KR100481621B1 - 내열성 안티카이모트립신 변이체 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 내열성 안티카이모트립신 변이체 및 그의 제조 방법에 관한 것으로, 본 발명의 내열성 안티카이모트립신 변이체들은 안티카이모트립신의 49번, 68번, 111번, 112번, 140번, 162번, 187번 및 385번 아미노산 중 하나 이상이 다른 아미노산으로 치환됨으로써 안티카이모트립신의 활성은 유지되면서 내열성이 크게 증가되어 안정성이 높으므로, 생체내에서 안정한 단백질 치료제로서 유용하며 진단 시약 개발, 친화성 컬럼의 제조 등 다른 여러 가지 용도에도 응용될 수 있다.
Description
본 발명은 저해효율의 감소 없이 내열성이 증가된 알파-1-안티카이모트립신(이하, ACT라 함) 변이체 및 이의 제조 방법에 관한 것이다.
물질의 안정성은 그 물질의 기능을 유지하기 위해 절대적으로 필요하며 특히 변성이 잘 되는 단백질로 구성된 물질은 안정성이 보존기간과 체내에서의 반감기를 결정하는데 중요한 요인이 된다. 따라서 단백질로 구성된 치료물질이나 진단시약을 상업제품으로 개발하기 위해서는 이들 물질의 안정성을 증가시키는 것이 필수적이다. 인체 혈액에서 분리 및 정제된 기존의 단백질 치료제는 원료의 제한과 에이즈나 간염 바이러스와 같은 감염성 물질의 오염 문제 때문에 최근에는 유전공학기법을 통해 생산하려는 시도가 증가하고 있다. 그러나 이와 같이 생산된 재조합 단백질들은 인체에서 분리된 것들보다 상대적으로 안정성이 낮으므로 혈장에 투여하였을 때 반감기가 현저하게 떨어지는 경향이 있어서 치료제로서의 개발에 한계를 드러내고 있다. 따라서, 이러한 안정성 감소 문제를 해결하기 위한 방법의 모색이 필요한데, 그 방법 중 하나는 유전자 변이를 통해 아미노산을 치환시켜 활성은 유지시키면서 안정성이 증가된 변이단백질을 생산하는 유전공학적 방법이다. 단백질의 내열성과 변성에 대한 안정성은 밀접한 상관관계가 있음이 이미 이론적 및 실험적으로 밝혀진 바 있다(Pace, Trends in Biotechnology, 8, 93-98(1990)).
한편, ACT는 혈장 내에 존재하는 단백질 분해효소인 카이모트립신(chymotrypsin)을 저해함으로써, 염증반응, 혈액응고, 면역반응, 혈전 융해 등의 단백질 분해작용을 조절할 뿐만 아니라, 호르몬 운반, 암 전이, 세포 이동, 수정, 세포 사멸 등의 다양한 생명현상을 조절한다 (Vaux et al., Cell, 76, 777-779 (1994); Stefansson and Lawrence, Nature, 383, 441-443(1996)).
ACT는 398 개의 아미노산으로 이루어진 당단백질로서 조직 손상 시 급속히 혈장내의 농도가 증가하고 염증반응에 관여하며, ACT의 이상은 기관지염이나 폐기종을 유발한다. 카텝신 G(cathepsin G), 카이모트립신(chymotrypsin), 카이마제(mast cell chymases) 등의 단백질분해효소와 저해복합체를 형성함으로써 조직을 보호한다. 또한 ACT는 전립선 암에 특이적으로 발현되는 단백질분해효소와 복합체를 형성할 뿐만 아니라(Peehl, Cancer (phila.), 75, (supple.) 2021-2026(1995)), 알츠하이머형 치매에서 보여지는 아밀로이드 플라크의 형성을 조절할 수 있는 기능이 있는 것으로 보고되었다(Ma et al., Nature, 372, 92-94(1994)). ACT의 유전자 염기서열은 알려져 있으며(Hill and Hastie, Nature, 326, 96-99(1987); 서열번호: 1), 활성이 있는 상태로 대장균에서 재조합 단백질로 발현된 바 있다(Lukas et al., Nat. Struct. Biol., 3, 888-893(1996)).
