CN100488500C - Cox-2抑制剂预防免疫缺陷的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种治疗或预防特征在于免疫缺陷的疾病(如HIV)的方法，其中对患者施用一种COX-2抑制剂或其衍生物或药学可接受的盐，优选的是异氟磷、L-745337、罗非考昔、NS 398、SC58125、依托度酸、美洛昔康、赛乐考昔、flusolide或尼美舒利，和含有它们的组合物和产品，或它们在生产药物及治疗中的用途。

Description

COX-2抑制剂预防免疫缺陷的用途
本发明属于免疫缺陷和病毒感染治疗领域。更具体而言，本发明涉及环加氧酶-2(COX-2)抑制剂或其衍生物在免疫缺陷和病毒病(特别是HIV感染和AIDS及相关疾病)治疗的免疫调节中的用途。
前列腺素在炎症过程中起重要作用，前列腺素形成的抑制是研制抗炎药的常见靶标。非类固醇类抗炎药(NSAID’s)抑制环加氧酶(COX)，COX是参与由花生四烯酸生物合成前列腺素中间体的一种酶。有几种NSAID’s已用于临床，包括如吲哚美辛、吡罗昔康、替诺昔康、二氯芬酸、美洛昔康、替尼达帕、伊索昔康、乙酰水杨酸、二氟尼柳、舒林酸、布洛芬、萘普生和酮洛芬等药物。
NSAID’s是当前世界上最广泛使用的药物之一。
这些NSAID’s是临床上有效的药物，它们具有解热、抗炎和抗血栓作用。这类药物的主要适应证是关节炎，包括骨关节炎和类风湿性关节炎，肌肉骨胳痛和全身疼痛。然而，这些药物具有严重的副作用。最常见的副作用是胃肠溃疡和出血、血小板凝集抑制和与其它药物相互作用。
二十世纪九十年代初，克隆了该酶的第二种COX同工型。这种新的COX同工型现在被称为COX-2(Vane等人，1998，Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.，38，97-120)。
现在COX有两种众所周知的同工型：COX-1和COX-2(最近也推测存在COX-3)。COX-1存在于大多数组织中，可以视为看家酶。例如，COX-1酶活性保护胃肠道的内层。然而，COX-2通常不存在，但在炎症期间增多。NSAID’s的几种副作用与COX-1酶的抑制有关。NSAID’s抑制COX-1和COX-2(见表1-3)。
表1：不同NSAID’s在豚鼠巨噬细胞模型上的IC50值和COX-2/COX-1比(IC50值来自Engelhart等人，J.Inflammatory Res.，44，422-43，1995)
 
NSAID’s COX-2 IC<sub>50</sub>(μmol/升) COX-1 IC<sub>50</sub>(μmol/升) COX-2选择性COX-1/COX-2
美洛昔康 0.0019 0.00577 3
二氯芬酸 0.0019 0.000855 0.45
吡罗昔康 0.175 0.00527 0.030
替诺昔康 0.322 0.201 0.6
吲哚美辛 0.00636 0.00021 0.03
teridep 47.8 0.393 0.008
表2：完整细胞中NSAID’s对COX-1(牛内皮细胞)和COX-2(刺激的巨噬细胞)的IC50值(IC50值来自Taketo，J.NationalCancer Institute，90，1529-1536，1998)
 
NSAID’s COX-2 IC<sub>50</sub>(μmol/升) COX-1 IC<sub>50</sub>(μmol/升) COX-2选择性COX-1/COX-2
阿司匹林 50 0.3 0.006
吲哚美辛 0.6 0.01 0.02
托芬那酸 0.005 0.0003 0.06
布洛芬 15 1 0.07
对乙酰氨基酚 20 2.7 0.1
水杨酸钠 100 35 0.35
BW 755C 1.2 0.65 0.5
氟比洛芬 0.025 0.02 0.8
卡洛芬 3 3 1
二氯芬酸 0.35 0.5 1.4
萘普生 1.3 2.2 1.7
BF 389 0.03 0.15 5
表3：重组人PGH合成(COX-1和COX-2)的抑制(IC50值来自Laneuvill等人，J.Pharm.Exp.Ther.，271，927-34，1994)
 
NSAID’s COX-2 IC<sub>50</sub>(μmol/升) COX-1 IC<sub>50</sub>(μmol/升) COX-2选择性COX-1/COX-2
吲哚美辛 >1000 13.5 <0.01
亚硫酸舒林酸 50.7 1.3 0.03
吡罗昔康 >500 17.7 0.04
二氯芬酸 20.5 2.7 0.13
氟比洛芬 3.2 0.5 0.16
甲氯芬那酸 9.7 1.5 0.15
布他酮 >100 16.0 <0.16
萘普生 28.4 4.8 0.17
布洛芬 12.5 4.0 0.3
酮咯酸氨丁三醇 60.5 31.5 0.5
DHA(22:6) 41 25.6 0.6
6-MNA 93.5 64.0 0.7
依托度酸 60 74.4 1.2
水杨酸 >1000 >1000 -1
最近十年来，已经确定了几种新的选择性COX-2抑制剂和所谓的“优选”COX-2抑制剂。其中几种COX-2抑制剂已经研制，少数最近已经进入市场。在这些新COX-2抑制剂中，有一些在临床剂量时不显示抑制COX-1。对这些COX-2抑制剂的用途的广泛临床研究和临床实践表明，与非选择性NSAID’s相比，这些新COX-2抑制剂在安全性上有很大优势。COX-2抑制剂的综述参见，例如：Golden等人，1999，Osteoarthritis.25，p359-379，Mitchel等人，1999，Brit.J.Pharmacol.，128，p1121-1132，Lipsky，1999，Am.J.Med.，106(5B)，p515-575，Taketo，1998，J.National Cancer Inst.，90，p1529-1537，Griswold等人，1996，Med.Res.Rev.，16，pl81-206，Reitz等人，1995，Ann.Rep.Med.Chem.，30，p179-188。
关于不同COX-2抑制剂的其它文献包括，例如：Lane，1997，J.Rheumatol.，24(suppl.45)，p20-24，Mehlish等人，1998，Clin.Pharmacol.Ther.，63，p1-8，Zhao等人，1997，Arthritis Rheum.，40(suppl.)，S88，Ehrich等人，1997，Arthritis Rheum.，40(Suppl.)S93，Maziasz等人，1997，Arthritis Rheum.，40(suppl.)，S195，Mengle-Gaw等人，1997，Arthritis Rheum.，40(suppl.)，S93，Morrison，1999，Clin.Ther.，21，p943-953，Chan等人，1995，J.Pharmacol.Exp.Ther.，274，p1531-37，Riendeau等人，1997，Br.J.Pharmacol.，121，p105-117，Black等人，1999，J.Med.Chem.，42，p1274-81，Cuo等人，1996，J.Biol.Chem.，271，p19134-39，Geiss，1999，Scand.J.Rheumatol.，109(suppl.)，p31-37，Warner等人，1999，PNAS USA，96，p7563-68，Bjarnson等人，1997，Scand.J.Gastroenterol.，32，p126-130，Danneberg等人，1999，Semin.Oncol.，26，p499-504，Mitchell等人，1993，PNAS USA，90，p11693-97，Futaki等人，1994，Prostaglandins，47，p55-9，Futaki等人，1993，J.Pharm.Pharmacol.，45，p753-5，Masferrer等人，1954，PNAS USA，91，p3228-32，Klein等人，1994，Biochem.Pharmacol.，48，p1605-10，Reitz等人，1994，J.Med.Chem.，37，p3878-81，Seibert等人，1994，PNAS USA，91，p12013-17，Klein等人，1996，Biochem.Pharmacol.，51，p285-90，Nantal等人，1998，第九届国际炎症研究协会会议，11月1-5日，Pennig等人，1997，J.Med.Chem.，40，p1347-65，Puig等人，2000，J.Med.Chem.，43，p214-223。
根据化学结构，COX-2抑制剂是相对多样化的一组化合物。选择性抑制COX-2的化合物在近十年的许多专利文献中有描述。包括：WO 94/26781，WO 94/20480，WO 94/13635，WO 95/00501，WO 94/27980，WO 94/15932，WO 95/21817，WO 95/15316，WO96/06840，WO 96/03388，WO 96/03387，WO 96/03392，WO96/25405，WO 96/24584，WO 96/03385，WO 96/16934，WO98/41516，WO 98/43966，WO 99/12930，EPO 673 366，WO98/41511，WO 98/47871，WO 99/20110，WO 99/23087，WO99/14194，WO 99/14195，WO 99/15513和WO 99/15503，以及美国专利号5,380,738、5,344,991、5,393,790、5,434,178、5,474,995、5,475,018和5,510,368。
