PT1303265E - ''utilização de inibidores da cox-2 como imuno-estimulantes, no tratamento do vih ou da sida'' - Google Patents

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DESCRIÇÃO "UTILIZAÇÃO DE INIBIDORES DA COX-2 COMO IMUNO-ESTIMULANTES, NO TRATAMENTO DO VIH OU DA SIDA" A invenção insere-se no campo do tratamento de imunodeficiências em infecções virais. Mais especificamente, a invenção refere-se à utilização de inibidores da ciclo-oxigenase-2 (COX-2) na imunomodulação para o tratamento da infecção com VIH e da SIDA.

As prostaglandinas desempenham um papel importante no processo de inflamação e a inibição da formação de prostaglandinas tem sido um alvo comum no desenvolvimento de fármacos anti-inflamatórios. Os fármacos anti-inflamatórios não-esteróides (NSAID) inibem a ciclo-oxigenase (COX), a qual é uma enzima envolvida na biossíntese de intermediários da prostaglandina a partir do ácido araquidónico. Estão presentes vários NSAID na utilização clinica, incluindo fármacos como indometacina, piroxicam, tenoxicam, diclofenac, meloxicam, tenidap, isoxicam, ácido acetilsalicílico, diflunisal, sulindac, ibuprofeno, naproxeno e cetoprofeno.

Os NSAID estão, presentemente, entre os fármacos mais amplamente prescritos em todo o mundo.

Estes NSAID são fármacos clinicamente eficientes e possuem efeitos antipiréticos, anti-inflamatórios e antitrombóticos. As indicações principais desta classe de fármacos consistem em 1 artrite incluindo osteoartrite e artrite reumatóide, patologias musculo-esqueléticas dolorosas e patologias de dor gerais. No entanto, são verificados efeitos secundários graves com estes fármacos. Os efeitos secundários mais frequentes são ulceração gastro-intestinal e hemorragia, inibição da agregação das plaquetas e interacção com outros fármacos.

No inicio dos anos 1990 foi clonada uma segunda isoforma da enzima COX. Esta nova isoforma da COX é, presentemente, conhecida com COX-2 (Vane et ai., 1998, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol., 38, p97-120) .

Presentemente, existem duas isoformas da COX, bem conhecidas, COX-1 e COX-2 (recentemente foi, também, postulada a existência da COX 3) . A COX-1 está presente na maioria dos tecidos e pode ser considerada como uma enzima de manutenção. A actividade da enzima COX-1 protege, por exemplo, o revestimento do tracto gastro-intestinal. No entanto, a COX-2 não está normalmente presente mas aumenta durante a inflamação. Vários dos efeitos secundários dos NSAID estão relacionados com a inibição da enzima COX-1. Os NSAID inibem tanto a COX-1 como a COX-2 (ver Tabelas 1-3) : 2

Tabela 1: Valores da IC50 e proporções C0X-2/C0X-1 de diferentes NSAID, no modelo dos macrófagos de cobaia (valores de IC50 de Engelhart et al. em J. Inflamatory Res., 44, p422-43, 1995) NSAID IC50 da COX-2 (pmol/litro) IC50 da COX-1 (pmol/litro) Selectividade da COX-2 COX-l/COX-2 Meloxicam 0,0019 0,00577 3 Diclofenac 0,0019 0,000855 0,45 Piroxicam 0,175 0,00527 0,030 Tenoxicam 0,322 0,201 0,6 Indometacina 0,00636 0,00021 0,03 Teridep OO 0,393 0,008

Tabela 2: Valores da IC5o para NSAID sobre a COX-1 (células endoteliais bovinas) e a COX-2 (macrófagos estimulados), em células intactas (valores da IC50 de Taketo em J. National Câncer Institute, 90, pl529-1536, 1998) NSAID IC50 da COX-2 (pmol/litro) IC50 da COX-1 (pmol/litro) Selectividade da COX-2 COX-l/COX-2 Asprina 50 0,3 0,006 Indometacina 0,6 0,01 0,02 Ácido tolfenâmico 0,005 0,0003 0,06 Ibuprofeno 15 1 0,07 Acetaminofeno 20 2,7 0,1 Salicilato de sódio 100 35 0,35 BW 755C 1,2 0,65 0,5 3 (continuação) NSAID IC50 da COX-2 (pmol/litro) IC50 da COX-1 (pmol/litro) Selectividade da COX-2 COX-l/COX-2 Flubiprofeno 0,025 0,02 0,8 Carprofeno 3 3 1 Diclofenac 0,35 0,5 1,4 Naproxeno 1,3 2,2 1,7 BF 389 0,03 0,15 5

Tabela 3: Inibição da síntese da PGH humana recombinante (COX-1 e COX-2) (valores da IC50 de Laneuvill et al. em J. Pharm. Exp. Ther., 271, p927-34, 1994) NSAID IC50 da COX-2 (pmol/litro) IC50 da COX-1 (pmol/litro) Selectividade da COX-2 COX-l/COX-2 Indometacina >1000 13,5 <0,01 Sulfureto de sulindac 50,7 1,3 0,03 Piroxicam >500 17,7 0,04 Diclofenac 20,5 2,7 0,13 Flubiprofeno 3,2 0,5 0,16 Meclofenemato 9,7 1,5 0,15 Fenilbutazona >100 16, 0 <0,16 Naproxeno 28,4 4,8 0,17 Ibuprofeno 12,5 4,0 0,3 Cetorolac de trometamina 60,5 31,5 0,5 DHA (22:6) 41 25, 6 0, 6 6-MN A 93,5 64, 0 0,7 Etodolac 60 74,4 1,2 Ácido salicíclico >1000 >1000 -1 4

Durante a última década foram identificados vários novos inibidores selectivos da COX-2 e inibidores da COX-2, designados como "preferidos". Foram desenvolvidos vários destes inibidores da COX-2 e alguns destes chegaram recentemente ao mercado. Alguns destes novos inibidores da COX-2 não apresentam inibição da COX-1 em doses clinicas. Os vastos estudos clínicos e a prática clínica na utilização destes inibidores da COX-2 mostram que estes novos inibidores da COX-2 apresentam vantagens significativas em termos de segurança, em comparação com NSAID não-selectivos. Para revisões dos inibidores da COX-2 ver, por exemplo, Golden et al., 1999, Osteoarthritis. 25, p359-379, Mitchel et al., 1999, Brit. J. Pharmacol., 128, pll21-1132, Lipsky, 1999, Am. J. Med., 106 (5B), p515-575, Taketo, 1998, J. National Câncer Inst., 90, pl529-1537, Griswold et al., 1996, Med. Res. Rev., 16, pl81-206 e Reitz et al., 1995, Ann. Rep. Med. Chem., 30, pl79-188.

Outras publicações de interesse, sobre diferentes inibidores da COX-2 incluem, por exemplo: Lane, 1997, J. Rheumatol., 24 (suppl. 49), p20-24, Mehlish et al., 1998, Clin. Pharmacol. Ther., 63, pl-8, Zhao et al., 1997, Arthritis Rheum., 40 (suppl.), S88, Ehrich et al., 1997, Arthritis Rheum., 40 (suppl.), S93, Maziasz et al., 1997, Arthritis Rheum., 40 (suppl.), S195, Mengle-Gaw et al., 1997, Arthritis Rheum., 40 (suppl.), S93, Morrison, 1999, Clin. Ther., 21, p943-953, Chan et al., 1995, J. Pharmacol. Exp. Ther., 21 A, pl531-37, Riendeau et al., 1997, Br. J. Pharmacol., 121, pl05-117, Black et al., 1999, J. Med. Chem., 42, pl274-81, Cuo et al., 1996, J. Biol. Chem., 271, pl9134-39, Geiss, 1999, Scand. J. Rheumatol., 109 (suppl.), p31-37, Warner et al., 1999, PNAS USA, 96, p7563-68, Bjarnson et al., 1997, Scand. J. Gastroenterol., 32, pl26-130, Danneberg et al., 1999, Semin. Oncol., 26, p499-504, Mitchell et 5 al., 1993, PNAS USA, 90, pll693-97, Futaki et al.f 1994,

Prostaglandins, 47, p55-9, Futaki et al., 1993, J. Pharm. Pharmacol., 45, p753-5, Masferrer et al., 1994, PNAS USA, 91, p3228-32, Klein et al., 1994, Biochem. Pharmacol., 48, pl605-10, Reitz et al., 1994, J. Med. Chem., 37, p3878-81, Seibert et al., 1994, PNAS USA, 91, pl2013-17, Klein et al., 1996, Biochem. Pharmacol., 51, p285-90, Nantal et al., 1998, 9th Intern.

Conference Inflamm. Res. Assoe., Nov 1-5, Pennig et al., 1997, J. Med. Chem., 40, pl347-65 e Puig et al., 2000, J. Med. Chem., 43, p214-223.

Os inibidores da COX-2 são um grupo relativamente diverso de compostos de uma perspectiva da estrutura química. Os compostos que inibem selectivamente a COX-2 são descritos em muitos documentos de patentes da década passada. Alguns destes são os documentos WO 94/26781, WO 94/20480, WO 94/13635, WO 95/00501, WO 94/27980, WO 94/15932, WO 95/21817, WO 95/15316, WO 96/06840, WO 96/03388, WO 96/03387, WO 96/03392, WO 96/25405, WO 96/24584, WO 96/03385, WO 96/16934, WO 98/41516, WO 98/43966, WO 99/12930, EP0 673366, WO 98/41511, WO 98/47871, WO 99/20110, WO 99/23087, WO 99/14194, WO 99/14195, WO 99/15513 e WO 99/15503 e nas patentes US números 5380738, 5344991, 5393790, 5434178, 5474995, 5475018 e 5510368. São actualmente disponibilizados dois compostos, rofecoxib (4-(4-metilsulfonil)fenil)-3-fenil-2(5H)-furanona) (I) no Vioxx® e celecoxib (4-(5-(4-metilfenil)-3-(trifluorometil)-lH-pirazol-1-il)-benzenossulfonamida) (II) no Celebra®: 6

0 Rofecoxib é descrito no documento WO 93/0500501 de Merck Frosst Canada e também em Morrison, 1999, Clin. Ther., 21, p943-953, Chan et al., 1995, J. Pharmacol. Exp. Ther., 274, pl531-37 e em Nantel et al., 1998, supra. O Celecoxib é descrito por Geiss, 1999, Scand. J. Rheumatol., 109 (suppl.), p31-37 e Penning et al., 1997, J. Med. Chem., 40, pl347-65. O Celecoxib é descrito como sendo 375 vezes mais selectivo para a COX-2 em comparação com a COX-1.

Foram avaliados vários outros inibidores da COX-2 em sistemas biológicos e alguns destes são BF 389 (III), CGP 28232 (IV), DFP, DFU (V), DuP 697 (VI), etodolac (VII), FK 3311 (VIII), flosulide (IX), L-745,337 (X), meloxicam (Mobic®, documento US 4233299, 4-hidroxi-2-metil-N-(5-metil-2-tiazolil)-1,l-dióxido-2H-l,2-benzotiazina-3-carboxamida) (XI) , MF triciclico (XII), nimesulide (XIII), NS-398 (XIV) e SC-58125 (XV) : 7

F

(X)

(ΧΙΟ

Os compostos adicionais descritos para a inibição da COX-2 incluem S-2474 (de Shionogi, documento EP 595546, 5(E)—(3,5—di— terc-butil-4-hidroxi)benzilideno-2-etil-l,2-isotiazolidina-l,1-dióxido) (XVI), JTE-522 ou RWK-57504 (4-(4-ciclo-hexil-2-metil- 5-oxazolil)-2-fluorobenzenossulfonamida) (XVII), mesilato de

Darbufelona (Pfizer, documento WO 94/03448, sal de monometanossulfonato de 2-amina-5-((3,5-bis(1,1-dimetiletil)-4-hidroxifenil)metileno-4 (5H)-tiazolona) (XVIII), 6089 (de

Kotobuki Pharmaceutical) (XIX), Valdecoxib (Pharmacia, 9 4-(5-metil-3-fenil-4-isoxazolil)benzenossulfonamida) (XX) ,

Paracoxib de sódio (Pharmacia, sal de sódio de N-( (4-(5-metil-3- fenil-4-isozazolil)-fenil)sulfoni 4-(2-oxo-3-fenil-2,3-di-hidro-oxa (Almirall-Prodesfarma) (XXII) e Co.) : )-propanamida) (XXI), ol-4-il)-benzenossulfonamida Etoricoxib (MK-633, Merck and

(XVII) 0

0=S—OH

10

dos compostos descritos acima, os que têm a estrutura estabelecida na fórmula B abaixo são para utilização na invenção.

As indicações para os inibidores da COX-2 são artrite, patologias de dor musculo-esquelética e dor geral, as quais têm sidom tratadas com NSAID clássicos, tais como indometacina, diclofenac e naproxeno. Recentemente foi também sugerida a utilização de inibidores da COX-2 na terapia do cancro e, provavelmente, também na prevenção do cancro. Os inibidores da 11 COX-2 podem ter também potencial para utilização em relação à doença de Alzheimer e outros processos cerebrais associados à demência.