본 발명의 목적은 내열성이 증가된 안티카이모트립신 변이체를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 변이체를 코드하는 DNA 및 이를 포함하는 발현벡터를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 발현벡터로 형질전환된 미생물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 형질전환체를 배양하는 것을 포함하는 내열성 안티카이모트립신 변이체의 생산 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적에 따라, 본 발명에서는 알파-1-안티카이모트립신(ACT)의 활성을 유지하면서도 안정성이 크게 증가된 ACT 변이체, 이를 코드하는 DNA, 이 DNA를 포함하는 발현벡터, 이 발현벡터로 형질전환된 미생물 및 이 미생물을 배양하여 ACT 변이체를 생산하는 방법을 제공한다.
본 발명의 ACT 변이체는 서열번호: 2의 아미노산 서열을 갖는 인간 ACT의 아미노산 중 49번, 68번, 111번, 112번, 140번, 162번, 187번 및 385번 아미노산 중 하나 이상이 다른 아미노산으로 치환되어 내열성이 증가된 것들이다. 바람직한 치환체들은 서열번호: 2의 아미노산 서열을 갖는 ACT로부터 49번 이소로이신의 로이신 또는 발린으로의 치환; 68번 아스파라진의 글리신으로의 치환; 111번 세린의 이소로이신으로의 치환; 112번 메티오닌의 이소로이신으로의 치환; 140번 알라닌의 발린으로의 치환; 162번 글리신의 발린으로의 치환; 187번 페닐알라닌의 로이신, 발린, 이소로이신 또는 시스테인으로의 치환; 및 385번 아스파라진의 알라닌으로의 치환으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 치환을 하나 이상 포함할 수 있다.
예시적인 치환체들은 서열번호: 2의 아미노산 서열을 갖는 ACT로부터 49번 아미노산인 이소로이신이 로이신 또는 발린으로 치환된 것["I49L" 또는 "I49V"]; 68번 아미노산인 아스파라진이 글리신으로 치환된 것["N68G"]; 111번 세린이 이소로이신으로 치환된 것["S111I"]; 112번 메티오닌이 이소로이신으로 치환된 것["M112I"]; 140번 알라닌이 발린으로 치환된 것["A140V"]; 162번 글리신이 발린으로 치환된 것["G162V"]; 187번 페닐알라닌이 로이신, 발린, 이소로이신 또는 시스테인으로 치환된 것["F187L", "F187V", "F187I" 또는 "F187C"]; 및 385번 아스파라진이 알라닌으로 치환된 것["N385A"]이다.
본 발명의 ACT 변이체들은 이를 코드하는 DNA를 적절한 발현벡터에 삽입하고, 제작된 벡터를 통상적인 방법에 따라 적절한 숙주세포에 형질전환시킨 후, 형질전환체를 배양하여 ACT를 발현시킨 다음 배양액으로부터 내열성 ACT를 분리하는 방법으로 제조할 수 있다.
본 발명의 ACT 변이체를 코드하는 DNA는 서열번호: 1의 DNA 서열에서 치환하고자 하는 부위의 코돈을 부위 특이적 돌연변이법(site-directed mutagenesis)에 의해 목적하는 아미노산의 코돈으로 치환하여 얻을 수 있으며, 코돈의 축퇴성(degeneracy)으로 인해 본 발명의 변이체를 코딩하는 다양한 DNA가 존재할 수 있다. 특히 아미노산 서열에 영향을 주지 않고 숙주가 선호하는 코돈을 선택하여 변화된 DNA를 사용함으로써 ACT의 발현량을 증가시킬 수도 있다.
ACT 변이체의 발현벡터는 상기 DNA를 선택된 숙주 세포에서 이종 단백질의 발현에 사용되는 것으로 공지된 적절한 벡터에 삽입하여 제조할 수 있다. 상기 발현 벡터를 적절한 숙주 세포에 형질전환시켜 본 발명의 내열성 ACT 변이체를 생산하는 형질전환체를 얻을 수 있으며, 숙주 세포로는 대장균 등을 사용할 수 있다.