现在研制了两种化合物，罗非考昔(rofecoxib)(4-(4-甲磺酰)苯基)-3-苯基-2(5H)-呋喃酮)(I)，为
Figure C01814319D00091
和赛乐考昔(celecoxib)(4-(5-(4-甲苯基)-3-(三氟甲基)-1H-吡唑-l-基)-苯磺酰胺)(II)，为
Figure C01814319D00092
罗非考昔在加拿大Merck Frosst的WO 93/0500501中有述，在Morrison，1999，Clin.Ther.，21，p943-953，Chan等人，1995，J.Pharmacol.Exp.Ther.，274，p1531-37和Nantel等人，1998，同上中也有描述。
赛乐考昔在Geiss，1999，Scand.J.Rheumatol.，109(suppl.)，p31-37和Penning等人，1997，J.Med.Chem.，40，p1347-65中有描述。据描述，赛乐考昔对COX-2的选择性比对COX-1高375倍。
其它几种COX-2抑制剂已在生物系统中进行了评价，包括BF389(III)、CGP 28232(IV)、DFP、DFU(V)、DuP 697(VI)、依托度酸(VII)、FK3311(VIII)、flosulide(IX)、L-745,337(X)、美洛昔康(
Figure C01814319D0009112713QIETU
，US 4233299，4-羟基-2-甲基-N-(5-甲基-2-噻唑基)-1，1-二氧化物-2H-1，2-苯并噻嗪-3-咪唑羧酰胺)(XI)、MF三环(XII)、尼美舒利(XIII)、NS-398(XIV)和SC-58125(XV)：
Figure C01814319D00101
Figure C01814319D00111
描述的其它COX-2抑制化合物包括：S-2474(来自Shionogi，EP595546，5(E)-(3，5-二叔丁基-4-羟基)苯亚甲基-2-乙基-1，2-异噻唑烷-1，1-二氧化物)(XVI)、JTE-522或RWK-57504(4-(4-环己基-2-甲基-5-噁唑基)-2-氟苯磺酰胺)(XVII)、Darbufelone甲磺酸盐(Pfizer，WO 94/03448，2-氨基-5-((3，5-二(1，1-二甲基乙基)-4-羟苯基)亚甲基-4(5H)-噻唑酮的一甲磺酸盐)(XVIII)、6089(来自Kotobuki Pharmaceutical)(XIX)、Valdecoxib(Pharmacia，4-(5-甲基-3-苯基-4-异噁唑基)-苯磺酰胺)(XX)、Paracoxib钠(Pharmacia，N-((4-(5-甲基-3-苯基-4-异噁唑基)-苯基)磺酰基)-丙酰胺的钠盐)(XXI)、4-(2-氧-3-苯基-2，3-二氢噁唑-4-基)-苯磺酰胺(Almirall-Prodespharma)(XXII)和Etoricoxib(MK-633，Merck and Co.)：
Figure C01814319D00121
Figure C01814319D00131
上述化合物组成了在下文所述方法中使用的优选COX-2抑制剂。
COX-2抑制剂的适应症是关节炎、肌肉骨骼痛和全身疼痛，这些疾病可用经典NSAIDs治疗，如吲哚美辛、二氯芬酸和萘普生。最近，也有人建议在癌症治疗中使用COX-2抑制剂，也许可以预防癌症。COX-2抑制剂也有可能用于阿尔茨海默病和与痴呆有关的其它脑病。
COX-2抑制剂的临床应用的可能性在下列文献中讨论，例如：Nature，367，p215-216(1994)，Drug NeWs and Perspectives，7，p501-512(1994)，Annual Reports in Medicinal Chem.，30，p179-188(1995)，Oncogene，18，p7908-7916(1999)。
关于COX-2抑制剂在抗病毒治疗，或更具体而言，在HIV/AIDS治疗上的用途，没有特别的建议，也没有检测COX-2抑制剂的抗-HIV作用。此外，对于在病毒或非病毒引起的免疫缺陷的治疗中使用COX-2抑制剂(或非选择性COX抑制剂)作为免疫刺激剂也没有建议。
HIV感染和AIDS是一个重要的健康问题，全世界有超过3.3千万人感染该病毒。大多数感染者位于非洲(亚撒哈拉)和亚洲的部分地区。现在常规临床使用的有两类抗-AIDS化合物：HIV逆转录酶抑制剂和HIV蛋白酶抑制剂。HIV逆转录酶抑制剂可分为非核苷逆转录酶抑制剂(NNRTIs)和核苷逆转录酶抑制剂(NRTIs)。
最常用的NNRTI’s有奈韦拉平、地拉夫定、efavirenz、emivirine和T180。最常用的NRTI’s包括齐多夫定、地丹诺辛、司他夫定和扎西他宾。临床上使用的HIV蛋白酶抑制剂包括inclinavir、palinavir和沙喹那韦。
当前对HIV感染和AIDS的治疗基于几种药物的联用，即所谓的逆转录酶抑制剂和蛋白酶抑制剂的混合物(鸡尾酒)。这些组合称为HAART(高活性抗逆转录病毒治疗)，非常有效，能使患者血液中的病毒降至不可检测的水平。然而，HAART不能治愈患者，因为病毒仍然存在于免疫细胞中，疾病在任何时候都有可能复发；治疗中断后通常出现病毒血症峰，快速发展为AIDS。此外，在HAART期间仍然具有免疫缺陷和HIV特异的T细胞功能障碍。这种治疗需要终生治疗，而且极其昂贵。仅药物花费通常就超过15000美元。另外，该治疗还有其它几个问题：患者适应困难(复杂的药物方案)、耐药性病毒的发展、不理想的药代动力学和副作用，如骨髓抑制和长期代谢影响。
最近发表的关于抗-HIV治疗的综述有，例如：Hilgegroth，1998，Pharm.Uns.Zeit.，1998，27，p22-25，Hilgegroth，1998，Pharm.Uns.Zeit.，1998，7，p111-116，Stellbrink，1997，Dk Arztebl.，94，p2497-2503，Rettle等人，1998，Int.J.STD AIDS，9，p80-87，De-Clercq，1998，Antiviral Res.，38，p153-179，Gait等人，1995，TIBTECH，13，p430-438和Redshaw等人，《新出现的药物：改良药物展望》，第6章，p127-154，1997。
总之，尽管多种药物联用如HAART能明显改善HIV感染患者的预后，但HIV的抗病毒治疗在医学上仍需要新的化合物，特别是可刺激免疫系统的药物。本发明即满足了这一需要。
COX-2的表达通常只限于脑/脑过程、关节滑液和组织损伤部位。COX-2在正常淋巴结或淋巴细胞中未发现。但是现在惊奇地发现，在患免疫缺陷病MAIDs的小鼠中，淋巴结细胞表达高水平的COX-2。此外，从MAIDS淋巴结正选择的CD4+和CD8+T细胞以及B细胞也含有高水平的COX-2(见实施例2)。有人发现，这种COX-2可用来缓解免疫缺陷病的症状，例如，作为免疫刺激剂，例如通过产生抗原特异的免疫应答，来缓解T细胞功能障碍。
不受理论束缚，可以认为COX-2活性提高了PGE2的产量，从而提高了cAMP的水平，cAMP激活PKA信号传导途径，使淋巴细胞功能遭受损害。对MAIDs小鼠进行的体内研究表明，COX-2抑制剂提高了T细胞的免疫功能(见实施例6)。
本发明提供了一种治疗或预防免疫缺陷的新方法，特别是用于治疗HIV和AIDS，包括用治疗有效量的COX-2抑制剂或其衍生物或药学可接受的盐治疗患者。
因此，第一方面，本发明提供一种方法，用于治疗或预防人类或非人类动物中特征在于COX-2活性升高的疾病，如特征在于免疫功能降低的疾病(例如通过提高COX-2表达)，其中对该动物施以治疗有效量的COX-2抑制剂或其衍生物或药学可接受的盐。
在此使用时，COX-2活性提高是指由于产生更多的COX-2分子(例如提高表达)和/或更具活性的分子(例如从潜伏形式转化为活性形式或解除对活性形式的抑制)活性水平提高。优选地，该疾病的特征在于免疫功能降低，即，是一种免疫缺陷病，例如，显示淋巴细胞功能障碍。在此使用时，“免疫缺陷”是指参与正常免疫应答的细胞(特别是B细胞和T细胞)功能受损。因而此处所述的化合物可用来实现免疫刺激作用，以提高免疫应答。COX-2抑制剂被认为具有免疫调节作用。优选地，可以治疗的疾病包括病毒诱导的免疫缺陷病。
因此，上述方法可用于但不限于HIV或AIDS相关疾病的治疗。例如，约50％的多种常见免疫缺陷病患者具有类似于HIV感染的功能障碍，能从免疫刺激治疗获益。根据本发明，可以对需要HIV/AIDS治疗的患者施用任一种COX-2抑制剂。根据本发明治疗的优选疾病包括逆转录病毒感染，特别是HIV感染(和其它动物的相关病毒感染，例如SIV、FIV、MAIDS)和AIDS，以及多种常见免疫缺陷和与上述疾病有关的疾病的治疗。
可以治疗的患者优选地是哺乳动物，优选地是人和宠物或农畜，如狗、猫、猴、马、绵羊、山羊、母牛、兔、大鼠和小鼠。
此外，本发明还提供用于治疗或预防如上所述特征在于COX-2活性升高的疾病的COX-2抑制剂或其衍生物或药学可接受的盐，或COX-2抑制剂或其衍生物或药学可接受的盐在生产用于治疗或预防如上所述特征在于COX-2活性升高的疾病的药物中的用途。在此使用时，“治疗”是指该疾病的一种或多种症状(如传染性)减轻或缓解，优选地达到正常水平，或免疫功能障碍减轻或缓解。“预防”是指绝对防止，即无可检测的病原体，例如病毒，和/或特定症状(例如COX-2活性)保持正常水平，或症状出现的程度或时间降低或缓解(例如延迟)。
