JPH08509865A - 耐熱性α１−抗トリプシンムテイン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 野生型ヒトα１−抗トリプシン（ＡＴ）のアミノ酸配列中のいくつかのアミノ酸が他のアミノ酸で置換された本発明の突然変異された組換えＡＴは、野生型ＡＴに比べてその活性は維持しながらも向上された耐熱性を有する。前記組換えＡＴをコードする遺伝子を含有するベクター、該ベクターで形質転換された微生物、及び該微生物を用いて更に高い耐熱性を有する組換えＡＴを産生する方法も開示されている。

Description

【発明の詳細な説明】 耐熱性α１−抗トリプシンムテイン発明の属する技術分野 本発明は耐熱性が向上されたα１−抗トリプシン（以下“ＡＴ”と略する）及 びその産生方法に関するものである。 より詳細には、本発明は野生型ＡＴの少なくとも１つのアミノ酸が他のアミノ 酸残基で置換されることによって活性は維持しながら耐熱性が向上されたＡＴム テイン、前記ＡＴをコードするポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含有 するベクター、前記ベクターで形質転換された微生物、及び前記微生物を用いて 耐熱性が向上されたＡＴを産生する方法に関するものである。従来技術の説明 蛋白質の安定性は蛋白質の生体内寿命及び保存期間を決定するので、その機能 の維持に関して不可欠のものである。 従って、蛋白質を含む治療剤または診断試薬を工業製品として開発するために はその安定性を高めることが望ましい。 ヒトから分離され、精製された既存の蛋白質治療剤は、原料の制限の問題及び エイズ（ＡＩＤＳ）や肝炎ウイルスのような多様な感染性のウイルス等による汚 染の問題があるので、最近には組換えＤＮＡ技法を通じて治療剤を産生しようと する試みがなされることが多くなってきている。しかしながら、このような技法 で産生された組換え蛋白は、ヒトから分離されたものに比べ相対的に安定性が劣 るので、ヒトに投与した際半減期が著しく短くなる傾向がある。かかる安定性の 問題を克服するために、２つのアプローチで研究がなされてきた。１つは、安定 性減少の原因が微生物内で蛋白質の糖化が欠如しているか、または不充分な点に あるという事実を基にして、自然状態が完全糖化された形である蛋白質 を産生するもの、他の１つは、蛋白質のアミノ酸配列を変更して活性は維持しな がら安定性が高められた組換え蛋白を産生するものである。 これと関連して、蛋白質の耐熱性は変性に対するその安定性と密接な相関関係 があることが明らかになった（Ｐａｃｅ，Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ ｎｏｌｏｇｙ ，８，９３−９８，１９９０）参照）。 一方、ＡＴは肝の細胞で合成された後血液内に分泌され、トリプシン（ｔｒｙ ｐｓｉｎ）、キモトリプシン（ｃｈｙｍｏｔｒｙｐｓｉｎ）、エラスターゼ（ｅ ｌａｓｔａｓｅ）、コラゲナーゼ（ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ）、トロンビン（ｔ ｈｒｏｍｂｉｎ）及びプラスミン（ｐｌａｓｍｉｎ）のようなセリン系プロテア ーゼに対する阻害剤等と共にセルピン族（ｓｅｒｐｉｎ ｆａｍｉｌｙ）に属す る。ＡＴは分子量が５２ＫＤ（ｋｉｌｏｄａｌｔｏｎ）の糖蛋白で、生理的には 好中球内でエラスターゼに対する阻害剤として作用する。特に、肺胞に存在する 弾性繊維が好中球のエラスターゼにより分解されることを防止する。 ヒトのＡＴを産生する能力に関しては、多様な遺伝的欠陥が周知となっている （Ｃａｒｒｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．，６，３５−４ ２（１９８２）参照）。遺伝的欠陥のため血漿内のＡＴ濃度が減少して、プロテ アーゼとその阻害剤との間の均衡が失われ、これによって肺が伸縮性を失うこと になり肺気腫が発生し得る（Ｇａｄｅｋ ａｎｄ Ｃｒｙｓｔａｌ，ｉｎ Ｍｅ ｔａｂｏｌｉｃ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｉｎｈｅｒｉｔｅｄ Ｄｉｓｅａｓｅ ，Ｓ ｔａｎｂｕｒｙ ｅｔ ａｌ．，Ｅｄｓ．，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｐ．１４５０−１４６７）。これ以外にも、過多な喫煙やはげしい 環境汚染によるＡＴの不活性化から肺気腫が誘発されることもあり得る。 従って、このような疾患の治療のために、ＡＴの需要は大きく増えつつあり、 ヒトの血液から採取したＡＴではその需要をまかないきれない。 また、ＡＴは急性ショック症候群（ａｃｕｔｅ ｓｈｏｃｋ ｓｙｎｄｒｏｍｅ ）（Ｒｏｂｉｎ Ｗ．Ｃａｒｒｅｌｌ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｒｅｖｉｅｗｓ ，４，２９１−２９ ７（１９８６）参照）の治療にも使用できる。ショック症候群は、好中球のエラ スターゼがにわかに広範囲に放出され、血漿セルピンとプロテアーゼとの間の均 衡が壊れることによって生じることが知られている。 ＡＴをコードする遺伝子のヌクレオチド配列は既に知られており（Ｌｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２３，４８２８（１９８４）参照） 、ＡＴ遺伝子はクローニングされ、大腸菌（Ｂｏｌｌｅｎ ｅｔ ａｌ．，ＦＥ ＲＳ Ｌｅｔｔ． ，１６６，６７（１９８４）：Ｃｏｕｒｔｎｅｙ ｅｔ ａｌ ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１，６６９（１９８４ ）；Ｔｅｓｓｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，２０８，１８３（ １９８６）；Ｊｏｈｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．，４ ，２９１（１９８７）；Ｓｕｔｉｐｈｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ ．Ｍｅｄ． ，４，３０７（１９８７）；Ｌｅｅ ａｎｄ Ｙｕ，Ｋｏｒ．Ｊ．Ｂ ｉｏｃｈｅｍ． ，２２，１４８（１９８９）；及びＬｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏ ｌｅｃｕｌｅｓ ａｎｄ Ｃｅｌｌｓ ，３，７１−７４（１９９３）参照）及び 酵母（Ｔｒａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６０，４３ ８４（１９８５）；Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ ｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３１２， ７７（１９８４）；Ｃａｂｅｚｏｎ ｅｔ ａｏ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ ａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ，８１，６５９４（１９８４）；Ｍｏｉｒ ｅｔ ａｌ． ，Ｇｅｎｅ，５６，２０９（１９８７）；Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ｋｏｒ．Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ，２３，２６３（１９９０）；及びＫｉｍ ｅｔ ａ ｌ．，Ｋｏｒ．Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，３０，１０８（１９９２）参照）で 発現された。 また、ＡＴは、活性部位残基の３５８番目のメチオニン残基部位を特定部位突 然変異誘発法（ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）により 他のアミノ酸残基で置換することによって、エラスターゼ以外の他のセリン系プ ロテアーゼに対する阻害剤へ変異させるか、高められた耐酸化性を有するように 変異させることができることが報告された（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ． ，Ｎａｔｕｒｅ，３１２，７７−８０（１９８４）；Ｃｏｕｒｔｎｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３１３，１４９−１５１（１９８５）；Ｂａｒｒ ｅｔ ａｌ．，米国特許第４，７３２，９７３号；Ｉｎｓｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，米 国特許第４，７１１，８４８号参照）。一方、酵母で産生された糖化されていな いＡＴは試験管内での耐熱性が劣り、このような耐熱性の低下は生体内での半減 期の短縮と密接な相関関係があるということが報告され（Ｔｒａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６０，４３８４（１９８５）参照）、酵 母で生成され糖化された野生型ＡＴは耐熱性が低いことが明らかになった。ＡＴ の構造と機能との相関関係に対してはフバー（Ｈｕｂｅｒ）とカレル（Ｃａｒｒ ｅｌｌ）によって確認されている（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２８，８９５１ −８９６３（１９８９）参照）。発明の要約 従って、本発明の目的は優れた耐熱性及び熱力学的安定性を有する突然変異さ れた組換えＡＴ、即ちＡＴ突然変異蛋白質（以下ＡＴムテイン）を提供すること である。 本発明の他の目的は前記ＡＴムテインをコードするポリヌクレオチドを提供す ることである。 本発明の更に別の目的は前記遺伝子を含むベクター及び該ベクターで形質転換 された宿主細胞を提供することである。 本発明の更に別の目的は該形質転換体を用いて耐熱性が向上されたＡＴムテイ ンを産生する方法を提供することである。 本発明の１実施例によれば、野生型ＡＴの５１番目、５６番目、５９番目、６ ８番乃至７０番目、３７４番目、３８１番乃至３８７番目のアミノ酸中少なくと も１つが他のアミノ酸で置換されたＡＴムテインが提供される。図面の簡単な説明 本発明の前記目的及び特徴は、添付された図面を参考として下記の望ましい実 施態様の記載から明らかになるであろう。 第１図は代表的な野生型ＡＴのアミノ酸配列を示す。 第２図は大腸菌からＡＴムテインを分離及び精製する段階から得た試料を１２ ％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）−ポリアクリルアミドゲル電気泳動した結 果を示した写真である。 第３図は野生型ＡＴ、大腸菌内で発現された突然変異ＡＴ及びヒト血漿から分 離されたＡＴに対して５７℃で熱不活性化実験を行った結果を示したグラフであ る。 第４図は野生型ＡＴと、５１番目のアミノ酸残基がシステインである耐熱性Ａ Ｔムテインとの集合現象を比較するために、５５℃でＡＴの保存中に生じる、高 分子量蛋白質のゲル透過クロマトグラフィーによる定量分析結果を示したグラフ であり； 第５図は酵母培養液からＡＴムテインを分離及び精製する段階から得た試料を １２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥした結果を示した写真である。 第６図は酵母で産生されたＡＴムテインが糖化されているかを確認するために 、１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行って得た結果の写真であり、エ ンドグリコシダーゼで処理した後の分子量の変化を示している。 第７図は酵母で産生されたＡＴ、ヒト血漿ＡＴ及び大腸菌で産生されたＡＴム テインの５８℃での熱不活性化率を比較して示したグラフである。 第８図は大腸菌で発現された単一及び多重突然変異ＡＴに対する熱不活性化実 験の結果を示したグラフである。発明の詳細な説明 本発明にしたがって製造された耐熱性ＡＴムテインは、野生型ＡＴの５１番目 、５６番目、５９番目、６８番乃至７０番目、３７４番目、３８１番乃至３８７ 番目のアミノ酸中少なくとも１つが他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列を有 する。望ましい耐熱性ＡＴムテインは野生型ＡＴアミノ酸配列で１つ以上の下記 アミノ酸置換を起こしたものである。 ５１番目のフェニルアラニンのシステイン、バリン、ロイシン、イソロイシン またはアラニンによる置換； ５６番目のセリンのアラニンによる置換； ５９番目のトレオニンのアラニンまたはセリンによる置換； ６８番目のトレオニンのアラニンによる置換； ６９番目のリジンのグルタミンによる置換； ７０番目のアラニンのグリシンによる置換； ３７４番目のメチオニンのイソロイシン、ロイシンまたはバリンによる置換； ３８１番目のセリンのアラニンによる置換；及び ３８７番目のリジンのアルギニンによる置換。 前記アミノ酸置換中１つのみが起った単一突然変異ＡＴ中で、最も望ましいも のは５１番目残基のシステインであるもの及び３７４番目残基がイソロイシンで あるものである。前記単一突然変異ＡＴは、大腸菌内 で糖化されない形態として産生される場合、野生型ＡＴに比べて長い（１０倍以 上）半減期を有し、酵母で糖化された形態として産生される場合、更に高い耐熱 性を有する。 ２つ以上の前記アミノ酸置換がなされた典型的な多重突然変異ＡＴは、５１番 目及び３７４番目の残基がそれぞれロイシン及びイソロイシンで置換されたもの ；５９番目、６８番目及び７０番目の残基がそれぞれアラニン、アラニン及びグ リシンで置換されたもの；３８１番目及び３８７番目の残基がそれぞれアラニン 及びアルギニンで置換されたものである。多重突然変異ＡＴは単一突然変異ＡＴ に比べ著しく増加された耐熱性を示す。また、突然変異ＡＴが糖化されていると 耐熱性は更に増加し得る。 耐熱性ＡＴのアミノ酸配列は前記のように置換されたアミノ酸残基を除いては 野生型ＡＴのアミノ酸配列と同様である。本発明に於いて代表的な野生型ＡＴは 第１図で示すようなアミノ酸配列を有する。第１図の配列で１０１番目、２０４ 番目、２１３番目、２２３番目、３４１番目、３６３番目及び３７６番目の残基 等中の少なくとも１つがアルギニン、リジン、アラニン、システイン、アスパラ ギン、リジン及びグルタミン酸でそれぞれ置換された亜型も野生型の範囲に含ま れ得る。