KR960015885B1 - 효모로부터 재조합 히루딘을 생산하는 방법 - Google Patents

Abstract

내용없음.

Description

효모로부터 재조합 히루딘을 생산하는 방법

제1도는 본 발명에 따라 히루딘 발현벡터 YEGα-HIR525를 함유하는 효모를 배양하는 동안 시간경과에 따른 효모생장량, 히루딘 생성량, 플라스미드 안정성, 배지내 갈락토스 농도 및 에탄올의 농도 변화를 나타낸 그래프이다.

본 발명은 효모로부터 재조합 히루딘을 생산하는 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 재조합 히루딘 유전자의 발현 시스템을 포함하고 있는 효모의 발효 조건을 최적화함으로써 재조합 히루딘의 생산량을 증가시키는 방법에 관한 것이다.

히루딘은 흡혈 거머리인 히루도 메디시날리스(Hirudo medicinalis)로부터 분리된 65개 또는 66개의 아미노산으로 이루어진 분자량 7,000 정도의 작은 단백질로 트롬빈의 활성을 특이적으로 저해하며(도트(Dodt)등, Biol. Chem, Hoppe-Seyler 367, 803(1986)), 아주 낮은 농도로 혈액 응고 기작의 마지막 단계인 피브리노겐이 피브린으로 활성화되는 단계를 차단시켜 혈액의 응고를 효과적으로 방지한다(마크와트(Markwardt), Meth, Enzymol. 19, 924(1970)). 이러한 히루딘은 지금까지 알려진 트롬빈 활성 저해제로서는 가장 강력하고 특이적인 활성을 지닌 것으로 보고되고 있으며(왈스만과 마크와트(Walsmann and Markwardt), Thromb. Res. 40, 563(1985)), 현재 임상적으로 사용하고 있는 헤파린과 같은 혈액 응고 억제제에 비하여, 출혈 부작용이 적고, 트롬빈에만 선택적으로 작용하며, 항트롬빈인자 Ⅲ등의 보조인자를 필요로 하지 않는 등 여러 장점을 지니고 있어 항혈전제제로 개발하기 위한 많은 연구가 진행되어 왔다(소여(Sawyer), Bio/Technol. 9, 513(1991) ; 세들락(Sedlak), Gen. Eng. News, Jan. 5, 1992 ; 파리드(Fareed)등, Blood Coagulation and Fibrinolysis 2, 135, (1991) ; 와이츠와 허쉬(Weitz and Hirsh), Ann. Rev. Med. 43, 9(1992) ; 마크와트(Markwardt), Seminars in Thrombosis and Hemostasis 15, 269(1989)).

-히루딘은 흡혈 거머리인 히루도 메디시날리스의 머리부분으로부터 분리되어진 이래(마크와트(Markwardt), Hoppe-Seylers Z. Physiol. Chem. 308, 147(1957)), 거머리의 몸 전체에 분포되어 있음이 밝혀졌다(베그디(Bagdy)등, Meth, Enzymol. 45, 669(1976)). 흡혈 거머리로부터 순수 분리된 히루딘으로는 11개가 밝혀져 있으며, 대부분 65 내지 66개의 아미노산으로 구성되어 있다. 아미노 말단 서열을 기준으로 검토하여 보면 두가지 부류로 구분될 수 있다. 그 하나인 히루딘 변종 1(Hirudin variant 1 ; 이하 HV1로 약함)은 발린-발린으로 시작하는 부류이고, 다른 하나인 히루딘 변종 2(Hirudin variant 2 ; 이하 HV2로 약함)는 이소로이신-트레오닌으로 시작되는 부류이다.

그러나 거머리로부터 추출할 수 있는 천연의 히루딘은 개체당 20㎍이하이기 때문에, 유전공학 기법을 이용한 히루딘의 생산이 필연적으로 요구될 수 밖에 없었다. 그 일보로서, HV2 아미노산 서열을 바탕으로 탐침을 제작하여 히루도 메디시날리스의 cDNA 라이브러리로부터 히루딘 cDNA가 클로닝되었다(하비(Harvey)등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 83, 1084(1986)).

