JP4167733B2 - ＮＦ−κＢ活性化抑制剤 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、抗ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）剤、炎症予防・改善剤、成人病予防・改善剤、癌転移抑制剤として有用なＮＦ−κＢ（Nuclear Factor-Kappa B）活性化抑制剤、遺伝子発現調節剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
発生、分化、増殖、恒常性の維持などの高次の生命現象は、ある特定の遺伝的プログラムに従って正確に行われるが、それは個々の細胞における特異的な遺伝子の発現調節を通した細胞レベルにおける活性化、分化、増殖によって制御されている。これらの変化は遺伝情報の発現が起こるべき細胞へ、その外界からサイトカインやホルモンなどの刺激が加わり、細胞膜上の受容体に結合することにより始まり、種々の生化学的反応を経て最終的に核にシグナルを伝達し、遺伝子発現の変化を引き起こす。このような遺伝子発現の制御は主として遺伝子の転移レベルで行われていることが知られている。
【０００３】
外界からの刺激によって発現誘導される遺伝子群は、刺激により迅速に再活性化され得る状態にある。どの遺伝子が選択的に活性化されるかは遺伝子の発現制御領域に存在する特別な塩基配列、及びこれらのシスエレメントに特異的に結合する転写調節因子が存在するか否かによって決定される。つまり外界からの刺激によって転写調節因子が量的又は質的に活性化すれば遺伝子の発現が起こる。
【０００４】
転写調節因子のうちＮＦ−κＢは、ｐ５０及びｐ６５の２種類のサブユニットから成る蛋白質であり、非刺激時には阻害蛋白質Ｉ−κＢと結合して細胞質に存在している。この細胞質にＩＬ−１やＴＮＦ−αなどによる刺激が加わると、この刺激によって活性化されたキナーゼにより、Ｉ−κＢが不活性化され、放出されたＮＦ−κＢが核へ移行して転写の活性化が起こると考えられている。
【０００５】
ＮＦ−κＢにより活性化される、すなわち発現制御配列にＮＦ−κＢの結合するシスエレメントを持つ遺伝子は、ＩＬ−１（Interleukin-1）、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１２、ＩＦＮ−β（Interferon-β）、ｉＮＯＳ（Inducible nitric oxide synthase）、Ｇ−ＣＳＦ（Granulocyte colony stimulating factor）、ＧＭ−ＣＳＦ（Granulocyte macrophage colony stimulating factor）、ＴＮＦα（Tumor necrosis factor α）、ＣＯＸ−２（Cyclooxygenase-2）のような炎症性サイトカイン、ＥＬＡＭ−１（E-Selectin）、ＩＣＡＭ−１（CD54）、ＶＣＡＭ−１（CD106）のような細胞接着、細胞浸潤、癌転移の過程に重要な細胞接着分子などに関するものが多いことが知られている。また、ＭＭＰ−２，９（Matrixmetalloproteinase）のようなガン細胞の血管外への浸潤、転移に深く関与する酵素の活性化にもＮＦ−κＢの活性化が深く関与していることが知られていることから、ＮＦ−κＢ活性化抑制物質は抗炎症剤、癌転移抑制剤として期待されている。従って、ＮＦ−κＢ活性化抑制剤が有効に発現調節しうる遺伝子として、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１２、ＴＮＦ、ＩＦＮ、ｉＮＯＳ、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＣＯＸ−２、ＥＬＡＭ−１、ＩＣＡＭ−１、ＶＣＡＭ−１、ＭＭＰ−９等が挙げられる。また、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）は宿主細胞のＮＦ−κＢによりその転写が活性化され、ウイルスの増殖と感染の拡大が進むと考えられており、従って、ＮＦ−κＢの活性化抑制物質は、ＨＩＶ感染症（ＡＩＤＳ）の治療に有効であると期待されている（実験医学：９巻16号，68-, 199：Annu. Rev. Immunol.:12巻, 141-, 1994、Advances in Immunology:58巻, 1-、Science:265巻, 956-, 1994）。
【０００６】
成人病の一つである粥状動脈硬化発生の初期には、細胞内に大量のエステル化コレステロールを蓄積した泡沫細胞と呼ばれる単球マクロファージ由来の細胞の、血管内皮下での局所的な集簇が認められる。また、粥状動脈硬化巣にはＴリンパ球の存在も知られている。このような動脈硬化巣においてもＮＦ−κＢが活性化されていることが知られており、ＮＦ−κＢの活性化は動脈硬化発症過程における重要な初期ステップとして認識されている（J. Clin. Invest., 97, 1715-, 1996）。また、肝炎、腎炎、関節リウマチ組織においてもＮＦ−κＢの活性化が誘導されていることとも報告されている。従って、ＮＦ−κＢ活性化抑制剤は、動脈硬化や、肝炎、腎炎、関節リウマチ等の成人病の予防・改善剤として有効である。
【０００７】
このように、動脈硬化症や肝炎のような多くの成人病や各種の炎症、ウイルス性疾患、癌の転移にはＮＦ−κＢの活性化が極めて重要な役割を果していることが明らかとなっており、また、理論的にも、細胞実験レベルにおいても動物実験レベルにおいてもＮＦ−κＢ活性化抑制物質がこれら疾患の予防・改善に有効であることが認識されるに至っていることから、本出願人を含め多くの研究者がこれら疾患の制御を目的にＮＦ−κＢ活性化抑制物質の探索を行っている。
このような疾病制御の観点から、これまでにＮＦ−κＢの活性化を抑制する物質の探索が行われ、本出願人によって先に報告された没食子酸誘導体（特願平7-215983号）、Ｎ−アセチルシステインやピロリジンジチオカーボネート（The Journal of Immunology, 1994, 153:2681-）、アスピリンやサリチル酸ナトリウム（Science, 1994, 265(12):956-）、ベンゾキノン誘導体（特開平7-297860号、特開平7-291859号公報）、バナジウムコンプレックス（DE4336642）、ペルバナデート（J. Biological chem., 270(18)10631-10639, 1995）、フェニルアルシンオキシド（J. Biological chem., 270(18)10631-10639, 1995）、サイクリックイミド誘導体（WO9501348）、トシルフェニルクロロメチルケトン、ジイソクマリン、α−トコフェリルサクシネート、ペントキシフィリン、ベンゾキノン誘導体（特開平7-291860号公報）などが報告されている。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
従って、本発明の目的は、高い効力を有するＮＦ−κＢの活性化抑制剤及びこの作用に基づく優れた遺伝子発現調節剤、抗ヒト免疫不全ウイルス剤、炎症予防・改善剤、成人病予防剤、癌転移抑制剤を提供することにある。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
このような実情に鑑み、本発明者は鋭意研究を行った結果、特定のリグナン類が優れたＮＦ−κＢ活性化抑制作用を有することを見出し、本発明を完成した。
【００１０】
すなわち、本発明は次の一般式（１）
【００１１】
【化２】
【００１２】
（式中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3及びＲ4は同一又は異なって水素原子、ヒドロキシル基、アルキル基、ヒドロキシアルキル基又はアルコキシ基を示す）
で表されるリグナン類を有効成分とするＮＦ−κＢ活性化抑制剤（但し、抗腫瘍剤、肝臓障害改善剤、リューマチ性関節炎処置剤、移植時における免疫又は拒絶反応処置剤、乾癬処置剤及びマラリア処置剤として使用する場合を除く）、インターロイキン−１（ＩＬ−１）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、インターロイキン−８（ＩＬ−８）、インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）、インターフェロン−β（ＩＦＮ−β）、ＮＯ合成酵素（ｉＮＯＳ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、シクロオキシゲナーゼ−２（ＣＯＸ−２）、ＥＬＡＭ−１、ＩＣＡＭ−１、ＶＣＡＭ−１、マトリクスメタロプロテアーゼ−９（ＭＭＰ−９）、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦより選ばれる１又は２以上の物質の遺伝子発現調節剤（但し、抗腫瘍剤、肝臓障害改善剤、リューマチ性関節炎処置剤、移植時における免疫又は拒絶反応処置剤、乾癬処置剤及びマラリア処置剤として使用する場合を除く）を提供するものである。