本発明で使用できる野生型ＡＴには、前記野生型ＡＴ等中何れかの１つ が含まれ、また、野生型ＡＴの最初の連続した１１個のアミノ酸残基等中少なく とも１つがその活性に大きな変化を起こさず削除されるか他のアミノ酸で置換さ れたものも含まれる。 また、ＡＴを大腸菌で産生する場合は、ＡＴのアミノ酸配列でＮ−末端のアミ ノ酸にＭｅｔが付加されるか、または置換されるが、これらも本出願で定義した “野生型ＡＴ”に含まれる。従って、前記野生型ＡＴのアミノ酸配列を基にして 製造されたＡＴムテインは本発明の範囲内に 含まれる。しかしながら、アミノ酸の削除または付加と関係なく、ＡＴのアミノ 酸配列でのアミノ酸の番号は第１図で示したアミノ酸配列番号を基にしたもので ある。 本発明の耐熱性ＡＴは、特定部位突然変異誘発法によって産生されたＡＴムテ インをコードするポリヌクレオチドを有するベクターで宿主細胞を形質転換させ 、転換体から前記ポリヌクレオチドを発現させる方法、または化学的アミノ酸合 成による方法によって産生することができる。 本発明の耐熱性ＡＴムテインをコードするポリヌクレオチドは既存の化学的合 成法によって、または例えば、特定部位突然変異誘発法によって野生型ＡＴのｃ ＤＮＡを変異させることによって産生することができる。 一方、コドンの縮重（ｄｅｇｅｎｅｒａｃｙ）のために、１つのアミノ酸をコ ードする数個の相互相違したコドン等が存在することもでき、従って、同一なア ミノ酸配列をコードする遺伝子は相いに異なるヌクレオチド配列を有することが あり得る。 本発明のＡＴムテインをコードするポリヌクレオチドは、当技術分野で周知で ある適当な原核または眞核生物の発現システムを使用して発現させることができ る（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ，２ｎｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒ ｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｕ．Ｓ．Ａ．（１ ９８９）参照）。 発現は、糖化されていないＡＴの場合は、例えば大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）、 大腸菌ＪＭ１０９（ＤＥ３）または大腸菌ＮＭ５２２のような大腸菌で行われる ことが望ましいし、糖化されたＡＴの場合は、例えば、サッカロミケス・セレビ シェ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、サッカロミケス ・ジアスタチカス（Ｓａｃｃｈａｒ ｏｍｙｃｅｓ ｄｉａｓｔａｔｉｃｕｓ ）のような酵母で行うことが望ましい。 大腸菌及び酵母での発現に使用できる適当なベクターは前記引用したサンブル ック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）の文献及びフィアス（Ｆｉｅｒｓ）の論文“Ｐｒｏｃ ｅｄ，８ｔｈ Ｉｎｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ”，Ｓｏｃ．Ｆｒａｃ．ｄｅ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ，Ｐａｒｉｓ，（Ｄｕｒａｎｄ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．），ｐｐ．６８０−６９７（１９８８）に記述されて いる。 前記ベクターによる宿主細胞の形質転換は、何らかの通常の方法を使用して行 うことができる（前記引用したサンブルックの文献及びＩｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． ，１５３，１６３（１９８３）参照）。大腸菌を宿主 細胞として使用する場合、ベクターＤＮＡを吸収することができる感応細胞を準 備して、周知のＣａＣｌ２法によって処理できる。酵母の形質転換は、先ず宿主 細胞をスペロプラスト（ｓｐａｅｒｏｐｌａｓｔ）形態に作製した後、前記文献 等に記述されているような周知の方法を用いて行うことができる。 一般的に、目的の発現ベクターを含む宿主微生物を目的の蛋白質の産生を最大 化する最適条件の下で培養する。例えば、アンピシリン耐性遺伝子を選択マーカ ーとして含有するベクターで形質転換された大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を３７℃ でアンピシリン含有ＬＢ培地（バクト−トリプトン１０ｇ、バクト−酵母抽出物 ５ｇ、ＮａＣｌ １０ｇを水１リットルに溶解して製造）の中で培養する。酵母 の場合、文献（Ｓｈｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｙｅａ ｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．， Ｕ．Ｓ．Ａ．）に記述されている最適成長条件の下で培養することができる。 形質転換体を培養した後、目的のＡＴの回収及び精製は、当該分野で 周知の方法またはそれらを組み合わせて使用することによって行うことができる 。 例えば、形質転換された大腸菌細胞で発現されたＡＴムテインは、細胞培養物 から抽出するか、または蛋白質化学の分野で周知の任意の、適切な細胞を破壊す る方法によって回収できる。例えば、ＡＴムテインを精製するのに、大韓民国特 許公開公報第９３−６８６号の方法を用いることができる。即ち、大腸菌形質転 換体の培養物を遠心分離して細胞を得、その細胞をリゾチーム含有緩衝液に懸濁 させた後、超音波で破砕する。次いで、細胞破砕液を遠心分離して不溶性封入体 形態のＡＴを含有した沈降物を得る。この沈降物をトリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ −１００を含有する緩衝液に懸濁させた後懸濁液から回収する。前記過程を繰返 す。次いで、生成沈降物を尿素含有懸濁液に溶解させ、エチレンジアミン四酢酸 塩とメルカプトエタノールとを含有するリン酸カリウム溶液で希釈する。生成溶 液を、エチレンジアミン四酢酸塩とメルカプトエタノールとが添加された緩衝液 について透析し、同一緩衝液で平衡化されたＤＥＡＥ−セファセルカラム（Ｐｈ ａｒｍａｃｉａ ＬＫＢ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を通じて溶離させる。 溶離液をモノ−Ｑカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＬＫＢ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ｏｇｙ）上でＦＰＬＣすることによって精製する。 目的のＡＴムテインを培養培地へ分泌するための宿主細胞として酵母を使用す る場合、ＡＴムテインは、例えば、細胞培養液を遠心分離して細胞を除去し、上 澄液を濃縮し、濃縮液を硫酸アンモニウムで文画化し、生成溶液を遠心分離して 沈降物を得、前記沈降物を緩衝液について透析し、生成溶液をＤＥＡＥ−セファ セルカラムと、それに続きモノ−Ｑカラム上で溶離させる方法によって分離及び 精製できる。ＡＴムテインが酵母細胞内に蓄積される場合には、細胞を前記通常 の精製過程を行う前 に粉砕しなければならない。 本発明のＡＴムテインは好中球エラスターゼに対する阻害剤として作用し、特 に肺胞内の弾性繊維がエラスターゼによって分解されることを防止できる。従っ て、ＡＴムテインは遺伝子欠陥や環境汚染等による肺気腫の予防剤及び治療剤と して使用できる。特に、本発明のＡＴムテインは耐熱性が著しく高められたもの で非常に有用である。 下記実施例は本発明を具体的に例示するためのもので、発明の範囲を制限する ものではない。 実施例で、全てのＤＮＡ操作は、特に言及しない限り、前記引用したサンブル ック等の文献を参照して行った。本原で使用された制限酵素は米国のニューイン グランドバイオレッブス社（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）やドイ ツのベリンガーマンハイム社（Ｂｏｅｒｉｎｇｅｒ／Ｍａｎｎｈｅｉｍ）から購 入した。 下記参照例及び実施例でＡＴの活性及び熱安定性の測定には次の方法を用いた 。 ＡＴの活性は、文献（Ｔｒａｖｉｓ ＆ Ｊｏｈｎｓｏｎ ｉｎ Ｍｅｔｈｏ ｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ． ，８０，７５４（１９８１）参照）の方法によっ てペプチドを分解するエラスターゼの活性がＡＴによって阻害されることを評価 して測定した。具体的には、エラスターゼとＡＴ抽出物とを混合して反応させた 後、ここに基質（ジメチルスルホキシドにスクシニル−アラニル−アラニル−ア ラニル−パラ−ニトロアニリド（ＳＩＧＭＡ Ｓ４７６０）を溶解させ製造）を 添加し、残余エラスターゼの活性を決定するために４１０ｎｍで吸光度の変化を 測定することによってＡＴのエラスターゼ阻害活性を評価した。ＡＴの熱安定性 は、細胞抽出物を使用する際は５５℃で、精製されたＡＴを使用する時は５７℃ 乃至５８℃で処理されたＡＴを使用して、エラスターゼ阻害活 性を測定することによって評価した。対照用としては、大腸菌または酵母細胞で 産生された野生型ＡＴまたはヒト血漿から分離−精製された天然ＡＴを使用した 。 参照例１：ＡＴ遺伝子のクローニング ヒトの肝ｃＤＮＡライブラリ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）のクローン から、ローン（Ｌｏｎｇ）等が報告したＡＴ遺伝子中の５０乃至７２番目のヌク レオチドをプローブとして使用して３２個の陽性クローンを分離した（Ｂｉｏｃ ｈｅｍｉｓｔｒｙ ２３，４８２８（１９８４）参照）。プローブとして前記遺 伝子の１１５０乃至１１７２番目のヌクレオチドを使用して、それから４個のク ローンを得た。これらのクローンからプラスミドｐＵＣ−ＡＴ（Ｒ）を得、プラ スミドから制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩまたはＢａｍＨＩを用いた切断に よって１．３ｋｂ断片としＡＴ ｃＤＮＡを分離した（Ｌｅｅ ＆ Ｙｕ，Ｋｏ ｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ． ，２２，１４８（１９８９）参照）。 参照例２：野生型大腸菌組換えＡＴの発現 参照例１で得たｐＵＣ−ＡＴ（Ｒ）を制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩで切 断して１．３ｋｂ断片を分離し、この断片をｐＥＴ−８ｃプラスミド（Ｓｔｕｄ ｉｅｒ ａｎｄ Ｍｏｆｆａｔｔ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１８９，１１２（ １９８６）参照）のＢａｍＨＩ認識部位に挿入してプラスミドｐＥＡＴ８を作製 した。次いで、前記プラスミドを使用して大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換 させ、産生されたＡＴを野生型大腸菌組換えＡＴと命名した。産生された野生型 大腸菌組換えＡＴは、第一残基がグルタミン酸のかわりにメチオニンであり、他 の残基等は野生型ＡＴ（第１図参照）と同じアミノ酸配列を有する。前記野生型 組換えＡＴのアミノ酸配列は、文献（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ ４ ７７Ａ）の方法を用いる蛋白質配列分析実験によって同定さ れた。ｐＥＡＴ ８で形質転換された大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）は、微生物寄託 の国際的承認に対したブダペスト条約によって１９９１年４月１７日付で寄託番 号ＫＣＴＣ ０００９ＢＰで寄託された（大韓民国特許公開公報第９３−６８６ 号参照）。 製造例１：無作為突然変異遺伝子を含む形質転換体の産生 ＢａｍＨＩでプラスミドｐＥＡＴ８を切断して得た１．３ｋｂ ＤＮＡ断片を ベクターＭ１３ｍｐ１８の制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩ認識部位に挿入し た。Ｍ１３クローンから得た単一ＤＮＡ、プライマー＃１２０１及び＃１２１２ （Ｓｉｇｍａ社から購入）を使用して、エッケルトら（Ｅｃｋｅｒｔ ｅｔ ａ ｌ．）の文献（Ｅｃｋｅｒｔ ＆ Ｋｕｎｋｅｌ，ＰＣＲ Ｃｈａｐ．１４，Ｔ ｈｅ ｆｉｄｅｌｉｔｙ ｏｆ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎｓ ，ｅｄ．ｂｙ ＭｃＰｈａｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｏｘｆ ｏｒｄ Ｕｎｉｖ．Ｐｒｅｓｓ（１９９１）参照）の変形されたＰＣＲ法によっ て無作為突然変異を誘導したが、但し、反応溶液中のｄＡＴＰの濃度を０．１ｍ Ｍに低め、ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰをそれぞれ１ｍＭにし、１０ｍＭ塩 化マグシウムを添加した。前記ＰＣＲを２５回繰返した。増幅されたＤＮＡを制 限エンドヌクレアーゼＢｃｌＩ及びＢｓｔＸ１で切断して７７０ｂｐの断片（１ ７番目のコドンから２７３番目のコドンまで）を得、これで参照例２のｐＥＡＴ ８中のＢｃｌＩ／ＢｓｔＸ１断片を置換した。次いで、作製されたプラスミドで 大腸菌 ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換させ、アンピシリンに対する耐性を有す る形質転換体コロニー５×１０⁴個を収得した。 製造例２：耐熱性ＡＴを産生するコロニーのスクリニング（ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ）大腸菌で産生された耐熱性ＡＴムテインをコプレンら（Ｃｏｐｌｅｎ ｅｔ ａｌ．）の文献（Ｐｒｏｔｅｉｎｓ；Ｓｔｒｕｃｔ ｕｒｅ，ｆｕｎｔｉｏｎ ａｎｄ ｇｅｎｅｔｉｃｓ ，７，１６（１９９０）参 照）の変形された方法によってスクリニングした。製造例１で得たコロニーを、 １ｍＭイソプロピルβ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）を含有する培地（リン酸 二ナトリウム６ｇ、リン酸カリウム３ｇ、塩化アンモニウム１ｇ、グルコース２ ｇ、酵母抽出物０．２ｇ及びカザミノ酸３ｇを水１リットルに溶かして調製した もの）０．１mlに注入した後、一夜培養した。産生培養液に２５マイクロリット ルの溶菌液（２５０ｍＭトリス、ｐＨ８．０、２５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．