대부분의 의학적인 가치가 있는 단백질이 유전공학 기법에 의해 대장균을 숙주세포로 이용하여 생산된 바와 같이, 히루딘도 대장균에서 발현되었으나(포트캄프(Fortkamp)등, DNA 5, 511(1986)), 대장균에서 발현된 히루딘은 단백질 분해에 의해 그 발현율이 매우 낮고(하비(Harvey)등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 83, 1084(1986) ; 버그만(Bergman)등, Biol. Hoppe-Seyler 367, 731(1986) ; 도트(Dodt)등, FEBS Letters 202, 373(1986), 천연 히루딘의 아미노 말단의 아미노산은 메티오닌이 아니므로 메티오닌으로 시작되는 대장균 발현 히루딘은 트롬빈 저해 활성이 상당히 낮은 점(로와송(Loison)등, Bio/Technol. 6. 72(1988)등의 문제점을 안고 있다.

아미노 말단의 아미노산 전기의 성분 및 서열은 토롬빈 저해 활성에 중요한 역할을 담당하며, 이들이 변형 또는 제거될 경우 상기 활성은 상당히 감소하게 된다(코트니(Courtney)등, Seminars in Thrombosis and Hemostasis 15, 288(1989)). 세포외로 분비시키는 시그널을 사용하는 경우에도 대장균 유래의 내독소나 발열 물질(pyrogen)로 오염될 수 있으며 이를 제거하는 공정이 추가되어야 한다(라에츠(Raez), Escherichiacoli and Salmonella typhymurium, ed. Neidhardt et al., 498(1987), American Society for Microbiology 출판).

따라서, 낮은 생산수율과 높은 생산 비용의 문제점을 해결하기 위하여 효모 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae)를 숙주로 이용하려는 연구가 진행되었다. 르와송(Loison)등 (대한민국 특허공개 제88-7727호 ; 대한민국 특허공개 제88-700234호 ; Bio/Technol. 6. 72(1988))은 PGK 프로모터와 교배인자 α의 프로모터를 발현 프로모터로 이용하였고, 메이하크(Meyhack)등 (대한민국 특허공개 제87-6185호 ; Genetics and Molecular Biology of Industrial Microorganisms, ed. Hershberger et al., p. 311-321(1989), American Society for Microbiology 출판)과 리르쉬(Liersch)등 (대한민국 특허공개 제86-381호 및 제87-6185호)은 발현 프로모터로 GAPDH, PH05 또는 이들의 하이브리드(hybrid) 프로모터를 사용하였다. 그러나 PGK, GAPDH, 교배인자 α의 프로모터등은 구성적 발현(constitutive expression)을 위한 프로모터이므로 히루딘 생산을 별도로 유도시킬 수 없으며, 배지내의 인산염 농도가 적을때에 발현되는 PH05 프로모터는 유도시기를 조절하기 어려운 단점이 있다.

또한 세포외로의 분비를 위해서 사용되는 분비 시그널로 효모 인버타제 혹은 산 포스파타제 유전자를 이용하였으나(메이하크(Meyhack)등, 대한민국 특허공개 제87-6185호 ; Genetics and Molecular Biology of Industrial Microorganisms, ed. Hershberger et al., p. 311-321(1989), American Society for Microbiology 출판 ; 리르쉬(Liersch)등, 대한민국 특허공개 제86-381호 및 제87-6185호), 효모세포외의 배지로 완전히 분비되는 비율이 저조하였다(쉐크만과 노비크(Schekman과 Novick), The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces, ed. Strathern et al., p. 361(1982), Cold Spring Harbor Laboratory 출판).

다만, 르와송(Loison)등 (대한민국 특허공개 제88-7727호 ; 대한민국 특허공개 제87-700234호 ; Bio/Technol. 6, 72(1988)이 사용한 교배인자 α의 분비 시그널의 경우, 배지로의 하루딘 분비는 만족스러웠으나, 그 생산량은 여전히 저조하였다.

