21 kDa zu der Bande von ~19 kDa auf eine ähnliche Art und Weise, wie dies mit dem Inhibitor DEVD-CHO (4B, Spuren 5 und 6) beobachtet wurde. Diese Werte zeigen an, dass CPP32 autokatalytisch bei Asp9 nach der Aktivierung prozessiert wird, um eine p19 (große Untereinheit) und p12 (kleine Untereinheit) zu erzeugen.
Die frühere Beobachtung, dass gereinigtes menschliches CPP32 bei Asp28 prozessiert wurde, könnte an der Tatsache liegen, dass CPP32 aus dem Zytosol von Monozyten THP-1 nach Inkubation bei 37°C für mehrere Stunden (Nicholson et al., a. a. O. (1995)) aufgereinigt wurde. Das Zytosol von THP-1 enthält eine hohe Konzentration an ICE und möglicherweise andere ICE-Homologe, die für die zusätzliche Prozessierung bei Asp28 verantwortlich sein könnten. Die Bande von ~17 kDa ist ein Spaltprodukt von einem der kleineren intern translatierten Produkte, am wahrscheinlichsten der Bande von 29 kDa.
Auf ähnliche Weise erzeugte die in vitro Translation von Wildtyp- oder Asp198-mutiertem proMch3 (5A, Spuren 1 bzw. 2) zwei Hauptprodukte. Diese zwei Translationsprodukte sind ein Produkt von 35–36 kDa, was dem proMch3 vollständiger Länge entspricht, und ein internes Translationsprodukt von 30 kDa, das am wahrscheinlichsten mit Met45 anfängt. Andere interne Translationsprodukte, die kleiner als 30 kDa sind, können auch gesehen werden.
Wie proCPP32 erzeugte die Inkubation von proMch3 mit Granzym B die zwei Untereinheiten des aktiven Mch3-Enzymes (5A, Spur 6). Diese Untereinheiten können als eine Bande von ~12 kDa gesehen werden, die der kleinen C-terminalen Untereinheit entspricht, und zwei Banden von ~20 und ~18 kDa, die der großen N-terminalen Untereinheit entsprechen. Die Bande von 20 kDa ist ein Produkt der Prozessierung von Asp198 zwischen den zwei Untereinheiten und bei Asp23 in der Propeptid-Domäne. Die Bande von ~18 kDa ist ein Spaltprodukt des kleineren intern translatierten Produktes von 30 kDa. Es wurden keine Spaltprodukte, die der kleinen oder großen Untereinheit entsprechen, mit der Pufferkontrolle oder dem Asp198-mutierten proMch3 ( 5A, Spuren 1, 2 bzw. 4) beobachtet.
Im Unterschied zu CPP32 gab es ein Spaltprodukt von 33 kDa in den Asp198-mutierten proMch3 (Spur 4). Dieses Produkt ist ein Ergebnis der Spaltung mit Granzym B in der Propeptid-Domäne von proMch3, was anzeigt, dass Granzym B proMch3 zu aktivem Mch3 prozessieren kann, ohne das Erfordernis einer zusätzlichen Aktivität, um die Propeptid-Domäne zu entfernen. Nichtsdestoweniger haben wir kürzlich gezeigt, dass CPP32 auch die Propeptid-Domänen von proMch3 sehr wirksam spalten kann (Fernandes-Alnemri et al., a. a. O. (1995b)). In der Folge würde die Aktivierung von CPP32 in vitro durch Granzym B zu der weiteren Prozessierung von sowohl CPP32 als auch seinem eng verwandten Homologen, Mch3, führen.