내열성 ACT를 생산하는 변이주는, 형질전환체를 배양하고 배양 상층액 등을 시료로 하여 일정 시간 간격으로 열을 가한 후 남아 있는 카이모트립신 저해 활성을 측정하여 활성이 절반으로 줄어드는 데 소요되는 시간(반감기)을 측정하여 내열성이 증가된 변이주를 선택함으로써 얻을 수 있다.
본 발명의 ACT 변이체들은 서열번호: 2의 아미노산 서열을 갖는 야생형의 ACT에 비해 시험관내(in vitro) 실험에서 2.5 배 이상 증가된 반감기를 나타낸다. 따라서, 이들 내열성 ACT 변이체들은 야생형 ACT에 비해 혈장 내에서 증가된 반감기를 나타낼 것이며, 재조합 저해제의 산업적 개발에 이용될 수 있다. 내열성 ACT는 주사 투여, 에어로졸 흡입법 및 유전자 치료법 등에 의해 직접 인체에 투여될 수 있을 뿐만 아니라 진단 시약 개발, 친화성 컬럼의 제조 등 다른 여러 가지 용도에도 응용될 수 있다.
이하에서 본 발명을 실시예에 의거하여 보다 구체적으로 설명한다. 단, 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명이 이들만으로 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: ACT 발현 벡터의 제조
ACT 유전자의 염기서열(Hill and Hastie, Nature, 326, 96-99 (1987); 서열번호: 1)에 상보적인 서열번호: 3 및 4의 프라이머와 간 cDNA 라이브러리(클론테크사, 미국)를 사용하여 중합효소 연쇄반응법(94℃에서 3분간 예비 변성시킨 후, 94℃, 1분 20초, 50℃, 1분, 72℃, 2분의 사이클을 35 회 반복함)을 통하여 이중가닥 ACT cDNA를 증폭시켰다. 이 cDNA를 제한효소 HpaI과 EcoRI으로 절단하여 1% 아가로즈 겔 상에 전기영동하여 1.3 kb 크기의 DNA 조각을 분리하였다.
pFEAT30 (Kwon et al., J. Biol. Chem., 269, 9627-9731(1994)) 플라스미드를 NcoI으로 절단하여 그 절단부위를 대장균의 클레나우 효소 (Klenow; New England Biolabs사)로 메꾼 후, EcoRI으로 재차 절단한 부위에 상기한 ACT cDNA 조각을 클로닝하고, 제작된 플라스미드를 pFEACT라고 명명하였다.
실시예 2: ACT 변이체의 생산
플라스미드 pFEACT로 대장균 CJ236 균주 (Boeringer Mannheim 사)를 형질전환한 후 우리딘이 함유된 LB 배지에서 600 nm에서의 흡광도가 0.4가 될 때까지 배양하였다. 대장균 수의 10-20배 정도의 M13K07 헬퍼 파아지(Boeringer Mannheim 사)로 감염시킨 후 37℃에서 6시간 배양하여 안티카이모트립신 유전자를 함유하는 단일가닥 DNA를 함유하는 박테리오파지를 얻은 후, 페놀 처리하여 박테리오파지를 분쇄하고 단일가닥 DNA를 분리하였다. ACT 유전자에 부위 특이적 돌연변이(site-directed mutagenesis)를 유발하기 위하여, 일부 변이형 염기를 포함하는 하기의 올리고뉴클레오티드 프라이머 및 DNA 중합효소를 이용하여 쿤켈(Kunkel)의 방법(Kunkel et al., Methods in Enzymology, 154, 367-382 (1987))에 따라 이중가닥 DNA로 전환하였다:
49번 Ile를 Leu로 치환: 5'-TAAGAATGTCCTCTTCTCCCC-3' (서열번호: 5)
49번 Ile를 Val로 치환: 5'-TAAGAATGTCGTCTTCTCCCC-3' (서열번호: 6)
68번 Asn을 Gly으로 치환: 5'-AGACACCCAGGACATCTTCTTC-3' (서열번호: 7)
