CZ302448B6 - Farmaceutický prostredek - Google Patents

Abstract

Použití inhibitoru COX-2 obecného vzorce B, kde Y znamená cyklickou skupinu, s výhodou skupinu oxazolyl, isoxazolyl, thienyl, dihydrofuryl, furyl, pyrrolyl, pyrazolyl, thiazolyl, imidazolyl, isothiazolyl, cyklopentenyl, fenyl nebo pyridyl; n je celé císlo od 0 do 3; m je celé císlo od 0 do 4; R.sub.6.n. znamená ketocyklylovou, cykloalkylovou nebo arylovou skupinu, která muže být poprípade substituována jednou nebo více skupinami nebo atomy, s výhodou jedním nebo více atomy halogenu; R.sub.7 .n.každá nezávisle znamená substituent, kterým muže být jakákoli funkcní skupina, s výhodou atom vodíku nebo atom halogenu, nebo alkylová skupina, která muže být substituována jednou nebo více skupinami nebo atomy; R.sub.8.n. znamená alkylovou skupinu nebo skupinu NHR.sub.10.n.; R.sub.9.n. znamená atom halogenu; a R.sub.10.n. znamená atom vodíku nebo alkylovou skupinu poprípade substituovanou jednou nebo více skupinami nebo atomy, s výhodou acylovou skupinou; nebo jeho derivátu nebo farmaceuticky prijatelné soli, pro výrobu farmaceutického prostredku pro snížení nebo zmírnení dysfunkce T-bunek u cloveka s HIV nebo AIDS.

Description

Farmaceutický prostředek

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká léčení nedostatečnosti imunitního systému u virových infekcí. Vynález se zvláště týká použití inhibitorů cyklooxygenázy-2 (COX-2) nebo jejich derivátů pri ímunomodulaci pro léčení infekce HIV a AIDS.

io

Dosavadní stav techniky

Prostaglandiny mají důležitou úlohu při zánětlivých procesech a inhibice tvorby prostaglandinů je populárním cílem pro vývoj protizánětlivých léčiv. Nesteroidní protizánětlivá léčiva (NSAID) inhibují cyklooxygenázu (COX), což je enzym účastnící se biosyntézy prostaglandinových mezi15 produktů z kyseliny arachidonové. V současnosti se klinicky používá několik léčiv NSA1D včetně léčiv jako je indomethacm, piroxikam, tenoxikam, diklofenak, meloxikam, tenidap, isoxikam, kyselina acetylsalicylová, diflunisal, sulindak, ibuprofen, naproxen a ketoprofen.

Látky NSAID dnes patří celosvětově mezi nejčastěji předepisovaná léčiva.

Látky NSAID jsou klinicky účinná léčiva a mají antipyretické, protizánětlivé a antitrombotické účinky. Hlavní indikace pro tuto třídu léčiv je artritida včetně osteoartritidy a revmatoidní artritidy, bolestivé stavy kosterního a svalového systému a stavy obecné bolesti. Tato léčiva však mají vážné nežádoucí účinky. Nej častějším vedlejším účinkem je tvorba gastrointestinálních vředů a krvácení, inhibice agregace destiček a interakce s jinými léčivy.

Na počátku devadesátých let byla klonována druhá isoforma COX tohoto enzymu. Tato nová isoforma COX je nyní známá jako COX-2 (Van a další, 1998, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol., 38, str. 97 až 120).

Nyní tedy jsou dobře známy dvě isoformy COX, COX-1 a COX-2 (v nedávné době byla také vyslovena domněnka o existenci COX-3). COX-1 je přítomná ve většině tkání a může být považována za „domácí“ enzym, aktivita enzymu COX-1 například chrání výstelku gastrointestinál30 ního traktu. COX-2 však není přítomný za normálních okolností a jeho koncentrace stoupá při zánětu. Několik vedlejších účinků látek NSAID souvisí s inhibicí enzymu COX-1. Látky NSAID inhibují jak COX-1, tak i COX-2 (viz tabulky 1 až 3).

Tabulka 1: Hodnoty IC₅₀ a poměry COX-2/COX-1 různých látek NSAID v makrofágovém modelu na morčeti (hodnoty IC50 převzaté z Engelhart a další, J. Inflammatory Res., 44, str. 422 až 43, 1995)

NSAID	COX-2 IC50 (pmol/l)	COX-1 IC50(pmol/1)	Selektivita COX-2 COX-1/COX-2
Meloxikam	0,0019	0,00577	3
Diklofenak	0,0019	0,000855	0,45
Piroxikam	0,175	0,00527	0,030
Tenoxikam	0,322	0,201	0,6
Indomethacin	0,00636	0,00021	0,03
Teridep	47,8	0,393	0,008

-1 CZ 302448 B6

Tabulka 2: Hodnoty IC₅₀ pro látky NSA1D v intaktní buňce pro COX-1 (bovinní endotheliální buňky) a COX-2 (stimulované makrofágy) (hodnoty IC₅o pocházejí zTaketo, J. National Cancer Institute, 90, str. 1529 až 1536, 1998)

NSAID	COX-2 1C5O (pmol/l)	COX-1 1C5O (pmol/l)	SelektivitaCOX-2 COX-1/COX-2
Asprin	50	0,3	0,006
Indomethacin	0,6	0,01	0,02
Kyselina tolfenamová	0,005	0,0003	0,06
Ibuprofen	15	1	0,07
Acetaminofen	20	2,7	0,1
Salicylát sodný	100	35	0,35
BW 755C	1,2	0,65	0,5
Flubiprofen	0,025	0,02	0,8
Karprofen	3	3	1
Diklofenak	0,35	0,5	1,4
Naproxen	1,3	2,2	1,7
BF389	0,03	0,15	5

Tabulka 3: Inhibice syntézy rekombinantního lidského PGH (COX-1 a COX-2) (hodnoty IC₅o z publikace Laneuvill a další, J. Pharm. Exp. Ther., 271, str. 927 až 34, 1994)

NSAID	COX-2 IC50 (ymol/l)	COX-1 IC50 (pmol/l)	SelektivitaCOX-2 COX-1/COX-2
Indomethacin	>1000	13,5	<0,01
Sulindak sulfid	50,7	1,3	0,03
Piroxikam	>500	17,7	0,04
Diklofenak	20,5	2,7	0,13
Flubiprofen	3,2	0,5	0,16
Meklofenemát	9,7	1,5	0,15
Fenylbutazon	>100	16,0	<0,16
Naproxen	28,4	4,8	0.17
Ibuprofen	12,5	4,0	0,3

-2CZ 302448 B6

NSAID	COX-2 IC50 (pmol/l)	COX-1 IC50 (pmol/l)	SelektivitaCOX-2 COX-1/COX-2
Ketorolak	60,5	31,5	0.5
tromethamin
DHA (22 : 6)	41	25,6	0,6
6-MNA	93,5	64,0	0,7
Etodolak	60	74,4	1.2
Kyselina salícylová	>1000	>1000	-1

V poslední dekádě bylo identifikováno několik nových selektivních inhibitorů COX-2 a tzv. ,,preferenčních“ inhibitorů COX-2. Byl proveden vývoj několika z těchto inhibitorů COX-2 a několik z nich se v nedávné době dostalo na trh. Některé z nových inhibitorů COX-2 nevykazují v klinických dávkách inhibici COX-1. Důkladné klinické studie a použití těchto inhibitorů COX-2 v klinické praxi ukazují, že tyto nové inhibitory COX—2 mají velké výhody vzhledem k bezpečnosti ve srovnání s neselektivními léčivy NSAID. Přehledné články týkající se inhibitorů COX-2 jsou například Golden a další, 1999, Osteoarthritis. 25, str. 359 až 379, Mitchel a další, io 1999, Brit. J. Pharmacol., 128, str. 1121 až 1132, Lipsky, 1999, Am. J. Med., 106 (5B), str. 51 5 až 575, Taketo, 1998, J. National Cancer Inst., 90, str. 1529 až 1537, Griswold a další, 1996, Med. Res. Rev„ 16, str. 181 až 206 a Reitz a další, 1995, Ann. Rep. Med. Chem., 30, str. 179 až

188.

Další zajímavé publikace týkající se různých inhibitorů COX-2 jsou například: Lan, 1997, J. Rheumatol., 24 (dodatek 49), str. 20 až 24, Mehlish a další, 1998, Clin. Pharmacol. Ther., 63, str. 1 až 8, Zhao a další, 1997, Arthritis Rheum., 40 (dodatek), S88, Ehrich a další, 1997, Arthritis Rheum., 40 (dodatek), S93, Maziasz a další, 1997, Arthritis Rheum., 40 (dodatek), S195, Mengle-Gaw a další, 1997, Arthritis Rheum., 40 (dodatek), S93, Morrison, 1999, Clin. Ther., 21, str.

9 43 až 953, Chán a další, 1995, J. Pharmacol. Exp. Ther., 274, str. 1531 až 37, Riendeau a další,

1997, Br. J. Pharmacol., 121, str. 105 až 117, Black a další, 1999, J. Med. Chem., 42, str. 1274 až 81, Cuo a další, 1996, J. Biol. Chem., 271, str. 19134 až 39, Geiss, 1999, Scand. J. Rheumatol, 109 (dodatek), str, 31 až 37, Warner a další, 1999, PNAS USA, 96, str. 7563 až 68, Bjamson a další, 1997, Scand. J. GastroenteroL, 32, str. 126 až 130, Danneberg a další, 1999, Semin. Oncol.,

26, str. 499 až 504, Mitchell a další, 1993, PNAS USA, 90, str. 11693 až 97, Futaki a další, 1994,

Prostaglandins, 47, str. 55 až 9, Futaki a další, 1993, J. Pharm. Pharmacol., 45, str. 753 až 5, Masferrer a další, 1994, PNAS USA, 91, str. 3228 až 32, Klein a další, 1994, Biochem. Pharmacok, 48, str. 1605 až 10, Reitz a další, 1994, J. Med. Chem, 37, str. 3878 až 81, Seibert a další, 1994, PNAS USA, 91, str. 12013 až 17, Klein a další, 1996, Biochem. Pharmacol., 51, str. 285 až

90, Nantal a další, 1998, 9^ϋι Intem. Conference Inflam. Res. Assoc., 1. až 5. listopad, Pennig a další, 1997, J. Med. Chem., 40, str. 1347 až 65 a Puig a další, 2000, J. Med. Chem., 43, str. 214 až 223.

Inhibitory COX-2 tvoří z hlediska chemické struktury relativně různorodou skupinu sloučenin.

Sloučeniny, které selektivně inhibují COX-2, se popisují v posledních deseti letech v mnoha patentových dokumentech. Z nich je možno uvést následující: WO 94/26 781, WO 94/20 480, WO 94/13 635, WO 95/00 501, WO 94/27 980, WO 94/15 932, WO 95/21 817, WO 95/15 316, WO 96/06 840, WO 96/03 388, WO 96/03 387, WO 96/03 392, WO 96/25 405, WO 96/24 584, WO 96/03 385, WO 96/16 934, WO 98/41 516, WO 98/43 966, WO 99/12 930, EP 673 366,

WO 98/41 511 , WO 98/47 871, WO 99/20 110, WO 99/23 087, WO 99/14 194, WO 99/14 195,

WO 99/15 513 a WO 99/15 503 a v US patentech US 5 380 738, US 5 344 991, US 5 393 790,

US 5 434 178, US 5 474 995, US 5 475 018 a US 5 510 368.

V současnosti se na trh dostaly dvě sloučeniny, rofekoxib (4-(4-methylsulfonyl)fenyl>-3- feny 1— 2(5H)-furanon) (I) v preparátu Vioxx® a celekoxib (4-(5-(4-methylfenyI)-3-(trifluormethyl)1 H-pyrazol-l-yl)-benzensulfonamid) (II) v preparátu Celebra*:

Rofekoxib se popisuje v dokumentu WO 93/0500501 firmy Merck Frosst Canada a dále v článcích Morrison, 1999, Clin. Ther., 21, str. 943 až 953, Chán a další, 1995, J. Pharmacol.

ío Exp. Ther., 274, str. 1531 až 37 a v Nantel a další, 1998, výše.

Celekoxib se popisuje v Geiss, 1999, Scand. J. Rheumatol, 109 (dodatek), str. 31 až 37 a v Penning a další, 1997, J. Med. Chem., 40, str. 1347 až 65. Uvádí se, že celekoxib má 375 x vyšší selektivitu pro COX-2 než pro COX-1.

V biologických systémech bylo testováno několik dalších inhibitorů COX-2, z nichž některé jsou BF 389 (III), CGP 28232 (IV), DFP, DFU (V), DuP 697 (VI), etodolak (VII), FK 3311 (VIII), Bosu lid (IX), L-745,337 (X), meloxikam (Mobic®, US 4 233 299, 4-hydroxy-2-methyl-N-(5methyl-2-thiazolyl)-l,l-dioxid-2H-l,2-benzothiazin-3-karboxamid) (XI), tricyklický MF (XII), nimesulid (XIII), NS-398 (XIV) a SC-58125 (XV):

-4CZ 302448 B6

(X)

-5CZ 302448 B6

(XV)

SO2CH3

Další sloučeniny vhodné pro ínhibici COX-2 zahrnují S-2474 (Shionogi, EP 595 546, 5(E)(3,5-di-terc-butyl^l-hydroxy)benzyliden-2-ethyl—1,2-isothiazolidin-l, 1-dioxid) (XVI), JTE5 522 nebo RWK-57504 (4-(4-cyklohexyl-2-methyl-5-oxazoly 1)—2—fluor-benzensulfonamid) (XVII), Darbufelonmmesylát (Pfizer, WO 94/03 448, monomethansulfonátová sůl 2-amino-5((3,5-bis(l,l-dimethyIethyI)-4-hydroxyfenyl)methylen-4(5H)-thiazolonu) (XVIII), 6089 (firmy Kotobuki Pharmaceutical) (XIX), Valdekoxib (Pharmacia, 4-(5-methy 1-3-feny 1^4-isoxazolyl)benzensulfonamid) (XX), Parakoxib jako sodná sůl (Pharmacia, sodná sůl N-((4-(5“methyl-3n fenyM-isozazolyl)-fenyl)~sulfonyl)-propanamidu) (XXI), 4-{2-oxo-3-fenyl-2,3-dihydrooxazol^l—yl)benzensulfonamid (Almirall Prodespharma) (XXII) a Etorikoxib (MK-633, Merck a

Co.):

OH (XVI)

(XVH)

(XXII) (ΧΧΟ

- 7 CZ 302448 B6

Z výše popisovaných sloučenin jsou sloučeniny vzorce B uvedeného níže podle vynálezu použitelné v dále popisovaných způsobech.

