DE69429512T2

DE69429512T2 - Thermoresistente alpha-1-antitrypsinmütante

Info

Publication number: DE69429512T2
Application number: DE69429512T
Authority: DE
Inventors: Ki-Sun Kwon; Kee Nyung Lee; Hwa Soo Shin; Myeong-Hee Yu
Original assignee: Korea Green Cross Corp; Korea Institute of Science and Technology KIST
Current assignee: Korea Green Cross Corp; Korea Institute of Science and Technology KIST
Priority date: 1993-05-18
Filing date: 1994-05-17
Publication date: 2002-08-01
Anticipated expiration: 2014-05-18
Also published as: US5817484A; JP2768557B2; CA2163081A1; EP0701570B1; JPH08509865A; CA2163081C; DE69429512D1; EP0701570A1; WO1994026781A1

Description

Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Mutein von α-1-Antitrypsin (im folgenden als "AT" bezeichnet) mit erhöhter Thermoresistenz und ein Verfahren zu dessen Herstellung.
Konkreter betrifft die vorliegende Erfindung ein AT-Mutein mit erhöhter Thermoresistenz unter Beibehaltung seiner Aktivität, wobei mindestens eine Aminosäure eines Wildtyp-AT durch einen anderen Aminosäurerest ersetzt ist, ein Polynukleotid, das für das AT kodiert, einen Vektor, der das Polynukleotid umfaßt, einen Mikroorganismus, der mit dem Vektor transformiert ist, und ein Verfahren zur Herstellung von AT mit erhöhter Thermoresistenz unter Verwendung des Mikroorganismus.

Beschreibung des Standes der Technik

Die Stabilität eines Proteins ist für die Aufrechterhaltung seiner Funktion essentiell, da sie die Lebensdauer in vivo und die Lagerungszeit des Proteins bestimmt.
Dementsprechend ist es für ein therapeutisches Agens oder diagnostisches Reagens, das Proteine umfaßt, wünschenswert, eine verbesserte Stabilität für dessen kommerzielle Anwendung zu haben.
Nachdem die herkömmlichen proteinhaltigen therapeutischen Agenzien, die aus dem menschlichen Körper isoliert und gereinigt wurden, solche Probleme wie die Begrenztheit der Ressourcen und die Verunreinigung durch verschiedene infektiöse Agenzien, z. B. AIDS- oder Hepatitis-Virus, beinhalten, wurden viele Versuche unternommen, die therapeutischen Agenzien durch Anwendung einer rekombinanten DNA-Technologie herzustellen. Nachdem jedoch die Proteine, welche durch Anwendung dieser Technologie hergestellt wurden, im Vergleich zu den aus dem menschlichen Körper isolierten Proteinen im allgemeinen eine niedrigere Stabilität aufweisen, tendiert deren Lebensdauer dazu, deutlich verringert zu sein, wenn sie dem menschlichen Körper verabreicht werden. Zur Bewältigung eines solchen Stabilitätsproblems wurden zwei Ansätze untersucht: einer besteht darin, ein vollständig glycosyliertes Protein wie in seiner natürlichen Form herzustellen, basierend auf der Tatsache, daß die Abnahme der Stabilität auf fehlende oder unzureichende Glycosylierung des Proteins in einem Mikroorganismus zurückzuführen ist, und der andere besteht darin, ein rekombinantes Protein mit erhöhter Stabilität herzustellen, jedoch die Aktivität beizubehalten, indem die Aminosäuresequenz des Proteins modifiziert wird.
In diesem Zusammenhang ist bekannt, daß die Thermoresistenz eines Proteins in enger Beziehung zu seiner Stabilität gegen Denaturierung steht (siehe Pace, Trends in Biotechnology, 8, 93-98 (1990)).
Andererseits wird AT in Leberzellen synthetisiert und dann in das Blut sekretiert und wird zusammen mit vielen Inhibitoren von Serinproteasen, wie z. B. Trypsin, Chymotrypsin, Elastase, Collagenase, Thrombin oder Plasmin, in die Serpin-Familie eingeordnet. AT ist ein Glycoprotein mit einem Molekulargewicht von 52 kD und wirkt physiologisch als Inhibitor von Elastase in Neutrophilen. Insbesondere schützt es elastische Fasern, die in Alveoli pulmonis vorliegen, vor dem Abbau durch die Neutrophilen-Elastase.
Verschiedene genetische Defekte bezüglich der Fähigkeit, AT zu produzieren, sind wohlbekannt (siehe Carrell et al., Mol. Biol. Med., 6, 35-42 (1982)). Aufgrund der genetischen Defekte ist die Konzentration von AT im Blutplasma verringert, so daß das Gleichgewicht zwischen einer Protease und deren Inhibitoren gestört ist, wodurch die Lunge ihre Elastizität verliert und Emphyseme auftreten können (Gadek und Crystal, in Metabolic Basis of Inherited Disease, Stanbury et al., Hrsg., McGraw-Hill, New York, S. 1450-1467). Ferner können Emphyseme das Ergebnis einer Inaktivierung von AT aufgrund übermäßigen Rauchens oder schwerer Umweltverschmutzung sein.
Für die Behandlung dieser Störungen ist der Bedarf nach AT daher stark gestiegen und das aus menschlichem Blut isolierte AT konnte diesen Bedarf nicht stillen. AT könnte auch zur Behandlung des akuten Schocksyndroms eingesetzt werden (Robin W. Carrell, Biotechnolopy and Genetic Enaineering Reviews, 4, 291-297 (1986)). Das Schocksyndrom wird bekanntermaßen von der Störung eines Gleichgewichts zwischen Plasma-Serpinen und -Proteasen aufgrund einer plötzlichen massiven Freisetzung von Neutrophilen-Elastase verursacht.
Die Nukleotidsequenz eines für AT kodierenden Gens war bereits bekannt (Long et al., Biochemistrv, 23, 4828 (1984)) und das AT-Gen wurde in Escherichia coli (Bollen et al., FEBS Lett., 166, 67 (1984); Courtney et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 669 (1984); Tessier et al., FEBS Lett., 208, 183 (1986); Johnsen et al., Mol. Biol. Med., 4, 291 (1987); Sutiphong et al., Mol. Biol. Med., 4, 307 (1987); Lee und Yu, Kor. J. Biochem., 22, 148 (1989); und Lee et al., Molecules and Cells, 3, 71-74 (1993)) und in Hefe (Travis et al., J. Biol. Chem., 260, 4384 (1985); Rosenberg et al., Nature, 312, 77 (1984); Cabezon et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 6594 (1984); Moir et al., Gene, 56, 209 (1987); Kim et al., Kor. J. Biochem., 23, 263 (1990); und Kim et al., Kor. J. Microbiol., 30, 108 (1992)) kloniert und exprimiert.
Es wurde auch berichtet, daß AT modifiziert werden kann, um entweder einen Inhibitor einer anderen Serinprotease als Elastase darzustellen oder eine erhöhte Oxidationsbeständigkeit aufzuweisen, indem der Methioninrest an Position 358, der Rest an der aktiven Stelle, durch Anwendung von stellenspezifischer Mutagenese durch einen anderen Aminosäurerest ersetzt wird (Rosenberg et al., Nature, 312, 77-80 (1984); Courtney et al., Nature, 313, 149-151 (1985); Barr et al., US-Patent Nr. 4,732,973; Insley et al., US- Patent Nr. 4,711,848). Ferner wurde auch berichtet, daß ein in Hefe produziertes nichtglycosyliertes AT eine niedrige Thermoresistenz in vitro besitzt und diese Verringerung der Thermoresistenz eng mit der Verringerung der Halbwertszeit in vivo korreliert ist (Travis et al., J. Biol. Chem., 260, 4384 (1985)); und ein in Hefe produziertes glycosyliertes Wildtyp-AT wurde ebenfalls befunden, eine niedrige Thermoresistenz aufzuweisen. Die Korrelation zwischen der Struktur und der Funktion von AT wurde von Huber und Carrell (Biochemistrv, 28, 8951-8963 (1989)) gut belegt.
Chemical Abstracts, Bd. 110, Nr. 19, 1989, Seite 225, beschreibt die Veränderung der aktiven Stelle von α-1-AT durch den Ersatz von Methionin 358 durch Arginin, was zu einer erhöhten Thrombin-Inhibierungsrate führt. Die Veränderung von zwei zusätzlichen Resten erhöht diese Rate nicht weiter. Die resultierenden beiden ATe sind beide unglycosyliert und haben kürzere in vivo-Halbwertszeiten als Human-α-1-AT.
Die α-1-Antitrypsin-Varianten in Chemical Abstracts, Bd. 104, Nr. 3, 1986, Seite 156, zeigen entweder oxidationsbeständige Antielastase-Aktivität oder wirkungsvolle Thrombin-Inhibierungsfähigkeiten.
Keine dieser Druckschriften befaßt sich jedoch mit der erhöhten Thermoresistenz, welche durch die speziellen Aminosäureaustausche in der vorliegenden Erfindung verursacht wird.