Os potenciais da utilidade clinica dos inibidores da COX-2 são discutidos em, por exemplo, Nature, 367, p215-216 (1994), em Drug News and Perspectives, 7, p501-512 (1994), em Annual

Reports in Medicinal Chem., 30, pl79-188 (1995) e em Oncogene, 18, p7908-7916 (1999). Não existem quaisquer sugestões especificas para a utilização dos inibidores da COX-2 na terapia antiviral ou, mais especificamente, na terapia de VIH/SIDA e não foram testados quaisquer inibidores da COX-2, em termos dos efeitos anti-VIH. Além disso, não existe qualquer sugestão de utilização dos inibidores da COX-2 (ou dos inibidores da COX não-selectivos) como agentes imuno-estimulantes no tratamento da imunodeficiência de origem virai e não-viral. A infecção com o VIH e a SIDA são um problema de saúde significativo com mais de 33 milhões de pessoas infectadas com o virus em todo o mundo. A maioria das pessoas infectada está localizada em África (Subsariana) e em partes da Ásia. Existem hoje duas classes de compostos anti-SIDA na utilização clinica de rotina; os inibidores da transcritase reversa do VIH e os inibidores da protease do VIH. Os inibidores da transcritase reversa do VIH podem ser divididos em inibidores não-nucleósidos da transcritase reversa (NNRTI) e inibidores nucleósidos da transcritase reversa (NRTI).

Os NNRTI mais frequentemente utilizados são nevirapina, delavirdina, efavirenz, emivirina e T180. Os NRTI mais 12 frequentemente utilizados incluem zidovudina, didanosina, estavudina e zalcitabina. Os inibidores da protease do VIH, úteis clinicamente, incluem inclinavir, palinavir e saquiravir. 0 presente tratamento da infecção com VIH e da SIDA é baseado numa combinação de vários fármacos, designado cocktail de inibidores da transcritase reversa e inibidores da protease. Estas combinações, designadas HAART (terapia anti-retroviral altamente activa), são bastante eficazes e podem reduzir o virus até níveis não detectáveis no sangue do doente. No entanto, a HAART não é uma cura para o doente, uma vez que o vírus está ainda presente nas células imunitárias e a doença pode reaparecer em qualquer momento; são, frequentemente, observados picos de viremia e progressão rápida até à SIDA, após a descontinuação da terapia. Para além disso, a imunodeficiência e a disfunção das células T específica para o VIH persistem durante a HAART. Esta terapia requer o tratamento ao longo da vida e o tratamento é muito dispendioso. 0 custo dos fármacos, apenas, excede frequentemente 15000 USD. São verificados, além disso, vários outros problemas associados com esta terapia; dificuldades na colaboração do doente (regimes de fármaco complicados), desenvolvimento de vírus resistentes, farmacocinética não-ideal e efeitos secundários, tais como por exemplo a supressão da medula óssea e efeitos metabólicos de longo prazo.

Para revisões publicadas recentemente sobre terapia anti-VIH ver, por exemplo: Hilgegroth, 1998, Pharm. uns. Zeit., 1998, 27, p22-25, Hilgegroth, 1998, Pharm. uns Zeit., 7, plll-116, Stellbrink, 1997, Dk Àrztebl., 94, p2497-2503, Rettle et al., 1998, Int. J. STD AIDS, 9, p80-87, de-Clercq, 1998,

Antiviral Res., 38, pl53-179, Gait et al., 1995, TIBTECH, 13, 13 p430-438 e Redshaw et al. em "Emerging Drugs: The Prospects of Improved Medicines", Capitulo 6, pl27-154, 1997.

Em conclusão, apesar das combinações multifármaco como a HAART tenham melhorado significativamente, o prognóstico de doentes sofrendo de infecção com VIH, existe uma necessidade médica de novos compostos para a terapia antiviral do VIH; especialmente de agentes estimulantes do sistema imunitário. A presente invenção responde a esta necessidade. A expressão da COX-2 está normalmente restringida a processos cérebro/cérebro, à sinovia artrítica e locais de danos em tecidos. A COX-2 não é encontrada em nódulos linfáticos ou em linfócitos normais. No entanto, foi agora surpreendentemente verificado que, em murganhos infectados pelo distúrbio de imunodeficiência MAIDS, as células dos nódulos linfáticos expressam níveis elevados da COX-2. Para além disso, células T CD4+ e CD8+ seleccionadas positivamente, assim como células B dos nódulos linfáticos com MAIDS continham níveis aumentados da COX-2 (ver o Exemplo 2) . Foi verificado que esta COX-2 pode ser visada, para o alívio dos sintomas do distúrbio da imunodeficiência, e. g., para o alívio da disfunção de células T, por acção como um imuno-estimulante, e. g., produzindo respostas imunitárias específicas para um antigénio.

Embora não seja pretendida a limitação pela teoria, é considerado que a actividade da COX-2 aumenta a produção da PGE2 a qual, por sua vez aumenta os níveis do cAMP, o qual activa a via sinalizadora da PKA, resultando numa função linfocitária deficiente. 0 trabalho realizado in vivo em murganhos com MAIDS ilustra o facto dos inibidores da COX-2 melhorarem as funções imunitárias das células T (ver o Exemplo 6). 14 A invenção proporciona, deste modo, a utilização de um inibidor da COX-2 de fórmula geral B:

O (R9)m m!

Re

B

O (R7)n em que Y representa um grupo ciclico, de um modo preferido, um grupo oxazolilo, isoxazolilo, tienilo, di-hidrofurilo, furilo, pirrolilo, pirazolilo, tiazolilo, imidazolilo, isotiazolilo, ciclopentenilo, fenilo ou piridilo; n é um número inteiro de 0 a 3; m é um número inteiro de 0 a 4; Rê representa um grupo cetociclilo, cicloalquilo ou arilo, em que o grupo pode ser, opcionalmente, substituído por um ou mais grupos ou átomos, de um modo preferido, por um ou mais átomos de halogéneo; R7, cada um independentemente, representa um substituinte, o qual pode ser qualquer grupo funcional, de um modo preferido, um átomo de hidrogénio ou de halogéneo ou um grupo alquilo, em que o grupo alquilo pode ser substituído por um ou mais grupos ou átomos;

Re representa um grupo alquilo ou NHRio; 15 R9 representa um átomo de halogéneo; e

Rio representa um átomo de hidrogénio ou um grupo alquilo, opcionalmente, substituído por um ou mais grupos ou átomos, de um modo preferido, por um grupo acilo; ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, na preparação de um medicamento para o alívio da disfunção das células T num humano com VIH ou SIDA, em que o referido medicamento é formulado para administração oral.

Como aqui utilizado, a actividade aumentada da COX-2 refere-se a níveis aumentados de actividade, quer pela produção de mais moléculas COX-2 (e. g., expressão aumentada) e/ou de mais moléculas activas (e. g., conversão de formas latentes a activas ou remoção da inibição da forma activa). De um modo preferido, o referido distúrbio, é tipificado pela função imunitária diminuída, i. e., é uma patologia de imunodeficiência e. g., apresenta disfunções linfocitárias. Como aqui utilizado, "imunodeficiência" refere-se a uma função deficiente das células envolvidas nas respostas imunitárias normais, particularmente, células B e T. Deste modo, os compostos aqui descritos podem ser utilizados na obtenção de efeitos imuno-estimulantes para a intensificação das respostas imunitárias. Deste modo, é considerado que os inibidores da COX-2 têm efeitos imunomodulantes.

Os indivíduos que podem ser tratados são humanos. Como aqui utilizado, "tratamento" refere-se à redução ou alívio, de um 16 modo preferido, até níveis normais, de um ou mais dos sintomas do referido distúrbio, e. g., infecciosidade ou uma redução ou alívio da disfunção imunitária. "Prevenção" refere-se à prevenção absoluta, i. e., ausência de agente infeccioso detectável, e. g., vírus e/ou manutenção de níveis normais com referência a um sintoma particular (e. g., actividade da COX-2) ou redução ou alívio da extensão ou do momento (e. g., atraso) do estabelecimento desse sintoma. A enzima ciclo-oxigenase 2 é um novo alvo para a terapia de VIH/SIDA. 0 termo "inibidor da COX-2" designa um composto com capacidade de inibição da enzima ciclo-oxigenase 2, sem inibição significativa da ciclo-oxigenase 1, quando administrado numa concentração particular. De um modo preferido, este inclui compostos tendo uma selectividade para a inibição da ciclo-oxigenase-2, em relação à inibição da ciclo-oxigenase-1 (e. g., como determinado pela proporção COX-1:COX-2 na IC8o de acordo com o teste de WHMA, ver abaixo) de, pelo menos, 10 de um modo mais preferido de pelo menos, 50 e de um modo ainda mais preferido de, pelo menos, 100. (A proporção de selectividade de um composto específico irá variar com o ensaio biológico e com a forma sob a qual este é expresso (de um modo preferido, expresso como a proporção COX-1 :COX-2 na IC50 ou na IC8o), ver tabelas 1-4). As proporções aqui descritas referem-se a dados obtidos em um ou mais ensaios da COX bem conhecidos relevantes, utilizando, de um modo preferido, enzimas humanas purificadas, e. g., a proporção dos valores na IC50, por exemplo, como determinado por Engelhart et al., 1995, supra. No entanto, de um modo preferido, o teste é o teste de WHMA como descrito abaixo.

Foram realizadas várias análises das potências relativas da COX-1 e da COX-2, utilizando uma ampla gama de sistemas de 17 ensaio, desde enzimas purificadas isoladas a células intactas e modelos celulares de várias espécies. No entanto, presentemente, o modelo o mais amplamente aceite é o ensaio do sangue humano total (WBA) e uma versão modificada do ensaio de sangue total humano modificado por William Harvey (WHMA), o qual é o ensaio preferido. Estes ensaios utilizam células humanas facilmente disponíveis para testes, as quais são preferidas para utilização humana dos compostos. Estes têm, também, em consideração a ligação de NSAID às proteínas do plasma. Para além disso, a avaliação da selectividade é, de um modo preferido, realizada para a ICso e não para a ICso, uma vez que as curvas de concentração para a inibição da COX-2 e COX-1 não são paralelas e uma vez que a maioria dos compostos são utilizados em doses que fornecem concentrações plasmáticas no estado estacionário próximas de 80% de inibição (Warner et ai., 1999, PNAS USA, 96, p7563-7568)

No ensaio de WBA para a análise da COX-1, o sangue é tratado com o agente de teste, seguido após 60 min por ionóforo de cálcio e é incubado durante 30 min, ao fim dos quais o plasma é recolhido. Para a análise da COX-2, o sangue é tratado com aspirina, para inibir a COX-1 e após 6 horas com lipopolissacárido e agente de teste e é incubado durante 18 horas ao fim das quais o plasma é recolhido. Subsequentemente, o conteúdo em tromboxano B2 no plasma é avaliado por radioimunoensaio, como uma medida da actividade da COX.

No ensaio de WHMA, a análise da COX-1 é realizada como acima. Para a análise da COX-2, o sangue é tratado com meio condicionado, proveniente de culturas de células de epitélio de tracto respiratório humano (A549), expostas à interleucina 1β durante 24 horas e é incubado com este meio, juntamente com o 18 agente de teste durante 60 min, ao fim dos quais é adicionado ionóforo de cálcio seguido após 30 min por diclofenac para inactivar a produção de prosanóides. Subsequentemente, o plasma é recolhido e analisado para o seu conteúdo em prostaglandina E2 no plasma por radioimunoensaio como uma medida da actividade da COX-2. Os tempos de incubação para a avaliação das actividades da COX-1 e da COX-2 são semelhantes neste último ensaio o que torna as actividades mais comparáveis e o WHMA o ensaio preferido. A selectividade baseada em COX-2/WHIKA-COX-1 na ICso, utilizando este ensaio, é apresentada na Tabela 4 em que 0,2 e 0,02 representam, respectivamente, selectividades de 5 e 50 vezes para a COX-2.

Tabela 4: (Proporção COX-2/COX-1 na IC8or de acordo com o teste de WHMA obtido de Warner, et al., supra):

Composto Proporção COX-2/WHMA-COX-1 na ICso Di-isopropilfluorofosfato <0,01 L-745337 <0,01 rofecoxib 0,015 NS398 <0,05 SC58125 <0,01 (ensaio de WBA) etodolac 0,043 meloxicam 0,091 celecoxib 0,11 nimesulide 0,17 19

Consequentemente, numa característica preferida, a proporção de selectividade é determinada de acordo com o ensaio de WHMA na IC8o e os compostos tendo uma proporção de selectividade da C0X-2:C0X-1 inferior a 0,2, de um modo preferido, inferior a 0,05, e. g., inferior a 0,02, de um modo preferido, inferior a 0,01, e. g., <0,005, são particularmente preferidos para utilização em métodos da invenção. Referido de outro modo, os compostos preferidos têm uma proporção de selectividade COX-l:COX-2 (de acordo com o ensaio de WHMA na IC8o) de mais de 2, de um modo preferido, mais de 5, de um modo especialmente preferido, mais de 50 ou 100 como referido anteriormente. "Inibição" como aqui referido, refere-se a uma redução mensurável da actividade da ciclo-oxigenase-2. Isto pode ser realizado pela afectação da transcrição, tradução, modificação pós-tradução ou da actividade da COX-2. No entanto, de um modo preferido, a inibição é realizada pela inibição da actividade enzimática, i. e., por interferência com o sitio activo das moléculas COX-2 activas pré-existentes.