环加氧酶2是HIV/AIDS治疗的一种新靶标。术语“COX-2抑制剂”是指以特定浓度施用时能抑制环加氧酶2而不明显抑制环加氧酶1的化合物。优选地包括对环加氧酶2抑制的选择性比对环加氧酶1抑制的选择性(例如，按照WHMA试验，根据COX-1:COX-2IC80比确定，见下文)至少高10倍、更优选地至少高50倍、更优选地至少高100倍的化合物。(一种特定化合物的选择性比可随生物学测定和表达形式(优选地表示为COX-1:COX-2 IC50或IC80比)而不同，见表1-4。)此处所述比率是指在一次或多次相关的、众所周知的COX测定中，优选地使用纯化的人类酶所获得的数据，例如，根据Engelhart等人，1995，同上文测定的IC50值之比。然而，优选地采用如下所述的WHMA试验。
对COX-1和COX-2相对效能的大量分析使用多种测定系统进行，从分离的纯化酶到完整的细胞和来自不同种的细胞模型。然而，目前最广泛接受的模型是人全血测定(WBA)和改良WilliamHarvey人改良全血测定(WHMA)，这是优选的测定方法。这些测定法利用易于获得的人细胞测试哪一种化合物更适于人用。也考虑NSAIDs与血浆蛋白的结合。此外，当COX-2和COX-1抑制的浓度曲线不平行，并且大多数化合物以产生接近80％抑制的稳态血浆浓度的剂量使用时，优选地以IC80而不是IC50进行选择性测定(Warner等人，1999，PNAS USA，96，p7563-7568)。
在WBA测定中，对于COX-1分析，血液用待测试剂处理，60分钟后用钙离子载体处理，温育30分钟，之后收集血浆。对于COX-2分析，血液用阿司匹林处理以抑制COX-1，6小时后用脂多糖和待测试剂处理，温育18小时，之后收集血浆。随后，通过放射免疫测定估计血浆中的血栓烷B2浓度，作为COX活性的量度。
在WHMA测定中，COX-1分析如上进行。对于COX-2分析，血液用条件培养基(来自暴露于白介素1β 24小时的人气管上皮细胞(A549)的培养物)处理，与该培养基及待测试剂一起温育60分钟，之后加入钙离子载体，30分钟后加入二氯芬酸终止prosanoid的产生。之后收集血浆，通过放射免疫测定分析血浆中前列腺素E2的含量，作为COX-2活性的量度。在后一种测定中，COX-1和COX-2活性测定的温育时间类似，这使得活性更易于比较，使WHMA成为优选的测定方法。
采用该测定法，基于IC80下COX-2/WHMA-COX-1的选择性示于表4中，其中0.2和0.02分别代表5倍和50倍的COX-2选择性。
表4：根据WHMA试验，IC80下的COX-2/COX-1比，来自Warner等人，同上文：
 
化合物 IC<sub>80</sub>的COX-2/WHMA-COX-1比
异氟磷 <0.01
L-745337 <0.01
罗非考昔 0.015
NS398 <0.05
SC58125 <0.01(WBA测定)
依托度酸 0.043
美洛昔康 0.091
赛乐考昔 0.11
尼美舒利 0.17
因此，一个优选特征在于，根据IC80的WHMA试验测定选择性比，在本发明的方法中特别优选使用COX-2:COX-1选择性比小于0.2、优选地小于0.05、例如小于0.02、优选地小于0.01、例如<0.005的化合物。换言之，优选化合物的COX-1:COX-2选择性比(根据IC80的WHMA测定)大于2，优选地大于5，特别优选地大于50或100，如前所述。
“抑制”在此是指可测得的环加氧酶-2活性降低。这可通过影响转录、翻译、翻译后修饰或COX-2活性实现。然而优选地是通过抑制酶活性，即干扰现有活性COX-2分子的活性部位来实现抑制。
优选地，用于治疗免疫缺陷或病毒感染，特别是HIV感染和AIDS的COX-2抑制剂的COX-2 IC50约小于0.5μ mol/l，更优选地约小于0.2μ mol/l。
此处所述方法涉及COX-2抑制剂或其衍生物在预防和治疗多种疾病，包括免疫缺陷和病毒感染，特别是HIV和AIDS中的用途。
在本发明的一个优选实施方案中，根据本发明的治疗用COX-2抑制剂选自酸性磺胺。
在一个优选实施方案中，本发明使用的COX-2抑制剂选自根据下列通式A的化合物，包括甲磺酰胺醚和硫醚或其衍生物或药学可接受的盐：
其中，
X代表一个氧或硫原子或烷基，优选地是-CH2-基；
R1代表一个环烷基或芳基，它任选地可被一个或多个基团或原子优选地一个或多个卤素原子，如氟取代；
R2、R3、R4和R5独立地代表氢原子、硝基或酰基或烷基，它们任选地可被一个或多个基团(例如酰基)或原子取代，或者R2和R3、R3和R4或R4和R5与间插碳原子一起形成环戊酮基。
优选地，在这些化合物中，X是一个氧原子。在其它优选化合物中，R1是一个芳基或用一个或多个氟原子取代的芳基，或环烷基。
在其它优选化合物中，R2和R3是氢原子，R4是-NO2或-COCH3基团。其它优选化合物包括R2是一个氢原子、R3和R4一起形成环戊酮基的化合物。
特别优选地，本发明使用的通式A的化合物是此处所述称为flosulide、NS-398、尼美舒利、FK 3311和L-745 337的化合物。
在本发明的另一个优选实施方案中，本发明使用的COX-2抑制剂选自二芳基杂环。
可在本发明中用作COX-2抑制剂的二芳基杂环家族的实例包括下列通式B的化合物或其衍生物或药学可接受的盐。
Figure C01814319D00192
其中，
Y代表一个环基，优选地选自噁唑基、异噁唑基、噻吩基、二氢呋喃基、呋喃基、吡咯基、吡唑基、噻唑基、咪唑基、异噻唑基、环戊烯基、苯基或和吡啶基；
n是0-3的整数；
m是0-4的整数；
R6代表酮环基(ketocyclyl)、环烷基或芳基，该基团可任选地被一个或多个基团或原子优选地一个或多个卤素原子，如氟取代；
R7各自独立地代表一种取代基，可以是任一种功能基团，优选地是氢或卤素原子，优选地是氟或溴，或者烷基(优选地-CH3)，烷基可以被一个或多个基团或原子取代，优选地一个或多个氟原子，例如-CF3；
R8代表一个烷基，优选地-CH3或NHR10，优选地-NH2；
R9代表一个卤素原子，优选地氟；和
R10代表一个氢原子或烷基，任选地可被一个或多个基团或原子(优选地酰基)取代。
这类化合物在US 6,025,353中被称为抗血管生成剂，优选取代基和根据本发明的化合物的进一步描述与US 6,025,353相同。
在这些化合物中，优选地R8是-NH2或-CH3。在其它优选化合物中，Y是吡唑基、呋喃基或噻吩基。优选地，R6是一个芳基，任选地用一个或多个氟原子取代。优选地，n是1或2。优选地，R7是一个溴原子、酰基或取代烷基，如-CF3。
本发明使用的特别优选的通式B的化合物是此处所述被称为赛乐考昔、罗非考昔、DuP-697、SC-58125、DFP、DFU、CGP 28232和MF三环的化合物。
在此使用时，除非另外指出，术语“烷基”包括任何长链或短链、直链、分支或环形脂肪族饱和或不饱和烃基，任选地被羟基、烷氧基、酰氧基、硝基、烷氧羰氧基、氨基、芳基、氧或卤素基团单取代或多取代。不饱和烷基可以是单不饱和或多不饱和的，包括链烯基和烷烯基。这些基团可含有高达40个、但优选地1-10个碳原子。
在此使用时，环优选地是C5-7，任选地含有一个或多个选自氧、氮和硫的杂原子。
术语“酰基”在此使用时包括羧酸和碳酸基团，例如，酰氧基取代的烷基，包括如烷基羰氧基烷基。在这些类别中，任何烯基部分优选地具有对于上述烷基所述的碳原子含量。优选的芳基包括苯基和5-7个成员的单环杂芳族，特别是苯基，这些类别本身可任选地被取代。
典型的取代烷基R1包括烷氧烷基、羟烷氧烷基、多羟烷基、羟基多亚烷基氧烷基等，如烷氧甲基、烷氧乙基和烷氧丙基或酰氧甲基、酰氧乙基和酰氧丙基，如特戊酰氧基甲基。
在此使用时，除非另外指出，取代基可以被羟基、烷氧基、酰氧基、硝基、烷氧羰氧基、氨基、芳基、氧或卤素基团单取代或多取代。
在本发明的另一个优选实施方案中，COX-2抑制剂选自传统NSAID’s的修饰物，例如前体药物、酯或盐。
以传统NSAID’s的化学结构为基础，生产了更多新的选择性COX-2抑制剂。这种化合物可以是美洛昔康，它是一种oxecam(众所周知的吡罗昔康的COX-2特异性类似物)或乙酸衍生物，如依托度酸(二氯芬酸的COX-2特异性类似物)。最优选的该类化合物的其它例子有COX-2活性吲哚美辛衍生物和佐美酸。
在关于COX-2抑制剂的专利和专利申请中，例如，在上文列出的专利文件中，有根据本发明的化合物家族和亚家族的另一个清单。这些专利文件也列举了也是根据本发明的最优选COX-2抑制剂的特异性化合物。
然而，特别优选的化合物有：异氟磷、L-745337、罗非考昔、NS398、SC 58125、依托度酸、美洛昔康、赛乐考昔和尼美舒利。
生产根据本发明使用的COX-2抑制剂的方法在本领域众所周知，特别如上述文献所述。
根据本发明，用于治疗和预防此处所述疾病(例如免疫缺陷和病毒感染，特别是HIV/AIDS)的COX-2抑制剂，可含有一个或多个不对称中心和/或一个或多个双键，即本发明涉及此处公开的化合物的异构体和消旋体的用途。所有这些可能的异构体都属于本发明的范围。COX-2抑制剂可以是化合物的异构体混合物的形式，或者更优选地，是纯化异构体或药学可接受的盐的形式。
用于治疗根据本发明的疾病(例如免疫缺陷和病毒感染)的COX-2抑制剂的药用组合物能配制为药学可接受的盐，也可含有本领域众所周知的药学可接受的载体。
因此，本发明也涉及含有COX-2抑制剂或其衍生物或药学可接受的盐和药学可接受的稀释剂、载体或赋形剂的药用组合物。“药学可接受的”是指一种成分必须与组合物中的其它成分相容，以及接受者在生理上可以接受。
在其它实施方案中，本发明也涉及这些组合物的用途，和使用这些组合物的预防/治疗方法，如上文所述。
如果COX-2抑制剂是碱性的，可由药学可接受的无毒酸(包括无机酸和有机酸)制备盐。特别优选的盐是盐酸、氢溴酸、磷酸、硫酸、柠檬酸、马来酸、柠檬酸和酒石酸盐。
如果COX-2抑制剂是酸性的，可由药学可接受的无毒碱(包括无机碱或有机碱)制备盐。特别优选的盐是钠、钾和镁盐。
为了治疗和预防如此处所述的疾病，例如免疫缺陷或病毒疾病，包括HIV/AIDS，COX-2抑制剂能经口、直肠、局部、颊部、吸入或以注射或输液的形式肠胃外(例如肌内、皮下、腹膜内或静脉内)施用。优选的施用形式可经口、直肠和注射或输液施用。最优选的施用形式适于口服。
