KR20010023282A

KR20010023282A - 신규 조직 특이적 칼파인, 그의 제조 방법 및 용도

Info

Publication number: KR20010023282A
Application number: KR1020007001916A
Authority: KR
Inventors: 토마스 보엠; 나일 데아르
Original assignee: 스타르크, 카르크; 바스프 악티엔게젤샤프트
Priority date: 1997-08-26
Filing date: 1998-08-19
Publication date: 2001-03-26
Also published as: ZA987660B; BR9811365A; NO20000961D0; JP2001513992A; AU9263598A; NO20000961L; WO1999010480A2; IL134361A0; DE19737105A1; EP1009811A2; CN1277634A; WO1999010480A3; HUP0004027A2; CA2301815A1

Abstract

본 발명은 신규한 조직 특이적 칼파인 및 그의 생산방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 새로운 칼파인 억제제를 스크리닝하는 방법과 그의 용도에 관한 것이다.

Description

신규 조직 특이적 칼파인, 그의 제조 방법 및 용도 {New Tissue-Specific Calpaines, Their Production and Their Use}

본 발명은 새로운 조직 특이적 칼파인 및 그의 제조 방법에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 신규 칼파인 억제제의 스크리닝 방법 및 그의 용도에 관한 것이다.

칼파인은 시스테인 프로테아제 그룹의 세포내 비리보솜 효소이다. 이들은 진핵세포에서 Ca²⁺-의존적 신호전달 경로에 관여한다. 즉, 이들은 Ca²⁺농도에 의존적인 방법으로 세포 기능을 조절한다. 칼파인은 예를 들어 사람, 닭, 토끼 또는 랫트의 동물 조직 및 세포 내에 널리 존재한다. 또한 칼파인은 드로소필라 멜라노개스터 (Drosophila melanogaster), 스키스토소마 (Schistosoma) 또는 캐노르합디티스 엘레간스 (Caenorhabditis elegans)와 같은 하등 동물에서도 발견되었으나 효모, 진균, 또는 세균에서는 아직 발견되지 않았다.

지금까지 주요 3가지 이소폼의 칼파인이 널리 존재한다고 알려져 있으며, 이들은 시험관 내의 Ca²⁺의존적 활성화에 의해 구별된다. 칼파인 I(=μ 칼파인)은 μ몰의 칼슘 이온 농도에 의해 활성화되는 반면, 칼파인 II(=ｍ 칼파인)은 밀리몰의 칼슘 이온 농도에 의해 활성화된다. 두 칼파인 모두 두 개의 서브유닛으로 이루어져 있는데, 하나는 약 80 kDa의 큰 서브유닛이고 다른 하나는 약 30 kDa의 작은 서브유닛이다. 활성의 헤테로다이머의 두 서브유닛은 칼슘 결합 부위를 갖는다. 큰 서브유닛은 네가지 도메인(= I-IV), 즉 프로테아제 도메인(도메인 II), 칼슘 결합 도메인(도메인 IV) 및 그 기능이 불분명한 두 개의 도메인(I과 III)으로 이루어진다. 작은 30 kDa 서브유닛은 칼슘 결합 서브유닛(IV') 및 그 기능이 불분명한 다른 서브유닛(V)으로 이루어져 있다. 이 두 종류의 칼파인 외에, 칼슘 활성화에 대한 중간체인 세 번째 종류가 닭에서 발견되었다(Wang K.K.W. et al., TiPS, Vol.15, 1994: 412-419, Suzuki, K et al., Biol. Chem. Hoppe-Seyler, Vol. 376, 1995: 523-529).

널리 존재하는 칼파인 외에도, 조직 특이적으로 발현되는 2개의 신규한 칼파인이 최근에 확인되었다. nCL-1 (= p94)은 닭, 랫트 및 사람에서 발견되는 근육 특이적 칼파인이며, 모노머로서 활성을 갖을 것으로 추정되며, 80 kDa 서브유닛으로만 구성되어 있다. nCL-1 외에, 두개의 스플라이싱 변이체인 nCL-2와 nCL-2'로 존재하는 위장 특이적 칼파인이 있다. nCL-2'은 칼슘 결합 부위가 없다는 점에서 nCL-2와 차이를 보인다(Sorimachi, H. S. et al., J. Biol. Chem. Vol. 268, No. 26, 1993: 19476-19482, Sorimachi, H. S. et al., FEBS Lett. 343, 1994:1-5). 드로소필라에서 발견된 칼파인 상동성 단백질(= CalpA)은 액틴과 상호작용하며 배의 발생에 있어 중요한 역할을 할 것으로 예상되며, 두 개의 다른 스플라이싱 변이체를 갖는다(Mol. Cell. Biol. Vol. 15, No. 2, 1995: 824-834). 이 경우에도, 길이가 짧은 변이체에는 칼슘 결합 부위가 존재하지 않는다.

칼파인은 여러가지 생리학적 과정에서 중요한 역할을 수행하리라 예상된다. 프로테인 키나아제 C, 포스포리파아제 C, 스펙트린과 같은 세포골격, 막 결합 또는 조절 단백질과 MAP2, 근육 단백질, 신경 필라멘트 및 신경 펩티드와 같은 세포골격 단백질, 혈소판 단백질, 상피세포 성장인자, NMDA 수용체, 체세포분열에 관계하는 단백질 등의 많은 단백질이 칼파인의 기질이다(Barrett M. J. et al., Life Sci. 48, 1991: 1659-69, Wang K. K. et al., Trends in Pharmacol. Sci., 15, 1994: 412-419). 그러나, 칼파인의 정상적인 생리학적 기능은 아직 명백하게 파악되고 있지 않다. 이들은 세포사멸, 세포분열 및 분화 또는 배 발생과 같은 수많은 생리학적 과정에 관여한다.

예를 들어, 심장 허혈(예, 심근경색), 신장 또는 중추신경계의 허혈(예, 졸증), 염증, 근위축증, 눈의 백내장(회백내장), 중추신경계의 손상(예, 외상), 알츠하이머 병, HIV-유도된 신경장해, 파킨슨병, 헌팅턴무도병 등(위의 Wang K.K.참조)과 같은 병리생리학적 과정 및 질환에서 칼파인 수준의 상승이 측정되었다. 이들 질병과 세포내 칼슘 수준이 상승 유지되는 것과 연관이 있는 것으로 예상된다. 이 상승 유지된 칼슘 수준은 칼슘 의존적 과정이 과도하게 활성화되어 더이상 생리학적 조절을 받지 못하도록 한다. 따라서, 칼파인의 과활성화는 또한 병리생리학적 과정을 일으킬 지도 모른다.

이러한 이유 때문에, 칼파인 효소의 억제제가 상기 질병의 치료에 유용할 수 있다고 가정되었으며 다양한 연구를 통하여 이 가정을 확인하였다. 문헌[Seung-Chyul Hong et al.(Stroke 1994, 25 (3), 663-669)와 Bartus R. T. et al.(Neurological Res. 1995., 17, 249-258)]은 칼파인 억제제가 뇌졸증 후에 발생하는 급성 신경변성 장애에 신경보호 효과를 갖는다는 것을 보여주었다. 유사하게, 실험적인 뇌 손상 후에 칼파인 억제제가 기억 장애 및 신경운동 장애로부터 회복을 향상시켰다(Saatman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93, 1996: 3428-3433). Edelstein C.L. 등(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92, 1995, 7662-7666)은 칼파인 억제제가 저산소증으로 손상받은 신장에 대한 보호 효과를 갖는다는 것을 밝혔다. Yoshida K.I.등(Jap. Circ. J. 59(1), 1995, 40-48)은 칼파인 억제제가 허혈 또는 재관류로 인한 심장 손상 후에 유익한 효과를 나타낸다는 것을 밝혀내었다. 칼파인 억제제가 β-AP4 단백질의 방출을 억제하기 때문에 알츠하이머병 치료에서의 이용 가능성이 제시되었다(Higaki J. et al., Neuron, 14, 1995:651-659). 또한, 인터루킨-1α의 방출은 칼파인 억제제에 의해 억제된다(Watanabe N. et al., Cytokine, 6(6), 1994:567-601). 게다가, 칼파인 억제제가 종양세포에 대한 세포독성 효과를 갖고 있다는 것이 밝혀졌다(Shiba E. et al., 20th Meeting Int. Ass. Breast Cancer Res., Sendai Jp, 1994, 25.-28. Sept., Int. J. Onco. 5(Suppl.), 1994, 381). 또한 칼파인은 재발협착증 및 관절염에서 중요한 역할을 하고, 칼파인 억제제가 이들 병변에 유익한 효과를 보일 수 있다(March K. L. et al, Circ. Res. 72, 1993:413-423, Suzuki K. et al., Biochem J., 285, 1992:857-862).

나아가, 칼파인 억제제의 가능한 용도가 Wang K. K.의 문헌에서 확인되었다 (Trends in Pharmacol. Sci., 15, 1994: 412 -419).

가장 효능있고 선택적인 칼파인 억제제는 천연 세포내 단백질인 칼파스타틴이다. 이것은 칼파인 I과 칼파인 II 모두를 억제하지만, 카텝신 B, L 또는 파파인과 같은 다른 시스테인 및 티올 프로테아제에는 작용하지 않는다. 그러나 칼파스타틴은 약 700개의 아미노산으로 이루어진 그 크기와 세포막을 통과하지 못하기 때문에 가능한 치료법에 적합하지 않다는 단점을 가지고 있다. 저 분자량의 칼파인 억제 펩티드 외에 많은 비 펩티드 억제제가 확인되었다. 이들 억제제들은 불안정하고 빠르게 대사되며, 그 일부는 독성을 갖는다는 단점을 지니고 있다. 게다가 많은 칼파인 억제제는 충분한 선택성을 갖지 못한다. 다시 말해, 칼파인 I과 칼파인 II 뿐만 아니라 파파인과 키모트립신, 엘라스타아제 또는 카텝신 B와 L과 같은 다른 시스테인 프로테아제도 억제한다.

따라서 선택적이고 크게 효과적인 칼파인 억제제가 계속해서 요구되고 있다. 선택적인 억제제를 확인할 수 있는, 선택적이고 매우 효과적인 억제제를 스크리닝하기 위한 특이성이 높은 시험 시스템이 필요하다. 스크리닝 시험은 대개 널리 존재하는 칼파인 I과 칼파인 II를 이용하여 수행된다.

선택적인 억제제를 찾기 위해서, 시험을 위해 가능한 한 조직 특이적으로 발현되는 칼파인을 추가로 제공하는 것이 필요하며 바람직하다. 이에 의해, 각 칼파인에 대한 억제제들의 선택성을 시험할 수 있다.

게다가 칼파인은 여러가지 병변 및 질병에서 다르게 발현되며 이들 질병에서 중요한 역할을 하는 단백질일 가능성이 크기 때문에 더 많은 새로운 칼파인을 찾고 있다.

본 발명의 목적은 한편으로는 한 종류의 칼파인에만 억제 효과를 갖는 칼파인 억제제 및(또는) 다른 한편으로는 여러 칼파인에 대해 억제 효과를 갖는 칼파인 억제제를 확인할 수 있는 칼파인 억제제의 구별 및 확인 방법을 제공하고, 이들을 치료 목적으로 제공하는 것이다.