Jako indikace inhibitorů COX-2 je možno uvést artritidu, stavy muskuloskeletární bolesti a obecnou bolest, které byly dosud léčeny klasickými látkami NSAID jako indomethacin, diklofenak a naproxen. V poslední době bylo také navrhováno použití inhibitorů COX-2 při léčbě rakoviny a také při prevenci rakoviny. Inhibitory COX-2 by také mohly být využívány v souvislosti s Alzheimerovou chorobou a jinými procesy v mozku spojenými s demencí.

Možná klinická využití inhibitorů COX-2 se popisují například v Nátuře, 367, str. 215 až 216 (1994), v Drug News and Perspectives, 7, str. 501 až 512 (1994), v Annual Reports in Medicinal Chem., 30, str. 179 až 188 (1995) a vOncogen, 18, str. 7908 až 7916 (1999). Nejsou známy žádné konkrétní návrhy týkající se použití inhibitorů COX-2 při antivirové terapii nebo konkrétněji při terapii HIV/AIDS, a žádné inhibitory COX-2 nebyly testovány v souvislosti s působením proti HIV, Dále se nikde nenavrhuje použití inhibitorů COX-2 (nebo neselektivních inhibitorů COX) jako imunostimulačních prostředků při léčení imunologické nedostatečnosti virového a nevírového původu.

Infekce HIV a onemocnění AIDS představuje hlavní zdravotní problém, přičemž celosvětově je virem infikováno více než 33 milionů lidí. Většina infikovaných lidí žije v Africe (subsaharské) a v některých oblastech Asie. V současnosti se klinicky používají dvě třídy sloučenin účinkujících proti AIDS; inhibitory reverzní transkriptázy HIV a inhibitory HIV proteázy. Inhibitory reverzní transkriptázy HIV je možno rozdělit na nenukleosidové inhibitory reverzní transkriptázy (NNRTI) a nukleosidové inhibitory reverzní transkriptázy (NRTI).

Nejběžnějšími používanými látkami typu (NNRTI) jsou nevirapin, delavirdin, efavirenz, emivirin a TI 80. Nejčastěji používanými látkami typu NRTI jsou zidovudin, didanosin, stavudin a zalcitabin. Mezi klinicky použitelné inhibitory HIV proteázy patří inklinavir, palinavir a sakvíravir.

Léčení infekce HIV a AIDS je v současnosti založeno na kombinaci několika léčiv, tzv. koktejlu inhibitorů reverzní transkriptázy a inhibitorů proteázy. Tyto kombinace na2ývané HAART (highly active antiretroviral therapy) jsou poměrně účinné a mohou snížit množství viru v krvi pacienta zpět na nedetekováte 1 né hladiny. HAART však neznamenají pro pacienta vyléčení, protože virus je v imunitních buňkách stále přítomen, a onemocnění se může kdykoliv znovu objevit; po přerušení léčby často vrcholí viremie a pozoruje se rychlý postup k onemocnění AIDS. V průběhu léčby HAART dále často přetrvává imunologická nedostatečnost a dysfunkce T-buněk specifická pro HIV. Takové léčení musí probíhat po celý život a je velmi nákladné. Samotné náklady na léčivo často přesahují 15 000 USD. S tímto léčením je navíc spojeno několik problémů; obtíže se spoluprácí pacienta (komplikované léčebné režimy), vývoj rezistentních virů, ne ideál ní farmakokinetické vlastnosti a vedlejší účinky jako například suprese kostní dřeně a dlouhodobé metabolické účinky.

V poslední době publikované přehledné Články týkající se léčení infekce HIV jsou například: Hilgegroth, 1998, Pharm. uns. Zeit, 1998, 27, str. 22 až 25, Hilgegroth, 1998, Pharm. uns Zeit, 7, str. 111 až 116. Stellbrink, 1997, Dk Arztebl., 94, str. 2497 až 2503, Rettle a další, 1998, Int. J. STD AIDS, 9, str. 80 až 87, De Clercq, 1998, Antiviral Res., 38, str. 153 až 179, Gait a další, 1995, TIBTEC, 13, str. 430 až 438 a Redshaw a další v „Emerging Drugs: The Prospects of Improved Medicines‘\ kapitola 6, str. 127 až 154, 1997.

WO 00/40 243 popisuje sloučeniny pro inhibici produkce TNF odlišné od sloučenin vzorce B.

WO 00/69 255 popisuje použití inhibitorů COX-2 jako protizánětlivých látek pro léčení postupu viru, infekce a přenosu, nikoli pro léčení nebo prevenci infekce virem HIV nebo AIDS.

WO 98/20 864 se týká použití sloučenin NSAID pro léčení Alzheimerovy nebo Parkinsonovy choroby. Tento dokument není relevantní pro sloučeniny vzorce B.

-8CZ 302448 B6

WO 97/29 774 se týká použití inhibitorů COX-2 jako imunosupresivních látek.

WO 97/38 986 se týká léčení zánčtlivých stavů prekurzory inhibitoru COX-2.

Autoři předkládaného vynálezu identifikovali COX-2 jako specifický cíl ne na základě jeho pro5 tizánětlivých vlastností, ale na základě zjištění, že COX-2 může zvyšovat imunitní dysfunkci u pacientů s HIV. Zaměření léčby na COX-2 proto zmírní imunitní dysfunkci, čímž dojde k léčení

HÍV/AIDS.

Závěrem lze tedy říci, že ačkoli kombinace více léčiv jako HAART podstatně zlepšily prognózu io pacientů trpících infekcí HIV, je stále zapotřebí vyvíjet nové sloučeniny pro antivirovou terapii

HIV; týká se to zvláště prostředků stimulujících imunitní systém. Na tuto potřebu se zaměřuje předkládaný vynález.

Podstata vynálezu

Exprese COX-2 je za normálních okolností omezená na procesy probíhající v mozku, na artritickou synoviální tkáň a místa postižení tkáně. COX-2 se nevyskytuje v normálních lymfatických uzlinách nebo lymfocytech. Nyní však bylo překvapivě zjištěno, že u myší infikovaných imuno20 deficitní poruchou MA1DS se v buňkách lymfatických uzlin exprimují vysoké hladiny COX-2. Dále bylo zjištěno, že pozitivně selektované T-buftky CD4+ a CD8+ stejně jako B-buftky z lymfatických uzlin MAIDS, obsahovaly vysoké hladiny COX-2 (viz příklad 2). Bylo zjištěno, že je možno zaměřit se na tuto COX-2 s cílem odstranit příznaky imunodeficitní poruchy, například pro odstranění dysfunkce T-buněk imunostimulačním působením, například vytvářením imunitních odpovědí specifických pro antigen.

Aniž by si autoři přáli být vázáni teorií, předpokládá se, že aktivita COX-2 zvyšuje produkci PGE₂, která zase zvyšuje hladiny cAMP aktivujícího signálovou biochemickou cestu PKA vedoucí k nesprávné funkci lymfocytů. Práce prováděné na myších s MAIDS in vivo ukazují, že imunitní funkce T-buněk jsou zlepšovány inhibitory COX-2 (viz příklad 6).

Předkládaný vynález poskytuje použití inhibitoru COX-2 obecného vzorce B níže

kde

Y znamená cyklickou skupinu, s výhodou zvolenou ze skupiny oxazolyl, isoxazolyl, thienyl, dthydrofuryl, furyl, pyrrolyl, pyrazolyl, thiazolyl, imidazolyl, isothiazolyl, cyklopentenyl, fenyl nebo pyridyl;

n znamená celé číslo od 0 do 3;

m znamená celé číslo od 0 do 4;

R<5 znamená ketocyklylovou, cykloalkylovou nebo arylovou skupinu, která může popřípadě být substituována jednou nebo více skupinami nebo atomy, s výhodou jedním nebo více atomy halogenu, jako je fluor;

-9CZ 302448 B6

R₇ vždy nezávisle znamená substituent, kterým může být jakákoli funkční skupina, s výhodou atom vodíku nebo halogenu, s výhodou fluoru nebo bromu, nebo alkylová skupina (s výhodou -CH₃), kde alkylová skupina může být substituována jednou nebo více skupinami nebo atomy, s výhodou jedním nebo více atomy fluoru, například -CF?;

R_g znamená alkylovou skupinu, s výhodou -CH₃ nebo NHR|₀, s výhodou -NH₂;

R₉ znamená atom halogenu, s výhodou fluoru; a

Rio znamená atom vodíku nebo alkylovou skupinu popřípadě substituovanou jednou nebo více skupinami nebo atomy, s výhodou acylovou skupinou;

nebo jeho derivátu nebo farmaceuticky přijatelné soli pro výrobu farmaceutického prostředku pro snížení nebo zmírnění dysfunkce T-buněk u člověka sHIV nebo AIDS.

Tato třída sloučenin je nárokována v US 6 025 353 jako antiangiogení prostředky a další popis výhodných substituentů a sloučenin podle předkládaného vynálezu je stejný jako v dokumentu US 6 025 353.

V těchto sloučeninách je s výhodou skupina Rg -NH₂ nebo -CH₃.

V dalších výhodných sloučeninách Y znamená pyrazoly lovou, fůry lovou nebo thieny lovou skupinu.

S výhodou R^ znamená ary lovou skupinu popřípadě substituovanou jedním nebo více atomy fluoru.

S výhodou n je 1 nebo 2.

S výhodou R₇ znamená atom bromu, acylovou skupinu nebo substituovanou alkylovou skupinu, jakoje -CF₃.

Zvláště výhodné sloučeniny vzorce B pro použití v rámci vynálezu jsou zde popisované sloučeniny označené celekoxib, rofekoxib, DuP-697, SC-58125, DFP, DFU, CGP 28232 a tricyklický MF (MF-tricyklic, tricyklický methy lsulfonový derivát).

Jak se zde používá, zvýšená aktivita COX-2 označuje zvýšené úrovně aktivity buď prostřednictvím produkce většího počtu molekul COX-2 (např. zvýšená exprese), a/nebo většího počtu aktivních molekul (např. konverze z iatentní do aktivní formy nebo odstranění inhibice aktivní formy). Tato porucha se typicky vyznačuje sníženou funkcí imunitního systému, tj. je stavem imunitní nedostatečnosti, například vykazuje nesprávnou funkci lymfocytů. Jak se zde používá, imunitní nedostatečnost (imunodeficience, imunodefícit) označuje nesprávnou funkci buněk účastnících se normálních imunitních odpovědí, zvláště B- a T-buněk. Popisované sloučeniny mohou být tedy použity pro dosažení imunostimulačních efektů pro zesílení imunitních odpovědí, Inhibitory COX-2 jsou tedy považovány za látky s imunomodulačními účinky.

Metody mohou být použity pro léčení pacientů, s výhodou savců, zvláště člověka.

Jak se zde používá, „léčení“ označuje omezení nebo odstranění, s výhodou za dosažení normálních hodnot, jednoho nebo více příznaků uvedeného onemocnění, např. infekčnosti, nebo snížení nebo odstranění imunitní dysfunkce. „Prevence“ označuje absolutní prevenci, tj. nepřítomnost detekovatelného infekčního agens, např. viru, a/nebo zachování normálních hodnot v souvislosti

- 10CZ 302448 B6 s konkrétním příznakem (např. aktivita COX-2), nebo snížení nebo odstranění rozsahu onemocnění nebo časový posun (např. zpoždění) nástupu tohoto příznaku.

Enzym cyklooxygenáza 2 je novým cílem pro léčení HIV/AIDS. Termín „inhibitor COX-2“ označuje sloučeninu schopnou po podání v určité koncentraci inhibovat enzym cyklooxygenázu 2, aniž by došlo k významné inhibici cyktooxygenázy 1. S výhodou sem patří sloučeniny se selektivní inhibici cyklooxygenázy-2 vzhledem k inhibici cyklooxygenáz-1 (např. určenou poměrem IC₈o COX-1 : COX-2 podle testu WHMA, viz níže) alespoň 10, výhodněji alespoň 50, ještě výhodněji alespoň 100 (poměr selektivity pro určitou konkrétní sloučeninu se bude lišit io podle biologického testu a formy, ve které je vyjádřen (s výhodou se vyjadřuje jako poměr IC₅o nebo ÍC₈Q COX-1 : COX-2), viz tabulky 1 až 4). Zde popisované poměry se týkají údajů získaných v jednom nebo více relevantních známých testech na COX, s výhodou s použitím čištěných lidských enzymů, např. poměru hodnot IC₅o například při zjištění metodou podle Engelhart a další, 1995, výše. Testem je však s výhodou test WHMA popisovaný dále.

S použitím řady testovacích systémů, od izolovaných čištěných enzymů až po íntaktní buňky a buněčné modely různých druhů, byla prováděna řada analýz relativních účinností COX-1 a COX-2. V současnosti se však nejvíce přijímá model testu úplné lidské krve (WBA) a modifikovaná verze, jejímž autorem je William Harvey, modifikovaného testu úplné lidské krve (WHMA), která je výhodným testem. Tyto testy využívají snadno dostupných lidských buněk pro testování, které je výhodné pro použití sloučenin u člověka. Při těchto testech se také bere v úvahu vazba sloučenin NSAID na plasmatické proteiny. Navíc se s výhodou provádí hodnocení selektivity pro ICgo spíše než pro IC₅₀, protože koncentrační křivky pro inhibici COX-2 a COX-1 nejsou paralelní, a protože většina sloučenin se používá v dávkách poskytujících rovnovážné plasmatické koncentrace bližší 80% inhibici (Warner a další, 1999, PNAS USA, 96, str. 7563 až 7568).

Při testu WBA se pro analýzu COX-1 zpracuje krev působením testovacího činidla a o 60 min později vápníkovým ionoforem a inkubuje se dalších 30 min a potom se oddělí plasma. Pro ana30 lýzu COX-2 se krev zpracuje působením aspirinu pro inhibici COX-1 a o 6 h později působením lipopolysacharidu a testovacího činidla a inkubuje se 18 h a potom se oddělí plasma. Následně se zjišťuje obsah thromboxanu B2 v plasmě radioimunologickým testem jako měřítko aktivity COX.