对于所有施用形式，COX-2抑制剂均以通常含有众所周知的药学可接受的载体、佐剂和媒介的剂量单位制剂施用。因此，可以掺入活性成分，任选地与其它活性物质一起作为组合制剂，含有一种或多种常规载体、稀释剂和/或赋形剂，从而形成常规药用制剂，如片剂、丸剂、粉剂、菱剂、香袋、胶囊剂、酏剂、悬液、乳剂、溶液、糖浆、气雾剂(固体或液体基质)、软膏、软胶囊或硬胶囊、栓剂、无菌注射溶液、无菌包装粉末等。可生物降解聚合物(如聚酯、聚酐、聚乳酸或聚羟乙酸)也可用于固体植入。组合物可以利用冷冻干燥、过冷却或Permazyme稳定。
合适的赋形剂、载体或稀释剂包括：乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯树胶、磷酸钙、藻酸盐、黄蓍胶、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、糖浆、水、水/乙醇、水/乙二醇、水/聚乙烯、乙二醇、丙二醇、甲基纤维素、甲羟基苯甲酸盐、羟基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁、矿物油或脂肪物质，如硬脂或其适当的混合物。组合物还可含有润滑剂、湿润剂、乳化剂、悬浮剂、防腐剂、甜味剂、增香剂、吸收增强剂，例如用于经鼻给药(胆汁盐、卵磷脂、表面活性剂、脂肪酸、螯合剂)等等。本发明的组合物可以配制成在利用本领域周知的方法对患者施用后，快速、持续或延迟释放活性成分。
施用的活性成分可以适当修饰，以在药用组合物中使用。例如，利用适当的添加剂，如盐或非电解质、乙酸盐、SDS、EDTA、柠檬酸盐或乙酸缓冲液、甘露醇、甘氨酸、HAS或聚山梨醇酯，可以稳定活性成分。
可以配制偶联物以得到提高的亲脂性，提高细胞运输，提高溶解度或允许靶向。这些偶联物可以是可切割的，使偶联物作为前体药物。也可利用适当的金属络合物，例如含Zn、Ca或Fe的络合物，提供稳定性。
活性成分可以配制于适当载体中，用于输送或靶向特定细胞、器官或组织。因此，药用组合物可以采取微乳剂、脂质体、niosome或纳米颗粒的形式，其中可以吸收、掺入或结合活性成分。这能将产品有效地转化为不可溶形式。
这些颗粒可以携带适当的表面分子以提高循环时间(例如血清成分、表面活性剂、polyoxamine908、PEG等)，或用于位点特异性靶向的部分，如特定细胞携带的受体的配体。适用的给药技术和靶向技术在本领域众所周知，参见，例如：Kreuter，1994，Eur.J.DrugMetab.Pharmacokinet.，3，p253-256；Shen，1997，J.Drug Targeting，5(1)，p11-13；Mrsny，1997，J.Drug Targeting，5(1)，p5-9；Pettit和Gombotz，1998，TIBTECH，16，p343-349；Duncan，1997，J.DrugTargenting，5(1)，p1-4，关于药物靶向，Simari和Nabel，1996，Semin.Intervent.Cardiol.，1，p77-83；Torchilin，1998，J.Microencapsulation，15(1)，p1-19；Klyashchitsky和Owen，1998，J.Drug Targenting，5(6)，p443-458；Kreuter，1996，J.Anat.，189，p503-505；Fasano，1998，TIBTECH，16，p152-157；Kataoka等人，1993，24，p119-132；Anderson，1998，Nature，392(suppl)，p25-30；Langer，1998，Nature，392(suppl)，p5-10；Gregoriadis，1995，TIBTECH，13，p527-536；Gregoriadis等人，1997，FEBS Lett.，402，p107-110；Rolland，1998，Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems，15(2)，p143-198；Hope等人，1998，Molec.Memb.Biol.，15，p1-14；Scherman等人，1998，Curr.Opinion Biotech.，9(5)，p480-485，关于肽和核酸分子给药。定点靶向的例子见，例如Schafer等人，1992，Pharm.Res.，9，p541-546，其中纳米颗粒能在HIV感染的巨噬细胞中积累。显然，这些方法特别适用于此处所述的本发明的方法。
这些衍生的或偶联的活性成分属于根据本发明使用的抑制性分子的定义范围。
例如，用于口服的药用组合物含有活性成分和适当的生理可接受的药物，以形成片剂、胶囊、溶液、悬液或其它众所周知的口服制剂。这些组合物可通过生产口服药用组合物的任何方法生产。这些组合物能含有一种或多种生物活性剂，和一种或多种选自防腐剂、惰性稀释剂、粘度增强剂、着色剂、甜味剂、成粒剂、崩解剂、粘合剂、渗透活性剂、湿润剂、悬浮剂、用于制备缓释制剂的物质、油和水的成分。
非口服使用的药用组合物，例如直肠施用的栓剂或注射或输液用的溶液，能用众所周知的方法和适用于这些制剂的添加剂制备。所有注射和输注用制剂都应当是无菌制剂。
这些组合物中的活性成分可以占制剂重量的约0.01％-99％，优选地约0.1％-50％，例如10％。
为了用COX-2抑制剂治疗根据本发明的疾病，例如免疫缺陷和病毒感染，每日剂量水平应为0.005mg-约150mg/kg体重。剂量主要取决于COX-2抑制剂化合物的选择、临床状况(病毒类型、传染状态和患者病情)、患者年龄和体重、给药途径和药物的总用量，包括疗程的长短。更优选的剂量通常为每0.01mg-50mg/kg体重，更优选的是每日0.05mg-20mg/kg体重。例如，对于成人口服给药，可以每日施用25mg罗非考昔或200mg赛乐考昔。
剂量单位一般为1mg-500mg活性成分。
根据本发明的一个方面，一种COX-2抑制剂能与一种或多种其它COX-2抑制剂组合，治疗此处所述的疾病，例如免疫缺陷或病毒感染。
根据本发明的另一方面，COX-2抑制剂能与一种或多种其它COX-2抑制剂或一种或多种不同作用模式的其它药物组合，治疗疾病，如免疫缺陷、HIV感染或AIDS。这类组合的实例可以是COX-2抑制剂与一种或多种NNRTIs组合，或与一种或多种NRTIs组合，或与一种或多种HIV蛋白酶抑制剂组合，或一种或多种HAART与COX-2抑制剂组合。
另一方面，本发明提供组合一种或多种COX-2抑制剂与提高活性成分耐受性的化合物的方法和/或组合物，特别是在长期治疗中。典型的化合物包括抗组胺和质子泵抑制剂。
因此，本发明涉及含有上文所述COX-2抑制剂和一种或多种其它COX-2抑制剂和/或一种或多种其它活性成分的组合物。本发明还涉及这些组合物的用途和使用上述组合物的方法。本发明还涉及含有上述成分的产品，作为组合制剂在治疗或预防上述疾病时同时、分开或连续使用。
本发明参照下列附图，在下列非限制性实施例中进一步描述：
图1显示MAIDS感染后CD8+(A)、CD4+(B)和B(C)细胞中的cAMP水平。从感染MAIDS不同时间的小鼠的淋巴结中分离单核细胞，利用DACS-细胞分选仪通过负选择分离为CD4+、CD8+和B细胞。胞内cAMP水平通过超声处理和放射免疫测定法估计。条图代表平均值±SD(n＝3个体小鼠)；
图2显示CD4+、Thy-1.2阴性和阳性群体中的MAIDS cAMP水平。来自3只感染小鼠和三只年龄相当的对照小鼠的淋巴结细胞FACS-分选为CD4+，Thy-1.2+(空心条形)和CD4+，Thy-1.2-(实心条形)群体，如图1所述测定胞内cAMP水平。条图代表平均值±SD(n＝3)；
图3显示MAIDS与野生型小鼠的蛋白激酶A活性水平。(A)在含(总活性，阴影条形)或不含(游离活性，实心条形)5μmcAMP时，用肯普肽作为底物，对从小鼠脾细胞纯化的淋巴结细胞的去污剂溶解的提取物测得的激酶活性。减去不被PKA特异性蛋白激酶抑制剂(PKI，1μM)抑制的磷酸转移酶活性，只显示PKA特异性活性。相对于野生型仔畜，显示感染小鼠(MAIDS；n＝4)的活性。(B)对与(A)相同的提取物测得的[3H-cAMP]结合，计算R单体的摩尔量；
图4显示MAIDS和野生型小鼠细胞中PKA C亚基的免疫定位。来自对照小鼠(上图)和MAIDS感染小鼠(下面两幅图)的单核细胞通过细胞离心(cytospin)(400×g)附着于载玻片上，固定并用抗-PKA-C多克隆抗体和HRP-偶联的第二抗体进行免疫染色(染色呈褐色)。用苏木精复染(染色质染色呈蓝色)；
图5显示I型PKA拮抗剂Rp-8-溴-cAMP-硫逐磷酸酯(Rp-8-Br-cAMP)对MAIDS和野生型小鼠T细胞功能的影响。用自MAIDS小鼠(A)和未感染的对照小鼠(B)分离的T细胞估测TCR/CD3刺激的T细胞增殖。用相同实验分别检测浓度升高的cAMP激动剂(8-CPT-cAMP)对TCR/CD3刺激的自MAIDS(空圆，虚线)和对照小鼠(实圆，实线)分离的CD3+T细胞增殖的影响(C)。显示三次测定的平均值±SD。总结数据见表4(n＝11)。注意：A和B的标尺不同，而在C中，对于MAIDS和对照T细胞，将不含cAMP激动剂时TCR/CD3诱导的增殖标准化为100％；
图6显示正常和MAIDS淋巴结细胞在体外的PGE2分泌。来自MAIDS感染20周后的小鼠(实心条形，n＝9)和年龄相当的对照小鼠(阴影条形，n＝4)的未分选的淋巴结细胞在完全培养基中培养48小时，之后通过ELISA测定上清液中的PGE2分泌水平；