이에 본 발명자들은 GAL1-GAL10 프로모터와 교배인자 α를 연결한 발현분비 시스템과 효모에서 많이 사용되는 코돈을 도입하여 합성한 HV2 히루딘 유전자를 연결하여서 숙주세포의 성장과 무관하게 히루딘 발현율이 우수하면서도 배지로의 히루딘 분비 또한 만족스러운 재조합 히루딘 유전자 발현벡터를 개발하여 대한민국 특허공개 제92-11007호로 출원한 바 있다.

본 발명자들은 더 나아가 상기 재조합 히루딘 유전자 발현벡터로 형질전환된 효모를 발효시켜서 그 생산성을 높이고자 연구하던 중, 히루딘의 생산은 효모의 생장곡선과 일치한다는 점을 확인하고 배양 조건 및 배양배지의 조성을 변화시켜 재조합 히루딘의 생산성을 2배 가까이까지 향상시킬 수 있음을 알게 되어 본 발명을 완성하였다.

이하 본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다.

본 발명은 GAL1-GAL10 프로모터와 교배인자 α를 연결한 발현분비 시스템을 갖는 재조합 히루딘 유전자 발현벡터로 형질전환된 효모를 발효배지에서 배양하여서 재조합 히루딘을 생산함에 있어, 상기 배지중에 갈락토스와 효모 추출물 및 카사미노산을 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 히루딘의 생산방법을 제공하는 것이다.

본 발명에서는, 특히 효모 추출물과 카사미노산의 함량을 적당히 조절하는 것이 중요하다. 본 발명자들의 실험에 따르면 배지중에 효모 추출물의 함량을 3 내지 6%, 바람직하게는 4% 정도로 조절하는 것이 적당한 것으로 나타났으며, 카사미노산의 함량은 0.2 내지 0.8%, 특히 0.5%가 적당하였다.

갈락토스는 배지중에서 그의 함량이 증가할수록 히루딘의 생산량도 증가하나 갈락토스의 양이 증가되면 에탄올의 생산량도 급격히 증가되어 효모 생장을 저해하기 때문에 배양 중간중간에 갈락토스를 공급하는 유가배양 방식을 채택하는 것이 바람직하다. 본 발명자들의 실험에 따르면, 최초 배지중에 갈락토스를 4%의 양으로 첨가한 후 갈락토스 함량이 2%를 유지하도록 배양도중에도 계속 공급했을때 히루딘 생산량이 가장 높은 것으로 나타났다.

그 밖에도 본 발명의 배지에는 황산암모늄((NH₄)₂SO₄), 인산칼륨(KH₂PO₄), 황산마그네슘(MgSO₄), 염화칼슘(CaCl₂), 트립토판(tryptophan), 비오틴(biotin)등이 추가로 첨가될 수 있다.

본 발명의 배지는 pH를 5.0 내지 6.0 정도, 특히 pH 5.4로 유지시키며, 배양방식은 통기성 조건에서 약 30℃를 유지하면서 진탕배양하는 것이 바람직하다.

이와 같은 본 발명의 방법은 갈락토스 프로모터와 교배인자 α 분비 시그널을 이용한 것을 특징으로 하는 재조합 히루딘 유전자 발현벡터로 형질전환된 효모로부터 히루딘을 생산하는 경우에 적용가능하며, 그러한 구체적인 효모로는 발현벡터 YEGα-HIR525로 사카로마이세스 세레비지에 2805(Met a pep4 : : HIS3prb-δcanI his3δ ura3-52)를 형질전환시켜서 얻어진 사카로마이세스 세레비지에 2805(YEGα-HIR525)(KCTC 8519P, 특허출원 제92-11007호 참조)와 발현벡터 YEGα-HIR5로 동일 효모를 형질전환시켜서 얻어진 사카로마이세스 세레비지에 2805(YEGα-HIR5)(KCTC 8518P, 특허출원 제92-11007호 참조)가 있다.