Zusammenfassung der Erfindung

Dementsprechend besteht eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung darin, ein mutagenisiertes rekombinantes AT ("AT-Mutein") mit höherer Thermoresistenz und thermodynamischer Stabilität bereitzustellen.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung eines Polynukleotids, welches für das AT-Mutein kodiert.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung eines Vektors, der das Gen umfaßt, und einer mit dem Vektor transformierten Wirtszelle.
Eine noch weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung eines Verfahrens zur Herstellung des AT-Muteins mit erhöhter Thermoresistenz durch Einsatz der Transformante.
Gemäß einem Aspekt der vorliegenden Erfindung werden AT-Muteine bereitgestellt, bei denen mindestens eine der 51., der 56., der 59., der 68. bis 70., der 374., der 381. und der 387. Aminosäure eines Wildtyp-AT durch eine andere Aminosäure ersetzt ist.

Kurzbeschreibung der Zeichnungen

Die obigen Aufgaben und Merkmale der vorliegenden Erfindung werden aus der folgenden Beschreibung bevorzugter Ausführungsformen in Verbindung mit den Begleitzeichnungen ersichtlich werden, worin:
Fig. 1 die Aminosäuresequenz eines repräsentativen Wildtyp-AT zeigt;
Fig. 2 eine Fotografie ist, welche das Ergebnis einer SDS (Natriumdodecylsulfat)- Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) mit einem 12%igen Gel von Proben zeigt, die den Schritten der Isolierung und Reinigung des AT-Muteins aus einer E. coli-Kultur entnommen wurden;
Fig. 3 ein Diagramm ist, welches das Ergebnis thermischer Inaktivierungsexperimente bei 57ºC für Wildtyp-AT und Mutanten-AT, exprimiert in E. coli, und aus Human- Plasma isoliertem AT zeigt;
Fig. 4 ein Diagramm ist, welches das Ergebnis einer quantitativen Analyse von Proteinen mit hohem Molekulargewicht, die während der Lagerung von AT bei 55ºC gebildet werden, durch eine Gelpermeationschromatographie zum Vergleich der Aggregationen des Wildtyp-AT und des thermoresistenten AT-Muteins, bei dem der 51. Aminosäurerest Cystein ist, zeigt;
Fig. 5 eine Fotografie ist, welche das Ergebnis einer SDS-PAGE mit einem 12%igen Gel von Proben zeigt, die den Schritten der Isolierung und Reinigung der AT-Muteine aus einer Hefekultur entnommen wurden;
Fig. 6 eine Fotografie ist, welche durch eine SDS-PAGE mit einem 12%igen Gel erhalten wurde, welche die Änderung des Molekulargewichts von AT nach dessen Behandlung mit einer Endoglycosidase zeigt, um zu bestätigen, ob das in Hefe produzierte AT-Mutein glycosyliert wurde;
Fig. 7 ein Diagramm ist, welches den Vergleich der thermischen Inaktivierungsraten bei 58ºC von AT-Mutein, das in Hefe produziert wurde, dem Human-Plasma-AT und dem in E. coli produzierten AT-Mutein darstellt; und
Fig. 8 ein Diagramm ist, welches das Ergebnis eines thermischen lnaktivierungsexperiments für die in E. coli exprimierten Einfach- und Mehrfachmutanten-AT zeigt.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung

Ein thermoresistentes AT-Mutein, das gemäß der vorliegenden Erfindung hergestellt wurde, besitzt eine Aminosäuresequenz, bei der mindestens eine der 51., der 56., der 59., der 68. bis 70., der 374., der 381. und der 387. Aminosäure eines Wildtyp-AT durch eine andere Aminosäure ersetzt ist. Bevorzugte thermoresistente AT-Muteine sind diejenigen, bei denen mindestens eine der folgenden Aminosäuresubstitutionen der Wildtyp-AT- Aminosäuresequenz vorkommt:
Phenylalanin Nr. 51 durch Cystein, Valin, Leucin, Isoleucin oder Alanin,
Serin Nr. 56 durch Alanin,
Threonin Nr. 59 durch Alanin oder Serin,
Threonin Nr. 68 durch Alanin,
Lysin Nr. 69 durch Glutamin,
Alanin Nr. 70 durch Glycin,
Methionin Nr. 374 durch Isoleucin, Leucin oder Valin,
Serin Nr. 381 durch Alanin und
Lysin Nr. 387 durch Arginin.
Von den Einfachmutanten-AT, bei denen nur eine dieser Aminosäuresubstitutionen durchgeführt ist, sind diejenigen am meisten bevorzugt, bei denen der 51. Rest Cystein ist und bei denen der 374. Rest Isoleucin ist. Diese Einfachmutanten-AT besitzen eine längere (zehnfach oder mehr) Halbwertszeit als das Wildtyp-AT, wenn sie als unglycosylierte Form in E. coli produziert werden, und besitzen eine viel höhere Thermoresistenz, wenn sie als glycosylierte Form in Hefe produziert werden.
Ein beispielhaftes Mehrfachmutanten-AT mit zwei oder mehr dieser Aminosäuresubstitutionen kann dasjenige sein, bei denen der 51. und der 374. Rest durch Leucin bzw. Isoleucin ersetzt sind, der 59., der 68. und der 70. Rest durch Alanin, Alanin bzw. Glycin ersetzt sind, und der 381. und der 387. Rest durch Alanin bzw. Arginin ersetzt sind. Die Mehrfachmutanten-ATe weisen eine deutlich erhöhte Thermoresistenz gegenüber dem Einfachmutanten-ATen auf. Ferner kann, wenn die Mutanten-ATe glycosyliert sind, deren Thermoresistenz stärker erhöht sein.
Die Aminosäuresequenz des thermoresistenten AT ist mit Ausnahme des bzw. der wie oben ersetzten Aminosäurerests/e mit derjenigen des Wildtyp-AT identisch. Ein repräsentatives Wildtyp-AT in der vorliegenden Erfindung kann die in Fig. 1 gezeigte Aminosäuresequenz besitzen. Subtypen, bei denen mindestens einer des 101., des 204., des 213., des 223., des 341., des 363. und des 376. Rests in der Sequenz von Fig. 1 durch Arginin, Lysin, Alanin, Cystein, Asparagin, Lysin bzw. Glutaminsäure ersetzt ist, kann in der Wildtyp-Kategorie eingeschlossen sein. Das Wildtyp-AT, welches in der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden kann, kann irgendeines der obigen Wildtyp-ATe sein und mindestens einer der ersten 11 aufeinanderfolgenden Aminosäurereste des Wildtyp-AT kann ohne eine signifikante Veränderung seiner Aktivität deletiert oder durch eine andere Aminosäure ersetzt sein.
Ferner kann, falls AT in E. coli produziert wird, Met der N-terminalen Aminosäure in der Aminosäuresequenz von AT hinzugefügt oder dagegen ausgetauscht werden, was ebenfalls von dem "Wildtyp-AT" im Rahmen der Definition dieser Patentbeschreibung umfaßt wird.
Dementsprechend werden AT-Muteine, die auf Basis irgendwelcher der Aminosäuresequenzen für die obigen Wildtyp-ATe hergestellt werden, vom Umfang der vorliegenden Erfindung umfaßt. Jedoch erfolgt unabhängig von der Deletion oder Addition von (einer) Aminosäure(n) die Zählung der Aminosäuren in der Aminosäuresequenz von AT auf Grundlage der in Fig. 1 angegebenen Nummern.
Das thermoresistente AT der vorliegenden Erfindung kann entweder durch ein Verfahren, welches das Transformieren einer Wirtszelle mit einem Vektor, der ein für das AT-Mutein kodierendes Polynukleotid aufweist, welches durch Anwendung einer stellenspezifischen Mutagenese hergestellt ist, und die Expression des Polynukleotids von der Transformanten umfaßt, oder durch eine chemische Synthese der Aminosäuren hergestellt werden.
Ein Polynukleotid, das für das thermoresistente AT-Mutein der vorliegenden Erfindung kodiert, kann entweder durch ein bekanntes chemisches Syntheseverfahren oder durch Modifizierung einer cDNA eines Wildtyp-AT, beispielsweise mit Hilfe eines Verfahrens stellengerichteter Mutagenese, hergestellt werden.
Andererseits ist bekannt, daß aufgrund der Codon-Degeneration mehrere unterschiedliche Codons, die für eine Aminosäure kodieren, vorliegen können und deshalb kann das für dieselbe Aminosäuresequenz kodierende Gen unterschiedliche Nukleotidsequenzen aufweisen.
Das Polynukleotid, welches für das AT-Mutein der vorliegenden Erfindung kodiert, kann exprimiert werden, indem ein geeignetes, im Stand der Technik wohlbekanntes prokaryotisches oder eukaryotisches Expressionssystem eingesetzt wird (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory Press, USA (1989)).
Die Expression kann im Falle eines nicht-glycosylierten AT vorzugsweise in einem Escherichia coli wie z. B. E. coli BL21(DE3), E. coli JM109(DE3) oder E. coli NM522, und im Falle eines glycosylierten AT vorzugsweise in Hefe, wie z. B. Saccharomyces cerevisiae oder Saccharomyces diastaticus, durchgeführt werden.
Geeignete Vektorsysteme, welche zur Expression in E. coli und Hefe eingesetzt werden können, werden von Sambrook, oben, und von Fiers in "Proced. Bth Int. Biotechnology Symposium", Soc. Frac. de Microbiol., Paris (Durand et al., Hrsg.), S. 680- 697 (1988), beschrieben.
Die Transformation einer Wirtszelle mit dem genannten Expressionsvektor kann durchgeführt werden, indem irgendeines der herkömmlichen Verfahren (Sambrook et al., oben, und Ito et al., J. Bacteriol., 153, 163 (1983)) angewandt wird. Wenn E. coli als Wirtszelle eingesetzt wird, wird eine kompetente Zelle, die zur Aufnahme einer Vektor-DNA imstande ist, hergestellt und dann gemäß dem im Stand der Technik bekannten CaCl&sub2;- Verfahren behandelt. Die Transformation von Hefe kann durchgeführt werden, indem zuerst die Wirtszelle in Form eines Sphäroplasten vorbereitet wird und dann ein im Stand der Technik bekanntes Verfahren, wie z. B. die in den obigen Referenzen beschriebenen, angewandt wird.
Im allgemeinen wird der Wirts-Mikroorganismus, der einen gewünschten Expressionsvektor enthält, unter optimalen Bedingungen kultiviert, um die Produktion des gewünschten Proteins zu maximieren. Beispielsweise wird E. coli BL21 (DE3), transformiert mit einem Vektor, der ein Ampicillinresistenz-Gen als Selektionsmarker enthält, bei 37ºC in LB-Medium (hergestellt durch Lösen von 10 g Bacto-Trypton, 5 g Bacto-Hefeextrakt und 10 g NaCl in 1 l Wasser) mit Ampicillin kultiviert. In Falle von Hefe kann die Kultivierung unter optimalen Wachstumsbedingungen wie von Sherman et al. (Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor, N. Y., U. S. A.) beschrieben durchgeführt werden.
Nach der Kultivierung der Transformante kann das gewünschte AT gewonnen und durch Anwendung irgendeines der im Stand der Technik bekannten Verfahren oder einer Kombination davon gereinigt werden.
Beispielsweise kann das in den transformierten E. coli exprimierte AT-Mutein durch Extraktion aus der Zellkultur oder durch Aufbrechen der Zellen gemäß irgendeinem in der Proteinchemie bekannten geeigneten Verfahren gewonnen werden. Zur Reinigung des AT- Muteins kann beispielsweise das in der offengelegten koreanischen Patentveröffentlichung Nr. 93-686 beschriebene Verfahren eingesetzt werden. Das heißt, die Kultur der E. coli- Transformante wird zentrifugiert, um die Zellen zu ergeben, welche in einer Lysozym enthaltenden Pufferlösung suspendiert und dann einer Ultrabeschallung unterworfen werden, um sie aufzubrechen. Dann wird die Lösung aufgebrochener Zellen zentrifugiert, um ein Präzipitat zu ergeben, das AT in Form unlöslicher Einschlußkörper enthält. Dieses Präzipitat wird in einer Pufferlösung, die Triton X-100 enthält, suspendiert und dann aus der Suspension gewonnen. Diese Prozedur kann wiederholt werden. Danach wird das resultierende Präzipitat in einer Pufferlösung gelöst, die Harnstoff enthält, und dann mit einer Kaliumphosphatlösung verdünnt, die Ethylendiamintetraacetat und Mercaptoethanol enthält. Diese Lösung wird gegen eine Pufferlösung dialysiert, die Ethylendiamintetraacetat und Mercaptoethanol enthält, und über eine DEAE-Sephacel-Säule (Pharmacia LKB Biotechnology), mit der gleichen Pufferlösung äquilibriert, eluiert. Das Eluat wird mittels FPLC über eine Mono-Q-Säule (Pharmacia LKB Biotechnology) gereinigt.
Wenn Hefe als Wirtszelle für das gewünschte AT-Mutein eingesetzt wird, das in ein Kulturmedium sekretiert werden soll, kann das AT-Mutein beispielsweise durch Zentrifugation der Zellkultur zur Entfernung der Zellen, Konzentration des Überstands, Fraktionierung des Konzentrats mit Ammoniumsulfat, Zentrifugation der resultierenden Lösung, um ein Präzipitat zu ergeben, Durchführung einer Dialyse des Präzipitats gegen eine Pufferlösung und anschließende Elution der resultierenden Lösung über eine DEAE-Sephacel-Säule und dann eine Mono-Q-Säule isoliert und gereinigt werden. Falls das AT-Mutein innerhalb von Hefezellen akkumuliert wird, sollten die Zellen aufgebrochen werden, bevor das obige herkömmliche Reinigungsverfahren durchgeführt wird.
Das AT-Mutein der vorliegenden Erfindung kann als Inhibitor von Neutrophilen- Elastase dienen und insbesondere kann es die elastischen Fasern in Alveoli pulmonis vor dem Abbau durch Elastase schützen. Deshalb kann das AT-Mutein als präventives und therapeutisches Mittel gegen Emphyseme, die durch genetische Defekte oder Umweltverschmutzung verursacht werden, eingesetzt werden. Insbesondere ist das vorliegende AT-Mutein aufgrund seiner beträchtlich erhöhten Thermoresistenz sehr nützlich.
Die folgenden Beispiele sollen die vorliegende Erfindung speziell erläutern, ohne den Umfang der vorliegenden Erfindung zu beschränken.
In den Beispielen wurden alle DNA-Manipulationen nach dem Verfahren von Sambrook et al., oben, durchgeführt, soweit nicht anders angegeben. Die hier verwendeten Restriktionsenzyme wurden von New England Biolabs in den Vereinigten Staaten oder Boehringer Mannheim in Deutschland erhalten.
Zur Bestimmung der Aktivität und der thermischen Stabilität von AT in den folgenden Referenzbeispielen und Beispielen wurde das folgende Verfahren angewandt:
Die Aktivität von AT wurde gemessen, indem die Inhibierung der Elastase-Aktivität zum Abbau von Peptiden durch AT gemäß dem von Travis & Johnson in Methods in Enzymol 80, 754 (1981), beschriebenen Verfahren bestimmt wurde. Speziell wurde die AT- Aktivität zur Inhibierung von Elastase bestimmt durch: Mischen von Elastase und AT-Extrakt, um diese umzusetzen, Zugabe eines Substrats (hergestellt durch Lösen von Succinyl-Alanyl- Alanyl-Alanyl-p-Nitroanilid (SIGMA S4760) in Dimethylsulfoxid) und Messen der Extinktionsänderung bei 410 nm, um die restliche Elastase-Aktivität zu bestimmen. Die thermische Stabilität von AT wurde abgeschätzt durch die Bestimmung seiner Aktivität zur Inhibierung von Elastase unter Verwendung von AT, das bei 55ºC behandelt worden war, falls Zellextrakt eingesetzt wird, oder bei 57 bis 58ºC, falls ein gereinigtes AT eingesetzt wird. Als Kontrollen wurde ein in E. coli- oder Hefezellen produziertes Wildtyp-AT und natürliches AT, isoliert und gereinigt aus Human-Plasma, eingesetzt.