Zwei verkürzte Mch4, denen die N-terminalen FADD-ähnlichen Domänen fehlten, wurden verwendet, um die Spaltung von Mch4 durch Granzym B zu analysieren. Mch4-M134 beginnt mit dem Aminosäurerest M134 und proMch5-M235 beginnt mit dem Aminosäurerest M235. Die in vitro Translation von Mch4-M134 oder Asp239-mutiertem Mch4-M134 (5B, Spuren 4 bzw. 5) erzeugten zwei Hauptprodukte. Diese zwei Translationsprodukte wurden als ein Produkt von 39 kDa beobachtet, was Volllängen-Mch4 entspricht, und ein internes Translationsprodukt von 27 kDa. Dieses intern translatierte Produkt beginnt mit Met235. Dieses wurde durch die Deletion der cDNA-Sequenz bestätigt, die die ersten 101 Aminosäuren kodiert, und die Translation von Met102 ablaufen ließ. Diese Deletion erzeugte ein verkürztes Mch4-Protein, das in der Größe dem intern translatierten Mch4-Protein von ~27 kDa (5B, Spur 1) ähnlich war.
Granzym B spaltete das verkürzte Mch4-M235, um Banden "von 15–16 kDa und 12 kDa (5B, Spur 3) zu erzeugen. Auf der anderen Seite spaltete Granzym B das Mch4-M134 vollständiger Länge, um eine Bande von ~27 kDa (große Untereinheit) und eine Bande von 12 kDa (kleine Untereinheit) (Spur 8) zu erzeugen. Aufgrund des Vorliegens des intern translatierten Proteins von 27 kDa zusammen mit dem Mch4 vollständiger Länge wurde jedoch eine Bande von 15–16 kDa auch nach Inkubation mit Granzym B (Spur 8) erzeugt. Wie CPP32 und Mch3 wurde das Asp239-mutierte Mch4-M134 nicht durch Granzym B (Spur 6) gespalten und es gab keine Spaltung in der Pufferkontrolle (Spuren 1 und 4).
Diese Werte zeigen, dass Granzym B nicht nur proCPP32 aktiviert, sondern auch die verwandten ASCPs Mch3 und Mch4 durch Spaltung an ihren mutmaßlichen Prozessierungssequenzen IETD-S, IQAD-A bzw. IEAD-A. Die Spaltung an diesen Stellen erzeugt die zwei Untereinheiten, die den aktiven Enzymkomplex dieser Proteasen bilden.
Beispiel V
Mch4 ist stromaufwärts von CPP32 und Mch3 in der ASCP-Kaskade
Dieses Beispiel zeigt, dass Mch4 in der Lage ist, sowohl proCPP32 als auch proMch3 zu aktivieren, während es gegen die Spaltung von seinem Proenzym-Zustand resistent bleibt, wenn es in Gegenwart der aktivierten Formen von entweder CPP32 oder Mch3 inkubiert wird.
Die Beobachtungen legen nahe, dass die ASCPs an einer Kaskade von Aktivierungsereignissen beteiligt sind, die zu dem schließlichen Signal des Zelttodes führt. Um zu bestimmen, ob eine solche Kaskade innerhalb der Ced-3-Unterfamilie von ASCPs existiert oder auftritt, wurde die Aktivierung von CPP32 und seinem eng verwandten Homologen Mch3 durch ein anderes Mitglied der Unterfamilie, so wie proMch4, bewertet. Die Aktivierung wurde durch Inkubieren von gereinigtem rekombinantem Mch4 mit proCPP32 und proMch3 bestimmt.
Die Analyse der Spaltprodukte zeigte, dass proMch4 proCPP32 und proMch3 prozessierte und Spaltprodukte erzeugte, die identisch zu denjenigen waren, die durch Granzym B erzeugt wurden (4A, Spur 4 und 5A, Spur 5). Mch4 war nicht in der Lage, das von Asp zu Ala mutierte proCPP32 und proMch3 zu prozessieren (4A, Spur 3, und 5A, Spur 3). Wie Granzym B war Mch4 jedoch in der Lage, das Propeptid von Mch3 zu spalten, um eine Bande von 33 kDa (5A, Spur 3) zu erzeugen. Obwohl Mch4 in der Lage war, proMch4 zu spalten, war seine Aktivität gegenüber seinem Proenzym beträchtlich geringer als diejenige gegenüber proCPP32 und proMch3 (5B, Spur 7). Überdies gab es keine signifikante Spaltung von proMch4, wenn es mit rekombinanten CPP32- oder Mch3-Enzymen (6) inkubiert wurde. Die Aktivität mehrerer anderer ASCPs, so wie ICE, TX und Mch2 wurde auch geprüft, jedoch war keines dieser Enzyme in der Lage, wirksam proMch4 zu prozessieren. Diese Werte zeigen an, dass Mch4 stromaufwärts von CPP32 und Mch3 in der apoptotischen Proteasekaskade liegt.