본 발명자들은 SEQ ID NO. 1 또는 SEQ ID NO. 3의 서열을 갖는 CAPN6이라는 신규의 조직 특이적 칼파인 유전자, 유도된 아미노산 수준에서 60 내지 100%의 상동성을 갖는 그의 대립 변이체, 유사체 또는 유도체를 통해 상기 목적을 달성할 수 있음을 밝혀내었다. 여기에서 상기 칼파인, 그의 대립 변이체, 유사체 또는 유도체는 다음의 서열을 포함한다.

(a) Leu-Gly-Asn-Lys-Ala,

상기 서열은 사람의 칼파인 I에서 115번 위치의 시스테인 아미노산이 서열 SEQ ID NO. 1과 SEQ ID NO. 3의 81번 위치의 리신으로 변형되었다는 점에서 대응되는 사람 칼파인 I의 서열과 다르다.

(b) Ala-X-Ser-Cys-Leu-Ala,

대응되는 사람 칼파인 I의 서열과 비교하면, 122번과 125번 위치의 알라닌과 트레오닌 아미노산이 서열 SEQ ID NO. 1과 SEQ ID NO. 3의 88번과 91번 위치의 세린과 알라닌으로 변형되었다.

(c) Gly-Tyr-Thr-(His 또는 Tyr)-Thr-X-Thr,

대응되는 사람의 칼파인 I 서열과 비교하면, 272, 273 및 275번 위치의 히스티딘, 알라닌 및 세린 아미노산이 서열 SEQ ID NO. 1과 SEQ ID NO. 3의 252, 253 및 255번 위치의 티로신, 트레오닌 및 트레오닌으로 변경되었고, 또한 칼파인 I에서 274번 위치의 티로신 잔기가 SEQ ID NO. 3의 254번 위치의 히스티딘으로 추가로 변형되었다.

(d) Arg-X-Arg-Asn-Pro-Leu-Gly,

상기 서열은 사람의 칼파인 I에서 298번 위치의 트립토판 아미노산이 서열 SEQ ID NO. 1과 SEQ ID NO. 3의 286번 위치의 류신으로 변형되었다는 점에서 대응되는 사람 칼파인 I의 서열과 다르다.

상기 서열 중 X는 천연 아미노산이다.

본 발명은 또한 청구범위 제1항에서 청구되는 서열에 의해 코딩되는 칼파인, 그의 대립 변이체 또는 유사체를 조직 또는 세포로부터 단리하는 단계, 효소 CAPN6에 의한 기질 절단의 억제 및 한가지 이상의 다른 시험에서 시험 물질에 의한 효소 칼파인 I 및(또는) II의 기질 절단의 억제를 측정하는 단계 및 효소 CAPN6와 하나 이상의 다른 칼파인을 억제하는 시험 물질을 선별하는 단계를 포함하는, 칼파인 억제제를 확인하는 방법에 관한 것이다.

본 발명은 또한 세포내 시스템에서 시험 물질에 의한 효소 CAPN6 또는 칼파인 I 및(또는) II의 기질 절단의 억제를 측정하는 단계, 세포막을 통과하면서 효소 CAPN6 또는 칼파인 I 및(또는) II의 세포내 활성을 억제하는 시험 물질, 효소 CAPN6는 억제하지 않지만 효소 칼파인 I 및(또는) II를 억제하는 시험 물질, 또는 효소 CAPN6는 억제하지만 효소 칼파인 I 및(또는) II를 억제하지 않는 시험 물질을 선별하는 단계를 포함하는, 칼파인 억제제를 확인하는 방법에 관한 것이다. 시험되는 세포 내로 통과하지 못하면서 칼파인에 대해 시험관 내 활성을 갖는 물질도 유용하게 선별된다. 후속 분석시에 이들 물질들이 세포내에 들어갈 수 없거나 거의 들어가지 못하는 경우에는 이들 물질을 유도체화시킴으로써 이들의 세포내 투과성을 향상시킬 수 있다.

사람의 μ 및 ｍ 칼파인 단백질 유전자 서열을, BLAST 방법 프로그램을 이용한 국립 생물공학 정보 센터(National Center for Biotechnology Information, http://www.ncbi.nlm.nih.gov)의 EST 데이타뱅크에서의 상동성 검색을 위해 사용하였다. 칼파인의 전형적인 서열을 갖는 EST AA050030의 서열이 확인되었다. 이 서열을 사용하여 새로운 유전자 산물인 CAPN6(= nCL-4)라는 새로운 칼파인을 코딩하는 마우스 클론을 제조할 수 있었다. nCL-4 클론의 핵산 서열은 SEQ ID NO: 1이며, 유도된 칼파인 CAPN6의 아미노산 서열은 SEQ ID NO:2이다. 아미노산 서열은, 상동성이 낮기 때문에 μ 칼파인, ｍ 칼파인, nCL-1 또는 nCL-2의 이미 알려진 서브패밀리에 정렬시키는 것이 불가능하지만, 인트론의 존재를 고려하여 추정한 아미노산 서열은 전형적인 칼파인임을 보여준다. 칼파인 CAPN6은 이전에 알려진 바 없는 신규의 칼파인이다. EST 데이타 뱅크의 마우스에서 유래된 상기 서열을 이용한 조사에서 마우스 CAPN6 서열과 상동성을 갖는 사람의 4개의 부분 서열(AA169715, C17331, C16980 및 T39424)을 확인하였다. 이들 부분 서열은 374개의 아미노산 길이의 단백질을 코딩하는 연속된 서열로 조합될 수 있었다. 이 서열은 고유의 메티오닌 개시 코돈과 정지 코돈을 갖고 있지 않다. 따라서 이 서열은 클로닝된 마우스 서열에 대응하는 사람의 서열의 일부분일 것이다. 374개의 아미노산의 두 서열의 상동성은 94.9% 이다(도 1).

유전자 서열 SEQ ID NO:1에서 유래된 단백질 서열은 공지된 캐노르합디티스 엘레간스의 tra-3 유전자와 전체 아미노산 서열에 대해 최대인 30 %의 상동성을 보인다. 다른 공지된 칼파인과의 상동성은 20.9% (랫트 nCL-2) 내지 25.4% (마우스 ｍ 칼파인)이다. 리프만-피어슨(Lipman-Pearson) 방법 (Ktupl 2, Gap Penalty 4, Gap Length Penalty 12)에 따라 CAPN6와 사람의 CAPN1(= CAN1_HUMAN, Aoki et al., FEBS Lett. 205, 1986: 313-317), 사람의 CAPN2(= CAN2_HUMAN, Aoki et al., Biochemistry 27, 1988: 8122-8128), 랫트 CAPN2(= CAN2_RAT, Deluca et al., Biochim. Biophys. Acta 1216, 1993: 81-93), 사람의 CAPN3(= CAN3_HUMAN, Richard et al., Cell 81, 27-40), 랫트 CAPN3(= CAN3_RAT, Sorimachi et al., J. Biol. Chem. 264, 1989:20106-20111) 및 드로소필라 칼파인(= DMCLPNOCM_1)을 비교하면, 230-520 아미노산의 부분 서열에 대해 32.8% 내지 39.5%로 약간 더 큰 상동성을 보임이 확인되었으나, 이들 전체는 tra-3에 대한 상동성보다는 작은 것이다 (도 1, PAM25 잔기 중량표를 사용한 클러스탈법에 의한 배열). tra-3 외에 CAPN6는 최근 기술된 CAPN5 칼파인과 분명한 상동성을 보인다(44.2% 상동성, File No. P 19 718 248.8).

여러가지 데이타뱅크에서 마우스와 사람의 CAPN6 서열을 비교하여 CalpA, Tra-3 및 C16980, T39424, AA16971, R93331 및 G17331로 명명된 사람의 서열과의 상동성을 밝혔으나 이들의 기능에 대한 정보는 얻지 못하였다. 서열 비교는 국립 생물공학 정보 센터의 진 뱅크 EST(gene bank EST)와 데이타 뱅크 (http:www.ncbi.nlm.nih.gov) 및 워시-유 데이타 뱅크 (Wash-U databank; Homosapiens)를 이용하여 수행하였다. 또한, AA050030의 명칭으로 칼파인으로 명시된 마우스 EST 서열이 데이타 뱅크에서 확인되었다. 더이상의 정보는 데이타 뱅크에서 얻을 수 없었으며, AA16971T, R93331, C17331 및 AA050030의 전체 유전자 서열을 알 수 없었다.

두가지 칼파인(CAPN5 및 CAPN6)은 다른 칼파인과 구분되는 공통된 특성을 갖는다. 다른 칼파인과 비교해 볼 때, CAPN5 및 CAPN6은 말단이 절단된(truncated) 도메인 I 및 다른 칼파인들의 도메인 IV와 광범위한 상동성을 갖지 않는 변형된 C-말단을 갖고 있다. 칼파인의 Ca²⁺결합 부위의 컨센서스(consensus) 서열(EF 핸드로 불리움)은 도메인 IV의 영역에 위치하는데, 이 Ca²⁺결합 부위는 CAPN5 및 CAPN6의 경우에는 존재하지 않는다. 이는 곧 Ca²⁺이 도메인 IV에 결합하지 않고 이들 단백질이 다른 방법에 의해 활성화된다는 것을 의미한다. 따라서 이들은 칼로듈린-유사 도메인 IV가 없는 유일한 척추동물의 칼파인이다.

유도된 CAPN6 아미노산 서열은 변형된 촉매 부위의 형태에 또다른 특이성을 갖는다. 284번 위치의 Asn 잔기만이 보존되어 있으며, 마우스의 CAPN6 서열의 81번 위치의 시스테인 잔기와 252번 위치의 히스티딘 잔기가 각각 리신과 티로신로 치환되어 있다. 또한, 사람의 칼파인 I(= CAPN1, Aoki et al., FEBS Lett. 205, 1986:313-317)과 CAPN6 서열 SEQ ID NO. 1 및 SEQ ID NO. 3을 비교하면, 촉매 센터의 영역에서 더 많은 아미노산이 치환된 것을 확인할 수 있다. 따라서, CAPN1의 122 및 125번 위치의 아미노산 알라닌과 트레오닌은 CAPN6에서 88번과 91번 위치의 세린과 알라닌으로 변형되었다. 이와 유사하게, CAPN1의 272, 273, 275 및 298번 위치의 아미노산 히스티딘, 알라닌, 세린 및 트립토판이 CAPN6의 252, 253, 255 및 286번 위치의 티로신, 트레오닌, 트레오닌 및 류신으로 변형되었다. 아미노산 수준에서 단백질들이 최대로 일치되도록 하기 위해서 서열을 비교하고 서로 관련된 단백질들의 보존 영역을 배정함으로써 CAPN1과 CAPN6 단백질 내의 여러 위치로 아미노산이 배정된다. 따라서, 예를 들어 동일한 서열이 단백질 패밀리에 속하는 상이한 단백질들 내에서 매우 다른 부위 또는 위치에 존재하는 것이 가능해진다.