Referenzbeispiel 1: Klonierung eines AT-Gens

Aus den Klonen einer Human-Leber-cDNA-Bank (Clontech, USA) wurden unter Verwendung der Nukleotide Nr. 50 bis 72 des von Long et al. (Biochemistry, 23, 4828 (1984)) mitgeteilten AT-Gens als Sonde 32 positive Klone isoliert. 4 positive Klone wurden davon erhalten, wobei die Nukleotide Nr. 1150 bis 1172 dieses Gens als Sonde verwendet wurden. Aus diesen Klonen wurde das Plasmid pUC-AT(R) erhalten und eine AT-cDNA wurde durch die Verdauung mit Restriktionsendonuklease EcoRl oder BamHl als ein 1,3-kb- Fragment aus dem Plasmid isoliert (siehe Lee & Yu, Kor. J. Biochem., 22, 148 (1989)).

Referenzbeispiel 2: Expression eines rekombinanten Wildtyp-E. coli-AT

pUC-AT(R) aus dem obigen Referenzbeispiel 1 wurde mit der Restriktionsendonuklease BamHl verdaut, um ein 1,3-kb-Fragment zu ergeben, und das Fragment wurde in die BamHl-Erkennungsstelle des Plasmids pET-8c (Studier und Moffatt, J. Mol. Biol., 189, 112 (1986)) inseriert, um das Plasmid pEAT 8 herzustellen. Dann wurde E. coli BL21 (DE3) mit dem Plasmid transformiert und das davon produzierte AT wurde als rekombinantes Wildtyp-E. coli-AT bezeichnet. Das resultierende rekombinante Wildtyp-E. coli-AT besitzt eine Aminosäuresequenz, worin der erste Rest Methionin anstelle von Glutaminsäure ist und die anderen Reste mit denjenigen des Wildtyp-AT identisch sind (siehe Fig. 1). Die Aminosäuresequenz des rekombinanten Wildtyp-AT wurde durch eine Proteinsequenzierungsanalyse unter Einsatz von Applied Biosystem 477A identifiziert. Das mit pEAT 8 transformierte E. coli BL21 (DE3) wurde bei der Korean Collection for Type Cultures (KCTC) am 17. April 1991 unter der Hinterlegungsnummer KCTC 0009BP gemäß den Bedingungen des Budapester Vertrages hinsichtlich der Internationalen Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen zum Zwecke eines Patentverfahrens hinterlegt. Siehe die offengelegte koreanische Patentveröffentlichung Nr. 93-686.

Herstellungsbeispiel 1: Herstellung einer Transformante, die ein zufallsbestimmt mutagenisiertes Gen enthält

Ein 1,3-kb-DNA-Fragment, erhalten durch die Verdauung des Plasmids pEAT8 mit BamHl, wurde in die Erkennungsstelle der Restriktionsendonuklease BamHl des Vektors M13mp18 inseriert. Eine Zufalllsmutagenese wurde unter Verwendung einer einzelsträngigen DNA, die von dem M13-Klon erhalten worden war, und den Primern #1201 und #1212 (erhältlich von Sigma) gemäß einem modifizierten PCR-Verfahren von Eckert et al. (Eckert & Kunkel, PCR Kap. 14, The fidelity of DNA polymerase chain reactions, herausgegeben von McPharson et al., Oxford Univ. Press (1991)) durchgeführt, mit Ausnahme dessen, daß die Konzentration von dATP in der Reaktionslösung auf 0,1 mM verringert war, diejenige von dCTP, dGTP und dTTP jeweils 1 mM betrug und 10 mM Magnesiumchlorid zugegeben wurde. Diese PCR-Prozedur wurde 25 Zyklen wiederholt. Die amplifizierte DNA wurde mit den Restriktionsendonukleasen BclI und BstXl verdaut, um ein 770-bp-Fragment (vom 17. Codon bis zum 273. Codon) zu ergeben, welches das BclI/BstXl- Fragment in pEAT8 des Referenzbeispiels 2 ersetzte. Dann wurde E. coli BL21 (DE3) mit dem resultierenden Plasmid transformiert und 5 · 10&sup4; Transformanten-Kolonien mit Ampicillinresistenz wurden erhalten.

Herstellungsbeispiel 2: Screening von Kolonien, die ein thermoresistentes AT produzieren

Die in E. coli produzierten thermoresistenten AT-Muteine wurden gemäß einem von Coplen et al. (Proteins: Structure, function and genetics, 7, 16(1990)) offenbarten modifizierten Verfahren gescreent. Die in Herstellungsbeispiel 1 erhaltenen Kolonien wurden in 0,1 ml eines Mediums (hergestellt durch Lösen von 6 g Dinatriumphosphat, 3 g Kaliumphosphat, 1 g Ammoniumchlorid, 2 g Glucose, 0,2 g Hefeextrakt und 3 g Casaminosäure in 1 I Wasser), enthaltend 1 mM Isopropyl-β-thiogalactosid (IPTG) überimpft und dann über Nacht inkubiert. Zur resultierenden Kultur wurden 25 ul einer Lysislösung (250 mM Tris, pH 8,0, 25 mM EDTA, 0,25% Triton X-100, 0,5 mg/ml Lysozym) zugegeben und dann wurde die Kultur unter Schütteln bei Raumtemperatur eine Stunde lang inkubiert. Danach wurde die Kultur bei 60ºC eine Stunde lang wärmebehandelt und 25 ul 7 nM Elastase-Lösung (SIGMA E0258) wurden zugegeben. Die Reaktion wurde eine Stunde lang bei Raumtemperatur belassen und dann wurden 50 ul 1,2 mM Succinyl-Alanyl-Alanyl-Alanylp-Nitroanilid (SIGMA S4760) zugegeben, welche bei Raumtemperatur über Nacht umgesetzt wurden. Nach der Zugabe von 25 ul Natriumnitrit (0,2%, gelöst in 2 M HCl) wurde die Reaktionsmischung 3 Minuten lang stehengelassen. 25 ul von 2%igem Ammoniumsulfat wurden zugegeben und die Lösung wurde erneut 3 Minuten stehengelassen. Dann wurden 50 ul N-Naphthylethylendiamin-Lösung (0,05% in 95%igem Ethanol) zugegeben, um eine rote Farbreaktion zu entwickeln. Ein Klon, welcher keine rote Farbe aufweist, ist derjenige, welcher das thermoresistente AT-Mutein produziert, was als positiv bezeichnet wurde. Von den in Herstellungsbeispiel 1 hergestellten Kolonien wurden 5000 Klone gescreent, um 41 positive Klone zu erhalten.

Beispiel 1: Herstellung einer E. coli-Transformante, die ein AT-Mutein mit höherer Thermoresistenz exprimiert

Die Elastase-Inhibierungsaktivität von AT wurde durch Anwendung eines von Travis et al. (Travis & Johnson, Methods in Enzymol., 80, 754 (1981)) beschriebenen modifizierten Verfahrens bestimmt. Als Reaktionspuffer wurde 50 mM Tris (pH 8,0), enthaltend 50 mM NaCl, eingesetzt und 15 mM Succinyl-Alanyl-Alanyl-Alanyl-p-Nitroanilid (SIGMA S4760), gelöst in Dimethylsulfoxid, wurde als Substrat für Elastase eingesetzt. Eine Enzymlösung wurde hergestellt, indem Elastase bis zur Konzentration von 0,3 uM in der Reaktionspufferlösung, die 50% Glycerin enthielt, gelöst wurde.
Die transformierten Klone von Herstellungsbeispiel 2 wurden in LB-Medium überimpft und bei 37ºC inkubiert, bis die Extinktion bei 600 nm 0,8 erreichte. 0,4 mM IPTG wurde zugegeben und die Kultur weitere 3 Stunden lang inkubiert. Die Kultur wurde zentrifugiert, um die Zellen zu ernten, welche in einer 50 mM Tris-Pufferlösung (pH 8,0), enthaltend 50 mM NaCl, suspendiert und dann einer Ultrabeschallung bei 0ºC unterworfen wurden, um die Zellen aufzubrechen. Die Lösung aufgebrochener Zellen wurde bei 10.000 · g für 15 Minuten zentrifugiert, um den Überstand abzutrennen, der als AT-Extrakte verwendet wurde.
Die Elastase-Inhibierungsaktivität von AT wurde wie folgt bestimmt: 10 ul der Enzymlösung, 10 bis 50 ul der AT-Extrakte und die Reaktionspufferlösung wurden gemischt, um ein Endvolumen von 60 ul zu ergeben, und dann 10 Minuten lang umgesetzt. Nachdem 430 ul der Reaktionspufferlösung und 10 ul des Substrats dazu zugegeben worden waren, wurde die Extinktionsänderung bei 410 nm unmittelbar 3 Minuten lang gemessen.
Zur Beurteilung der Thermoresistenz wurde die Elastase-Inhibierungsaktivität von AT jede Minute gemessen, während die Temperatur bei 55ºC gehalten wurde. Eine E. coli- Transformante, welche das AT-Mutein mit erhöhter Thermoresistenz im Vergleich zu dem rekombinanten Wildtyp-AT produzieren kann, wurde isoliert. Die Transformante wird als Escherichia coli BL21 (DE3) (pEAT81) bezeichnet, welche bei der Korean Collection for Type Cultures (KCTC) am 19. März 1993 unter der Hinterlegungsnummer KCTC 0077BP hinterlegt wurde. Das von diesem E. coli BL21 (DE3) beherbergte Plasmid wird als pEAT81 bezeichnet.