112번 Met를 Ile로 치환: 5'-AGCTGAGTATTGGAAATGCCA-3' (서열번호: 8)
385번 Asn을 Ala로 치환: 5'-ATGGGAAATGTCATGTTTGTC-3' (서열번호: 9)
162번 Gly를 Val로 치환: 5'-GTGAAGAATGTAACTAGGGGG-3' (서열번호: 10)
111번 Ser을 Ile로 치환: 5'-ACAGGCAATGTCAGCGCACTC-3' (서열번호: 11)
140번 Ala를 Val로 치환: 5'-GGCTCCGAGGTCTTTGCCACT-3' (서열번호: 12)
187번 Phe를 Val로 치환: 5'-GAATTACATCCTCTTTAAAGCCAAA-3' (서열번호: 13)
187번 Phe를 Ile로 치환: 5'-GAATTACATCATCTTTAAAGCCAAA-3' (서열번호: 14)
187번 Phe를 Leu로 치환: 5'-GAATTACATCGTCTTTAAAGCCAAA-3' (서열번호: 15)
187번 Phe를 Cys로 치환: 5'-GAATTACATCTGCTTTAAAGCCAAA-3' (서열번호: 16)
상기와 같이 제조된 DNA의 염기서열 변화를 생거의 염기서열분석법 (Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 5463 (1977))을 활용하여 서열분석 키트(sequenases version 2.0 sequencing kit, US biochemical 사의 제품)을 사용하여 확인하였다. 각 변이체를 발현하는 플라스미드들은 각각 pFEACT-I49L, pFEACT-I49V, pFEACT-N68G, pFEACT-M112I, pFEACT-N385A, pFEACT-G162V, pFEACT-S111I, pFEACT-A140V, pFEACT-F187V, pFEACT-F187I, pFEACT-F187L 및pFEACT-F187C 라 명명하였다. 제조된 플라스미드들로 대장균 BL21(DE3)(Invitrogen 사)을 형질전환시켰으며, 이 중 A140V 변이체를 발현하는 플라스미드 pFEACT-A140V를 포함하는 대장균 BL21(DE3) 균주는 한국생명공학연구원 유전자은행에 2002년 1월 4일자 기탁번호 제 KCTC 10153BP 호로서 기탁되었다.
루빈 등의 방법(Rubin et al., J. Biol. Chem., 265, 1199-1207(1990))에 따라 형질전환체들을 37℃에서 600 nm에서의 흡광도가 0.8이 될 때까지 배양한 다음 IPTG를 0.4 mM 농도로 첨가하고 40℃에서 3 시간 더 배양함으로써 ACT를 발현시켰다. 발현된 단백질을 표적 단백질분해효소인 카이모트립신과 여러 비율로 반응시킨 후 SDS-PAGE 상에 전기영동을 한 결과 SDS에 의해 분리되지 않는 안정한 ACT-카이모트립신의 복합체를 형성함을 확인하였다(도 1). 도 1에서, 제 1열은 분자량 기준 단백질들(Gibco BRL사)로 위로부터 200 kD, 97.4 kD, 68 kD, 43 kD, 29 kD 이고, 2열은 대장균에서 생성된 재조합 ACT이고, 3 내지 6열은 카이모트립신을 ACT 몰수에 비해 각각 0.2배, 0.4배, 0.8배, 1.2배의 비율로 넣고 37℃에서 10분 간 배양한 후 전기영동한 것이고, 7열은 카이모트립신만을 전기영동한 것이다.
실시예 3: ACT 변이체의 내열성 확인
실시예 1에서 얻은 배양액을 원심분리하여 세포를 수확하고, 수확한 세포를완충용액 (10 mM 염화칼슘, 100 mM 트리스, pH 8.0)에 현탁시켜 초음파로 파쇄하였다. 파쇄액을 원심분리하여 불용성물질을 제거한 후 상등액을 ACT 추출액으로 사용하였다.