图7显示非选择性COX抑制剂对正常和MAIDS感染小鼠T细胞免疫功能的影响。柱图1——对照小鼠+抗-CD3；柱图2——对照小鼠+抗-CD3+吲哚美辛；柱图3——MAIDS小鼠+抗-CD3；柱图4——MAIDS小鼠+抗-CD3+吲哚美辛。在含及不含非选择性COX抑制剂吲哚美辛(50ng/ml)时，通过[3H]-胸苷掺入法测定未分选的淋巴结单核细胞混合群体的T细胞增殖反应。通过抗-CD3(mAb2C11；4μg/ml)交联实现T细胞激活。条图显示对照(n＝3)和MAIDS感染(n＝5)小鼠的平均值±SD，其它数据见表5。细胞培养72小时，其中后4小时含有[3H]-胸苷；
图8显示正常(A)和MAIDS感染(B)小鼠中不同淋巴结淋巴细胞亚群的COX-2表达。分别根据CD4、CD8和B220分子的表达，通过正选择FACS分选CD4+T、CD8+T和B细胞。CD11b-细胞通过负选择分选(根据CD11b的缺乏)。然后裂解来自MAIDS感染小鼠和正常小鼠的细胞，每一样品对10μg蛋白质进行COX-2表达的免疫印迹分析。印迹同时与肌动蛋白抗体反应作为对照；
图9显示MAIDS和野生型淋巴结细胞的CD11b表达。显示来自MAIDS感染小鼠和对照小鼠的不同淋巴结淋巴细胞亚群(CD4+、CD8+T细胞和B220+B细胞)的CD11b表达(通过流式细胞术)。R1：CD11b高；R2：CD11b暗；R3：CD11b-；
图10显示MAIDS感染小鼠和野生型小鼠的淋巴结的COX-2表达水平。淋巴结冷冻切片，进行COX-2免疫组化染色(染色呈褐色)。(a)正常对照淋巴结，生发中心进行COX-2染色。(b)较高放大倍数下的正常淋巴结。HRP颜色反应染色阳性的细胞是含摄入物质(箭头)的“可染色体”巨噬细胞。(c)来自MAIDS感染小鼠(感染后20周)的淋巴结。注意：改变的形态和结构。(d)较高放大倍数下进行COX-2染色的MAIDS淋巴结。注意：细胞质中免疫染色呈褐色的细胞数和大量有丝分裂形状；
图11显示体内施用非选择性COX抑制剂对HIV感染患者T细胞免疫功能的影响。对3名患者(患者1-3)根据[3H]-胸苷掺入估测CD3+T细胞的T细胞增殖反应，这3名患者参加II期临床试验，除三联治疗外，还每日3次口服25mg吲哚美辛，共14天。上图显示第0天、第14天(治疗两周后)和第28天(停止两周后)的T细胞免疫功能，分别标记为柱图1、2、3。通过抗-CD3(mAb SpVT3b)交联实现T细胞激活。A：T细胞激活后的基础增殖；B：在Rp-8-Br-cAMPS(1mM)存在下的增殖；注意：通过比较上图和下图，cAMP介导的免疫缺陷程度明显。条图代表三次测定的平均值±SD。细胞培养72小时，后16小时含有[3H]-胸苷；
图12显示体内施用非选择性COX抑制剂吲哚美辛对图11所述7名HIV感染患者的T细胞增殖的影响，患者1-7分别以实心圆、空心圆、实心三角形、空心三角形、实心正方形、空心正方形和实心菱形表示。对三次测定的平均值作图，连线表示每名患者的发展；
图13显示COX-2特异性抑制剂罗非考昔对MAIDS感染小鼠T细胞免疫功能的影响。在含和不含浓度逐渐升高(1.9-500nM)的COX-2特异性抑制剂罗非考昔时，通过[3H]-胸苷掺入法测定未分选的淋巴结单核细胞混合群体的T细胞增殖反应。通过抗-CD3(mAb2C11；4μg/ml)交联实现T细胞激活。显示三次测定的平均值和S形曲线拟合。细胞培养72小时，其中后4小时含有[3H]-胸苷；
图14显示COX-2特异性抑制剂赛乐考昔对MAIDS感染小鼠T细胞免疫功能的影响，如图13对于罗非考昔所述；
图15显示罗非考昔和赛乐考昔与吲哚美辛相比，对对照小鼠(1)或MAIDS小鼠(2)的离体淋巴结(LN)细胞分泌PGE2的影响。未分选的LN细胞在含或不含PGE2诱导剂——脂多糖(LPS；4μg/ml)、非特异性环加氧酶抑制剂——吲哚美辛(50ng/ml)、COX-2特异性抑制剂罗非考昔(0.125μM)和赛乐考昔(0.125μM)的完全培养基中培养。48小时后，通过EIA测定上清液中的PGE2浓度。分析3只感染小鼠(第20周)和3只年龄相当的对照小鼠。显示平均值±标准差；
图16显示用罗非考昔体内处理MAIDS小鼠对T细胞免疫功能的影响。MAIDS小鼠不处理(未处理1-3)或用罗非考昔经口处理(3mg/lkg/d，每日一次，处理1、2)7天，通过插入心室的导管给药。之后，在含(0.5或1.0mM，分别柱图B和C)及不含(柱图A)Rp-8-Br-cAMPS时，对来自处理和未处理动物的未分选的淋巴结单核细胞混合群体，通过[3H]-胸苷掺入法体外测定其T细胞增殖反应。所有样品均通过抗-CD3(mAb 2C11；4μg/ml)交联实现T细胞激活。对照代表未感染小鼠的T细胞增殖。显示三次测定的平均值。细胞培养72小时，其中后4小时含有[3H]-胸苷；
图17显示用罗非考昔或赛乐考昔体内处理MAIDS小鼠对T细胞免疫功能的影响。MAIDS小鼠注射载体(脂肪乳剂intralipid)、通过腹膜内注射以溶于脂肪乳剂中的罗非考昔处理(3mg/kg/d，每日一次，n＝6)，或通过腹膜内注射以赛乐考昔处理(20mg/kg/d，每日一次，n＝5)18-20天。之后，如图16所述，但不含Rp-8-Br-cAMPS，在体外测定T细胞增殖反应。对照代表未感染小鼠的T细胞增殖。显示三次测定的平均值(黑圆)、25-75％百分位(加框区域)和中值(框中的线)。条图代表范围；
图18显示用美洛昔康体内处理MAIDS小鼠对T细胞免疫功能的影响。将含有美洛昔康(释放率为70μg/动物/日)或磷酸缓冲液(PBS)的渗透泵(Alzet，100μl)皮下植入MAIDS小鼠(感染后14周)和健康小鼠中14天。a)，之后，如图17所述在体外测定T细胞增殖反应。显示每组的平均值±标准误(s.e.m.)。美洛昔康处理对抗-CD3刺激的MAIDS小鼠细胞增殖(实心条形)的影响，与接受PBS的MAIDS小鼠的结果(空心条形)相差显著(p<0.05)。b)，美洛昔康或PBS体内处理的a)中小鼠组的混合淋巴结培养物，在体外细胞培养液中补加美洛昔康(2.5μg/ml)，如a)所述测定抗-CD3诱导的T细胞增殖，体外补加美洛昔康的影响(空心条形)与没有补加的细胞反应(实心条形)相比较(p＝0.005)。c)，向美洛昔康或PBS体内处理的a)中小鼠组的混合淋巴结体外细胞培养物中加入Rp-8-Br-cAMPS(0.5mM)，如a)所述测定抗-CD3诱导的T细胞增殖，体外Rp-8-Br-cAMPS的影响(空心条形)表示为高出没有补加的细胞(实心条形)的诱导倍数。用Mann-Whitney U检验进行统计学分析以比较两组动物，用Wilcoxon配对检验比较进行两种不同处理的同一组别。
实施例
实施例1
鼠获得性免疫缺陷综合征(MAIDS)小鼠具有cAMP/I型PKA诱发的T细胞功能障碍
MAIDS(鼠获得性免疫缺陷综合征)。大量研究表明MAIDS是人类HIV感染的一个可能的模型。该综合征在感染了编码一种变异Pr60gag聚蛋白质的复制缺陷型逆转录病毒后发作(Chattopadhyay等人，1991，J.Virol.，65，p4232-4241；Jolicoeur，1991，FASEB J.，5，p2398-2405)。该综合征与脾脏和淋巴结中的进行性淋巴增生以及严重的免疫缺陷有关。尽管导致MAIDS的缺陷型逆转录病毒主要感染B细胞(Aziz，1989，Nature，338，p505-508)，但CD4+ T细胞表现严重的功能障碍，和对体外有丝分裂原刺激的无反应性。感染小鼠的大部分CD4+ T细胞(而不是CD8+ T细胞)的特征也在于异常的Thy-1阴性表型(Holmes等人，1990，Eur.J.Immunol.，20，p2783-2787；Moutschen等人，1994，Scand.J.Immunol.，39，p216-224(MAIDS))。在正常的未感染的小鼠中，生发中心选择性地发现有CD4+ Thy-1- T细胞，它们相当于最近的抗原特异性迁出物。
变异Pr60gag蛋白诱发T细胞异常的机制还不清楚。感染细胞分泌的可溶性因子据说一定程度上影响T细胞的功能(Simard，J.Virol.，68，p1903-1912)，但这些介质的性质尚未阐明。其它研究提示，CD4+ T细胞与抗原递呈细胞的直接、同源相互作用是诱发T细胞缺陷所必需的(Green，2001，J.Virol.，70，p2569-2575；de Leval，1998，J.Virol.，72，p5285-5290)。
腺苷酸环化酶-cAMP-蛋白激酶A途径在免疫应答的调节中起重要作用(Kammer，1991，Immunol.Today，9，p222-229)。众所周知，浓度升高的cAMP可抑制T细胞对多种刺激物(如抗-CD3mAb和白介素-2)的增殖反应。最近的报道提示，JAK3酪氨酸激酶的下调可能是cAMP抑制T细胞增殖的机制(Kolenko，1999，Blood，93，p2308-2318)。cAMP也能诱导膜蛋白的下调，因为暴露于cAMP诱导剂(如去甲肾上腺素)的鼠胸腺细胞或胸腺瘤细胞通过包括mRNA去稳定的机制下调Thy-1的表达(Wajeman-Chao，J.Immunol.，161，p4825-4833)。
前列腺素E2(PGE2)是cAMP的一种强诱导剂，主要由单核细胞、巨噬细胞和活化的T细胞分泌。PGE2通过抑制IL-2并提高IL-4产量，使平衡从1型T辅助细胞移向2型T辅助细胞(Betz和Fox，1991，J.Immunol.，146，p108-113；Meyaard，1997，Blood，89，p570-576)。它也使B细胞的分化倾向于IgE的产生(Fedyk和Phipps，1996，PNAS USA，93，p10978-10983)。前列腺素的合成由环加氧酶-1和-2(COX-1和COX-2)以及特异性PG合酶的连续作用完成(Smith和DeWitt，1996，Adv.Immunol.，62，p167-215)。COX-1的表达主要是组成型和普遍的，而COX-2只在特定细胞型(巨噬细胞、成纤维细胞、平滑肌细胞)中由NO和炎性细胞因子(如IL-1和TNF-α)诱导。