Beispiel 2: Sequenzierung eines DNA-Nukleotids, kodierend für das AT-Mutein

Ein 1,3-kb-DNA-Fragment, welches durch die Verdauung des in Beispiel 1 erhaltenen Plasmids pEAT 81 mit BamHl isoliert wurde, wurde in die BamHl-Erkennungsstelle eines Vektors M13mp18 inseriert. Dieser wurde einer Sequenzierungsanalyse unter Verwendung von ³&sup5;S-dATP und Sequenase Kit (US Biochemical Co.) gemäß einem von Sanger (Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 5463 (1977)) offenbarten Verfahren unterworfen, um zu bestätigen, daß das 51. Codon TTC (Phenylalanin) der DNA-Sequenz durch TGC (Cystein) ersetzt war.

Beispiel 3: Isolierung und Reinigung des AT-Muteins

Die Isolierung und Reinigung des AT-Muteins erfolgte unter Anwendung des in der offengelegten koreanischen Patentveröffentlichung Nr. 93-686 offenbarten Verfahrens. Das heißt, jede der E. coli-Transformanten (KCTC 0077BP und KCTC 0009BP) wurde in 250 ml M9ZB-Medium (hergestellt durch Lösen von 1 g Ammoniumchlorid, 3 g Kaliumdihydrogenphosphat, 6 g Natriumhydrogenphosphat, 2 g Glucose, 0,2 g Hefeextrakt, 3 g Casaminosäure in 1 l Wasser) überimpft und dann bei 37ºC inkubiert, bis die Extinktion bei 600 nm 0,8 erreichte. 0,4 mM IPTG wurde dazu zugegeben und dann wurde die Kultur weitere 3 Stunden lang inkubiert. Jede Kultur wurde zentrifugiert, um die Zellen zu ernten, welche in Pufferlösung A (50 mM NaCl, 1 mM Ethylendiamintetraacetat, 1 mM Mercaptoethanol, 50 mM Tris, pH 8,0), enthaltend 0,1 mg/ml Lysozym, suspendiert und dann einer Ultrabeschallung bei 0ºC unterworfen wurden, um die Zellen aufzubrechen. Jede der Suspensionen wurde 10 Minuten lang bei 10.000 · g zentrifugiert, um ein Präzipitat zu ergeben, das AT in Form unlöslicher Einschlußkörper enthielt. Jedes dieser Präzipitate wurde in der Pufferlösung A, umfassend 0,5% Triton X-100, suspendiert und dann wurde die Suspension zentrifugiert, um ein Präzipitat zu gewinnen. Dieser Waschschritt wurde ein weiteres Mal wiederholt. Nach Solubilisierung des Präzipitats in 5 ml Pufferlösung A, enthaltend 8 M Harnstoff, wurde die resultierende Lösung 30 Minuten stehengelassen und dann durch die Zugabe von 45 ml 50 mM Phosphatpuffer (pH 8,0), enthaltend 1 mM Ethylendiamintetraacetat und 1 mM Mercaptoethanol, verdünnt. Nach 30 Minuten wurde die verdünnte Lösung gegen eine 10 mM Phosphatpufferlösung (pH 6,5), enthaltend 1 mM Ethylendiamintetraacetat und 1 mM Mercaptoethanol, dialysiert. Das resultierende Dialysat wurde in eine DEAE-Sephacel-Säule (Pharmacia LKB Biotechnology), äquilibriert mit der Dialysepufferlösung, injiziert und dann mit der Dialysepufferlösung eluiert, die NaCl in einem linearen Konzentrationsgradienten von 0 mM bis 300 mM enthielt. Das Eluat wurde erneut auf die Mono-Q-Säule (Pharmacia LKB Biotechnology) in Verbindung mit FPLC aufgetragen und mit der Dialysepufferlösung eluiert, die NaCl in einem linearen Konzentrationsgradienten von 0 bis 200 mM enthielt, um ein gereinigtes AT zu erhalten (siehe Fig. 2).
In Fig. 2 ist Spur 1 der Extrakt aufgebrochener Zellen; Spur 2 zeigt das durch die Zentrifugation der aufgebrochenen Zellen erhaltene Präzipitat, das AT enthält; Spur 3 ist der Überstand, erhalten aus der Neufaltung des in Harnstoff solubilisierten Präzipitats; Spur 4 ist das während der Neufaltung gebildete Präzipitat; Spur 5 ist das gereinigte rekombinante AT nach Leiten über DEAE-Sephacel- und Mono-Q-Säulen; Spur 6 zeigt ein Human-Plasma- AT, das über eine Afft-Gel-Blue-Säule und Mono-Q-Säule geleitet worden war; und Spur 7 zeigt die Standard-Molekulargewichtsproteine.

Beispiel 4: Charakteristiken eines stellenspezifisch mutagenisierten Gens und AT-Muteins

< 4-1> : Konstruktion eines stellenspezifisch mutagenisierten Gens

Zum Erhalt eines mutagenisierten AT, bei dem der 51. Aminosäurerest durch eine der anderen 18 Aminosäuren als Phenylalanin und Cystein ersetzt ist, wurde eine stellenspezifische Mutagenese mit einem Oligonukleotid (Kunkel et al., Methods in Enzymolopv, 154, 367-382 (1987)) durchgeführt. Das zur Mutagenese eingesetzte Oligonukleotid besteht aus 30 Basen und dessen Sequenz wurde so gestaltet, daß die Codons neben dem 51. Codon für dieselben Aminosäuren wie die entsprechenden Codons des Wildtyp-AT kodieren und das 51. Codon für eine der 18 Aminosäuren kodiert, wie im folgenden gezeigt:
5'-GG AGG GAA G/CNN GAT ATT AGT ACT GTT GGA C-3',
wobei G/C bedeutet, daß die Basen G und C im selben Molverhältnis gemischt sind, und N bedeutet, daß A, T, G und C im selben Molverhältnis gemischt sind.
Unter Verwendung von E. coli CJ236 (duf, ungL Boehringer/Mannheim) als Wirtszelle wurde ein M13-Klon, der das AT-Gen enthielt, dreimal in LB-Medium mit 0,25 ug/ml Uridin amplifiziert, um Bakteriophagen-Partikel zu erzeugen, aus denen eine einzelsträngige Matrizen-DNA erhalten wurde. Ein synthetisiertes Oligonukleotid wurde mit der Matrizen-DNA verschmolzen. Die resultierende Phagen-DNA wurde zur Transformation von E. coli JM109 (ATCC 53323) eingesetzt und dann wurden die mutagenisierten Klone selektioniert. Die Sequenz der mutierten M13-Klone wurde wie in Beispiel 2 identifiziert, um zu bestätigen, daß der 51. Rest durch eine der 18 Aminosäuren ersetzt war. Aus den mutagenisierten M13-Klonen wurde eine RF (Replikationsform)-DNA isoliert und mit den Restriktionsendonukleasen BclI und BstXl verdaut, um ein 770-bp-Fragment zu ergeben, welches das BclI/BstXl-Fragment in dem Plasmid pEAT8 ersetzte, um einen mutagenisierten AT-Expressionsvektor zu erhalten. E. coli BL21 (DE3) wurde mit dem Vektor transformiert.