Při testu WHMA se analýza COX-1 provádí jako bylo uvedeno výše. Pro analýzu COX-2 se krev zpracuje kondicionovaným médiem z kultur epitehálních buněk lidských dýchacích cest (A549) vystavených interleukinu I β po dobu 24 h a krev se s tímto médiem inkubuje společně s testovacím činidlem 60 min a potom se přidá vápníkový ionofor a o 30 min později diklofenak pro zastavení produkce prostanoidů. Potom se oddělí plasma a analyzuje se na obsah prostaglan40 dinu E2 v plasmě radioimunologíckou metodou jako měřítko aktivity COX-2. Časy inkubace pro stanovení aktivit COX-1 a COX-2 jsou v tomto testu podobné, což umožňuje lepší srovnatelnost, a test WHMA je tedy výhodným testem.

Použití tohoto testu, selektivně založeného na COX-2/WHMA-COX-1 při ICso, je ukázáno v tabulce 4, kde 0,2 a 0,02 znamenají 5-, popř. 50-násobné selektivity pro COX-2.

- 11 CZ 302448 B6

Tabulka 4: Poměr COX-2/COX-1 při 1C_8O použitím testu WHMA z publikace Warner, a další, výše

Sloučenina	Poměr COX-2/WHMA-COX-1 při iCeo
diisopropylfluorfosfát	<0,01
L-745337	<0,01
rofekoxib	0,015
NS398	<0,05
SC58125	<0,01 (test WBA)
etodolak	0,043
meloxikam	0,091
celekoxib	0.11
nimesulid	0,17

Ve výhodném provedení se tedy zjišťuje poměr selektivity testem WHMA při IC₈₀ a pro použití v rámci předkládaného vynálezu jsou vhodné sloučeniny s poměrem selektivity COX-2 : COX1 méně než 0,2, výhodněji méně než 0,05, např. méně než 0,02, výhodněji méně než 0,01, např. io méně než 0,005. Jinak řečeno, výhodné sloučeniny mají poměr selektivity COX-1 : COX-2 (podle testu WHMA při IC₈o) více než 2, výhodněji více než 5, zvláště výhodně více než 50 nebo

100, jak bylo uvedeno výše.

„Inhibice“ zde označuje snížení měřitelné aktivity cyklooxygenázy-2. To může být dosaženo is ovlivněním transkripce, translace, posttranslační modifikace nebo aktivity COX-2. Inhibice se však s výhodou dosahuje inhibici enzymatické aktivity, tj. interferencí s aktivním místem již existujících aktivních molekul COX-2.

Inhibitory COX-2 mají s výhodou ICs₀ pro COX-2 méně než 0,5 pmol/l, výhodněji méně než 20 přibližně 0,2 pmol/l.

Inhibitory COX-2 pro použití podle vynálezu zahrnují sloučeniny obecného vzorce B níže

- 12CZ 302448 B6

kde

Y znamená cyklickou skupinu, s výhodou zvolenou ze skupiny oxazolyl, isoxazolyl, thienyl, dihydrofuryl, furyl, pyrrolyl, pyrazolyl, thiazolyl, imidazolyl, isothiazolyl, cyklopentenyl, fenyl a pyridyl;

n znamená celé číslo od 0 do 3;

m znamená celé číslo od 0 do 4;

Rů znamená ketocy kly lovou, eykloalkylovou nebo arylovou skupinu, která může popřípadě být substituována jednou nebo více skupinami nebo atomy, s výhodou jedním nebo více atomy halo15 genu, jako je fluor;

R? vždy nezávisle znamená substituent, kterým může být jakákoli funkční skupina, s výhodou atom vodíku nebo halogenu, s výhodou fluoru nebo bromu, nebo alkylová skupina (s výhodou CH₃), kde alkylová skupina může být substituována jednou nebo více skupinami nebo atomy, s výhodou jedním nebo více atomy fluoru, například -CF_?;

Rs znamená alkylovou skupinu, s výhodou -CH₃ nebo NHR_t0, s výhodou -NH₂;

R₉ znamená atom halogenu, s výhodou fluoru; a

Rto znamená atom vodíku nebo alkylovou skupinu popřípadě substituovanou jednou nebo více skupinami nebo atomy, s výhodou acylovou skupinou; nebo jejich derivát nebo farmaceuticky přijatelnou sůl.

Tato třída sloučenin je nárokována v US 6 025 353 jako antiangiogení prostředky a další popis výhodných substítuentů a sloučenin podle předkládaného vynálezu je stejný jako v dokumentu US 6 025 353.

V těchto sloučeninách je skupina R₈ -NH₂ nebo -CH₃. V dalších výhodných sloučeninách Y znamená pyrazolylovou, furylovou nebo thienylovou skupinu. S výhodou R/> znamená arylovou skupinu popřípadě substituovanou jedním nebo více atomy fluoru. S výhodou n je i nebo 2. S výhodou R? znamená atom bromu, acylovou skupinu nebo substituovanou alkylovou skupinu, jakoje-CF₃.

Zvláště výhodné sloučeniny vzorce B pro použití v rámci vynálezu jsou zde popisované sloučeniny označené celekoxib, rofekoxib, DuP-697, SC-58125, DFU a tricyklický MF (MF-tricyklic, tricyklický methylsulfonový derivát).

Jak se zde užívá, termín „alkyl“ zahrnuje jakýkoli dlouhý nebo krátký řetězec, přímou, rozvětve45 nou nebo cyklickou alifatickou nasycenou nebo nenasycenou uhlovodíkovou skupinu, popřípadě mono- nebo polysubstituovanou skupinami hydroxy, alkoxy, acyloxy, nitro, alkoxykarbony loxy, amino, aryl, oxo nebo halo, pokud není konkrétně uvedeno jinak. Nenasycené alkylové skupiny

-13CZ 302448 B6 mohou být mono- nebo polynenasycené a zahrnují alkeny lové i alkinylové skupiny. Tyto skupiny mohou obsahovat až 40, ale s výhodou 1 až 10 atomů uhlíku.

Jak se zde používá, cyklické kruhy jsou s výhodou C₅_₇ a popřípadě obsahují jeden nebo více 5 heteroatomů zvolených ze skupiny kyslík, dusík a síra.

Termín „acyl“, jak se zde užívá, zahrnuje karboxylátové i karbonátové skupiny, tedy např. acyloxy substituované alkylové skupiny zahrnují například alkylkarbonyloxyalkyl. V těchto skupinách obsahují kterékoli alkylenové části s výhodou atomy uhlíku jako je definováno pro alkylové to skupiny výše. Výhodné ary lové skupiny zahrnují fenyl a monocyklické 5 až 7-členné heteroaromatické skupiny, zvláště fenyl a tyto skupiny mohou být samy popřípadě substituované.

Mezi reprezentativní substituované alkylové skupiny R] patří alkoxyalkyl, hydroxyalkoxyalkyl, póly hydroxy alkyl, hydroxypolyalkylenoxyalkyl apod., jako je alkoxymethyl, alkoxyethyl a alko15 xypropyt nebo acyloxymethyl, acyloxyethyl a acyloxypropyl atd., např. pivaloy loxy methyl.

Jak se zde používá, substituované skupiny mohou být mono- nebo póly substituované skupinami hydroxy, alkoxy, acyloxy, nitro, a lkoxy karbony loxy, amino, aryl, oxo nebo halo, pokud není konkrétně uvedeno jinak.

Zvláště výhodné sloučeniny jsou však: rofekoxib, SC 58125, a celekoxib.

Způsoby výroby inhibitorů COX-2 pro použití podle předkládaného vynálezu jsou odborníkům v oboru dobře známé, např. jak se popisuje ve výše uvedené literatuře.

Inhibitor COX-2 pro použití podle předkládaného vynálezu, mohou obsahovat jedno nebo více asymetrických center a/nebo jednu nebo více dvojných vazeb, tj. vynález bude zahrnovat také použití izomeru a racemátů uvedených sloučenin. Do rámce předkládaného vynálezu patří všechny takové možné izomery. Inhibitor COX-2 může být ve formě izomemí směsi sloučenin nebo výhodněji ve formě čištěného izomeru nebo jeho farmaceuticky přijatelné soli.

Farmaceutický prostředek s obsahem inhibitoru nebo inhibitorů COX-2 pro léčení stavů podle vynálezu může být formulován jako farmaceuticky přijatelné soli a může také obsahovat v oboru známé farmaceuticky přijatelné nosiče.

Předkládaný vynález tedy také popisuje použití farmaceutických prostředků obsahujících inhibitor COX-2 nebo jeho derivát nebo farmaceuticky přijatelnou sůl a farmaceuticky přijatelné ředivo, nosič nebo pomocnou látku pro výrobu farmaceutického prostředku pro snížení nebo zmírnění dysfunkce T-buněk u člověka s HIV nebo AIDS.

Termín „farmaceuticky přijatelný“ znamená, že složka musí být kompatibilní sjinými složkami v prostředku a musí být fyziologicky přijatelná pro příjemce.

Jestliže je inhibitor COX-2 bazické povahy, mohou být připraveny s farmaceuticky přijatelnými 45 netoxickými kyselinami včetně anorganických a organických kyselin soli. Zvláště výhodné soli jsou soli kyseliny chlorovodíkové, bromovodíkové, fosforečné, sírové, citrónové, jablečné, citrónové a vinné.

Jestliže je inhibitor COX-2 kyselý, mohou být připraveny s farmaceuticky přijatelnými netoxic50 kými bázemi včetně anorganických nebo organických bází soli. Zvláště výhodné soli jsou sodné, draselné a megluminové soli.

Pro léčení a prevenci onemocnění popisovaných výše mohou být inhibitory COX-2 podávány orálně, rektálně, místně, bukalně, inhalačně nebo parenterálně (například intramuskulámě, sub55 kutánně, intraperitoneálně nebo intravenózně) ve formě injekce nebo infuze. Výhodné formy

- 14CZ 302448 B6 podávání budou orálně, rektálně, injekcí nebo infuzí. Nej výhodnější forma podávání bude orální podávání.

Pro všechny formy podávání se inhibitor COX-2 podává formulován v jednotkových dávkách obvykle obsahujících známé farmaceuticky přijatelné nosiče, adjuvans a vehikula. Účinná složka muže být tedy zahrnuta, popřípadě spolu s jinými účinnými látkami ve formě kombinovaného preparátu, s jedním nebo více běžnými nosiči, ředivy a/nebo pomocnými látkami, do běžných galenických preparátů jako jsou tablety, pilulky, prášky, pastilky, sáčky, Škrobové oplatky, elixíry, suspenze, emulze, roztoky, sirupy, aerosoly (v pevném nebo kapalném médiu), masti, měkké io a tvrdé želatinové kapsle, čípky, sterilní injekční roztoky, sterilně balené prášky apod. Pro pevné implantáty mohou být použity také biologicky degradovatelné polymery (jako jsou polyestery, polyanhydridy, kyselina polymléčná nebo kyselina póly gly kolová). Prostředky mohou být stabilizovány použitím lyofilizace, podchlazení nebo systému Permazyme.

Vhodnými pomocnými látkami, nosiči nebo ředivy jsou laktóza, dextróza, sacharóza, sorbitol, mannitol, škroby, akáciová guma, fosforečnan vápenatý, algináty, tragakant, želatina, křemičitan vápenatý, mikrokrystalická celulóza, polyvinylpyrrolidon, celulóza, vodný sirup, voda, voda/ethanol, voda/glykol, voda/polyethylenglykol, propylenglykol, methylcelulóza, methylhydroxybenzoáty, propy lhydroxybenzoáty, talek, stearan horečnatý, minerální olej nebo mastné látky jako je pevný tuk nebo jejich vhodné směsi. Prostředky mohou navíc obsahovat kluzné látky, maziva, smáčedla, emulgátory, suspendující látky, ochranné látky, sladidla, ochucovadla, látky zvyšující adsorpcí, například pro dodávání nosem (žlučové kyseliny, lecitiny, povrchově aktivní látky, mastné kyseliny, chelatační látky) apod. Prostředky podle vynálezu mohou být formulovány tak, aby poskytly rychlé, prodloužené nebo opožděné uvolňování účinné složky po podání pacientovi dobře známými postupy. Účinná látka pro podávání může být pro použití ve farmaceutickém prostředku vhodně modifikována. Účinná složka může být například stabilizována, například vhodnými aditivy jako jsou soli nebo neelektrolyty, acetát, SDS, EDTA, citrátové nebo acetátové pufry, mannitol, glycin, HSA nebo polysorbát. Pro dosažení zlepšené lipofílnosti, zvýšeného buněčného transportu, zlepšené rozpustnosti nebo lepšího směrování na cíl, mohou být ao formulovány konjugáty. Tyto konjugáty mohou být schopné štěpení tak, že se konjugát chová jako prekurzor. Stability může být také dosaženo použitím vhodných kovových komplexů, např.

se Zn, Ca nebo Fe.

Účinná složka může být formulována ve vhodném vehikulu pro dodávání nebo pro směrování do určitých buněk, orgánů nebo tkání. Farmaceutické prostředky mohou mít tedy formu mikroemulzí, liposomů, niosomů nebo nanočástic, ve kteiých může být účinná složka absorbována, adsorbována, inkorporována nebo navázána. Tak je možno účinně převést produkt do nerozpustné formy.

Tyto částice mohou nést vhodné povrchové molekuly pro zvýšení doby cirkulace (např. složky séra, povrchově aktivní látky, plyoxamin 908, PEG atd.) nebo skupiny pro místně specifické působení, jako ligandy pro konkrétní buněčné receptory. Vhodné způsoby dodávání léčiv a směrování na cil jsou v oboru dobře známé, viz například Kreuter, 1994, Eur. J. Drug Meíab. rharmacokinet, 3, str. 253 až 256; Shen, 1997,1 Drug Targeting, 5(1), str. 11 až 13; Mrsny, 1997, J.