２５％ トリトンＸ−１００、０．５mg／mlのリゾチーム）を加え、培養液を室温で１時 間振とう培養した。次いで、前記培養液を６０℃で１時間熱処理し、ここに７ｎ Ｍエラスターゼ溶液（ＳＩＧＭＡ Ｅ０２５８）２５マイクロリットルを添加し た。反応混合物を室温で１時間静置させ、ここに、１．２ｍＭスクシニル−アラ ニル−アラニル−アラニル−パラ−ニトロアニリド（ＳＩＧＭＡ Ｓ４７６０） を加え、室温で一夜反応させた。２５マイクロリットルの亜窒酸ナトリウム（２ Ｍ ＨＣｌに０．２％濃度で溶解してある）を加えた後、反応混合物を３分間静 置した。０．２％硫酸アンモニウム２５マイクロリットルを加え、その溶液を３ 分間更に静置した。次いで、５０マイクロリットルのＮ−ナフチルエチレンジア ミン溶液（９５％エタノール中の０．０５％溶液）５０マイクロリットルを加え て赤色反応を起こした。赤色を示さないクローンが耐熱性ＡＴムテインを生成す るものであり、これを陽性と呼ぶものとした。製造例１で製造されたコロニー中 ５，０００個のクローンをスクリニングして４１個の陽性クローンを得た。 実施例１．優れた耐熱性を有するＡＴムテインを発現する大腸菌形質転換体の産 生 ＡＴのエラスターゼ阻害活性はトラビスらの方法（Ｔｒａｖｉｓ ＆ Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，８０，７５４（１ ９８１）参照）の変形された方法を用いて評価した。反応緩衝液としては５０ｍ Ｍ ＮａＣｌを含有する５０ｍＭトリス（ｐＨ８．０）を使用し、エラスターゼ に対する基質としてはジメチルスルホキシドに溶解した１５ｍＭスクシニル−ア ラニル−アラニル−アラニル−パラ−ニトロアニリド（ＳＩＧＭＡ Ｓ４７６０ ）を用いた。酵素液は５０％グリセロールを含有する反応緩衝液にエラスターゼ を０．３μＭの濃度になるように溶解することによって調製した。 製造例２で得た形質転換クローンをＬＢ培地に接種し、３７℃で６００ｎｍで の吸光度が０．８になるまで培養した。ＩＰＴＧを０．４ｍＭ添加し、培養液を ３時間更に培養した。培養液を遠心分離して細胞を収穫し、その細胞を５０ｍＭ ＮａＣｌ含有５０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．０）に懸濁させた後、０℃で超 音波処理して細胞を破砕した。破砕細胞液を１５分間遠心分離（１０，０００ｘ ｇ）して上澄液を取った後ＡＴ抽出液として使用した。 ＡＴのエラスターゼ阻害活性は下記のように決定された：酵素液１０マイクロ リットル、ＡＴ抽出液１０乃至５０マイクロリットル及び反応緩衝液を混合して 最終容量を６０マイクロリットルにした後、１０分間反応させた。反応緩衝液４ ３０マイクロリットル及び基質１０マイクロリットルを添加し、直ちに４１０ｎ ｍでの吸光度変化を３分間測定した。 耐熱性を評価するために、温度を５５℃で維持しながら１分ごとにＡＴのエラ スターゼ阻害活性を測定した。野生型組換えＡＴに比べ熱安定性が高められたＡ Ｔムテインを産生する大腸菌形質転換体を分離した。この形質転換体を大腸菌Ｂ Ｌ２１（ＤＥ３）（ｐＥＡＴ８１）と命名し、１９９３年３月１９日付で遺伝子 銀行（Ｋｏｒｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒ ｅｓ）に寄託番号ＫＣＴＣ ００７７ＢＰで寄託された。前記大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に含有されているプ ラスミドをｐＥＡＴ８１と命名した。 実施例２．ＡＴムテインをコードするＤＮＡのヌクレオチド配列の決定 実施例１で得たプラスミドｐＥＡＴ８１をＢａｍＨＩで切断させ単離した１． ３ｋｂ ＤＮＡ切片をＭ１３ｍｐ１８ベクターのＢａｍＨＩ認識部位に挿入した 。３５Ｓ−ｄＡＴＰ及びセケナーゼキット（Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ Ｋｉｔ，ＵＳ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）を用い、サンガーの方法（Ｓａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７４，５４６ ３（１９７７）参照）を利用して配列分析をした結果、ＤＮＡ配列の５１番目の コドンＴＴＣ（フェニルアラニン）がＴＧＣ（システイン）で置換されたことを 確認した。 実施例３．ＡＴムテインの分離及び精製 ＡＴムテインの分離精製は、大韓民国特許公開公報第９３−６８６号に開示し た方法を利用して行った。即ち、大腸菌形質変換体（ＫＣＴＣ ００７７ＢＰ及 びＫＣＴＣ ０００９ＢＰ）をＭ９ＺＢ培地（１ｇの塩化アンモニウム、３ｇの 一塩基性リン酸カリウム、６ｇの二塩基性リン酸ナトリウム、２ｇのグルコース 、０．２ｇの酵母抽出物及び３ｇのカザミノ酸を水１ｌに溶解して調製したもの ）２５０ｍｌにそれぞれ接種した後、３７℃で、６００ｎｍでの吸光度が０．８ になるまで培養した。ＩＰＴＧを０．４ｍＭ添加し、培養液を３時間更に培養し た。それぞれの培養液を遠心分離して細胞を収穫し、収穫した細胞を、０．１mg ／ｍｌのリゾチームを含有する緩衝液Ａ（５０ｍＭ ＮａＣｌ）１ｍＭエチレン ジアミン四酢酸塩、１ｍＭメルカプトエタノール、５０ｍＭトリス、ｐＨ８．０ ）に懸濁させた後、０℃で超音波処理して細胞を破砕した。それぞれの懸濁液を １０分間遠心分離（１０，０００ｘｇ）してＡＴが含有された沈降物を不溶性封 入体形態として得た。かかる沈降物 をそれぞれ、０．５％トリトンＸ−１００が添加された緩衝溶液Ａ中に懸濁させ 、該懸濁液を遠心分離して沈降物を回収した。前記洗浄段階を更に１回繰返した 。沈降物を、８Ｍ尿素を含有する緩衝溶液５ｍｌに溶解させた後、生成溶液を３ ０分間静置し、１ｍＭエチレンジアミン四酢酸塩及び１ｍＭメルカプトエタノー ルを含有する５０ｍＭリン酸塩緩衝液（ｐＨ８．０）４５ｍｌを加え希釈した。 ３０分後、１ｍＭエチレンジアミン四酢酸塩及び１ｍＭメルカプトエタノールを 含有する１０ｍＭリン酸塩緩衝液（ｐＨ６．５）に対して前記希釈液を透析した 。このようにして得た透析液を、透析緩衝液で平衡化したＤＥＡＥ−セファセル （Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＬＫＢ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）カラムに注入し て、０−３００ｍＭの線形濃度勾配のＮａＣｌを含有する透析緩衝液で溶離した 。溶離液を再びＦＰＬＣと共にモノ−Ｑカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＬＫＢ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）に付加し、０−２００ｍＭの線形濃度勾配のＮａ Ｃｌを含有する透析液で溶離させて、精製されたＡＴを得た（第２図参照）。 第２図で、第１列は破砕された細胞抽出物を示し、第２列は破砕された細胞の 遠心分離によって得たＡＴを含有する沈降物を示し、第３列は尿素に溶解された 沈降物を再生（ｒｅｆｏｌｄｉｎｇ）して得た上澄液を示し、第４列は再生中に 産生された沈降物を示し、第５列はＤＥＡＥ−セファセルカラムとモノＱカラム を通過させた後の精製された組換えＡＴを示し、第６列はアフィ−ゲルブルー（ Ａｆｆｉ−Ｇｅｌ Ｂｌｕｅ）カラムとモノＱカラムを通過させたヒト血漿ＡＴ を示し、第７列は標準分子量の蛋白質を示す。 実施例４．部位特異性突然変異遺伝子とＡＴムテインとの特性 〈４−１〉部位特異突然変異遺伝子の産生 ５１番目のアミノ酸残基がフェニルアラニン及びシステインの以外の １８個アミノ酸中１つで置換された突然変異されたＡＴ等を得るために、オリゴ ヌクレオチドによる特定部位突然変異誘発法（Ｋｕｎｋｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｍ ｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ，１５４，３６７−３８２（１９８ ７）参照）を用いた。前記突然変異誘導に使用されたオリゴヌクレオチドは３０ 個の塩基からなっており、その配列は、次のように、５１番目コドンに隣接した コドンが野生型ＡＴの該当部分と同じアミノ酸をコードし、５１番目のコドンが １８個のアミノ酸中１つをコードできるように設計されている。 ここで、Ｇ／Ｃは塩基ＧとＣが同モル比で混ぜられたものであり、ＮはＡ、Ｔ 、Ｇ及びＣが同モル比で混合されたことを意味する。 大腸菌ＣＪ２３６（ｄｕｔ−，ｕｎｇ−，Ｂｏｅｒｉｎｇｅｒ／Ｍａｎｎｈｅ ｉｍ）を宿主として用いて、ＡＴ遺伝子を含有するＭ１３クローンを、ウリジン （ｕｒｉｄｉｎｅ）が０．２５μｇ／ｍｌ添加された培地で３回増幅させてバク テリオファージ（ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｒｇｅ）粒子を生成し、この粒子から 単一鋳型ＤＮＡを得た。合成されたオリゴヌクレオチドを鋳型ＤＮＡに結合した 。生成されたファージＤＮＡを使用して大腸菌ＪＭ１０９（ＡＴＣＣ ５３３２ ３）を形質転換させた後、突然変異されたクローンを選別した。変異Ｍ１３クロ ーンの配列を実施例２と同様に同定して、５１番目の残基が１８個のアミノ酸中 １つで置換されたことを確認した。前記突然変異されたクローンからＲＦ（Ｒｅ ｐｌｉｃａｔｉｖｅ Ｆｏｒｍ）ＤＮＡを分離した後、制限エンドヌクレアーゼ ＢｃｌＩ及びＢｓｔＸＩで処理して７７０ｂｐ断片を得て、これをプラスミドｐ ＥＡＴ８のＢｃｌＩ／ＢｓｔＸＩ断片の代わりに置換して突然変異ＡＴ発現ベク ターを得た。前記ベクターで大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換させた。 〈４−２〉ＡＴムテインの熱安定性測定 ＡＴムテインを産生する大腸菌の細胞抽出液を、実施例１と同様の耐熱性を評 価した。評価の結果、５１番目のアミノ酸がバリン、ロイシン、イソロイシン、 またはアラニンで置換されたＡＴムテインの熱安定性の増加が認められた。それ から、ＡＴムテインを実施例３と同じ方法で精製した後、アフィ−ゲルブルーカ ラム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）通過後モノＱカラム上でＦＰＬＣを行って精製したヒト 血漿ＡＴ（Ａ９２０４）と比較することによって、各ムテインのエラスターゼに 対する会合定数及び熱に対する不活性化率を決定した。会合定数はベアチらの方 法（Ｂｅａｔｔｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５５，３９３ １−３９３４（１９８０）参照）によって、次のようにして算出した。 同一濃度（８ｎＭ）のエラスターゼとＡＴを含む反応混合液から１０分間１分 おきに試料を採取した。基質として１ｍＭのスクシニル−アラニル−アラニル− アラニル−ｐ−ニトロアニリド（ＳＩＧＭＡ Ｓ４７６０）をそれぞれの試料に 加えた。４１０ｎｍでの吸光度を測定して各試料のエラスターゼ活性を決定した 後、時間に対するエラスターゼ濃度の逆数をグラフ化して得られた直線の傾き値 から会合定数を求めた。下記表Ｉで示したように、大腸菌で産生された野生型Ａ Ｔ及び組換えＡＴムテインはヒト血漿のＡＴの値と類似した会合定数を有し、こ れは組換えＡＴムテインの活性が正常であることを立証する。 熱安定性を比較するために、多様な種類のＡＴムテインを５７℃で培養し、培 養液から１分ごとに試料を採取した。ＡＴムテインの残余活性を実施例１でのよ うな方法で測定し、時間に対する残余活性の対数値をグラフ化して得た直線（第 ３図参照）から半減期と熱不活性化率を算出した。その結果は下記表１に示した 。 前記実施例でみられるように、ＡＴムテインは野生型ＡＴの活性に似た活性を有 しており、熱に対する安定性が大腸菌で産生された野生型組換えＡＴに比べ著し く高められたことが分る。特に、５１番目アミノ酸がシステインで置換されたＡ Ｔムテインは野生型組換えＡＴに比べて熱安定性が１３．５倍も高められ、ヒト 血漿のＡＴに似ていた耐熱性を示した。 〈４−３〉ＡＴムテインの集合抑制能力 ロマスらの方法（Ｌｏｍａｓ，Ｄ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３５ ７ ，６０５−６０７（１９９２）；及びＬｏｍａｓ，Ｄ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ，３２，５００−５０８（１９９３）参照）によれば 、ＡＴ分子は高温（４１℃以上）または弱い変性条件の下で重合され活性がない 形態に集合する傾向があり、これが熱不活性化を起こすことが知られている。Ａ Ｔムテイン及び野生型ＡＴの集合度を相互比較するために、集合反応を誘導した 後、ゲル透過クロマトグラフィー法によって高分子量蛋白質の形成を評価した。 より詳細に は、精製されたＡＴを５５℃で０．１mg／mlの濃度で適当な時間培養した後、ス ペロース（Ｓｕｐｅｒｏｓｅ）１２カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＬＫＢ Ｂｉ ｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）上でのＦＰＬＣによって分子量別に分画した。第４図 で示したように、５１番目のアミノ酸がシステイン残基で置換された本発明のＡ Ｔムテインが、野生型ＡＴに比べてずっと低い比率で重合されることが明らかに なった。従って、アミノ酸配列の５１番目残基の突然変異は重合反応によるＡＴ の不活性化度を減少させると考えられる。第４図で、１２．５分で溶離された分 画は活性形蛋白であり、それより前に溶離された蛋白質は不活性の高分子量蛋白 質である。 実施例５．糖化されたＡＴムテインの産生及び特定化 〈５−１〉酵母でのＡＴ遺伝子発現用ベクターの作製 野生型ＡＴ遺伝子及びＡＴ突然変異遺伝子をそれぞれ含有する大腸菌発現プラ スミドｐＥＡＴ８（ＫＣＴＣ ０００９ＢＰ）及びｐＥＡＴ８１（ＫＣＴＣ ０ ０７７ＢＰ）を制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩ及びＳｍａＩで切断し、それ ぞれの切断されたプラスミドから１．３Ｋｂ ＤＮＡ断片を分離した。それぞれ の断片をプラスミドｐＹＥＳ２４（Ａｈｎ ｅｔ ａｌ．，Ｋｏｒ．Ｊ．Ｍｉｃ ｒｏｂｉｏｌ． ，３０，４０３（１９９２）参照）のＢａｍＨＩ及びＳｍａＩ部 位へ挿入した。