이하 본 발명을 실시예에 의거하여 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 예시하는 것으로 본 발명이 여기에 국한되는 것은 아니다.

본 발명의 실시예에서는 특별한 언급이 없는 한 다음의 사항을 따른다.

[실험균주 및 플라스미드원]

플라스미드 YEGα-HIR525를 단백분해 효소가 결핍된 돌연변이 효모 균주인 사카로마이세스 세레비지에 2805(Mat a pep4 : : HIS3 prb1-δ his3δ ura3-52) 균주에 리튬이온방법(기이츠 및 쉬이스트(Gietz & Schiest), Yeast 7, 253(1991)으로 형질전환 시켜서 얻은 균주인 사카로마이세스 세레비지에(YEGα-HIR525)(KCTC 8519P)를 사용하였다.

[배지조성]

YPD 액체배지(효모 추출물 1%, 펩톤 2%, 포도당 2%)를 기본으로 하여, 포도당에서는 히루딘의 발현이 억제되므로 탄소원으로는 갈락토스만을 사용하였고, 질소원으로는 효모 추출물을 기본적으로 사용하고 추가 질소원으로 카사미노산, 엔지 아민, 카제인 펩톤 및 폴리 펩톤을 사용하여 히루딘 생성량을 비교하였다.

상기 배지 조성은 대한민국 특허공개 제92-11007호에서 사용하였던 배지, 즉 1X UraGlu 또는 1X UraGal 배지(아미노산이 결핍된 효모 질소 기질 6.7g, 황산 아데닌 200mg, 1M K₂HPO₄10ml, 혼합 아미노산 0.7g 및 포도당 또는 갈락토스 20g/리터, pH 5.8) 및 2X UraGal 배지(아미노산이 결핍된 효모 질소 기질 8.5g, 황산 아데닌 400mg, 황산아연 30mg, FeCl₃40mg, 혼합 아미노산 2g, 숙신산 10g, NaOH 5g 및 포도당 또는 갈락토스 40g/리터, pH 5.4)의 조성과 차이가 크다.

[효모 생장량의 측정방법]

효모의 배양액을 600nm에서의 흡광도가 0.5 이하가 되도록 증류수로 희석하여 흡광분광분석기(Kontron Instrument, 미국)를 이용하여 600nm에서의 흡광도를 측정하였다.

[갈락토스의 정량법]

효모의 배양액을 6000xg로 5분 동안 원심분리하여 세포를 제거하고 상등액을 증류수로 20배 희석한 후 그중 100㎕를 시험관에 넣고 1ml의 DNS 용액(리터당, 디니트로살리실산 1g, 나트륨 칼륨 타르트레이트 300g, NaOH 16g)을 첨가하여 섞은 다음 100℃에서 10분간 처리하고 실온에서 식힌 후 흡광분광분석기(Kontron Instrument, 미국)를 이용하여 570nm에서의 흡광도를 측정하고 표준치와 비교하여 갈락토스를 정량하였다.

[에탄올의 정량법]

에탄올의 정량은 가스크로마토그라프(Hewlett Packard, 미국)를 이용하였다. 운반 기체로는 질소(40psi)를 이용하였고 불꽃 이온화 검출기(FID)에는 수소와 압축공기를 각각 20psi와 40psi로 공급하였다. 오븐 온도는 170℃, 검출기와 주입기 온도는 공히 200℃로 하였다. 효모의 배양액을 6000xg로 5분 동안 원심분리하여 세포를 제거하고 상등액을 증류수로 10배 희석한 후 이중 2㎕를 가스크로마토그라프에 주입하여 나타난 크로마토그램의 면적을 표준치와 비교, 정량하였다.