Drug Targeting, 5(1), str. 5 až 9; Pettit & Gombotz, 1998, TIBTECH, 16, str. 343 až 349; a Duncan, 1997, J. Drug Targeting, 5(1), str. 1 až 4, co se týče směrování na cíl, a Simari & Nabel, 1996, Semin. Intervent. Cardiol., I, str. 77 až 83; Torchilin, 1998, J. Microencapsulation, 15(1), str. 1 až 19; Klyashchitsky & Owen, 1998, J. Drug Targeting, 5(6), str, 443 až 458; Kreuter, 1996, J. Anat., 189, str. 503 až 505; Fasano, 1998, TIBTECH, 16, str. 152 až 157; Kataoka a so další, 1993, 24, str. 119 až 132; Anderson, 1998, Nátuře, 392 (dod.), str. 25 až 30; Langer, 1998, Nátuře, 392 (dod.), str. 5 až 10; Gregoriadis, 1995, TIBTECH, 13, str. 527 až 536; Gregoriadis a další, 1997, FEBS Lett., 402, str. 107 až 110; Rolland, 1998, Critical Reviews in Therapeutic DrugCarrier Systems, 15(2), str. 143 až 198; Hope a další, 1998, Motec. Memb. Biol., 15, str. 1 až 14; a Scherman a další, 1998, Curr. Opinion Biotech., 9(5), str. 480 až 485, co se týče dodává55 ní molekul peptidů a nukleových kyselin. Příklady specifického působení na určitá místa je

- 15CZ 302448 B6 možno nalézt například v Schafer a další, 1992, Pharm. Res., 9, str. 541 až 546, kde mohou být nanočástice akumulovány v makrofázích infikovaných HIV. Je zřejmé, že tyto metody mají přímá použití ve způsobech podle předkládaného vynálezu, popisovaných v přihlášce.

Do definice inhibičních molekul používaných podle vynálezu spadají také derivatizované nebo konjugované účinné složky.

Tak např. farmaceutický prostředek pro orální použití obsahuje účinnou složku nebo složky a vhodné fyziologicky přijatelné látky pro vytvoření tablet, kapslí, roztoků, suspenzí nebo jiných ío známých formulací pro orální podávání. Tyto prostředky se mohou připravovat jakýmkoli v oboru známým způsobem pro výrobu orálních farmaceutických prostředků. Tyto prostředky mohou obsahovat jednu nebo více biologicky účinných látek a jednu nebo více látek zvolených ze skupiny ochranných prostředků, inertních řediv, prostředků zvyšujících viskozitu, barviv, sladidel, pomocných granulačních látek, rozvolňovadel, poj i v, osmoticky aktivních látek, smáčedel, suspendujících látek, látek pro přípravu formulací se zpožděným účinkem, olejů a vody.

Farmaceutické prostředky pro jiné než orální použití, např. čípky pro rektální podávání nebo roztoky pro injekce nebo infuze mohou být připraveny použitím známých metod a aditiv těchto prostředků. Všechny formulace pro injekce a infuze by měly být sterilní.

Účinná složka v těchto prostředcích může tvořit od přibližně 0,01 do přibližně 99 % hmotnostních prostředku, s výhodou od přibližně 0,1 do přibližně 50 %, například 10 %.

Pro léčení onemocnění podle vynálezu budou denní dávky v rozmezí 0,005 až přibližně

150 mg/kg tělesné hmotnosti. Dávka silně závisí na volbě sloučeniny inhibitoru COX-2, klinickém stavu (typu viru, stavu infekce a stavu pacienta), věku a hmotnosti pacienta, způsobu podání a celkovém užívání léčiva pacientem včetně délky průběhu léčení. Výhodnější dávky budou normálně mezi 0,01 a 50 mg/kg tělesné hmotnosti denně, a ještě výhodněji 0,05 až 20 mg/kg tělesné hmotnosti denně. Denně je tedy možno například orálně podávat dospělému člověku

25 mg rofekoxibu nebo 200 mg celekoxibu.

Dávkové jednotky obsahují obecně mezi 1 a 500 mg účinné složky.

Podle jednoho provedení předkládaného vynálezu může být inhibitor COX-2 kombinován s jed35 ním nebo více dalšími inhibitory COX-2 pro léčení onemocnění, např. imunodeficitu nebo virové infekce.

Podle dalšího provedení předkládaného vynálezu může být inhibitor COX-2 definovaný výše kombinován s jedním nebo více dalšími inhibitory COX-2 nebo jedním nebo více dalšími léčivy s různými způsoby účinku pro léčení onemocnění. Příklady takových kombinací by mohl být inhibitor COX-2 v kombinaci s jednou nebo více látkami NNRTI nebo v kombinaci s jednou nebo více látkami NRTI nebo v kombinaci s jedním nebo více inhibitory HIV proteázy nebo jednou nebo více látkami HAART v kombinaci s inhibitorem COX-2.

V dalším provedení poskytuje předkládaný vynález použití, která kombinují jeden nebo více inhibitorů COX-2 se sloučeninami, které zlepšují tolerovatelnost účinné složky, zvláště při dlouhodobém léčení. Typické sloučeniny zahrnují antihistaminika a inhibitory protonové pumpy. Vynález bude nyní popsán na následujících příkladech s odkazy na následující obrázky.

-16CZ 302448 B6

Přehled obrázků na výkresech

Obr. 1 ukazuje hladiny cyklického AMP pro infekci MAIDS v buňkách CD8+ (A), CD4+ (B) a B (C). Mononukleámí buňky byly izolovány z lymfatických uzlin myší infikovaných

MAIDS po různou dobu a separovány do skupin CD4+, CD8+ a B negativní selekcí použitím buněčného sorteru FACS. Hladiny intracelulámího cAMP byly měřeny použitím sonikace a radioimunologického testu. Pruhy znamenají střední hodnotu ± SD (n = 3 jednotlivé myši).

io

Obr. 2 ukazuje hladiny cAMP po MAIDS v CD4+, Thy-1.2 negativních a pozitivních populacích. Buňky lymfatických uzlin ze tří infikovaných a tří kontrolních myší stejného věku byly tříděny pomocí FACS na populace CD4+, Thy-1.2+ (prázdné pruhy) a CD4+, Thy-1.2- (plné pruhy), a stejně jako na obr. I byly testovány intralulámí hladiny cAMP. Pruhy znamenají střední hodnotu ± SD (n = 3).

Obr. 3 ukazuje hladiny aktivity proteinkinázy A v MAIDS myších proti myším standardního typu. (A): aktivity kinázy s použitím Kemptidu jako substrátu v přítomnosti (celková aktivita, šrafované pruhy) nebo nepřítomnosti (volná aktivita, plné pruhy) 5 μΜ cAMP byly testovány v extraktech so lub i lizo váných detergentech buněk lymfatických uzlin vyčištěných z myších slezin. Aktivita fosfotransferázy neinhibovaná inhibitorem proteinkinázy specifickým pro PKA (PKI, 1 μΜ) byla odečtena, aby byla ukázána pouze aktivita specifická pro PKA. Aktivity u infikovaných myší (MAIDS; n = 4) jsou ukázány vzhledem k aktivitám odpovídajících myší standardního typu.

(B) Vazba [³H-cAMP] byla měřena ve stejných extraktech jako v části (A) a byla vypočítána molámí množství monomeru R.

Obr. 4 ukazuje imunologicky zjištěnou lokalizaci C-podjednotky PKA v buňkách myší s MAIDS a myší standardního typu. Mononukleámí buňky kontrolních myší (horní obrázek) a myší infikovaných MAIDS (dva dolní obrázky) byly navázány na sklíčka centrifugací metodou cytospin (400 x g), fixovány a imunologicky barveny polyklonální protilátkou anti-PKA-C a sekundární protilátkou konjugovanou s HRP (hnědé zbarvení). Opačné barvení je provedeno hematoxylinem (modré zbarvení na chromatinu).

Obr. 5 ukazuje vliv antagonisty PKA typu I Rp-8-brom-cAMP-fosforothioátu (Rp-8-Br35 cAMPS) na funkci T-buněk v myších infikovaných MAIDS a myších standardního typu. Proliferace T-buněk stimulovaná TCR/CD3 byla zjišťována na izolovaných Tbuňkách z myší MAIDS (A) a neinfíkovaných kontrolních myší (B). Vliv stoupajících koncentrací agonisty cAMP (8—CPT-cAMP) na proliferaci CD3+ T-buněk stimulovaných TCR/CD3 izolovaných z myší MAIDS (prázdné kroužky, tečkovaná čára) a kont40 rolních myší (plné kroužky, plná čára) byly testovány odděleně ve stejných experimentech (C). Jsou ukázány střední hodnoty trojitě prováděných stejných experimentů ± SD. Shrnutá data jsou uvedena v tab. 4 (n = 11).

Poznámka: V částech A a B jsou odlišná měřítka, zatímco v Části C je proliferace indukovaná TCR/CD3 v nepřítomnosti agonisty cAMP normalizovaná na 100 % pro T-buň45 ky myší s MAIDS a kontrolních myší.

Obr. 6 ukazuje sekreci PGE₂ buněk lymfatických uzlin z normálních myší a myší MAIDS in vitro. Netříděné buňky lymfatických uzlin myší infikovaných MAIDS (plné pruhy, n = 9) v čase 20 týdnů po infekci a kontrolních myší odpovídajícího věku (šedé pruhy, n = 4) byly kultivovány 48 h v kompletním médiu a potom byly měřeny sekrenované hladiny PGE₂ v supematantech metodou ELISA.

Obr. 7 ukazuje vliv neselektivního inhibitoru COX na imunitní funkci T-buněk v normálních myších a myších infikovaných MAIDS. Sloupec 1 - kontrolní myši + anti-CD3; slou- 17CZ 302448 B6 pec 2 - kontrolní myši + anti-CD3 + indomethacin; sloupec 3 - myši MAIDS + and— CD3; sloupec 4 - myši MAIDS + anti-CD3 + indomethacin. P rol iterativní odpovědi 'Τ'buněk byly měřeny ve smíšené populaci netříděných mononukleárních buněk lymfatických uzlin jako inkorporace ['HJ -thymidinu v nepřítomnosti a přítomnosti neselektiv5 ního inhibitoru COX indomethacinu (50 ng/ml). Aktivace T-buněk byla provedena křížovým navázáním protilátky anti-CD3 (mAb 20 1; 4 pg/ml). Pruhy ukazují střední hodnoty ± SD kontrolních (n - 3) a MAIDS infikovaných (n = 5) myší, další údaje jsou uvedeny v tab. 5. Buňky byly kultivovány 72 h, přičemž na poslední čtyři hodiny byl přidán [³H]-thymidin.

io

Obr. 8 ukazuje expresi COX-2 různými soubory lymfocytů lymfatických uzlin v normálních (A) a MAIDS infikovaných (B) myších. Buňky CD4+ T, CD8+ T a B-buňky byly tříděny metodou FACS pozitivní selekcí na základě exprese molekul CD4, CD8 a B220. Buňky CD1 lb byty tříděny negativní selekcí (na základě nepřítomnosti CD1 lb). Buňky myší infikovaných MAIDS a normálních myší byly potom lyžovány a 10 pg proteinu z každého vzorku bylo analyzováno imunologickým přenosem na expresi COX-2. Přenosy byly ponechány souběžně reagovat s protilátkami proti aktinu jako kontrolou.

Obr. 9 ukazuje expresi CD1 lb v buňkách lymfatických uzlin u myší MAIDS a myší standardní ního typu. Je ukázána exprese CDllb (průtokovou cytometrií) různých podskupin lymfocytů lymfatických uzlin (CD4+, CD8+ T-buněk a B220+ B-buněk) z myší infikovaných MAIDS a kontrolních myší. Rl: CD1 lb; R2: CD1 lb dim a R3: CD1 lb-.

Obr. 10 ukazuje hladiny exprese COX-2 v lymfatických uzlinách myší infikovaných MAIDS a 25 myší standardního typu. Lymfatické uzliny byly řezány za mrazu a zpracovány imunohistochemickým barvením COX-2 (hnědé zbarvení), (a) Normální kontrolní lymfatická uzlina s germinálním centrem barveným na COX2. (b) Normální lymfatická uzlina při vyšším zvětšení. Buňky, které jsou pozitivní na barevnou reakci HRP jsou makrofágy typu „tingible body“ s pohlceným materiálem (šipky), (c) Lymfatická uzlina z myší infikovaných MAIDS (20. týden po infekci).

Poznámka: Změněná morfologie a architektura.

(d) Vyšší zvětšení lymfatických uzlin myší MAIDS barvených na COX-2,

Poznámka: Rada buněk s hnědým imunologickým zbarvením v cytoplasmě a četné mitotické obrazce.

Obr. 11 ukazuje vliv podávání neselektivního inhibitoru COX in vivo na imunitní funkci Tbuněk u pacientů infikovaných HIV. Proliferační odpovědi T-buněk byly zjišťovány v CD3+ T-buňkách jako inkorporace [³H]-thymidinu ze tří pacientů (pacient 1 až 3) účastnících se fáze II klinického pokusu, kteří dostávalo 3 x denně 25 mg indomethaci40 nu perorálně 14 dnů navíc k trojité kombinační terapii. Horní část ukazuje imunitní funkci T-buněk v den 0, den 14 (po 2 týdnech léčení) a v den 28 (2 týdny po přerušení léčení), přičemž jednotlivé experimenty jsou označeny jako sloupce 1, 2 a 3. Aktivace T-buněk byla provedena zkříženou vazbou protilátek anti-CD3 (mAb, SpVT3b). A: Bazální proliferace po aktivaci T-buněk; B: proliferace v přítomnosti Rp-8-Br45 cAMPS(l mM).

Poznámka: Stupeň imunodeficitu podmíněného cAMP je zřejmý z porovnání horní a dolní části. Pruhy ukazují střední hodnoty ± SD z trojnásobných paralelních stanovení. Buňky byly kultivovány 72 h a na posledních 16 h byl přidán [³H]-thymidin.

Obr. 12 ukazuje vliv podávání in vivo neselektivního inhibitoru COX indomethacinu na proliferaci T-buněk u pacientů infikovaných HIV, jak bylo popsáno v obr. 11, ale pro sedm pacientů ukázaných na obrázku v pořadí 1 až 7 plnými kroužky, prázdnými kroužky, plnými trojúhelníky, prázdnými trojúhelníky, plnými čtverci, prázdnými čtverci a

- 18CZ 302448 B6 plnými kosočtverci. Jsou vyneseny střední hodnoty z trojnásobných opakování měření, propojovací čáry ukazují vývoj u každého pacienta.