作製されたそれぞれのプラスミドをＢａｍＨＩで切断した後マン ビーン（ｍｕｎｇｂｅａｎ）ヌクレアーゼで処理し、連結反応させてプラスミド ｐＧＡＴ１１（野生型）及びｐＧＡＴ１５（突然変異体）を作製した。プラスミ ドで、ＡＴ遺伝子は分泌シグナル配列とサッカロミケス・ジアスタチカス（Ｓａ ｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｄｉａｓｔａｔｉｃｕｓ）のＳＴＡ１遺伝子から誘導 されたプロモータ部分とを含む４５０ｂｐ配列の後に位置する。野生型ＡＴ遺伝 子を含有するｐＧＡＴ１１の作製は 既に報告されていた（Ｓｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｋｏｒ．Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏ ｌ． ，３１，２０３（１９９３）参照）。 〈５−２〉酵母形質転換体の産生及び培養 前記〈５−１〉で得たプラスミドによる酵母細胞の形質転換は、酢酸リチウム 法（Ｉｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１５３、１６３（１９ ８３）参照）によって行った。サッカロミケス・ジアスタチカス（Ｓａｃｃｈａ ｒｏｍｙｃｅｓ ｄｉａｓｔａｔｉｃｕｓ）ＹＩＹ３４５（ＫＣＴＣ １７９１ ）（Ｙａｍａｓｈｉｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１６１， ５７４（１９８５）参照）を宿主として使用した。 ｐＧＡＴ１５で形質転換されたサッカロミケス・ジアスタチカス（Ｓａｃｃｈ ａｒｏｍｙｃｅｓ ｄｉａｓｔａｔｉｃｕｓ）を次のように培養した：それぞれ ２０mg／ｌのヒスチジン及びロイシンを含むＹＮＢ培地（０．６７％アミノ酸欠 如酵母窒素基質及び２％グルコース水溶液）で形質転換体を３０℃で１６乃至１ ８時間培養した後、ＹＥＰＤ培地（１％酵母抽出物、２％ペプトン、２％グルコ ース水溶液）で２４時間培養した。 〈５−３〉酵母培養液からＡＴの分離及び精製 前記〈５−２〉で得た各酵母培養液を遠心分離して細胞を除去し、生成上澄液 を限外濾過方法（Ａｍｉｃｏｎ ＰＭ３０使用）によって濃縮した。この濃縮液 に、６０％飽和されるまで硫酸アンモニウムを加えた後、生成液を１５分間２５ ，０００×ｇの下で遠心分離して沈降物を除去した。飽和度７５％となるように 硫酸アンモニウムを添加した。生成溶液を遠心分離して沈降物を得、この沈降物 を緩衝液Ｂ（１０ｍＭトリス、１ｍＭエチレンジアミン四酢酸塩、１ｍＭメルカ プトエタノール、ｐＨ８．０）に溶かした後、同一緩衝液に対して透析した。透 析産物に、 硫酸プロタミンを０．１％になるように加え、遠心分離して沈降物を除去し、前 記緩衝液Ｂに対して更に透析した。生成溶液を、緩衝液Ｂで平衡化されたＤＥＡ Ｅ−セファセル（Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＬＫＢ）カラムに投入し、０乃至２００ ｍＭ線形濃度勾配のＮａＣｌを含む緩衝液Ｂで溶離させた後、更にモノ−Ｑ−カ ラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＬＫＢ）の上で０乃至１５０ｍＭ ＮａＣｌ線形濃 度勾配で溶離させることによって精製した。 第５図は酵母培養液からのＡＴの分離精製段階で得た試料に対するＳＤＳ−電 気泳動分析結果を示す。第１列は培養液を限外濾過した後得た濃縮液に対するも のであり；第２列は硫酸アンモニウムによる分画化及び硫酸プロタミンによる沈 降の後の上澄液に対するものであり；第３列はＤＥＡＥ−セファセルカラムを通 過した後の活性ＡＴ含有分画に対するものであり；第４列はモノＱカラムを通過 した後の精製されたＡＴムテインに対するものであり；第５列は標準分子量蛋白 質に対するものである。 〈５−４〉酵母で産生されたＡＴムテインの糖化の確認 前記〈５−３〉で得たＡＴムテインが糖化されているかを確認するために、精 製されたＡＴムテインをエンドグリコシターゼＨ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂ ｉｏｌａｂｓ社、以下“エンドＨ“と略する）で処理した後、ＳＤＳ−電気泳動 した。エンドＨはＮ−糖化された高マンノース（ｈｉｇｈ−ｍａｎｎｏｓｅ）型 の炭水和物殘基を除去することによって糖蛋白の分子量を減少させ、この結果は ＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認することができる。エンドＨはヒトで産生される複合型 炭水和物を含む糖蛋白に対しては作用しない。一般的に、酵母で分泌された糖蛋 白は高マンノース型炭水和物を含有する。第６図でみるように、酵母で産生され たＡＴムテインの分子量は、糖化された形態のヒト血漿ＡＴのそれと近 似し、エンドＨ処理後は、大腸菌で産生された分子量４５ＫＤの糖化されていな いＡＴムテインと近似した。従って、前記〈５−２〉での酵母で産生されたＡＴ ムテインは高マンノース型のＮ−糖化されている糖蛋白であることを確認した。 第６図で、第１列は大腸菌で発現された糖化されていないＡＴムテインに対する ものであり；第２列はヒト血漿ＡＴに対するものであり；第３列はエンドＨ処理 したヒト血漿ＡＴに対するものであり；第４列は酵母で産生された野生型組換え ＡＴに対するものであり；第５列は酵母で産生されエンドＨで処理した野生型Ａ Ｔに対するものであり；第６列は酵母で産生されたＡＴムテインに対するもので あり；第７列は酵母で産生されエンドＨ処理した変異形ＡＴに対するものであり ；第８列は標準分子量蛋白質に対するものである。 〈５−５〉糖化されたＡＴムテインの特定化 前記〈５−３〉で精製された野生型組換えＡＴと５１番目のアミノ酸がシステ インで置換され酵母から産生されたＡＴムテインとの５８℃での阻害活性及び耐 熱性を前記実施例４と同様の方法で測定し、これを実施例３及び４からそれぞれ 得た野生型大腸菌組換えＡＴ及びヒト血漿ＡＴとそれぞれ比較した。糖化された 組換えＡＴは野生型ＡＴに比べて、プロテアーゼ阻害活性については同等であり 、耐熱性は著しく増加した（第７図、表２参照）。酵母で産生された野生型組換 えＡＴは大腸菌で発現された野生型組換えＡＴに比べて耐熱性が５．３倍増加し たが、ヒト血漿のＡＴよりは低かった。しかしながら、酵母で産生され糖化され たＡＴムテインは、酵母で産生された野生型ＡＴ及びヒト血漿ＡＴに比べ耐熱性 がそれぞれ３１倍及び６倍も高かった。 実施例６．縮重されたオリゴヌクレオチドを用いた特定部位無作為突然変異誘発 及びＡＴムテインの特性 ＡＴの疏水性コア領域で多様な突然変異を誘発させることによって耐熱性突然 変異体を得るために、混合合成オリゴヌクレオチドを用いて、野生型ＡＴのアミ ノ酸配列で５１番目殘基の隣りの疏水性部位を無作為突然変異させた。突然変異 誘発のため選定された部位は野生型ＡＴ配列の４８番目乃至７０番目のアミノ酸 殘基と３６８番目乃至３９１番目の殘基であった。この部位の無作為突然変異誘 導のために、ハッチスンらの方法（Ｈｕｔｃｈｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏ ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ． ，８３，７１０−７１４（１９ ８６）参照）によって混合合成オリゴヌクレオチドを使用した。即ち、オリゴヌ クレオチドの化学合成に使用された４種（Ａ，Ｔ，Ｃ，Ｇ）のホスホラミジト（ ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ）溶液それぞれを微量の残りの３つのホスホラ ミジト溶液で汚染されるようにした。汚染された溶液をオリゴヌクレオチドの合 成に用い、産生されたオリゴヌクレオチドの配列の上で微量の塩基を挿入させた 。このような混合合成オリゴヌクレ オチドを実施例４に記述されたように特定部位突然変異誘発法（Ｋｕｎｋｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１５４，３６７ −３８２（１９８７）参照）に使用すと、特定部位に対する無作為変異を効率的 に誘発することができる。 前記２つの変異部位をカバーするために、（ａ）４８番目乃至６０番目の残基 、（ｂ）５８番目乃至７０番目の残基、（ｃ）３６８番目乃至３８０番目の残基 及び（ｄ）３７８番目乃至３９１番目の残基の配列に対して相補的な下記の４種 のオリゴヌクレオチドを合成して突然変異誘導に使用した。 変異頻度を最適化させるために、本実施例では、４種のホスホルアミジト溶液 それぞれと、他の３種のホスホルアミジトとをそれぞれ２．５％ずつ汚染される ように混合した。実施例４のような方法で、合成されたオリゴヌクレオチドを使 用して部位特異突然変異を誘導した。収得したＭ１３クローンから分離したＲＦ ＤＮＡからＢａｍＨＩ−切断及び突然変異されたＡＴ遺伝子を発現ベクターｐ ＥＡＴ８のＢａｍＨＩ部位に挿入して、突然変異ＡＴ遺伝子発現用ベクターを得 た。前記製造例２で記述したスクリニング法によって大腸菌で発現されたＡＴム テインの耐熱性を調べて耐熱性の突然変異体を選別した。ＡＴムテインの５５℃ での耐熱性と大腸菌野生型組換えＡＴのそれとを実施例１のように比較した。そ の結果、前記ＡＴムテインは大腸菌野生型組換えＡＴに比べて半減期が２．７７ 倍乃至１５．７３倍長くなったことが分った。その結 果を下記表３に示した。 実施例７．多重突然変異ＡＴの産生 前記実施例等で産生された耐熱性ＡＴのアミノ酸置換（表２及び表３）を選択 的に組み合わせることによって耐熱性が更に向上された突然変異ＡＴを得るため に、前記実施例４に記述されたオリゴヌクレオチドを用いた部位特異突然変異法 を用いて２つまたはそれ以上のアミノ酸が他のアミノ酸で置換された多重突然変 異ＡＴを得た。その結果５１番目の残基がロイシンであり３７４番目の残基がイ ソロイシンである２つのアミノ酸が置換された多重突然変異ＡＴはそれぞれの単 一突然変異ＡＴに比べ卓越した耐熱性（３００倍以上）を有する（第８図参照） 。また、５９番目、６８番目及び７０番目の残基がそれぞれアラニン、アラニン 及びグリシンで、３つのアミノ酸が置換された多重突然変異ＡＴは単一変異ＡＴ に比べ３００倍以上の耐熱性を示す。第８図は大腸菌で発現され た単一突然変異ＡＴ及び多重突然変異ＡＴに対する熱不活性化実験の結果を示し たグラフである。第８図で、●は実施例４のように５５℃で毎分ごとに測定した 野生型組換えＡＴの活性；▽は５１番目のアミノ酸がロイシンで置換された突然 変異ＡＴの活性；▼は３７４番目の殘基がイソロイシンで置換された突然変異Ａ Ｔの活性；□は５１番目及び３７４番目の残基がそれぞれロイシン及びイソロイ シンで置換された突然変異ＡＴの活性である。 こうして、多重突然変異体が単一突然変異体より耐熱性を更に向上することが 明らかになった。また、多重突然変異ＡＴが酵母で糖化された形態として産生さ れる場合は、耐熱性が更に高められよう。 本発明の特定の実施態様について記述したが、当業者によって下記の特許請求 範囲で定義した本発明の範囲内で、本発明の多様な改変が可能であることは勿論 である。

【手続補正書】特許法第１８４条の８ 【提出日】１９９４年１２月６日 【補正内容】 明細書 耐熱性α１−抗トリプシンムテイン発明の属する技術分野 本発明は耐熱性が向上されたα１−抗トリプシン（以下“ＡＴ”と略する）及 びその産生方法に関するものである。 より詳細には、本発明は野生型ＡＴの少なくとも１つのアミノ酸が他のアミノ 酸残基で置換されることによって活性は維持しながら耐熱性が向上されたＡＴム テイン、前記ＡＴをコードするポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含有 するベクター、前記ベクターで形質転換された微生物、及び前記微生物を用いて 耐熱性が向上されたＡＴを産生する方法に関するものである。従来技術の説明 蛋白質の安定性は蛋白質の生体内寿命及び保存期間を決定するので、その機能 の維持に関して不可欠のものである。 従って、蛋白質を含む治療剤または診断試薬を工業製品として開発するために はその安定性を高めることが望ましい。 ヒトから分離され、精製された既存の蛋白質治療剤は、原料の制限の問題及び エイズ（ＡＩＤＳ）や肝炎ウイルスのような多様な感染性のウイルス等による汚 染の問題があるので、最近には組換えＤＮＡ技法を通じて治療剤を産生しようと する試みがなされることが多くなってきている。しかしながら、このような技法 で産生された組換え蛋白は、ヒトから分離されたものに比べ相対的に安定性が劣 るので、ヒトに投与した際半減期が著しく短くなる傾向がある。かかる安定性の 問題を克服するために、２つのアプローチで研究がなされてきた。１つは、安定 性減少の原因が微生物内で蛋白質の糖化が欠如しているか、または不充分な点に あるという事実を基にして、自然状態が完全糖化された形である蛋白質 を産生するもの、他の１つは、蛋白質のアミノ酸配列を変更して活性は維持しな がら安定性が高められた組換え蛋白を産生するものである。 これと関連して、蛋白質の耐熱性は変性に対するその安定性と密接な相関関係 があることが明らかになった（Ｐａｃｅ，Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ ｎｏｌｏｇｙ ，８，９３−９８，１９９０）参照）。 一方、ＡＴは肝の細胞で合成された後血液内に分泌され、トリプシン（ｔｒｙ ｐｓｉｎ）、キモトリプシン（ｃｈｙｍｏｔｒｙｐｓｉｎ）、エラスターゼ（ｅ ｌａｓｔａｓｅ）、コラゲナーゼ（ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ）、トロンビン（ｔ ｈｒｏｍｂｉｎ）及びプラスミン（ｐｌａｓｍｉｎ）のようなセリン系プロテア ーゼに対する阻害剤等と共にセルピン族（ｓｅｒｐｉｎ ｆａｍｉｌｙ）に属す る。ＡＴは分子量が５２ＫＤ（ｋｉｌｏｄａｌｔｏｎ）の糖蛋白で、生理的には 好中球内でエラスターゼに対する阻害剤として作用する。特に、肺胞に存在する 弾性繊維が好中球のエラスターゼにより分解されることを防止する。 ヒトのＡＴを産生する能力に関しては、多様な遺伝的欠陥が周知となっている （Ｃａｒｒｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．，６，３５−４ ２（１９８２）参照）。遺伝的欠陥のため血漿内のＡＴ濃度が減少して、プロテ アーゼとその阻害剤との間の均衡が失われ、これによって肺が伸縮性を失うこと になり肺気腫が発生し得る（Ｇａｄｅｋ ａｎｄ Ｃｒｙｓｔａｌ，ｉｎ Ｍｅ ｔａｂｏｌｉｃ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｉｎｈｅｒｉｔｅｄ Ｄｉｓｅａｓｅ ，Ｓ ｔａｎｂｕｒｙ ｅｔ ａｌ．