对于导致MAIDS的T细胞功能障碍的机制仍了解极少。主要涉及CD4+ T细胞，而几篇报道提出，CD8+ T细胞的改变仅仅是由于缺乏足够的CD4+ T细胞辅助。相反，B细胞反应的抑制是固有的，不能仅仅用缺陷型CD4+淋巴细胞来解释。因此，发明者观察到的B细胞和CD4+ T细胞而非CD8+ T细胞中cAMP选择性增多符合cAMP参与MAIDS相关的无反应性过程。
据发明者所知，这第一次证明了疾病模型中cAMP的亚群选择性增多。如果可溶性因子，如前列腺素E2，确实负责cAMP诱导，如何解释其作用的亚群选择性呢？以前的研究比较了CD4+和CD8+ T细胞上不同前列腺素类受体的表达，结论是两个亚群有类似的表达模式。正常CD8+ T细胞对PGE2的cAMP诱导作用非常敏感。一个可能的解释是在受体后水平发生；记忆/活化T细胞对PGE2比幼稚T细胞更具反应性。对于MAIDS——它与MHC II类依赖的过程有关，CD4+T细胞能获得特定的激活状态，使它们对特定浓度的PGE2的作用更加敏感。前列腺素类作用的受体后调节主要由G受体激酶(GRK)介导，GRK从相应的膜受体上解偶联蛋白G。炎症状态如类风湿性关节炎的特征在于GRK的下调，因而在于淋巴细胞对cAMP诱导剂(如儿茶酚胺)的敏感性提高。来自感染小鼠的CD4+和CD8+ T细胞的GRK活性水平未知。
实施例1和2中使用的方法
小鼠和细胞悬液
雄性C57BL/6小鼠饲养于发明者的实验设施中。小鼠在4周龄和5周龄时腹膜内注射两次0.25ml无细胞病毒提取液。年龄相当的对照小鼠腹膜内注射两次0.25ml磷酸缓冲液(PBS)。在感染后不同时间，通过CO2窒息杀死小鼠。用注射器解离外周淋巴结(腹股沟、腋窝和颈部)，获得单细胞悬液，并通过尼龙细胞染色器，用RPMI 1640完全培养基洗涤三次，在台盼蓝排除后用Thoma血细胞计数器计数。
病毒
如前所述，由2个月前注射RadLV-Rs的小鼠的淋巴结制备病毒提取物。收集淋巴结，在PBS中研磨，以1.5×104g离心30分钟。再次以1.5×104g离心上清液30分钟。将此无细胞提取液贮存于液氮中。用XC空斑测定法定量病毒颗粒。该病毒制品含有103颗粒形成单位(PFU)新嗜性病毒/ml。
抗体
用下列多克隆抗体进行Western印迹实验；一级抗体：多克隆兔抗COX-1或兔抗COX-2抗体。(Santa Cruz Biotechnology)；第二步：辣根过氧化物酶偶联的抗兔抗体购自TransductionLaboratories(Transduction Laboratories，UK)。流式细胞分析使用如下单克隆抗体：PE-偶联的CD4/L3T4(YTS.191.1)、FITC-偶联的CD45R/B220(RA3-6B2)、FITC-偶联的CD11b/Mac-1(M1-70)、FITC-偶联的CD161/NK-1.1(PK136)、FITC-偶联的CD8a(Ly-2)和CD16/CD32(Fc γ III/II受体)(2.4G2)(均购自Pharmingen：San Diego，CA，USA)。CD3 moAb(145-2C11)在发明者的实验室中纯化。伴刀豆球蛋白A(ConA)购自BoehringerMannheim Biochemica，植物凝集素-M(PHA)购自Difco。
流式细胞分析和细胞分选
利用FACStar-plus流式细胞分选仪和Cellquest软件(BectonDickinson)进行分析。用前向和侧向散射门控活淋巴细胞。对于FITC(绿色)和PE(橙色)双色分析，用氩离子激光(气水冷却型Spinnaker 1161；Spectra Physics，Mountain View，CA)提供488nm的蓝光激发。对于细胞分选，60×106个细胞与抗-Fc γ II(Fc阻断)温育，以防止非特异性相互作用，之后在冰上用荧光染料偶联的抗体标记20分钟。通过消耗CD8+ B220+ CD11b+细胞负选择CD4+ T细胞。类似地，通过消耗CD4+ B220+ CD11b+细胞负选择CD8+ T细胞，通过消耗CD8+ CD4+ CD11b+细胞负选择B细胞。每次分选都用流式细胞术重新分析选择的级分，估计纯度，其总是高于97％。
cAMP定量
单淋巴结细胞悬液如上所述制备，用RPMI 1640洗涤两次，以1500×g离心3分钟。之后通过超声处理破碎细胞，促进胞内cAMP向提取溶液(0.01N HCl，95％乙醇)中释放。以13×104×g离心含有细胞裂解液的溶液15分钟，将上清液移至新试管中。在SpeedVac浓缩器中45℃蒸发提取液，沉淀贮存于-20℃。使用前，将沉淀重悬浮于测定缓冲液中，采用125I-标记的cAMP测定系统(Amersham，England)通过放射免疫测定法(RIA)测定cAMP水平。通过与曲线-线性标准曲线比较，测定待测样品中的cAMP浓度。对于阳性和阴性对照，淋巴结细胞(1×106)分别与1mM二丁酰-cAMP和0.5mM DDA(腺苷酰环化酶抑制剂)在潮湿5％ CO2孵箱中37℃温育30分钟，之后测定cAMP浓度。
细胞匀浆和免疫印迹
细胞(50×106)在含有10mM磷酸钾(pH7.1)、250mM蔗糖、1mM EDTA、0.1％ Triton X-100和各10μg/ml蛋白酶抑制剂——胰凝乳蛋白酶抑制剂、亮抑蛋白酶肽、胃酶抑制剂A和抗蛋白酶的缓冲液中，通过在冰上超声处理(2×15s)匀浆(Tasken等人，1993，J.Biol.Chem.，268，p21276-21283)，离心30分钟(15000×g)除去不可溶物质。通过Bradford试验(BioRad)测定蛋白质浓度。对于免疫印迹，通过10％ SDS-PAGE分离40μg蛋白质，转移到PVDF膜上，与溶于含5％脱脂奶粉和0.1％ BSA(Blotto)的TBS/Tween中的抗体一起温育。用HRP偶联的二级抗体(JacksonLaboratories/Transduction Laboratories)和ECL(Amersham)检测一级抗体。
PKA的磷酸转移酶活性
在R.Roskoski(Methods Enzymol.，1983，99，p36)所述的测定混合物中，用[γ-32P]-ATP(比活性0.25Ci/mMol，Amersham)使PKA特异的底物(Leu-Arg-Arg-Ala-Ser-Leu-Gly)(Kemp等人，1976，PNSA USA，73，p1038-1042)肯普肽，Peninsula LaboratoriesINC.)磷酸化，测定PKA的催化活性。在含及不含cAMP(5μM)和PKI(1μM)时测定磷酸转移酶活性，减去不被PKI抑制的低水平活性，测定PKA特异的活性。
cAMP结合测定
溶解的PKA调节亚基的特异[3H]cAMP结合如Cobb和Corbin(Methods in Enzymology，159，p202-208，1988)所述在含有[2，8-3H]cAMP(2.25μM；比活性为5 Ci/mMol；DuPont-New EnglandNuclear)的混合液中进行定量。根据每个调节亚基单体上的两个cAMP结合部位计算R亚基的摩尔比。
免疫细胞化学
对照和感染的淋巴结淋巴细胞与冷丙酮固定5分钟，用0.1％皂苷PBS溶液洗涤两次，每次5分钟。在0.1％皂苷/PBS中与0.3％过氧化氢温育15分钟阻断内源过氧化物酶。用皂苷/PBS漂洗后，玻片在室温下与阻断缓冲液(溶于0.1％皂苷/PBS的1.5％正常山羊血清)温育30分钟，随后在潮湿容器中与一级抗体溶液室温温育60分钟。抗Ca抗体购自Santa Cruz，用含0.1％皂苷和0.5％正常山羊血清的PBS 1:1000稀释。然后如前所述洗涤玻片，与生物素化山羊抗兔抗体一起温育。后者用ABC复合物(Novastain Super ABC试剂盒，Novocastra)检测。过氧化物酶用二氨基联苯胺(DAB)(Dako)显色，DAB在H2O2存在下产生褐色沉淀。玻片用苏木精-曙红(Sigma)复染。将cytospin与抗PKA-Cα亚基的特异肽温育，检测特异性。
免疫组织化学
用4％低聚甲醛固定、塑料包埋的组织(JB4-JBPolysciences)制作2μm厚的组织切片，在该切片上进行免疫组织化学。切片用胰蛋白酶(0.24％)在37℃下透化1分钟，然后用Tween 20(2％)在37℃下透化30分钟。在室温下与H2O2(1％)温育30分钟，以猝灭内源过氧化物酶。非特异性部位用正常山羊血清(1.5％)在37℃下饱和1小时。然后将切片与一级多克隆兔抗COX-1或兔抗COX-2抗体(Santa Cruz Biotechnology)4℃温育过夜，然后与生物素化山羊抗兔抗体温育2小时。后者用ABC复合物检测(Novostain Super ABC试剂盒，Novocastra)。过氧化物酶用二氨基联苯胺(DAB)(Dako)显色，DAB在H2O2存在下产生褐色沉淀。切片用苏木精-曙红(Sigma)复染。将切片与正常兔血清而不是一级抗体一起温育，检测特异性。
MAIDS小鼠的增殖测定
通过在平底96孔微孔板中以100μl体积温育0.1×106 CD3+T细胞/ml进行增殖测定。以1:1的细胞：磁珠比加入绵羊抗小鼠IgG(Dynal，目录号110.02)包被的单分散性磁珠，随后加入终稀释度为4μg/ml的抗-CD3(克隆2C11)，实现激活。开始时仔细滴定抗体的最佳浓度，始终以几个不同的抗体稀释度进行平行实验。温育细胞72小时，其中后4小时含有[3H]-胸苷(0.4μCi)，用细胞收集器(Skatron，Sterling，VA，USA)收集到玻璃纤维滤器上，分析增殖。用闪烁分析仪(Tri-Carb，Packard，Meriden，CT，USA)计数掺入的前体。需要时，加入cAMP类似物，30分钟后加入抗-CD3抗体激活。8-CPT-cAMP购自Sigma(St.Louis，MO)，Sp-和Rp-8-Br-cAMPS购自BioLog Life Science Company(Bremen，德国)，均用PBS溶解为4-10mM的浓度，用厂商指定的消光系数计算浓度。吲哚美辛溶解于水中，以50ng/ml浓度使用。