【００１３】
【発明の実施の形態】
リグナン類は植物においてはヒノキ科のアスナロ（Thujopsis dolabrata）（Chem. Pharm. Bull. 20(6)1150-1155(1972)）などに見出されている他、種々の合成法が報告されており（Natural Product Report, 183-205(1995)）、また、これまでに一部のリグナンに抗ヘルペスウイルス活性、抗サイトメガロウイルス活性や癌細胞（mouse leukemia, human lung carcinoma, human colon carcinoma）増殖抑制活性（Planta Med. 59,246-249(1993)）、血小板へのＰＡＦ（Platelet activating factor）の結合阻害（Natural Product Report, 183-205(1995)）などが報告されているが、そのＮＦ−κＢ活性化抑制作用については全く知られていない。
【００１４】
本発明で用いられるリグナン類は、前記一般式（１）で表されるものであり、式中Ｒ1 〜Ｒ4 は同一又は異なって水素原子、ヒドロキシル基、アルキル基、ヒドロキシアルキル基又はアルコキシ基を示し、アルキル基としては炭素数１〜１０のものが好ましく、例えばメチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、ヘプチル基、オクチル基、ノニル基、デシル基などの直鎖又は分岐鎖のものが挙げられる。ヒドロキシアルキル基としては、炭素数１〜１０の直鎖又は分岐鎖のものが好ましく、例えばヒドロキシエチル基などを挙げることができる。また、アルコキシ基としては炭素数１〜１０の直鎖又は分岐鎖のものが好ましく、例えばメトキシ基、エトキシ基、ｎ−プロピルオキシ基、イソプロピルオキシ基、ｎ−ブチルオキシ基、ｓｅｃ−ブチルオキシ基、ｔｅｒｔ−ブチルオキシ基、ペンチルオキシ基、ヘキシルオキシ基、ヘプチルオキシ基、オクチルオキシ基、ノニルオキシ基、デシルオキシ基等を挙げることができる。
これらのうち、一般式（１）においてＲ1 が水素原子、ヒドロキシル基又は炭素数１〜３のアルコキシ基であり、Ｒ2 、Ｒ3 及びＲ4 がヒドロキシル基又はメトキシ基で表されるものが特に好ましい。
【００１５】
このようなリグナン類（１）は、例えばアスナロ（主に葉部、小枝部）から抽出することができる。抽出は、アスナロ又はその乾燥末を水、有機溶媒（石油エーテル、ｎ−ヘキサン、シクロヘキサン、四塩化炭素、トルエン、ベンゼン、ジクロロメタン、クロロホルム、エーテル、酢酸エチル、ブタノール、アセトン、プロパノール、エタノール、メタノール、ピリジン、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、ブチレングリコール等）、水性アルコール等を用い、通常３〜７０℃で抽出処理することにより行う。
【００１６】
アスナロ原体からの好ましい具体的抽出例としては、アスナロの乾燥粉砕物１００ｇをエタノール１リットルに浸漬し、室温で時々攪拌しながら７日間抽出を行い、得られた抽出液をろ過し、ろ液を５℃で３日間静置した後、再度ろ過して上澄みを得る方法が挙げられる。次いで得られた抽出液から溶媒を留去して得られた残渣を、適宜メタノール、エタノール、酢酸エチル等の溶媒に溶解し、更に水、メタノール、エタノール、酢酸エチル、クロロホルム、ジクロロメタン、ヘキサン、アセトン、ベンゼン等を溶出溶媒として、アンバーライトＸＡＤ−２、ダイアイオンＨＰ−２０、ＴＳＫゲルＨＷ−４０等の親水性ポリマーやセファデックスＬＨ−２０等のセファデックス、逆相系シリカゲルやシリカゲル、セルロース等を担体に用いたカラムクロマトグラフィーに付し、薄層クロマトグラフィーなどで目的成分を確認しながら分画することにより目的物を得ることができる。また、場合によりベンゼン、エーテル、ヘキサン、アセトン、メタノール、エタノール、水等の適当な溶媒を用いて再結晶することにより精製してもよい。
【００１７】
また、文献記載の方法（Natural Product Report, 183-205(1995)等）により種々の誘導体を合成することができ、その由来は特に限定されるものではない。
【００１８】
本発明のＮＦ−κＢ活性化抑制剤には、リグナン類に加えて、既存の抗炎症剤、抗アレルギー剤、抗ヒスタミン剤等の薬物を任意に組合わせて配合することができ、また、通常用いられる賦形剤及びその他の添加剤とともに任意の形態に製剤化される。かかる賦形剤、添加剤の例として、固形状のものとしては乳糖、カオリン、ショ糖、結晶セルロース、コーンスターチ、タルク、寒天、ペクチン、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム、レシチン、塩化ナトリウム等が挙げられ、液状のものとしてはグリセリン、落花生油、ポリビニルピロリドン、オリーブ油、エタノール、ベンジルアルコール、プロピレングリコール、水等が挙げられる。
【００１９】
本発明の医薬は、その剤型に応じて経口、経腸、外用、注射、点眼、点鼻、吸入、経粘膜等いずれの経路によってもヒトに投与することができる。またその投与量は、年齢、体重、性別、症状、治療効果、投与方法、処理時間等の種々の要因によって異なり、特に限定されないが、経口投与の場合は通常大人１人当たり１回に０．１〜２０００mg、特に１０〜４００mgの範囲を１日１回〜数回に分けて投与することが好ましい。また、非経口投与の場合は、通常大人１人当たり１回に０．１〜２０００mg、特に１０〜４００mgの範囲を１日１回〜数回投与することが好ましい。
【００２０】
本発明の医薬の剤型としては特に限定されず、例えば錠剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、坐剤、トローチ剤、シロップ剤、乳液、液剤（ドリンク剤）、軟ゼラチンカプセル、クリーム、ゲル、ペースト、スプレー、注射剤等が挙げられる。
錠剤の形態にする場合は、担体としては、この分野で公知のものを広く使用できる。これには、例えば澱粉、乳糖、ショ糖、カルボキシメチルセルロース、コーンスターチ、無機塩類、尿素等の賦形剤；水、エタノール、プロパノール、単シロップ、ブドウ糖、澱粉液、ゼラチン溶液、カルボキシメチルセルロース、セラック、メチルセルロース、リン酸カリウム、ポリビニルピロリドン等の結合剤；乾燥澱粉、アルギン酸ナトリウム、カンテン末、ラミナラン末、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウム、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸モノグリセライド、澱粉、乳糖等の崩壊剤；白糖、ステアリン、カカオバター、水素添加油等の崩壊抑制剤；ラウリル硫酸ナトリウム、第４級アンモニウム塩等の吸収促進剤；グリセリン、澱粉等の保湿剤；澱粉、乳糖、カオリン、ベントナイト、コロイド状ケイ酸等の吸着剤；ステアリン酸塩、ホウ酸末、精製タルク、ポリエチレングリコール等の滑沢剤等が挙げられる。更に錠剤は必要に応じて通常の剤皮を施した錠剤、例えば糖衣錠、ゼラチン被包錠、腸溶包錠、フィルムコーティング錠あるいは二重錠、多層錠とすることができる。
【００２１】
丸剤の形態にする場合には、担体としてはこの分野で公知のものを広く使用でき、これには、例えば澱粉、乳糖、ブドウ糖、カカオ脂、硬化植物油、カオリン、タルク等の賦形剤；アラビアゴム末、トラガント末、ゼラチン、エタノール等の結合剤；ラミナランカンテン等の崩壊剤等が挙げられる。
【００２２】
坐剤の形態にする場合は、担体としてはこの分野で公知のものを広く使用でき、これには例えばカカオ脂、ゼラチン、ポリエチレングリコール、高級アルコール、高級アルコールのエステル類、半合成グリセリド等を挙げることができる。
【００２３】
注射剤として調製する場合は、液剤及び懸濁剤は殺菌され、かつ血液と等張であることが望ましく、これら液剤、懸濁剤及び乳剤の形態にする場合は、希釈剤として、この分野において慣用されているものを利用することができる。例えば水、エチルアルコール、プロピレングリコール、エトキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレン化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類等を挙げることができる。尚、この場合、等張性の水溶液を調製するに十分な量の食塩、ブドウ糖、グリセリン等を医薬製剤中に含有せしめてもよく、また通常の溶解補助剤、緩衝剤、無痛化剤等を添加してもよい。更に必要に応じて着色剤、保存剤、香料、風味剤、甘味剤や他の医薬品を医薬製剤中に含有せしめてもよい。