Obr. 13 ukazuje vliv látky rofekoxib, specifického inhibitoru COX-2, na imunitní funkci T~ buněk u myší infikovaných MAIDS. Proliferační odpovědi T-buněk byly zjišťovány ve směsných populacích netříděných mononukleámích buněk lymfatických uzlin ínkorporací [³H]-thymÍdinu v nepřítomnosti a přítomnosti zvyšujících se koncentrací (1,9 až 500 nM) specifického inhibitoru COX-2 rofekoxibu. Aktivace T-buněk byla provedena zkříženou vazbou protilátky anti-CD3 (mAb 2C11; 4 pg/ml). Jsou ukázány střední i o hodnoty z trojnásobných opakování měření společně s proloženou křivkou sigmoidního tvaru. Buňky byly kultivovány 72 hod a [³H]-thymidin byl přidán na poslední 4 h.

Obr. 14 ukazuje vliv sloučeniny celekoxib, specifického inhibitoru COX-2, na imunitní funkci u myší infikovaných MAIDS, jak je popsáno na obr. 13 pro rofekoxib.

Obr. 15 ukazuje vliv sloučenin rofekoxib a celekoxib v porovnání s indomethacinem na sekreci PGE₂ lymfatickými uzlinami (LN) buněk ex vivo u kontrolních myší (l) nebo myší infikovaných MAIDS (2). Netříděné buňky LN byly kultivovány v kompletním médiu v přítomnosti nebo nepřítomnosti induktoru PGE₂, Iipopolysacharidu (LPS; 4 pg/ml);

nespecifického inhibitoru cyklooxygenázy, indomethacinu (50 ng/ml); a specifických inhibitorů COX-2 rofekoxibu (0,125 pM) a celekoxibu (0,125 pM). Po 48 h byla měřena koncentrace PGE₂ metodou EIA v supematantech. Byly analyzovány tri jednotlivé infikované myši (týden 20) a spojené supematanty ze tri kontrolních myší odpovídajícího věku. Jsou ukázány střední hodnoty ± standardní odchylky.

Obr. 16 ukazuje vliv ošetření in vivo myší infikovaných MAIDS sloučeninou rofekoxib na imunitní funkci T-buněk. Myši MAIDS byly ponechány neošetřené (neošetřené 1 až 3) nebo byly ošetřeny sloučeninou rofekoxib per os (3 mg/kg/den podané jednou denně, ošetřené 1 a 2) po dobu 7 dnů, podávání trubičkou vloženou do žaludku. Potom byly zjišťovány proliferativní odpovědi T-buněk in vitro ve směsné populaci netříděných mononukleámích buněk lymfatických uzlin ošetřených a neošetřených zvířat inkorporací [³H]-thymidinu v nepřítomnosti (sloupce A) a přítomnosti Rp-8-Br-cAMPS (0,5 nebo 1,0 mM, sloupce B a C). Aktivace T-buněk byla provedena u všech vzorků zkříženou vazbou protilátky anti-CD3 (mAb 2C11; 4 pg/ml). Kontrola ukazuje prolife35 raci T-buněk v neinfikovaných myších. Jsou ukázány střední hodnoty ze tří paralelních zjištění. Buňky byly kultivovány 72 h, přičemž [³H]_thymidin byl přidán na poslední 4 h.

Obr. 17 ukazuje vliv ošetření in vivo myší infikovaných MAIDS látkami rofekoxib nebo celeko40 xib na imunitní funkci T-buněk, Myším MAIDS bylo vstříknuto vehikulum (intralipid), rofekoxib v intralipidu intraperitoneální injekcí (3 mg/kg/den podáváno 1 x denně, n 6) nebo sloučenina celekoxib intraperitoneální injekcí (20 mg/kg/den podáváno 1 x denně, n - 5) 18 až 20 dní. Potom byla zjišťována proliferační odpověď T-buněk, jak bylo popsáno na obr. 16, ale bez Rp-Br-cAMP. Kontroly představují proliferaci T45 buněk v neinfikovaných myších. Jsou ukázány střední hodnoty z trojnásobných paralelních experimentů (černá kolečka) spolu s percentilem 25 až 75 % (obdélníkové oblasti) a mediánem (čára v obdélníku). Pruhy znázorňují rozmezí.

Obr. 18 ukazuje vliv ošetření in vivo myší infikovaných MAIDS meloxikamem na imunitní funkci T-buněk. Myším infikovaným MAIDS byly subkutánně implantovány osmotické pumpy (Alzet, 100 μΐ) s meloxikamem (rychlost uvolňování 70 gg/zvíře/den) nebo fyziologickým roztokem s fosfátovým pufrem (PBS) (14 týdnů po infekci) a zdravé myši 14 dnů. (A) Potom byly zjišťovány proliferační odpovědi T-buněk in vitro jak je popsáno u obr. 17. Jsou ukázány střední hodnoty ± standardní chyba střední hodnoty (s.e.m.) z každé skupiny. Vliv ošetření meloxikamem na proliferaci buněk stimulova- 19CZ 302448 B6 ných anti-CD3 z myší MAIDS (plné pruhy) v porovnání s proliferací myší MAIDS ošetřených PBS (prázdné pruhy) je významný (p <0,05). (Β) K směsným kulturám lymfatických uzlin ze skupin myší v části (A) ošetřené in vivo meloxikamem nebo PBS byly zpětně přidány meloxikam (2,5 pg/ml) v buněčné kultuře in vitro, proliferace T5 buněk indukovaná antí-CD3 byla zjišťována jako v části (A), a vliv meloxikamu zpětně přidaného in vitro (prázdné pruhy) byl porovnáván s odpovědí buněk, u kterých nebyl proveden přídavek in vitro (plné obdélníky) (p = 0,005). (C) Rp-8-Br-cAMP (0,5 mM) byl přidán k buněčným kulturám in vitro nebo směsným kulturám lymfatických uzlin ze skupin myší z části (A) ošetřených in vivo meloxikamem nebo PBS, proliferace Τι o buněk indukovaná anti-CD3 byla zjišťována jako v části (A), a vliv Rp-8-Br-cAMP in vitro (prázdné pruhy) byl vyjádřen jako násobek indukce zvýšené proti buňkám, u kterých nebyl proveden přídavek in vitro (plné pruhy). Statistické hodnocení bylo provedeno Mann-Whitneyovým U testem pro porovnání dvou skupin zvířat a Wilcoxonovým testem Matched Pairs Test pro porovnání stejné skupiny se dvěma způsoby ošetřeis ní.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Myši se syndromem získaného imunodeficitu myší (MAIDS) mají dysfunkci T-buněk indukovanou cAMP/PKA typu 1

MAIDS (Murine Acquired Immunodeficiency Syndrome)

Četné studie považují MAIDS jako možný model pro infekci lidí virem HIV. Tento syndrom se vyvíjí po infekci retrovirem s defektní replikací, který kóduje variantu polyproteinu Pr60^gag ío (Chattopadhyay a další, 1991, J. Virol., 65, str. 4232 až 4241; Jolicoeur, 1991, FASEB, J., 5, str.

2398 až 2405). Tento syndrom je spojen s progresivní lymfoproliferací ve slezině a lymfatických uzlinách a těžkými defekty imunity. I když defektní retrovirus odpovědný za MAIDS infikuje většinou B-buňky (Aziz, 1989, Nátuře, 338, str. 505 až 508), u CD4⁺ T-buněk se vyvíjí silná dysfunkce a neschopnost stimulace mitogeny in vitro. Velká frakce CD4⁺ T-buněk (ale nikoli

CD8* T-buněk) infikovaných myší je také charakterizována neobvyklým Thy-1 negativním fenotypem (Holmes a další, 1990, Eur. J. Immunol., 20, str. 2783 až 2787; Moutschen a další, 1994, Scand. J. Immunol., 39, str. 216 až 224 (MAIDS)). U normálních neinfikovaných myší se CD4⁺ Thy-1 T-buňky nalézají výlučně v germinálních centrech, kde odpovídají čerstvým vystupujícím buňkám specifickým pro antigen.

Mechanismus, kterým varianta proteinu Pr60^gag indukuje abnormality T-buněk, není znám. Byl vysloven názor, že funkci T-buněk ovlivňují rozpustné faktory sekrenované infikovanými buňkami (Simard, J. Virol., 68, str. 1903 až 1912) na dálku, ale povaha těchto mediátorů nebyla nikdy objasněna. Jiné studie navrhovaly, že pro indukci defektů T-buněk jsou nezbytné přímé, analogické interakce mezi CD4⁺ T-buňkami a buňkami předkládajícími antigen (Green, 2001, J. Virol., 70, str. 2569 až 2575; de Leval, 1998, J. Virol., 72, str. 5285 až 5290).

Důležitou úlohu při regulaci imunitních odpovědí hraje biochemická cesta adenylátcyklázacAMP-proteinkináza A (Kammer, 1991, Immunol. Today, 9, str. 222 až 229). Je známo, že zvý50 šená koncentrace cAMP inhibuje proliferační odpovědi T-buněk na různé stimuly, jako jsou anti-CD3 mAb a interIeukin-2. Poslední zprávy navrhují, že zeslabující regulace ty rosí n kinázy je JAK3 by mohla být mechanismem, kterým cAMP inhibuje proliferací T-buněk (Kolenko, 1999, Blood, 93, str. 2308 až 2318). Cyklický AMP by také mohl indukovat zeslabující regulaci membránových proteinů, protože myší thymocyty nebo thymové buňky vystavené látkám indukujícím

-20CZ 302448 B6 cAMP jako je norepinefrin zeslabují expresi Thy-1 mechanismem zahrnujícím destabilizaci mRNA (Wajeman-Chao, J. Immunol., 161, str. 4825 až 4833).

Prostaglandin E₂ (PGE₂), silný induktor cAMP, je sekrenován hlavně monocyty, makrofágy a aktivovanými T-buňkami. PGE₂ posouvá rovnováhu od T-helperových buněk typu 1 k T-helperovým buňkám typu 2 inhibici IL-2 a zesílením produkce IL-4 (Betz a Fox, 1991, J. Immunol., 146, str. 108 až 113; Meyaard, 1997, Blood, 89, str. 570 až 576). Zesiluje také diferenciaci Bbuněk směrem k produkci IgE (Fedyk a Phipps, 1996, PNAS USA, 93, str. 10978 až 10983). Syntéza prostaglandinu je výsledkem postupného působení cyklooxygenázy-1 a -2 (COX-1 a io COX-2) a specifických PG syntáz (Smith a DeWitt, 1996, Adv. Immunol., 62, str. 167 až 215). Zatímco exprese COX-1 je z velké části konstitutivní a všudypřítomná, COX-2 se indukuje pouze v některých typech buněk (makrofágy, fibroblasty, buňky hladkých svalů) působením NO a zánětlivých cytokinů jako IL—1 a TNF-ct.

Mechanismy odpovědné za dysfunkci T-buněk u MAIDS dosud nejsou zcela jasné. CD4’ Tbuňky se účastní přednostně, zatímco některé zprávy navrhovaly, že změna CD8⁺ T-buněk je způsobena pouze nedostatkem odpovídající pomoci CD4⁺ T-buněk. Naopak inhibice odpovědí B-buněkje vnitřní a nemůže být vysvětlen pouze defektními CD4⁺ lymfocyty. Pozorování autorů vynálezu selektivního zvýšení hladiny cAMP v B-buňkách a CD4⁺ T-buňkách a nikoli v CD8⁺

T-buňkách je proto v souladu s účastí cAMP při anergickém procesu souvisejícím s MAIDS.

Podle znalostí autorů vynálezu jde o první ukázku selektivního zvýšení hladiny cAMP v modelu nemoci. Jestliže je však za indukci cAMP odpovědný rozpustný faktor jako je prostaglandin E₂, co by mohlo vysvětlit následnou selektivitu jeho účinku? Dosavadní studie porovnávaly expresi různých prostanoidních receptorů na CD4’ a CD8⁺ T-buňkách a došly k závěru, že u obou skupin se vyskytuje podobné rozložení exprese. Normální CD8⁺ T-buňky jsou úplně vnímavé k účinkům PGE2 z hlediska indukce cAMP. Možné vysvětlení by mohlo být na postreceptorové úrovni; paměťové/aktivované T-buňky jsou vnímavější na PGE2 než naivní T-buňky. Při MAIDS, kde probíhají procesy závislé na MHC třídy II, by mohly CD4⁺ T-buňky dojít do urči30 tého stavu aktivace, a stát se tak vnímavější na účinek dané koncentrace PGE2. Postreceptorová modulace prostanoidních účinků je v podstatě zprostředkovaná G-receptorovými kinázami (GRK), které odpojují protein G z odpovídajícího membránového receptorů. Zánětlivé stavy jako je revmatoidní artritida jsou charakterizovány zeslabující regulací GRK, a proto zvýšenou citlivostí lymfocytů na látky indukující cAMP, jako jsou katecholaminy. Hladiny aktivity GRK v CD4⁺ a CD8⁺ T-buňkách infikovaných myší nejsou známy.

Metody použité v příkladech 1 a 2

Myši a buněčná suspenze

Samci myší C57BL/6 byli chováni v zařízení autorů vynálezu. Myši dostaly ve věku 4 a 5 týdnů dvakrát i.p. 0,25 ml bezbuněčného virového extraktu. Kontrolní myši odpovídajícího věku dostaly dvě injekce i.p. 0,25 ml fyziologického roztoku s fosfátovým pufrem. V různých časech po infekci byly myši usmrceny CO₂. Periferní lymfatické uzliny (tříselné, podpažní, krční) byly rozmělněny stříkačkami pro získání jednobuněčných suspenzí, třikrát promyty kompletním médiem RPMI 1640 a počítány na Thomově cytometru po vyloučení trypanové modři

Virus

Virový extrakt byl připraven z lymfatických uzlin myší, kterým byl vstříknut o 2 měsíce dříve RadLV-Rs, jak bylo popsáno dříve. Lymfatické uzliny byly odděleny, rozemlety v PBS a centrifugovány při 1,5 x 10⁴ g 30 min. Supematant byl znovu odstřeďován 30 min při 1,5 x I0⁴ g. Tento bezbuněčný virový extrakt byl uchováván v kapalném dusíku. Pro kvantifikaci virových částic byl použit test XC ptaque. Virový preparát obsahoval 10³ živých jednotek (PFU) ekotrop55 ního viru/ml.