ACT 활성측정은 숀바움 등의 방법(Schonbaum et al., J. Biol. Chem., 246, 2930-2935, 1961)을 사용하였다. 완충액은 50 mM 염화 나트륨과 10 mM 염화칼슘, 0.005 % 트리톤 X-100이 첨가된 50 mM 트리스 (pH 7.8)이고, 기질은 숙시닐-알라닐-알라닐-프로린-페닐알라닐-파라니트로아닐리드를 10 mM이 되도록 디메틸설폭사이드에 녹인 것이며, 효소액은 50% 글리세롤을 첨가한 반응 완충액(50 mM 염화 나트륨과 10 mM 염화칼슘, 0.005 % 트리톤 X-100이 첨가된 50 mM 트리스, pH 7.8)에 카이모트립신을 0.3 μM이 되도록 용해시켰다. 효소저해활성은 효소액 10 ㎕, ACT 추출액 10 ㎕ 및 반응 완충액을 섞어 60 ㎕로 만든 후 37℃에서 10분간 반응시키고, 반응완충액 430 ㎕와 기질 10 ㎕를 첨가하여 410 nm에서 흡광도의 변화를 3분간 측정하였다.
내열성을 결정하기 위하여, ACT 추출액을 52℃로 유지하면서 시간별로 잔여 카이모트립신 저해 활성을 측정하고, 대조군으로 pFEACT를 함유하는 대장균 BL21(DE3) 세포에서 동일한 방법으로 생산한 야생형 재조합 ACT를 사용하였다. 그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, 49번 이소로이신이 로이신으로 치환된 경우 반감기가 25분에서 64분으로 증가하였고, 발린으로 치환된 경우는 96분으로 증가하였다. 68번 아스파라진이 글리신으로 치환된 경우는 반감기가 25분에서 67분으로, 112번 메티오닌이 이소로이신으로 치환된 경우는 116분으로, 385번 아스파라진이 알라닌으로 치환된 경우는 64분으로, 162번 아미노산인 글리신이 발린으로 치환된 경우는 316분으로, 111번 아미노산인 세린이 이소로이신으로 치환된 경우는 95분으로, 140번 아미노산인 알라닌이 발린으로 치환된 경우는 705분으로, 187번 아미노산인 페닐알라닌이 발린, 이소로이신, 로이신, 또는 시스테인으로 치환된 경우는 각각 90분, 93분, 100분, 88분으로 증가하였다.
본 발명의 안티카이모트립신 변이체들은 효소의 활성은 유지되면서 내열성이 크게 증가되어 안정성이 높으므로, 생체내에서 안정한 단백질 치료제로서 유용하며 진단 시약 개발, 친화성 컬럼의 제조 등 다른 여러 가지 용도에도 응용될 수 있다.
도 1은 대장균에서 생성된 재조합 안티카이모트립신의 카이모트립신과의 복합체 형성 실험결과를 나타낸 사진이고,
도 2는 대장균에서 생성된 야생형과 변이형 재조합 안티카이모트립신의 52℃에서의 열불활성화 실험결과를 나타낸 그래프이다.
<110> Korea Institute of Science and Technology
<120> Thermostable antichimotrypsin muteins
<160> 16
<170> KopatentIn 1.71
<210> 1
<211> 1194
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(1194)
<400> 1
aac agc cca ctt gac gag gag aat ctg acc cag gag aac caa gac cga 48
Asn Ser Pro Leu Asp Glu Glu Asn Leu Thr Gln Glu Asn Gln Asp Arg
1 5 10 15
ggg aca cac gtg gac ctc gga tta gcc tcc gcc aac gtg gac ttc gct 96
Gly Thr His Val Asp Leu Gly Leu Ala Ser Ala Asn Val Asp Phe Ala
20 25 30
ttc agc ctg tac aag cag tta gtc ctg aag gcc ctt gat aag aat gtc 144
Phe Ser Leu Tyr Lys Gln Leu Val Leu Lys Ala Leu Asp Lys Asn Val
35 40 45
atc ttc tcc cca ctg agc atc tcc acc gcc ttg gcc ttc ctg tct ctg 192
Ile Phe Ser Pro Leu Ser Ile Ser Thr Ala Leu Ala Phe Leu Ser Leu
50 55 60
ggg gcc cat aat acc acc ctg aca gag att ctc aag gcc tcg agt tca 240
Gly Ala His Asn Thr Thr Leu Thr Glu Ile Leu Lys Ala Ser Ser Ser
65 70 75 80
cct cac gga gac tta ctg agg cag aaa ttc act cag agc ttc cag cac 288
Pro His Gly Asp Leu Leu Arg Gln Lys Phe Thr Gln Ser Phe Gln His
85 90 95
ctc cgc gca ccc tca atc agt tcc agc gat gag ctg cag ctg agt atg 336
Leu Arg Ala Pro Ser Ile Ser Ser Ser Asp Glu Leu Gln Leu Ser Met
100 105 110
gga aat gcc atg ttt gtc aaa gag caa ctc agt ctg ctg gac agg ttc 384