< 4-2> : Bestimmung der thermischen Stabilität von AT-Muteinen

Die Zellextrakte von E. coli, welche die AT-Muteine produzieren wurden hinsichtlich ihrer Thermoresistenz wie in Beispiel 1 bewertet. Die Auswertungsergebnisse zeigen, daß die AT-Muteine, bei denen die 51. Aminosäure durch Valin, Leucin, Isoleucin oder Alanin ersetzt war, eine erhöhte thermische Stabilität aufweisen. So wurde, nachdem die AT- Muteine mit demselben Verfahren wie in Beispiel 3 beschrieben gereinigt worden waren, die Assoziationskonstante zu Elastase und die thermische Inaktivierungsrate eines jeden Muteins bestimmt durch Vergleich mit denjenigen des Human-Plasma-AT (A9204), welches durch Leiten über eine Afft-Gel-Blue-Säule (Bio-Rad) und dann FPLC über eine Mono-Q- Säule gereinigt worden war. Die Assoziationskonstante wurde gemäß Beatty's Verfahren (Beatty et al., J. Biol. Chem., 255, 3931-3934 (1980)) wie folgt berechnet:
Aus der Reaktionsmischung, welche die gleichen Konzentrationen (8 nM) an Elastase und AT enthält, wurden Proben der Mischung jede Minute 10 Minuten lang entnommen. 1 mM Succinyl-Alanyl-Alanyl-Alanyl-p-Nitroanilid (SIGMA S4760) wurde als Substrat jeder Probe zugegeben. Die Elastase-Aktivität jeder Probe wurde durch Messen der Extinktion bei 410 nm bestimmt und dann wurde die Assoziationskonstante aus der Steigung des Graphen der reziproken Elastase-Konzentration gegen die Zeit berechnet. Wie in Tabelle I unten gezeigt, besitzen das in E. coli produzierte Wildtyp-AT und rekombinante AT-Mutein eine ähnliche Assoziationskonstante wie diejenige eines Human-Plasma-AT, was belegt, daß die rekombinanten AT-Muteine eine normale Aktivität gegenüber Elastase aufweisen.
Zum Vergleich ihrer thermischen Stabilität wurden verschiedene Arten von AT- Muteinen bei 57ºC inkubiert, woraus Proben jede Minute entnommen wurden. Dann wurde die verbleibende Aktivität der AT-Muteine in gleicher Weise wie in Beispiel 1 oben beschrieben bestimmt und deren Halbwertszeit und thermische Inaktivierungsrate aus der Steigung des Graphen eines logarithmischen Wertes der verbleibenden Aktivität gegen die Zeit (siehe Fig. 3) berechnet. Die Ergebnisse sind in Tabelle I unten gezeigt. Tabelle I. Assoziationskonstante und Halbwertszeit und Inaktivierungsrate des mutagenisierten rekombinanten AT bei 57ºC
Wie in den obigen Beispielen gezeigt, besitzen die AT-Muteine eine ähnliche Aktivität wie diejenige des Wildtyp-AT, während sie eine erhöhte Thermoresistenz im Vergleich zu einem in E. coli produzierten rekombinanten Wildtyp-AT aufweisen. Insbesondere das AT- Mutein, bei dem die 51. Aminosäure durch Cystein ersetzt ist, weist eine ähnliche Thermoresistenz wie diejenige von Human-Plasma-AT auf welche 13,5mal höher ist als diejenige des rekombinanten Wildtyp-AT.

< 4-3> : Verringerte Aggregationstendenz der AT-Muteine

Nach Lomas et al. (Lomas, D. A., et al., Nature, 357, 605-607 (1992), und Lomas, D. A., et al., Biochemistry, 32, 500-508 (1993)) tendieren AT-Moleküle dazu, bei hoher Temperatur (oberhalb von 41ºC) oder unter milden Denaturierungsbedingungen in eine nicht-aktive Form zu aggregieren, welche bekanntermaßen eine thermische Inaktivierung verursacht. Um das Ausmaß der Aggregation eines AT-Muteins mit demjenigen eines Wildtyp-AT zu vergleichen, wurde die Aggregation induziert und dann die Bildung von hochmolekularen Proteinen mittels Gelpermeationschromatographie bestimmt. Konkreter wurde ein gereinigtes AT in einer Konzentration von 0,1 mg/ml bei 55ºC für einen angemesssenen Zeitraum inkubiert und dann durch FPLC über eine Superose-12-Säule (Pharmacia LKB Biotechnology) nach dem Molekulargewicht fraktioniert. Wie in Fig. 4 gezeigt, wurde das AT-Mutein der vorliegenden Erfindung, bei dem die 51. Aminosäure durch einen Cysteinrest ersetzt ist, befunden, im Vergleich zum Wildtyp-AT mit beträchtlich geringerer Rate polymerisiert zu werden. Dementsprechend wird angenommen, daß die Mutagenese des 51. Rests der Aminosäuresequenz den Grad der durch seine Polymerisation verursachten Inaktivierung von AT verringert. In Fig. 4 ist die bei 12,5 Min. eluierte Fraktion das Protein in aktiver Form und die Proteine, die vor dieser Zeit eluiert werden, sind inaktive Proteine mit hohem Molekulargewicht.

Beispiel 5: Herstellung und Charakterisierung des glycosylierten AT-Muteins

< 5-1> : Konstruktion eines Vektors zur Expression eines AT-Gens in Hefe

Die E. coli-Expressionsplasmide pEAT8 (KCTC 0009BP) und pEAT81 (KCTC 0077BP), die ein Wildtyp-AT-Gen bzw. ein AT-Mutein-Gen enthalten, wurden mit den Restriktionsendonukleasen BamHl und Smal verdaut und ein 1,3-Kb-DNA-Fragment wurde aus jedem der verdauten Plasmide isoliert. Jedes dieser Fragmente wurde in die BamHl- und Smal-Stelle in dem Plasmid pYES24 inseriert (Ahn et al., Kor. J. Microbiol., 30, 403 (1992)). Jedes der resultierenden Plasmide wurde mit BamHl verdaut, mit einer Mungobohnennuklease behandelt und dann ligiert, um die Plasmide pGAT11 (Wildtyp) und pGAT15 (Mutante) zu konstruieren. In den Plasmiden ist das AT-Gen nach einer 450-bp- Sequenz, die eine Sekretionssignalsequenz und einen Teil des Promoters, der von dem STA1-Gen von Saccharomyces diastaticus stammt, umfaßt, lokalisiert. Die Konstruktion von pGAT11, enthaltend das Wildtyp-AT-Gen, wurde bereits mitgeteilt (siehe Song et al., Kor. J. Microbiol., 31, 203 (1993)).

< 5-2> : Herstellung und Kultivierung einer Hefe-Transformante

Die Transformation von Hefezellen mit den oben in < 5-1> erhaltenen Plasmiden wurde gemäß dem Lithiumacetat-Verfahren (Ito et al., J. Bacteriol., 153, 163 (1983)) durchgeführt. Saccharomyces diastaticus YIY345 (KCTC 1791) (Yamashita et al., J. Bacteriol., 161, 574 (1985)) wurde als Wirtszelle eingesetzt.
Saccharomyces diastaticus, transformiert mit pGAT15, wurde wie folgt kultiviert: die Transformante wurde zuerst in YNB-Medium (0,67% Hefe-Stickstoff-Base ohne Aminosäure und 2% wäßrige Glucoselösung), enthaltend jeweils 20 mg/l an Histidin und Leucin, 16 bis 18 Stunden lang bei 30ºC inkubiert und dann in YEPD-Medium (1% Hefeextrakt, 2% Pepton und 2% wäßrige Glucoselösung) 24 Stunden lang.