，Ｅｄｓ．，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｐ．１４５０−１４６７）。これ以外にも、過多な喫煙やはげしい 環境汚染によるＡＴの不活性化から肺気腫が誘発されることもあり得る。 従って、このような疾患の治療のために、ＡＴの需要は大きく増えつつあり、 ヒトの血液から採取したＡＴではその需要をまかないきれない。 また、ＡＴは急性ショック症候群（ａｃｕｔｅ ｓｈｏｃｋ ｓｙｎｄｒｏｍｅ ）（Ｒｏｂｉｎ Ｗ． Ｃａｒｒｅｌｌ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｒｅｖｉｅｗｓ ，４，２９１−２ ９７（１９８６）参照）の治療にも使用できる。ショック症候群は、好中球のエ ラスターゼがにわかに広範囲に放出され、血漿セルピンとプロテアーゼとの間の 均衡が壊れることによって生じることが知られている。 ＡＴをコードする遺伝子のヌクレオチド配列は既に知られており（Ｌｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２３，４８２８（１９８４）参照） 、ＡＴ遺伝子はクローニングされ、大腸菌（Ｂｏｌｌｅｎ ｅｔ ａｌ．，ＦＥ ＲＳ Ｌｅｔｔ． ，１６６，６７（１９８４）：Ｃｏｕｒｔｎｅｙ ｅｔ ａｌ ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１，６６９（１９８４ ）；Ｔｅｓｓｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，２０８，１８３（ １９８６）；Ｊｏｈｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．，４ ，２９１（１９８７）；Ｓｕｔｉｐｈｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ ．Ｍｅｄ． ，４，３０７（１９８７）；Ｌｅｅ ａｎｄ Ｙｕ，Ｋｏｒ．Ｊ．Ｂ ｉｏｃｈｅｍ． ，２２，１４８（１９８９）；及びＬｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏ ｌｅｃｕｌｅｓ ａｎｄ Ｃｅｌｌｓ ，３，７１−７４（１９９３）参照）及び 酵母（Ｔｒａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６０，４３ ８４（１９８５）；Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ ｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３１２， ７７（１９８４）；Ｃａｂｅｚｏｎ ｅｔ ａｏ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ ａｄ．Ｓｃｉ ．ＵＳＡ，８１，６５９４（１９８４）；Ｍｏｉｒ ｅｔ ａｌ． ，Ｇｅｎｅ，５６，２０９（１９８７）；Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ｋｏｒ．Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ，２３，２６３（１９９０）；及びＫｉｍ ｅｔ ａ ｌ．，Ｋｏｒ．Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，３０，１０８（１９９２）参照）で 発現された。 また、ＡＴは、活性部位残基の３５８番目のメチオニン残基部位を特定部位突 然変異誘発法（ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）により 他のアミノ酸残基で置換することによって、エラスターゼ以外の他のセリン系プ ロテアーゼに対する阻害剤へ変異させるか、高められた耐酸化性を有するように 変異させることができることが報告された（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ． ，Ｎａｔｕｒｅ，３１２，７７−８０（１９８４）；Ｃｏｕｒｔｎｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３１３，１４９−１５１（１９８５）；Ｂａｒｒ ｅｔ ａｌ．，米国特許第４，７３２，９７３号；Ｉｎｓｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，米 国特許第４，７１１，８４８号参照）。一方、酵母で産生された糖化されていな いＡＴは試験管内での耐熱性が劣り、このような耐熱性の低下は生体内での半減 期の短縮と密接な相関関係があるということが報告され（Ｔｒａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６０，４３８４（１９８５）参照）、酵 母で生成され糖化された野生型ＡＴは耐熱性が低いことが明らかになった。ＡＴ の構造と機能との相関関係に対してはフバー（Ｈｕｂｅｒ）とカレル（Ｃａｒｒ ｅｌｌ）によって確認されている（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２８，８９５１ −８９６３（１９８９）参照）。発明の要約 従って、本発明の目的は優れた耐熱性及び熱力学的安定性を有する突然変異さ れた組換えＡＴ、即ちＡＴ突然変異蛋白質（以下ＡＴムテイン）を提供すること である。 本発明の他の目的は前記ＡＴムテインをコードするポリヌクレオチドを提供す ることである。 本発明の更に別の目的は前記遺伝子を含むベクター及び該ベクターで形質転換 された宿主細胞を提供することである。 本発明の更に別の目的は該形質転換体を用いて耐熱性が向上されたＡＴムテイ ンを産生する方法を提供することである。 本発明の１実施例によれば、野生型ＡＴの５１番目、５６番目、５９番目、６ ８番及び７０番目、３７４番目、３８１番乃至３８７番目のアミノ酸中少なくと も１つが他のアミノ酸で置換されたＡＴムテインが提供される。図面の簡単な説明 本発明の前記目的及び特徴は、添付された図面を参考として下記の望ましい実 施態様の記載から明らかになるであろう。 第１図は代表的な野生型ＡＴのアミノ酸配列を示す。 第２図は大腸菌からＡＴムテインを分離及び精製する段階から得た試料を１２ ％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）−ポリアクリルアミドゲル電気泳動した結 果を示した写真である。 第３図は野生型ＡＴ、大腸菌内で発現された突然変異ＡＴ及びヒト血漿から分 離されたＡＴに対して５７℃で熱不活性化実験を行った結果を示したグラフであ る。 第４図は野生型ＡＴと、５１番目のアミノ酸残基がシステインである耐熱性Ａ Ｔムテインとの集合現象を比較するために、５５℃でＡＴの保存中に生じる、高 分子量蛋白質のゲル透過クロマトグラフィーによる定量分析結果を示したグラフ であり； 第５図は酵母培養液からＡＴムテインを分離及び精製する段階から得た試料を １２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥした結果を示した写真である。 第６図は酵母で産生されたＡＴムテインが糖化されているかを確認するために 、１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行って得た結果の写真であり、エ ンドグリコシダーゼで処理した後の分子量の変化を示している。 第７図は酵母で産生されたＡＴ、ヒト血漿ＡＴ及び大腸菌で産生されたＡＴム テインの５８℃での熱不活性化率を比較して示したグラフである。 第８図は大腸菌で発現された単一及び多重突然変異ＡＴに対する熱不活性化実 験の結果を示したグラフである。発明の詳細な説明 本発明にしたがって製造された耐熱性ＡＴムテインは、野生型ＡＴの５１番目 、５６番目、５９番目、６８番及び７０番目、３７４番目、３８１番乃至３８７ 番目のアミノ酸中少なくとも１つが他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列を有 する。望ましい耐熱性ＡＴムテインは野生型ＡＴアミノ酸配列で１つ以上の下記 アミノ酸置換を起こしたものである。 ５１番目のフェニルアラニンのシステイン、バリン、ロイシン、イソロイシン またはアラニンによる置換； ５６番目のセリンのアラニンによる置換； ５９番目のトレオニンのアラニンまたはセリンによる置換； ６８番目のトレオニンのアラニンによる置換； ７０番目のアラニンのグリシンによる置換； ３７４番目のメチオニンのイソロイシン、ロイシンまたはバリンによる置換； ３８１番目のセリンのアラニンによる置換；及び ３８７番目のリジンのアルギニンによる置換。 前記アミノ酸置換中１つのみが起った単一突然変異ＡＴ中で、最も望ましいも のは５１番目残基のシステインであるもの及び３７４番目残基がイソロイシンで あるものである。前記単一突然変異ＡＴは、大腸菌内で糖化されない形態として 産生される場合、野生型ＡＴに比べて長い （１０倍以上）半減期を有し、酵母で糖化された形態として産生される場合、更 に高い耐熱性を有する。 ２つ以上の前記アミノ酸置換がなされた典型的な多重突然変異ＡＴは、５１番 目及び３７４番目の残基がそれぞれロイシン及びイソロイシンで置換されたもの ；５９番目、６８番目及び７０番目の残基がそれぞれアラニン、アラニン及びグ リシンで置換されたもの；３８１番目及び３８７番目の残基がそれぞれアラニン 及びアルギニンで置換されたものである。多重突然変異ＡＴは単一突然変異ＡＴ に比べ著しく増加された耐熱性を示す。また、突然変異ＡＴが糖化されていると 耐熱性は更に増加し得る。 耐熱性ＡＴのアミノ酸配列は前記のように置換されたアミノ酸残基を除いては 野生型ＡＴのアミノ酸配列と同様である。本発明に於いて代表的な野生型ＡＴは 第１図で示すようなアミノ酸配列を有する。第１図の配列で１０１番目、２０４ 番目、２１３番目、２２３番目、３４１番目、３６３番目及び３７６番目の残基 等中の少なくとも１つがアルギニン、リジン、アラニン、システイン、アスパラ ギン、リジン及びグルタミン酸でそれぞれ置換された亜型も野生型の範囲に含ま れ得る。本発明で使用できる野生型ＡＴには、前記野生型ＡＴ等中何れかの１つ が含まれ、また、野生型ＡＴの最初の連続した１１個のアミノ酸残基等中少なく とも１つがその活性に大きな変化を起こさず削除されるか他のアミノ酸で置換さ れたものも含まれる。 また、ＡＴを大腸菌で産生する場合は、ＡＴのアミノ酸配列でＮ−末端のアミ ノ酸にＭｅｔが付加されるか、または置換されるが、これらも本出願で定義した “野生型ＡＴ”に含まれる。従って、前記野生型ＡＴのアミノ酸配列を基にして 製造されたＡＴムテインは本発明の範囲内に含まれる。しかしながら、アミノ酸 の削除または付加と関係なく、ＡＴ のアミノ酸配列でのアミノ酸の番号は第１図で示したアミノ酸配列番号を基にし たものである。 本発明の耐熱性ＡＴは、特定部位突然変異誘発法によって産生されたＡＴムテ インをコードするポリヌクレオチドを有するベクターで宿主細胞を形質転換させ 、転換体から前記ポリヌクレオチドを発現させる方法、または化学的アミノ酸合 成による方法によって産生することができる。 本発明の耐熱性ＡＴムテインをコードするポリヌクレオチドは既存の化学的合 成法によって、または例えば、特定部位突然変異誘発法によって野生型ＡＴのｃ ＤＮＡを変異させることによって産生することができる。 一方、コドンの縮重（ｄｅｇｅｎｅｒａｃｙ）のために、１つのアミノ酸をコ ードする数個の相互相違したコドン等が存在することもでき、従って、同一なア ミノ酸配列をコードする遺伝子は相いに異なるヌクレオチド配列を有することが あり得る。 本発明のＡＴムテインをコードするポリヌクレオチドは、当技術分野で周知で ある適当な原核または眞核生物の発現システムを使用して発現させることができ る（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ，２ｎｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒ ｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｕ．Ｓ．Ａ．（１ ９８９）参照）。 発現は、糖化されていないＡＴの場合は、例えば大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）、 大腸菌ＪＭ１０９（ＤＥ３）または大腸菌ＮＭ５２２のような大腸菌で行われる ことが望ましいし、糖化されたＡＴの場合は、例えば、サッカロミケス・セレビ シェ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、サッカロミケス ・ジアスタチカス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｄｉａｓｔａｔｉｃｕｓ）の ような酵母で行うことが望 ましい。 大腸菌及び酵母での発現に使用できる適当なベクターは前記引用したサンブル ック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）の文献及びフィアス（Ｆｉｅｒｓ）の論文“Ｐｒｏｃ ｅｄ，８ｔｈ Ｉｎｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ”，Ｓｏｃ．Ｆｒａｃ．ｄｅ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ，Ｐａｒｉｓ，（Ｄｕｒａｎｄ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．），ｐｐ．６８０−６９７（１９８８）に記述されて いる。 前記ベクターによる宿主細胞の形質転換は、何らかの通常の方法を使用して行 うことができる（前記引用したサンブルックの文献及びＩｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． ，１５３，１６３（１９８３）参照）。大腸菌を宿主 細胞として使用する場合、ベクターＤＮＡを吸収することができる感応細胞を準 備して、周知のＣａＣｌ２法によって処理できる。酵母の形質転換は、先ず宿主 細胞をスペロプラスト（ｓｐａｅｒｏｐｌａｓｔ）形態に作製した後、前記文献 等に記述されているような周知の方法を用いて行うことができる。 一般的に、目的の発現ベクターを含む宿主微生物を目的の蛋白質の産生を最大 化する最適条件の下で培養する。