De um modo preferido, os inibidores da COX-2 têm uma ICso da COX-2 inferior a cerca de 0,5 pmol/litro, de um modo mais preferido, inferior a, cerca de, 0,2 pmol/litro.

Os inibidores da COX-2 para utilização na invenção compreendem compostos de fórmula geral B, abaixo 20

em que Y representa um grupo cíclico, de um modo preferido, seleccionado de oxazolilo, isoxazolilo, tienilo, di- hidrofurilo, furilo, pirrolilo, pirazolilo, tiazolilo, imidazolilo, isotiazolilo, ciclopentenilo, fenilo e piridilo; n é um número inteiro de 0 a 3; m é um número inteiro de 0 a 4; R-6 representa um grupo cetociclilo, cicloalquilo ou arilo, em que o grupo pode ser, opcionalmente, substituído por um ou mais grupos ou átomos, de um modo preferido, por um ou mais átomos de halogéneo, tal como flúor; R7, cada um independentemente, representa um substituinte, o qual pode ser qualquer grupo funcional, de um modo preferido, um átomo de hidrogénio ou halogéneo, de um modo preferido, flúor ou bromo ou um grupo alquilo (de um modo preferido, -CH3), em que o grupo alquilo pode ser substituído por um ou mais grupos ou átomos, de um modo preferido, por um ou mais átomos de flúor, por exemplo, -CF3; 21

Re representa um grupo alquilo, de um modo preferido -CH3 ou NHR10, de um modo preferido -NH2; R9 representa um átomo de halogéneo, de um modo preferido, flúor; e

Rio representa um átomo de hidrogénio ou um grupo alquilo, opcionalmente, substituído por um ou mais grupos ou átomos, de um modo preferido, por um grupo acilo; ou um derivado ou um seu sal farmaceuticamente aceitável.

Esta classe de compostos é reivindicada como agentes anti-angiogénicos no documento US 6025353 e uma descrição adicional de substituintes preferidos e dos compostos de acordo com a presente invenção é a mesma que no documento US 6025353.

De um modo preferido, nesses compostos, Rs é -NH2 ou -CH3. Em compostos preferidos adicionais, Y é um grupo pirazolilo, furilo ou tienilo. De um modo preferido, Rô é um grupo arilo, opcionalmente, substituído com um ou mais átomos de flúor. De um modo preferido, n é 1 ou 2. De um modo preferido, R7 é um átomo de bromo, um grupo acilo ou um grupo alquilo substituído, tal como -CF3.

Os compostos especialmente preferidos de fórmula B para utilização na invenção são compostos aqui descritos designados celecoxib, rofecoxib, DuP-697, SC-58125, DFU e MF tricíclico.

Como aqui utilizado, o termo "alquilo" inclui qualquer grupo hidrocarboneto alifático, saturado ou insaturado, de cadeia linear, ramificado ou cíclico, de cadeia longa ou curta, 22 opcionalmente, mono ou poli substituído por grupos hidroxilo, alcoxilo, aciloxilo, nitro, alcoxicarboniloxilo, amina, arilo, oxo ou halo, a menos que especificamente estabelecido de outra forma. Os grupos alquilo insaturados podem ser mono ou poli-insaturados e podem incluir, tanto grupos alcenilo como alcinilo. Esses grupos podem conter até 40 átomos de carbono, de um modo preferido, 1 a 10.

Como aqui utilizado, os anéis cíclicos são, de um modo preferido, C5-7 e opcionalmente contêm um ou mais heteroátomos, seleccionados de oxigénio, azoto e enxofre. 0 termo "acilo", como aqui utilizado, inclui, tanto grupos carboxilato, como carbonato, deste modo, por exemplo, grupos alquilo substituídos com aciloxilo incluem, por exemplo, alquilcarboniloxilalquilo. Nesses grupos, quaisquer partes alquileno têm, de um modo preferido, conteúdos em átomos de carbono definidos para os grupos alquilo acima. Os grupos arilo preferidos incluem fenilo e heteroaromáticos monocíclicos com 5-7 membros, especialmente, fenilo e esses grupos podem ser eles próprios opcionalmente substituídos.

Os grupos alquilo substituídos Ri, representativos, incluem alcoxialquilo, hidroxialcoxialquilo, poli-hidroxialquilo, hidroxipolialquileno-oxialquilo e semelhantes, tais como os grupos alcoximetilo, alcoxietilo e alcoxipropilo ou os grupos aciloximetilo, aciloxietilo e aciloxipropilo, e. g., pivaloiloximetilo.

Como aqui utilizado, os grupos substituídos podem ser mono ou poli substituídos por grupos hidroxilo, alcoxilo, aciloxilo, 23 nitro, alcoxicarboniloxilo, amina, arilo, oxo ou halo, menos que especificamente preferido de outra forma.

No entanto, os compostos particularmente preferidos são: rofecoxib, SC-58125 e celecoxib.

Os métodos de produção de inibidores da COX-2 para utilização de acordo com a invenção são bem conhecidos dos especialistas na técnica, particularmente, como descrito na literatura referida acima.

Um inibidor da COX-2, para utilização na presente invenção pode conter um ou mais centros assimétricos e/ou uma ou mais ligações duplas, i. e., a invenção estende-se à utilização de isómeros e racematos dos compostos aqui divulgados. Todos esses isómeros possíveis encontram-se dentro do âmbito da presente invenção. 0 inibidor da COX-2 pode estar sob a forma de uma mistura isomérica de compostos ou, de um modo mais preferido, sob a forma de um isómero purificado ou de um seu sal farmaceuticamente aceitável. A composição farmacêutica do(s) inibidor(es) da COX-2 para o tratamento de patologias de acordo com a invenção pode ser formulada sob a forma de sais farmaceuticamente aceitáveis e pode, também, conter veículos farmaceuticamente aceitáveis bem conhecidos na técnica.

Por "farmaceuticamente aceitável" é pretendido significar que o ingrediente deve ser compatível com outros ingredientes na composição, assim como deve ser fisiologicamente aceitável para o receptor. 24

Se o inibidor da COX-2 é básico, podem ser preparados sais a partir de ácidos não-tóxicos farmaceuticamente aceitáveis, incluindo ácidos inorgânicos e orgânicos. Os sais particularmente preferidos são os sais dos ácidos clorídrico, bromidrico, fosfórico, sulfúrico, cítrico, maleico, cítrico e tartárico.

Se o inibidor da COX-2 é acídico, podem ser preparados sais a partir de bases não-tóxicas farmaceuticamente aceitáveis, incluindo bases inorgânicas ou orgânicas. Os sais particularmente preferidos são os sais de sódio, potássio e meglumina.

Como discutido acima, as composições irão ser adequadas para a administração oral.

Para todas as formas de administração, o inibidor da COX-2 é administrado em formulações de unidade de dosagem contendo, normalmente, transportadores, adjuvantes e veículos, bem conhecidos, farmaceuticamente aceitáveis. Deste modo, o ingrediente activo pode ser incorporado, opcionalmente, em conjunto com outras substâncias activas, como uma preparação combinada, com um ou mais veículos, diluentes e/ou excipientes convencionais, para a produção de preparações galénicas convencionais, tais como, comprimidos, pílulas, pós, losangos, saquetas, hóstias, elixires, suspensões, emulsões, soluções, xaropes, aerossóis (sob a forma de um sólido ou num meio líquido), unguentos, cápsulas de gelatina moles e rígidas, supositórios, soluções injectáveis estéreis, pós empacotados estéreis. Podem ser, também, utilizados polímeros biodegradáveis (tais como, poliésteres, polianidridos, ácido poliláctico ou ácido poliglicólico), em implantes sólidos. As composições podem 25 ser estabilizadas pela utilização de liofilização, subarrefecimento ou Permazyme.

Os excipientes, veículos ou diluentes adequados são lactose, dextrose, sacarose, sorbitol, manitol, amidos, goma de acácia, fosfato de cálcio, aglinatos, tragacanto, gelatina, silicato de cálcio, celulose microcristalina, polivinilpirrolidona, celulose, xarope de água, água, água/etanol, água/glicol, água/polietileno, glicol, propilenoglicol, metilcelulose, metil-hidroxibenzoatos, hidroxibenzoatos de propilo, talco, estearato de magnésio, óleo mineral ou substâncias gordas, tais como gorduras sólidas ou suas misturas adequadas. As composições podem incluir, adicionalmente, agentes lubrificantes, agentes molhantes, agentes emulsionantes, agentes de suspensão, agentes conservantes, agentes adoçantes, agentes aromatizantes, intensificadores de adsorção, e. g., para a distribuição nasal (sais da bílis, lecitinas, tensioactivos, ácidos gordos, quelantes) e semelhantes. As composições da invenção podem ser formuladas de forma a proporcionar a libertação rápida, prolongada ou retardada do ingrediente activo após a administração ao doente pela utilização de processos bem conhecidos na técnica. 0 ingrediente activo para a administração pode ser apropriadamente modificado para utilização numa composição farmacêutica. Por exemplo, o ingrediente activo pode ser estabilizado, por exemplo, pela utilização de aditivos apropriados, tais como, sais ou não-eletrólitos, acetato, SDS, EDTA, tampões citrato ou acetato, manitol, glicina, HSA ou polissorbato. 26

Podem ser formulados conjugados para proporcionar lipofilicidade melhorada, aumentar o transporte celular, aumentar a solubilidade ou permitir o direccionamento. Estes conjugados podem ser quebráveis, de forma a que o conjugado se comporte como um pró-fármaco. A estabilidade pode ser, também, conferida pela utilização de complexos metálicos apropriados, e. g., com Zn, Ca ou Fe. 0 ingrediente activo pode ser formulado num veiculo apropriado, para distribuição ou para visar células, orgâos ou tecidos particulares. Deste modo, as composições farmacêuticas podem tomar a forma de microemulsões, lipossomas, niossomas ou nanoparticulas, aos quais o ingrediente activo pode ser absorvido, adsorvido, incorporado ou ligado. Isto pode converter efectivamente o produto numa forma insolúvel.

Estas partículas podem transportar moléculas superficiais apropriadas para melhorar o tempo de circulação (e. g., componentes de soro, tensioactivos, polioxamina908, PEG, etc.) ou partes, para o direccionamento especifico para um local, tais como ligandos para receptores particulares presentes na célula. As técnicas apropriadas para a distribuição de fármacos e para o direccionamento são bem conhecidas na técnica, mas ver, por exemplo, Kreuter, 1994, Eur. J. Drug Metab. Pharmacokinet., 3, p253-256; Shen, 1997, J. Drug Targeting, 5(1), pll-13; Mrsny, 1997, J. Drug Targeting, 5(1), p5-9; Pettit e Gombotz, 1998, TIBTECH, 16, p343-349; e Duncan, 1997, J. Drug Targeting, 5(1), pl-4, no que se refere ao direccionamento de fármacos e Simari e Nabel, 1996, Semin. Intervent. Cardiol., 1, p77-83; Torchilin, 1998, J. Microencapsulation, 15(1), pl-19; Klyashchitsky e Owen, 1998, J. Drug Targeting, 5(6), p443-458; Kreuter, 1996, J. Anat., 189, p503-505; Fasano, 1998, TIBTECH, 16, pl52-157; 27

Kataoka et al., 1993, 24, pll9-132; Anderson, 1998, Nature, 392(suppl), p25-30; Langer, 1998, Nature, 392(suppl), p5-10; Gregoriadis, 1995, TIBTECH, 13, p527-536; Gregoriadis et al., 1997, FEBS Lett., 402, pl07-110; Rolland, 1998, Criticai Reviews ín Therapeutic Drug Carrier Systems, 15(2), pl43-198; Hope et al., 1998, Molec. Memb. Biol., 15, pl-14; e Scherman et al., 1998, Curr. Opinion Biotech., 9(5), p480-485, no que se refere à distribuição de moléculas peptidicas e de ácidos nucleicos. Para um exemplo de direccionamento dirigido para um local especifico, ver, por exemplo, Scháfer et al., 1992, Pharm. Res., 9, p541-546, no qual podem ser acumuladas nanoparticulas em macrófagos infectados com VIH. Esses métodos têm, evidentemente, aplicações particulares nos métodos da invenção aqui descrita. É pretendido que esses ingredientes activos, derivatizados ou conjugados estejam incluídos na definição de moléculas inibidoras, as quais são utilizadas de acordo com a invenção.

Deste modo, por exemplo, a composição farmacêutica para utilização oral contém o(s) ingrediente(s) activo(s) e agentes adequados, fisiologicamente aceitáveis, para formar comprimidos, cápsulas, soluções, suspensões ou outras formulações bem conhecidas para administração oral. Essas composições podem ser preparadas de acordo com qualquer método conhecido para a produção de composições farmacêuticas orais. Essas composições podem conter um ou mais agentes biologicamente activos e um ou mais agentes seleccionados do grupo dos agentes conservantes, diluentes inertes, agentes de aumento da viscosidade, agentes corantes, agentes adoçantes, agentes granulantes, agentes desintegrantes, agentes ligantes, agentes activos osmóticos, agentes molhantes, agentes de suspensão, materiais para a preparação de formulações de retardamento, óleos e água. 28 0 ingrediente activo nessas composições pode compreender desde cerca de 0,01% a cerca de 99% em peso da formulação, de um modo preferido, de cerca de 0,1 a cerca de 50%, por exemplo, 10%.