사람의 CAPN6 서열은 시스테인 잔기가 치환된 것 외에도 254 위치의 티로신이 히스티딘으로 치환되어 있다(표 1). 예를 들어, 이것은 CAPN6이 다른 칼파인과는 다른 기질 특이성을 가지거나, 활성 부위가 CAPN6 기능에 중요하지 않거나, 다른 칼파인의 억제제이거나, 또는 CAPN6이 위유전자(pseudogene)이거나 등으로 설명이 가능하다. 여기서 마지막 가능성은 많은 아미노산이 보존되어 있기 때문에 부적합하다. 89번 위치의 시스테인 잔기가 촉매 반응을 하는 81번 위치의 손실된 시스테인 잔기의 기능을 담당할 것으로 예상된다. 가능성은 희박하지만, CAPN6가 프로테아제 활성을 갖지 않는다 하더라도 보조인자 또는 기질에 대한 결합 부위에서 다른 칼파인과 경쟁을 함으로써 조절 과정에 관여할 것이다.

CAPN6의 게놈 서열

아미노산 No.	81^*	89	254^*	284^*	286¹
마우스 CAPN6 (129 ES 세포 DNA)	K	C	Y	N	L
사람 CAPN6 (헬라(Hela) 세포 DNA)	K	C	H	N	L
기타 칼파인	C	S/C	Y	N	W

* 활성부위의 아미노산 (Arthur et al., FEBS Lett. 368, 1995: 397-400)

1. m 칼파인에 류신이 없는 경우 낮은 활성 보임 (Arthur et al., FEBS Lett. 368, 1995: 397 - 400)

Tra-3는 캐노르합디티스 엘레간스에서 성 결정에 관여한다. tra-3와 관련된 여러 유전자들과 그 유전자 산물들의 캐스케이드는 캐노르합디티스가 수컷이 되는지 자웅동체가 발생하는지의 여부를 결정한다 (Kuwabara P.E. et al., TIG, Vol.8, No. 5, 1992: 164-168). Tra-3는 정자 발생 과정에 관여하는 것으로 보인다. 마우스 CAPN6와 tra-3 사이의 여러 도메인에서 아미노산의 보존도는 도메인 I, II, III 및 T에 대해 각각 39.2%, 42.0%, 30.9% 및 22%이다.

17 마우스 배 mRNA로부터 유래된 cDNA로부터 시작하여, 앞에서 언급한 프라이머 (Cal6 및 Cal9)와 EST AA050030에서 유래된 서열을 이용하여 변형된 RACE(= rapid amplification of cDNA ends) 방법 (Frohman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 1988, 8998-9002; Edwards et al., Nucl. Acids Res. 19, 1991, 5227-5232)에 의해 클로닝된 CAPN6의 전체 서열을 클로닝하였다. SEQ ID No. 1은 641개의 아미노산을 갖는 분자량 74.6 kDa의 단백질을 코딩한다. 번역 시작을 위한 전형적인 서열이 메티오닌 개시 코돈 앞에 위치한다. 서열의 정확도는 상기 서열을 갖는 여러 cDNA 클론의 서열 분석에 의해 확인하였다.

도 2는 마우스 CAPN5(= nCL-3), 사람 CAPN5(= nCL-3), 마우스 CAPN6(= nCL-4) 및 사람 CAPN6(= nCL-4) 사이의 상동성을 제시하고 있다. 또한, 도 2는 캐노르합디티스 tra-3, 사람 p94, 마우스 m 칼파인, 사람 μ 칼파인 및 랫트 nCL-2의 서열을 나타내고 있다. 여러가지 칼파인과 CAPN6 사이에 일치하는 아미노산은 검은색 박스로 표시되어 있으며, 대쉬는 서열이 최대한 일치하도록 하기 위해 도입된 공백을 나타낸다. 명백하게는, 두 개의 서열은 사람의 p94 서열로부터 결실되어진 것이다. 이들 영역은 '='로 나타내었다. 촉매 센터에서 보존된 아미노산은 화살표로 표시하였으며, CAL6와 CAL9에 해당하는 아미노산 서열은 밑줄로 나타내었다. 도메인 명칭은 해당하는 서열 세그먼트 위에 표시하였다.

도 3은 여러가지 칼파인의 계통발생도를 나타낸 것이다. 이 계통도를 만들기 위해 차이를 배제하는 가장 근접한 이웃 방법(Saitou et al. Mol. Biol. Evol. 4, 1987, 406-425)을 이용하여 계통발생학적 분석을 실시하였다. 이 계통발생학적 분석법으로 척추동물의 칼파인을 6가지의 다른 그룹으로 분류할 수 있다. (도 3, 오른쪽). 척추동물의 칼파인은 CAPN5-(= nCL-3-)와 CAPN6-(= nCL-4-) 그룹에 가장 근접한 이웃으로 정해질 수 있으며 그들 자신의 그룹을 형성할 수 있다. 따라서, CAPN5와 CAPN6 유전자는 척추동물의 칼파인보다 무척추동물의 칼파인에 더 큰 유사성을 갖는 그들 자신의 칼파인 그룹을 각각 형성한다. 수평선의 길이는 여러 칼파인 사이의 계통발생학적 거리와 비례하며, 수직선의 길이는 중요한 의미를 갖지 않는다. 계통발생도를 작성하는데 사용된 서열은 다음의 스위스프로트(SWISSPROT)와 EMBL 번호(승인번호)를 갖는다.: 사람 m (P17655), μ(P07384), p94(P20807); 랫트 m (Q07009), nCL-2 (D14480), p94(P16259); 마우스 p94(X92523); 닭 m(D38026), μ(D38027), μ/m(P00789), p94(D38028); 선충(nematode) tra-3(U12921); 드로소필라 CalpA(Q11002) 및 Dm(X78555), 스키스토소마(P27730). 사람 nCL-2 부분 서열은 EST 클론 AA026030의 번역본에 해당한다(Hellier et al., 1995, The Wash U-Merck EST project).

EST 클론 AA026030에서 유래된 아미노산 서열은 상기 분석에 의하면 랫트 nCL-2 서열과 통상의 상동성보다 더 큰 상동성을 보인다. 상기 분석에는 단지 부분 서열만이 사용되었기 때문에 nCL-2에 대해 얻어진 계통발생도는 정확하지 않을 확률이 크다. 선충 CPL1의 서열은 Barnes와 Hodjkin에 의해 사용된 수정본이다 (EMBOJ., 1996, 15:4477-4484).

처음 7 개의 엑손은 EMBL 데이타 뱅크에서 얻을 수 있는 것(승인 번호 L25598)을 사용한 반면, 마지막 5개의 엑손은 8028-8133, 8182-8239, 8729-8818, 8865-8983 및 9087에서 끝까지의 뉴클레오티드를 연결하여 얻었다. 유도된 N-말단 서열은 그 길이와 많은 글리신 잔기로 인해 칼파인에 있어 비정상적이다.

새로운 조직 특이적 칼파인 CAPN6은 단지 태반조직에서만 발현된다(도 4). 사람의 태반은 빠른 성장과 분화를 보이는 기관이기 때문에, 악성종양과 비슷하게 매우 공격적인 조직이어서 "전악성 조직(premalignant tissue)"으로 언급된다.

프로테아제는 세포 및 태반의 발생 및 분화시에 중요한 역할을 한다. 태반에는 프로테아제와 프로테아제 억제제가 균형을 이루어 풍부하게 존재하여 이들은 태반의 발생을 가능하게 한다. 여기에서 CAPN6은 프로테아제로서 중요한 역할을 의 수행 및(또는) 다른 칼파인 시스테인 프로테아제의 조절에 관여할 것이다.

CAPN6은 임신 중에 5 내지 7%로 발생하는 임신중독증(= 자간전증; preeclampsia)과 같은 태반의 병리학적 과정에 관여할 수 있다. 자간전증(= 임신으로 인한 고혈압)은 임신 중에 가장 일반적인 합병증 중의 하나이며, 고혈압과 단백뇨의 특징을 보이며, 흔히 지나친 부종, 경우에 따라 경련을 일으키기도 한다. 임신 중의 자간전증은 산모와 태아의 사망, 조산 또는 미약한 경우에는 태아의 영양결핍 또는 성장장애의 중요한 원인이 된다. 이것은, 예를 들어 유전적 요인(열성 또는 우성 유전인자), 산모의 면역 내성, 혈관확장제/수축제의 불균형 및 CAPN6이 관련되는 복합적 원인에서 유래된다.

자간전증에 걸린 여성은 CAPN6에 의해 조절방식으로 영향을 받을 수 있는 바소프레시나아제와 안지오텐시나아제 수준을 변경시킨다.

CAPN6의 또다른 가능한 기능은 태반 내의 소마토스타틴, 글루카곤 및 성장호르몬의 분해를 조절하므로써 태아의 성장에 영향을 준다는 것이다. 또한 태아의 성장을 촉진하는 산모의 혈청 단백질의 분해에 CAPN6이 영향을 줄 것이다.

CAPN6은 태아 발생 동안에 태반 점막에서 복잡한 과정들에 관여하고, TNFα와 IFNγ에 의해 유도되는 세포사멸, 예를 들어 다른 칼파인을 조절함으로써 영양모세포의 세포사멸을 조절할 가능성도 있다. 따라서 CAPN6이 태아의 발생에 관여하는 것으로 생각된다.

선택적인 칼파인 억제제를 확인하기 위하여, 가능한 한 특이적인 억제제 확인 방법이 필요하다. 이와 관련하여, 선택된 억제제가 필요한 칼파인(들)만을 억제하고 다른 시스테인 프로테아제는 억제하지 않음으로써 생리학적 과정을 방해하지 않는 것이 중요하다.

억제 활성을 조사할 시험 물질들은 예를 들어 화학 물질, 미생물 또는 식물 추출물일 수 있다. 이들의 CAPN6, 칼파인 I 및(또는) II에 대한 억제 활성 시험 외에도, 카텝신 B 또는 다른 티올 프로테아제에 대한 활성도 일반적으로 시험된다. 이상적으로는, 우수한 억제제는 카텝신 B, L, 엘라스타아제, 파파인, 키모트립신 또는 다른 시스테인 프로테아제에는 전혀 또는 거의 활성을 보이지 않으면서 칼파인 I 및 II에 대해 우수한 활성을 보여야만 한다.

신규한 조직 특이적 칼파인 CAPN6을 사용하여 칼파인 I, II, nCL-1, nCl-2 및(또는) nCL-4를 포함하는 여러가지 칼파인에 대한 억제 활성을 구별할 수 있는 억제제를 확인하기 위해 본 발명에 따른 방법을 이용할 수 있다.

이를 위해 다양한 억제제 시험을 다음과 같이 수행하였다.

카텝신 B 시험

카텝신 B 억제는 S. Hasnain 등의 방법(J. Biol. Chem. 268, 1993, 235-240)과 유사한 방법으로 측정하였다.

시험되는 화학 물질, 미생물 또는 식물 추출물 및 DMSO(최종 농도: 100 μM 내지 0.01 μM)로 제조된 억제제 용액 2 ㎕를 88 ㎕의 카텝신 B(Calbiochem으로부터 구입한 사람 간의 카텝신 B를 500 μM 완충액에 5 단위가 되도록 희석함)에 첨가하였다. 이 혼합물을 상온(= 25℃)에서 60분간 예비 인큐베이션하고, 10 mM Z-Arg-Arg-pNA(10% DMSO를 포함하는 완충액 중의) 10 ㎕를 첨가하여 반응을 개시시켰다. 405 nm에서 30분간 마이크로타이터 플레이트 판독기에서 반응을 유지시켰다. 이어서, 최대 기울기로부터 IC₅₀값을 결정하였다.