例えば、アンピシリン耐性遺伝子を選択マーカ ーとして含有するベクターで形質転換された大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を３７℃ でアンピシリン含有ＬＢ培地（バクト−トリプトン１０ｇ、バクト−酵母抽出物 ５ｇ、ＮａＣｌ １０ｇを水１リットルに溶解して製造）の中で培養する。酵母 の場合、文献（Ｓｈｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｙｅａ ｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．， Ｕ．Ｓ．Ａ．）に記述されている最適成長条件の下で培養することができる。 形質転換体を培養した後、目的のＡＴの回収及び精製は、当該分野で周知の方 法またはそれらを組み合わせて使用することによって行うこと ができる。 例えば、形質転換された大腸菌細胞で発現されたＡＴムテインは、細胞培養物 から抽出するか、または蛋白質化学の分野で周知の任意の、適切な細胞を破壊す る方法によって回収できる。例えば、ＡＴムテインを精製するのに、大韓民国特 許公開公報第９３−６８６号の方法を用いることができる。即ち、大腸菌形質転 換体の培養物を遠心分離して細胞を得、その細胞をリゾチーム含有緩衝液に懸濁 させた後、超音波で破砕する。次いで、細胞破砕液を遠心分離して不溶性封入体 形態のＡＴを含有した沈降物を得る。この沈降物をトリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ −１００を含有する緩衝液に懸濁させた後懸濁液から回収する。前記過程を繰返 す。次いで、生成沈降物を尿素含有懸濁液に溶解させ、エチレンジアミン四酢酸 塩とメルカプトエタノールとを含有するリン酸カリウム溶液で希釈する。生成溶 液を、エチレンジアミン四酢酸塩とメルカプトエタノールとが添加された緩衝液 について透析し、同一緩衝液で平衡化されたＤＥＡＥ−セファセルカラム（Ｐｈ ａｒｍａｃｉａ ＬＫＢ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を通じて溶離させる。 溶離液をモノ−Ｑカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＬＫＢ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ｏｇｙ）上でＦＰＬＣすることによって精製する。 目的のＡＴムテインを培養培地へ分泌するための宿主細胞として酵母を使用す る場合、ＡＴムテインは、例えば、細胞培養液を遠心分離して細胞を除去し、上 澄液を濃縮し、濃縮液を硫酸アンモニウムで文画化し、生成溶液を遠心分離して 沈降物を得、前記沈降物を緩衝液について透析し、生成溶液をＤＥＡＥ−セファ セルカラムと、それに続きモノ−Ｑカラム上で溶離させる方法によって分離及び 精製できる。ＡＴムテインが酵母細胞内に蓄積される場合には、細胞を前記通常 の精製過程を行う前に粉砕しなければならない。 本発明のＡＴムテインは好中球エラスターゼに対する阻害剤として作用し、特 に肺胞内の弾性繊維がエラスターゼによって分解されることを防止できる。従っ て、ＡＴムテインは遺伝子欠陥や環境汚染等による肺気腫の予防剤及び治療剤と して使用できる。特に、本発明のＡＴムテインは耐熱性が著しく高められたもの で非常に有用である。 下記実施例は本発明を具体的に例示するためのもので、発明の範囲を制限する ものではない。 実施例で、全てのＤＮＡ操作は、特に言及しない限り、前記引用したサンブル ック等の文献を参照して行った。本原で使用された制限酵素は米国のニューイン グランドバイオレッブス社（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）やドイ ツのベリンガーマンハイム社（Ｂｏｅｒｉｎｇｅｒ／Ｍａｎｎｈｅｉｍ）から購 入した。 下記参照例及び実施例でＡＴの活性及び熱安定性の測定には次の方法を用いた 。 ＡＴの活性は、文献（Ｔｒａｖｉｓ ＆ Ｊｏｈｎｓｏｎ ｉｎ Ｍｅｔｈｏ ｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ． ，８０，７５４（１９８１）参照）の方法によっ てペプチドを分解するエラスターゼの活性がＡＴによって阻害されることを評価 して測定した。具体的には、エラスターゼとＡＴ抽出物とを混合して反応させた 後、ここに基質（ジメチルスルホキシドにスクシニル−アラニル−アラニル−ア ラニル−パラ−ニトロアニリド（ＳＩＧＭＡ Ｓ４７６０）を溶解させ製造）を 添加し、残余エラスターゼの活性を決定するために４１０ｎｍで吸光度の変化を 測定することによってＡＴのエラスターゼ阻害活性を評価した。ＡＴの熱安定性 は、細胞抽出物を使用する際は５５℃で、精製されたＡＴを使用する時は５７℃ 乃至５８℃で処理されたＡＴを使用して、エラスターゼ阻害活性を測定すること によって評価した。対照用としては、大腸菌または酵 母細胞で産生された野生型ＡＴまたはヒト血漿から分離−精製された天然ＡＴを 使用した。 参照例１：ＡＴ遺伝子のクローニング ヒトの肝ｃＤＮＡライブラリ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）のクローン から、ローン（Ｌｏｎｇ）等が報告したＡＴ遺伝子中の５０乃至７２番目のヌク レオチドをプローブとして使用して３２個の陽性クローンを分離した（Ｂｉｏｃ ｈｅｍｉｓｔｒｙ ２３，４８２８（１９８４）参照）。プローブとして前記遺 伝子の１１５０乃至１１７２番目のヌクレオチドを使用して、それから４個のク ローンを得た。これらのクローンからプラスミドｐＵＣ−ＡＴ（Ｒ）を得、プラ スミドから制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩまたはＢａｍＨＩを用いた切断に よって１．３ｋｂ断片としＡＴ ｃＤＮＡを分離した（Ｌｅｅ ＆ Ｙｕ，Ｋｏ ｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ． ，２２，１４８（１９８９）参照）。 参照例２：野生型大腸菌組換えＡＴの発現 参照例１で得たｐＵＣ−ＡＴ（Ｒ）を制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩで切 断して１．３ｋｂ断片を分離し、この断片をｐＥＴ−８ｃプラスミド（Ｓｔｕｄ ｉｅｒ ａｎｄ Ｍｏｆｆａｔｔ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１８９，１１２（ １９８６）参照）のＢａｍＨＩ認識部位に挿入してプラスミドｐＥＡＴ８を作製 した。次いで、前記プラスミドを使用して大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換 させ、産生されたＡＴを野生型大腸菌組換えＡＴと命名した。産生された野生型 大腸菌組換えＡＴは、第一残基がグルタミン酸のかわりにメチオニンであり、他 の残基等は野生型ＡＴ（第１図参照）と同じアミノ酸配列を有する。前記野生型 組換えＡＴのアミノ酸配列は、文献（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ ４ ７７Ａ）の方法を用いる蛋白質配列分析実験によって同定された。ｐＥＡＴ ８ で形質転換された大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）は、微 生物寄託の国際的承認に対したブダペスト条約によって１９９１年４月１７日付 で寄託番号ＫＣＴＣ ０００９ＢＰで寄託された（大韓民国特許公開公報第９３ −６８６号参照）。 製造例１：無作為突然変異遺伝子を含む形質転換体の産生 ＢａｍＨＩでプラスミドｐＥＡＴ８を切断して得た１．３ｋｂ ＤＮＡ断片を ベクターＭ１３ｍｐ１８の制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩ認識部位に挿入し た。Ｍ１３クローンから得た単一ＤＮＡ、プライマー＃１２０１及び＃１２１２ （Ｓｉｇｍａ社から購入）を使用して、エッケルトら（Ｅｃｋｅｒｔ ｅｔ ａ ｌ．）の文献（Ｅｃｋｅｒｔ ＆ Ｋｕｎｋｅｌ，ＰＣＲ Ｃｈａｐ．１４，Ｔ ｈｅ ｆｉｄｅｌｉｔｙ ｏｆ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎｓ ，ｅｄ．ｂｙ ＭｃＰｈａｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｏｘｆ ｏｒｄ Ｕｎｉｖ．Ｐｒｅｓｓ（１９９１）参照）の変形されたＰＣＲ法によっ て無作為突然変異を誘導したが、但し、反応溶液中のｄＡＴＰの濃度を０．１ｍ Ｍに低め、ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰをそれぞれ１ｍＭにし、１０ｍＭ塩 化マグシウムを添加した。前記ＰＣＲを２５回繰返した。増幅されたＤＮＡを制 限エンドヌクレアーゼＢｃｌＩ及びＢｓｔＸ１で切断して７７０ｂｐの断片（１ ７番目のコドンから２７３番目のコドンまで）を得、これで参照例２のｐＥＡＴ ８中のＢｃｌＩ／ＢｓｔＸ１断片を置換した。次いで、作製されたプラスミドで 大腸菌 ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換させ、アンピシリンに対する耐性を有す る形質転換体コロニー５×１０⁴個を収得した。 製造例２：耐熱性ＡＴを産生するコロニーのスクリニング（ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ）大腸菌で産生された耐熱性ＡＴムテインをコプレンら（Ｃｏｐｌｅｎ ｅｔ ａｌ．）の文献（Ｐｒｏｔｅｉｎｓ；Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，ｆｕｎｔｉｏｎ ａ ｎｄ ｇｅｎｅｔｉｃｓ ，７，１６（１９ ９０）参照）の変形された方法によってスクリニングした。製造例１で得たコロ ニーを、１ｍＭイソプロピルβ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）を含有する培地 （リン酸二ナトリウム６ｇ、リン酸カリウム３ｇ、塩化アンモニウム１ｇ、グル コース２ｇ、酵母抽出物０．２ｇ及びカザミノ酸３ｇを水１リットルに溶かして 調製したもの）０．１mlに注入した後、一夜培養した。産生培養液に２５マイク ロリットルの溶菌液（２５０ｍＭトリス、ｐＨ８．０、２５ｍＭ ＥＤＴＡ、０ ．２５％トリトンＸ−１００、０．５mg／mlのリゾチーム）を加え、培養液を室 温で１時間振とう培養した。次いで、前記培養液を６０℃で１時間熱処理し、こ こに７ｎＭエラスターゼ溶液（ＳＩＧＭＡ Ｅ０２５８）２５マイクロリットル を添加した。反応混合物を室温で１時間静置させ、ここに、１．２ｍＭスクシニ ル−アラニル−アラニル−アラニル−パラ−ニトロアニリド（ＳＩＧＭＡ Ｓ４ ７６０）を加え、室温で一夜反応させた。２５マイクロリットルの亜窒酸ナトリ ウム（２Ｍ ＨＣｌに０．２％濃度で溶解してある）を加えた後、反応混合物を ３分間静置した。０．２％硫酸アンモニウム２５マイクロリットルを加え、その 溶液を３分間更に静置した。次いで、５０マイクロリットルのＮ−ナフチルエチ レンジアミン溶液（９５％エタノール中の０．０５％溶液）５０マイクロリット ルを加えて赤色反応を起こした。赤色を示さないクローンが耐熱性ＡＴムテイン を生成するものであり、これを陽性と呼ぶものとした。製造例１で製造されたコ ロニー中５，０００個のクローンをスクリニングして４１個の陽性クローンを得 た。 実施例１．優れた耐熱性を有するＡＴムテインを発現する大腸菌形質転換体の産 生 ＡＴのエラスターゼ阻害活性はトラビスらの方法（Ｔｒａｖｉｓ ＆ Ｊｏｈ ｎｓｏｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，８０，７ ５４（１９８１）参照）の変形された方法を用いて評価した。反応緩衝液として は５０ｍＭ ＮａＣｌを含有する５０ｍＭトリス（ｐＨ８．０）を使用し、エラ スターゼに対する基質としてはジメチルスルホキシドに溶解した１５ｍＭスクシ ニル−アラニル−アラニル−アラニル−パラ−ニトロアニリド（ＳＩＧＭＡ Ｓ ４７６０）を用いた。酵素液は５０％グリセロールを含有する反応緩衝液にエラ スターゼを０．３μＭの濃度になるように溶解することによって調製した。 製造例２で得た形質転換クローンをＬＢ培地に接種し、３７℃で６００ｎｍで の吸光度が０．８になるまで培養した。ＩＰＴＧを０．４ｍＭ添加し、培養液を ３時間更に培養した。培養液を遠心分離して細胞を収穫し、その細胞を５０ｍＭ ＮａＣｌ含有５０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．０）に懸濁させた後、０℃で超 音波処理して細胞を破砕した。破砕細胞液を１５分間遠心分離（１０，０００ｘ ｇ）して上澄液を取った後ＡＴ抽出液として使用した。 ＡＴのエラスターゼ阻害活性は下記のように決定された：酵素液１０マイクロ リットル、ＡＴ抽出液１０乃至５０マイクロリットル及び反応緩衝液を混合して 最終容量を６０マイクロリットルにした後、１０分間反応させた。反応緩衝液４ ３０マイクロリットル及び基質１０マイクロリットルを添加し、直ちに４１０ｎ ｍでの吸光度変化を３分間測定した。 耐熱性を評価するために、温度を５５℃で維持しながら１分ごとにＡＴのエラ スターゼ阻害活性を測定した。野生型組換えＡＴに比べ熱安定性が高められたＡ Ｔムテインを産生する大腸菌形質転換体を分離した。この形質転換体を大腸菌Ｂ Ｌ２１（ＤＥ３）（ｐＥＡＴ８１）と命名し、１９９３年３月１９日付で遺伝子 銀行（Ｋｏｒｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒ ｅｓ）に寄託番号ＫＣＴＣ００７７ＢＰで寄託された。前記大腸菌ＢＬ２１（Ｄ Ｅ３）に含有さ れているプラスミドをｐＥＡＴ８１と命名した。 実施例２．ＡＴムテインをコードするＤＮＡのヌクレオチド配列の決定 実施例１で得たプラスミドｐＥＡＴ８１をＢａｍＨＩで切断させ単離した１． ３ｋｂ ＤＮＡ切片をＭ１３ｍｐ１８ベクターのＢａｍＨＩ認識部位に挿入した 。３５Ｓ−ｄＡＴＰ及びセケナーゼキット（Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ Ｋｉｔ，ＵＳ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）を用い、サンガーの方法（Ｓａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７４，５４６ ３（１９７７）参照）を利用して配列分析をした結果、ＤＮＡ配列の５１番目の コドンＴＴＣ（フェニルアラニン）がＴＧＣ（システイン）で置換されたことを 確認した。 