[항트롬빈 역가의 측정 및 히루딘의 정량법]

효모 배양액에서의 트롬빈 억제 활성의 측정을 위하여 배양액을 6000xg에서 5분 동안 원심분리하여 세포를 제거한 후 트롬빈 억제 활성 측정 반응용액(0.1M 트리스 염산, pH 8.0, 0.12M NaCl, 0.01% 아지드화나트륨, 0.1% 소혈청 알부민)으로 적당한 배율로 연속 희석하였다. 또한, 상기 반응용액에 시그마사의 인체트롬빈(T8885)을 희석시켜 0.6 NIH-U/ml로 만들고, 기질인 크로모짐(Chromozym Th ; Boehringer Mannheim사 제품)도 역시 반응용액에 녹여 200μM로 만들었다. 트롬빈 50㎕와 적정 배율로 희석된 시료 또는 반응 용액 50㎕를 섞어 37℃에서 10분 동안 충분히 섞어준 후, 기질 100㎕를 첨가한 즉시 마이크로 플레이트 리더(THERMOmax, Molecular Divices사)를 사용하여 15초 간격으로 5분 동안 405nm에서 흡광도를 측정했다. 히루딘 활성은 트롬빈 활성에 대응하는 AT-U(antithrombin units)로 표현된다. 트롬빈은 NIH-U으로 표준화되어 있어, 1 AT-U는 트롬빈 1 NIH-U의 활성을 완전히 저해하는 히루딘의 양을 의미한다. 실질적으로 토롬빈 저해역가는 일정양의 트롬빈과 항트롬빈제를 섞은 후 남아 있는 트롬빈의 활성을 측정하여 총 사용된 트롬빈이 갖는 활성에서 이 남아 있는 활성을 제하고 남은 값으로부터 히루딘(Accurate Chemical & Scientific Corporation사로부터 구입)을 표준으로 사용하여 표준곡선을 작성하여 트롬빈 저해 역가를 계산하였다. 트롬빈 저해역가를 이용하여 효모에 의해 생산된 히루딘의 족사카로마이세스 세레비지에 2805(YEGα-HIR525)(KCTC 8519P) 균주에 의해서 생성된 히루딘의 비활성(specific activity)이 13,000 AT-U/mg(Sohn 등, J. Microbiol. Bitechnol. 1, 266, 1992)인 것에 따라 AT-U를 mg으로 환산하였다.

[플라스미드 안정성 확인법]

효모의 배양액을 멸균 증류수로 적정 배율로 희석한 다음 YPD 한천배지(효모 추출물 1%, 펩톤 2%, 포도당 2%, 한천 2%)에 도말하여 30℃에서 3일간 배양한 후 나타난 콜로니를 다시 영양배지인 YPD 한천배지와 최소배지인 YCAD 한천배지(아미노산이 결핍된 효모 질소 기질 0.67%, 카사미노산 0.5%, 포도당 2%, 한천 2%)에 각각 옮겨 다시 30℃에서 3일간 배양한 후 나타난 콜로니를 서로 비교하였다.

[참조예 1]

[배지중 추가 질소원의 선별]

사카로마이세스 세레비지에 2805(YEGα-HIR525)(KCTC 8519P)를 배양액 100ml가 담긴 배플달린 플라스크(baffled flask)내에서 30℃에서 140rpm으로 48시간 동안 진탕 배양하였다. 완충 최소배지(아미노산이 결핍된 효모 질소 기질 0.85%, 갈락토스 4%, 10mM 숙신산, NaOH 4g/리터, pH 5.4)에 추가 질소원으로 카사미노산, 카제인 펩톤, 엔지 아민 및 폴리 펩톤을 각각 0.5% 첨가하여 배양한 결과를 표 1에 나타내었다. 표 1에 나타난 바와같이 카사미노산을 이용하였을 때의 효모 생장량 및 히루딘 생성량이 가장 높았다. 따라서 추가 질소원으로는 카사미노산이 적당한 것으로 나타났다.