칼파인 I 및 II 시험

기질로서 함마르스텐(Hammarsten) 카제인(Merck, Darmstadt)을 사용하여 칼파인 억제제의 활성을 발색시험법으로 검사하였다. Buroker-Kilgore와 Wang 등의 문헌(Anal. Biochem. 208, 1993, 387-392)에 기재된 방법에 따라 마이크로타이터 플레이트에서 시험을 실시하였다. 돼지의 적혈구의 칼파인 I(0.04 U/시험)과 신장의 칼파인 II(0.2 U/시험)를 칼바이오켐(Calbiochem)으로부터 공급받아 효소로서 사용하였다. 용매 DMSO의 농도가 1%를 넘지 않도록 하면서 시험될 물질을 상온에서 효소와 함께 60분간 인큐베이션하였다. 바이오-라드(Bio-Rad)의 발색 시약을 첨가한 후, SLT Easy Reader EAR 400으로 595 nm에서 광학 밀도를 측정하였다. 억제제가 없이 측정된 효소의 최대 활성과 칼슘 첨가 없이 측정된 효소 활성에서 측정된 광학밀도로부터 효소의 50% 활성을 결정한다.

또한, 칼파인 억제제의 활성은 Suc-Leu-Tyr-AMC를 기질로이용하여 결정할 수 있다. 이 형광발색법은 Zhaozhao Li 등(J. Med. Chem. 36, 1993, 3472-3480)에 의해 기재된 방법이다.

칼파인은 세포내 시스테인 프로테아제이기 때문에 칼파인에 의한 세포내 단백질의 분해를 방지하기 위해서는 칼파인 억제제가 세포막을 통과할 필요가 있다. E 64 및 류펩틴과 같은 일부 공지된 칼파인 억제제들은 세포막을 거의 통과하지 못하기 때문에, 이들이 우수한 칼파인 억제제라 하더라도 세포에는 거의 효과를 나타내지 못한다. 그러므로, 사람 혈소판 시험과 같이 효능있는 칼파인 억제제의 세포막 통과 능력에 대한 추가적인 시험을 실시하는 것이 유리하다.

칼파인 억제제의 세포내 활성을 측정하기 위한 혈소판 시험

혈소판 내의 단백질의 칼파인 매개 분해법을 Zhaozhao Li 등(J. Med. Chem., 36, 1993, 3472-3480)에 의해 기술된 방법으로 실시하였다. 공여자로부터 받은 신선한 시트르산 나트륨 혈액으로부터 사람의 혈소판을 분리하여 완충액(5 mM Hepes, 140 mM NaCl 및 1 mg/㎖ BSA, pH 7.3) 중에 10⁷세포/㎖의 농도로 조정하였다.

혈소판 (0.1 ㎖)을 여러 농도의 (DMSO에 용해된) 효능있는 억제제 1 ㎕ 중에서 5분간 예비 인큐베이션하였다. 그리고 나서, 칼슘 이오노포어 A 23187(시험에서 1 μM) 및 칼슘(시험에서 5 mM)을 첨가하고 37℃에서 5분간 추가로 인큐베이션하였다. 원심분리 후, 혈소판을 SDS-PAGE 시료 완충액에 용해시키고 95℃에서 5분간 끓인 후 8% 겔에서 단백질을 분리시켰다. 액틴 결합 단백질(= ABP)와 탈린의 절단을 정량 밀도계로 측정하였다. 칼슘과 이오노포어를 첨가한 후에 이들 단백질은 사라지고 200 kDa 미만의 분자량 부위에서 새로운 밴드가 나타났다. 이것으로부터 억제제 첨가시와 억제제가 없는 대조군의 경우에 대해 효소의 50% 최대활성을 결정한다.

유사하게, 뇌 절편 및 세포 배양물과 같은 조직의 일부도 세포막 투과능 시험에 적합하다.

CAPN6의 억제 시험은 CAPN6 단백질을 발현하고, 특이 항체를 이용하여 이를 검출할 수 있는 세포 내에서 실시된다. 세포가 예를 들어 칼슘 및 적당한 이오노포어로 자극되었을 때, CAPN6이 활성화된다. Takaomi Saido는 문헌(J. Biochem. 11, 1992, 81-86)에서, 활성화 후의 μ 칼파인의 자가분해적 전이 및 항체를 이용한 검출을 기술하였다. CAPN6을 검출하기 위해 적합한 항체를 만들었다. 칼파인 억제제는 자가분해적 전이를 방지하고, 이에 대응하는 정량은 항체를 이용하여 실시할 수 있다.

시험관 내 시험과 세포 혈소판 시험에서 기술된 것 뿐만 아니라, 당업자에게 공지된 다른 모든 칼파인 시험, 예를 들어, 피질 뉴우런의 글루타메이트-유도된 세포 사멸의 억제 시험(Maulucci-Gedde M.A et al., J. Neurosci. 7, 1987:357-368), NT2 세포의 칼슘-매개된 세포 사멸(Squier N.K.T. et al., J. Cell. Physiol., 159, 1994:229-237. Patel T. et al., Faseb Journal 590, 1996:587-597) 또는 스펙트린, MAP2 또는 tau와 같은 단백질의 분해 산물에 대한 조직 시료의 분석(Ami Arai et al., Brain Research, 1991, 555, 276-280, James Brorson et al., Stroke, 1995, 26, 1259-1267)도 적합하다.

CAPN6의 시험관 내 시험에서, 칼파인 또는 그의 동물 또는 사람의 상동체는 태반과 같이 효소를 정상적으로 또는 인위적으로 (즉, 재조합 발현에 의해) 발현하는 조직 및 세포 또는 한 카피 이상의 CAPN6 유전자, 그의 대립 변이체 또는 유사체 및(또는) 이들 유전자의 한 카피 이상을 포함하는 벡터를 포함하는 세포 또는 미생물로부터 정제되고 추출액 그대로 또는 순수한 효소로서 사용된다.

본 발명에 따른 방법에서는 효능있는 억제제에 의한 효소 CAPN6 활성 억제를 위한 시험과 조합하여 다양한 칼파인 억제제 시험을 유리하게 실시하였다. 이에 따라, 효소 CAPN6만을 억제하고 다른 칼파인은 억제하지 않는 억제제, 또는 반대로 다른 칼파인만을 억제하고 CAPN6 효소 또는 CAPN6 효소와 하나 이상의 다른 칼파인을 억제하지 않는 억제제의 선별을 수반한다. CAPN6의 억제제들은 임신중독증 증세에 유용하게 이용될 수 있다.

또한, 다양한 억제제 시험은 CAPN6, 칼파인 I 및(또는) II에 대한 시험 물질의 억제 효과의 시험 뿐만 아니라, 대조군으로서 시험 물질없이 시험을 실시하는 방식으로 수행된다. 이러한 시험을 통하여 시험 물질의 억제 효과를 용이하게 검출할 수 있다.

본 발명에 의한 또다른 방법은 다른 칼파인의 효소 작용으로부터 유리하게 보호하기 위해 CAPN6 또는 그의 대립 변이체, 유사체 또는 합성 유도체를 이용한다.

본 발명에 의한 다른 방법은 일반적으로 모든 칼파인 또는 칼파인 I, II, nCL-1, nCL-2 또는 CAPN6과 같은 각각의 칼파인을 유리하게 억제할 수 있는 신규 칼파인 억제제를 스크리닝하기 위해 CAPN6 효소를 사용한다. 또한, 다양한 시험 물질들은 시험 시스템에서 각각 또는 동시에 시험될 수 있다. 시험 물질들은 자동화된 직렬 시험 시스템에서 그들의 억제 작용에 대해 편리하게 스크리닝된다.

일반적으로 모든 물질들이 억제제 시험에 적합하다. 따라서 물질들은 예를 들어 고전적인 화학 합성, 결합 화학, 또는 미생물, 동물 또는 식물 추출물로부터 유래될 수 있다. 미생물 추출물은 예를 들어 배양액, 미생물의 파괴된 세포 또는 생물학적 변형된 물질들을 의미한다. 세포 분획도 시험에 적합하다.

효소 활성을 갖는 유전자 산물을 단리하는데 적합한 모든 원핵 또는 진핵 발현 시스템은 CAPN6 유전자, 또는 그의 동물 상동체, 사람의 상동체, 그의 대립 변이체 또는 유사체의 클로닝에 적합하다. 바람직한 발현 시스템은 CAPN6 유전자 서열을 세균, 진균 또는 동물 세포, 매우 바람직하게는 곤충 세포에서 발현될 수 있는 것이다. 발현 생물, 예를 들면 진핵 또는 원핵 세포로부터로 단리 직후에 또는 재생(renaturation) 후에 앞에서 언급한 하나 이상의 공지된 칼파인 기질을 절단하거나 자신을 자가분해할 수 있는 활성 단백질을 제공하는 CAPN6 단백질을 효소 활성을 갖는 유전자 산물이라고 할 수 있다.

칼파인 I 및 II에 대해 앞에서 기재된 시험과 같은 시험관 내 시험 또는 혈소판 시험과 같은 세포내 시험과 같이 칼파인의 효소 활성을 결정하는데 적합한 시험은 당업자에게 모두 공지된 것이다. 비색 분석법(Buroker-Kilgore M. et al., Anal. Biochem. 208, 1993:387-392) 또는 형광분석법을 기초로 하는 시험 방법을 활성 검출에 사용할 수 있다.

또한, CAPN6의 효소 활성을 갖는 유전자 산물은 CAPN6 유전자의 촉매 센터 및(또는) CAPN6 유전자의 다른 서열 및(또는) 다른 칼파인 유전자 서열 및(또는) 다른 서열을 포함하면서 효소 활성을 보이는 모든 부분 서열을 의미한다

숙주 생물은 예를 들어. 이. 콜라이(Escherichia coli), 바실러스 섭틸리스(Bacillus subtilis), 스트렙토마이세스 리비단스(Streptomyces lividans) , 스트렙토코커스 카르노수스(Streptococcus carnosus)와 같은 같은 세균, 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae), 스키조사카로마이세스 폼베 (Schizosaccharomyces pombe)와 같은 효모, 아스퍼질러스 니거(Aspergillus niger)와 같은 진균, 스포돕테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda), 트리코플루시아 (trichoplusia) 세포와 같은 곤충 세포, 또는 바이러스 발현에 적합한 모든 다른 곤충 세포 또는 CV1, COS, C127, 3T3 또는 CHO와 같은 동물 세포 또는 사람 세포와 같이 숙주 생물로서 적합한 모든 원핵 또는 진핵 생물을 의미한다.

발현 시스템은 예를 들어 위에서 언급한 발현 생물과, 이 생물에 적합한 플라스미드 또는 T7 RNA 폴리머라아제/프로모터 시스템과 같은 바이러스 또는 파아지또는 파아지λ의 조절 서열을 갖는 벡터의 조합을 의미한다.

발현 시스템은 바람직하게는 이. 콜라이와 그의 플라스미드 및 파아지 또는 배큘로바이러스(baculovirus) 시스템과 스포돕테라 프루기페르다와 같은 이에 대응하는 곤충 세포의 조합을 의미한다.

또한, 추가의 3' 및(또는) 5' 말단의 조절 서열이 CAPN6 유전자의 본 발명에 의한 유리한 발현에 적합하다.

이들 조절 서열은 CAPN6 유전자가 특이적으로 발현되도록 하기 위한 것이다. 이것은 예를 들어 숙주 생물에 따라, 유전자가 유도되었을 때만 유전자가 발현 또는 과다 발현되거나 또는 즉시 발현 및(또는) 과다 발현될 수 있다는 것을 의미한다.