実施例３．ＡＴムテインの分離及び精製 ＡＴムテインの分離精製は、大韓民国特許公開公報第９３−６８６号に開示し た方法を利用して行った。即ち、大腸菌形質変換体（ＫＣＴＣ ００７７ＢＰ及 びＫＣＴＣ ０００９ＢＰ）をＭ９ＺＢ培地（１ｇの塩化アンモニウム、３ｇの 一塩基性リン酸カリウム、６ｇの二塩基性リン酸ナトリウム、２ｇのグルコース 、０．２ｇの酵母抽出物及び３ｇのカザミノ酸を水１ｌに溶解して調製したもの ）２５０ｍｌにそれぞれ接種した後、３７℃で、６００ｎｍでの吸光度が０．８ になるまで培養した。ＩＰＴＧを０．４ｍＭ添加し、培養液を３時間更に培養し た。それぞれの培養液を遠心分離して細胞を収穫し、収穫した細胞を、０．１mg ／ｍｌのリゾチームを含有する緩衝液Ａ（５０ｍＭ ＮａＣｌ）１ｍＭエチレン ジアミン四酢酸塩、１ｍＭメルカプトエタノール、５０ｍＭトリス、ｐＨ８．０ ）に懸濁させた後、０℃で超音波処理して細胞を破砕した。それぞれの懸濁液を １０分間遠心分離（１０，０００ｘｇ）してＡＴが含有された沈降物を不溶性封 入体形態として得た。かかる沈降物をそれぞれ、０．５％トリトンＸ−１００が 添加された緩衝溶液Ａ中に 懸濁させ、該懸濁液を遠心分離して沈降物を回収した。前記洗浄段階を更に１回 繰返した。沈降物を、８Ｍ尿素を含有する緩衝溶液５ｍｌに溶解させた後、生成 溶液を３０分間静置し、１ｍＭエチレンジアミン四酢酸塩及び１ｍＭメルカプト エタノールを含有する５０ｍＭリン酸塩緩衝液（ｐＨ８．０）４５ｍｌを加え希 釈した。３０分後、１ｍＭエチレンジアミン四酢酸塩及び１ｍＭメルカプトエタ ノールを含有する１０ｍＭリン酸塩緩衝液（ｐＨ６．５）に対して前記希釈液を 透析した。このようにして得た透析液を、透析緩衝液で平衡化したＤＥＡＥ−セ ファセル（Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＬＫＢ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）カラム に注入して、０−３００ｍＭの線形濃度勾配のＮａＣｌを含有する透析緩衝液で 溶離した。溶離液を再びＦＰＬＣと共にモノ−Ｑカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＬＫＢ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）に付加し、０−２００ｍＭの線形濃度勾 配のＮａＣｌを含有する透析液で溶離させて、精製されたＡＴを得た（第２図参 照）。 第２図で、第１列は破砕された細胞抽出物を示し、第２列は破砕された細胞の 遠心分離によって得たＡＴを含有する沈降物を示し、第３列は尿素に溶解された 沈降物を再生（ｒｅｆｏｌｄｉｎｇ）して得た上澄液を示し、第４列は再生中に 産生された沈降物を示し、第５列はＤＥＡＥ−セファセルカラムとモノＱカラム を通過させた後の精製された組換えＡＴを示し、第６列はアフィ−ゲルブルー（ Ａｆｆｉ−Ｇｅｌ Ｂｌｕｅ）カラムとモノＱカラムを通過させたヒト血漿ＡＴ を示し、第７列は標準分子量の蛋白質を示す。 実施例４．部位特異性突然変異遺伝子とＡＴムテインとの特性 〈４−１〉部位特異突然変異遺伝子の産生 ５１番目のアミノ酸残基がフェニルアラニン及びシステインの以外の１８個ア ミノ酸中１つで置換された突然変異されたＡＴ等を得るために、 オリゴヌクレオチドによる特定部位突然変異誘発法（Ｋｕｎｋｅｌ ｅｔ ａｌ ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１５４，３６７−３８２（ １９８７）参照）を用いた。前記突然変異誘導に使用されたオリゴヌクレオチド は３０個の塩基からなっており、その配列は、次のように、５１番目コドンに隣 接したコドンが野生型ＡＴの該当部分と同じアミノ酸をコードし、５１番目のコ ドンが１８個のアミノ酸中１つをコードできるように設計されている。 ここで、Ｇ／Ｃは塩基ＧとＣが同モル比で混ぜられたものであり、ＮはＡ、Ｔ 、Ｇ及びＣが同モル比で混合されたことを意味する。 大腸菌ＣＪ２３６（ｄｕｔ−，ｕｎｇ−，Ｂｏｅｒｉｎｇｅｒ／Ｍａｎｎｈｅ ｉｍ）を宿主として用いて、ＡＴ遺伝子を含有するＭ１３クローンを、ウリジン （ｕｒｉｄｉｎｅ）が０．２５μｇ／ｍｌ添加された培地で３回増幅させてバク テリオファージ（ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｒｇｅ）粒子を生成し、この粒子から 単一鋳型ＤＮＡを得た。合成されたオリゴヌクレオチドを鋳型ＤＮＡに結合した 。生成されたファージＤＮＡを使用して大腸菌ＪＭ１０９（ＡＴＣＣ ５３３２ ３）を形質転換させた後、突然変異されたクローンを選別した。変異Ｍ１３クロ ーンの配列を実施例２と同様に同定して、５１番目の殘基が１８個のアミノ酸中 １つで置換されたことを確認した。前記突然変異されたクローンからＲＦ（Ｒｅ ｐｌｉｃａｔｉｖｅ Ｆｏｒｍ）ＤＮＡを分離した後、制限エンドヌクレアーゼ ＢｃｌＩ及びＢｓｔＸＩで処理して７７０ｂｐ断片を得て、これをプラスミドｐ ＥＡＴ８のＢｃｌＩ／ＢｓｔＸＩ断片の代わりに置換して突然変異ＡＴ発現ベク ターを得た。前記ベクターで大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換させた。 〈４−２〉ＡＴムテインの熱安定性測定 ＡＴムテインを産生する大腸菌の細胞抽出液を、実施例１と同様の耐熱性を評 価した。評価の結果、５１番目のアミノ酸がバリン、ロイシン、イソロイシン、 またはアラニンで置換されたＡＴムテインの熱安定性の増加が認められた。それ から、ＡＴムテインを実施例３と同じ方法で精製した後、アフィ−ゲルブルーカ ラム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）通過後モノＱカラム上でＦＰＬＣを行って精製したヒト 血漿ＡＴ（Ａ９２０４）と比較することによって、各ムテインのエラスターゼに 対する会合定数及び熱に対する不活性化率を決定した。会合定数はベアチらの方 法（Ｂｅａｔｔｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５５，３９３ １−３９３４（１９８０）参照）によって、次のようにして算出した。 同一濃度（８ｎＭ）のエラスターゼとＡＴを含む反応混合液から１０分間１分 おきに試料を採取した。基質として１ｍＭのスクシニル−アラニル−アラニル− アラニル−ｐ−ニトロアニリド（ＳＩＧＭＡ Ｓ４７６０）をそれぞれの試料に 加えた。４１０ｎｍでの吸光度を測定して各試料のエラスターゼ活性を決定した 後、時間に対するエラスターゼ濃度の逆数をグラフ化して得られた直線の傾き値 から会合定数を求めた。下記表Ｉで示したように、大腸菌で産生された野生型Ａ Ｔ及び組換えＡＴムテインはヒト血漿のＡＴの値と類似した会合定数を有し、こ れは組換えＡＴムテインの活性が正常であることを立証する。 熱安定性を比較するために、多様な種類のＡＴムテインを５７℃で培養し、培 養液から１分ごとに試料を採取した。ＡＴムテインの残余活性を実施例１でのよ うな方法で測定し、時間に対する残余活性の対数値をグラフ化して得た直線（第 ３図参照）から半減期と熱不活性化率を算出した。その結果は下記表１に示した 。 前記実施例でみられるように、ＡＴムテインは野生型ＡＴの活性に似た活性を有 しており、熱に対する安定性が大腸菌で産生された野生型組換えＡＴに比べ著し く高められたことが分る。特に、５１番目アミノ酸がシステインで置換されたＡ Ｔムテインは野生型組換えＡＴに比べて熱安定性が１３．５倍も高められ、ヒト 血漿のＡＴに似ていた耐熱性を示した。 〈４−３〉ＡＴムテインの集合抑制能力 ロマスらの方法（Ｌｏｍａｓ，Ｄ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３５ ７ ，６０５−６０７（１９９２）；及びＬｏｍａｓ，Ｄ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ，３２，５００−５０８（１９９３）参照）によれば 、ＡＴ分子は高温（４１℃以上）または弱い変性条件の下で重合され活性がない 形態に集合する傾向があり、これが熱不活性化を起こすことが知られている。Ａ Ｔムテイン及び野生型ＡＴの集合度を相互比較するために、集合反応を誘導した 後、ゲル透過クロマトグラフィー法によって高分子量蛋白質の形成を評価した。 より詳細に は、精製されたＡＴを５５℃で０．１mg／mlの濃度で適当な時間培養した後、ス ペロース（Ｓｕｐｅｒｏｓｅ）１２カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＬＫＢ Ｂｉ ｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）上でのＦＰＬＣによって分子量別に分画した。第４図 で示したように、５１番目のアミノ酸がシステイン残基で置換された本発明のＡ Ｔムテインが、野生型ＡＴに比べてずっと低い比率で重合されることが明らかに なった。従って、アミノ酸配列の５１番目殘基の突然変異は重合反応によるＡＴ の不活性化度を減少させると考えられる。第４図で、１２．５分で溶離された分 画は活性形蛋白であり、それより前に溶離された蛋白質は不活性の高分子量蛋白 質である。 実施例５．糖化されたＡＴムテインの産生及び特定化 〈５−１〉酵母でのＡＴ遺伝子発現用ベクターの作製 野生型ＡＴ遺伝子及びＡＴ突然変異遺伝子をそれぞれ含有する大腸菌発現プラ スミドｐＥＡＴ８（ＫＣＴＣ ０００９ＢＰ）及びｐＥＡＴ８１（ＫＣＴＣ ０ ０７７ＢＰ）を制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩ及びＳｍａＩで切断し、それ ぞれの切断されたプラスミドから１．３Ｋｂ ＤＮＡ断片を分離した。それぞれ の断片をプラスミドｐＹＥＳ２４（Ａｈｎ ｅｔ ａｌ．，Ｋｏｒ．Ｊ．Ｍｉｃ ｒｏｂｉｏｌ． ，３０，４０３（１９９２）参照）のＢａｍＨＩ及びＳｍａＩ部 位へ挿入した。作製されたそれぞれのプラスミドをＢａｍＨＩで切断した後マン ビーン（ｍｕｎｇｂｅａｎ）ヌクレアーゼで処理し、連結反応させてプラスミド ｐＧＡＴ１１（野生型）及びｐＧＡＴ１５（突然変異体）を作製した。プラスミ ドで、ＡＴ遺伝子は分泌シグナル配列とサッカロミケス・ジアスタチカス（Ｓａ ｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｄｉａｓｔａｔｉｃｕｓ）のＳＴＡ１遺伝子から誘導 されたプロモータ部分とを含む４５０ｂｐ配列の後に位置する。野生型ＡＴ遺伝 子を含有するｐＧＡＴ１１の作製は 既に報告されていた（Ｓｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｋｏｒ．Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏ ｌ． ，３１，２０３（１９９３）参照）。 〈５−２〉酵母形質転換体の産生及び培養 前記〈５−１〉で得たプラスミドによる酵母細胞の形質転換は、酢酸リチウム 法（Ｉｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１５３、１６３（１９ ８３）参照）によって行った。サッカロミケス・ジアスタチカス（Ｓａｃｃｈａ ｒｏｍｙｃｅｓ ｄｉａｓｔａｔｉｃｕｓ）ＹＩＹ３４５（ＫＣＴＣ １７９１ ）（Ｙａｍａｓｈｉｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１６１， ５７４（１９８５）参照）を宿主として使用した。 ｐＧＡＴ１５で形質転換されたサッカロミケス・ジアスタチカス（Ｓａｃｃｈ ａｒｏｍｙｃｅｓ ｄｉａｓｔａｔｉｃｕｓ）を次のように培養した：それぞれ ２０mg／ｌのヒスチジン及びロイシンを含むＹＮＢ培地（０．６７％アミノ酸欠 如酵母窒素基質及び２％グルコース水溶液）で形質転換体を３０℃で１６乃至１ ８時間培養した後、ＹＥＰＤ培地（１％酵母抽出物、２％ペプトン、２％グルコ ース水溶液）で２４時間培養した。 〈５−３〉酵母培養液からＡＴの分離及び精製 前記〈５−２〉で得た各酵母培養液を遠心分離して細胞を除去し、生成上澄液 を限外濾過方法（Ａｍｉｃｏｎ ＰＭ３０使用）によって濃縮した。この濃縮液 に、６０％飽和されるまで硫酸アンモニウムを加えた後、生成液を１５分間２５ ，０００×ｇの下で遠心分離して沈降物を除去した。飽和度７５％となるように 硫酸アンモニウムを添加した。生成溶液を遠心分離して沈降物を得、この沈降物 を緩衝液Ｂ（１０ｍＭトリス、１ｍＭエチレンジアミン四酢酸塩、１ｍＭメルカ プトエタノール、ｐＨ８．０）に溶かした後、同一緩衝液に対して透析した。透 析産物に、 硫酸プロタミンを０．１％になるように加え、遠心分離して沈降物を除去し、前 記緩衝液Ｂに対して更に透析した。生成溶液を、緩衝液Ｂで平衡化されたＤＥＡ Ｅ−セファセル（Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＬＫＢ）カラムに投入し、０乃至２００ ｍＭ線形濃度勾配のＮａＣｌを含む緩衝液Ｂで溶離させた後、更にモノ−Ｑ−カ ラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＬＫＢ）の上で０乃至１５０ｍＭ ＮａＣｌ線形濃 度勾配で溶離させることによって精製した。 第５図は酵母培養液からのＡＴの分離精製段階で得た試料に対するＳＤＳ−電 気泳動分析結果を示す。第１列は培養液を限外濾過した後得た濃縮液に対するも のであり；第２列は硫酸アンモニウムによる分画化及び硫酸プロタミンによる沈 降の後の上澄液に対するものであり；第３列はＤＥＡＥ−セファセルカラムを通 過した後の活性ＡＴ含有分画に対するものであり；第４列はモノＱカラムを通過 した後の精製されたＡＴムテインに対するものであり；第５列は標準分子量蛋白 質に対するものである。 〈５−４〉酵母で産生されたＡＴムテインの糖化の確認 前記〈５−３〉で得たＡＴムテインが糖化されているかを確認するために、精 製されたＡＴムテインをエンドグリコシターゼＨ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂ ｉｏｌａｂｓ社、以下“エンドＨ”と略する）で処理した後、ＳＤＳ−電気泳動 した。エンドＨはＮ−糖化された高マンノース（ｈｉｇｈ−ｍａｎｎｏｓｅ）型 の炭水和物殘基を除去することによって糖蛋白の分子量を減少させ、この結果は ＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認することができる。