【００２４】
また、噴霧剤の形態にする場合には、分散剤及び噴射剤はこの分野で公知のものを広く使用でき、分散剤としては例えば大豆レシチン、卵黄レシチン類、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸等の脂肪酸、ソルビタントリオレート、ソルビタンモノオレート等のソルビタン類等を用いることができる。また噴射剤として例えばフレオン１１、フレオン１２、フレオン１１４等の通常不燃性液化ガスを用いることができる。
【００２５】
軟膏の形態にする場合にもこの分野で公知のものを広く使用でき、例えば水、エタノール、イソプロピルアルコール、グリセリン、ポリエチレングリコール、ソルビトール、ポリビニルアルコール等の多価アルコール、動物性油脂、植物性油脂、鉱物油、硬化油、ミツロウ等のワックス、液状パラフィン、パラフィンロウ等の高級炭化水素、ステアリン酸等の脂肪酸、乳化剤、アニオン界面活性剤、カチオン界面活性剤、両性界面活性剤といった界面活性剤、キサンタンガム、アルギン酸ナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシビニルポリマー等の水溶性高分子化合物等を使用することができる。また、色素、保存剤、香料等も必要に応じて配合してもよい。
【００２６】
リグナン類（１）が製剤中に配合されるべき量としては特に限定されず、広範囲に適宜選択されるが、通常製剤中１〜７０重量％、特に１〜３０重量％であるのが好ましい。
【００２７】
【発明の効果】
本発明のリグナン類は優れたＮＦ−κＢ活性化抑制作用を有し、遺伝子発現調節剤、抗炎症剤、抗ヒト免疫不全ウイルス剤、癌転移抑制剤、炎症予防・改善剤、成人病予防剤として有用である。従って、これを有効成分として含有する製剤は、そのＮＦ−κＢ活性化抑制作用、遺伝子発現調節作用に基づき、ヒト免疫不全感染症（ＡＩＤＳ）、気管支炎、アレルギー性鼻炎、関節炎、腎炎、肝炎、乾せん、蕁麻疹、接触皮膚炎、アトピー性皮膚炎、ＵＶ炎症、関節リウマチ、喘息、動脈硬化、各種癌転移等の予防・治療に広く用いることができる。
【００２８】
【実施例】
次に、実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００２９】
製造例１
アスナロ乾燥粉砕物（１８０ｇ）をエタノール１Ｌに浸漬し、室温において時々攪拌しながら７日間抽出を行い、得られた抽出液を濾過し、濾液を５℃において３日間静置した後、再度濾過し、上澄みを得た。次に溶媒を留去して得られた残渣（２．４ｇ）をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル、ＣＨＣｌ3：ＣＨ3ＯＨ、Ｈ2Ｏ：ＣＨ3ＯＨ）、高速液体クロマトグラフィー（ＹＭＣ−ＯＤＳ Ｓ−１０、ＹＭＣ社製）に供し、化合物１（一般式（１）において、Ｒ1＝Ｈ、Ｒ2＝Ｒ3＝Ｒ4＝ＯＣＨ3）２５mgを得た。
【００３０】
製造例２
製造例１と同様にして、化合物２（一般式（１）において、Ｒ1＝ＯＨ、Ｒ2＝Ｒ3＝Ｒ4＝ＯＣＨ3）１０mgを得た。
【００３１】
製造例３
製造例１と同様にして、化合物３（一般式（１）において、Ｒ1＝Ｒ2＝Ｒ3＝Ｒ4＝ＯＣＨ3）２１mgを得た。
【００３２】
製造例４
製造例１と同様にして、化合物４（一般式（１）において、Ｒ1＝Ｈ、Ｒ2＝Ｒ4＝ＯＣＨ3、Ｒ3＝ＯＨ）１５mgを得た。
【００３３】
試験例１ ＮＦ−κＢ活性化抑制試験：
（ａ−１）ケラチノサイトの調製
正常ヒトケラチノサイトをＴ−２５フラスコで培養し、サブコンフルエントに達した時点で成長因子類を含まない培地（K-110(-)）（極東製薬（株）製）（５ml）で１度洗浄し、Ｋ−１１０（−）（５ml）で１日培養する。その後新たなＫ−１１０（−）に置き換え、刺激物質（最終濃度IL-1α:1.25ng/ml、TNFα:1.25ng/ml又はLPS（リポポリサッカライド ):10μg/ml）を添加し、更に１時間培養する。培養後、細胞をＰＢＳ（−）で洗浄し、下記の方法により核蛋白質の抽出を行った。尚、被験物質（最終濃度100nM）はＵＶＢ（紫外線）照射の１５時間前に細胞に添加した。
【００３４】
（ａ−２）ＵＶＢ照射ケラチノサイトの調製
正常ヒトケラチノサイトをＴ−２５フラスコで培養し、サブコンフルエントに達した後、成長因子類を含まない培地（K-110(-)で１度洗浄し、Ｋ−１１０（−）（５ml）で１日培養する。その後ＰＢＳ（−）（５ml）で２度洗浄し、ＰＢＳ（−）（２ml）存在下、ＵＶＢ（15mJ/cm2）を照射する。照射後ＰＢＳを除去し、Ｋ−１１０（−）を５ml添加し、２時間培養する。培養後細胞をＰＢＳ（−）で洗浄し、下記の方法により核蛋白質の抽出を行った。尚、被験物質（最終濃度100nM）はＵＶＢ照射の１５時間前に細胞に添加した。
【００３５】
（ｂ）血管内皮細胞の調製
コラーゲン（Ｉ）コートしたＴ−２５フラスコ内にてＥ−３００培地（極東製薬（株）製）中でコンフルエントとなった正常ヒト臍帯由来血管内皮細胞に被験物質（100nM）を添加する。１５時間後に刺激物質（最終濃度IL-1a:1.25ng/ml、TNFa:1.25ng/ml又はPMA（ホルボール12−ミリステート13−アセテート）:10ng/ml ）を添加し１時間培養する。培養液を除去した後ＰＢＳ（−）にて洗浄し、下記の方法により核蛋白質の抽出を行った。
【００３６】
（ｃ）核蛋白質の抽出
培養液除去後ＰＢＳ（−）にて洗浄した細胞に、バッファーＡ（10mM HEPES-NaOH(pH7.9), 1.5mM MgCl2, 10mM KCl, 1.0mMジチオスレイトール(DTT), 0.5mMα−フェニルメタンスルホニルフロライド(PMSF), ２μg/mlアプロチニン，２μg/mlペプスタチン）１mlを加え、セルスクレイパーを用いて細胞を剥離回収する。遠心処理（12000rpm, 10分間）し、上清を除去した後バッファーＢ（バッファーＡ＋0.1％ Triton X）８０μｌを添加し、ピペッティングにより細胞を懸濁させ、氷上に１０分間放置する。遠心処理（14000rpm, 10分間）後、上清を除去し、バッファーＣ（20mM HEPES-NaOH(pH7.9), 1.5mM MgCl2, 420mM NaCl, 1.0mM DTT, 0.5mM PMSF, 0.2mM EDTA, ２μg/mlアプロチニン，２μg/mlレプスタチン, 25％グリセロール）７０μｌを加え、ピペッティングにより細胞を懸濁させ、氷上に３０分間放置する。遠心処理（15000rpm, 20分間）後、上清を核蛋白抽出物として回収する。核蛋白質は、１mg/ml に調整し、ゲルシフトアッセイに用いた。
ゲルシフトアッセイは基本的にはPromega社製のゲルシフトアッセイシステムを用いて行った。１mg/ml の核蛋白質（２μｌ），Ｈ2Ｏ（４又は５μｌ），結合バッファー（50mM Tris-HCl(pH7.5), 5.0mM MgCl2, 250mM NaCl, 2.5mM DTT, 2.5mM EDTA, 20％グリセロール,0.25mg/mlポリ(dI-dC)ポリ(dI-dC)）（２μｌ）、競合物質（NF-κBオリゴヌクレオチド）、非競合物質（OCT1オリゴヌクレオチド）（１又は０μｌ）を混合し、室温で１０分間放置する。その後、予めＴ４−ポリヌクレオチドキナーゼにより32Ｐラベルした下記32Ｐ−ＮＦ−κＢコンセンサス オリゴヌクレオチド（１μｌ）を添加、更に室温で２０分間放置し、その後ゲルローディングバッファー（250mM Tris-HCl(pH7.5), 0.2％ BPB, 40％グリセロール）（１μｌ）を加え反応を停止させる。
【００３７】
ＮＦ−κＢコンセンサス オリゴヌクレオチド
５′−ＡＧＴＴＧＡＧＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＣＡＧＧＣ−３′
３′−ＴＣＡＡＣＴＣＣＣＣＴＧＡＡＡＧＧＧＴＣＣＧ−５′
【００３８】
次に０．５Ｘ ＴＢＥ（トリス／ホウ酸／EDTA）バッファー中、ポリアクリルアミドゲル（５％）電気泳動に供し、ゲルを乾燥後、オートラジオグラフィーを行い、ＤＮＡプローブの移動度の変化からＮＦ−κＢ活性化抑制効果を評価した。評価は、バイオイメージングアナライザーＢＡＳ２０００（フジフィルム社製）により各バンドの放射活性を測定し、ＩＬ−１無刺激のときのＮＦ−κＢの放射活性の値、ＩＬ−１のみで刺激した場合の放射活性の値から、各被験物質で処理した場合のＮＦ−κＢの活性化の程度をＮＦ−κＢ活性化抑制率として算出することにより行った。結果を表１に示す。尚、シフトしたバンドが目的のものであるか否かを検証するため、非標識プローブによる競争実験を同時に行った。