Para o tratamento de distúrbios de acordo com a invenção os níveis de dose por dia situam-se na gama de 0, 005 mg a cerca de 150 mg/kg do peso corporal. A dose depende fortemente da selecçâo do composto inibidor da COX-2, da situação clínica (tipo de vírus, estado da infecção e patologia do doente), da idade e peso do doente, da via de administração e da utilização total de fármacos pelo doente, incluindo o período de tempo do processo de tratamento. As doses mais preferidas irão situar-se, normalmente, entre 0,01 mg e 50 mg/kg do peso corporal, diariamente e, de um modo ainda mais preferido, entre 0,05 mg a 20 mg/kg do peso corporal, diariamente. Deste modo, por exemplo, podem ser administrados 25 mg de rofecoxib ou 200 mg de celecoxib, diariamente, por administração oral a um humano adulto.

As unidades de dosagem situam-se geralmente entre 1 mg e 500 mg do ingrediente activo.

De acordo com um aspecto da presente invenção, um inibidor da COX-2 pode ser combinado com um ou mais de outros inibidores da COX-2, para o tratamento de distúrbios como aqui descrito, e. g., uma imunodeficiência ou infecção virai.

De acordo com um outro aspecto da presente invenção, o inibidor da COX-2 definido acima pode ser combinado com um ou mais inibidores da COX-2 adicionais ou com um ou mais de outros 29 fármacos, com modos diferentes de acção, para o tratamento do distúrbio, e. g., a imunodeficiência, infecção com VIH ou SIDA. 0 inibidor da COX-2 em combinação com um ou mais NNRTI ou em combinação com um ou mais NRTI ou em combinação com um ou mais inibidores da protease do VIH ou um ou mais HAART em combinação com o inibidor da COX-2, podem ser exemplos dessas combinações.

Num aspecto adicional, a presente invenção proporciona utilizações, as quais combinam um ou mais inibidores da COX-2 com compostos que melhoram a tolerância do ingrediente activo, especialmente durante o tratamento a longo prazo. Os compostos típicos incluem anti-histamínicos e inibidores da bomba de protões. A invenção é descrita, adicionalmente, nos Exemplos seguintes com referência às Figuras seguintes. A Figura 1 mostra os níveis de AMP cíclico, após a infecção da MAIDS em células CD8+(A), CD4+(B) e B(C). Foram isoladas células mononucleares a partir de nódulos linfáticos de murganhos infectados com MAIDS ao longo de vários períodos de tempo e foram separadas em células CD4 + , CD8+ e B, por selecção negativa, utilizando um separador celular FACS. Os níveis intracelulares do cAMP foram avaliados por sonicação e radioimunoensaio. As barras representam a média ± SD (n=3 murganhos individuais); A Figura 2 mostra os níveis do cAMP na MAIDS em populações CD4+, negativas e positivas para Thy-1.2. As células dos nódulos linfáticos de três murganhos infectados e de três controlos com idades correspondentes foram separadas, por FACS, nas populações CD4+, Thy-1.2+ (barras não preenchidas) 30 e CD4 + , Thy-1.2- (barras preenchidas) e os níveis intracelulares do cAMP foram avaliados como na Figura 1. As barras representam a média ± SD (n=3); A Figura 3 mostra os níveis da actividade da cinase da proteína A em murganhos com MAIDS vs do tipo selvagem. (A) Foram examinadas as actividades de cinase, utilizando Kemptido como substrato, na presença (actividade total, barras sombreadas) ou na ausência (actividade livre, barras preenchidas) de cAMP 5 μΜ, em extractos solubilizados com detergente de células de nódulos linfáticos, purificados a partir de baços de murganho. A actividade de fosfotransferase não inibida pelo inibidor da cinase de proteína específico para PKA (PKI, 1 μΜ) foi subtraída, para mostrar apenas a actividade específica para a PKA. São apresentadas as actividades em murganhos infectados (MAIDS; n=4) em relação às dos seus irmãos do tipo selvagem. (B) Foi medida a ligação de [3H-cAMP] nos mesmos extractos que em (A) e foram calculadas as quantidades molar do monómero R; A Figura 4 mostra a imunolocalização da subunidade C da PKA em células de murganhos com MAIDS e do tipo selvagem. As células mononucleares de murganhos de controlo (painel superior) e de murganhos infectados com MAIDS (dois painéis inferiores) foram ligadas a lâminas de vidro num equipamento cytospin (400 x g) , foram fixadas e foram imunocoradas com anticorpo policlonal anti-PKA-C e anticorpo secundário conjugado com HRP (coloração castanha). A contracoloração é realizada com hematoxilina (coloração azul da cromatina); 31 A Figura 5 mostra o efeito do antagonista da PKA do tipo I Rp-8-Bromo-cAMP-fosforotioato (Rp-8-Br-cAMPS) sobre a função das células T em murganhos com MAIDS e do tipo selvagem. A proliferação de células T estimuladas com TCR/CD3 foi avaliada com células T isoladas provenientes de murganhos com MAIDS (A) e murganhos de controlo não infectados (B) . Nas mesmas experiências foi examinado separadamente o efeito de concentrações crescentes do agonista do cAMP (8-CPT-cAMP) sobre a proliferação de células T CD3+ estimuladas com TCR/CD3, isoladas a partir de murganhos com MAIDS (circulos não preenchidos, linha tracejada) e de controlo (círculos preenchidos e linha continua) (C). São apresentados os valores médios das determinações em triplicado ± SD. Ver a Tabela 4 para dados resumidos (n=ll). Nota: A escala difere em A e B, enquanto que, em C, a proliferação induzida por TCR/CD3, na ausência do agonista do cAMP está normalizada para 100%, tanto para células T com MAIDS, como de controlo; A Figura 6 mostra a secreção da PGE2, in vitro, por células normais e de nódulos linfáticos de MAIDS. Foram cultivados células dos nódulos linfáticos não separadas provenientes de murganhos infectados com MAIDS (barras preenchidas, n=9), 20 semanas após a infecção e de murganhos de controlo com idades correspondentes (barras sombreadas, n=4), durante 48 h em meio completo, após o que, os niveis segregados da PGE2 nos sobrenadantes foram medidos por ELISA; A Figura 7 mostra o efeito de um inibidor não-selectivo da COX, sobre a função imunitária de células T, em murganhos normais e infectados com MAIDS. Coluna 1 - murganhos de 32 controlo + anti-CD3; coluna 2 - murganhos de controlo + anti-CD3+ indometacina; coluna 3 - murganhos com MAIDS + anti-CD3; coluna 4 - murganhos com MAIDS + anti-CD3+ indometacina. Foram avaliadas as respostas proliferativas das células T, numa população mista de células mononucleares de nódulos linfáticos não separadas, por

incorporação de [3H]-timidina, na ausência e na presença do inibidor não-selectivo da COX indometacina (50 ng/mL). A activação das células T foi realizada por reticulação de anti-CD3 (mAb 2C11; 4 pg/mL). As barras mostram os valores médios ± SD, dos murganhos de controlo (n=3) e infectados com MAIDS (n=5), ver a Tabela 5 para dados adicionais. As células foram cultivadas durante 72 h, durante as quais foi incluída [3H]-timidina nas últimas 4 h; A Figura 8 mostra a expressão da COX-2 por subconjuntos diferentes de linfócitos dos nódulos linfáticos, em murganhos normais (A) e infectados com MAIDS (B). As células T CD4 + , T CD8+ e B foram separadas por FACS por selecção positiva com base, respectivamente, na expressão das moléculas CD4, CD8 e B220. As células CDllb- foram separadas por selecção negativa (com base na ausência de CDllb). Foram, então, lisadas células de murganhos infectados com MAIDS e normais e foram submetidas 10 pg de proteína de cada amostra, a análise por imunotransferência da expressão da COX-2. As transferências foram feitas reagir, simultaneamente, com anticorpos contra actina como controlo; A Figura 9 mostra a expressão de CDllb em células dos nódulos linfáticos com MAIDS e do tipo selvagem. É apresentada a expressão de CDllb (por citometria de fluxo) 33 pelos diferentes subconjuntos de linfócitos dos nódulos linfáticos (células T CD4 + , CD8+ e células B B220+) de murganhos infectados com MAIDS e de controlo. Rl: CDllb elevado; R2: CDllb escuras e R3: CDllb-.; A Figura 10 mostra os níveis de expressão da COX-2 em nódulos linfáticos de murganhos infectados com MAIDS e de murganhos do tipo selvagem. Os nódulos linfáticos foram crio-seccionados e foram submetidos a coloração imuno-histoquímica para COX-2 (coloração castanha). (a) Nódulos linfáticos normais de controlo com o centro germinal corado para a COX-2. (b) Nódulos linfáticos normais numa ampliação mais elevada. As células com coloração positiva para a reacção de coloração da HRP são macrófagos com "corpos tingíveis" com material ingerido (setas) . c. Nódulo linfático de murganhos infectados com MAIDS (semana 20 após infecção). Nota: morfologia e arquitectura alteradas, d. Ampliação mais elevada de nódulo linfático com MAIDS, corado para a COX-2. Nota: número de células com imunocoloração castanha no citoplasma e numerosas figuras mitóticas; A Figura 11 mostra o efeito da administração in vivo de um inibidor não-selectivo da COX, sobre a a função imunitária de células T de doentes infectados com VIH. As respostas proliferativas das células T foram avaliadas em células T CD3+ como a incorporação de [3H]-timidina de 3 doentes (doentes 1 a 3), participando num ensaio clínico de fase II e recebendo 25 mg de indometacina três vezes por dia oralmente durante 14 dias, para além de terapia de combinação tripla. Os painéis superiores mostram a função imunitária das células T no dia 0, dia 14 (após tratamento 34 de 2 semanas) e no dia 28 (2 semanas após a descontinuação), legendada, respectivamente, como colunas 1, 2 e 3. A activação das células T foi realizada por reticulação de anti-CD3 (mAb SpVT3b). A: proliferação basal após activação das células T; B: proliferação na presença de Rp-8-Br-cAMPS (1 mM); Nota: o grau da imunodeficiência mediada pelo cAMP é evidente, por comparação entre o painel superior e o inferior. As barras mostram valores médios ± SD de determinações em triplicado. As células foram cultivadas durante 72 h, durante as quais foi incluída [3H]-timidina, nas últimas 16 h; A Figura 12 mostra o efeito da administração in vivo de um inibidor não-selectivo da COX indometacina na proliferação de células T de doentes infectados com VIH, como descrito na Figura 11, mas para 7 doentes, indicados, respectivamente, para os doentes 1 a 7, por círculos preenchidos, círculos não preenchidos, triângulos preenchidos, triângulos não preenchidos, quadrados preenchidos, quadrados não preenchidos e losangos preenchidos. São representados os valores médios das determinações em triplicado, as linhas de ligação mostram o evolução de cada doente; A Figura 13 mostra o efeito do rofecoxib, um inibidor específico da COX-2, sobre a função imunitária das células T em murganhos infectados com MAIDS. As respostas proliferativas das células T foram avaliadas numa população mista de células mononucleares de nódulos linfáticos, não separadas por incorporação de [3H]-timidina, na ausência e na presença de concentrações crescentes (1,9 a 500 nM) do inibidor rofecoxib, específico da COX-2. A activação das 35 células T foi realizada pela reticulação de anti-CD3 (mAb 2C11; 4 pg/mL). São apresentados os valores médios das determinações em triplicado em conjunto com uma curva sigmóide ajustada. As células foram cultivadas durante 72 h, durante as quais foi incluída [3H]-timidina nas últimas 4 h; A Figura 14 mostra o efeito do celecoxib, um inibidor específico da COX-2, sobre a função imunitária das células T em murganhos infectados com MAIDS, como descrito na Figura 13 para o rofecoxib; A Figura 15 mostra o efeito do rofecoxib e do celecoxib, em comparação com a indometacina na secreção de PGE2 por células dos nódulos linfáticos (LN), ex vivo, para murganhos de controlo (1) ou murganhos com MAIDS (2) . As células dos LN não separadas foram cultivadas em meio completo na presença ou na ausência do indutor da PGE2, lipopolissacárido (LPS; 4 pg/mL); do inibidor não-específico da ciclo-oxigenase, indometacina (50 ng/mL); e dos inibidores específicos da COX-2, rofecoxib (0,125 pM) e celecoxib (0,125 pM). A concentração de PGE2 nos sobrenadantes foi medida por EIA, após 48 h. Foram analisados 3 murganhos infectados individuais (semana 20) e grupos de 3 controlos com idades correspondentes, são apresentadas as médias ± desvios de padrões; e A Figura 16 mostra o efeito do tratamento in vivo de murganhos com MAIDS com rofecoxib sobre a função imunitária das células T. Os murganhos com MAIDS foram mantidos sem tratamento (sem tratamento 1 a 3) ou foram tratados com rofecoxib por via oral (3 mg/kg/dia, administrados uma vez, 36 diariamente com tratamento 1 e 2), durante sete dias, administrado através de um tubo inserido no ventrículo. Subsequentemente, as respostas proliferativas das células T foram avaliadas in vitro numa população mista de células mononucleares de nódulos linfáticos não separadas, de animais tratados e não tratados por incorporação de [3H] -timidina, na ausência (colunas A) e na presença de Rp-8-Br-cAMPS (0,5 ou 1,0 mM, respectivamente, colunas B e C) . A activação das células T foi obtida, em todas as amostras por reticulação de anti-CD3 (mAb 2C11; 4 pg/mL). 0 controlo representa a proliferação das células T em murganhos não infectados. São apresentados os valores médios de determinações em triplicado. As células foram cultivadas durante 72 h, durante as quais foi incluída [3H]-timidina nas últimas 4 h; A Figura 17 mostra o efeito do tratamento, in vivo, de murganhos com MAIDS com rofecoxib ou celecoxib sobre a função imunitária das células T. Os murganhos com MAIDS foram injectados com veículo (intralipid), foram tratados com rofecoxib no intralipid, por injecção intraperitoneal (3 mg/kg/dia, administrados uma vez, diariamente, n=6) ou foram tratados com celecoxib, por injecção intraperitoneal (20 mg/kg/dia, administrados uma vez, diariamente, n=5), durante 18 a 20 dias. Subsequentemente, foram avaliadas as respostas proliferativas das células T in vitro como descrito para a Figura 16, mas sem Rp-Br-cAMPs. O controlo representa a proliferação das células T em murganhos não infectados. São apresentados os valores médios das determinações em triplicado (círculos negros), juntamente com o percentil de 25 a 75% (áreas enquadradas) e número médio (linha na caixa). As barras representam a gama; e 37 A Figura 18 mostra o efeito do tratamento, in vivo, de murganhos com MAIDS com meloxicam, sobre a função imunitária das células T. Foram implantadas, subcutaneamente, bombas osmóticas (Alzet, 100 pL) com meloxicam (velocidade de libertação de 70 pg/animal/dia) ou com soro fisiológico tamponado com fosfato (PBS), em murganhos com MAIDS (14 semanas após a infecção) e murganhos saudáveis durante 14 dias. a), Subsequentemente, foram avaliadas as respostas proliferativas das células T in vitro como descrito para a Figura 17. São apresentados os valores médios ± erro padrão da média (s.e.m), de cada grupo. O efeito do tratamento com meloxicam sobre a proliferação estimulada com anti-CD3 de células de murganhos com MAIDS (barras preenchidas) em comparação com o dos murganhos com MAIDS que receberam PBS (barras não preenchidas) é significativo (p<0,05). b), foi adicionado de novo meloxicam (2,5 pg/mL) às culturas mistas de nódulos linfáticos dos grupos de murganhos de a), tratados in vivo com meloxicam ou PBS em cultura celular in vitro, a proliferação de células T induzida por anti-CD3 foi avaliada como em a) e o efeito do meloxicam adicionado de novo in vitro (barras não preenchidas) foi comparado com a resposta das células sem adição in vitro (barras preenchidas) (p=0,005) . c) , foi adicionado Rp-8-Br-cAMPS (0,5 mM) às culturas de células in vitro de culturas mistas de nódulos linfáticos dos grupos de murganhos em a) , tratados in vivo com meloxicam ou PBS, a proliferação de células T induzida por anti-CD3 foi avaliada como em a) e o efeito de Rp-8-Br-cAMPS in vitro (barras não preenchidas) foi expresso como o número de vezes que a indução era superior à das células que não receberam qualquer adição in 38 vitro (barras preenchidas). As estatísticas foram analisadas pelo teste U de Mann-Whitney, para a comparação entre dois grupos de animais e com o Teste dos Pares Combinados de Wilcoxon, para comparação entre o mesmo grupo com dois tratamentos diferentes.