Gly Asn Ala Met Phe Val Lys Glu Gln Leu Ser Leu Leu Asp Arg Phe
115 120 125
acg gag gat gcc aag agg ctg tat ggc tcc gag gcc ttt gcc act gac 432
Thr Glu Asp Ala Lys Arg Leu Tyr Gly Ser Glu Ala Phe Ala Thr Asp
130 135 140
ttt cag gac tca gct gca gct aag aag ctc atc aac gac tac gtg aag 480
Phe Gln Asp Ser Ala Ala Ala Lys Lys Leu Ile Asn Asp Tyr Val Lys
145 150 155 160
aat gga act agg ggg aaa atc aca gat ctg atc aag gac ccc gac tcg 528
Asn Gly Thr Arg Gly Lys Ile Thr Asp Leu Ile Lys Asp Pro Asp Ser
165 170 175
cag aca atg atg gtc ctg gtg aat tac atc ttc ttt aaa gcc aaa tgg 576
Gln Thr Met Met Val Leu Val Asn Tyr Ile Phe Phe Lys Ala Lys Trp
180 185 190
gag atg ccc ttt gac ccc caa gat act cat cag tca agg ttc tac ttg 624
Glu Met Pro Phe Asp Pro Gln Asp Thr His Gln Ser Arg Phe Tyr Leu
195 200 205
agc aag aaa aag tgg gta atg gtg ccc atg atg agt ttg cat cac ctg 672
Ser Lys Lys Lys Trp Val Met Val Pro Met Met Ser Leu His His Leu
210 215 220
act ata cct tac ttc cgg gac gag gag ctg tcc tgc acc gtg gtg gag 720
Thr Ile Pro Tyr Phe Arg Asp Glu Glu Leu Ser Cys Thr Val Val Glu
225 230 235 240
ctg aag tac aca ggc aat gcc agc gca ctc ttc atc ctc cct gat caa 768
Leu Lys Tyr Thr Gly Asn Ala Ser Ala Leu Phe Ile Leu Pro Asp Gln
245 250 255
gac aag atg gag gaa gtg gaa gcc atg ctg ctc cca gag acc ctg aag 816
Asp Lys Met Glu Glu Val Glu Ala Met Leu Leu Pro Glu Thr Leu Lys
260 265 270
cgg tgg aga gac tct ctg gag ttc aga gag ata ggt gag ctc tac ctg 864
Arg Trp Arg Asp Ser Leu Glu Phe Arg Glu Ile Gly Glu Leu Tyr Leu
275 280 285
cca aag ttt tcc atc tcg agg gac tat aac ctg aac gac ata ctt ctc 912
Pro Lys Phe Ser Ile Ser Arg Asp Tyr Asn Leu Asn Asp Ile Leu Leu
290 295 300
cag ctg ggc att gag gaa gcc ttc acc agc aag gct gac ctg tca ggg 960
Gln Leu Gly Ile Glu Glu Ala Phe Thr Ser Lys Ala Asp Leu Ser Gly
305 310 315 320
atc aca ggg gcc agg aac cta gca gtc tcc cag gtg gtc cat aag gtc 1008
Ile Thr Gly Ala Arg Asn Leu Ala Val Ser Gln Val Val His Lys Val
325 330 335
gtg tct gat gta ttt gag gag ggc aca gaa gca tct gct gcc aca gca 1056
Val Ser Asp Val Phe Glu Glu Gly Thr Glu Ala Ser Ala Ala Thr Ala
340 345 350
gtc aaa atc acc ctc ctt tct gca tta gtg gag aca agg acc att gtg 1104
Val Lys Ile Thr Leu Leu Ser Ala Leu Val Glu Thr Arg Thr Ile Val
355 360 365
cgt ttc aac agg ccc ttc ctg atg atc att gtc cct aca gac acc cag 1152
Arg Phe Asn Arg Pro Phe Leu Met Ile Ile Val Pro Thr Asp Thr Gln
370 375 380
aac atc ttc ttc atg agc aaa gtc acc aat ccc aag caa gcc 1194
Asn Ile Phe Phe Met Ser Lys Val Thr Asn Pro Lys Gln Ala
385 390 395
<210> 2
<211> 398
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 2