-21 CZ 302448 B6

Protilátky

Pro experimenty s westernovým přenosem byly použity následující polyklonální protilátky: primární: polyklonální králičí protilátka proti COX-1 nebo králičí protilátka proti COX-2 (Santa Cruz Biotechnology); sekundární: protikráličí protilátka konjugovaná s křenovou peroxidázou byla zakoupena od Transduction Laboratories (Transduction Laboratories, UK). Pro průtokovou cytometrii byly moAbs použity následovně: PE-konjugované CD4/L3T4 (YTS. 191,1), F1TCkonjugované CD45R/B220 (RA3-6B2), FITC-konjugované CDIlb/Mac-l (Ml/70), FITCkonjugované CD161/NK-1J (PK136), FITC-konjugované CD8a (Ly-2) a CD16/CD32 (FcyIIf/II receptor) (2,4G2), (všechny firmy Pharmingen: San Diego, CA, USA). CD3 moAb (145-2C11) byla čištěna v laboratoři autorů vynálezu. Konkanavalin A (ConA) byl zakoupen u firmy Boehringer Mannheim Biochemica a ťytohemaglutinin-M (PHA) od firmy Difco. Průtoková cytometrie a tříděni buněk

Analýzy byly prováděny na přístroji FACStar-plus flow cell sorter se softwarem Cellquest software (Becton Dickinson). Pro třídění životaschopných lymfocytů byl použit přední a postranní rozptyl. Pro dvoubarevnou analýzu FITC (zelená) a PE (oranžová), byla prováděna excitace v modré oblasti 488 nm argonovým iontovým laserem (Air-to-Water cooled model Spinnaker 1161; Spectra Physics, Mountain View, CA). Pro třídění buněk bylo inkubováno 60 x 10⁶ buněk santi-FcyRIl (Fc Block) pro zabránění nespecifických interakcí před značením po dobu 20 min na ledu protilátkami konjugovanými s fluorochromem. CD4^ T-buňky byly vybrány negativně odstraněním buněk CD8⁺, B220+, CD1 lb^r. Podobně byla provedena negativní selekce CD8⁺ Tbuněk odstraněním buněk CD4\ B220\ CDllb^F a negativní selekce B-buněk odstraněním buněk CD8', CD4⁺, CDllbÁ Pro každé třídění byla zvolená frakce reanalyzována průtokovou cytometrii pro dosažení čistoty, která byla vždy vyšší než 97 %.

Kvantifikace cyklického AMP

Suspenze buněk zjedné lymfatické uzliny byly připravovány jak bylo popsáno výše, dvakrát promyty RPMI 1640 a centrifugovány 1500 x g 3 min. Buňky byly potom rozbity sonikací pro umožnění uvolnění intracelulámího cAMP do extrakčního roztoku (0,0IN HC1, 95% ethanol). Roztok obsahující buněčný lyzát byl centrifugován při 13 x 10⁴ x g 15 min a supematant byl oddělen do čerstvé zkumavky. Extrakt byl odpařen v koncentrátoru Speed Vac při 45 °C a pevný podíl byl uchováván při -20 °C. Těsně před použitím byl pevný podíl resuspendován v testovacím pufru a hladiny cAMP byly měřeny radioimunologickým testem (RIA) s použitím testovacího systému s ’²⁵I-značeným cAMP (Amersham, Anglie). Koncentrace cAMP v testovacích vzorcích byla zjišťována porovnáním se zakřivenou-lineámí standardní křivkou. Pro pozitivní a negativní kontroly byly inkubovány buňky lymfatických uzlin (1 x 10⁶) s 1 mM dDibutyrylcAMP a 0,5mM DDA (inhibitor adenylylcyklázy) 30 min při 37 °C v atmosféře zvlhčeného vzduchu s 5 % CO₂ před měřením koncentrace cAMP.

Homogenizace buněk a imunologický přenos

Buňky (50 x 10⁶) byly homogenizovány sonikací (2 x 15 s) na ledu v pufru obsahujícím 10 mM fosforečnan draselný, pH 7,1, 250 mM sacharózu, 1 mM EDTA, 0,1% triton X-100 a 10 pg/ml každého z inhibitorů proteáz chymostatinu, leupeptinu, pepstatinu A a antipainu (Tasken a další, 1993, J. Biol. Chem., 268, str. 21276 až 21283), a centrifugovány 30 min (15 000 x g) pro odstranění nerozpustného materiálu. Koncentrace proteinů byly zjišťovány Bradfordovým testem (BioRad). Pro imunologický přenos bylo odděleno 40 pg proteinu na 10% SDS-PAGE, přeneseno na PVDF membrány a inkubováno s protilátkami v pufru TBS/Tween s 5% odtučněným sušeným mlékem a 0,1% BSA (Blotto). Primární protilátky byly detekovány sekundárními protilátkami konjugovanými s HRP (Jackson Laboratoríes/Transduction Laboratories) a ECL (Amersham).

-22CZ 302448 B6

Fosfotransferázová aktivita PKA

Katalytická aktivita PKA byla zjišťována fosforylací substrátu specifického pro PKA (Leu-Arg5 Arg-Ala-Ser-Leu-Gly) (Kemp a další, 1976, PNAS USA, 73, str. 1038 až 1042, Kemptide, Peninsula Laboratories INC.) s použitím [γ-³²Ρ]-ΑΤΡ (specifická aktivita 0,25 Ci (9,25 gBq)/mmol, Amersham) v testovací směsi popsané R. Roskoskim (Methods EnzymoL, 1983, 99, str. 36).Fosfotransferázová aktivita byla měřena jak v přítomnosti, tak i v nepřítomnosti cAMP (5 μΜ) a PK1 (1 μΜ) a nízké úrovně aktivity neinhibované PKI byly odečteny pro zjištění io aktivity specifické pro PKA.

Měření vazby cyklického AMP

Kvantifikace specifické vazby [³H] cAMP solubitizovaných regulačních podjednotek PKA byla prováděna jak bylo popsáno v Cobb a Corbin (Methods in Enzymology, 159, str. 202 až 208, 1988) ve směsi obsahující [2,8-³H]cAMP (2,25 μΜ; specifická aktivita 5 CÍ (185 gBq)/mmol; Du Pont-New England Nuclear). Molámí poměry podjednotek R byly vypočteny na základě dvou vazebných míst pro cAMP na každém monomeru regulační podjednotky.

Imunocytochemická analýza

Kontrolní a infikované lymfocyty lymfatických uzlin byly fixovány chladným acetonem 5 min a dvakrát promývány 5 min vždy v 0,1% saponinu v PBS. Endogenní peroxidáza byla blokována inkubací s 0,3% peroxidem vodíku v 0,1% saponinu/PBS 15 min. Po opláchnutí v saponinu/OBS byla sklíčka inkubována 30 min při laboratorní teplotě s blokovacím pufrem (1,5% normální kozí sérum v 0,1% saponinu/PBS), a potom následovala inkubace 60 min s roztokem primární protilátky při laboratorní teplotě ve zvlhčené komůrce. Protilátka proti Ca byla od firmy Santa Cruz a byla zředěna l : 1000 v PBS s obsahem 0,1% saponinu a 0,5% normálního kozího séra. Sklíčka byla potom promyta jako dříve a inkubována s biotinyl ovanou kozí proti králičí protilátkou. Ta byla detekována komplexem ABC (Novastain Super ABC Kit, Novocastra). Peroxidáza byla zviditelněna použitím diaminobenzidinu (DAB) (Dako), který poskytuje v přítomnosti H₂O₂ hnědou sraženinu. Sklíčka byla barvena směsi hematoxylin-eosin (Sigma). Specificita byla testována inkubací cytospinu se specifickým peptidem proti podjednotce Ca PKA.

Imunohistochemická analýza

Imunohistochemická analýza byla prováděna na histologie kých řezech tloušťky 2 pm, které byly provedeny ve tkáních fixovaných 4% paraformaldehydem a zalitých do plastické hmoty (JB4JBPolySciences). Řezy byly permeabilizovány trypsinem (0,24 %) 1 min pri 37 °C a potom

Tweenem 20 (2%) 30 min při 37 °C. Endogenní peroxidázy byly inhibovány inkubací s H₂O₂ (1%) 30 min pri teplotě laboratoře. Nespecifická místa byla nasycena normálním kozím sérem (1,5%) 1 h pri 37 °C. Řezy byly potom inkubovány přes noc pri 4 °C s primární polyklonální králičí protilátkou proti COX-1 nebo králičí protilátkou proti COX-2 (Santa Cruz Biotechnology) a potom 2 h s biotinylovanou kozí protikráličí protilátkou. Ta byla detekována komplexem

ABC (Novostain Super ABC Kit, Novocastra). Peroxidáza byla zviditelněna pomocí diaminobenzidinu (DAB) (Dako), který poskytuje v přítomnosti H₂O₂ hnědou sraženinu. Řezy byly barveny hematoxylin-eosinem (Sigma). Specifita byla testována inkubací řezů s normálním králičím sérem namísto primární protilátky.

Proliferační testy u myší s MAIDS

Proliferační testy byly prováděny inkubací 0,1 x 10⁶ CD3+ T-buněk/ml ve 100 μΙ objemu na 96jamkových mikrotitračních destičkách s plochým dnem. Aktivace byla provedena následným přidáním monodisperzních magnetických kuliček potažených ovčí protilátkou proti myšímu IgG

-23CZ 302448 B6 (Dynal, kat. č. 110.02) v poměru buňky : kuličky 1 : 1 a potom byla přidána protilátka proti CD3 (klon 2C1 1) na konečné přidání 4 pg/ml pro dané experimenty. Optimální koncentrace protilátky byla při počátečním nastavení opatrně titrována a vždy byly provedeny paralelní experimenty při několika různých ředěních protilátky. Proliferace byla analyzována inkubací buněk 72 h, přičemž na poslední 4 hodiny byl přidán [³H]-thymidin (0,4 pCi (14,8 kBq)) a buňky byly odděleny na zařízení cell harvester (Skatron, Sterling, V A, USA) na filtrech ze skleněných vláken. Inkorporovaný prekurzor byl počítán na scintilačním analyzátoru (Tri-Karb, Packard,, Meriden, CT, USA). Pokud byly použity analogy cAMP, byly přidány 30 min před aktivací přidáním protilátek proti CD3. 8-CPT-cAMP pocházelo od firmy Sigma (St. Louis, MO) a Sp- a Rp-8-Br-cAMPS byly io od firmy BioLog Life Science Company (Břemen, Německo) a vždy byly rozpuštěny na koncentrace 4 až 10 mM v PBS, přičemž koncentrace byly vypočteny použitím extinkčních koeficientů uvedených výrobcem. Indomethacin byl rozpuštěn ve vodě a použit při koncentrací 50 ng/ml.

Stanovení PGE₂

500 μΙ supematantu buněk lymfatických uzlin ze 48 hodinové kultury z kontrolních a infikovaných myší bylo pipetováno do 1,5 ml polypropylenových zkumavek, do kterých bylo přidáno 500 μΐ směsi voda : ethanol (1 : 4) a 10 μΐ ledově chladné kyseliny octové. Zkumavky byly opatrně míchány a ponechány 5 min při teplotě laboratoře. Potom byla provedena centrifugace pří

2500 x g 2 min. Supematanty byly odděleny a naneseny na minikolony Amprep Cl8, které byly ekvilibrovány dvěma objemy kolony 10% ethanolu. Kolony byly potom promyty jedním objemem H₂O a jedním objemem kolony hexanu. PGE₂ byl potom eluován 2 x 0,75 ml ethylacetátu. Frakce byly odděleny a odpařeny pod dusíkem do sucha. Potom byly všechny frakce rekonstituovány ve 100 μΐ testovacího pufru a PGE₂ byl stanoven pomocí kitu Amersham EIA podle dopo25 ručení výrobce.

Statistické analýzy

Pro porovnání dvou skupin jedinců byl používán dvoudílný Mann-Whitneyův U test. Koeficienty korelace (r) byly počítány metodou Spearman's rank test. Statistické analýzy a proložení křivek byly prováděny softwarem Statistica (StatSoft Inc., Tulsa, OK) a Sigma Plot (Jandel Corporation, Erkrath, Německo). Výsledky se uvádějí jako mediány a 25. až 75. percentily, pokud není uvedeno jinak hodnoty p jsou dvojstranné a jsou považovány za významné při hodnotě <0,05.

Experimentální část

Infekce MAIDS vede ke zvýšené koncentraci cAMP v CD4+ T-buňkách. Myši inokulované směsí retrovirů známých jako RadLV-Rs, které způsobují vyvinutí MAIDS, byly usmrceny v různých časech po infekci a buňky lymfatických uzlin byly roztříděny použitím negativního výběru a průtokového cytometru/sorteru buněk na čisté B-buňky a CD4+ a CD8+ T-buňky. Intracelulámí hladiny cAMP byly zjišťovány v různých buněčných populacích po infekci. Jak je vidět na obr. 1, hladiny cAMP byly silně zvýšené (více než dvacetkrát) po několika týdnech infekce v CD4+ T-buňkách. V pozdějších stadiích jsou také zvýšené hladiny cAMP B-buněk, zatímco v případě CD8+ T-buněk jsou pozorovány pouze menší změny. Navíc, jestliže byly

CD4+ T-buňky rozděleny na Thy-1.2+ a Thy 1.2- buňky pozitivním tříděním, bylo zřejmé, že k hlavnímu zvýšení hladin cAMP došlo v buňkách Thy-1.2- (obr. 2, šesti násobné). Tato populace přítomná normálně v malém nadbytku také vykazovala vyšší bazální hladiny cAMP než u buněk Thy-1.2+, jestliže byly obě populace získány od neinfikováných myší.

Zjištění aktivity PKA fosfotransferázy v postnukleárních supematantech z extraktů solubilizovaných detergentem ukázalo, že v buňkách lymfatických uzlin MAIDS byly celkové hladiny aktivity cAMP dependentní kinázy snížené, zatímco v nepřítomnosti cAMP byly pozorovány malé změny (obr. 3A). To je v souladu s chronickou aktivací a disociací PKA vedoucí buď k degradaci podjednotky C, nebo ktranslokaci C. Testování vazby cAMP (obr. 3B) neukázalo žádné změny v celkových hladinách podjednotek R PKA, Imunocytochemická analýza buněk lymfatických

-24CZ 302448 B6 uzlin myší s MAIDS a kontrolních myší ukázala zvýšené hladiny imunoreaktivní podjednotky C PKA v jádře (obr. 4). To je opět v souladu s aktivací biochemické cesty cAMP-PKA pri MAIDS.