[표 1]

[참조예 2]

[배지중 카사미노산의 함랑에 따른 히루딘 생성량의 비교]

사카로마이세스 세레비지에 2805(YEGα-HIR525)를 배지 100ml가 담긴 배플달린 플라스크(baffled flask)내에서 30℃에서 140rpm으로 48시간 동안 진탕 배양하였다. 10mM 숙신산을 첨가하여 배지의 초기 pH가 5.4가 되도록 조절하였다. 효모 추출물과 갈락토스의 함량을 각각 1% 및 4%로 고정하고, 카사미노산을 0.5, 1, 1.5, 2%로 조절하였다. 배양이 끝난 후 효모의 생장량과 히루딘의 생성량을 측정하여 그 결과를 표 2에 나타내었다.

표 2에 나타난 바와같이 카사미노산의 증가에 따라 효모 생장량은 감소하였고, 히루딘의 생성량도 감소하였다. 따라서 카사미노산은 0.5% 첨가하는 것이 특히 바람직하다는 것을 확인하였다.

[표 2]

[참조예 3]

[배지중 효모 추출물 함량에 따른 히루딘 생성량의 비교]

상기 참조예 1에서와 동일한 방법으로 배양하되, 배지중 갈락토스의 양과 카사미노산의 양을 각각 4%와 0.5%로 고정하고, 효모 추출물의 양을 0.5, 1, 1.5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 10%로 조절하였다. 효모 생장량 및 히루딘 생성량 측정 결과를 다음 표 3에 나타내었는 바, 효모 추출물의 배지내 함량이 4%일때까지 효모의 생장량 및 히루딘 생성량은 증가하였고, 5% 이상에서는 서서히 감소하였다. 따라서, 효모 추출물은 3 내지 6% 정도의 양으로 포함시키는 것이 바람직하며, 특히 4%의 양으로 포함시켰을때 가장 바람직한 결과를 얻을 수 있음을 확인하였다.

[표 3]

[참조예 4]

[배지중 갈락토스 함량에 따른 히루딘 생성량의 비교]

상기 참조예 1에서와 동일한 방법으로 효모를 배양하되, 배지중 효모 추출물 및 카사미노산의 양을 각각 4% 및 0.5%로 고정하고, 갈락토스를 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8 및 10%로 첨가하였다. 48시간 동안 배양한 후, 효모 생장량, 히루딘 생성량 및 에탄올 생성량을 조사하여 그 결과를 표 4에 나타내었다. 표 4에서 보는 바와같이 1 내지 3%의 양으로 첨가하였을 때에는 에탄올의 생성농도는 낮으나 36시간 이내에 갈락토스가 고갈되어 효모의 생장량 및 히루딘 생성량이 더이상 증가하지 않았다. 반면, 갈락토스 6% 이상에서는 과량의 에탄올이 생성되었고 이로 인하여 세포의 성장이 저해되어 히루딘 생성량도 저조하였다. 갈락토스를 4 내지 5%, 특히 4%를 첨가하였을 때에는 효모의 생장량 및 히루딘 생성량은 높고 에탄올의 생성량은 낮았다. 갈락토스를 4%로 첨가하였을 때에는, 48시간 배양후에 효모 생장량은 OD_600nm72.2이고, 이때 히루딘 생성량은 69.7mg/L이었다. 따라서, 600nm에서의 흡광도에서 O.D.1에 해당하는 효모로부터 965㎍의 재조합 히루딘을 얻었다.

이렇게, 48시간 배양후에는 갈락토스의 함량이 높을수록 효모 생장량은 증가하나 에탄올의 생성량도 급격히 증가하여 히루딘 생성량은 갈락토스 함량 5% 이상에서 오히려 감소하므로 갈락토스 함량은 4%가 적합하다.

[표 4]

[참조예 5]

[갈락토스 유가배양방식에 의한 히루딘의 생산]

상기 참조예 1에서와 동일한 방법으로 효모를 배양하되, 효모 추출물 및 카사미노산의 배지중 함량을 각각 4% 및 0.5%로 고정하고, 갈락토스 함량의 증가에 따른 에탄올 생성을 방지하기 위해 배양후 24시간이 경과한 뒤부터 12시간마다 2%의 갈락토스를 첨가하였다. 그 결과 84시간 후의 효모 생장량은 OD_600nm103.4이고, 이때 히루딘의 생성량은 125.9mg/L이고 에탄올의 생성량은 8.3g/L였다. 따라서, 600nm에서의 흡광도에서 O.D.1에 해당하는 효모로부터 127㎍의 재조합 히루딘을 얻었다.