Asn Ser Pro Leu Asp Glu Glu Asn Leu Thr Gln Glu Asn Gln Asp Arg
1 5 10 15
Gly Thr His Val Asp Leu Gly Leu Ala Ser Ala Asn Val Asp Phe Ala
20 25 30
Phe Ser Leu Tyr Lys Gln Leu Val Leu Lys Ala Leu Asp Lys Asn Val
35 40 45
Ile Phe Ser Pro Leu Ser Ile Ser Thr Ala Leu Ala Phe Leu Ser Leu
50 55 60
Gly Ala His Asn Thr Thr Leu Thr Glu Ile Leu Lys Ala Ser Ser Ser
65 70 75 80
Pro His Gly Asp Leu Leu Arg Gln Lys Phe Thr Gln Ser Phe Gln His
85 90 95
Leu Arg Ala Pro Ser Ile Ser Ser Ser Asp Glu Leu Gln Leu Ser Met
100 105 110
Gly Asn Ala Met Phe Val Lys Glu Gln Leu Ser Leu Leu Asp Arg Phe
115 120 125
Thr Glu Asp Ala Lys Arg Leu Tyr Gly Ser Glu Ala Phe Ala Thr Asp
130 135 140
Phe Gln Asp Ser Ala Ala Ala Lys Lys Leu Ile Asn Asp Tyr Val Lys
145 150 155 160
Asn Gly Thr Arg Gly Lys Ile Thr Asp Leu Ile Lys Asp Pro Asp Ser
165 170 175
Gln Thr Met Met Val Leu Val Asn Tyr Ile Phe Phe Lys Ala Lys Trp
180 185 190
Glu Met Pro Phe Asp Pro Gln Asp Thr His Gln Ser Arg Phe Tyr Leu
195 200 205
Ser Lys Lys Lys Trp Val Met Val Pro Met Met Ser Leu His His Leu
210 215 220
Thr Ile Pro Tyr Phe Arg Asp Glu Glu Leu Ser Cys Thr Val Val Glu
225 230 235 240
Leu Lys Tyr Thr Gly Asn Ala Ser Ala Leu Phe Ile Leu Pro Asp Gln
245 250 255
Asp Lys Met Glu Glu Val Glu Ala Met Leu Leu Pro Glu Thr Leu Lys
260 265 270
Arg Trp Arg Asp Ser Leu Glu Phe Arg Glu Ile Gly Glu Leu Tyr Leu
275 280 285
Pro Lys Phe Ser Ile Ser Arg Asp Tyr Asn Leu Asn Asp Ile Leu Leu
290 295 300
Gln Leu Gly Ile Glu Glu Ala Phe Thr Ser Lys Ala Asp Leu Ser Gly
305 310 315 320
Ile Thr Gly Ala Arg Asn Leu Ala Val Ser Gln Val Val His Lys Val
325 330 335
Val Ser Asp Val Phe Glu Glu Gly Thr Glu Ala Ser Ala Ala Thr Ala
340 345 350
Val Lys Ile Thr Leu Leu Ser Ala Leu Val Glu Thr Arg Thr Ile Val
355 360 365
Arg Phe Asn Arg Pro Phe Leu Met Ile Ile Val Pro Thr Asp Thr Gln
370 375 380
Asn Ile Phe Phe Met Ser Lys Val Thr Asn Pro Lys Gln Ala
385 390 395
<210> 3
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> oligonucleotide primer
<400> 3
ccaaccgtta acagcccact tgacgaagag aat 33
<210> 4
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide primer
<400> 4
ccggaattcg gggccagctg tgcccagagg ccc 33
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide primer
<400> 5
taagaatgtc ctcttctccc c 21
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide primer
<400> 6
taagaatgtc gtcttctccc c 21
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide primer
<400> 7
agacacccag gacatcttct tc 22
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide primer
<400> 8
agctgagtat tggaaatgcc a 21
<210> 9
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide primer