【００３９】
【表１】
【００４０】
この結果、本発明のリグナン類が優れたＮＦ−κＢ活性化抑制作用を有することが判明した。
【００４１】
試験例２ ＲＴ−ＰＣＲによるｍＲＮＡ発現量の解析：
ヒトケラチノサイトに紫外線を照射する実験系において各種遺伝子のｍＲＮＡの発現に対するリグナン類の効果について評価した。
（ａ）ケラチノサイトの調製
正常ヒトケラチノサイトをＴ−２５フラスコで培養し、サブコンフルエントに達した後成長因子類を含まない培地（K-110(-)）（極東製薬（株）製）で１度洗浄し、Ｋ−１１０（−）（５ml）で１日培養する。その後ＰＢＳ（−）（５ml）で２度洗浄し、ＰＢＳ（−）（２ml）存在下、ＵＶＢ（15mJ/cm2）を照射する。照射後ＰＢＳを除去、Ｋ−１１０（−）を５ml添加し、４時間培養する。４時間後細胞をＰＢＳ（−）で洗浄し、Isogen（１ml）（和光純薬製）を加え、常法に従いトータルＲＮＡを抽出した。尚、被験物質（化合物３）（最終濃度100nM）はＵＶＢ照射の１５時間前に細胞に添加した。
【００４２】
（ｂ）ｃＤＮＡの合成とＲＴ−ＰＣＲ
Takara（株）のＲＮＡ ＰＣＲキットを用いて逆転写及びＰＣＲを行った。
トータルＲＮＡ（500ng/3.5μl）(3.5μl)，２５mM MgCl2(４μl)，１０×ＰＣＲバッファー（100mM Tris-HCl(pH8.3), 500mM KCl）(2μl), ｄＮＴＰ混合物(2.5mM)(８μl), ＲＮａｓｅインヒビター（40U/μl)(0.5μl), リバース トランスクリプターゼ（５U/μl）(1μl), オリゴ d(T)18(50pmol/μl)(1μl)をＰＣＲチューブ中で混合し、サーマルサイクラーを用い、４２℃で６０分間、５２℃で３０分間、９９℃で５分間、４℃で１０分間反応を行いｃＤＮＡを合成した。
ＰＣＲはｃＤＮＡ（４μｌ），２５mM MgCl2（４μｌ），１０×ＰＣＲバッファー（1.6μl），Ｈ2Ｏ（11.1μl), Ｔａｑポリメラーゼ（５U/μl）(0.1μl), Ｒｅｄｉ Ｌｏａｄ(2μl), ２０uMプライマーＦ，Ｒ（各0.2μl)を混合し、サーマルサイクラーを用い、（１）９４℃で１分間、（２）９４℃で１分間、６０℃で２分間、７２℃で９０秒間を１サイクルとしこれを所定の回数（15〜40サイクル）繰り返してＤＮＡを増幅し、（３）４℃で反応を行った。ＰＣＲ増幅産物は１．５％アガロース／ＴＡＥゲル電気泳動（200V,30分間）に供し、０．３μl/ml ＥｔＢｒ／ＴＡＥで３０分染色、Ｈ2Ｏで１５分間洗浄した後、ＦＭ−ＢＩＯ（日立製）により解析した。この時、各バンドの濃さを測定し、ＵＶＢ未照射の値と、照射時の値から各物質で処理した場合の各遺伝子の発現の程度をｍＲＮＡを抑制率として算出した。抑制率は無刺激時を１００、刺激時を０として算出した。その結果を表２に示す。
【００４３】
【表２】
【００４４】
＊：プライマー配列
ＩＬ−６−Ｆ：ＡＴＧＡＡＣＴＣＣＴＴＣＴＣＣＡＣＡＡＧＣＧＣ
ＩＬ−６−Ｒ：ＧＡＡＧＡＧＣＣＣＴＣＡＧＧＣＴＧＧＡＣＴＧ
（Nature 324, 73-(1986)）
ＩＬ−８−Ｆ：ＡＴＧＡＣＴＴＣＣＡＡＧＣＴＧＧＣＣＧＴＧＧＣＴ
ＩＬ−８−Ｒ：ＴＣＴＣＡＧＣＣＣＴＣＴＴＣＡＡＡＡＡＣＴＴＣＴＣ
（Cytokine 1,2-(1986)）
ｉＮＯＳ−Ｆ：ＣＧＧＴＧＣＴＧＴＡＴＴＴＣＣＴＴＡＣＧＡＧＧＣＧＡＡＧＡＡＧＧ
ｉＮＯＳ−Ｒ：ＧＧＴＧＣＴＧＣＴＴＧＴＴＡＧＧＡＧＧＴＣＡＡＧＴＡＡＡＧＧＧＣ
（Proc. Natl. Acad. Sci., 90, 3491-(1993)）
ＣＯＸ−２−Ｆ：ＴＴＣＡＡＡＴＧＡＧＡＴＴＧＴＧＧＧＡＡＡＡＴ
ＣＯＸ−２−Ｒ：ＡＧＡＴＣＡＴＣＴＣＴＧＣＣＴＧＡＧＴＡＴＣＴＴ
（J. Biol. Chem., 269, 11769-(1994)）
【００４５】
この結果、本発明のリグナン類が優れた炎症性メディエーター遺伝子発現調節作用を有することが判明した。
【００４６】
試験例３ ノーザンブロットによる細胞接着分子ｍＲＮＡ発現量の解析：
血管内皮細胞における細胞接着分子ｍＲＮＡの発現とリグナン類の効果につきノーザンブロットにより解析した。
（ａ）血管内皮細胞の調製
コラーゲン（Ｉ）コートしたＴ−７５フラスコ内にてＥ−３００培地中でコンフルエントとなった正常ヒト臍帯由来血管内皮細胞に、被験物質（化合物３：最終濃度100nM）を添加する。１５時間後にヒトＴＮＦαを最終濃度１．２５ng／mlとなるよう添加し、３時間培養する。培養液除去後ＰＢＳ（−）にて洗浄し、Invitrogen社製Micro-Fast Track mRNA Isolationキットを用いてPoly−Ａ+ＲＮＡを単離した。
【００４７】
得られたｍＲＮＡはアガロースゲル電気泳動に供した後、Hybond−Ｎ+ ナイロン膜（アマシャム社製）に転写、ＵＶ固定を行いフィルターを作成した。次いで鮭精子ＤＮＡで６時間プレハイブリダイゼーションを行った後、ELAM-1, ICAM-1 GAPDH（Takara（株）製）の32Ｐ−ｃＤＮＡプローブと４２℃で１８時間ハイブリダイズした。終了後フィルターは２Ｘ−ＳＳＣ−０．２％ＳＤＳ溶液にて洗浄し、ＢＡＳ２０００によりｍＲＮＡ発現量を解析した。この時、各バンドの濃さを測定し、ＵＶＢ未照射の値と、照射時の値から各物質で処理した場合の各遺伝子の発現の程度を抑制率として算出した。その結果を表３に示す。
【００４８】
【表３】
【００４９】
この結果、本発明のリグナン類が優れた細胞接着分子遺伝子発現抑制作用を有することが判明した。
【００５０】
以上のように、本発明のリグナンは優れたＮＦ−κＢ活性化抑制作用と、炎症及び癌転移に深く関与する遺伝子の発現調節作用を有しており、それに基づき抗ヒト免疫不全ウイルス剤、炎症の予防・改善剤、成人病予防剤、癌転移抑制剤として有効に用いることができる。
【００５１】
実施例１ 注射剤
下記成分を注射用蒸留水５mlに溶解し、加熱滅菌して注射剤を製造した。
（組成） （mg）
化合物３ １５
ブドウ糖 １００
【００５２】
実施例２ 注射剤
下記成分を注射用蒸留水５mlに溶解し、加熱滅菌して注射剤を製造した。
（組成） （mg）
化合物３ １５
没食子酸オクチル １５
ブドウ糖 １００
【００５３】
実施例３ ローション
下記成分を常法に従って混合し、ローションを製造した。
（組成） （ｇ）
化合物１ １
グリセリンモノステアレート １
エタノール １５
プロピレングリコール ４
イソプロピルパルミテート ３
ラノリン １
セラミド ０．５
パラオキシ安息香酸メチル ０．１
ビタミンＣ ０．５
香料 微 量
色素 微 量
精製水 ７２
【００５４】
実施例４ 錠剤
下記成分を用い、常法に従って、直径９mm、重量２００mgの錠剤を製造した。
（組成） （ｇ）
化合物１ １０００
ヒドロキシプロピルセルロース ８００
軽質無水ケイ酸 ２００
乳糖 ５００
結晶セルロース ５００
タルク ５００
【００５５】
実施例５ 硬カプセル剤用充填薬剤
下記成分を用い、常法に従って、硬カプセル剤用充填薬剤を製造した。
（組成） （ｇ）
化合物２ １０００
結晶セルロース １０００
乳糖 １５００
軽質無水ケイ酸 ２００
【００５６】
実施例６ 顆粒剤
下記成分を用い、常法に従って、顆粒剤を製造した。
（組成） （ｇ）
化合物１ ２００
乳糖 ２００
ヒドロキシプロピルセルロース ３００
タルク １５
【００５７】
実施例７ クリーム
下記成分を常法に従って混合し、クリームを製造した。
【００５８】
実施例８ 軟膏
下記成分を常法に従って混合し、軟膏を製造した。
【００５９】
実施例９ クリーム
下記成分を常法に従って混合し、クリームを製造した。
【００６０】
実施例１０ 錠剤
下記成分を用い、常法に従って錠剤を製造した。
【００６１】
実施例１１ 錠剤
下記成分を均一に混合し、打錠機にて圧縮成型して１錠２００mgの錠剤を製造した。
【００６２】
実施例１２ 錠剤
下記処方に従い、（１）、（４）及び（２）の一部を均一に混合して圧縮成型した後粉砕し、（３）及び（２）の残量を加えて混合し、打錠機にて圧縮成型して１錠２００mgの錠剤を製造した。
【００６３】
実施例１３ 顆粒剤
下記成分を均一に混合し、捏和し、押出し造粒機により造粒後、乾燥し、篩別して、顆粒剤を製造した。
【００６４】
実施例１４ カプセル剤
下記成分を均一に混合し、２００mgを２号カプセルに充填した。
【００６５】
実施例１５ 注射剤
下記処方に従い、（５）を（１）及び（３）溶解し、これに（２）と（４）の溶液を加えて乳化し、注射剤を製造した。
【発明の属する技術分野】
本発明は、抗ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）剤、炎症予防・改善剤、成人病予防・改善剤、癌転移抑制剤として有用なＮＦ−κＢ（Nuclear Factor-Kappa B）活性化抑制剤、遺伝子発現調節剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