[실시예]

4% 효모 추출물, 0.5% 카사미노산, 4% 갈락토스를 포함하고, 10mM 숙신산으로 초기 pH는 5.4가 되도록 조절한 배지 2리터를 3리터 용량의 발효조(New Brunswick Scientific사, 미국)에 가한 후, 여기에 사카로마이세스 세레비지에 2805(YEGα-HIR525)를 접종하여, 30℃에서 900rpm의 속도로 교반하고 분당 2리터의 속도로 통기하며 배양하였다. 배양 24시간 후부터 배지내의 갈락토스양을 정량하면서 2% 이상의 농도가 유지되도록 50% 갈락토스 수용액을 첨가하였다. 이때의 배양시간에 따른 세포 생장량, 히루딘 생성량, 에탄올 생성량 및 플라스미드 안정성을 측정하여 제1도에 나타내었다. 제1도에 나타낸 바와같이 38시간 후의 효모 생장량은 OD_600nm130이며, 이때 히루딘 생성량은 158mg/L이었다. 따라서 600nm에서의 흡광도에서 O.D.1에 해당하는 효모로부터 1215㎍의 재조합 히루딘을 얻었다. 또한 배양중에 플라스미드의 안정성도 85% 이상으로 높게 유지되었으며 불필요한 부산물인 에탄올은 비교적 낮은 농도로 생성된 후 다시 소모되었다.

이상의 결과로부터 알 수 있는 바와같이 사카로마이세스 세레비지에 2805(YEGα-HIR525)(KCTC 8519P)를 갈락토스 4%, 효모 추출물 4%, 카사미노산 0.5%를 기본배지로 하고 갈락토스를 2% 수준에서 유가배양할때, 600nm에서의 흡광도에서 O.D.1에 해당하는 효모당 700㎍(특허출원 제92-11007호의 실시예 5 참고)이던 기존의 하루딘 생산성을 같은 조건에서 측정하였을때 O.D.1에 해당하는 효모당 1215㎍으로 증가시킬 수 있었다.

Claims (7)

1. GAL1-GAL10 프로모터와 교배인자 α의 분비 시그날을 연결한 발현 분비시스템을 갖는 재조합 히루딘 유전자 발현벡터로 형질전환된 호모를 배양하여 재조합 히루딘을 생산함에 있어서, 상기 효모를 갈락토스와 효모 추출물 및 카사미노산을 포함하는 배지에서 배양함을 특징으로 하는 재조합 히루딘의 생산방법.
2. 제1항에 있어서, 상기 배지가 4%의 갈락토스, 3 내지 6%의 효모 추출물, 0.2 내지 0.8%의 카사미노산을 포함하는 것임을 특징으로 하는 방법.
3. 제2항에 있어서, 상기 배지가 4%의 갈락토스, 4%의 효모 추출물 및 0.5%의 카사미노산을 포함하는 것임을 특징으로 하는 방법.
4. 제1항 내지 제3항중 어느 한항에 있어서, 상기 갈락토스를 초기 배지에 함유시키며 배양 도중에 첨가시키는 방법.
5. 제4항에 있어서, 상기 배지에서의 배양 도중에 전체 배지중의 갈락토스의 농도가 2% 이상으로 유지되도록 유가배양하는 방법.
6. 제1항에 있어서, 상기 효모가 사카로마이세스 세레비지에 2805(YEGα-HIR525)(KCTC 8519P)인 방법.
7. 제1항에 있어서, 상기 효모가 사카로마이세스 세레비지에 2805(YEGα-HIR5)(KCTC 8518P)인 방법.