Die obigen Ergebnisse, die anzeigen, dass proMch4, Mch3 und CPP32 eine Rolle in der Proteasekaskade spielen, werden weiter durch einmalige Eigenschaften gestützt, die von diesen und verwandten ASCPs gezeigt werden. Insbesondere haben ASCPs zwei einmalige Eigenschaften, die sie von anderen Proteasen unterscheiden. Zuerst spalten sie alle ihre Substrate nach Asp-Resten und ihre Aktivierung erfordert die Spaltung nach Asp-Resten, die in hochkonservierten Prozessierungsstellen zwischen ihrer großen und kleinen Untereinheit lokalisiert sind. Die Fähigkeit, nach Asp-Resten zu spalten, wird nur von Granzym B geteilt, einer Serin-Protease, die jedoch zu ihrer Aktivierung keine Spaltung nach Asp-Resten erfordert. Zusätzlich zu diesen Eigenschaften enthalten sowohl Mch4 als auch Mch5 N-terminale FADD-ähnliche Effektordomänen des Absterbens. Die N-terminale Effektordomäne des Absterbens von FADD (Hsu et al., Cell, 84: 299–308 (1996)) kann eine der zwei FADD-ähnlichen Domänen in entweder proMch4 oder proMch5 zur Aktivierung und Rekrutierung für den Fas-apoptotischen Stoffwechselweg binden. Die Aktivierung von proMch4 oder proMch5 durch FADD kann zum Beispiel zur Aktivierung der stromabwärts gelegenen Proteasen, so wie CPP32 und Mch3, führen.
Die obigen Eigenschaften zeigen an, dass ASCPs miteinander nach Art einer Proteasekaskade interagieren und sich aktivieren, als auch als Substrate für Granzym B wirken. Überdies führt die Fähigkeit eines Familienmitgliedes, mehrere andere Familienmitglieder zu aktivieren und umgekehrt zu vielfachen Proteasekaskaden und der Erzeugung vielfacher apoptotischer Stoffwechselwege, da mehrere ASCP-Familienmitglieder in einem Zelltyp coexistieren. Belege für das Vorliegen mehrfacher apoptotischer Stoffwechselwege wird von Untersuchungen mit Mäusen bestätigt, die für ICE oder Bcl2 defizient sind. Zum Beispiel verbleiben Thymozyten aus ICE-defizienten Mäusen für die Apoptose, die durch Glucocorticoid und ionisierende Strahlung induziert wird, empfindlich, werden jedoch resistent gegen die durch anti-Fas induzierte A poptose (Kuida et al., Science 267: 2000–2003 (1995)). Auf der anderen Seite werden T-Zellen aus bcI2-defizienten Mäusen für die durch Glucocorticoid und ionisierende Strahlung induzierte Apoptose empfindlicher, jedoch weniger empfindlich für die durch anti-CD3-induzierte Apoptose.
Wie in 7 gezeigt, weisen die obigen Ergebnisse auf das Vorliegen mehrfacher Proteasekaskaden hin, die durch verschiedene apoptotische Anreize aktiviert werden können. Zum Beispiel betrifft eine dieser Kaskaden proMch4, das stromaufwärts von CPP32, Mch2 und Mch3 arbeitet. Nachdem proMch4 einmal durch bestimmte apoptotische Anreize aktiviert ist, kann es die Proenzyme von Mch3 und CPP32, wie oben gezeigt, prozessieren und aktivieren. Diese zwei ASCPs sind wahrscheinlich für die PARP-Spaltung in der Apoptose verantwortlich. Aktives CPP32 kann wiederum proMch2 aktivieren, die einzige ASCP, die Lamin spalten kann. Da CPP32, Mch3 und proMch4 nur schwach durch CrmA (siehe Tabelle 1) inhibiert werden, würde die obige Kaskade nicht in einer ICE-Knockout-Maus beeinträchtigt werden oder durch den ICE-Inhibitor CrmA inhibiert werden. Daher ist es wahrscheinlich, dass die durch Glucocorticoid und Strahlung induzierte Apoptose durch diese Kaskade auftritt.