EXEMPLOS EXEMPLO 1

Murganhos com a síndrome da imunodeficiência adquirida murina (MAIDS) têm uma disfunção das células T induzida por cAMP/PKA do tipo I MAIDS (Síndrome da Imunodeficiência Adquirida Murina). Numerosos estudos consideraram a MAIDS como um modelo possível para a infecção de humanos pelo VIH. Esta síndrome desenvolve-se após infecção com um retrovírus com replicação deficiente que codifica uma poliproteína Pr609a9 variante (Chattopadhyay et al., 1991, J. Virol., 65, p4232-4241; Jolicoeur, 1991, FASEB J., 5, p2398-2405) . A síndrome está associada com a linfoproliferação progressiva no baço e nos nódulos linfáticos e deficiências imunitárias graves. Embora o retrovírus deficiente responsável pela MAIDS infecte, maioritariamente, células B (Aziz, 1989, Nature, 338, p505-508), as células T CD4 + apresentam uma disfunção profunda e anergia ao estímulo mitogénico in vitro. Uma grande parte das células T CD4+ (mas não das células T CD8+) de murganhos infectados é, também, caracterizada por um fenótipo Thy-1 negativo, pouco comum (Holmes et al., 1990, Eur. J. Immunol., 20, p2783-2787; Moutschen et al., 1994, Scand. J.

Immunol., 39, p216-224 (MAIDS)). Em murganhos normais, não 39 infectados, as células T CD4+ Thy-1" são encontradas, selectivamente, nos centros germinais onde estas correspondem a emigrantes recentes específicos para um antigénio. Não é conhecido o mecanismo pelo qual a proteína Pr609a9 variante induz anomalias nas células T. Tem sido defendido que os factores solúveis segregados pelas células infectadas influem na função das células T (Simard, J. Virol., 68, pl903-1912), à distância, mas a natureza desses mediadores nunca foi elucidada. Outros estudos sugeriram que sejam necessárias interacções relacionadas directas, entre células T CD4+ e células apresentadoras de antigénio para a indução de deficiências de células T (Green, 2001, J. Virol., 70, p2569-2575; de Levai, 1998, J. Virol., 72, p5285-5290. A via da ciclase do adenilato-cAMP-cinase da proteína A desempenha um papel importante na regulação de respostas imunitárias (Kammer, 1991, Immunol. Today, 9, p222-229) . É sabido que a concentração aumentada do cAMP inibe respostas proliferativas das células T a vários estímulos, tais como, mAb anti-CD3 e interleucina-2. Uma referência recente sugeriu que a regulação negativa da cinase de tirosina JAK3 pudesse representar um mecanismo pelo qual o cAMP inibe a proliferação das células T (Kolenko, 1999, Blood, 93, p2308-2318). O AMP cíclico pode induzir, também, a regulação negativa de proteínas da membrana, uma vez que os timócitos ou as células de timoma murino expostos a agentes indutores do cAMP, tal como norepinefrina, regulam negativamente a expressão de Thy-1 através de um mecanismo envolvendo a desestabilização do ARNm (Wajeman-Chao, J. Immunol., 161, p4825—4833) . 40 A prostaglandina E2 (PGE2) , um indutor potente do cAMP, é segregada principalmente por monocitos, macrófagos e células T activadas. A PGE2 desloca o equilíbrio das células T-auxiliadoras do tipo 1 para das células T-auxiliadoras do tipo 2, por inibição da IL-2 e intensificação da produção de IL-4 (Betz e Fox, 1991, J. Immunol., 146, pl08-113; Meyaard, 1997, Blood, 89, p570-576) . Esta desvia, também, a diferenciação das células B para a produção de IgE (Fedyk e Phipps, 1996, PNAS USA, 93, pl0978-10983) . A síntese de prostaglandina resulta da acção sequencial das ciclo-oxigenases 1 e 2 (COX-1 e COX-2) e de sintetases específicas para PG (Smith e DeWitt, 1996, Adv. Immunol., 62, pl67-215) . Enquanto que a expressão da COX-1 é, basicamente, constitutiva e ubíqua, a COX-2 é induzida, apenas, em determinados tipos de células (macrófagos, fibroblastos, células do músculo liso) por NO e citocinas inflamatórias, tais como IL-1 e TNF-a.

Os mecanismos responsáveis pela disfunção das células T na MAIDS são, ainda, pouco compreendidos. As células T CD/ estão, de um modo preferido, envolvidas, uma vez que várias referências sugeriram que a alteração das células T CD8+ seja, apenas, devida à falta de auxílio adequado das células T CD4+. Pelo contrário, a inibição das respostas das células B é intrínseca e não pode ser explicada apenas por linfócitos CD4+ deficientes. A observação dos Requerentes de um aumento selectivo do cAMP em células B e em células T CD4+ e não em células T CD8+ é, consequentemente, compatível com o envolvimento do cAMP no processo anérgico associado com a MAIDS.

Esta é a primeira demonstração de um aumento do cAMP selectivo para um subconjunto num modelo de doença conhecido pelos Requerentes. Se um factor solúvel, tal como a 41 prostaglandina E2 é, de facto, responsável pela indução do cAMP, o que pode explicar a selectividade da sua acção para um subconjunto? Os estudos anteriores compararam a expressão de vários receptores prostanóides em células T CD4 + e CD8+ e obtiveram um padrão de expressão semelhante em ambos os subconjuntos. As células T CD8+ normais são totalmente susceptíveis aos efeitos indutores do cAMP da PGE2. Uma explicação possível pode ocorrer ao nível do pós-receptor; as células T de memória/activadas respondem melhor à PGE2 do que células T sem experiência prévia. Na MAIDS, em que estão envolvidos processos dependentes da classe II do MHC, as células T CD4 + podem adquirir um estado particular de activação, tornando-as mais susceptíveis ao efeito de uma determinada concentração de PGE2. A modulação dos efeitos dos prostanóides pelo pós-receptor é mediada principalmente por cinases do receptor G (GRK), as quais desligam a proteína G do receptor membranar correspondente. Os estados inflamatórios, tal como artrite reumatóide são caracterizados por uma regulação negativa da GRK e, consequentemente, por uma sensibilidade aumentada dos linfócitos aos agentes indutores do cAMP, tal como catecolaminas. Os níveis de actividade da GRK em células T CD4+ e CD8+ de murganhos infectados são desconhecidos. Métodos utilizados nos Exemplos 1 e 2

Murganhos e suspensão celular

Foram produzidos murganhos C57BL/6 do sexo masculino nas instalações dos Requerentes. Foram injectados murganhos com 4 e 5 semanas idade, duas vezes, i. p., com 0,25 mL do extracto virai isento de células. Os murganhos de controlo com idade 42 correspondente foram injectados, duas vezes i. p., com 0,25 mL de soro fisiológico tamponado com fosfato (PBS) . Os murganhos foram mortos por asfixia com CO2 em tempos diferentes após a infecção. Os nódulos linfáticos periféricos (inguinal, axilar e cervical) foram dissociados com seringas para obter suspensões de células isoladas e foram passados através de um corante de células de nylon, foram lavados três vezes com meio RPMI 1640 completo e foram contados num citómetro Thoma, após exclusão com azul tripano. Vírus O extracto virai foi preparado a partir de nódulos linfáticos de murganhos injectados com RadLV-Rs, 2 meses antes como descrito anteriormente. Os nódulos linfáticos foram recolhidos, triturados em PBS e centrifugados a 1,5 x 104 g, durante 30 min. O sobrenadante foi centrifugado novamente durante 30 min, a 1,5 x 104 g. Este extracto virai acelular foi armazenado em azoto liquido. Foi utilizado o ensaio de placas XC para quantificar as partículas virais. A preparação virai continha 103 unidades formadoras de partículas (PFU) de virus ecotrópico/mL.

Anticorpos

Foram utilizados os seguintes anticorpos policlonais nas experiências de transferência de Western; Primário: anticorpo policlonal anti-COX-1 de coelho ou anti-COX-2 de coelho.(Santa Cruz Biotechnology); Segundo passo: O conjugado de Peroxidase de Rábano anti-coelho foi adquirido de Transduction Laboratories 43 (Transduction Laboratories, UK) . Para a citometria de fluxo, os moAbs utilizados são como se segue: CD4/L3T4 conjugado com PE (YTS.191.1), CD45R/B220 conjugado com FITC (RA3-6B2), CDllb/Mac-1 conjugado com FITC (Ml/70), CD161/NK-1.1 conjugado com FITC (PK136), CD8a (Ly-2) e CD16/CD32 (Receptor FcyIII/II) (2.4G2) conjugados com FITC, (todos de Pharmingen: San Diego, CA, EUA). 0 moAb CD3 (145-2C11) foi purificado no laboratório dos Requerentes. A Concanavalin A (ConA) foi adquirida de Boehringer Mannheim Biochemica e a fito-hemaglutinina-M (PHA), da Difco.

