NO330509B1 - Anvendelse av en COX-2-inhibitor for fremstilling av et medikament, produkt, farmasoytisk blanding samt anvendelse derav. - Google Patents

Description

Denne oppfinnelse gjelder området immunsvikt og virusinfeksjoner. Nærmere bestemt vedrører oppfinnelsen anvendelsen av cyklooksygenase-2- (COX-2) inhibitorer eller derivater derav for fremstilling av et medikament for behandling eller forebyggelse av HIV-infeksjon og AIDS.

Prostaglandiner spiller en viktig rolle i inflammasjonsprosessen, og inhibering av dannelsen av prostaglandiner har vært et populært mål for utvikling av anti-inflammatoriske medikamenter. NSAID (non-steroid anti-inflammatory drugs) inhiberer cyklooksygenase (COX), som er et enzym involvert i biosyntesen av prostaglandin-mellomprodukter fra arakidonsyre. I klinisk anvendelse er diverse NSAID, inklusivt medikamenter som indometacin, piroksikam, tenoxicam, diklofenak, meloxikam, tenidap, isoxicam, acetylsalisylsyre, diflunisal, sulindak, ibuprofen, naproksen og ketoprofen.

NSAID er idag blant de mest utstrakt foreskrevne medikamenter i verden.

Disse NSAID er klinisk effektive medikamenter som har antipyretiske, anti-inflammatoriske og antitrombotiske effekter. Hovedindikasjonene for denne medikamentklasse er artritt, inklusivt osteoartritt og reumatoid artritt, smertefulle muskelskjelett-tilstander og generelt smertetilstander. Disse medikamentene har imidlertid alvorlige bivirkninger. Den hyppigste bivirkning er gastrointestinal ulcerasjon og blødning, inhibering av blodplateaggregasjon og interaksjon med andre medikamenter.

Tidlig på 1990-tallet ble det klonet en annen COX-isoform av enzymet. Denne nye COX-isoformen er nå kjent som COX-2 (Vane et al., 1998, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol., 38, s. 97-120).

Det finnes nå to velkjente isoformer av COX, COX-1 og COX-2 (nylig har eksistensen av COX-3 også vært postulert). COX-1 inngår i de fleste vev og kan ansees som husholdningsenzymet. Aktiviteten av COX-1-enzymet beskytter for eksempel slimhinnen i den gastrointestinale trakt. COX-2 er imidlertid normalt ikke tilstede, men øker under inflammasjon. Flere av bivirkningene av NSAID er relatert til inhibering av COX-1-enzym. NSAID inhiberer både COX-1 og COX-2 (se Tabell 1-3):

I løpet av den siste dekade er det identifisert flere nye selektive COX-2-inhibitorer og såkalte «preferensielle» COX-2-inhibitorer. Flere av disse COX-2-inhibitorene er blitt utviklet og noen få av disse har nylig kommet på markedet. Enkelte av disse nye COX-2-inhibitorene inhiberer ikke COX-1 i kliniske doser. Omfattende kliniske studier og klinisk praksis ved bruk av disse COX-2-inhibitorene viser at disse nye COX-2-inhibitorene har store fordeler med hensyn til sikkerhet sammenlignet med ikke-selektive NSAID. Angående oversikter over COX-2-inhibitorer, se foreksempel Golden et al., 1999, Osteoarthritis. 25, s. 359-379, Mitchel et al., 1999, Brit. J. Pharmacol., 128, s. 1121-1132, Lipsky, 1999, Am. J. Med. 106 (5B), s. 515-575, Taketo, 1998, J. National Cancer Inst., 90, s. 1529-1537, Griswold et al., 1996, Med. Res. Rev., 16, s.181-206 og Reitzera/., 1995, Ann. Rep. Med. Chem., 30, s.179-188.