発生、分化、増殖、恒常性の維持などの高次の生命現象は、ある特定の遺伝的プログラムに従って正確に行われるが、それは個々の細胞における特異的な遺伝子の発現調節を通した細胞レベルにおける活性化、分化、増殖によって制御されている。これらの変化は遺伝情報の発現が起こるべき細胞へ、その外界からサイトカインやホルモンなどの刺激が加わり、細胞膜上の受容体に結合することにより始まり、種々の生化学的反応を経て最終的に核にシグナルを伝達し、遺伝子発現の変化を引き起こす。このような遺伝子発現の制御は主として遺伝子の転移レベルで行われていることが知られている。
【０００３】
外界からの刺激によって発現誘導される遺伝子群は、刺激により迅速に再活性化され得る状態にある。どの遺伝子が選択的に活性化されるかは遺伝子の発現制御領域に存在する特別な塩基配列、及びこれらのシスエレメントに特異的に結合する転写調節因子が存在するか否かによって決定される。つまり外界からの刺激によって転写調節因子が量的又は質的に活性化すれば遺伝子の発現が起こる。
【０００４】
転写調節因子のうちＮＦ−κＢは、ｐ５０及びｐ６５の２種類のサブユニットから成る蛋白質であり、非刺激時には阻害蛋白質Ｉ−κＢと結合して細胞質に存在している。この細胞質にＩＬ−１やＴＮＦ−αなどによる刺激が加わると、この刺激によって活性化されたキナーゼにより、Ｉ−κＢが不活性化され、放出されたＮＦ−κＢが核へ移行して転写の活性化が起こると考えられている。
【０００５】
ＮＦ−κＢにより活性化される、すなわち発現制御配列にＮＦ−κＢの結合するシスエレメントを持つ遺伝子は、ＩＬ−１（Interleukin-1）、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１２、ＩＦＮ−β（Interferon-β）、ｉＮＯＳ（Inducible nitric oxide synthase）、Ｇ−ＣＳＦ（Granulocyte colony stimulating factor）、ＧＭ−ＣＳＦ（Granulocyte macrophage colony stimulating factor）、ＴＮＦα（Tumor necrosis factor α）、ＣＯＸ−２（Cyclooxygenase-2）のような炎症性サイトカイン、ＥＬＡＭ−１（E-Selectin）、ＩＣＡＭ−１（CD54）、ＶＣＡＭ−１（CD106）のような細胞接着、細胞浸潤、癌転移の過程に重要な細胞接着分子などに関するものが多いことが知られている。また、ＭＭＰ−２，９（Matrixmetalloproteinase）のようなガン細胞の血管外への浸潤、転移に深く関与する酵素の活性化にもＮＦ−κＢの活性化が深く関与していることが知られていることから、ＮＦ−κＢ活性化抑制物質は抗炎症剤、癌転移抑制剤として期待されている。従って、ＮＦ−κＢ活性化抑制剤が有効に発現調節しうる遺伝子として、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１２、ＴＮＦ、ＩＦＮ、ｉＮＯＳ、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＣＯＸ−２、ＥＬＡＭ−１、ＩＣＡＭ−１、ＶＣＡＭ−１、ＭＭＰ−９等が挙げられる。また、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）は宿主細胞のＮＦ−κＢによりその転写が活性化され、ウイルスの増殖と感染の拡大が進むと考えられており、従って、ＮＦ−κＢの活性化抑制物質は、ＨＩＶ感染症（ＡＩＤＳ）の治療に有効であると期待されている（実験医学：９巻16号，68-, 199：Annu. Rev. Immunol.:12巻, 141-, 1994、Advances in Immunology:58巻, 1-、Science:265巻, 956-, 1994）。
【０００６】
成人病の一つである粥状動脈硬化発生の初期には、細胞内に大量のエステル化コレステロールを蓄積した泡沫細胞と呼ばれる単球マクロファージ由来の細胞の、血管内皮下での局所的な集簇が認められる。また、粥状動脈硬化巣にはＴリンパ球の存在も知られている。このような動脈硬化巣においてもＮＦ−κＢが活性化されていることが知られており、ＮＦ−κＢの活性化は動脈硬化発症過程における重要な初期ステップとして認識されている（J. Clin. Invest., 97, 1715-, 1996）。また、肝炎、腎炎、関節リウマチ組織においてもＮＦ−κＢの活性化が誘導されていることとも報告されている。従って、ＮＦ−κＢ活性化抑制剤は、動脈硬化や、肝炎、腎炎、関節リウマチ等の成人病の予防・改善剤として有効である。
【０００７】
このように、動脈硬化症や肝炎のような多くの成人病や各種の炎症、ウイルス性疾患、癌の転移にはＮＦ−κＢの活性化が極めて重要な役割を果していることが明らかとなっており、また、理論的にも、細胞実験レベルにおいても動物実験レベルにおいてもＮＦ−κＢ活性化抑制物質がこれら疾患の予防・改善に有効であることが認識されるに至っていることから、本出願人を含め多くの研究者がこれら疾患の制御を目的にＮＦ−κＢ活性化抑制物質の探索を行っている。
このような疾病制御の観点から、これまでにＮＦ−κＢの活性化を抑制する物質の探索が行われ、本出願人によって先に報告された没食子酸誘導体（特願平7-215983号）、Ｎ−アセチルシステインやピロリジンジチオカーボネート（The Journal of Immunology, 1994, 153:2681-）、アスピリンやサリチル酸ナトリウム（Science, 1994, 265(12):956-）、ベンゾキノン誘導体（特開平7-297860号、特開平7-291859号公報）、バナジウムコンプレックス（DE4336642）、ペルバナデート（J. Biological chem., 270(18)10631-10639, 1995）、フェニルアルシンオキシド（J. Biological chem., 270(18)10631-10639, 1995）、サイクリックイミド誘導体（WO9501348）、トシルフェニルクロロメチルケトン、ジイソクマリン、α−トコフェリルサクシネート、ペントキシフィリン、ベンゾキノン誘導体（特開平7-291860号公報）などが報告されている。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
従って、本発明の目的は、高い効力を有するＮＦ−κＢの活性化抑制剤及びこの作用に基づく優れた遺伝子発現調節剤、抗ヒト免疫不全ウイルス剤、炎症予防・改善剤、成人病予防剤、癌転移抑制剤を提供することにある。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
このような実情に鑑み、本発明者は鋭意研究を行った結果、特定のリグナン類が優れたＮＦ−κＢ活性化抑制作用を有することを見出し、本発明を完成した。
【００１０】
すなわち、本発明は次の一般式（１）
【００１１】
【化２】
（式中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3及びＲ4は同一又は異なって水素原子、ヒドロキシル基、アルキル基、ヒドロキシアルキル基又はアルコキシ基を示す）
で表されるリグナン類を有効成分とするＮＦ−κＢ活性化抑制剤（但し、抗腫瘍剤、肝臓障害改善剤、リューマチ性関節炎処置剤、移植時における免疫又は拒絶反応処置剤、乾癬処置剤及びマラリア処置剤として使用する場合を除く）、インターロイキン−１（ＩＬ−１）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、インターロイキン−８（ＩＬ−８）、インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）、インターフェロン−β（ＩＦＮ−β）、ＮＯ合成酵素（ｉＮＯＳ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、シクロオキシゲナーゼ−２（ＣＯＸ−２）、ＥＬＡＭ−１、ＩＣＡＭ−１、ＶＣＡＭ−１、マトリクスメタロプロテアーゼ−９（ＭＭＰ−９）、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦより選ばれる１又は２以上の物質の遺伝子発現調節剤（但し、抗腫瘍剤、肝臓障害改善剤、リューマチ性関節炎処置剤、移植時における免疫又は拒絶反応処置剤、乾癬処置剤及びマラリア処置剤として使用する場合を除く）を提供するものである。
【００１３】
【発明の実施の形態】