Citometria de fluxo e separação celular

As análises foram realizadas, utilizando o separador celular de fluxo FACStar-plus com o programa informático Cellquest (Becton Dickinson). Foram utilizados os dispersores dianteiro e lateral para capturar os linfócitos viáveis. Foi fornecida excitação azul a 488nm, através de um laser de iões de árgon (Modelo de refrigeração ar-água Spinnaker 1161; Spectra Physics, Mountain View, CA) , para a análise a duas cores de FITC (verde) e PE (laranja). Para a separação celular, foram incubadas 60 x 106 células com anti-FcyRII (bloqueio de Fc), para prevenir interacções não especificas, antes da marcação, durante 20 min, em gelo, com os anticorpos conjugados com fluorocromo. As células T CD4+ foram seleccionadas negativamente por esgotamento das células CD8+ B220+ CDllb+. De um modo semelhante, as células T CD8+ foram seleccionadas negativamente por esgotamento das células CD4+ B220+ CDllb+ e as células B por esgotamento das células CD8+ CD4+ CDllb+. Para cada separação, a fracção seleccionada foi re-analisada por citometria de fluxo para avaliar a pureza, a qual foi sempre superior a 97%. 44

Quantificação do AMP cíclico

As suspensões de células isoladas de nódulos linfáticos foram preparadas como descrito acima, foram lavadas duas vezes com RPMI 1640 e foram centrifugadas a 1500 x g, durante 3 min. As células foram rebentadas, subsequentemente, por sonicação, para facilitar a libertação do cAMP intracelular para a solução de extracção (HC1 0,01 N, etanol a 95%). A solução contendo o lisado celular foi centrifugada a 13 x 104 x g, durante 15 min e

0 sobrenadante foi removido para um novo tubo. O extracto foi evaporado num concentrador Speed Vac a 45 °C e o sedimento foi armazenado a -20 °c. O sedimento foi ressuspenso no tampão de ensaio, imediatamente antes da utilização e os níveis do cAMP foram medidos por radioimunoensaio (RIA), utilizando o sistema de ensaio do cAMP marcado com 125I (Amersham, Inglaterra) . A concentração do cAMP nas amostras de teste foi determinada por comparação com uma curva padrão curvilínea. Para os controlos positivos e negativos, as células dos nódulos linfáticos (1 x 106) foram incubadas, respectivamente, com dDibutiril-cAMP 1 mM e DDA (inibidor da ciclase do adenililo) 0,5 mM, durante 30 min, a 37 °C, numa incubadora de ar com CO2 a 5% humidificada, antes da medição da concentração do cAMP.

Homogenização celular e imunotransferência

Foram homogeneizadas células (50 x 10β) por sonicação (2 x 15 s) em gelo num tampão contendo fosfato de potássio 10 mM, pH 7,1, sacarose 250 mM, EDTA 1 mM, Triton X-100 a 0,1% e 10 pg/mL de cada um dos inibidores de protease, quimostatina, 45 leupeptina, pepstatina A e antipaína (Tasken et al., 1993, J. Biol. Chem., 268, p21276-21283) e foram centrifugadas durante 30 min (15000 x g), para remover o material insolúvel. As concentrações de proteína foram determinadas pelo ensaio de Bradford (BioRad). Para a imunotransferência, foram separadas 40 pg de proteína por SDS-PAGE a 10%, que foram transferidas para membranas de PVDF e incubadas com anticorpos em TBS/Tween com leite em pó magro a 5% e BSA a 0,1% (Blotto) . Os anticorpos primários foram detectados com anticorpos secundários conjugados com HRP (Jackson Laboratories/Transduction Laboratories) e ECL (Amersham).

Actividade de Fosfotransferase da PKA A actividade catalítica da PKA foi ensaiada por fosforilação de um substrato específico da PKA (Leu-Arg-Arg-Ala-Ser-Leu-Gly) (Kemp et al., 1976, PNAS USA, 73, pl038-1042) Kemptido, Península Laboratories INC) utilizando [γ~32Ρ]-ΑΤΡ (actividade específica 0,25 Ci/mMol, Amersham) numa mistura de ensaio descrita por R. Roskoski (Methods Enzymol., 1983, 99, p36) . A actividade de fosfotransferase foi medida, tanto na presença, como na ausência do cAMP (5 μΜ) e PKI (1 μΜ) e foram subtraídos os níveis baixos de actividade não inibida pelo PKI, para determinar a actividade específica da PKA.

Medições da ligação do AMP cíclico A quantificação da ligação de subunidades reguladoras da PKA solubilizadas específicas para [3H]cAMP foi realizada como descrito por Cobb e Corbin (Methods ín Enzymology, 159, 46 ρ2 02 — 208, 1988), numa mistura contendo [2,8-3H]cAMP (2,25 μΜ; actividade específica de 5 Ci/mMol; Du Pont - New England Nuclear). As proporções molares das subunidades R foram calculadas com base em dois locais de ligação ao cAMP em cada monómero da subunidade reguladora.

Imunocitoquímica

Os linfócitos dos nódulos linfáticos de controlo e infectados foram fixados com acetona arrefecida durante 5 min e foram lavados duas vezes durante 5 min cada em saponina 0,1% em PBS. A peroxidase endógena foi bloqueada por incubação com peróxido de hidrogénio a 0,3% em saponina/PBS a 0,1%, durante 15 min. Após lavagem em saponina/PBS, as lâminas foram incubadas durante 30 min à t.a., com tampão de bloqueamento (soro de cabra normal a 1,5% em saponina a 0,1%/PBS), seguida por incubação durante 60 min com solução de anticorpo primário à t.a., numa câmara humidificada. O anticorpo contra a Ca foi obtido de Santa Cruz e foi diluído a 1:1000 em PBS contendo saponina a 0,1% e soro de cabra normal a 0,5%. As lâminas foram, então, lavadas como anteriormente e foram incubadas com anticorpo de cabra

anti-coelho biotinilado. Este foi, posteriormente, detectado pelo complexo ABC (Novastain Super ABC Kit, Novocastra). A peroxidase foi revelada utilizando diaminabenzidina (DAB) (Dako) a qual origina um precipitado castanho, na presença de H202. As lâminas foram contra-coradas com hematoxilina-eosina (Sigma). A especificidade foi testada por incubação do cytospin com o péptido específico contra a subunidade Ca da PKA. 47

Imuno-histoquímica A imuno-histoquímica foi realizada em secções histológicas com 2 pm de expessura realizadas em tecidos fixados em paraformaldeído a 4% e embebidos em plástico (JB4-JBPolysciences). As secções foram permeabilizadas com tripsina (0,24%) durante 1 min a 37 °C e depois com Tween 20 (2%) durante 30 min a 37 °C. As peroxidases endógenas foram inactivadas por incubação com H202 (1%), durante 30 min, à temperatura ambiente. Os locais não-específicos foram saturados com soro de cabra normal (1,5%) durante 1 h a 37 °C. As secções foram, então, incubadas durante a noite a 4 °C com anticorpo policlonal primário de coelho anti-COX-1 ou de coelho anti-COX-2 (Santa Cruz Biotechnology) e depois durante 2 h com o anticorpo de cabra anti-coelho biotinilado. Este último foi detectado pelo complexo ABC (Novostain Super ABC Kit, Novocastra). A peroxidase foi revelada utilizando diaminabenzidina (DAB) (Dako), a qual origina um precipitado castanho na presença de H202, as Secções foram contra-coradas com hematoxilina-eosina (Sigma). A especificidade foi testada por incubação de secções com soro de coelho normal em lugar do anticorpo primário.

Ensaios de proliferação para murganhos com MAIDS

Os ensaios de proliferação foram realizados por incubação de 0,1 X 106 células T CD3+/mL num volume de 100 pL em placas de microtítulação de 96 poços de fundo plano. A activação foi realizada pela adição subsequente de esferas magnéticas monodispersas revestidas com IgG de ovelha anti-murganho (Dynal, n° de cat. 110.02) numa proporção células:esferas de 1:1, seguida pela adição de anti-CD3 (clone 2C11) numa diluição final 48 de 4 pg/mL para as experiências apresentadas. A concentração óptima do anticorpo foi titulada, cuidadosamente, na preparação inicial e foram sempre realizadas experiências paralelas em várias diluições diferentes do anticorpo. A proliferação foi analisada pela incubação de células durante 72 horas, durante as quais foi incluída [3H]-timidina (0,4 pCi) , durante as últimas 4 horas e foi recolhida com um recoletor celular (Skatron, Sterling, VA, EUA), para filtros de fibra de vidro. O precursor incorporado foi contado num analisador de cintilação (Tri-Carb, Packard, Meriden, CT, EUA). Os análogos do cAMP, quando utilizados, foram adicionados 30 min antes da activação por adição de anticorpos anti-CD3. O 8-CPT-cAMP foi obtido de Sigma (St. Louis, MO) e Sp-e Rp-8-Br-cAMPS foram obtidos de BioLog Life Science Company (Bremem, Alemanha) e foram todos dissolvidos em concentrações de 4 a 10 mM em PBS e as concentrações foram calculadas utilizando os coeficientes de extinção fornecidos pelo fabricante. A indometacina foi dissolvida em água e foi utilizada numa concentração de 50 ng/mL.

Determinação da PGE2

Foram pipetados 500 pL de um sobrenadante da cultura com 48 h de células de nódulos linfáticos de controlo e de murganhos infectados, para tubos de polipropileno com 1,5 mL, aos quais foram adicionados 500 pL de água:etanol (1.4) e 10 pL de ácido acético gelado. Os tubos foram misturados, cuidadosamente e deixados 5 min à temperatura ambiente. Isto foi seguido por centrifugação a 2500 X g durante 2 min. Os sobrenadantes foram recolhidos e passados através de minicolunas C18 Amprep examinadas, as quais tinham sido iniciadas com 2 volumes de coluna de etanol a 10%. As colunas foram, então, lavadas com 49 1 volume de H2O e 1 volume de coluna de hexano. A PGE2 foi, então, eluída com 2 x 0,75 mL de acetato de etilo. As fracções foram recolhidas e evaporadas sob azoto até à secura. Finalmente, cada fracção foi reconstituída em 100 pL de tampão de ensaio e a PGE2 foi ensaiada utilizando o kit EIA da Amersham como recomendado pelo fabricante.

Análises estatísticas

Foi utilizado 0 teste U de Mann-Whitney (bilateral) Para comparação entre os dois grupos de indivíduos. Os coeficientes de correlação (r) foram calculados pelo teste de classes de Spearman. As análises estatística e de ajustamento da curva foram realizadas utilizando, respectivamente, os conjuntos de programas informáticos Statistica (StatSoft Inc., Tulsa, OK) e Sigma Plot (Jandel Corporation, Erkrath, Alemanha). Os resultados são fornecidos como medianas e percentis 25° a 75°, a menos que indicado de outra forma, os valores de p são bilaterais e são considerados significativos quando <0,05.

Experimental A infecção da MAIDS origina cAMP elevado em células T CD4+ - Foram sacrificados murganhos inoculados com uma mistura de retrovírus conhecidos como RadLV-Rs, que causam o desenvolvimento de MAIDS, em momentos diferentes após a infecção e as células dos nódulos linfáticos foram separadas por selecção negativa utilizando um citómetro de fluxo/separador celular em células B puras e células T CD4+ e CD8+. Foram avaliados os níveis intracelulares do cAMP nas diferentes populações 50 celulares, após a infecção. Como pode ser observado na Figura 1, os níveis do cAMP foram significativamente aumentados (mais de 20 vezes) em células T CD4 + , após algumas semanas de infecção. Em etapas subsequentes, os níveis do cAMP das células B aumentaram, também, enquanto que foram apenas observadas modificações pouco significativas nas células T CD8+. Além disso, quando as células T CD4 + foram separadas em células Thy-1.2+ e Thy-1.2- por separação positiva foi evidente que o aumento mais significativo dos níveis do cAMP foi verificado nas células Thy-1.2- (figura 2, 6 vezes). Esta população, normalmente, de baixa abundância apresentou, também, níveis basais mais elevados do cAMP em comparação com os das Thy-1.2+, quando ambas as populações foram recolhidas a partir de murganhos não infectados. O exame da actividade de fosfotransferase da PKA em sobrenadantes pós-nucleares a partir de extractos solubilizados com detergente revelou que os níveis totais de actividade de cinase dependente do cAMP se encontravam diminuídos em células de nódulos linfáticos com MAIDS, enquanto que foram observadas modificações pouco significativas na actividade, na ausência do cAMP (Figura 3A) . Isto é consistente com uma activação crónica e a dissociação da PKA originando, quer a degradação da subunidade C, quer o deslocamento da C. A avaliação da ligação do cAMP (Figura 3B) não revelou quaisquer modificações dos níveis totais das subunidades R da PKA. A imunocitoquímica das células dos nódulos linfáticos de murganhos com MAIDS e de controlo revelou níveis aumentados da subunidade C da PKA imunoreactiva no núcleo (Figura 4) . Isto é, novamente, consistente com uma activação da via cAMP-PKA na MAIDS. 51 0 antagonista da PKA do tipo I melhora a proliferação de células T de células T com MAIDS -