Andre publikasjoner av interesse angående forskjellige COX-2-inhibitorer

inkluderer for eksempel: Lane, 1997, J. Rheumatol., 24 (suppl. 49), s. 20-24, Mehlish et al., 1998, Clin. Pharmacol. Ther., 63, s.1-8, Zhao et al., 1997, Arthritis Rheum., 40 (suppl.), s 88, Ehrich et al., 1997, Arthritis Rheum., 40 (suppl.), s. 93, Maziasz et al., 1997, Arthritis Rheum., 40 (suppl.) s. 195, Mengle-Gaw et al., 1997, Arthritis Rheum., 40 (suppl.) s. 93, Morrison, 1999, Clin. Ther., 21, s. 943-953, Chan et al.,

1995, J. Pharmacol. Exp. Ther., 274, s.1531-37, Riendeau et al., 1997, Br. J. Pharmacol., 121, s. 105-117, Black et al., 1999, J. Med. Chem., 42, s. 1274-81, Cuo et al., 1996, J. Biol. Chem., 271, s. 19134-39, Geiss, 1999, Scand. J. Rheumatol., 109 (suppl.), s. 31-37, Warner er al., 1999, PNAS USA, 96, s. 7563-68, Bjarnson er al., 1997, Scand. J. Gastroenterol. 32. s. 126-130, Danneberg et al., 1999, Semin. Oncol., 26, s. 499-504, Mitchell et al., 1999, PNAS USA, 90, s. 11693-97, Futaki er al., 1994, Prostaglandins, 47, s. 55-9, Futaki et al., 1993, J. Pharm. Pharmacol., 45, s. 753-5, Masferrerera/., 1994, PNAS USA, 91, s. 3228-32, Klein et al., 1994, Biochem. Pharmacol., 48, s. 1605-10, Reitzera/., 1994, J. Med. Chem., 37, s. 3878-81, Seibert et al., 1994, PNAS USA, 91, s. 12013-17, Klein et al., 1996, Biochem. Pharmacol., 51, s. 285-90, Nantal et al., 1998, 9th Intern. Conference Inflamm. Res. Assoc, Nov. 1-5, Pennig et al., 1997, J. Med. Chem., 40, s. 1347-65 og Puig et al., 2000, J. Med. Chem., 43, s. 214-223.

COX-2-inhibitorer er en relativt variert grupper av forbindelser vurdert ut fra kjemisk struktur. Forbindelser som selektivt inhiberer COX-2 er beskrevet i mange patentdokumenter fra siste tiårsperiode. Enkelte av disse er WO 94/26781,

WO 94/20480, WO 94/13635, WO 95/00501, WO 94/27980, WO 94/15932,

WO 95/21817, WO 95/15316, WO 96/06840, WO 96/03388, WO 96/03387,

WO 96/03392, WO 96/25405, WO 96/24584, WO 96/03385, WO 96/16934,

WO 98/41516, WO 98/43966, WO 99/12930, EPO 673.366, WO 98/41511,

WO 98/47871, WO 99/20110, WO 99/23087, WO 99/14194, WO 99/14195,

WO 99/15513 og WO 99/15503, samt i US-patentene 5.380.738, 5.344.991, 5.393.790, 5.434.178, 5.474.995, 5.475.018 og 5.510.368.

WO 0040243 tilveiebringer nye pyridin-substituerte forbindelser, fremgangsmåter for fremstilling derav, anvendelse derav for behandling av cytokin-medierte sykdommer og farmasøytiske sammensetninger for anvendelse i slik terapi. Forbindelsene inhiberer CSBP/p38 kinase og inhibisjonen av denne kinasen fører til en reduksjon i syntesen av COX-2 og andre pro-inflammatoriske cytokiner.

Iniguez er al. diskuterer reguleringen av T celle aktivering. Behandling av T celler med mikromolare konsentrasjoner av NS398 eller celecoxib reduserte i betydelig grad tidlige og sene hendelser av T celle aktivering og foreslår at COX-2 selektive NSAID er immunosuppresive midler.

Kamoshita er al. beskriver anvendelse av protease inhibitorer så som DFP for å inhibere virkningen an viral kappe glykoprotein maturase for å påvirke intracellulær HIV type I gp160 prosessering i dyrkede celler.

Schrøder viser at infeksjon av monocytter med human immunsvikt virus type I (HIV-1) (stamme Ada-M) forårsket økte nivåer av leukotrien B4(LTB4) og prostaglandin E2(PGE2)in vitro, og at HIV inhibitoren Avarol reduserte i sterk grad nivåene av PTB4og PGE2med en IC50verdi i det mikromolare området.

To forbindelser som for tiden bringes på markedet er rofecoxib (4-(4-metylsulfonyl)fenyl)-3-fenyl-2(5H)-furanon) (I) i Vioxx® og celecoxib (4-(5-(4-metylfenyl)-3-(trifluormetyl)-1H-pyrazol-1-yl)-benzensulfonamid) (II) i Celebra®:

Rofecoxib er beskrevet i WO 93/0500501 fra Merck Frosst Canada og videre i Morrison, 1999, Clin. Ther., 21, s. 943-953, Chan era/., 1995, J. Pharmacol. Exp. Ther., 274, s. 1531-37 og i Nantel et al., 1998, supra.