In einem alternativen ICE- oder einem ICE-ähnlichen Stoffwechselweg führt die Aktivierung vom ICE oder einer ICE-ähnlichen ASCP wie TX durch einen apoptotischen Anreiz oder eine stromaufwärts gelegene ASCP zur Aktivierung von CPP32, Mch2 und Mch3 (7). Dieses Ergebnis tritt auf, das TX ICE aktivieren kann (Faucheu et al., The EMBO J. 14: 1914–1922 (1995)) und ICE proCPP32 aktivieren kann (Tewari et al., Cell 81: 801–809 (1995)). Weiterhin kann Mch5 proCPP32 und proTX prozessieren. Dieser ICE-ähnliche Stoffwechselweg arbeitet wahrscheinlich in dem Fas-apoptotischen Stoffwechselweg, da ein ICE-Knockout oder CrmA in einigen Zelltypen diesen Stoffwechselweg außer Kraft setzen. Außerdem geht während der Fas-induzierten Apoptose eine ICE-ähnliche Aktivität der CPP32-ähnlichen Aktivität voraus (E-nari et al., Nature 380: 723–726 (1996)). In der Folge bindet FADD wahrscheinlich an eine FADD-ähnliche Domäne in proMch5 oder proMch4 zur Aktivierung und Rekrutierung für den Fas-apoptotischen Stoffwechselweg. Diese Schlussfolgerung tritt auf, da diese Domänen sowohl zur homotypen als auch hetero typen Interaktion fähig sind. Nachdem es einmal an ein FADD gebunden ist, kann proMch5 einer autokatalytischen Prozessierung zu den reifen Enzymen unterliegen. In dieser Alternative könnte reifes proMch5 auch direkt proCPP32 aktivieren, oder indirekt durch Aktivieren von proTX. Reifes CPP32 würde wiederum das Lamin spaltende Enzym Mch2 aktivieren.
Die am weitesten N-terminalen oder ersten Domänen in sowohl proMch4 als auch proMch5 (Mch4A, 3A) sind eng mit FADD verwandt und wirken wahrscheinlich durch Binden an die zweite C-terminale FADD-ähnliche (interagierende) Domäne als Aktivatoren von proMch4 und proMch5. Es ist wahrscheinlich, dass entweder proMch4 oder proMch5 die Fas-Apoptose durch Interagieren mit FADD vermittelt. Da sie jedoch zwei N-terminale FADD-Domänen aufweisen, können diese Polypeptide an anderen Formen der Apoptose beteiligt sein. Zum Beispiel kann proMch4 oder proMch5 unter normalen Bedingungen durch einen Repressor reprimiert werden, der auf seiner N-terminalen FADD-Domäne sitzt. Abänderungen des zellulären Zustandes könnten den Repressor freisetzen, was es der N-terminalen Domäne erlaubt, mit der zweiten C-terminalen, mit FADD interagierenden Domäne in Wechselwirkung zu treten, was zur Aktivierung von proMch4 oder proMch5 führt und in der Folge zur Aktivierung von stromabwärts gelegenen Proteasen, so wie CPP32, Mch3 und Mch2.
In noch einer anderen getrennten apoptotischen Proteasekaskade wird eine exogene Protease verwendet, um mehrfache endogene ASCPs zu aktivieren. Dieses ist die Granzym B-Kaskade, die von zytotoxischen T-Lymphozyten verwendet wird, um ihre Zielzellen abzutöten (siehe 7). Mit dem Verständnis für diese mehrfachen Kaskaden und ihre regulatorischen Aktivierungsereignisse ist es nun möglich, diese Stoffwechselwege entweder alleine oder in Kombination zur therapeutischen Behandlung von menschlichen Krankheiten ins Ziel zu nehmen.