リグナン類は植物においてはヒノキ科のアスナロ（Thujopsis dolabrata）（Chem. Pharm. Bull. 20(6)1150-1155(1972)）などに見出されている他、種々の合成法が報告されており（Natural Product Report, 183-205(1995)）、また、これまでに一部のリグナンに抗ヘルペスウイルス活性、抗サイトメガロウイルス活性や癌細胞（mouse leukemia, human lung carcinoma, human colon carcinoma）増殖抑制活性（Planta Med. 59,246-249(1993)）、血小板へのＰＡＦ（Platelet activating factor）の結合阻害（Natural Product Report, 183-205(1995)）などが報告されているが、そのＮＦ−κＢ活性化抑制作用については全く知られていない。
【００１４】
本発明で用いられるリグナン類は、前記一般式（１）で表されるものであり、式中Ｒ1 〜Ｒ4 は同一又は異なって水素原子、ヒドロキシル基、アルキル基、ヒドロキシアルキル基又はアルコキシ基を示し、アルキル基としては炭素数１〜１０のものが好ましく、例えばメチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、ヘプチル基、オクチル基、ノニル基、デシル基などの直鎖又は分岐鎖のものが挙げられる。ヒドロキシアルキル基としては、炭素数１〜１０の直鎖又は分岐鎖のものが好ましく、例えばヒドロキシエチル基などを挙げることができる。また、アルコキシ基としては炭素数１〜１０の直鎖又は分岐鎖のものが好ましく、例えばメトキシ基、エトキシ基、ｎ−プロピルオキシ基、イソプロピルオキシ基、ｎ−ブチルオキシ基、ｓｅｃ−ブチルオキシ基、ｔｅｒｔ−ブチルオキシ基、ペンチルオキシ基、ヘキシルオキシ基、ヘプチルオキシ基、オクチルオキシ基、ノニルオキシ基、デシルオキシ基等を挙げることができる。
これらのうち、一般式（１）においてＲ1 が水素原子、ヒドロキシル基又は炭素数１〜３のアルコキシ基であり、Ｒ2 、Ｒ3 及びＲ4 がヒドロキシル基又はメトキシ基で表されるものが特に好ましい。
【００１５】
このようなリグナン類（１）は、例えばアスナロ（主に葉部、小枝部）から抽出することができる。抽出は、アスナロ又はその乾燥末を水、有機溶媒（石油エーテル、ｎ−ヘキサン、シクロヘキサン、四塩化炭素、トルエン、ベンゼン、ジクロロメタン、クロロホルム、エーテル、酢酸エチル、ブタノール、アセトン、プロパノール、エタノール、メタノール、ピリジン、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、ブチレングリコール等）、水性アルコール等を用い、通常３〜７０℃で抽出処理することにより行う。
【００１６】
アスナロ原体からの好ましい具体的抽出例としては、アスナロの乾燥粉砕物１００ｇをエタノール１リットルに浸漬し、室温で時々攪拌しながら７日間抽出を行い、得られた抽出液をろ過し、ろ液を５℃で３日間静置した後、再度ろ過して上澄みを得る方法が挙げられる。次いで得られた抽出液から溶媒を留去して得られた残渣を、適宜メタノール、エタノール、酢酸エチル等の溶媒に溶解し、更に水、メタノール、エタノール、酢酸エチル、クロロホルム、ジクロロメタン、ヘキサン、アセトン、ベンゼン等を溶出溶媒として、アンバーライトＸＡＤ−２、ダイアイオンＨＰ−２０、ＴＳＫゲルＨＷ−４０等の親水性ポリマーやセファデックスＬＨ−２０等のセファデックス、逆相系シリカゲルやシリカゲル、セルロース等を担体に用いたカラムクロマトグラフィーに付し、薄層クロマトグラフィーなどで目的成分を確認しながら分画することにより目的物を得ることができる。また、場合によりベンゼン、エーテル、ヘキサン、アセトン、メタノール、エタノール、水等の適当な溶媒を用いて再結晶することにより精製してもよい。
【００１７】
また、文献記載の方法（Natural Product Report, 183-205(1995)等）により種々の誘導体を合成することができ、その由来は特に限定されるものではない。
【００１８】
本発明のＮＦ−κＢ活性化抑制剤には、リグナン類に加えて、既存の抗炎症剤、抗アレルギー剤、抗ヒスタミン剤等の薬物を任意に組合わせて配合することができ、また、通常用いられる賦形剤及びその他の添加剤とともに任意の形態に製剤化される。かかる賦形剤、添加剤の例として、固形状のものとしては乳糖、カオリン、ショ糖、結晶セルロース、コーンスターチ、タルク、寒天、ペクチン、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム、レシチン、塩化ナトリウム等が挙げられ、液状のものとしてはグリセリン、落花生油、ポリビニルピロリドン、オリーブ油、エタノール、ベンジルアルコール、プロピレングリコール、水等が挙げられる。
【００１９】
本発明の医薬は、その剤型に応じて経口、経腸、外用、注射、点眼、点鼻、吸入、経粘膜等いずれの経路によってもヒトに投与することができる。またその投与量は、年齢、体重、性別、症状、治療効果、投与方法、処理時間等の種々の要因によって異なり、特に限定されないが、経口投与の場合は通常大人１人当たり１回に０．１〜２０００mg、特に１０〜４００mgの範囲を１日１回〜数回に分けて投与することが好ましい。また、非経口投与の場合は、通常大人１人当たり１回に０．１〜２０００mg、特に１０〜４００mgの範囲を１日１回〜数回投与することが好ましい。
【００２０】
本発明の医薬の剤型としては特に限定されず、例えば錠剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、坐剤、トローチ剤、シロップ剤、乳液、液剤（ドリンク剤）、軟ゼラチンカプセル、クリーム、ゲル、ペースト、スプレー、注射剤等が挙げられる。
錠剤の形態にする場合は、担体としては、この分野で公知のものを広く使用できる。これには、例えば澱粉、乳糖、ショ糖、カルボキシメチルセルロース、コーンスターチ、無機塩類、尿素等の賦形剤；水、エタノール、プロパノール、単シロップ、ブドウ糖、澱粉液、ゼラチン溶液、カルボキシメチルセルロース、セラック、メチルセルロース、リン酸カリウム、ポリビニルピロリドン等の結合剤；乾燥澱粉、アルギン酸ナトリウム、カンテン末、ラミナラン末、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウム、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸モノグリセライド、澱粉、乳糖等の崩壊剤；白糖、ステアリン、カカオバター、水素添加油等の崩壊抑制剤；ラウリル硫酸ナトリウム、第４級アンモニウム塩等の吸収促進剤；グリセリン、澱粉等の保湿剤；澱粉、乳糖、カオリン、ベントナイト、コロイド状ケイ酸等の吸着剤；ステアリン酸塩、ホウ酸末、精製タルク、ポリエチレングリコール等の滑沢剤等が挙げられる。更に錠剤は必要に応じて通常の剤皮を施した錠剤、例えば糖衣錠、ゼラチン被包錠、腸溶包錠、フィルムコーティング錠あるいは二重錠、多層錠とすることができる。
【００２１】
丸剤の形態にする場合には、担体としてはこの分野で公知のものを広く使用でき、これには、例えば澱粉、乳糖、ブドウ糖、カカオ脂、硬化植物油、カオリン、タルク等の賦形剤；アラビアゴム末、トラガント末、ゼラチン、エタノール等の結合剤；ラミナランカンテン等の崩壊剤等が挙げられる。
【００２２】
坐剤の形態にする場合は、担体としてはこの分野で公知のものを広く使用でき、これには例えばカカオ脂、ゼラチン、ポリエチレングリコール、高級アルコール、高級アルコールのエステル類、半合成グリセリド等を挙げることができる。
【００２３】
注射剤として調製する場合は、液剤及び懸濁剤は殺菌され、かつ血液と等張であることが望ましく、これら液剤、懸濁剤及び乳剤の形態にする場合は、希釈剤として、この分野において慣用されているものを利用することができる。例えば水、エチルアルコール、プロピレングリコール、エトキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレン化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類等を挙げることができる。尚、この場合、等張性の水溶液を調製するに十分な量の食塩、ブドウ糖、グリセリン等を医薬製剤中に含有せしめてもよく、また通常の溶解補助剤、緩衝剤、無痛化剤等を添加してもよい。更に必要に応じて着色剤、保存剤、香料、風味剤、甘味剤や他の医薬品を医薬製剤中に含有せしめてもよい。
【００２４】
また、噴霧剤の形態にする場合には、分散剤及び噴射剤はこの分野で公知のものを広く使用でき、分散剤としては例えば大豆レシチン、卵黄レシチン類、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸等の脂肪酸、ソルビタントリオレート、ソルビタンモノオレート等のソルビタン類等を用いることができる。また噴射剤として例えばフレオン１１、フレオン１２、フレオン１１４等の通常不燃性液化ガスを用いることができる。