조절서열 및 인자들은 CAPN6 유전자 발현에 대한 유용한 효과를 보유하여 CAPN6 발현을 증가시키는 것이 바람직하다. 따라서, 조절 요소들은 프로모터 및(또는) 인핸서(enhancer)와 같은 강한 전사 신호를 이용하여 전사 단계에서 향상될 수 있다. 그러나, 이 외에도 예를 들어 mRNA의 안정성을 향상시켜 번역을 증가시키는 것도 가능하다.

인핸서는 예를 들어 RNA 폴리머라아제와 DNA사이의 상호작용을 향상시킴으로써 CAPN6 유전자의 발현을 증가시키는 DNA 서열을 의미한다.

앞에 프로모터가 존재하거나 존재하지 않고 조절 유전자가 존재하거나 또는 존재하지 않는 CAPN6 유전자의 앞에 및(또는) 뒤에 한가지 이상의 DNA 서열이 존재하여 유전자는 유전자 구조체로 존재한다.

또한, CAPN6 유전자의 발현은 CAPN6 유전자의 카피수를 증가시킴으로써 증가시킬 수 있다. CAPN6 유전자의 카피수는 예를 들어 CHO 발현 벡터에서 증폭시킴으로써 증가시킬 수 있다. 또다른 적합한 벡터들은 pDE 계열의 벡터(2 시스트론 벡터)로서 이들은 또한 디히드로폴레이트 리덕타아제의 증폭가능 마커 유전자를 포함하고 있다. 상세한 내용은 문헌(Current Protocol in Molecular Biology Vol.2, 1994)에 기재되어 있다.

CAPN6 유전자 또는 그의 동물 상동체를 UV 조사 또는 화학적 돌연변이원 처리와 같은 전형적인 돌연변이 유발법 및(또는) 부위 지정 돌연변이 유발법, 결실(들), 삽입(들) 및(또는) 치환(들)과 같은 특이적 돌연변이 유발법으로 변형시켜 초기 효소에 비해 효소 활성이 증가된 CAPN6을 얻을 수 있다. 효소활성은 예를 들어 절단되는 기질을 더 빠르게 전환시키도록 촉매 센터를 변형시킴으로써 증가시킬 수 있다. 또한, 효소 활성은 위에서 언급한 유전자 증폭뿐만 아니라 효소 생합성 억제 인자의 제거 및(또는) 불활성 CAPN6 단백질 대신 활성 단백질의 합성에 의해서도 증가시킬 수 있다. 이러한 방법으로 시험관 내 실험을 위해 보다 많은 양의 효소를 공급할 수 있다.

예를 들어 PCR 기술(Molecular Cloning, Sambrook, Fritsch and Maniatis, Cold Spring Harbor, Laboratory Press, Second Edition, 1989, Chapter 14, 1-35, ISBN 0-87969-309-6 및 Saiki et al., Science, 239, 1988, 487 et seq. 참조)을 이용하여 게놈 DNA 또는 cDNA로부터 출발하여 CAPN6 또는 그의 동물 상동체 또는 사람의 상동체를 쉽게 클로닝할 수 있고, CAPN6는 바람직하게는 게놈 DNA, 특히 바람직하게는, 마우스 세포 또는 사람 세포의 게놈 DNA를 이용하여 클로닝할 수 있다.

클로닝을 위한 숙주 생물로는 예를 들어 모든 이. 콜라이 균주가 적합하고, 이. 콜라이 균주 DH10B가 바람직하다. 클로닝 벡터로는 모든 이. 콜라이 발현 벡터가 적합하다(Molecular Cloning, Sambrook, Fritsch and Maniatis, Cold Spring Harbor, Laboratory Press, Second Edition., 1989, Chapter 14, 1-35, ISBN 0-87969-309-6 참조). 특히 적합한 예는 pBR 또는 pUC에서 유래한 벡터 또는 셔틀 벡터이고, pBluescript가 특히 적합하다.

SEQ ID No:2에 표시된 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 CAPN6 유전자 또는 그의 대립 변이체는 단리하여 서열분석을 실시하여 얻을 수 있다. 대립 변이체들은 아미노산 수준에서 60 내지 100%, 바람직하게는 70 내지 100%, 특히 바람직하게는 80 내지 100%의 상동성을 갖는 CAPN6 변이체를 의미한다. 대립 변이체는 특히 SEQ ID No:1 및 SEQ ID NO:3에 나타낸 서열에 대해 뉴클레오티드를 결실, 삽입 또는 치환시킴으로써 얻을 수 있고, CAPN6 활성은 유지되며, CAPN6 유전자, 유사체 또는 유도체에서와 같이 서열 (a) Leu-Gly-Asn-Lys-Ala, (b) Ala-X-Ser-Cys-Leu-Ala, (c) Gly-Tyr-Thr-(His 또는 Tyr)-Thr-X-Thr 및 (d) Arg-X-Arg-Asn-Pro-Leu-Gly이 존재하는 기능적 변이체를 포함한다.

CAPN6의 유사체는 예를 들면 그의 동물 상동체, 말단이 절단된 서열, 단일 가닥의 DNA 또는 코딩 및 비코딩 DNA 서열의 RNA, 특히 안티센스 RNA를 의미한다.

CAPN6 유도체의 예는 포스포네이트 또는 티오에이트기에 의해 핵산의 포스페이트기가 치환된 핵산 포스포네이트 또는 포스포티오에이트와 같이 효소에 의해 절단되기 어려운 유도체이다.

언급한 뉴클레오티드 서열 앞에 존재하는 프로모터는 프로포터의 기능과 활성은 손상시키지 않으면서 삽입(들) 및(또는) 결실(들)에 의해 하나 이상의 뉴클레오티드 서열을 교환함으로써 변형시킬 수 있다. 또한, 프로모터는 그 서열을 변형시키거나 이종 생물체로부터 유래되거나 또는 합성된 활성이 더 큰 프로모터로 완전히 치환시켜 활성을 향상시킬 수 있다.

본 발명에 따른 방법에서 확인된 칼파인 억제제는 칼파인 장애와 관련된 질병, 예를 들어, 재발 협착증, 관절염, 심장, 신장 및 중추신경계의 허혈(예, 뇌졸증), 염증, 근위축증, 눈의 백내장(예, 회백내장), 중추신경계 손상(예, 외상), 알츠하이머 병, HIV-유도된 신경장해, 파킨슨병, 헌팅턴무도병과 같은 심혈관계, 면역학적, 염증성, 알레르기성, 신경학적, 신경퇴행성 또는 종양학적 질병 치료용 의약의 제조, 바람직하게는 임신 중독증과 같은 태반 질병 또는 태아발생의 이상 치료용 의약의 제조에 적합하다.

본 발명에 따른 CAPN6 유전자 서열은 또한 질병 진단 또는 유전자 요법에도 적합하다.

실시예 1: CAPN6 유전자의 클로닝

마우스 CAPN6 서열(EMBL 승인번호 Y12583)을, 태그 17 마우스 배 및 EST AA050030 서열로부터 유도된 프라이머 서열을 이용한 RACE 방법으로 클로닝하였다. 대응하는 EST 서열을 포함하는 플라스미드 클론은 I.M.A.G.E 협회(Research Genetics Inc.)로부터 입수하였다. 사람의 CAPN6 상동체는 마우스 단백질 서열과 tblastn 알고리즘을 이용하여 EST 데이타 뱅크에서 상동성 검색을 통해 얻었다. 부분 서열들을 결합하여 1083개의 뉴클레오티드 길이를 갖는 사람 CAPN6의 불완전한 서열(SEQ ID NO:3)을 제조할 수 있었다.

실시예 2: 여러 조직에서 CAPN6 유전자의 발현

50 개의 다른 조직에서 유래한 RNA를 포함하는 클론테크사(Clontech)의 사람 RNA 마스터 블롯으로³²P-표지된 사람 cDNA 단편을 이용하여 여러 조직에서 CAPN6 유전자의 발현을 검출하였다. 제조사의 지시에 따라 혼성화 및 매우 엄격한 조건하에 세척을 실시하였다. 발현 실험에 사용된 CAPN6 cDNA 단편은 EST AA 050030을 포함하는 2.2 kb EcoRI/XhoI 단편이었다. CAPN6는 태반 조직에서만 발현되었다(도 4 참조). RNA 양을 측정하기 위해 대조군으로서 사람의 유비퀴틴 DNA 시료를 사용하여 블로팅을 실시하였다.

실시예 3 : CAPN6 유전자의 염색체 상의 위치

NIGMS 사람/설치류 체세포 하이브리드 "맵핑 패널(mapping panel)"(Coriell Cell Repositories)을 이용하여 사람 유전자의 위치를 결정하였다. PCR에 사용된 프라이머 서열은 5'-gttgaaactgattggggtctg-3' 및 5'-ctgtcttcccaaggggtttctc-3'이었다. PCR 증폭은 58℃의 어닐링 온도에서 실시하였고 그 결과 200bp의 절편을 얻었다. 사람 염색체와 PCR 산물 사이의 일치 여부를 확인하였다. 사람 염색체에서 유전자의 정확한 위치는 Standford G3 RH 패널 (Research Genetics)을 이용하고 Standford Human Genome Center의 위치 결정 서비스 (http://www.shgc.stanford.edu)에 PCR 산물을 전송하여 확인하였다. 사람의 CAPN6 유전자는 DXS7356 마커에 결합된 X 염색체에 위치한다는 것을 알아냈다.

실시예 4 : 카텝신 B 실험

억제제 및 DMSO(최종 농도: 100 μM 내지 0.01 μM)로 제조된 억제제 용액 2 ㎕를 88㎕의 카텝신 B(Calbiochem으로부터 구입한 사람 간의 카텝신 B를 500 μM 완충액에 5 단위가 되도록 희석함)에 첨가하였다. 이 혼합물을 상온(= 25℃)에서 60분간 예비 인큐베이션하고 10 mM의 Z-Arg-Arg-pNA(10% DMSO를 포함하는 완충액 중의) 10㎕를 첨가하여 반응을 개시시켰다. 405 nm에서 30분간 마이크로타이터 플레이트 판독기에서 반응을 유지시켰다. 이어서, 최대 기울기로부터 IC₅₀값을 결정하였다.

실시예 5 : 칼파인 실험

기질로서 함마르스텐 카제인(Merck, Darmstadt)을 사용하여 칼파인 억제제의 활성을 발색시험법으로 조사하였다. Buroker-Kilgore와 Wang 등의 문헌(Anal. Biochem. 208, 1993, 387-392)에 기재된 방법에 따라 마이크로타이터 플레이트에서 실험을 실시하였다. 앞에서 언급한 시스템 중의 하나에서 발현되고 정제된 CAPN6를 효소로 사용하였다. 용매 DMSO의 농도가 1%를 넘지 않도록 하면서 물질을 효소와 함께 상온에서 60분간 인큐베이션하였다. 바이오-라드 발색 시약을 첨가한 후, SLT Easy Reader EAR 400으로 595 nm에서 광학 밀도를 측정하였다. 억제제 없이 측정된 효소의 최대 활성과 칼슘 첨가 없이 측정된 효소 활성에서 측정된 광학밀도로부터 효소의 50% 활성을 결정한다.