Beispiel VI
proMch4 weist Aktivität zur Zellabtötung auf
Dieses Beispiel zeigt die Expression von proMch4 und die Induktion der Apoptose in kultivierten Zellen.
Um zu bestimmen, ob proMch4 eine Aktivität zur Zellabtötung aufweist, wurde die Induktion der frühen Apoptose in Sf9-Baculovires-Zellen geprüft. Kurz gesagt wurden Sf9-Zellen mit rekombinanten Baculoviren infiziert, die für Volllängen-proMch4 oder Volllängen-CPP32 als ein Standard kodierten (Fernandes-Alnemri et al., J. Biol. Chem. 269: 30761–30764 (1994)). Die Zellen wurden dann mikroskopisch auf morphologische Anzeichen von Apoptose untersucht, so wie Bläschenbilden der Cytoplasmamembrane, Kondensation von nukleärem Chromatin und Freisetzung kleiner apoptotischer Körperchen. Überdies wurde die genomische DNA auf die internukleosomale DNA-Spaltung hin untersucht.
Für die Konstruktion von Transfervektoren und rekombinanten Baculoviren wurde Volllängen-proMch4 in pBluescriptKS+ mit BamHI und EcoRI ausgeschnitten und in einen mit BamHI/EcoRI geschnittenen Vektor pVL1393 (Invitrogen, San Diego, Kalifornien) subkloniert, um den Transfervektor pVL-proMch4 zu erzeugen. Der Transfervektor pVL-CPP32 wurde hergestellt, wie zuvor beschrieben (Fernandes-Alnemri et al., a. a. O. (1994)). Die rekombinanten Transfervektoren wurden dann verwendet, um rekombinante Baculoviren zu erzeugen, wie zuvor beschrieben (Summens et al., "Manual of Methods for Baculovirus Vectors and Insert Culture Procedures," Texas Experimental Station Bulletin No. 1555 (Texas A&M University, College Station, Texas (1987); und Alnemri et al., J. Biol. Chem. 266: 3925–3936 (1991)).
Zu Induktion der Apoptose in Sf9-Zellen durch proMch4 und CPP32 wurden die Zellen mit rekombinanten Baculoviren AcNPV-proMch4 oder AcNPV-CPP32 infiziert. Die Apoptose wurde mikroskopisch durch Zählen der Zellen mit der geeigneten Morphologie (Bläschenbildung, nukleäre Kondensation) gemessen. Auf eine andere Weise wurde die internukleosomale DNA- Spaltung als ein charakteristischer Macker bewertet. Kurz gesagt wurde die gesamte zelluläre DNA 42 h nach der Infektion von entweder Kontroll-Sf9-Zellen oder Sf9-Zellen, die mit Baculoviren AcNPV-proMch4 oder AcNPV-CPP32 infiziert waren (Alnemri et al., a. a. O. (1995)), isoliert. Die DNA-Proben wurden durch Elektrophorese in einem 1,8% Agarosegel analysiert, das Ethidiumbromid enthielt.
Die Expression von Volllängen-proMch4 in Sf9-Zellen bewirkte, dass ein signifikanter Prozentanteil der Zellen um etwa 48 h nach der Infektion eine Apoptose durchlief, die auch durch die Induktion der internukleosomalen DNA-Spaltung manifestiert war. Diese Ergebnisse stimmen damit überein, dass proMch4 eine Protease der Zellabtötung ist, da AcNPV-CPP32 ähnliche Ergebnisse lieferte.
Beispiel VII
Die Mch5-FADD-Homologiedomäne B induziert die Apoptose.
Um zu bestimmen, ob die Expression der FADD-ähnlichen Domäne B von proMch5 (Mch5B) die Apoptose induzieren kann, wurde sie in einen Expressionsvektor für Säugetiere kloniert und in die menschliche Brustkrebs-Zeltlinie MCF7 transfiziert.