< 5-3> : Isolierung und Reinigung von AT aus der Hefekultur

Jede der in < 5-2> oben erhaltenen Hefekulturen wurde zentrifugiert, um Zellen zu entfernen, und der resultierende Überstand wurde durch ein Ultrafiltrationsverfahren (unter Verwendung von Amicon PM30) konzentriert. Zu diesem Konzentrat wurde Ammoniumsulfat bis zu 60% Sättigung zugegeben, dann wurde die resultierende Lösung mit 25.000 · g 15 Min, lang zentrifugiert, um das Präzipitat zu entfernen. Ammoniumsulfat wurde bis 75% Sättigung zugegeben. Nach der Zentrifugation der resultierenden Lösung, um ein Präzipitat zu ergeben, wurde dieses Präzipitat in Pufferlösung B (10 mM Tris, 1 mM Ethylendiamintetraacetat, 1 mM Mercaptoethanol, pH 8,0) gelöst und gegen die gleiche Pufferlösung dialysiert. Protaminsulfat wurde bis zu einer Konzentration von 0,1% dem resultierenden Dialysat zugegeben, welches zur Entfernung eines Präzipitats zentrifugiert und gegen die Pufferlösung B dialysiert wurde. Die resultierende Lösung wurde durch Auftragen auf eine mit Pufferlösung B äquilibrierte DEAE-Sephacel (Pharmacia LKB)-Säule, die mit einem linearen Konzentrationsgradienten von 0 bis 200 mM NaCl in Pufferlösung B eluiert wurde, gefolgt von Auftrennung mit einer Mono-Q-Säule (Pharmacia LKB) mit einem linearen Konzentrationsgradienten von 0 bis 150 mM NaCl gereinigt.
Fig. 5 zeigt die Ergebnisse einer SDS-PAGE-Analyse für die Proben, die während der Isolierung und Reinigung des AT-Muteins aus der Hefekultur erhalten worden waren. Spur 1 ist für das Konzentrat, das nach der Ultrafiltration der Kultur erhalten wurde; Spur 2 ist für den Überstand, der nach der Ammoniumsulfatfraktionierung und der Fällung mit Protaminsulfat erhalten wurde; Spur 3 ist für die ein aktives AT enthaltende Fraktion, die nach Leiten über eine DEAE-Sephacel-Säule erhalten wurde; Spur 4 zeigt das gereinigte AT-Mutein, das nach Leiten über eine Mono-Q-Säule erhalten wurde; und Spur 5 ist für die Standard-Molekulargewichtsproteine.

< 5-4> : Bestätigung der Glycosylierung des in Hefe produzierten AT-Muteins

Zur Bestätigung, ob das AT-Mutein, welches aus < 5-3> oben erhalten wurde, glycosyliert ist, wurde das gereinigte AT-Mutein mit Endoglycosidase H (New England Biolabs; hier im folgenden als "Endo H" bezeichnet) behandelt und dann einer SDS-PAGE unterworfen. Endo H entfernt einen N-glycosylierten Kohlenhydratrest des Typs mit hohem Mannosegehalt, wodurch das Molekulargewicht des Glycoproteins verringert wird, was durch SDS-PAGE bestätigt werden kann. Endo H wirkt nicht auf ein Glycoprotein, das ein im Menschen produziertes Kohlenhydrat eines komplexen Typs umfaßt. Im allgemeinen enthält ein in Hefe sekretiertes Glycoprotein einen Kohlenhydrattyp mit hohem Mannosegehalt. Wie in Fig. 6 gezeigt, war das Molekulargewicht des in Hefe produzierten AT-Muteins ähnlich demjenigen des Human-Plasma-AT in glycosylierter Form und nach Behandlung mit Endo H änderte sich das Molekulargewicht, um demjenigen des unglycosylierten AT-Muteins mit einem Molekulargewicht von 45 KD, das in E. coli produziert wird, ähnlich zu sein. Deshalb wurde bestätigt, daß das in Hefe produzierte AT-Mutein von < 5-2> oben ein N-glycosyliertes Glycoprotein des Typs mit hohem Mannosegehalt ist.
In Fig. 6 ist Spur 1 für das unglycosylierte AT-Mutein, das in E. coli exprimiert wird; Spur 2 ist für das Human-Plasma-AT; Spur 3 ist für das Human-Plasma-AT, das mit Endo H behandelt wurde; Spur 4 ist für das in Hefe produzierte rekombinante Wildtyp-AT; Spur 5 ist für das in Hefe produzierte und mit Endo H behandelte Wildtyp-AT; Spur 6 ist für das in Hefe produzierte AT-Mutein; Spur 7 ist für das in Hefe produzierte und mit Endo H behandelte AT- Mutein; und Spur 8 ist für die Standard-Molekulargewichtsproteine.

< 5-5> : Charakterisierung des glycosylierten AT-Muteins

Die inhibitorische Aktivität und Thermoresistenz bei 58ºC eines jeden der in Hefe produzierten AT-Muteine, bei denen die 51. Aminosäure durch Cystein ersetzt ist, und des nach < 5-3> oben gereinigten rekombinanten Wildtyp-AT wurden auf die gleiche Weise wie in Beispiel 4 oben bestimmt und mit denjenigen des in den Beispielen 3 bzw. 4 erhaltenen rekombinanten Wildtyp-E. coli-AT und Human-Plasma-AT verglichen. Das glycosylierte rekombinante AT wies dieselbe Protease-Inhibierungsaktivität und eine außerordentlich erhöhte Thermoresistenz im Vergleich zu dem Wildtyp-AT auf (siehe Fig. 7, Tabelle II). Das in Hefe produzierte rekombinante Wildtyp-AT besaß eine 5,3fach höhere Thermoresistenz als diejenige des in E. coli exprimierten rekombinanten Wildtyp-AT, jedoch eine niedrigere Thermoresistenz als diejenige des Human-Plasma-AT. Das in Hefe produzierte glycosylierte AT-Mutein wies jedoch eine 31fach bzw. 6fach höhere Thermoresistenz als diejenige des in Hefe produzierten Wildtyp-AT bzw. des Human-Plasma-AT auf. Tabelle II. Assoziationskonstante und Halbwertszeit und Inaktivierungsrate von in Hefe produzierten ATen bei 58ºC

Beispiel 6: Stellenspezifische Zufallsmutagenese unter Verwendung degenerierter Oligonukleotide und charakteristische Eigenschaften der AT-Muteine

Um potenziell thermoresistente Mutanten durch eine konvergente Mutagenese im hydrophoben Kernbereich von AT zu erhalten, wurde eine Zufallsmutagenese der hydrophoben Stellen neben dem 51. Rest in der Aminosäuresequenz des Wildtyp-AT durch Verwendung gemischter synthetischer Oligonukleotide durchgeführt. Die für die Mutation gewählten Stellen waren die Aminosäurereste Nr. 48 bis 70 und Reste Nr. 368 bis 391 in der Wildtyp-AT-Sequenz. Für die Zufallsmutagenese wurden die gemischten synthetischen Oligonukleotide gemäß einem Verfahren eingesetzt, das von Hutchison beschrieben wurde (Hutchison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83, 710-714 (1986)). Das heißt, jede der vier (A, T, C, G) Phosphoramidit-Lösungen, die für die Synthese der Oligonukleotide eingesetzt wurden, war mit kleineren Mengen der anderen drei Phosphoramidit-Lösungen kontaminiert. Durch die Verwendung der kontaminierten Lösung bei der Synthese des Oligonukleotids wurden Spurenbasen in das resultierende Oligonukleotid eingeführt. Wenn diese gemischten synthetisierten Oligonukleotide bei der stellenspezifischen Mutagenese wie in Beispiel 4 oben beschrieben (Kunkel et al., Methods in Enzymoloay, 154, 367-382 (1987)) eingesetzt werden, kann eine Zufallsmutagenese an einer bestimmten Stelle effektiv stattfinden.
Zur Abdeckung der obengenannten beiden zu mutierenden Stellen wurden die folgenden vier Oligonukleotide, komplementär zu den Sequenzen von (a) den Resten Nr. 48 bis 60, (b) den Resten Nr. 58 bis 70, (c) den Resten Nr. 368 bis 380 bzw. (d) den Resten Nr. 378 bis 391, synthetisiert und zur Mutagenese eingesetzt:
(a) 5'-GGC TGT AGC GAT GCT CAC TGG GGA GAA GAA GAT ATT GGT-3'
(b) 5'-AGC CTT GGT CCC CAG GGA GAG CAT TGC AAA GGC TGT AGC-3'
(c) 5-CTT GGT ATT TTG GTC AAT CAT TAA GAA GAC AAA GGG TTT-3'
(d) 5'-GGG ATT CAC CAC TTT TCC CAT GAA GAG GGG AGA CTT GGT ATT-3'
In diesem Beispiel wurde für die optimale Mutationsfrequenz jede der vier Phosphoramidit-Lösungen mit den anderen drei Phosphoramiditen gemischt, um jeweils zu 2,5% kontaminiert zu sein. Die stellenspezifische Mutagenese wurde mit den synthetisierten Oligonukleotiden nach demselben Verfahren wie in Beispiel 4 beschrieben durchgeführt. Das BamHl-verdaute mutagenisierte AT-Gen von RF-DNA, die aus den erhaltenen M13- Klonen isoliert worden war, wurde in die BamHl-Stelle des Expressionsvektors pEAT8 inseriert, um einen Expressionsvektor für das mutagenisierte AT-Gen zu erhalten. Die thermoresistenten Mutanten wurden durch Beurteilung der thermischen Stabilität der in E. coli exprimierten AT-Muteine gemäß dem im obigen Herstellungsbeispiel 2 beschriebenen Screeningverfahren ausgewählt. Die thermische Stabilität bei 55ºC des AT-Muteins wurde mit derjenigen des rekombinanten E. coli-Wildtyp-AT wie in Beispiel 1 oben verglichen. Als Ergebnis wurde gezeigt, daß die Halbwertszeit des AT-Muteins im Vergleich zu derjenigen des rekombinanten E. coli-Wildtyp-AT um das 2,77fache bis 15,73fache erhöht wurde. Die Ergebnisse sind in Tabelle III unten gezeigt. Tabelle III. Vergleich der Thermoresistenz der AT-Muteine und des Wildtyp-AT