Antagonista PKA typu I zlepšuje proliferaci T-buněkpocházejících z MAIDS

Pro zjištění účinku zvýšené hladiny cAMP a aktivace PKA na inhibicí proliferace T-buněk indukované TCR/CD3 používali autoři vynálezu analog cAMP substituovaný sírou (Rp-8-BrcAMPS) fungující jako úplný antagonista PKA typu I (Gjertsen, Mellgren, a další, 1995, 1665/id). Obr. 5A ukazuje, že v T-buňkách odvozených z myší infikovaných MAIDS byla proio liferace stimulovaná TCR/CD3 nižší než 10 % proliferace T-buněk neinfikovaných kontrolních myší (obr. 5B). Když byl vliv antagonisty PKA typu I zjišťován u T-buněk MAIDS, autoři dále pozorovali zvýšení proliferace indukované TCR/CD3 závisející na koncentraci, které bylo při vyšších koncentracích více než čtyřnásobné (obr. 5A), zatímco působením na kontrolní T-buňky nebyla pozorována žádná stimulace (obr. 5B). U 11 myší infikovaných MAIDS byla vážně poškozená proliferace T-buněk ve srovnání s kontrolami (p <0,001) a u 10 z 11 myší zlepšil antagonista PKA typu I proliferaci T-buněk (p <0,01; medián 2,2-násobek, tabulka 5). Stimulační účinek antagonisty cAMP nedosáhl nasyceného stavu i při nejvyšších použitých koncentracích (obr. 5A a podobné údaje (nejsou ukázány) byly získány pro všechny myši v tabulce 5). To ukazuje, že rozpustnost sloučeniny, afinita nebo její dostupnost pro buňky mohou být omezujícími faktory pro pozorovaný účinek. Antagonista s vyšší permeabilitou a silnějšími účinky na PKA typu I by mohl, pokud by byl k dispozici, dále zlepšit proliferaci T-buněk MAIDS indukovanou TCR/CD3.

Dále byl testován účinek antagonisty cAMP na proliferaci indukovanou TCR/CD3 u pěti myší infikovaných MAIDS a pěti kontrolních myší. U T-buněk z myší infikovaných MAIDS se objevil významný posun v citlivosti na inhibicí proliferace buněk exogenně přidaným 8-CPT-cAMP (obr. 5C a tabulka 5). Navíc, jestliže byly maximální rychlosti proliferace T-buněk myší infikovaných MAIDS a proliferace kontrolních T-buněk normalizovány na 100 % (obr. 5C a neukázané údaje), bylo zřejmé, že navíc k inhibiční křivce cAMP posunuté doleva byly podstatně odlišné směrnice křivek (Hillovy koeficienty 0,6 (0,54 až 1,52) u T-buněk z myší MAIDS proti 2,2 (1,9 až 2,5) pro normální T-buňky, tabulka 5, p <0,05). Zvýšená citlivost na inhibicí analogem cAMP ukazuje na příspěvek zvýšené hladiny endogenního cAMP při primingu vazebného místa B pro cAMP u PKA typu I s následným zvýšením afinity místa A na exogenně přidaný analog cAMP. Posun směrnice křivky od kooperativní vazebné situace na místo pro dva ligandy ke zdánlivé nekooperativní inhibiční křivce působením 8-CPT-cAMP také ukazuje na obsazení místa B zvýšenou koncentrací endogenního cAMP.

-25CZ 302448 B6

Tabulka 5

Myši	Anti-CD3- indukovaná proliferace (cpm)	Zvýšení proliferace Rp-8-Br- CAMPS (násobek zvýšení)	Inhibice proliferace 8-CPT-cAMP (IC50 pM)	Inhibice proliferace 8-CPT-cAMP (Hillův koeficient)
1	9525	19	6	41
2	3 312	24	22	54
3	9 153	14	8	58
4	959	37	n. d.	n. d.
5	13 791	10	52	156
6	6 370	19	66	152
7	6 357	22	n. d.	n. d.
8	9 986	42	n. d.	n. d.
9	5 696	40	n. d.	n. d.
10	16 132	37	n. d.	n. d.
11	3 740	37	n. d.	n. d.
MAIDS	6 370*	2,2**	0,22	0,58***
Medián (25. - 75. percentily)	(3 740 -9 986) n = 11	(1,9-3,7) n - 11	(0,08- 0,52) n = 5	(0,54 - 1,52) n - 5
Kontroly Medián (25. - 75. percentily)	62 281 (56 539- 82 038) n = 6	1.1 ¢1.0-1,3) n = 6	0,40 (0,33 - 0,46) n - 4	2,24 (1,93 -2,47) n - 4

MAIDS proti kontrolám;

* znamená p <0,001, ** znamená p <0,01 a *** znamená p <0,05 n. d. = nebylo stanoveno

Příklad 2

Dysfunkce T-buněk indukovaná cyklickým AMP myší s MAIDS je způsobena zvýšenou pro dukcí PGE₂ CD1 lb-pozitivním buňkami se zvýšenými hladinami COX-2

-26CZ 302448 B6

Zvýšená produkce PGE₂ v buňkách infikovaných MAIDS

Směsné buněčné populace lymfatických uzlin byly izolovány z myší infikovaných MAIDS a kontrolních myší a kultivovány in vitro. Sekrenované hladiny PGE₂ byly měřeny v supematantech z médií po 48 hodinách kultivace, přičemž se ukázalo, že buňky infikované MAIDS sekrenovaly 7 až 8 krát více PGE₂ než kontrolní buňky.

Inhibice produkce PGE2 obnoví proliferací T-buněk infikovaných MAIDS ίο V dalším experimentu byly směsné buňky lymfatických uzlin aktivovány protilátkami proti CD3 pro indukci proliferace T-buněk a po 72 hodinách byla měřena inkorporace [³H]-thymÍdinu. Proliferace buněk z myší infikovaných MAIDS byla opět pouze 10 až 20 % proliferace T-buněk neinfikovaných kontrolních buněk. Když však byl ke kulturám přidán indomethacin pro inhibici produkce PGE₂ ve směsných kulturách, silně zvýšil proliferací buněk pěti myší infikovaných

MAIDS na úrovně srovnatelné s proliferací u kontrolních myší (obr. 6). Co se týče deseti dalších myší infikovaných MAIDS (tabulka 6), účinek indomethacinu na proliferací T-buněk směsných lymfocytových kultur byl velmi významný (p <0,01). Naopak ošetření kontrolních kultur indomethacinem nevedlo ke změně proliferace.

COX-2 je exprimována ve vysokých hladinách v lymfatických uzlinách myší infikovaných MAIDS

Normálním zdrojem cyklooxygenázové aktivity produkující PEG₂ je konstitutivně exprimovaná COX-1. U myší infikovaných MAIDS však nebylo možno nalézt žádné zvýšení hladiny COX-1, které by odpovídalo za zvýšené hladiny PGE₂ (údaje nejsou ukázány). Exprese COX-2 je nor25 málně omezena na procesy probíhající v mozku, na artritickou synoviální tkáň a na místa poranění tkání. COX-2 se nevyskytuje v lymfatických uzlinách nebo v lymfocytech, jak je ukázáno např. pro kontrolní lymfocyty na obr. 8 (horní část). Autoři vynálezu překvapivě zjistili, že nezralé buňky lymfatických uzlin z myší infikovaných MAIDS exprimují vysoké hladiny COX-2 (obr. 8, dolní část). Navíc obsahovaly vysoké hladiny COX-2 pozitivně selektované CD4+ a

CD8+ T-buňky stejně jako B-buňky z lymfatických uzlin myší infikovaných MAIDS. Naopak negativně selektované buňky CD11 b- obsahovaly pouze nízké hladiny COX-2.

Při analýze CD4+ a CD8+ T-buněk a B-buněk (markér B220) z myší infikovaných MAIDS a kontrolních myší průtokovou cytometrií, bylo zřejmé, že markér CD1 lb není normálně exprimo35 ván na buňkách T nebo B. Určitá část CD4+ T-buněk i B-buněk z myší infikovaných MAIDS byla CDI lb pozitivní (bright) (třídění značené RI) a další množství CD4+ T-buněk a B-buněk stejně jako CD8+ T-buněk bylo CDI lb negativní (dim) (třídění značené R2), což ukazuje, že zde došlo k významné, ale nižší expresi CDllb. Subpopulace MAIDS-infikovaných CD4+ a CD8+ T-buněk byly tedy CDllb pozitivní, popř. negativní, zatímco většina B-buněk byla pozitivní.

Jestliže se vezme v úvahu skutečnost, že COX-2 exprimují CDllb+ buňky a nikoli CDllhbuňky, je možno dojít k závěru, že jak B-buňky, tak i T-buňky v lymfatických uzlinách myší infikovaných MAIDS exprimují COX-2.

Při ímunohistochemickém testování intaktních lymfatických uzlin z myší infikovaných MAIDS je zřejmé, že dojde ke změně celkové architektury buněk se ztrátou germinálních center u buněk myší infikovaných MAIDS (týden 19 po infekci) ve srovnání s buňkami kontrolních myší (obr. 10, c proti a). Při vyšším zvětšení preparátů imunologicky barvených na COX-2 je zřejmé, že zatímco lymfatické uzliny z kontrolních zvířat vykazují pouze hnědé zbarvení HRP v pohlceném materiálu v makrofázích (falešně pozitivní „barvitelná“ tělíska, obr. 10b), velký podíl buněk lymfatických uzlin myší infikovaných MAIDS se barví pozitivně na COX-2 (obr. 1 Od).

-27CZ 302448 B6

Tabulka 6

Myši	Médium	Indomethacin	Anti-CD3	Indomethacin/ Anti-CD3
1	1304	1 412	6 245	9 381
2	1082	1 129	8 019	47 926
3	209	265	918	1 345
4	236	335	8 938	11 579
5	4 715	4 317	6 591	8 545
6	1 799	ND	2 932	ND
7	3 051	ND	7 436	ND
8	1 668	ND	3 594	19 624
9	839	2 363	7 885	31 830
10	3 413	7 316	8 777	42 244
Medián	1 486	1 412	7 013	15 601**
(25. - 75. percentily)	(839 - 3 051) n = 10	(335 -4 317) n = 7	(3 594 - 8 019) n = 10	(8 963 - 37 037) n - 8

Indomethacin (Indo) proti kontrolám; ** znamená p <0,01

Příklad 3

U pacientů infikovaných HIV dochází jen k okrajovým účinkům, jestliže jsou léčeni neselektivním inhibitorem COX in vivo ío

Metody

Negativní selekce CD3+ T-buněk periferní krve pacientu s HIV

I5 CD3+ T-buňky periferní krve byly čištěny negativní selekcí z povlaku sražených leukocytů normálních zdravých dárců (Ullevaal University Hospital Blood Center, Oslo, Norsko). Ve stručnosti, mononukleární buňky periferní krve byly izolovány v hustotním gradientu (Lymphopre, NycoMed, Oslo, Norsko) a po centrifugaci následovala negativní selekce použitím monodisperzních magnetických kuliček přímo potažených protilátkami proti CD14 a CD19 a kuliček s krysí protilátkou proti myšímu IgG potažených protilátkami proti CD56 a magnetu. Magnetické kuličky byly všechny od firmy Dynal (Oslo, Norsko, kat. č. 111.12, 111.04 a 110.11), zatímco protilátka proti CD56 byla od firmy Pharmingen San Diego, CA, kat. č. 3166O.d). Všechny kroky byly prováděny při 4 °C. Buněčné suspenze byly analyzovány průtokovou cytometrií a bylo ukázáno, že obsahují více než 90 % CD3+ buněk.

-28CZ 302448 Β6

Testy proliferace použitím T-buněk pacientů s HIV

Testy proliferace byly prováděny inkubací 0,75 x 10^ó CD3+ T-buněk/ml ve 100 μΐ objemu v 96jamkových mikrotitračních destičkách s plochým dnem. Aktivace bylo dosaženo následným přidáním monodisperzních magnetických kuliček potažených ovčí protilátkou proti myšímu IgG (Dynal, kat. č. 110.02) při poměru buňky : kuličky 1:1a následně přidáním protilátky anti-CD3 (klon SpvT₃b) na konečné ředění 1 : 125 000 pro ukázané experimenty. Optimální koncentrace protilátky byla opatrně titrována při počátečním nastavení a vždy byly prováděny paralelní experimenty při několika různých ředěních protilátky. Proliferace byla analyzována inkubací buněk 72 hod, přičemž na posledních 16 h byl přidán [³H]-thymidin. Buňky byly promyty a sklizeny na skleněných filtrech a potom analyzovány počítáním β-scintilace. Analogy cAMP, pokud byly použity, byly přidány 30 min před aktivací ve formě přidání protilátek anti-CD3. 8-CPT-cAMP byl od firmy Sigma (St. Louis, MO).

Experimentální Část

Nadcházející fáze II klinických experimentů je testování imunostimulačního účinku krátkodobého léčení neselektivním inhibitorem COX (indomethacin) na náhražkových parametrech na T-buňkách pacientů infikovaných HIV. Podle schváleného protokolu dostávali pacienti 50 mg indomethacinu 3 x denně (celková dávka 150mg/den) po dobu 2 týdnů s odebíráním vzorků v den 0, den 14 a den 28 (2 týdny po přerušení podávání). V důsledku nepříznivých jevů jako je bolest v nadbřišku a dyspepsie a přerušení studie u původních pacientů, musela být tato dávka snížena z 5 na 25 mg indomethacinu 3 x za den (celková dávka 75 mg/den). Obr. 11 ukazuje imunitní funkci T-buněk (měřenou jako proliferace po aktivaci) u tří pacientů (pacient 1 až pacient 3), kteří dosud ukončili studii. Homí část ukazuje úrovně proliferace po aktivaci T-buněk na začátku (0 dnů), při ukončení podávání indomethacinu (14 dnů) a 2 týdny potom (28 dnů). Jak je vidět, u pacientů 1 a 2 nedošlo ke zvýšení imunitní funkce podáváním neselektivního antagonisty COX in vivo. U pacienta 3 však došlo ke zvýšení odpovědí T-buněk přibližně 2,5 krát, které přetrvávalo až dva týdny po přerušení podávání indomethacinu. Dolní část obr. 11b ukazuje proliferaci T-buněk po inkubaci s antagonistou cAMP selektivním pro ΡΚΑ-Ϊ, R.p-8-Br-cAMPS in vitro, v buněčných kulturách. Stupeň dysfunkce T-buněk zprostředkovaný cAMP je zřejmý z navrácení proliferace dosažené působením antagonisty (srovnej homí a dolní část; přibližně dvojnásobné zvýšení proliferace u pacientů 1 a 3 ve všech časech, žádný efekt u pacienta 2). Z obr. 11 je zřejmé, že indomethacin neměl uspokojivý efekt, což je možno připisovat nedostatečné selektivitě vůči COX-2 stejně jako omezeným dávkám v důsledku nepříznivých vedlejších účinků.