<400> 9
atgggaaatg tcatgtttgt c 21
<210> 10
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide primer
<400> 10
gtgaagaatg taactagggg g 21
<210> 11
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide primer
<400> 11
acaggcaatg tcagcgcact c 21
<210> 12
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide primer
<400> 12
ggctccgagg tctttgccac t 21
<210> 13
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide primer
<400> 13
gaattacatc ctctttaaag ccaaa 25
<210> 14
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide primer
<400> 14
gaattacatc atctttaaag ccaaa 25
<210> 15
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide primer
<400> 15
gaattacatc gtctttaaag ccaaa 25
<210> 16
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide primer
<400> 16
gaattacatc tgctttaaag ccaaa 25
Claims (7)
- 서열번호: 2의 아미노산 서열을 갖는 인간 안티카이모트립신의 아미노산이 다음과 같이 치환되어 내열성이 증가된 안티카이모트립신 변이체:49번 이소로이신이 로이신 또는 발린으로 치환;68번 아스파라진이 글리신으로 치환;111번 세린이 이소로이신으로 치환;112번 메티오닌이 이소로이신으로 치환;140번 알라닌이 발린으로 치환;162번 글리신이 발린으로 치환;187번 페닐알라닌이 로이신, 발린, 이소로이신 또는 시스테인으로 치환; 또는385번 아스파라진이 알라닌으로 치환.
- 삭제
- 제 1 항의 안티카이모트립신 변이체를 코드하는 DNA.
- 제 3 항의 DNA를 포함하는 안티카이모트립신 변이체 발현 벡터.
- 제 4 항의 발현 벡터로 형질전환된 미생물.
- 제5항에 있어서,플라스미드 pFEACT-A140V로 형질전환된 대장균 BL21(DE3) (기탁번호 제 KCTC 10153BP 호).
- 제5항의 미생물을 적절한 배지에서 배양한 후 제1항의 내열성 안티카이모트립신 변이체를 분리하는 것을 포함하는, 제1항의 내열성 안티카이모트립신 변이체의 제조 방법.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR10-2002-0014688A KR100481621B1 (ko) | 2002-03-19 | 2002-03-19 | 내열성 안티카이모트립신 변이체 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR10-2002-0014688A KR100481621B1 (ko) | 2002-03-19 | 2002-03-19 | 내열성 안티카이모트립신 변이체 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20030075451A KR20030075451A (ko) | 2003-09-26 |
| KR100481621B1 true KR100481621B1 (ko) | 2005-04-08 |
Family
ID=32225274
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR10-2002-0014688A KR100481621B1 (ko) | 2002-03-19 | 2002-03-19 | 내열성 안티카이모트립신 변이체 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR100481621B1 (ko) |
-
2002
- 2002-03-19 KR KR10-2002-0014688A patent/KR100481621B1/ko not_active IP Right Cessation
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| NCBI GeneBank Accession Version ITHUC GI:2144574, alpha-1-antichymotrypsin precursor - human. * |
| 과학기술부, 발행기관-한국생명공학연구원, 1993, 동일발명자, 초록 * |
| 과학기술처, 연구기관-한국과학기술연구원, 1991.08, 동일출원인, 요약문(pp. 3-5) * |
| 과학기술처, 연구기관-한국과학기술연구원, 1994.09, 동일출원인, 요약문(pp.3-5), 결론(p. 35) * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR20030075451A (ko) | 2003-09-26 |
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