Beispiel 7: Herstellung des Mehrfachmutanten-AT

Um das Mutanten-AT mit einer stärker erhöhten Thermoresistenz durch selektive Kombination der Aminosäureaustausche in den thermoresistenten AT, die in den vorherigen Beispielen hergestellt worden waren (Tabellen II & III), zu erhalten, wurde das Mehrfachmutanten-AT, bei dem zwei oder mehr Aminosäuren durch andere Aminosäuren ersetzt sind, durch die stellenspezifische Mutagenese unter Verwendung der Oligonukleotide wie in Beispiel 4 oben beschrieben hergestellt. Das Mehrfachmutanten-AT, welches zwei Aminosäureaustausche aufweist, wobei der 51. Rest Leucin ist und der 374. Rest Isoleucin ist, weist eine höhere (300fach oder mehr) Thermoresistenz als diejenige eines jeden der Einfachmutanten-ATe auf (siehe Fig. 8). Auch weist das Mehrfachmutanten-AT mit drei Aminosäureaustauschen, wobei der 59., der 68. und der 70. Rest Alanin, Alanin bzw. Glycin sind, im Vergleich zu den Einfachmutanten-AT eine mindestens 300fach höhere Thermoresistenz auf. Fig. 8 ist ein Diagramm, welches das Ergebnis des thermischen lnaktivierungsexperiments für die Einfachmutanten-AT und das Mehrfachmutanten-AT, exprimiert in E. coli, zeigt. In Fig. 8 ist die Aktivität des rekombinanten Wildtyp-AT bei 55ºC, jede Minute auf dieselbe Weise wie in Beispiel 4 oben beschrieben gemessen; ist diejenige des Mutanten-AT, bei dem die 51. Aminosäure durch Leucin ersetzt ist; ist diejenige des Mutanten-AT, bei dem der 374. Rest durch Isoleucin ersetzt ist, und ist diejenige des Mutanten-AT, bei dem der 51. und der 374. Rest durch Leucin bzw. Isoleucin ersetzt ist.
So wurde festgestellt, daß die Mehrfachmutante die Thermoresistenz der Einfachmutanten weiter erhöht. Darüber hinaus steht zu erwarten, daß wenn die Mehrfachmutanten-ATe in glycosylierter Form in Hefe produziert werden, deren Thermoresistenz noch mehr erhöht sein wird.
Obwohl die Erfindung unter Bezugnahme auf die obigen speziellen Ausführungsformen beschrieben wurde, sollte berücksichtigt werden, daß verschiedene Modifikationen und Abänderungen, die für die Fachleute, an die sich die Erfindung richtet, ersichtlich sein werden, durchgeführt werden können und von dem Umfang der Erfindung, wie er durch die folgenden Ansprüche definiert wird, ebenfalls umfaßt werden.

Claims

1. Human-α-1-Antitrypsin-Mutein mit erhöhter Thermoresistenz, welches eine Aminosäuresequenz eines Wildtyp-Human-α-1-Antitrypsins (Fig. 1) aufweist, worin mindestens eine der 51., der 56., der 59., der 68. bis 70., der 374., der 381. und der 387. Aminosäure des Wildtyp-Human-a-1-Antitrypsins durch eine andere Aminosäure ersetzt ist.

2. Human-α-1-Antitrypsin-Mutein nach Anspruch 1, worin mindestens eine der folgenden Aminosäuresubstitutionen vorkommt:

Phenylalanin Nr. 51 durch Cystein, Valin, Leucin, Isoleucin oder Alanin,

Serin Nr. 56 durch Alanin,

Threonin Nr. 59 durch Alanin oder Serin,

Threonin Nr. 68 durch Alanin,

Lysin Nr. 69 durch Glutamin,

Alanin Nr. 70 durch Glycin,

Methionin Nr. 374 durch Isoleucin, Leucin oder Valin,

Serin Nr. 381 durch Alanin, und

Lysin Nr. 387 durch Arginin.

3. Human-α-1-Antitrypsin-Mutein nach Anspruch 1, worin mindestens eine der 11 aufeinanderfolgenden Aminosäuren vom N-Terminus deletiert oder durch eine andere Aminosäure ersetzt ist.

4. Human-α-1-Antitrypsin-Mutein nach Anspruch 1, welches glykosyliert ist.

5. Human-α-1-Antitrypsin-Mutein nach Anspruch 1, worin Phenylalanin Nr. 51 und Methionin Nr. 374 des Wildtyp-Human-α-1-Antitrypsins durch Leucin bzw. Isoleucin ersetzt sind.

6. Human-α-1-Antitrypsin-Mutein nach Anspruch 1, worin das Threonin Nr. 59., das Threonin Nr. 68, das Alanin Nr. 70 des Wildtyp-Human-α-1-Antitrypsins durch Alanin, Alanin bzw. Glycin ersetzt sind.

7. Polynukleotid, kodierend für das Human-α-1-Antitrypsin-Mutein nach Anspruch 1.

8. Expressionsvektor, enthaltend das Polynukleotid nach Anspruch 7.

9. Vektor nach Anspruch 8, bei dem es sich um pEAT81 (KCTC 0077BP) oder pGAT15, hergestellt durch Insertion des 1,3-kb-BamHl-Smal-DNA-Fragments des Plasmids pEAT81 (KCTC 0077BP) in die BamHl-Smal-Stelle des Plasmids pYES24, Verdauung des resultierenden Plasmids mit BamHl, Behandlung der resultierenden DNA mit Mungobohnen-Nuklease und Ligierung der DNA, handelt.

10. Mikroorganismus, welcher mit einem Expressionsvektor, enthaltend das Polynukleotid nach Anspruch 7, transformiert ist.

11. Mikroorganismus-Transformante nach Anspruch 10, welche durch Transformation von Escherichia coli BL21 (DE3) mit pEAT81, hinterlegt unter KCTC 0077BP, hergestellt ist.

12. Mikroorganismus nach Anspruch 10, welcher durch Transformation von Saccharomyces diastaticus YIY545 mit pGAT15, hergestellt durch Insertion des 1,3-kb-BamHl-Smal-DNA-Fragments des Plasmids pEAT81 (KCTC 0077BP) in die BamHl-Smal-Stelle des Plasmids pYES24, Verdauung des resultierenden Plasmids mit BamHl, Behandlung der resultierenden DNA mit Mungobohnen-Nuklease und Ligierung der DNA, hergestellt ist.

13. Verfahren zur Herstellung des Human-α-1-Antitrypsin-Muteins nach Anspruch 1 mit erhöhter Thermoresistenz, welches das Kultivieren des Mikrooorganismus nach Anspruch 10 unter geeigneten Bedingungen und Isolieren des produzierten AT-Muteins aus der Kultur umfaßt.

14. Verfahren nach Anspruch 13, worin ein glykosyliertes Human-α-1-Antitrypsin- Mutein durch Kultivieren von Saccharomvces diastaticus YIY545, der mit pGAT15, hergestellt durch Insertion des 1,3-kb-BamHl-Smal-DNA-Fragments des Plasmids pEAT81 (KCTC 0077BP) in die BamHl-Smal-Stelle des Plasmids pYES24, Verdauung des resultierenden Plasmids mit BamHl, Behandlung der resultierenden DNA mit Mungobohnen-Nuklease und Ligierung der DNA, transformiert wurde, und Isolieren des produzierten Muteins aus der Kultur hergestellt wird.