Para examinar o efeito do cAMP elevado e da activação da PKA na inibição da proliferação de células T induzida por TCR/CD3 foi utilizado um análogo do cAMP substituído com enxofre (Rp-8-Br-cAMPS) funcionando como um antagonista total da PKA do tipo I (Gjertsen, Mellgren, et al. 1995 1665/id) . A figura 5A mostra que em células T de murganhos infectados com MAIDS, a proliferação estimulada por TCR/CD3 foi inferior a 10% da de células T de murganhos de controlo não infectados (Figura 5B) . Para além disso, quando o efeito do antagonista da PKA do tipo I foi avaliado em células T com MAIDS, foi observado um aumento dependente da concentração, na proliferação induzida por TCR/CD3, que foi superior a 4 vezes, em concentrações mais elevadas (Figura 5A), enquanto que não foi observado qualquer estímulo por tratamento de células T de controlo (Figura 5B). Na observação de onze murganhos infectados com MAIDS, a totalidade apresentava proliferação muito deficiente de células T, em comparação com os controlos (p<0,001) e em 10 de 11 murganhos o antagonista da PKA do tipo I melhorou a proliferação das células T (p<0,01; 2,2 vezes a mediana, Tabela 5). O efeito estimulante do antagonista do cAMP não foi saturado, mesmo nas concentrações mais elevadas utilizadas (Figura 5A e foram obtidos dados semelhantes (não apresentados) para a totalidade dos murganhos da Tabela 5) . Isto indica que a solubilidade, afinidade ou disponibilidade do composto, para as células, pode ser um factor limitante para o efeito observado. Deste modo, um antagonista da PKA do tipo I mais permeável e potente, quando disponível, pode melhorar, adicionalmente, a proliferação de células T com MAIDS induzida por TCR/CD3. 52 A seguir, foi investigado o efeito do agonista do cAMP sobre a proliferação induzida por TCR/CD3 em cinco murganhos infectados com MAIDS e quatro controlos. As células T de murganhos infectados com MAIDS revelaram um deslocamento evidente da sensibilidade à inibição da proliferação celular por 8-CPT-cAMP adicionado exogenamente (Figura 5C e Tabela 5) . Além disso, quando as taxas de proliferação máximas das células T provenientes de murganhos infectados com MAIDS e as das células T de controlo foram normalizadas para 100% (Figura 5C e dados não apresentados) foi evidente que para além de uma curva de inibição do cAMP deslocada para a esquerda, os declives das curvas foram significativamente diferentes (coeficientes de Hill de 0,6 (0,54 a 1,52) para células T de murganhos com MAIDS versus 2,2 (1,9-2,5) para células T normais, Tabela 5, p<0,05). A sensibilidade aumentada à inibição pelo análogo do cAMP sugere uma contribuição do cAMP endógeno elevado na iniciação do local B de ligação do cAMP, da PKA do tipo I com um aumento subsequente da afinidade do local A para o análogo do cAMP adicionado exogenamente. O deslocamento do declive da curva de uma a situação cooperativa de ligação ao local de dois ligandos para uma curva de inibição não-cooperativa aparente pelo 8-CPT-cAMP indica, também, a ocupação do local B pelo cAMP endógeno elevado. 53

Tabela 5.

Murganhos Proliferação induzida por anti-CD3 (cpm) Aumento na proliferação por Rp-8-Br-cAMPS (número de vezes de aumento) Inibição da proliferaçã o por 8-CPT-cAMP (IC50, μΜ) Inibição da proliferação por 8-CPT-cAMP (coeficiente de Hill) 1 9525 19 6 41 2 3312 24 22 54 3 9153 14 8 58 4 959 37 n.d. n.d. 5 13791 10 52 156 6 6370 19 66 152 7 6357 22 n.d. n.d. 8 9986 42 n.d. n.d. 9 5696 40 n.d. n.d. 10 16132 37 n.d. n.d. 11 3740 37 n.d. n.d. MAIDS 6370* 2, 2** 0,22 0,58*** Mediana (3740-9986) (1,9-3,7) (0,08-0,52) (0,54-1,52) n=ll (percentis 25-75°) n=ll n=5 n=5 Controlos 62281 1,1 0,40 2,24 Mediana (56539-82038) (1,0-1,3) (0,33-0,46) (1,93-2,47) (percentis 25-75°) n=6 n=6 n=4 n=4 MAIDS vs controlos; * representa p<0,001, ** representa p<0, 01 e *** representa p<0,05 54 EXEMPLO 2 A disfunção das células T induzida pelo AMP cíclico da MAIDS é devida à produção aumentada de PGE2 por células positivas para CDllb com níveis aumentados de COX-2

Produção elevada de PGE2 na MAIDS -

Foram isoladas populações mistas de células dos nódulos linfáticos, a partir de murganhos infectados com MAIDS e de controlo e foram cultivadas in vitro. Foram avaliados os níveis segregados de PGE2 nos sobrenadantes dos meios após 48 horas de cultura e revelaram que as células infectadas com MAIDS segregavam 7 a 8 vezes mais PGE2 do que as células do controlo. A inibição da produção da PGE2 restabelece a proliferação das células T na MAIDS - A seguir, as células mistas dos nódulos linfáticos foram activadas por anticorpos anti-CD3 para induzir a proliferação de células T e após 72 horas foi examinada a incorporação de [3H]-timidina. A proliferação das células de murganhos infectados com MAIDS foi, novamente, apenas 10 a 20% da proliferação de células T das células não infectadas. No entanto, quando foi adicionada indometacina às culturas, para inibição da produção da PGE2 nas culturas mistas, isto aumentou, significativamente, a proliferação de células de cinco murganhos infectados com MAIDS para niveis comparáveis com os dos murganhos de controlo (Figura 6) . Na observação de 10 murganhos infectados com MAIDS, adicionais, (Tabela 6) , o efeito da indometacina sobre a proliferação de células T de culturas linfocitárias mistas foi 55 muito significativo (p<0,01). Pelo contrário, o tratamento das culturas de controlo com indometacina não alterou a proliferação. A COX-2 é expressa em níveis elevados nos nódulos linfáticos de murganhos infectados com MAIDS - A COX-1 expressa constitutivamente é a fonte normal de actividade de ciclo-oxigenase que produz PGE2. No entanto, não foi possível verificar qualquer aumento da COX-1 em murganhos com MAIDS que pudesse justificar os níveis aumentados da PGE2 (dados não apresentados). A expressão da COX-2 está normalmente restringida a processos cérebro/cérebro, à sinovia artrítica e a locais de danos de tecidos. A COX-2 não é encontrada em nódulos linfáticos ou em linfócitos, como apresentado, e. g., na Figura 8 para linfócitos de controlo (painel superior) . Surpreendentemente, os requerentes verificaram que as células dos nódulos linfáticos imaturos, provenientes de murganhos infectados com MAIDS expressam níveis elevados da COX-2 (Figura 8, painel inferior) . Além disso, as células T CD4 + e CD8+ seleccionadas positivamente, assim como as células B de nódulos linfáticos com MAIDS continham níveis elevados da COX-2. Pelo contrário, as células CDllb seleccionadas negativamente continham, apenas, níveis baixos da COX-2.

Pela observação das células T CD4 + e CD8+ e das células B (marcador B220) de murganhos infectados com MAIDS e de controlo, por citometria de fluxo tornou-se evidente que o marcador CDllb não é normalmente expresso nas células T ou B. No entanto, uma fracção distinta tanto de células T CD4+ como de células B de murganhos infectados com MAIDS eram CDllb brilhantes (captura 56 marcada RI) e um grupo adicional de células T CD4+ e células B, assim como de células T CD8+ eram CDllb escuras (captura marcada R2), indicando que estas apresentavam niveis significativos, mas inferiores de expressão de CDllb. Deste modo, as subpopulações de células T CD4 + e CD8+ infectadas com MAIDS eram, respectivamente, CDllb brilhantes e escuras, enquanto que a maioria das células B era positiva. Considerado em conjunto com o facto das células CDllb+ e não as células CDllb- expressarem a COX-2, isto indica que tanto as células B como as células T dos nódulos linfáticos dos murganhos infectados com MAIDS expressam a COX-2.

Pela observação de nódulos linfáticos intactos de murganhos infectados com MAIDS, por imuno-histoquimica, torna-se evidente que a arquitectura geral é alterada com a perda de centros germinais na MAIDS (semana 19 após infecção), em comparação com os murganhos de controlo (Figura 10, c versus a). Numa ampliação mais elevada de lâminas imunocoradas para a COX-2, torna-se evidente que enquanto que os nódulos linfáticos dos animais de controlo apresentam, apenas, coloração HRP castanha no material ingerido nos macrófagos (corpos "tingiveis" falsamente positivos, Figura 10b), uma grande proporção das células dos nódulos linfáticos na MAIDS coram positivamente para a COX-2 (Figura 10a) . 57

Tabela 6.

Murganho Meio Indometacina Anti-CD3 Indometacina /Anti-CD3 1 1304 1412 6245 9381 2 1082 1129 8019 47926 3 209 265 918 1345 4 236 335 8938 11579 5 4715 4317 6591 8545 6 1799 ND 2932 ND 7 3051 ND 7436 ND 8 1668 ND 3594 19624 9 839 2363 7885 31830 10 3413 7316 8777 42244 Mediana 1486 1412 7013 15601" (percentis 25-75°) (839-3051) (335-4317) (3594-8019) (8963-37037) O 1—1 II C n=7 O 1—1 II C n=8 Indometacina (Indo) vs. controlos; ** representa p<0,01 58 EXEMPLO 3

Os doentes com VIH apresentam efeitos marginais quando tratados, in vivo, com o inibidor não-selectivo da COX Métodos

Selecção negativa das células T CD3+ do sangue periférico de doentes com VIH

Foram purificadas células T CD3+ do sangue periférico, por selecção negativa, a partir da camada leucocitária de dadores saudáveis normais (Centro de Sangue do Hospital da Universidade de Ullevaal, Oslo, Noruega). Resumidamente, foram isoladas células mononucleares do sangue periférico, por centrifugação em gradiente de densidade (Lymphoprep, NycoMed, Oslo, Noruega), seguida por selecção negativa utilizando esferas magnéticas monodispersas revestidas directamente com anticorpos contra CD14 e CD19 e esferas de IgG de rato anti-murganho revestidas com anticorpos contra CD56 e um magneto. As esferas magnéticas foram todas obtidas de Dynal (Oslo, Noruega, respectivamente, n° de cat. 111.12, 111.04 e 110.11), enquanto que o anticorpo anti-CD56 foi obtido de Pharmingen (San Diego, CA, n° de cat. 31660.d). Todos os passos foram realizados a 4 °C. As suspensões celulares foram analisadas por citometria de fluxo e demonstraram consistir em mais de 90% de células CD3+. 59

Ensaios de proliferação utilizando células T de doentes com

VIH

Os ensaios de proliferação foram realizados por incubação de 0,75 X 106 células T CD3+/mL, num volume de 100 pL em placas de microtitulação com 96 poços de fundo plano. A activação foi realizada pela adição subsequente de esferas magnéticas monodispersas revestidas com IgG de ovelha anti-murganho (Dynal, n° cat. 110.02) numa proporção célulasresferas de 1:1, seguida pela adição de anti-CD3 (clone SpvT3b), numa diluição final de 1:125000, para as experiências apresentadas. A concentração óptima do anticorpo foi titulada cuidadosamente na preparação inicial e foram sempre realizadas experiências paralelas em várias diluições diferentes do anticorpo. A proliferação foi analisada pela incubação de células durante 72 horas, durante as quais foi incluída [3H]-timidina nas últimas 16 horas. As células foram lavadas e recolhidas para filtros de vidro e foram analisadas, subsequentemente, por contagem da cintilação β. Os análogos do cAMP quando utilizados foram adicionados 30 min antes da activação pela adição de anticorpos anti-CD3. O 8-CPT-cAMP foi obtido de Sigma (St. Louis, MO).

Experimental

Um ensaio clínico de fase II a decorrer está a testar o efeito imuno-estimulante do tratamento a curto prazo com um inibidor não-selectivo da COX (indometacina), sobre parâmetros de substituição em células T de doentes infectados com VIH. De acordo com o protocolo aprovado, os doentes deveriam receber 50 mg de indometacina, 3 vezes por dia (dose total de 150 mg/dia), durante 2 semanas com amostragem no dia 0, dia 14 e 60 dia 28 (2 semanas após a descontinuação). No entanto, devido a eventos adversos, tais como dor e dispepsia epigástrica e descontinuação do estudo entre os doentes iniciais, esta dose teve que ser reduzida para 25 mg de indometacina, 3 vezes por dia (dose total de 75 mg/dia) . A figura 11 mostra a função imunitária de células T (medida como a proliferação após a activação) dos 3 doentes (doente 1 a doente 3) que concluíram até ao momento o estudo. 0 painel superior mostra os níveis de proliferação após activação das células T no início (0 dias), no final do tratamento com indometacina (14 dias) e após 2 semanas (28 dias) . Como pode ser verificado, os doentes 1 e 2 não aumentaram a sua função imunitária devido a um antagonista da COX, não-selectivo, administrado in vivo. No entanto em 3 doentes, as respostas das célula T aumentaram, aproximadamente, 2,5 vezes e persistiram até 2 semanas após a descontinuação da indometacina. A figura 11b, painel inferior, mostra a proliferação das células T após incubação com um antagonista do cAMP selectivo para a PKA-I, Rp-8-Br-cAMPS, in vitro, em culturas de células. O grau da disfunção das célula T mediada pelo cAMP é evidente pela reversão da proliferação obtida pelo antagonista (comparar painéis superiores e inferiores; aumento de aprox. 2 vezes da proliferação nos doentes internados 1 e 3 em todos os momentos, enquanto que não se verifica qualquer efeito no doente 2). A partir da fig. 11, é evidente que a indometacina não apresenta um efeito convincente, o que pode ser atribuído à ausência de selectividade para a COX-2, assim como às limitações na dose devidas a eventos adversos. 61 EXEMPLO 4

Os doentes com VIH apresentam efeitos marginais após a administração de inibidor não-selectivo da Cox, in vivo, (continuação das experiências do Exemplo 3) Métodos

Os métodos utilizados foram como descritos no Exemplo 3.