PGE2测定
将来自对照和感染小鼠的淋巴结细胞的500μl 48小时培养上清液移至1.5ml聚丙烯管中，加入500μl水:乙醇(1.4)和10μl冰冷的乙酸。轻轻混合试管，在室温下放置5分钟。随后以2500×g离心2分钟。收集上清液，过Amprep C18微型柱，该柱用2倍柱体积的10％乙醇初始化(prime)。然后用1倍体积的H2O和1倍柱体积的已烷洗柱。PGE2用2×0.75ml乙酸乙酯稀释。合并级分，在氮气下蒸发干燥。最后，每个级分用100μl测定缓冲液重建，按照厂商推荐，用Amersham EIA试剂盒测定PGE2。
统计学分析
用Mann-Whitney U检验(双尾)比较两组个体。相关系数(r)用Spearman＝s秩和检验计算。统计学和曲线拟合分析分别用Statistica(Statsoft Inc.，Tulsa，OK)和Sigma Plot(JandelCorporation，Erkrath，德国)软件包进行。如不另外说明，结果表示为中值和25％-75％百分位，p值是双向的，当<0.05时视为显著。
实验
MAIDS感染使CD4+T细胞中的cAMP增多。接种逆转录病毒混合物(称为RadLV-Rs，导致MAIDS)的小鼠在感染不同时间后杀死，用流式细胞仪/细胞分选器通过负选择将淋巴结细胞分选为纯B细胞和CD4+和CD8+T细胞。测定感染后不同细胞群体的胞内cAMP水平。从图1可以看出，CD4+T细胞在感染数周后cAMP水平明显升高(超过20倍)。后期，B细胞的cAMP水平也升高，而在CD8+T细胞中只观察到较小的变化。此外，通过阳性分选将CD4+T细胞分离为Thy-1.2+和Thy-1.2-细胞时，显然主要是Thy-1.2-细胞的cAMP水平升高(图2，6倍)。当均来自于未感染的小鼠时，这一通常为低丰度的群体也显示高于Thy-1.2+的基础cAMP水平。
测定去污剂溶解提取物的核后上清液中的PKA磷酸转移酶活性，显示MAIDS淋巴结细胞中cAMP依赖的激酶活性总水平下降，而无cAMP时活性只有较小改变(图3A)。这符合慢性激活和导致C亚基降解或C移位的PKA解离。对cAMP结合的测定(图3B)显示PKA R亚基总水平无改变。来自MAIDS和对照小鼠的淋巴结细胞的免疫细胞化学显示，核中免疫反应性PKA C亚基的水平升高(图4)。这也符合MAIDS中cAMP-PKA途径的激活。
I型PKA拮抗剂提高MAIDS T细胞的T细胞增殖
为了测定增多的cAMP和PKA激活对抑制TCR/CD3-诱导的T细胞增殖的影响，我们使用硫取代的cAMP类似物(Rp-8-Br-cAMPS)作为I型PKA的完全拮抗剂(Gjertsen，Mellgren等人，19951665，同上文)。图5A显示，在MAIDS感染小鼠的T细胞中，TCR/CD3-刺激的增殖不到未感染对照小鼠的T细胞的10％(图5B)。此外，当估测I型PKA拮抗剂在MAIDS T细胞中的作用时，我们发现TCR/CD3诱导的增殖有浓度依赖的提高，在较高浓度时超过4倍(图5A)，而对照T细胞的处理未见刺激(图5B)。观察11只MAIDS感染小鼠，与对照相比，它们的T细胞增殖均严重削弱(p<0.001)，而对于11只小鼠中的10只，I型PKA拮抗剂增强了T细胞增殖(p<0.001；中值2.2倍，图5)。cAMP拮抗剂的刺激作用甚至在所用的最高浓度时仍未饱和(图5A，对于表5中的所有小鼠获得类似的数据(未显示))。这表明，化合物的溶解度、亲和力或细胞的利用率可能是观察到的作用的限制因素。因此，通透性和效能更高的I型PKA拮抗剂可进一步增强TCR/CD3-诱导的MAIDS T细胞增殖。
然后，用5只MAIDS感染的小鼠和4只对照小鼠研究cAMP激动剂对TCR/CD3-诱导的增殖的影响。来自MAIDS感染小鼠的T细胞显示，外源加入的8-CPT-cAMP使敏感性明显偏移至细胞增殖抑制(图5C和表5)。而且，当MAIDS感染小鼠的T细胞和对照T细胞的最大增殖率标准化为100％时(图5C，数据未显示)，显然除了cAMP抑制曲线左移外，曲线斜率显著不同(MAIDS小鼠的T细胞的Hill系数为0.6(0.54-1.52)，正常T细胞为2.2(1.9-2.5)，表5，p<0.05)。cAMP类似物使敏感性提高到抑制，这提示，是由于I型PKA的初始cAMP结合部位B上内源cAMP增多，随后对于外源添加的cAMP类似物的A部位亲和力提高。8-CPT-cAMP使曲线斜率由协同、双配基部位结合状态转变为明显的非协同抑制曲线，也表明B部位被增多的内源cAMP占据。
表5
Figure C01814319D00391
MAIDS相对于对照；＊表示0<0.001，＊＊表示p<0.01，＊＊＊表示p<0.05
实施例2
cAMP诱导的MAIDS T细胞功能障碍是由于随着COX-2水平升高，CD11b阳性细胞的PGE2产量提高
提高的MAIDS的PGE2产量
混合淋巴结细胞群体分离自MAIDS感染的小鼠和对照小鼠，并在体外培养。培养48小时后测定培养上清液中的PGE2分泌水平，显示MAIDS感染的细胞比对照细胞多分泌7-8倍的PGE2。
PGE2生产的抑制恢复了MAIDS的T细胞增殖
然后，用抗-CD3抗体激活混合淋巴结细胞，以诱导T细胞增殖，72小时后检测[3H]-胸苷掺入。来自MAIDS感染小鼠的细胞的增殖只有未感染细胞的T细胞增殖的10-20％。然而，当向培养液中加入吲哚美辛抑制混合培养物产生PGE2时，5只MAIDS感染小鼠的细胞增殖显著提高到相当于对照小鼠的水平(图6)。观察另外10只MAIDS感染的小鼠(表6)，吲哚美辛对混合淋巴细胞培养物T细胞增殖的影响非常显著(p<0.01)。相反，用吲哚美辛处理对照培养物不改变增殖。
在MAIDS感染小鼠的淋巴结中，COX-2高水平表达
组成型表达的COX-1是产生PGE2的环加氧酶活性的正常来源。然而，在MAIDS小鼠中未发现COX-1增多，这能说明PGE2水平提高(数据未显示)。COX-2的表达通常只限于脑/脑过程、关节炎滑液和组织损伤部位。在淋巴结或淋巴细胞中未发现COX-2，如图8中对照淋巴细胞所示(上图)。我们意外地发现，来自MAIDS感染小鼠的粗淋巴结细胞表达高水平的COX-2(图8，下图)。此外，从MAIDS淋巴结正选择的CD4+和CD8+T细胞以及B细胞含有高水平的COX-2。相反，负选择的CD11b-细胞只含低水平的COX-2。
通过流式细胞术观察来自MAIDS感染小鼠和对照小鼠的CD4+和CD8+T细胞和B细胞(B220标记)，显然在T或B细胞上一般不表达CD11b标记。然而，来自MAIDS感染小鼠的CD4+T细胞和B细胞的不同级分是CD11b明亮的(门控标记的R1)，另一组CD4+T细胞和B细胞以及CD8+T细胞是CD11b暗淡的(门控标记的R2)，表明它们具有显著但较低的CD11b表达水平。因此，MAIDS感染的CD4+和CD8+T细胞亚群分别是CD11b明亮和暗淡的，而大多数B细胞为阳性。结合CD11b+细胞而不是CD11b-细胞表达COX-2的事实，表明来自MAIDS感染小鼠的淋巴结中B细胞和T细胞表达COX-2。
通过免疫组织化学观察来自MAIDS感染小鼠的完整淋巴结，很明显总体结构改变，与对照小鼠相比，MAIDS(感染后19周)中失去了生发中心(图10，c与a)。在较高放大倍数下，COX-2免疫染色的玻片显示，对照动物的淋巴结只是巨噬细胞的摄入物质在HRP染色后呈褐色(假阳性“可染色”体，图10b)，MAIDS的大多数淋巴结细胞为COX-2染色阳性(图10d)。
表6
Figure C01814319D00411
实施例3
HIV患者当用非选择性COX抑制剂体内处理时显示边际效应
方法
外周血CD3+T细胞从HIV患者中负选择
通过负选择从正常健康供体的血细胞层纯化外周血CD3+T细胞(Ullevaal大学医院血液中心，Oslo，挪威)。简言之，如下分离外周血单核细胞：密度梯度(Lymphoprep，NycoMed，Oslo，挪威)离心，随后利用直接以CD14和CD19抗体包被的单分散性磁珠和以CD56抗体包被的大鼠抗小鼠IgG珠和磁铁负选择。磁珠均购自Dynal(Oslo，挪威，目录号分别为111.12，111.04，110.11)，而抗-CD56抗体购自Pharmingen(San Diego，CA，目录号31660.d)。所有步骤都在4℃下进行。细胞悬液通过流式细胞术分析，显示含有90％以上的CD3+细胞。
利用HIV患者T细胞的增殖测定
通过在平底96孔微孔板中以100μl体积温育0.75×106 CD3+T细胞/ml进行增殖测定。以1:1的细胞：磁珠比加入绵羊抗小鼠IgG(Dynal，目录号110.02)包被的单分散性磁珠，随后加入终稀释度为1:125000的抗-CD3(克隆SpvT3b)，实现激活。开始时仔细滴定抗体的最佳浓度，始终以几个不同的抗体稀释度进行平行实验。温育细胞72小时，其中后16小时含有[3H]-胸苷，分析其增殖。洗涤细胞，收集到玻璃滤器上，随后通过β-闪烁计数分析。需要时，加入cAMP类似物，30分钟后加入抗-CD3抗体激活。8-CPT-cAMP购自Sigma(St.Louis，MO)。
实验