Nach der Transfektion (36 Stunden) wurde der Prozentanteil transfizierter Zellen, die apoptotisch waren, gezählt. 8 zeigt, dass in Zellen, die mit dem Kontroll-Plasmid pcDNA3 transfiziert waren, etwa 50% der Zellen apoptotisch waren. Dieses Ergebnis liegt wahrscheinlich an der Induktion der Apoptose durch das Lipofektionsreagenz, das für die DNA-Transfektion verwendet wurde. Im Gegensatz dazu waren etwa 80% der Zellen, die mit Mch5B transfiziert waren, apoptotisch (8). Daher induziert die heterologe Expression der Mch5-FADD-ähnlichen Domäne B die Apoptose in diesen Zellen.
Die Induktion der Apoptose durch Mch5B zeigt, dass der Mechanismus, durch welchen Mch5B die Apoptose induziert, der Art ähnlich ist, auf welche die homologe Domäne in FADD (der FADD-Effektordomäne für das Absterben) die Apoptose induziert, wenn sie durch Transfektion exprimiert wird. Dieser Mechanismus betrifft das Binden der Mch5-FADD-ähnlichen Domäne an die pro-Domäne von entweder proMch4 oder proMch5, das Binden induziert die Aktivierung der Proteasen proMch4 oder proMch5 und die Induktion der Apoptose.
Kurz gesagt, es wurde Mch5B in den Expressionsvektor für Säugetiere pcDNA3 subkloniert. Die cDNA von Mch5 in dem Vektor BluescriptKS wurde als Matrize für die PCR-Amplifikation der Mch5-FADD-B-Domäne unter Verwendung der folgenden Primer verwendet:
5'-Primen: CCTACAGGATCCACTTCTGCCGCATGAGC, 3'-Primer: ACTCCTCCCCTT-TGCTGAATTCTTAATAGTCGT. Das PCR-Produkt wurde mit BamHI und EcoRI geschnitten und in einen mit BamHI/EcoRI geschnittenen pcDNA3 ligiert, um den Vektor Mch5/FaddB/pcDNA3 (MFp) zu erzeugen. Die DNA von MFp wurde in DHSα-Bakterien transduziert und die DNA wurde aufgereinigt. Zur Transfektion wurde MFp oder pcDNA3 (1,8 μg) mit dem Liofectin-Reagenz (GIBCO Life Technology) gemischt und 0,2 μg des Plasmides pC-MC-SPORT-βgal (GTBCOBRL Katalog Nr. 10586–014) auf zu 50% konfluente Kulturen von MCF7-Zellen für 8 Stunden bei 37° aufgegeben. Die Zellen wurden dann gewaschen und Wachstumsmedium zugegeben. Nach 36 Stunden wurden die Zellen in 10% Paraformaldehyd fixiert und die Expression von β-Galactosidase wurde durch Inkubieren der Zellen mit einer Substratlösung von X-gal sichtbar gemacht.
Obwohl die Erfindung mit Bezugnahme auf die offenbarten Experimente beschrieben wurde, werden die Fachleute bereitwillig zu schätzen wissen, dass die besonderen Experimente, die ausgeführt sind, die Erfindung nur erläutern. Es sollte verstanden werden, dass verschiedene Abweichungen gemacht werden können. Demgemäß ist die Erfindung nur durch die folgenden Ansprüche beschränkt.

Claims

Isoliertes Mch4-Polypeptid, welches die in SEQ ID NO. 2 gezeigte Aminosäuresequenz vollständig oder einen Teil davon umfasst, wobei das Polypeptid oder der Teil davon eine funktionelle Aktivität zeigt, umfassend Mch4-Substratbindung, Mch4-Aspartat-spezifische Proteolyse, Mch4-FADD-Interaktion, Mch4-FADD-ähnliche Domäne homotype Interaktion, Mch4-FADD-ähnliche Domäne heterotype Interaktion, Mch4-Proenzym-Spaltung oder Mch4-Apoptoseinduktion.