エンドＨはヒトで産生される複合型 炭水和物を含む糖蛋白に対しては作用しない。一般的に、酵母で分泌された糖蛋 白は高マンノース型炭水和物を含有する。第６図でみるように、酵母で産生され たＡＴムテインの分子量は、糖化された形態のヒト血漿ＡＴのそれと近 似し、エンドＨ処理後は、大腸菌で産生された分子量４５ＫＤの糖化されていな いＡＴムテインと近似した。従って、前記〈５−２〉での酵母で産生されたＡＴ ムテインは高マンノース型のＮ−糖化されている糖蛋白であることを確認した。 第６図で、第１列は大腸菌で発現された糖化されていないＡＴムテインに対する ものであり；第２列はヒト血漿ＡＴに対するものであり；第３列はエンドＨ処理 したヒト血漿ＡＴに対するものであり；第４列は酵母で産生された野生型組換え ＡＴに対するものであり；第５列は酵母で産生されエンドＨで処理した野生型Ａ Ｔに対するものであり；第６列は酵母で産生されたＡＴムテインに対するもので あり；第７列は酵母で産生されエンドＨ処理した変異形ＡＴに対するものであり ；第８列は標準分子量蛋白質に対するものである。 〈５−５〉糖化されたＡＴムテインの特定化 前記〈５−３〉で精製された野生型組換えＡＴと５１番目のアミノ酸がシステ インで置換され酵母から産生されたＡＴムテインとの５８℃での阻害活性及び耐 熱性を前記実施例４と同様の方法で測定し、これを実施例３及び４からそれぞれ 得た野生型大腸菌組換えＡＴ及びヒト血漿ＡＴとそれぞれ比較した。糖化された 組換えＡＴは野生型ＡＴに比べて、プロテアーゼ阻害活性については同等であり 、耐熱性は著しく増加した（第７図、表２参照）。酵母で産生された野生型組換 えＡＴは大腸菌で発現された野生型組換えＡＴに比べて耐熱性が５．３倍増加し たが、ヒト血漿のＡＴよりは低かった。しかしながら、酵母で産生され糖化され たＡＴムテインは、酵母で産生された野生型ＡＴ及びヒト血漿ＡＴに比べ耐熱性 がそれぞれ３１倍及び６倍も高かった。 実施例６．縮重されたオリゴヌクレオチドを用いた特定部位無作為突然変異誘発 及びＡＴムテインの特性 ＡＴの疏水性コア領域で多様な突然変異を誘発させることによって耐熱性突然 変異体を得るために、混合合成オリゴヌクレオチドを用いて、野生型ＡＴのアミ ノ酸配列で５１番目殘基の隣りの疏水性部位を無作為突然変異させた。突然変異 誘発のため選定された部位は野生型ＡＴ配列の４８番目乃至７０番目のアミノ酸 殘基と３６８番目乃至３９１番目の殘基であった。この部位の無作為突然変異誘 導のために、ハッチスンらの方法（Ｈｕｔｃｈｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏ ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ． ，８３，７１０−７１４（１９ ８６）参照）によって混合合成オリゴヌクレオチドを使用した。即ち、オリゴヌ クレオチドの化学合成に使用された４種（Ａ，Ｔ，Ｃ，Ｇ）のホスホラミジト（ ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ）溶液それぞれを微量の残りの３つのホスホラ ミジト溶液で汚染されるようにした。汚染された溶液をオリゴヌクレオチドの合 成に用い、産生されたオリゴヌクレオチドの配列の上で微量の塩基を挿入させた 。このような混合合成オリゴヌクレ オチドを実施例４に記述されたように特定部位突然変異誘発法（Ｋｕｎｋｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１５４，３６７ −３８２（１９８７）参照）に使用すと、特定部位に対する無作為変異を効率的 に誘発することができる。 前記２つの変異部位をカバーするために、（ａ）４８番目乃至６０番目の残基 、（ｂ）５８番目乃至７０番目の残基、（ｃ）３６８番目乃至３８０番目の残基 及び（ｄ）３７８番目乃至３９１番目の残基の配列に対して相補的な下記の４種 のオリゴヌクレオチドを合成して突然変異誘導に使用した。 変異頻度を最適化させるために、本実施例では、４種のホスホルアミジト溶液 それぞれと、他の３種のホスホルアミジトとをそれぞれ２．５％ずつ汚染される ように混合した。実施例４のような方法で、合成されたオリゴヌクレオチドを使 用して部位特異突然変異を誘導した。収得したＭ１３クローンから分離したＲＦ ＤＮＡからＢａｍＨＩ−切断及び突然変異されたＡＴ遺伝子を発現ベクターｐ ＥＡＴ８のＢａｍＨＩ部位に挿入して、突然変異ＡＴ遺伝子発現用ベクターを得 た。前記製造例２で記述したスクリニング法によって大腸菌で発現されたＡＴム テインの耐熱性を調べて耐熱性の突然変異体を選別した。ＡＴムテインの５５℃ での耐熱性と大腸菌野生型組換えＡＴのそれとを実施例１のように比較した。そ の結果、前記ＡＴムテインは大腸菌野生型組換えＡＴに比べて半減期が２．７７ 倍乃至１５．７３倍長くなったことが分った。その結 果を下記表３に示した。 実施例７．多重突然変異ＡＴの産生 前記実施例等で産生された耐熱性ＡＴのアミノ酸置換（表２及び表３）を選択 的に組み合わせることによって耐熱性が更に向上された突然変異ＡＴを得るため に、前記実施例４に記述されたオリゴヌクレオチドを用いた部位特異突然変異法 を用いて２つまたはそれ以上のアミノ酸が他のアミノ酸で置換された多重突然変 異ＡＴを得た。その結果５１番目の残基がロイシンであり３７４番目の残基がイ ソロイシンである２つのアミノ酸が置換された多重突然変異ＡＴはそれぞれの単 一突然変異ＡＴに比べ卓越した耐熱性（３００倍以上）を有する（第８図参照） 。また、５９番目、６８番目及び７０番目の残基がそれぞれアラニン、アラニン 及びグリシンで、３つのアミノ酸が置換された多重突然変異ＡＴは単一変異ＡＴ に比べ３００倍以上の耐熱性を示す。第８図は大腸菌で発現され た単一突然変異ＡＴ及び多重突然変異ＡＴに対する熱不活性化実験の結果を示し たグラフである。第８図で、●は実施例４のように５５℃で毎分ごとに測定した 野生型組換えＡＴの活性；▽は５１番目のアミノ酸がロイシンで置換された突然 変異ＡＴの活性；▼は３７４番目の殘基がイソロイシンで置換された突然変異Ａ Ｔの活性；□は５１番目及び３７４番目の残基がそれぞれロイシン及びイソロイ シンで置換された突然変異ＡＴの活性である。 こうして、多重突然変異体が単一突然変異体より耐熱性を更に向上することが 明らかになった。また、多重突然変異ＡＴが酵母で糖化された形態として産生さ れる場合は、耐熱性が更に高められよう。 本発明の特定の実施態様について記述したが、当業者によって下記の特許請求 範囲で定義した本発明の範囲内で、本発明の多様な改変が可能であることは勿論 である。請求の範囲 １．野生型ヒトα１−抗トリプシンの５１番目、５６番目、５９番目、６８番目 及び７０番目、３７４番目、３８１番目及び３８７番目アミノ酸中一つ以上が他 のアミノ酸で置換されたことを特徴とする野生型ヒトα１−抗トリプシンアミノ 酸配列を有した、耐熱性が向上されたヒトα１−抗トリプシンムテイン。 ２．下記アミノ酸置換中１つ以上が生じた請求項１に記載のヒトα１−抗トリプ シン： ５１番目のフェニルアラニンのシステイン、バリン、ロイシン、イソロイシン またはアラニンによる置換； ５６番目のセリンのアラニンによる置換； ５９番目のトレオニンのアラニンまたはセリンによる置換； ６８番目のトレオニンのアラニンによる置換； ７０番目のアラニンのグリシンによる置換； ３７４番目のメチオニンのイソロイシン、ロイシンまたはバリンによる置換； ３８１番目のセリンのアラニンによる置換；及び ３８７番目のリジンのアルギニンによる置換。 ３．Ｎ−末端の連続的な１１個のアミノ酸中１つ以上が削除されるか他のアミノ 酸で置換されたことを特徴とする請求項１に記載のヒトα１−抗トリプシンムテ イン。 ４．糖化されたことを特徴とする請求項１に記載のヒトα１−抗トリプシンムテ イン。 ５．野生型ヒトα１−抗トリプシンの５１番目のフェニルアラニン及び３７４番 目のメチオニンがそれぞれロイシン及びイソロイシンで置換されたことを特徴と する請求項１に記載のヒトα１−抗トリプシンムテイ ン。 ６．野生型ヒトα１−抗トリプシンの５９番目のトレオニン、６８番目のトレオ ニン及び７０番目のアラニンがそれぞれアラニン、アラニン及びグリシンで置換 されたことを特徴とする請求項１に記載のヒトα１−抗トリプシンムテイン。 ７．請求項１に記載のヒトα１−抗トリプシンムテインをコードするポリヌクレ オチド。 ８．請求項７に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。 ９．ｐＥＡＴ８１またはｐＧＡＴ１５の請求項８に記載の発現ベクター。 １０．請求項７に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された 微生物。 １１．大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）をｐＥＡＴ８１で形質転換することによって産 生された請求項１０に記載の微生物形質転換体（寄託番号ＫＣＴＣ ００７７Ｂ Ｐ）。 １２．サッカロミケス・ジアスタチカス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｄｉａ ｓｔａｔｉｃｕｓ ）ＹＩＹ３４５をｐＧＡＴ１５で形質転換することによって産 生された請求項１０に記載の微生物。 １３．請求項１０に記載の微生物を適切な条件の下で培養し、該培養液から産生 されたＡＴムテインを分離することを含む、耐熱性が向上された請求項１記載の ヒトα１−抗トリプシンムテインの産生方法。 １４．ｐＧＡＴ１５で形質転換されたサッカロミケス・ジアスタチカス（Ｓａｃ ｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｄｉａｓｔａｔｉｃｕｓ ）ＹＩＹ３４５を培養し、該培 養液から産生されたムテインを分離することによって糖化されたヒトα１−抗ト リプシンムテインを産生することを特徴とする請求項１３に記載の方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ //(Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｒ 1:85） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:85） (72)発明者 ユー、ミョング−ヒー 大韓民国ソウル137―030・セオチョ―グ・ ジャムウォン―ドング 49―８・ハンカン グ アパートメント ３―1003 (72)発明者 クウォン、キ−サン 大韓民国テージョン305―333・ユセオング ―グ・オウン―ドング・ハンビットアパー トメント 130―1306 (72)発明者 リー、キー・ニュング 大韓民国テージョン305―333・ユセオング ―グ・オウン―ドング・ハンビットアパー トメント 105―1004 (72)発明者 シン、フワ・スー 大韓民国テージョン300―200・ドング― グ・ヨングジョング―ドング・シンドンガ アパートメント ３―303

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．野生型ヒトα１−抗トリプシンの５１番目、５６番目、５９番目、６８番目 乃至７０番目、３７４番目、３８１番目及び３８７番目アミノ酸中一つ以上が他 のアミノ酸で置換されたことを特徴とする野生型ヒトα１−抗トリプシンアミノ 酸配列を有した、耐熱性が向上されたヒトα１−抗トリプシンムテイン。 ２．下記アミノ酸置換中１つ以上が生じた請求項１に記載のヒトα１−抗トリプ シン： ５１番目のフェニルアラニンのシステイン、バリン、ロイシン、イソロイシン またはアラニンによる置換； ５６番目のセリンのアラニンによる置換； ５９番目のトレオニンのアラニンまたはセリンによる置換； ６８番目のトレオニンのアラニンによる置換； ６９番目のリジンのグルタミンによる置換； ７０番目のアラニンのグリシンによる置換； ３７４番目のメチオニンのイソロイシン、ロイシンまたはバリンによる置換； ３８１番目のセリンのアラニンによる置換；及び ３８７番目のリジンのアルギニンによる置換。 ３．Ｎ−末端の連続的な１１個のアミノ酸中１つ以上が削除されるか他のアミノ 酸で置換されたことを特徴とする請求項１に記載のヒトα１−抗トリプシンムテ イン。 ４．糖化されたことを特徴とする請求項１に記載のヒトα１−抗トリプシンムテ イン。 ５．野生型ヒトα１−抗トリプシンの５１番目のフェニルアラニン及び３７４番 目のメチオニンがそれぞれロイシン及びイソロイシンで置換さ れたことを特徴とする請求項１に記載のヒトα１−抗トリプシンムテイン。 ６．野生型ヒトα１−抗トリプシンの５９番目のトレオニン、６８番目のトレオ ニン及び７０番目のアラニンがそれぞれアラニン、アラニン及びグリシンで置換 されたことを特徴とする請求項１に記載のヒトα１−抗トリプシンムテイン。 ７．請求項１に記載のヒトα１−抗トリプシンムテインをコードするポリヌクレ オチド。 ８．請求項７に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。 ９．ｐＥＡＴ８１またはｐＧＡＴ１５の請求項８に記載の発現ベクター。 １０．請求項７に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された 微生物。 １１．大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）をｐＥＡＴ８１で形質転換することによって産 生された請求項１０に記載の微生物形質転換体（寄託番号ＫＣＴＣ ００７７Ｂ Ｐ）。 １２．サッカロミケス・ジアスタチカス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｄｉａ ｓｔａｔｉｃｕｓ ）ＹＩＹ３４５をｐＧＡＴ１５で形質転換することによって産 生された請求項１０に記載の微生物。 １３．請求項１０に記載の微生物を適切な条件の下で培養し、該培養液から産生 されたＡＴムテインを分離することを含む、耐熱性が向上された請求項１記載の ヒトα１−抗トリプシンムテインの産生方法。 １４．ｐＧＡＴ１５で形質転換されたサッカロミケス・ジアスタチカス（Ｓａｃ ｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｄｉａｓｔａｔｉｃｕｓ ）ＹＩＹ３４５を培養し、該培 養液から産生されたムテインを分離することによって糖化されたヒトα１−抗ト リプシンムテインを産生することを特徴とする請求項１３に記載の方法。