正在进行中的II期临床试验用于检测非选择性COX抑制剂(吲哚美辛)短期治疗对HIV感染患者T细胞代用品参数的免疫刺激作用。根据获准的方案，患者接受50mg吲哚美辛，每日3次(总剂量150mg/d)，共2周，于第0、14、28天(停止后2周)采样。然而，由于副作用如上腹部疼痛和消化不良，以及最初患者停止研究，该剂量不得不削减为25mg吲哚美辛，每日3次(总剂量75mg/d)。图11显示如今已完成研究的3名患者(患者1-3)的T细胞免疫功能(测定为激活后的增殖)。上图显示开始时(0天)、完成吲哚美辛治疗时(14天)和2周后(28天)T细胞激活后的增殖水平。如所见，患者1和2通过体内施用非选择性COX拮抗剂未提高其免疫功能。然而在患者3，T细胞反应提高约2.5倍，在停用吲哚美辛后持续高达2周。图11b下图显示在细胞培养物中与PKA-I选择性cAMP拮抗剂Rp-8-Br-cAMPS体外温育后的T细胞增殖。根据拮抗剂引起的增殖逆转，cAMP介导的T细胞功能障碍程度十分明显(比较上图与下图；在所有时间点，患者1和3的增殖约提高2倍，而患者2无影响)。从图11可以清楚地看出，吲哚美辛没有确定的作用，这可能是由于缺乏COX-2选择性以及副作用引起的剂量限制。
实施例4
HIV患者在体内施用非选择性COX抑制剂后显示边际效应(实施例3的实验的继续)
方法
使用的方法如实施例3所述。
实验
图12显示来自于7名正在进行II期临床试验(实施例3的继续)的患者的结果，他们除三联治疗外，还口服25mg吲哚美辛，每日3次，共14天。患者1-3对应于实施例3所述。施用吲哚美辛的问题是如上(实施例3)所述的副作用，这使剂量限于25mg，每日3次。在此许可剂量，该非选择性COX抑制剂的作用处于边缘。治疗14天后，7名患者中只有2名具有明显增强的T细胞免疫功能(以T细胞激活后的增殖测定)，而一名患者免疫功能降低，4名患者改变较小。停用吲哚美辛2周后，7名患者中有5名免疫反应性比第0天时提高。然而，只有2名患者T细胞增殖提高2倍以上。
实施例5
COX-2抑制剂提高体外MAIDS T细胞的免疫功能
方法
增殖测定中使用的方法如实施例1所述。PGE2测定如实施例1所述。
实验
增殖测定
混合淋巴结细胞从感染17周后的MAIDS小鼠中分离。用抗-CD3抗体激活细胞，以诱导T细胞增殖，72小时后测定[3H]-胸苷掺入，作为免疫功能的量度。MAIDS感染小鼠的细胞增殖只是未感染T细胞增殖的5-20％(MAIDS细胞为2000-12000cpm，来自未感染小鼠的细胞平均为55000cpm)。然而，当向培养液中加入罗非考昔(图13)和赛乐考昔(图14)时，MAIDS感染小鼠的细胞增殖以浓度依赖的方式提高2-3倍。相反，用罗非考昔或赛乐考昔处理未感染小鼠的对照培养物不能提高增殖(在COX-2抑制剂存在下提高0.8-1.0倍，即没有提高，未显示)。对于来自MAIDS小鼠的T细胞，产生半数最大作用(ED50)的罗非考昔和赛乐考昔浓度是，罗非考昔约0.01μM，赛乐考昔0.03μM。亚微摩尔浓度即有效的事实清楚地表明，观察到的免疫应答增强通过COX-2而不是COX-1的抑制介导，COX-1只在微摩尔浓度罗非考昔和赛乐考昔时受抑制(数值来自于Warner等人，1999，PNAS USA，96，p7563-7568)。因此，罗非考昔和赛乐考昔引起的受抑制T细胞免疫功能的逆转通过抑制COX-2使混合培养物的PGE2产量降低，因而T细胞cAMP水平降低。
PGE2产生
也分析了COX-2抑制剂罗非考昔和赛乐考昔对PGE2水平的影响。从图15可以看出，来自MAIDS小鼠的粗淋巴结细胞比来自健康小鼠的淋巴结细胞多分泌5-6倍的PGE2(见图6)。此外，感染小鼠中LPS引起的PGE2水平升高8-10倍，未感染小鼠约2倍。当细胞在COX-2抑制剂罗非考昔或赛乐考昔存在下温育时，MAIDS淋巴结细胞的PGE2分泌类似于未感染的细胞。吲哚美辛的作用(比较图7中的增殖)作为对照。
实施例6
COX-2抑制剂提高体内MAIDS T细胞的免疫功能
方法与实验
感染的小鼠(感染后17周)用对应于人用推荐剂量(考虑啮齿动物的清除率高7倍)的罗非考昔经口(即口服)处理一周。MAIDS小鼠一般发展为免疫增生综合征，伴淋巴结及脾增大。据此，未处理的感染动物平均脾重1.3g，集合淋巴结平均重1.7g。相反，接受罗非考昔7天的MAIDS小鼠平均脾重0.8g，集合淋巴结平均重0.3g，表明淋巴增生逆转。
结果示于图16中。当测定来自处理和未处理的感染小鼠的粗淋巴结细胞的T细胞免疫功能时，显然未处理的感染动物具有2000-10000cpm(平均7300cpm)的抗-CD3诱导的增殖，接受罗非考昔1周的感染小鼠对抗-CD3的T细胞反应比未处理的感染小鼠提高2.7-5.6倍。此外还证明，在Rp-8-Br-cAMPS存在下，未处理的感染小鼠其抗-CD3诱导的T细胞增殖增强，在罗非考昔处理的小鼠中，没有这种2-3倍的影响，表明体内罗非考昔处理降低PGE2水平，并逆转cAMP-介导的T细胞功能抑制。
实施例7
用罗非考昔或赛乐考昔体内处理MAIDS小鼠提高了对抗-CD3的T细胞反应和免疫应答
方法与实验
感染小鼠用相当于人用推荐剂量的罗非考昔和赛乐考昔处理(考虑啮齿动物清除率高7倍，分别为3mg/kg/d和20mg/kg/d)。肠胃外给药通过腹膜内注射以脂肪乳剂配制的COX-2抑制剂实现。结果示于图17中。
在感染18-20天后测定来自处理和未处理的感染小鼠的粗淋巴结细胞的T细胞免疫功能时，显然未处理的感染动物具有约10000cpm的抗-CD3诱导的增殖，而接受罗非考昔18-20天的感染小鼠对抗-CD3的T细胞反应比未处理的感染小鼠约提高2倍。类似地，赛乐考昔使大多数注射小鼠的细胞的免疫应答提高到约为未处理、未感染小鼠的3倍。
实施例8
美洛昔康体内处理MAIDS小鼠提高T细胞免疫功能
方法与实验
感染和健康小鼠用2.8mg/kg/d美洛昔康处理，考虑到啮齿动物的清除率高7倍，该剂量相当于人用的推荐剂量。肠胃外给药通过皮下植入充满水溶性吲哚美辛注射化合物的渗透泵实现。估测T细胞功能，结果示于图18中。
在处理2周后测定来自处理和对照(PBS)处理的感染小鼠的粗淋巴结细胞的T细胞免疫功能时，显然PBS处理的感染动物具有约500cpm的抗-CD3诱导的增殖，而接受美洛昔康14天的感染小鼠对抗-CD3的T细胞应答比只接受PBS的感染小鼠显著提高(图18a，10倍以上，p<0.05)。
当在3天体外T细胞增殖测定中向细胞培养物中补加美洛昔康以阻止美洛昔康体内抑制缓解，从而阻止COX-2的重新激活时，美洛昔康处理组的免疫应答比不加美洛昔康组高2倍(p＝0.005)，与体内接受PBS的MAIDS小鼠相比，作用也很显著(图18b，p<0.05)。
相反，已经证明，当向抗-CD3刺激的混合淋巴结体外培养物中加入I型PKA选择性cAMP拮抗剂Rp-8-Br-cAMPS时，只有体内接受PBS的MAIDS小鼠的免疫应答提高，而美洛昔康处理小鼠不提高(图18c)。cAMP拮抗剂在美洛昔康处理的MAIDS小鼠中不起作用这一事实表明，体内美洛昔康处理降低或消除了cAMP诱发的MAIDS的免疫缺陷，并且恢复了免疫功能。

Claims (18)

1.COX-2抑制剂在生产用于减轻或缓解患有免疫功能障碍的人的HIV或AIDS中免疫功能障碍的药物中的用途，在IC80下根据WHMA测定法，所述COX-2抑制剂的COX-1：COX-2选择性比>5，其中所述COX-2抑制剂是通式B的化合物或其药学上可接受的盐：
Figure C01814319C00021
其中
Y代表环基；
n是0至3的整数；
m是0至4的整数；
R6代表酮环基、环烷基或芳基，该基团可任选地被一个或多个基团或原子取代；
R7分别代表可以是任意一种功能基团的取代基；
R8代表烷基或NHR10；
R9代表卤素原子；以及
R10代表氢原子或烷基，该烷基任选地可被一个或多个基团或原子取代。
2.如权利要求1所述的用途，其中在IC80下根据WHMA测定法，所述COX-2抑制剂的COX-1：COX-2选择性比>50。
3.如权利要求1或2所述的用途，其中Y是噁唑基、异噁唑基、噻吩基、二氢呋喃基、呋喃基、吡咯基、吡唑基、噻唑基、咪唑基、异噻唑基、环戊烯基、苯基或吡啶基。
4.如权利要求1或2所述的用途，其中R6是被一个或多个卤素原子取代的酮环基、环烷基或芳基。
5.如权利要求1或2所述的用途，其中R7分别代表氢或卤素原子，或烷基，该烷基可以被一个或多个基团或原子取代。
6.如权利要求1或2所述的用途，其中R10是被一个或多个酰基取代的烷基基团。
7.如权利要求1或2所述的用途，其中R8是-NH2或-CH3。
8.如权利要求1或2所述的用途，其中Y是吡唑基、呋喃基或噻吩基。
9.如权利要求1或2所述的用途，其中R6是芳基，其任选地用一个或多个氟原子取代。
10.如权利要求1或2所述的用途，其中n是1或2。
11.如权利要求1或2所述的用途，其中R7是溴原子、酰基或取代的烷基。
12.如权利要求1或2所述的用途，其中所述COX-2抑制剂是赛乐考昔、罗非考昔、DuP-697、SC-58125、DFU或MF三环。
13.如权利要求12所述的用途，其中所述COX-2抑制剂是罗非考昔。
14.如权利要求12所述的用途，其中所述COX-2抑制剂是赛乐考昔。
15.一种药物组合物，其含有如权利要求1至14任意一项所述的COX-2抑制剂或其药学可接受的盐，以及药学上可接受的稀释剂、载体或赋形剂，用于减轻或缓解患有免疫功能障碍的人的HIV或AIDS中的免疫功能障碍。
16.如权利要求15所述的药物组合物，其还含有一种或多种其它COX-2抑制剂或其药学上可接受的盐，和/或一种或多种其它活性成分。
17.一种产品，其含有如权利要求1至14任意一项所述的COX-2抑制剂或其药学上可接受的盐，以及一种或多种其它COX-2抑制剂或其药学上可接受的盐，和/或一种或多种其它活性成分，其作为组合制剂，用于同时、分开或连续用于减轻或缓解患有免疫功能障碍的人的HIV或AIDS中的免疫功能障碍。
18.如权利要求15或16所述的药物组合物在生产用于减轻或缓解患有免疫功能障碍的人的HIV或AIDS中的免疫功能障碍的药物中的用途。
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