Příklad 4

U pacientů s HIV dochází jen k okrajovým účinkům po podání neselektivního inhibitoru COX in vivo (pokračováni experimentů z přikladu 3)

Metody

Bylo použito stejných metod jako v příkladu 3.

Experimentální část

Výsledky pro 7 pacientů v nastupující fázi II klinického experimentu (pokračování příkladu 3), kteří dostávali indomethacin 25 mg 3 x denně perorálně 14 dnů navíc k troj kombinační terapii, jsou ukázány na obr. 12. Pacienti 1 až 3 odpovídají pacientům popsaným v příkladu 3. Při podávání indomethacinu se vyskytují stejné nepříznivé účinky jako bylo popsáno výše (příklad 3), které omezují dávku na 25 mg 3 x denně. Pri této přípustné dávce jsou účinky tohoto neselektiv-29CZ 302448 Β6 ního inhibitoru COX pouze okrajové. Po 14 dnech léčení došlo pouze u dvou ze sedmi pacientů kjasnému zvýšení imunitní funkce T-buněk měřené jako proliferace po aktivaci T-buněk, zatímco u jednoho pacienta imunitní funkce poklesla a u čtyř pacientů nastaly menší změny. Dva týdny po přerušení podávání indomethacinu byly u pěti ze sedmi pacientů zvýšené imunitní odezvy ve srovnání s dnem 0. Pouze u dvou pacientů však došlo k více než dvojnásobnému zvýšení proliferace T-buněk.

Příklad 5

Inhibitory COX-2 zlepšují imunitní funkci T-buněk infikovaných MA1DS in vitro

Metody

Metody použité při testech proliferace byly stejné jako bylo popsáno v příkladu 1. Test PGE₂ byl popsán v příkladu 1.

Experimentální část Test proliferace

Smíšené buňky lymfatických uzlin byly izolovány z myší infikovaných MAIDS 17 týdnů po infekci. Buňky byly aktivovány protilátkami anti-CD3 pro indukcí proliferace T-buněk a po 72 hodinách byla zjišťována inkorporace [³H]-thymidinu jako měřítko imunitní funkce. Proliferace buněk myší infikovaných MAIDS byla opět pouze 5 až 20 % proliferace T-buněk neiníikovaných kontrol (2000 až 12 000 cpm v buňkách infikovaných MAIDS proti střední hodnotě 55 000 cpm v buňkách neinfikovaných myší). Jestliže však byl ke kulturám přidán rofekoxib (obr. 13) nebo celekoxib (obr. 14), došlo ke zvýšení proliferace buněk myší infikovaných MAIDS 2 až 3 x v závislosti na koncentraci. Naopak působení na kontrolní kultury neinfikovaných myší látkami rofekoxib nebo celekoxib nezvýšilo proliferaci (0,8 až 1,0-násobné zvýšení v přítomnosti inhibitorů COX-2, tj. žádné zvýšení, není ukázáno). V T-buňkách myší infikovaných MAIDS byla koncentrace rofekoxib a celekoxíbu, která způsobila polovinu maximálního účinku (ED50) přibližně 0,01 μΜ pro rofekoxib a 0,03 μΜ pro celekoxib. Skutečnost, že účinné jsou submikromolámí koncentrace jasně ukazuje, že pozorované zvýšení imunitní odpovědi je zprostředkováno ínhibici COX-2 a nikoli COX-1, která je inhibována pouze při mikromolámích koncentracích rofekoxibu a celekoxibu (hodnoty z Warner a další, 1999, PNAS USA, 96, str. 7563 až 7568). Obnovení imunitní funkce inhibovaných T-buněk rofekoxibem a celekoxibem tedy vede ke snížené produkci PGE₂ ve směsných kulturách a tím snížení hladin cAMP v T-buňkách v důsledku inhibice COX-2.

Produkce PGE₂

Byl také analyzován vliv inhibitorů COX-2 rofekoxibu a celekoxibu na hladiny PGE₂. Jak je vidět z obr. 15, nezralé buňky lymfatických uzlin myší infikovaných MAIDS sekrenovaly 5 až 6 x více PGE₂ než buňky lymfatických uzlin zdravých myší (viz také obr. 6). Hladiny PGE₂ jako odpověď na LPS dále stouply u infikovaných myší 8 až 10 x ve srovnání s přibližně dvojnásobným zvýšením u neinfikovaných myší. Jestliže byly buňky inkubovány v přítomnosti inhibitorů COX2 rofekoxibu nebo celekoxibu, sekrece PGE₂ buňkami lymfatických uzlin infikovanými MAIDS byla podobná jako sekrece ne infikovaným i buňkami. Vliv indomethacinu (srovnej proliferaci v obr. 7) je zařazen jako kontrola.

Příklad 6

Inhibitor COX-2 zlepšuje imunitní funkci T-buněk infikovaných MAIDS in vivo

-30CZ 302448 B6

Metody a experimentální část

Infikované myši (17 týdnů po infekci) byly ošetřovány jeden týden per os (tj. orálně) dávkou rofekoxibu odpovídající doporučené dávce pro použití u lidí (v úvahu se přitom bere sedm inásobně vyšší vylučování u hlodavců). U myší infikovaných MAIDS se normálně vyvíjí imunoproliferační syndrom se zvětšenými lymfatickými uzlinami a slezinou. V souladu s tímto zjištěním měla neléčená neinfikovaná zvířata průměrnou hmotnost sleziny 1,3 g a průměrnou hmotnost spojených lymfatických uzlin 1,7 g. Naopak myši infikované MAIDS, které dostávaly rofeio koxib 7 dnů, měly průměrné hmotnosti sleziny 0,8 g a průměrnou hmotnost spojených lymfatických uzlin 0,3 g, což ukazuje na obnovení lymfoproliferace.

Výsledky jsou ukázány na obr. 16. Když byla imunitní funkce T-buněk hodnocena v nezralých (crude) buňkách lymfatických uzlin z infikovaných ošetřovaných a neošetřovaných myší, bylo zřejmé, že zatímco u neléěených infikovaných zvířat byla proliferace indukovaná anti-CD3 v rozmezí 2000 až 10 000 cpm (průměr 7300 cpm), infikované myši léčené rofekoxibem jeden týden měly odpovědi T-buněk na anti-CD3 zvýšené 2,7 až 5,6 násobně ve srovnání s infikovanými neléčenými myšmi. Navíc jestliže se u infikovaných neléěených myší projevila zvýšená proliferace T-buněk indukovaná anti-CD3 v přítomnosti Rp-8-Br-cAMPS, toto 2 až 3 násobné zvýšení se ztratilo u myší léčených rofekoxibem, což ukazuje, že léčení rofekoxibem in vivo snížilo hladiny PGE? a zastavilo inhibici funkce T-buněk prostřednictvím cAMP.

Příklad 7

Ošetřování myší s MAIDS in vivo rofekoxibem nebo celekoxibem zvyšuje odpovědi T-buněk na anti-CD3 a imunitní odpovědi

Metody a experimentální část

Infikované myši byly léčeny rofekoxibem a celekoxibem v dávkách odpovídajících doporučené dávce pro použití u člověka (v úvahu se bere sedminásobné vylučování u hlodavců, 3, popř. 20 mg/kg/den). Parenterální podávání se provádělo intraperitoneální injekcí inhibitorů COX-2 formulovaných v intralipidu. Výsledky jsou ukázány na obr. 17.

Při hodnocení imunitní funkce T-buněk v nezralých buňkách lymfatických uzlin z infikovaných léčených a neléěených myší po 18 až 20 dnech infekce bylo zřejmé, že zatímco ne léčené infikované myši měly proliferaci indukovanou anti-CD3 v oblasti 10 000 cpm, infikované myši léčené rofekoxibem 18 až 20 dnů měly odpovědi T-buněk na anti-CD3 přibližně dvojnásobně zvýšené ve srovnání s infikovanými, neléčenými myšmi. Podobně celekoxib zvyšoval imunitní odpovědi u buněk většiny skupin léčených myší na přibližně trojnásobek ve srovnání s neléčenými, neinfikovanými myšmi.

Příklad 8

Léčení in vivo myší infikovaných MAIDS meloxikamem zvyšuje imunitní funkci T-buněk

Metody a experimentální část

Infikované a zdravé myši byly léčeny dávkou 2,8 mg/kg/den meloxikamu, což odpovídá doporučené dávce pro použití u lidí, přičemž se bere v úvahu sedminásobné vyšší vylučování u hlodavců. Parenterální podávání se provádělo subkutánní implantací osmotických pump naplněných ve vodě rozpustnou injekční sloučeninou meloxikamu. Funkce T-buněk byla hodnocena za získání výsledků ukázaných v obr. 18.

-31 CZ 302448 B6

Při hodnocení imunitní funkce T-buněk v nezralých buňkách lymfatických uzlin léčených a kontrolních (podáváno PBS) infikovaných myší po dvou týdnech léčení bylo zřejmé, že zatímco infikované myši léčené PBS měly proliferaci indukovanou anti-CD3 v oblasti 500 cpm, infikované myši léčené meloxikamem po dobu 14 dnů měly imunitní odpovědi T-buněk na anti-CD3 podstatně zvýšené ve srovnání s infikovanými myšmi, které dostávaly pouze PBS (obr. 18a, více než desetinásobné zvýšení; p <0,05). Jestliže byl meloxikam přidán zpět k buněčným kulturám v průběhu tri dnů proliferační ho testu T-buněk in vitro pro zabránění přerušení inhibice meloxikamem in vivo a tím reaktivace COX-2, imunitní odpověď ve skupině léčené meloxikamem byla dvojnásobně vyšší než bez přídavku meloxikamu in vitro (p - 0,005) a ve srovnání s imunitní odpovědí myší infikovaných MAIDS, které dostávaly PBS in vivo byl účinek opět významný (obr. 18b, p < 0,05).

Naopak pouze u myší, které dostávaly PBS in vivo a nikoli u myší léčených meloxikamem se projevily zvýšené imunitní odpovědi, jestliže byl ke směsným kulturám lymfatických uzlin in vitro stimulovaným anti-CD3 přidáván antagonista cAMP selektivní pro PKA typ 1, Rp-8Br-cAMPS (obr. 18c). Skutečnost, že vliv antagonisty cAMP není u myší infikovaných MAIDS léčených meloxikamem přítomný ukazuje, že léčení meloxikamem in vivo snižuje nebo odstraňuje imunitní nedostatečnost myší infikovaných MAIDS indukovanou cAMP a obnovuje imunitní funkci.

Claims (12)

1. Použití inhibitoru COX-2 obecného vzorce B kde

Y znamená cyklickou skupinu, s výhodou skupinu oxazolyl, isoxazolyl, thienyl, dihydrofuryl, furyl, pyrrolyl, pyrazolyl, thiazolyl, imidazolyl, isothiazolyl, cyklopentenyl, fenyl nebo pyridyl; n je celé číslo od 0 do 3;

m je celé číslo od 0 do 4;

znamená ketocyklylovou, cykloalkylovou nebo arylovou skupinu, která může být popřípadě substituována jednou nebo více skupinami nebo atomy, s výhodou jedním nebo více atomy halogenu;

R₇ každá nezávisle znamená substituent, kterým může být jakákoli funkční skupina, s výhodou atom vodíku nebo atom halogenu, nebo alkylová skupina, která může být substituována jednou nebo více skupinami nebo atomy;

-32CZ 302448 B6

Rs znamená alkylovou skupinu, nebo skupinu NHR_l0;

R9 znamená atom halogenu; a

R₁₀ znamená atom vodíku nebo alkylovou skupinu popřípadě substituovanou jednou nebo více skupinami nebo atomy, s výhodou acylovou skupinou;

nebo jeho derivátu nebo farmaceuticky přijatelné soli, pro výrobu farmaceutického prostředku pro snížení nebo zmírnění dysfunkce T-buněk u člověka s HIV nebo AIDS.

2. Použití podle nároku 1, kde inhibitor COX-2 má poměr selektivity COX-1 : COX-2 >5, s výhodou >50 při měření testem WHMA při IC₈o

3. Použití podle nároku 1 nebo 2, kde Rg je NH₂ nebo -CH₃.

4. Použití podle kteréhokoli z nároků 1 až 3, kde Y je skupina pyrazolyl, furyl nebo thienyl.

5. Použití podle kteréhokoli z nároků 1 až 4, kde R^ je arylová skupina popřípadě substituovaná jedním nebo více atomy fluoru.

6. Použití podle kteréhokoli z nároků 1 až 5, kde n je l nebo 2.

7. Použití podle kteréhokoli z nároků 1 až 6, kde R7 je atom bromu, acylová skupina nebo substituovaná alkylová skupina.

8. Použití podle kteréhokoli z nároků 1 až 7, kde inhibitorem COX-2 je celekoxib, rofekoxib, DuP-697, SC-58125, DFU, tricyklický MF, JTE-522, valdekoxib, parakoxib jako sodná sůl, 4(2-oxo-3-fenyl-2,3-dihydrooxazoM—yl)-benzensulfonamid nebo etorikoxib.

9. Použití podle nároku 8, kde inhibitorem COX-2 je rofekoxib.

10. Použití podle nároku 8, kde inhibitorem COX-2 je celekoxib.

11. Použití farmaceutického prostředku obsahujícího inhibitor COX-2 nebo jeho derivát nebo farmaceuticky přijatelnou sůl, podle kteréhokoli z nároků 1 až 10, a farmaceuticky přijatelné ředivo, nosič nebo pomocnou látku, pro výrobu farmaceutického prostředku pro snížení nebo zmírnění dysfunkce T-buněk u člověka s HIV nebo AIDS.

12. Použití podle nároku 11, kde uvedený prostředek navíc obsahuje jeden nebo více dalších inhibitorů COX-2, jejich derivátů nebo farmaceuticky přijatelných solí a/nebo jednu nebo více dalších účinných složek.