Isolierte Nukleinsäuresequenz, die für ein Polypeptid nach Anspruch 1 codiert.
Isolierte Nukleinsäuresequenz nach Anspruch 2, wobei das Fragment Einzel- oder Doppelstrang-Nucleinsäuren der in SEQ ID NO. 1 gezeigten Sequenz umfasst.
Isolierte Nukleinsäuresequenz nach Anspruch 2, wobei das Fragment codierende oder nicht-codierende Stränge der Sequenz umfasst.
Isolierte Nukleinsäuresequenz nach Anspruch 2, degenerierte Varianten davon oder dazu komplementäre Volllänge-Sequenzen, wobei die Nukleinsäuresequenz die Nukleotide 148 bis 1263 von SEQ ID NO. 1, die Nukleotide 1264 bis 1584 von SEQ ID NO. 1, die Nukleotide 199 bis 435 von SEQ ID NO. 1, die Nukleotide 481 bis 714 von SEQ ID NO. 1, die Nukleotide 1213 bis 1227 von SEQ ID NO. 1 oder eine zusammenhängende Nukleinsäuresequenz, welche die SEQ ID NO. 2 codiert, umfasst.
Isoliertes Mch4-Polypeptid nach Anspruch 1, wobei das Polypeptid oder der Teil davon weiterhin die katalytische Domäne von Mch4 umfasst.
Isoliertes Mch4-Polypeptid nach Anspruch 1, wobei das Polypeptid oder der Teil davon die Aminosäuresequenzen 18 bis 105 von SEQ ID NO. 2 oder die Aminosäuresequenzen 112 bis 189 von SEQ ID NO. 2 umfasst.
Isoliertes Mch4-Polypeptid nach Anspruch 1, wobei die Aminosäuresequenz umfasst: SEQ ID NO. 2, Aminosäuren 1 bis 239 von SEQ ID NO. 2, Aminosäuren 1 bis 372 von SEQ ID NO. 2, Aminosäuren 373 bis 479 von SEQ ID NO. 2, Aminosäuren 102 bis 346 von SEQ ID NO. 2, Aminosäuren 102 bis 239 von SEQ ID NO. 2, Aminosäuren 18 bis 105 von SEQ ID NO. 2, Aminosäuren 112 bis 189 von SEQ ID NO. 2, oder ein QACQG-enthaltendes Fragment von Mch4.
Isolierte Nukleinsäuresequenz oder eine degenerierte Variante davon, die ein Mch5-Polypeptid codiert oder ein Fragment eines Mch5-Polypeptids codiert, ebenso wie dazu komplementäre Volllänge-Sequenzen, wobei die Nukleinsäuresequenz umfasst: SEQ ID NO. 3, Nukleotide 257 bis 1429 von SEQ ID NO. 3, Nukleotide 638 bis 874 von SEQ ID NO. 3, oder eine zusammenhängende Nukleinsäuresequenz, die für SEQ ID NO. 4 codiert.
Isolierte Nukleinsäure nach Anspruch 9, wobei die Nukleinsäuresequenz SEQ ID NO. 3, eine degenerierte Variante davon oder eine dazu komplementäre Volllänge-Sequenz ist.
Isoliertes Mch5-Polypeptid, umfassend SEQ ID NO. 4, Aminosäuren 1 bis 284 von SEQ ID NO. 4, Aminosäuren 1 bis 391 von SEQ ID NO. 4, oder Aminosäuren 128 bis 205 von SEQ ID NO. 4.
Vektor, umfassend die Mch4-Nukleinsäure nach Anspruch 1 oder die Mch5-Nukleinsäure nach Anspruch 9.
Zelle, umfassend den Vektor nach Anspruch 12.
Rekombinantes Verfahren zum Herstellen eines Mch4-Polypeptids oder eines Mch5-Polypeptids, umfassend das Kultivieren der Zelle nach Anspruch 13 unter Bedingungen, die die Expression des Mch4- oder Mch5-Polypeptids ermöglichen.