Celecoxib er beskrevet av Geiss, 1999, Scand. J. Rheumatol., 109 (suppl.), s. 31-37 og av Penning et al., 1997, J. Med. Chem., 40, s. 1347-65. Celecoxib er angitt å være 375 ganger mer selektiv for COX-2 enn for COX-1.

Diverse andre COX-2-inhibitorer har vært evaluert i biologiske systemer, og enkelte av disse er BF 389 (III), CGP 28232 (IV), DFP, DFU, (V), DuP 697 (VI), etodolac (VII), FK 3311 (VIII), flosulide (IX), L-745.337 (X), meloxikam (Mobic®, US-patent 4.233.299, 4-hydroksy-2-metyl-N-(5-metyl-2-tiazolyl)-1,1 -dioksyd-2H-1,2-benzotiazin-2-karboksamid) (XI), MF tricyklisk (XII), nimesulide (XIII), NS-398 (XIV) og SC-58125 (XV):

Ytterligere forbindelser beskrevet for COX-2-inhibering er S-2474 (fra Shionogi, EP 595546, 5(E)-(3,5-di-tert-butyl-4-hydroksy)benzyliden-2-etyl-1,2-isotiazolidin-1,1-dioksyd) (XVI), JTE-522 eller RWK-57504 (4-(4-cykloheksyl-2-metyl-oksazolyl)-2-fluorbenzensulfonamid) (XVII), Darbufelone-mesylat (Pfizer,

WO 94/03448, mono-metansulfonatsalt av2-amino-5-((3,5-bis-(1,1-dimetyletyl)-4-hydroksyfenyl)metylen-4(5H)-tiazolon) (XVIII), 6089 (fra Kotobuki Pharmaceutical)

(XIX) , Valdecoxib (Pharmacia, 4-(5-metyl-3-fenyl-4-isoksazolyl)-benzensulfonamid)

(XX) , Paracoxib-natrium (Pharmacia, natriumsalt av N-((4-(5-metyl-3-fenyl-4-isoksazolyl)-fenyl)-sulfonyl)-propanamid) (XXI), 4-(2-okso-3-fenyl-2,3-dihydrooksazol-4-yl)-benzensulfonamid (Almirall-Prodespharma) (XXII) og Etoricoxib (MK-633, Merck & Co.):

De ovenfor beskrevne forbindelsene, dvs. de som har strukturen angitt i formel b nedenfor som anvendes ifølge foreliggende oppfinnelse kan brukes i de fremgangsmåter som er beskrevet nedenfor.

Indikasjonene for COX-2-inhibitorer er artritt, smertetilstander i muskel- og skjelettsystemet og generell smerte som har vært behandlet med klassiske NSAID, så som indometacin, diklofenak og naproksen. Det har nylig vært foreslått å benytte COX-2-inhibitorer i cancerterapi og eventuelt også cancerforebyggelse. COX-2-inhibitorer kan også ha mulighet for anvendelse i relasjon til Alzheimers sykdom og andre demens-assosierte hjerneprosesser.

Mulighetene for en klinisk anvendelse av COX-2-inhibitorer er omtalt for eksempel i Nature, 367, s. 215-216 (1994), i Drug News and Perspectives, 7, s. 501-512 (1994), i Annual Reports in Medicinal Chem., 30, s. 179-188 (1995) og i Oncogene, 18, s. 7908-7916 (1999).

Det har ikke spesifikt vært foreslått å benytte COX-2-inhibitorer ved antiviral terapi, eller nærmere bestemt ved HIV/AIDS-terapi, og ingen COX-2-inhibitorer har vært testet med hensyn til anti-HIV effekter. Det er dessuten ikke foreslått å benytte COX-2-inhibitorer (eller ikke-selektive COX-inhibitorer) som immunstimulerende midler ved behandlingen av immunsvikt av viral og ikke-viral opprinnelse.