실시예 6 : 칼파인 억제제의 세포 활성을 확인하기 위한 혈소판 실험

혈소판 내의 단백질의 칼파인 매개 분해법을 Zhaozhao Li 등(J. Med. Chem., 36, 1993, 3472-3480)에 의해 기술된 방법으로 실시하였다. 공여자로부터 받은 신선한 시트르산 나트륨 혈액으로부터 사람의 혈소판을 분리하여 완충액(5 mM Hepes, 140 mM NaCl 및 1 mg/㎖ BSA, pH 7.3) 중의 농도를 10⁷세포/㎖로 조정하였다.

혈소판 0.1㎖을 여러 농도의 (DMSO에 용해된) 억제제 1 ㎕ 중에서 5분간 예비 인큐베이션하였다. 그리고 나서 칼슘 이오노포어 A23187(실험에서 1μM) 및 칼슘(실험에서 5mM)을 첨가하고 37℃에서 5분간 추가로 인큐베이션하였다. 원심분리 후, 혈소판을 SDS-PAGE 시료 완충액에 용해시키고 95℃에서 5분간 끓여 8% 겔에서 단백질을 분리시켰다. 액틴 결합 단백질(= ABP)과 탈린의 절단을 정량 밀도계로 조사한 결과, 칼슘과 이오노포어의 첨가 후에 이들 단백질이 사라지고 200 kDa 분자량 부위에서 새로운 밴드가 나타났다. 이것으로부터 효소의 50% 최대 활성을 결정한다.

(1) GENERAL INFORMATION:

(i) APPLICANT:

(A) NAME: BASF Aktiengesellschaft

(B) STREET: Carl Bosch Strasse

(C) CITY: Ludwigshafen

(D) STATE: Rheinland-Pfalz

(E) COUNTRY: Germany

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(ii) TITLE OF APPLICATION: Novel tissue-specific calpains, their preparation and use

(iii) NUMBER OF SEQUENCES: 4

(iv) COMPUTER-READABLE FORM:

(A) MEDIUM TYPE: Floppy disk

(B) COMPUTER: IBM PC compatible

(C) OPERATING SYSTEM: PC-DOS/MS-DOS

(D) SOFTWARE: PatentIn Release #1.0, Version #1.25 (EPO)

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(ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic)

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(iii) ANTISENSE: NO

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(A) ORGANISM : Mus musculus

(vii) IMMEDIATE SOURCE:

(B) CLONE: CAPN6

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(A) NAME/KEY: 5'UTR

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(A) NAME/KEY: CDS

(B) LOCATION: 130..2055

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(A) NAME/KEY: 3'UTR

(B) LOCATION: 2056..2069

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GGGGTTACCT GGCTAAGAGC AGCAGCAGCA GCAGCAGCAG CAGCAGCAGT AGCAGCAGCA 60