Experimental

Na Figura 12 são apresentados os resultados de 7 doentes num ensaio clinico de fase II a decorrer (continuação do Exemplo 3) que receberam 25 mg de indometacina três vezes por dia, oralmente durante 14 dias, além de terapia de combinação tripla. Os doentes 1-3 correspondem aos descritos no Exemplo 3. 0 problema associado à administração da indometacina consiste em eventos adversos como descrito acima (Exemplo 3) que limitam a dose a 25 mg três vezes por dia. Nesta dose permissiva, os efeitos deste inibidor não-selectivo da COX são marginais. Após 14 dias de tratamento, apenas, dois de sete doentes apresentavam a função imunitária da células T elevada, de um modo evidente, medida como a proliferação após a activação das células T, enquanto que um doente apresentava função imunitária diminuída e quatro doentes apresentavam alterações pouco significativas. Duas semanas após a descontinuação da indometacina, cinco de sete doentes tinham sensibilidade imunitária elevada, em comparação com o dia 0. No entanto, apenas dois doentes apresentavam um aumento superior a duas vezes da proliferação das células T. 62 EXEMPLO 5

Os inibidores da Cox 2 melhoram a função imunitária de células T com MAIDS in vitro Métodos

Os métodos utilizados no ensaio de proliferação foram como descritos no Exemplo 1. 0 ensaio da PGE2 foi como descrito no Exemplo 1.

Experimental

Ensaio de Proliferação

Foram isoladas células dos nódulos linfáticos, mistas, a partir de murganhos com MAIDS, 17 semanas após a infecção. As células foram activadas por anticorpos anti-CD3, para induzir a proliferação de células T e foi examinada a incorporação de [3H]-timidina após 72 horas como uma medida da função imunitária. A proliferação das células de murganhos infectados com MAIDS foi, novamente, apenas 5 a 20% da proliferação das células T de células não infectadas (2000 a 12000 cpm para as células com MAIDS vs. uma média de 55000 cpm para as células de murganhos não infectados). No entanto, quando foi adicionado rofecoxib (Figura 13) ou celecoxib (Figura 14) às culturas, isto aumentou duas a três vezes a proliferação de células de murganhos infectados com MAIDS de uma forma dependente da concentração. Pelo contrário, o tratamento de culturas de controlo de 63 murganhos não infectados com rofecoxib ou celecoxib não aumentou a proliferação (aumento de 0,8-a 1,0 vezes na presença dos inibidores da COX-2, i. e., sem aumento, não apresentado). Em células T de murganhos com MAIDS, a concentração de rofecoxib e celecoxib que produziu um efeito metade do máximo (ED50) foi de, aproximadamente, 0,01 μΜ para o rofecoxib e 0,03 μΜ para o celecoxib. O facto das concentrações submicromolares serem eficazes, indica, de um modo evidente, que o aumento observado na resposta imunitária é mediado através a inibição da COX-2 e não da COX-1, a qual é inibida, apenas, em concentrações micromolares de rofecoxib e celecoxib (valores de Warner et al., 1999, PNAS USA, 96, p7563-7568) . Deste modo, a reversão da função imunitária inibida das células T por rofecoxib e celecoxib, resulta na produção de PGE2 diminuída nas culturas mistas e, deste modo, em níveis diminuídos do cAMP de células T, através da inibição da COX-2.

Produção da PGE2

Foi também analisado o efeito dos inibidores da COX-2, rofecoxib e celecoxib sobre os níveis da PGE2. Como pode ser verificado na Figura 15, as células dos nódulos linfáticos imaturos de murganhos com MAIDS segregaram 5 a 6 vezes mais PGE2 do que as células dos nódulos linfáticos de murganhos saudáveis (ver, também, Fig 6) . Além disso, os níveis da PGE2 em resposta a LPS aumentaram 8-10 vezes em murganhos infectados, em comparação com, aproximadamente, 2 vezes em não infectados. Quando as células foram incubadas na presença dos inibidores da COX-2, rofecoxib ou celecoxib, a secreção da PGE2 de células de nódulos linfáticos com MAIDS foi semelhante à de células não infectadas. 64 0 efeito da indometacina (comparar a proliferação na Fig. 7) é incluído como controlo. EXEMPLO 6

0 inibidor Cox 2 melhora a função imunitária de células T com MAIDS ín vivo Métodos e Experimental

Os murganhos infectados (17 semanas após a infecção) foram tratados durante uma semana per os (i. e., oralmente) com uma dose de rofecoxib correspondente à dose recomendada para utilização em humanos (e tendo em consideração a eliminação 7 vezes mais elevada em roedores). Os murganhos com MAIDS desenvolvem, normalmente, uma síndrome de imunoproliferação com nódulos linfáticos e baço aumentados. De acordo com isto, os animais infectados não tratados, apresentavam um peso médio do baço de 1,3 g e um peso médio dos nódulos linfáticos reunidos de 1,7 g. Pelo contrário, os murganhos com MAIDS recebendo rofecoxib durante 7 dias apresentavam pesos médios do baço de 0,8 g e um peso médio dos nódulos linfáticos reunidos de 0,3 g, indicando uma reversão da linfoproliferação.

Os resultados são apresentados na Figura 16. Quando foi avaliada a função imunitária das células T nas células dos nódulos linfáticos imaturos de murganhos infectados, tratados e não tratados, tornou-se evidente que, enquanto que os animais infectados não tratados apresentavam proliferação induzida por anti-CD3 na gama entre 2000 e 10000 cpm (média de 7300 cpm), os murganhos infectados que receberam rofecoxib durante uma semana 65 apresentavam respostas de células T contra anti-CD3 que foram aumentadas 2,7 a 5,6 vezes, em comparação com murganhos infectados não tratados. Além disso, enquanto que os murganhos infectados, não tratados apresentavam proliferação aumentada de células T induzida por anti-CD3 na presença de Rp-8-Br-cAMPS, este efeito de 2 a 3 vezes foi perdido nos murganhos tratados com rofecoxib, indicando que o tratamento com rofecoxib in vivo baixou os níveis da PGE2 e inverteu a inibição da função das células T mediada pelo cAMP. EXEMPLO 7 0 tratamento de murganhos com MAIDS in vivo com rofecoxib ou celecoxib aumenta respostas das células T a anti-CD3 e as respostas imunitárias Métodos e Experimental

Os murganhos infectados foram tratados com rofecoxib e celecoxib correspondentes à dose recomendada para utilização em humanos (e tendo em consideração a eliminação 7 vezes mais elevada em roedores, respectivamente, 3 e 20 mg/kg/dia). A administração parentérica foi realizada por injecção intraperitonealmente de inibidores da Cox-2 formulados em intralipid. Os resultados são apresentados na Figura 17.

Quando foi avaliada a função imunitária de células T em células dos nódulos linfáticos imaturos de murganhos infectados, tratados e não tratados após 18 a 20 dias de infecção tornou-se evidente que, enquanto que os animais infectados não tratados apresentavam proliferação induzida por anti-CD3 na gama das 66 10000 cpm, os murganhos infectados que receberam rofecoxib durante 18 a 20 dias apresentavam respostas de células T a anti-CD3 que estavam aumentadas, aproximadamente, duas vezes, em comparação com murganhos infectados não tratados. De um modo semelhante, o celecoxib melhorou as respostas imunitárias em células provenientes da maioria do grupo de murganhos injectados para, aproximadamente, 3 vezes mais do que os murganhos não tratados não infectados. EXEMPLO 8 de Referência

O tratamento in vivo de murganhos com MAIDS com meloxicam aumenta a função imunitária de células T Métodos e Experimental

Os murganhos infectados e saudáveis foram tratados com meloxicam 2,8 mg/kg/dia, o que corresponde à dose recomendada para utilização em humanos, quando é tida em consideração a eliminação 7 vezes mais elevada em roedores. A administração parentérica foi realizada pelo implante subcutâneo de bombas osmóticas cheias com composto de injecção de meloxicam solúvel em água. Foi avaliada a função das células T e os resultados são apresentados na Figura 18.

Quando foi avaliada a função imunitária das células T em células de nódulos linfáticos imaturos de murganhos infectados, tratados e tratados com controlo (PBS) após 2 semanas de tratamento tornou-se evidente que, enquanto que os animais infectados tratados com PBS apresentavam proliferação induzida por anti-CD3 na gama das 500 cpm, os murganhos infectados que 67 receberam meloxicam durante 14 dias apresentavam respostas imunitárias células T a anti-CD3 que estavam significativamente aumentadas, em comparação com murganhos infectados que receberam, apenas, PBS (Fig. 18a, mais de 10 vezes; p<0,05).

Quando foi de novo adicionado meloxicam às culturas celulares durante o ensaio de proliferação de células T in vitro de 3 dias para prevenir a libertação a partir da inibição in vivo pelo meloxicam e, deste modo, a reactivação da COX-2, a resposta imunitária no grupo tratado com meloxicam foi duas vezes mais elevada do que sem adição de meloxicam in vitro (p=0,005) e em comparação com a de murganhos com MAIDS que receberam PBS in vivo, o efeito foi, novamente, significativo (Fig. 18b, p<0,05) .

Pelo contrário, apenas os murganhos com MAIDS que receberam PBS in vivo e não os murganhos tratados com meloxicam, demonstraram respostas imunitárias aumentadas, quando o antagonista do cAMP selectivo para a PKA do tipo I, Rp-8-Br- cAMPS, foi adicionado a culturas mistas de nódulos linfáticos estimuladas com anti-CD3, in vitro (Fig. 18c) . O facto do efeito do antagonista do cAMP estar ausente em murganhos com MAIDS tratados com meloxicam, indica que o tratamento com meloxicam in vivo reduz ou remove a imunodeficiência induzida por cAMP na MAIDS e restabelece a função imunitária.

Lisboa, 25 de Setembro de 2007 68

Claims (10)

1. REIVINDICAÇÕES 1. utilização de um inibidor da COX-2 de fórmula geral B:

   em que Y representa um grupo cíclico, de um modo preferido, um grupo oxazolilo, isoxazolilo, tienilo, di-hidrofurilo, furilo, pirrolilo, pirazolilo, tiazolilo, imidazolilo, isotiazolilo, ciclopentenilo, fenilo ou piridilo; n é um número inteiro de 0 a 3; m é um número inteiro de 0 a 4; R6 representa um grupo cetociclilo, cicloalquilo ou arilo, em que o grupo pode ser, opcionalmente, substituído por um ou mais grupos ou átomos, de um modo preferido, por um ou mais átomos de halogéneo; R7, cada um independentemente, representa um substituinte, o qual pode ser qualquer grupo funcional, de um modo preferido, um átomo de hidrogénio ou de halogéneo ou um grupo alquilo, em que o grupo alquilo pode ser substituído por um ou mais grupos ou átomos; 1 R8 representa um grupo alquilo ou NHRi0; R9 representa um átomo de halogéneo; e Rio representa um átomo de hidrogénio ou um grupo alquilo, opcionalmente, substituído por um ou mais grupos ou átomos, de um modo preferido, por um grupo acilo; ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, na preparação de um medicamento para o alívio da disfunção de células T num humano com VIH ou SIDA, em que o referido medicamento é formulado para administração oral.
2. 2. Utilização como reivindicada na reivindicação 1, em que o referido inibidor da COX-2 tem uma proporção de selectividade COX-1:COX-2 >5, de um modo preferido, >50, de acordo com o ensaio de WHMA na IC80.
3. 3. Utilização como reivindicada na reivindicação 1 ou 2, em que R8 é -NH2 ou -CH3.
4. 4. Utilização como reivindicada em qualquer uma das reivindicações 1 a 3, em que Y é um grupo pirazolilo, furilo ou tienilo.
5. 5. Utilização como reivindicada em qualquer uma das reivindicações 1 a 4, em que R6 é um grupo arilo, opcionalmente, substituído com um ou mais átomos de flúor. 2
6. 6. Utilização como reivindicada em qualquer uma das reivindicações 1 a 5, em que n é 1 ou 2,
7. 7. Utilização como reivindicada em qualquer uma das reivindicações 1 a 6, em que R7 é um átomo de bromo, um grupo acilo ou um grupo alquilo substituído.
8. 8. Utilização como reivindicada em qualquer uma das reivindicações 1 a 7, em que o referido inibidor da Cox 2 é celecoxib, rofecoxib, DuP-697, SC-58125, DFU MF tricíclico, JTE-522, Valdecoxin, Palacoxib de sódio 4-(2-oxo-3-fenil-2,3-di-hidro-oxazol-4-il)-benzenossulfonamida ou etoricoxib.
9. 9. Utilização como reivindicada na reivindicação 8, em que o referido inibidor da COX-2 é rofecoxib.
10. 10. Utilização como reivindicada na reivindicação 8, em que o referido inibidor da COX-2 é celecoxib. Lisboa, 25 de Setembro de 2007 3