【００２５】
軟膏の形態にする場合にもこの分野で公知のものを広く使用でき、例えば水、エタノール、イソプロピルアルコール、グリセリン、ポリエチレングリコール、ソルビトール、ポリビニルアルコール等の多価アルコール、動物性油脂、植物性油脂、鉱物油、硬化油、ミツロウ等のワックス、液状パラフィン、パラフィンロウ等の高級炭化水素、ステアリン酸等の脂肪酸、乳化剤、アニオン界面活性剤、カチオン界面活性剤、両性界面活性剤といった界面活性剤、キサンタンガム、アルギン酸ナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシビニルポリマー等の水溶性高分子化合物等を使用することができる。また、色素、保存剤、香料等も必要に応じて配合してもよい。
【００２６】
リグナン類（１）が製剤中に配合されるべき量としては特に限定されず、広範囲に適宜選択されるが、通常製剤中１〜７０重量％、特に１〜３０重量％であるのが好ましい。
【００２７】
【発明の効果】
本発明のリグナン類は優れたＮＦ−κＢ活性化抑制作用を有し、遺伝子発現調節剤、抗炎症剤、抗ヒト免疫不全ウイルス剤、癌転移抑制剤、炎症予防・改善剤、成人病予防剤として有用である。従って、これを有効成分として含有する製剤は、そのＮＦ−κＢ活性化抑制作用、遺伝子発現調節作用に基づき、ヒト免疫不全感染症（ＡＩＤＳ）、気管支炎、アレルギー性鼻炎、関節炎、腎炎、肝炎、乾せん、蕁麻疹、接触皮膚炎、アトピー性皮膚炎、ＵＶ炎症、関節リウマチ、喘息、動脈硬化、各種癌転移等の予防・治療に広く用いることができる。
【００２８】
【実施例】
次に、実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００２９】
製造例１
アスナロ乾燥粉砕物（１８０ｇ）をエタノール１Ｌに浸漬し、室温において時々攪拌しながら７日間抽出を行い、得られた抽出液を濾過し、濾液を５℃において３日間静置した後、再度濾過し、上澄みを得た。次に溶媒を留去して得られた残渣（２．４ｇ）をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル、ＣＨＣｌ3：ＣＨ3ＯＨ、Ｈ2Ｏ：ＣＨ3ＯＨ）、高速液体クロマトグラフィー（ＹＭＣ−ＯＤＳ Ｓ−１０、ＹＭＣ社製）に供し、化合物１（一般式（１）において、Ｒ1＝Ｈ、Ｒ2＝Ｒ3＝Ｒ4＝ＯＣＨ3）２５mgを得た。
【００３０】
製造例２
製造例１と同様にして、化合物２（一般式（１）において、Ｒ1＝ＯＨ、Ｒ2＝Ｒ3＝Ｒ4＝ＯＣＨ3）１０mgを得た。
【００３１】
製造例３
製造例１と同様にして、化合物３（一般式（１）において、Ｒ1＝Ｒ2＝Ｒ3＝Ｒ4＝ＯＣＨ3）２１mgを得た。
【００３２】
製造例４
製造例１と同様にして、化合物４（一般式（１）において、Ｒ1＝Ｈ、Ｒ2＝Ｒ4＝ＯＣＨ3、Ｒ3＝ＯＨ）１５mgを得た。
【００３３】
試験例１ ＮＦ−κＢ活性化抑制試験：
（ａ−１）ケラチノサイトの調製
正常ヒトケラチノサイトをＴ−２５フラスコで培養し、サブコンフルエントに達した時点で成長因子類を含まない培地（K-110(-)）（極東製薬（株）製）（５ml）で１度洗浄し、Ｋ−１１０（−）（５ml）で１日培養する。その後新たなＫ−１１０（−）に置き換え、刺激物質（最終濃度IL-1α:1.25ng/ml、TNFα:1.25ng/ml又はLPS（リポポリサッカライド ):10μg/ml）を添加し、更に１時間培養する。培養後、細胞をＰＢＳ（−）で洗浄し、下記の方法により核蛋白質の抽出を行った。尚、被験物質（最終濃度100nM）はＵＶＢ（紫外線）照射の１５時間前に細胞に添加した。
【００３４】
（ａ−２）ＵＶＢ照射ケラチノサイトの調製
正常ヒトケラチノサイトをＴ−２５フラスコで培養し、サブコンフルエントに達した後、成長因子類を含まない培地（K-110(-)で１度洗浄し、Ｋ−１１０（−）（５ml）で１日培養する。その後ＰＢＳ（−）（５ml）で２度洗浄し、ＰＢＳ（−）（２ml）存在下、ＵＶＢ（15mJ/cm2）を照射する。照射後ＰＢＳを除去し、Ｋ−１１０（−）を５ml添加し、２時間培養する。培養後細胞をＰＢＳ（−）で洗浄し、下記の方法により核蛋白質の抽出を行った。尚、被験物質（最終濃度100nM）はＵＶＢ照射の１５時間前に細胞に添加した。
【００３５】
（ｂ）血管内皮細胞の調製
コラーゲン（Ｉ）コートしたＴ−２５フラスコ内にてＥ−３００培地（極東製薬（株）製）中でコンフルエントとなった正常ヒト臍帯由来血管内皮細胞に被験物質（100nM）を添加する。１５時間後に刺激物質（最終濃度IL-1a:1.25ng/ml、TNFa:1.25ng/ml又はPMA（ホルボール12−ミリステート13−アセテート）:10ng/ml ）を添加し１時間培養する。培養液を除去した後ＰＢＳ（−）にて洗浄し、下記の方法により核蛋白質の抽出を行った。
【００３６】
（ｃ）核蛋白質の抽出
培養液除去後ＰＢＳ（−）にて洗浄した細胞に、バッファーＡ（10mM HEPES-NaOH(pH7.9), 1.5mM MgCl2, 10mM KCl, 1.0mMジチオスレイトール(DTT), 0.5mMα−フェニルメタンスルホニルフロライド(PMSF), ２μg/mlアプロチニン，２μg/mlペプスタチン）１mlを加え、セルスクレイパーを用いて細胞を剥離回収する。遠心処理（12000rpm, 10分間）し、上清を除去した後バッファーＢ（バッファーＡ＋0.1％ Triton X）８０μｌを添加し、ピペッティングにより細胞を懸濁させ、氷上に１０分間放置する。遠心処理（14000rpm, 10分間）後、上清を除去し、バッファーＣ（20mM HEPES-NaOH(pH7.9), 1.5mM MgCl2, 420mM NaCl, 1.0mM DTT, 0.5mM PMSF, 0.2mM EDTA, ２μg/mlアプロチニン，２μg/mlレプスタチン, 25％グリセロール）７０μｌを加え、ピペッティングにより細胞を懸濁させ、氷上に３０分間放置する。遠心処理（15000rpm, 20分間）後、上清を核蛋白抽出物として回収する。核蛋白質は、１mg/ml に調整し、ゲルシフトアッセイに用いた。
ゲルシフトアッセイは基本的にはPromega社製のゲルシフトアッセイシステムを用いて行った。１mg/ml の核蛋白質（２μｌ），Ｈ2Ｏ（４又は５μｌ），結合バッファー（50mM Tris-HCl(pH7.5), 5.0mM MgCl2, 250mM NaCl, 2.5mM DTT, 2.5mM EDTA, 20％グリセロール,0.25mg/mlポリ(dI-dC)ポリ(dI-dC)）（２μｌ）、競合物質（NF-κBオリゴヌクレオチド）、非競合物質（OCT1オリゴヌクレオチド）（１又は０μｌ）を混合し、室温で１０分間放置する。その後、予めＴ４−ポリヌクレオチドキナーゼにより32Ｐラベルした下記32Ｐ−ＮＦ−κＢコンセンサス オリゴヌクレオチド（１μｌ）を添加、更に室温で２０分間放置し、その後ゲルローディングバッファー（250mM Tris-HCl(pH7.5), 0.2％ BPB, 40％グリセロール）（１μｌ）を加え反応を停止させる。
【００３７】
ＮＦ−κＢコンセンサス オリゴヌクレオチド
５′−ＡＧＴＴＧＡＧＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＣＡＧＧＣ−３′
３′−ＴＣＡＡＣＴＣＣＣＣＴＧＡＡＡＧＧＧＴＣＣＧ−５′
【００３８】
次に０．５Ｘ ＴＢＥ（トリス／ホウ酸／EDTA）バッファー中、ポリアクリルアミドゲル（５％）電気泳動に供し、ゲルを乾燥後、オートラジオグラフィーを行い、ＤＮＡプローブの移動度の変化からＮＦ−κＢ活性化抑制効果を評価した。評価は、バイオイメージングアナライザーＢＡＳ２０００（フジフィルム社製）により各バンドの放射活性を測定し、ＩＬ−１無刺激のときのＮＦ−κＢの放射活性の値、ＩＬ−１のみで刺激した場合の放射活性の値から、各被験物質で処理した場合のＮＦ−κＢの活性化の程度をＮＦ−κＢ活性化抑制率として算出することにより行った。結果を表１に示す。尚、シフトしたバンドが目的のものであるか否かを検証するため、非標識プローブによる競争実験を同時に行った。
【００３９】
【表１】
この結果、本発明のリグナン類が優れたＮＦ−κＢ活性化抑制作用を有することが判明した。
【００４１】
試験例２ ＲＴ−ＰＣＲによるｍＲＮＡ発現量の解析：
ヒトケラチノサイトに紫外線を照射する実験系において各種遺伝子のｍＲＮＡの発現に対するリグナン類の効果について評価した。
（ａ）ケラチノサイトの調製