GCAGCAGCAG CAGCAGCAGC AGCAGCAGCA GCAGGGTTCC TGAGCTAACT CAGACCTAGT 120

TTGATAGCA ATG GGT CCT CCT CTG AAG CTC TTC AAA AAC CAG AAG TAC 168

Met Gly Pro Pro Leu Lys Leu Phe Lys Asn Gln Lys Tyr

1 5 10

CAA GAA CTG AAG CAG GAG TGC ATG AAG GAT GGC CGC CTT TTC TGT GAC 216

Gln Glu Leu Lys Gln Glu Cys Met Lys Asp Gly Arg Leu Phe Cys Asp

15 20 25

CCA ACC TTC CTA CCG GAG AAT GAT TCT CTG TTT TTC AAC CGG CTG CTT 264

Pro Thr Phe Leu Pro Glu Asn Asp Ser Leu Phe Phe Asn Arg Leu Leu

30 35 40 45

CCT GGG AAG GTG GTG TGG AAG CGT CCA CAG GAC ATT TCT GAT GAC CCC 312

Pro Gly Lys Val Val Trp Lys Arg Pro Gln Asp Ile Ser Asp Asp Pro

50 55 60

CAC CTG ATT GTG GGC AAC ATC AGC AAC CAC CAG CTG ATC CAG GGC AGA 360

His Leu Ile Val Gly Asn Ile Ser Asn His Gln Leu Ile Gln Gly Arg

65 70 75

TTG GGG AAC AAG GCA ATG ATC TCT GCA TTT TCC TGT TTG GCT GTT CAG 408

Leu Gly Asn Lys Ala Met Ile Ser Ala Phe Ser Cys Leu Ala Val Gln

80 85 90

GAG TCA CAC TGG ACA AAG GCA ATT CCC AAC CAC AAG GAT CAG GAA TGG 456

Glu Ser His Trp Thr Lys Ala Ile Pro Asn His Lys Asp Gln Glu Trp

95 100 105

GAT CCT CGA AAG CCA GAG AAA TAC GCT GGA ATC TTT CAC TTC CGC TTC 504

Asp Pro Arg Lys Pro Glu Lys Tyr Ala Gly Ile Phe His Phe Arg Phe

110 115 120 125

TGG CAT TTT GGA GAA TGG ACC GAG GTG GTG ATT GAT GAC TTG CTT CCC 552

Trp His Phe Gly Glu Trp Thr Glu Val Val Ile Asp Asp Leu Leu Pro

130 135 140

ACC ATC AAC GGA GAT CTG GTC TTC TCA TTC TCC ACC TCC ATG AAT GAG 600

Thr Ile Asn Gly Asp Leu Val Phe Ser Phe Ser Thr Ser Met Asn Glu

145 150 155

TTT TGG AAT GCT CTA CTG GAA AAA GCG TAT GCA AAG CTG CTG GGC TGT 648

Phe Trp Asn Ala Leu Leu Glu Lys Ala Tyr Ala Lys Leu Leu Gly Cys

160 165 170

TAT GAG GCT TTG GAT GGT CTG ACC ATC ACT GAT ATC ATC ATG GAC TTC 696

Tyr Glu Ala Leu Asp Gly Leu Thr Ile Thr Asp Ile Ile Met Asp Phe

175 180 185

ACT GGC ACA CTG GCT GAA ATC ATT GAC ATG CAG AAA GGA CGA TAC ACT 744

Thr Gly Thr Leu Ala Glu Ile Ile Asp Met Gln Lys Gly Arg Tyr Thr

190 195 200 205

GAT CTT GTT GAG GAG AAG TAC AAG CTG TTT GGA GAA CTG TAC AAA ACG 792

Asp Leu Val Glu Glu Lys Tyr Lys Leu Phe Gly Glu Leu Tyr Lys Thr

210 215 220

TTC ACC AAA GGA GGT CTA ATT TGC TGC TCC ATT GAG TCT CCC AGC CAG 840

Phe Thr Lys Gly Gly Leu Ile Cys Cys Ser Ile Glu Ser Pro Ser Gln

225 230 235

GAG GAA CAA GAA GTT GAA ACA GAC TGG GGA CTA CTG AAG GGT TAT ACC 888

Glu Glu Gln Glu Val Glu Thr Asp Trp Gly Leu Leu Lys Gly Tyr Thr

240 245 250

TAC ACC ATG ACT GAT ATT CGC AAG CTC CGT CTC GGA GAA AGA CTT GTG 936

Tyr Thr Met Thr Asp Ile Arg Lys Leu Arg Leu Gly Glu Arg Leu Val

255 260 265

GAA GTC TTC AGT ACT GAG AAG CTG TAT ATG GTT CGC CTA AGG AAC CCA 984

Glu Val Phe Ser Thr Glu Lys Leu Tyr Met Val Arg Leu Arg Asn Pro

270 275 280 285

TTG GGA AGA CAG GAA TGG AGT GGC CCC TGG AGT GAA ATT TCA GAG GAG 1032

Leu Gly Arg Gln Glu Trp Ser Gly Pro Trp Ser Glu Ile Ser Glu Glu

290 295 300

TGG CAG CAA CTG ACT GTA ACA GAT CGC AAG AAC CTA GGA CTT GTT ATG 1080

Trp Gln Gln Leu Thr Val Thr Asp Arg Lys Asn Leu Gly Leu Val Met

305 310 315

TCT GAT GAT GGA GAA TTT TGG ATG AGT CTG GAA GAT TTT TGC CAC AAC 1128

Ser Asp Asp Gly Glu Phe Trp Met Ser Leu Glu Asp Phe Cys His Asn

320 325 330

TTT CAC AAA CTG AAT GTC TGC CGC AAT GTG AAT AAT CCT GTT TTT GGC 1176

Phe His Lys Leu Asn Val Cys Arg Asn Val Asn Asn Pro Val Phe Gly

335 340 345

CGC AAG GAG CTG GAA TCA GTG GTG GGA TGT TGG ACT GTG GAT GAT GAC 1224

Arg Lys Glu Leu Glu Ser Val Val Gly Cys Trp Thr Val Asp Asp Asp

350 355 360 365

CCT CTG ATG AAC CGA TCA GGA GGT TGC TAT AAC AAC CGT GAT ACC TTC 1272

Pro Leu Met Asn Arg Ser Gly Gly Cys Tyr Asn Asn Arg Asp Thr Phe

370 375 380

TTG CAG AAT CCT CAG TAC ATT TTC ACT GTG CCC GAG GAT GGC CAT AAA 1320

Leu Gln Asn Pro Gln Tyr Ile Phe Thr Val Pro Glu Asp Gly His Lys

385 390 395

GTC ATC ATG TCA CTG CAA CAG AAG GAC CTA CGC ACT TAC CGC CGA ATG 1368

Val Ile Met Ser Leu Gln Gln Lys Asp Leu Arg Thr Tyr Arg Arg Met

400 405 410

GGA AGA CCT GAT AAT TAC ATC ATT GGT TTT GAG CTC TTC AAG GTG GAG 1416

Gly Arg Pro Asp Asn Tyr Ile Ile Gly Phe Glu Leu Phe Lys Val Glu

415 420 425

ATG AAC CGA AGG TTC CGT CTT CAC CAT CTG TAT ATT CAG GAG CGT GCT 1464

Met Asn Arg Arg Phe Arg Leu His His Leu Tyr Ile Gln Glu Arg Ala

430 435 440 445

GGG ACT TCC ACT TAT ATC GAC ACC CGT ACT GTG TTT CTG AGC AAG TAT 1512

Gly Thr Ser Thr Tyr Ile Asp Thr Arg Thr Val Phe Leu Ser Lys Tyr

450 455 460

CTG AAG AAG GGC AGC TAC GTG CTT GTT CCA ACC ATG TTC CAA CAT GGC 1560

Leu Lys Lys Gly Ser Tyr Val Leu Val Pro Thr Met Phe Gln His Gly

465 470 475

CGT ACC AGT GAA TTT CTG CTG AGG ATC TTC TCT GAA GTG CCC GTC CAG 1608

Arg Thr Ser Glu Phe Leu Leu Arg Ile Phe Ser Glu Val Pro Val Gln

480 485 490

CTC AGG GAA CTG ACC TTG GAC ATG CCC AAG ATG TCT TGC TGG AAC CTG 1656

Leu Arg Glu Leu Thr Leu Asp Met Pro Lys Met Ser Cys Trp Asn Leu

495 500 505

GCA CGT GGC TAC CCA AAG GTG GTT ACC CAG ATC ACT GTC CAC AGT GCT 1704

Ala Arg Gly Tyr Pro Lys Val Val Thr Gln Ile Thr Val His Ser Ala

510 515 520 525

GAG GGC CTG GAG AAG AAG TAT GCC AAT GAA ACT GTC AAT CCA TAT CTG 1752

Glu Gly Leu Glu Lys Lys Tyr Ala Asn Glu Thr Val Asn Pro Tyr Leu

530 535 540

ATC ATC AAA TGT GGA AAG GAG GAA GTC CGT TCC CCT GTC CAG AAG AAT 1800

Ile Ile Lys Cys Gly Lys Glu Glu Val Arg Ser Pro Val Gln Lys Asn

545 550 555

ACT GTG CAT GCC ATT TTT GAC ACG CAG GCC GTT TTC TAC AGA AGG ACC 1848

Thr Val His Ala Ile Phe Asp Thr Gln Ala Val Phe Tyr Arg Arg Thr

560 565 570

ACT GAC ATT CCT ATT ATC ATC CAG GTG TGG AAC AGC AGA AAA TTC TGT 1896

Thr Asp Ile Pro Ile Ile Ile Gln Val Trp Asn Ser Arg Lys Phe Cys

575 580 585

GAT CAG TTC CTG GGG CAG GTT ACT CTC GAT GCT GAC CCC AGC GAC TGC 1944

Asp Gln Phe Leu Gly Gln Val Thr Leu Asp Ala Asp Pro Ser Asp Cys

590 595 600 605

CGT GAT CTG AAA TCT CTG TAC CTG CGT AAG AAG GGT GGT CCT ACT GCC 1992

Arg Asp Leu Lys Ser Leu Tyr Leu Arg Lys Lys Gly Gly Pro Thr Ala

610 615 620

AAA GTC AAG CAA GGT CAC ATC AGC TTC AAA GTT ATC TCT AGC GAT GAT 2040

Lys Val Lys Gln Gly His Ile Ser Phe Lys Val Ile Ser Ser Asp Asp

625 630 635

CTC ACT GAG CTC TAAGTAGTCA TCATCAG 2069

Leu Thr Glu Leu

640

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 2:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 641 amino acids

(B) TYPE: amino acid

(D) TOPOLOGY: linear

(ii) MOLECULE TYPE: Protein

(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 2:

Met Gly Pro Pro Leu Lys Leu Phe Lys Asn Gln Lys Tyr Gln Glu Leu

1 5 10 15

Lys Gln Glu Cys Met Lys Asp Gly Arg Leu Phe Cys Asp Pro Thr Phe

20 25 30

Leu Pro Glu Asn Asp Ser Leu Phe Phe Asn Arg Leu Leu Pro Gly Lys

35 40 45

Val Val Trp Lys Arg Pro Gln Asp Ile Ser Asp Asp Pro His Leu Ile

50 55 60

Val Gly Asn Ile Ser Asn His Gln Leu Ile Gln Gly Arg Leu Gly Asn

65 70 75 80

Lys Ala Met Ile Ser Ala Phe Ser Cys Leu Ala Val Gln Glu Ser His

85 90 95

Trp Thr Lys Ala Ile Pro Asn His Lys Asp Gln Glu Trp Asp Pro Arg

100 105 110

Lys Pro Glu Lys Tyr Ala Gly Ile Phe His Phe Arg Phe Trp His Phe

115 120 125

Gly Glu Trp Thr Glu Val Val Ile Asp Asp Leu Leu Pro Thr Ile Asn

130 135 140

Gly Asp Leu Val Phe Ser Phe Ser Thr Ser Met Asn Glu Phe Trp Asn

145 150 155 160

Ala Leu Leu Glu Lys Ala Tyr Ala Lys Leu Leu Gly Cys Tyr Glu Ala

165 170 175

Leu Asp Gly Leu Thr Ile Thr Asp Ile Ile Met Asp Phe Thr Gly Thr

180 185 190

Leu Ala Glu Ile Ile Asp Met Gln Lys Gly Arg Tyr Thr Asp Leu Val

195 200 205

Glu Glu Lys Tyr Lys Leu Phe Gly Glu Leu Tyr Lys Thr Phe Thr Lys

210 215 220

Gly Gly Leu Ile Cys Cys Ser Ile Glu Ser Pro Ser Gln Glu Glu Gln

225 230 235 240

Glu Val Glu Thr Asp Trp Gly Leu Leu Lys Gly Tyr Thr Tyr Thr Met

245 250 255

Thr Asp Ile Arg Lys Leu Arg Leu Gly Glu Arg Leu Val Glu Val Phe

260 265 270

Ser Thr Glu Lys Leu Tyr Met Val Arg Leu Arg Asn Pro Leu Gly Arg

275 280 285

Gln Glu Trp Ser Gly Pro Trp Ser Glu Ile Ser Glu Glu Trp Gln Gln

290 295 300

Leu Thr Val Thr Asp Arg Lys Asn Leu Gly Leu Val Met Ser Asp Asp

305 310 315 320

Gly Glu Phe Trp Met Ser Leu Glu Asp Phe Cys His Asn Phe His Lys

325 330 335

Leu Asn Val Cys Arg Asn Val Asn Asn Pro Val Phe Gly Arg Lys Glu

340 345 350

Leu Glu Ser Val Val Gly Cys Trp Thr Val Asp Asp Asp Pro Leu Met

355 360 365

Asn Arg Ser Gly Gly Cys Tyr Asn Asn Arg Asp Thr Phe Leu Gln Asn

370 375 380

Pro Gln Tyr Ile Phe Thr Val Pro Glu Asp Gly His Lys Val Ile Met

385 390 395 400

Ser Leu Gln Gln Lys Asp Leu Arg Thr Tyr Arg Arg Met Gly Arg Pro

405 410 415

Asp Asn Tyr Ile Ile Gly Phe Glu Leu Phe Lys Val Glu Met Asn Arg

420 425 430

Arg Phe Arg Leu His His Leu Tyr Ile Gln Glu Arg Ala Gly Thr Ser

435 440 445

Thr Tyr Ile Asp Thr Arg Thr Val Phe Leu Ser Lys Tyr Leu Lys Lys

450 455 460

Gly Ser Tyr Val Leu Val Pro Thr Met Phe Gln His Gly Arg Thr Ser

465 470 475 480

Glu Phe Leu Leu Arg Ile Phe Ser Glu Val Pro Val Gln Leu Arg Glu

485 490 495

Leu Thr Leu Asp Met Pro Lys Met Ser Cys Trp Asn Leu Ala Arg Gly

500 505 510

Tyr Pro Lys Val Val Thr Gln Ile Thr Val His Ser Ala Glu Gly Leu

515 520 525

Glu Lys Lys Tyr Ala Asn Glu Thr Val Asn Pro Tyr Leu Ile Ile Lys

530 535 540

Cys Gly Lys Glu Glu Val Arg Ser Pro Val Gln Lys Asn Thr Val His

545 550 555 560

Ala Ile Phe Asp Thr Gln Ala Val Phe Tyr Arg Arg Thr Thr Asp Ile

565 570 575

Pro Ile Ile Ile Gln Val Trp Asn Ser Arg Lys Phe Cys Asp Gln Phe

580 585 590

Leu Gly Gln Val Thr Leu Asp Ala Asp Pro Ser Asp Cys Arg Asp Leu

595 600 605

Lys Ser Leu Tyr Leu Arg Lys Lys Gly Gly Pro Thr Ala Lys Val Lys

610 615 620

Gln Gly His Ile Ser Phe Lys Val Ile Ser Ser Asp Asp Leu Thr Glu

625 630 635 640

Leu

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 3:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 1125 base pairs

(B) TYPE: nucleic acid

(C) STRANDEDNESS: single

(D) TOPOLOGY: linear

(ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic)

(iii) HYPOTHETICAL: NO

(iii) ANTISENSE: NO

(vi) ORIGINAL SOURCE:

(A) ORGANISM: Homo sapiens

(vii) IMMEDIATE SOURCE:

(B) CLONE: CAPN6

(ix) FEATURES:

(A) NAME/KEY: CDS

(B) LOCATION: 2..1125

(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 3:

G CTT GTT GAG GAG AAG TAC AAG CTA TTC GGA GAA CTG TAC AAA ACA 46

Leu Val Glu Glu Lys Tyr Lys Leu Phe Gly Glu Leu Tyr Lys Thr

1 5 10 15

TTT ACC AAA GGT GGT CTG ATC TGC TGT TCC ATT GAG TCT CCC AAT CAG 94

Phe Thr Lys Gly Gly Leu Ile Cys Cys Ser Ile Glu Ser Pro Asn Gln

20 25 30

GAG GAG CAA GAA GTT GAA ACT GAT TGG GGT CTG CTG AAG GGC CAT ACC 142

Glu Glu Gln Glu Val Glu Thr Asp Trp Gly Leu Leu Lys Gly His Thr

35 40 45

TAT ACC ATG ACT GAT ATT CGC AAA ATT CGT CTT GGA GAG AGA CTT GTG 190

Tyr Thr Met Thr Asp Ile Arg Lys Ile Arg Leu Gly Glu Arg Leu Val

50 55 60

GAA GTC TTC AGT GCT GAG AAG CTG TAT ATG GTT CGC CTG AGA AAC CCC 238

Glu Val Phe Ser Ala Glu Lys Leu Tyr Met Val Arg Leu Arg Asn Pro

65 70 75

TTG GGA AGA CAG GAA TGG AGT GGC CCC TGG AGT GAA ATT TCT GAA GAG 286

Leu Gly Arg Gln Glu Trp Ser Gly Pro Trp Ser Glu Ile Ser Glu Glu

80 85 90 95

TGG CAG CAA CTG ACT GCA TCA GAT CGC AAG AAC CTG GGG CTT GTT ATG 334

Trp Gln Gln Leu Thr Ala Ser Asp Arg Lys Asn Leu Gly Leu Val Met

100 105 110

TCT GAT GAT GGA GAG TTT TGG ATG AGC TTG GAG GAC TTT TGC CGC AAC 382

Ser Asp Asp Gly Glu Phe Trp Met Ser Leu Glu Asp Phe Cys Arg Asn

115 120 125

TTT CAC AAA CTG AAT GTC TGC CGC AAT GTG AAC AAC CCT ATT TTT GGC 430

Phe His Lys Leu Asn Val Cys Arg Asn Val Asn Asn Pro Ile Phe Gly

130 135 140

CGA AAG GAG CTG GAA TCG GTG TTG GGA TGC TGG ACT GTG GAT GAT GAT 478

Arg Lys Glu Leu Glu Ser Val Leu Gly Cys Trp Thr Val Asp Asp Asp

145 150 155

CCC CTG ATG AAC CGC TCA GGA GGC TGC TAT AAC AAC CGT GAT ACC TTC 526

Pro Leu Met Asn Arg Ser Gly Gly Cys Tyr Asn Asn Arg Asp Thr Phe

160 165 170 175

CTG CAG AAT CCC CAG TAC ATC TTC ACT GTG CCT GAG GAT GGG CAC AAG 574

Leu Gln Asn Pro Gln Tyr Ile Phe Thr Val Pro Glu Asp Gly His Lys

180 185 190

GTC ATT ATG TCA CTG CAG CAG AAG GAC CTG CGC ACT TAC CGC CGA ATG 622

Val Ile Met Ser Leu Gln Gln Lys Asp Leu Arg Thr Tyr Arg Arg Met

195 200 205

GGA AGA CCT GAC AAT TAC ATC ATT GGC TTT GAG CTC TTC AAG GTG GAG 670

Gly Arg Pro Asp Asn Tyr Ile Ile Gly Phe Glu Leu Phe Lys Val Glu

210 215 220

ATG AAC CGC AAA TTC CGC CTC CAC CAC CTC TAC ATC CAG GAG CGT GCT 718

Met Asn Arg Lys Phe Arg Leu His His Leu Tyr Ile Gln Glu Arg Ala

225 230 235

GGG ACT TCC ACC TAT ATT GAC ACC CGC ACA GTG TTT CTG AGC AAG TAC 766

Gly Thr Ser Thr Tyr Ile Asp Thr Arg Thr Val Phe Leu Ser Lys Tyr

240 245 250 255

CTG AAG AAG GGC AAC TAT GTG CTT GTC CCA ACC ATG TTC CAG CAT GGT 814

Leu Lys Lys Gly Asn Tyr Val Leu Val Pro Thr Met Phe Gln His Gly

260 265 270

CGC ACC AGC GAG TTT CTC CTG AGA ATC TTC TCT GAA GTG CCT GTC CAG 862

Arg Thr Ser Glu Phe Leu Leu Arg Ile Phe Ser Glu Val Pro Val Gln

275 280 285

CTC AGG GAA CTG ACT CTG GAC ATG CCC AAA ATG TCC TGC TGG AAC CTG 910

Leu Arg Glu Leu Thr Leu Asp Met Pro Lys Met Ser Cys Trp Asn Leu

290 295 300

GCT CGT GGC TAC CCG AAA GTA GTT ACT CAG ATC ACT GTT CAC AGT GCT 958

Ala Arg Gly Tyr Pro Lys Val Val Thr Gln Ile Thr Val His Ser Ala

305 310 315

GAG GAC CTG GAG AGG AGG TAT GCC AAT GGA ACT GTA AAC CCA TAT TTG 1006

Glu Asp Leu Glu Arg Arg Tyr Ala Asn Gly Thr Val Asn Pro Tyr Leu

320 325 330 335

GTC ATC AAA TGT GGA AAG GAG GAA GTC CGT TCT CCT GTC CAG AAA AAT 1054

Val Ile Lys Cys Gly Lys Glu Glu Val Arg Ser Pro Val Gln Lys Asn

340 345 350

ACA GTT CAT GCC ATT TTT GAC ACC CAT GCC ATT TTC TAC AGA AGG ACC 1102

Thr Val His Ala Ile Phe Asp Thr His Ala Ile Phe Tyr Arg Arg Thr

355 360 365

ACG GAC ATT CCT ATT ATA GTA CA 1125

Thr Asp Ile Pro Ile Ile Val

370

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 4:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 374 amino acids

(B) TYPE: amino acid

(D) TOPOLOGY: linear

(ii) MOLECULE TYPE: protein

(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 4:

Leu Val Glu Glu Lys Tyr Lys Leu Phe Gly Glu Leu Tyr Lys Thr Phe

1 5 10 15

Thr Lys Gly Gly Leu Ile Cys Cys Ser Ile Glu Ser Pro Asn Gln Glu

20 25 30

Glu Gln Glu Val Glu Thr Asp Trp Gly Leu Leu Lys Gly His Thr Tyr

35 40 45

Thr Met Thr Asp Ile Arg Lys Ile Arg Leu Gly Glu Arg Leu Val Glu

50 55 60

Val Phe Ser Ala Glu Lys Leu Tyr Met Val Arg Leu Arg Asn Pro Leu

65 70 75 80

Gly Arg Gln Glu Trp Ser Gly Pro Trp Ser Glu Ile Ser Glu Glu Trp

85 90 95

Gln Gln Leu Thr Ala Ser Asp Arg Lys Asn Leu Gly Leu Val Met Ser

100 105 110

Asp Asp Gly Glu Phe Trp Met Ser Leu Glu Asp Phe Cys Arg Asn Phe

115 120 125

His Lys Leu Asn Val Cys Arg Asn Val Asn Asn Pro Ile Phe Gly Arg

130 135 140

Lys Glu Leu Glu Ser Val Leu Gly Cys Trp Thr Val Asp Asp Asp Pro

145 150 155 160

Leu Met Asn Arg Ser Gly Gly Cys Tyr Asn Asn Arg Asp Thr Phe Leu

165 170 175

Gln Asn Pro Gln Tyr Ile Phe Thr Val Pro Glu Asp Gly His Lys Val

180 185 190

Ile Met Ser Leu Gln Gln Lys Asp Leu Arg Thr Tyr Arg Arg Met Gly

195 200 205

Arg Pro Asp Asn Tyr Ile Ile Gly Phe Glu Leu Phe Lys Val Glu Met

210 215 220

Asn Arg Lys Phe Arg Leu His His Leu Tyr Ile Gln Glu Arg Ala Gly

225 230 235 240

Thr Ser Thr Tyr Ile Asp Thr Arg Thr Val Phe Leu Ser Lys Tyr Leu

245 250 255

Lys Lys Gly Asn Tyr Val Leu Val Pro Thr Met Phe Gln His Gly Arg

260 265 270

Thr Ser Glu Phe Leu Leu Arg Ile Phe Ser Glu Val Pro Val Gln Leu

275 280 285

Arg Glu Leu Thr Leu Asp Met Pro Lys Met Ser Cys Trp Asn Leu Ala

290 295 300

Arg Gly Tyr Pro Lys Val Val Thr Gln Ile Thr Val His Ser Ala Glu

305 310 315 320

Asp Leu Glu Arg Arg Tyr Ala Asn Gly Thr Val Asn Pro Tyr Leu Val

325 330 335

Ile Lys Cys Gly Lys Glu Glu Val Arg Ser Pro Val Gln Lys Asn Thr

340 345 350

Val His Ala Ile Phe Asp Thr His Ala Ile Phe Tyr Arg Arg Thr Thr

355 360 365

Asp Ile Pro Ile Ile Val

370

Claims

하기 서열 (a) 내지 (d)를 포함하는, SEQ ID NO. 1 또는 SEQ ID NO. 3의 서열을 갖는 CAPN6 칼파인 유전자, 유도된 아미노산 수준에서 60 내지 100%의 상동성을 갖는 그의 대립 변이체, 유사체 또는 유도체.

(a) Leu-Gly-Asn-Lys-Ala,

(상기 서열은 사람의 칼파인 I에서 115번 위치의 시스테인 아미노산이 서열 SEQ ID NO. 1 과 SEQ ID NO. 3의 81번 위치의 리신으로 변형되었다는 점에서 대응되는 사람 칼파인 I의 서열과 상이함)

(b) Ala-X-Ser-Cys-Leu-Ala,

대응되는 사람 칼파인 I의 서열과 비교하면, 122번과 125번 위치의 알라닌과 트레오닌 아미노산이 서열 SEQ ID NO. 1과 SEQ ID NO. 3의 88번과 91번 위치의 세린과 알라닌으로 변형됨)

(c) Gly-Tyr-Thr-(His 또는 Tyr)-Thr-X-Thr,

(대응되는 사람의 칼파인 I 서열과 비교하면, 272, 273 및 275번 위치의 히스티딘, 알라닌 및 세린 아미노산이 서열 SEQ ID NO. 1과 SEQ ID NO. 3의 252, 253 및 255번 위치의 티로신, 트레오닌 및 트레오닌으로 변경되었고, 또한 칼파인 I에서 274번 위치의 티로신 잔기가 SEQ ID NO. 3의 254번 위치의 히스티딘으로 추가로 변형됨)

(d) Arg-X-Arg-Asn-Pro-Leu-Gly,

(상기 서열은 사람의 칼파인 I에서 298번 위치의 트립토판 아미노산이 서열 SEQ ID NO. 1과 SEQ ID NO. 3의 286번 위치의 류신으로 변형되었다는 점에서 대응되는 사람 칼파인 I의 서열과 상이함)

상기 서열 중 X는 천연 아미노산이다.
제1항에 기재된 CAPN6 칼파인 유전자, 그의 대립 변이체 또는 유사체를 포함하고 유전자 발현을 증가시키는 하나 이상의 조절 신호와 기능적으로 연결된 유전자 구조체.
제1항에 기재된 CAPN6 유전자, 그의 대립 변이체 또는 유사체에 의해 코딩되는 아미노산 서열.
제3항에 있어서, 효소 활성을 갖는 단백질의 아미노산 서열.
제1항에 기재된 서열에 의해 코딩되는 칼파인, 그의 대립 변이체 또는 유사체를 조직 또는 세포로부터 단리하는 단계, 시험 물질에 의한 효소 CAPN6의 기질 절단의 억제 및 한가지 이상의 다른 시험에서 효소 칼파인 I 및(또는) II의 기질 절단의 억제를 측정하는 단계 및 효소 CAPN6와 한 가지 이상의 다른 칼파인을 억제하는 시험 물질을 선별하는 단계를 포함하는, 칼파인 억제제의 확인 방법.
제5항에 있어서, 효소 CAPN6은 억제하지 않지만 효소 칼파인 I 및(또는) II는 억제하는 시험 물질을 선별하는 방법.
제5항에 있어서, 효소 CAPN6은 억제하지만 효소 칼파인 I 및(또는) II는 억제하지 않는 시험 물질을 선별하는 방법.
제5항 내지 7항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 시스템에서 세포막을 통과하는 시험 물질을 선별하는 방법.
제1항에 기재된 효소 CAPN6의 유전자 서열, 그의 대립 변이체 또는 유사체의 한 카피 이상을 벡터에 클로닝하는 단계, 효소 CAPN6의 유전자, 그의 대립 변이체 또는 유사체를 벡터에 적합한 숙주 생물체에서 발현시키는 단계 및 효소를 숙주 생물체로부터 단리하는 단계를 포함함을 특징으로 하는 효소 CAPN6, 그의 대립 변이체 또는 유사체의 제조 방법,
제9항에 있어서, 상기 유전자, 대립 변이체 또는 유사체를 원핵, 또는 진핵 세포에 발현시킬 수 있는 벡터를 사용하는 방법.
제9항에 있어서, 세균, 진균 또는 동물세포를 숙주 생물체로서 사용하는 방법.
제9항에 있어서, 배큘로바이러스를 벡터로 사용하고, 곤충 세포를 숙주 생물체로 사용하는 방법.
제5항 내지 8항 중 어느 한 항에서 확인될 수 있는 칼파인 억제제의, 칼파인 장애가 존재하는 질병 치료용 의약을 제조하기 위한 용도.
제13항에 있어서, 심혈관계, 면역학적, 염증성, 알레르기성, 신경학적, 신경퇴행성 또는 종양학적 질병으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 질병 치료용 의약을 제조하기 위한 용도.
제3항에 기재된 아미노산 서열의, 시험 시스템에서의 용도.
제3항에 기재된 아미노산 서열의, 항체 생산을 위한 용도.
제1항에 기재된 유전자 서열, 그의 대립 변이체 또는 유사체의, 안티센스 mRNA 생산을 위한 용도.
제17항에 기재된 안티센스 mRNA의, 칼파인 기능 장애가 존재하는 질병 치료용 의약을 제조하기 위한 용도.
제1항에 기재된 칼파인 유전자, 그의 대립 변이체 또는 유사체의, 질병 진단 및 유전자 요법을 위한 용도.