正常ヒトケラチノサイトをＴ−２５フラスコで培養し、サブコンフルエントに達した後成長因子類を含まない培地（K-110(-)）（極東製薬（株）製）で１度洗浄し、Ｋ−１１０（−）（５ml）で１日培養する。その後ＰＢＳ（−）（５ml）で２度洗浄し、ＰＢＳ（−）（２ml）存在下、ＵＶＢ（15mJ/cm2）を照射する。照射後ＰＢＳを除去、Ｋ−１１０（−）を５ml添加し、４時間培養する。４時間後細胞をＰＢＳ（−）で洗浄し、Isogen（１ml）（和光純薬製）を加え、常法に従いトータルＲＮＡを抽出した。尚、被験物質（化合物３）（最終濃度100nM）はＵＶＢ照射の１５時間前に細胞に添加した。
【００４２】
（ｂ）ｃＤＮＡの合成とＲＴ−ＰＣＲ
Takara（株）のＲＮＡ ＰＣＲキットを用いて逆転写及びＰＣＲを行った。
トータルＲＮＡ（500ng/3.5μl）(3.5μl)，２５mM MgCl2(４μl)，１０×ＰＣＲバッファー（100mM Tris-HCl(pH8.3), 500mM KCl）(2μl), ｄＮＴＰ混合物(2.5mM)(８μl), ＲＮａｓｅインヒビター（40U/μl)(0.5μl), リバース トランスクリプターゼ（５U/μl）(1μl), オリゴ d(T)18(50pmol/μl)(1μl)をＰＣＲチューブ中で混合し、サーマルサイクラーを用い、４２℃で６０分間、５２℃で３０分間、９９℃で５分間、４℃で１０分間反応を行いｃＤＮＡを合成した。
ＰＣＲはｃＤＮＡ（４μｌ），２５mM MgCl2（４μｌ），１０×ＰＣＲバッファー（1.6μl），Ｈ2Ｏ（11.1μl), Ｔａｑポリメラーゼ（５U/μl）(0.1μl), Ｒｅｄｉ Ｌｏａｄ(2μl), ２０uMプライマーＦ，Ｒ（各0.2μl)を混合し、サーマルサイクラーを用い、（１）９４℃で１分間、（２）９４℃で１分間、６０℃で２分間、７２℃で９０秒間を１サイクルとしこれを所定の回数（15〜40サイクル）繰り返してＤＮＡを増幅し、（３）４℃で反応を行った。ＰＣＲ増幅産物は１．５％アガロース／ＴＡＥゲル電気泳動（200V,30分間）に供し、０．３μl/ml ＥｔＢｒ／ＴＡＥで３０分染色、Ｈ2Ｏで１５分間洗浄した後、ＦＭ−ＢＩＯ（日立製）により解析した。この時、各バンドの濃さを測定し、ＵＶＢ未照射の値と、照射時の値から各物質で処理した場合の各遺伝子の発現の程度をｍＲＮＡを抑制率として算出した。抑制率は無刺激時を１００、刺激時を０として算出した。その結果を表２に示す。
【００４３】
【表２】
＊：プライマー配列
ＩＬ−６−Ｆ：ＡＴＧＡＡＣＴＣＣＴＴＣＴＣＣＡＣＡＡＧＣＧＣ
ＩＬ−６−Ｒ：ＧＡＡＧＡＧＣＣＣＴＣＡＧＧＣＴＧＧＡＣＴＧ
（Nature 324, 73-(1986)）
ＩＬ−８−Ｆ：ＡＴＧＡＣＴＴＣＣＡＡＧＣＴＧＧＣＣＧＴＧＧＣＴ
ＩＬ−８−Ｒ：ＴＣＴＣＡＧＣＣＣＴＣＴＴＣＡＡＡＡＡＣＴＴＣＴＣ
（Cytokine 1,2-(1986)）
ｉＮＯＳ−Ｆ：ＣＧＧＴＧＣＴＧＴＡＴＴＴＣＣＴＴＡＣＧＡＧＧＣＧＡＡＧＡＡＧＧ
ｉＮＯＳ−Ｒ：ＧＧＴＧＣＴＧＣＴＴＧＴＴＡＧＧＡＧＧＴＣＡＡＧＴＡＡＡＧＧＧＣ
（Proc. Natl. Acad. Sci., 90, 3491-(1993)）
ＣＯＸ−２−Ｆ：ＴＴＣＡＡＡＴＧＡＧＡＴＴＧＴＧＧＧＡＡＡＡＴ
ＣＯＸ−２−Ｒ：ＡＧＡＴＣＡＴＣＴＣＴＧＣＣＴＧＡＧＴＡＴＣＴＴ
（J. Biol. Chem., 269, 11769-(1994)）
【００４５】
この結果、本発明のリグナン類が優れた炎症性メディエーター遺伝子発現調節作用を有することが判明した。
【００４６】
試験例３ ノーザンブロットによる細胞接着分子ｍＲＮＡ発現量の解析：
血管内皮細胞における細胞接着分子ｍＲＮＡの発現とリグナン類の効果につきノーザンブロットにより解析した。
（ａ）血管内皮細胞の調製
コラーゲン（Ｉ）コートしたＴ−７５フラスコ内にてＥ−３００培地中でコンフルエントとなった正常ヒト臍帯由来血管内皮細胞に、被験物質（化合物３：最終濃度100nM）を添加する。１５時間後にヒトＴＮＦαを最終濃度１．２５ng／mlとなるよう添加し、３時間培養する。培養液除去後ＰＢＳ（−）にて洗浄し、Invitrogen社製Micro-Fast Track mRNA Isolationキットを用いてPoly−Ａ+ＲＮＡを単離した。
【００４７】
得られたｍＲＮＡはアガロースゲル電気泳動に供した後、Hybond−Ｎ+ ナイロン膜（アマシャム社製）に転写、ＵＶ固定を行いフィルターを作成した。次いで鮭精子ＤＮＡで６時間プレハイブリダイゼーションを行った後、ELAM-1, ICAM-1 GAPDH（Takara（株）製）の32Ｐ−ｃＤＮＡプローブと４２℃で１８時間ハイブリダイズした。終了後フィルターは２Ｘ−ＳＳＣ−０．２％ＳＤＳ溶液にて洗浄し、ＢＡＳ２０００によりｍＲＮＡ発現量を解析した。この時、各バンドの濃さを測定し、ＵＶＢ未照射の値と、照射時の値から各物質で処理した場合の各遺伝子の発現の程度を抑制率として算出した。その結果を表３に示す。
【００４８】
【表３】
この結果、本発明のリグナン類が優れた細胞接着分子遺伝子発現抑制作用を有することが判明した。
【００５０】
以上のように、本発明のリグナンは優れたＮＦ−κＢ活性化抑制作用と、炎症及び癌転移に深く関与する遺伝子の発現調節作用を有しており、それに基づき抗ヒト免疫不全ウイルス剤、炎症の予防・改善剤、成人病予防剤、癌転移抑制剤として有効に用いることができる。
【００５１】
実施例１ 注射剤
下記成分を注射用蒸留水５mlに溶解し、加熱滅菌して注射剤を製造した。
（組成） （mg）
化合物３ １５
ブドウ糖 １００
【００５２】
実施例２ 注射剤
下記成分を注射用蒸留水５mlに溶解し、加熱滅菌して注射剤を製造した。
（組成） （mg）
化合物３ １５
没食子酸オクチル １５
ブドウ糖 １００
【００５３】
実施例３ ローション
下記成分を常法に従って混合し、ローションを製造した。
（組成） （ｇ）
化合物１ １
グリセリンモノステアレート １
エタノール １５
プロピレングリコール ４
イソプロピルパルミテート ３
ラノリン １
セラミド ０．５
パラオキシ安息香酸メチル ０．１
ビタミンＣ ０．５
香料 微 量
色素 微 量
精製水 ７２
【００５４】
実施例４ 錠剤
下記成分を用い、常法に従って、直径９mm、重量２００mgの錠剤を製造した。
（組成） （ｇ）
化合物１ １０００
ヒドロキシプロピルセルロース ８００
軽質無水ケイ酸 ２００
乳糖 ５００
結晶セルロース ５００
タルク ５００
【００５５】
実施例５ 硬カプセル剤用充填薬剤
下記成分を用い、常法に従って、硬カプセル剤用充填薬剤を製造した。
（組成） （ｇ）
化合物２ １０００
結晶セルロース １０００
乳糖 １５００
軽質無水ケイ酸 ２００
【００５６】
実施例６ 顆粒剤
下記成分を用い、常法に従って、顆粒剤を製造した。
（組成） （ｇ）
化合物１ ２００
乳糖 ２００
ヒドロキシプロピルセルロース ３００
タルク １５
【００５７】
実施例７ クリーム
下記成分を常法に従って混合し、クリームを製造した。
実施例８ 軟膏
下記成分を常法に従って混合し、軟膏を製造した。
実施例９ クリーム
下記成分を常法に従って混合し、クリームを製造した。
実施例１０ 錠剤
下記成分を用い、常法に従って錠剤を製造した。
実施例１１ 錠剤
下記成分を均一に混合し、打錠機にて圧縮成型して１錠２００mgの錠剤を製造した。
実施例１２ 錠剤
下記処方に従い、（１）、（４）及び（２）の一部を均一に混合して圧縮成型した後粉砕し、（３）及び（２）の残量を加えて混合し、打錠機にて圧縮成型して１錠２００mgの錠剤を製造した。
実施例１３ 顆粒剤
下記成分を均一に混合し、捏和し、押出し造粒機により造粒後、乾燥し、篩別して、顆粒剤を製造した。
実施例１４ カプセル剤
下記成分を均一に混合し、２００mgを２号カプセルに充填した。
実施例１５ 注射剤
下記処方に従い、（５）を（１）及び（３）溶解し、これに（２）と（４）の溶液を加えて乳化し、注射剤を製造した。
Claims (2)
- 一般式（１）
で表されるリグナン類を有効成分とするＮＦ−κＢ活性化抑制剤（但し、抗腫瘍剤、肝臓障害改善剤、リューマチ性関節炎処置剤、移植時における免疫又は拒絶反応処置剤、乾癬処置剤及びマラリア処置剤として使用する場合を除く）。 - 請求項１記載のリグナン類を有効成分とするインターロイキン−６（ＩＬ−６）、インターロイキン−８（ＩＬ−８）、インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）、ＮＯ合成酵素（ｉＮＯＳ）、シクロオキシゲナーゼ−２（ＣＯＸ−２）、ＥＬＡＭ−１及びＩＣＡＭ−１より選ばれる１又は２以上の物質の遺伝子発現抑制剤（但し、抗腫瘍剤、肝臓障害改善剤、リューマチ性関節炎処置剤、移植時における免疫又は拒絶反応処置剤、乾癬処置剤及びマラリア処置剤として使用する場合を除く）。
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