HIV-infeksjon og AIDS er et vesentlig helseproblem med mer enn 33 millioner mennesker infisert med viruset på verdensbasis. De fleste infiserte mennesker befinner seg i Afrika (sub-Sahara) og i deler av Asia. I dag finnes to klasser av anti-AIDS-forbindelser i rutinemessig klinisk bruk; inhibitorer av HIV revers-transkriptase og inhibitorer av HIV-protease. HIV revers-transkriptase-inhibitorer kan inndeles i ikke-nukleoside revers-transkriptase-inhibitorer (NNRTI) og nukleoside revers-transkriptase-inhibitorer (NRTI).

De hyppigst anvendte NNRTI er nevirapin, delavirdin, efavirenz, emivirin og T180. De hyppigst anvendte NRTI erzidovudin, didanosin, stavudin og zalcitabin. Klinisk anvendelige HIV protease-inhibitorer omfatter inclinavir, palinavir og saquinavir.

Dagens behandling av HIV-infeksjon og AIDS er basert på en kombinasjon av flere medikamenter, en såkalt cocktail av inhibitorer av revers-transkriptase og protease-inhibitorer. Disse kombinasjonene betegnet HAART (highly active antiretro-viral therapy), er ganske effektive og kan redusere viruset tilbake til upåvisbare nivåer i pasientens blod. HAART er imidlertid ikke en helbredelse for pasienten, siden viruset fremdeles er tilstede i de immune cellene, og sykdommen kan gjen-oppstå på et hvilket som helst tidspunkt. Etter avbrudd av behandlingen har viremien maksimum, og hurtig progresjon til AIDS observeres ofte. Dessuten vedvarer immun-svikten og den HIV-spesifikke T-celle dysfunksjon under HAART. Denne terapien fordrer livsvarig behandling, og behandlingen er meget kostbar. Bare medikament-omkostningene overskrider ofte USD 15000. Dessuten er flere andre problemer assosiert med denne terapien; vanskeligheter med pasientetterlevelse (kompliserte medikamentregimer), utvikling av resistente virus, ikke-ideell farmakokinetikk, og slike bivirkninger som for eksempel undertrykkelse av benmarg og langvarige metabolske effekter.

Angående publiserte oversikter om anti-HIV terapi, se for eksempel: Hilgegroth, 1998, Pharm. uns. Zeit., 1998, 27, s. 22-25, Hilgegroth, 1998, Pharm. unsZeit., 7, s. 111-116, Stellbrink, 1997, DK Arztebl., 94, s. 2497-2503, Rettle et al., 1998, Int. J. STD AIDS, 9, s. 80-87, De-Clercq, 1998, Antiviral Res., 38, s. 153-179, Gait er al., 1995, TIBTECH, 13 s. 430-438 og Redshaw er al. i "Emerging Drugs: The Prospects of Improved Medicines", kapittel 6, s. 127-154,1997.

Som konklusjon er det, selv om multimedikament-kombinasjoner som HAART betydelig har forbedret prognosen for pasienter som lider av HIV-infeksjon, et medisinsk behov for nye forbindelser til antiviral terapi av HIV; spesielt midler som stimulerer immunsystemet. Foreliggende oppfinnelse er rettet mot dette behov.

Ekspresjon av COX-2 er normalt begrenset til hjerne/hjerne-prosesser, til artrittisk synovia og seter med vevsskade. COX-2 finnes ikke i normale lymfeknuter eller lymfocytter. Det har nå imidlertid overraskende vist seg at lymfeknuteceller hos mus infisert med immunsvikt-lidelsen MAI DS, uttrykker høye nivåer av COX-2. Dessuten inneholdt positivt selekterte CD4+ og CD8+ T-celler så vel som B-celler fra MAIDS-lymfeknuter høye nivåer av COX-2 (se Eksempel 2). Det har vist seg at denne COX-2 kan målrettes mot lindring av symptomer av immunsvikt-forstyrrelsen, f.eks. til å lindre T-celle dysfunksjon ved å virke som et immunstimulerende middel, f.eks. ved å utvikle antigen-spesifikke immunresponser.

Uten noe ønske om å bindes til denne teori, antas det at COX-2-aktivitet øker PGE2-produksjonen som i sin tur øker nivået av cAMP som aktiverer PKA-signaliseringsveien og resulterer i nedsatt lymfocyttfunksjon. Arbeid foretatt på mus med MAI DS in vivo illustrerer at COX-2-inhibitorer forbedrer immunfunksjonene til T-celler (se Eksempel 6).

Foreliggende oppfinnelse vedrører følgelig anvendelse av en COX-2-inhibitor med generell formel B:

hvor

Y representerer en cyklisk gruppe, fortrinnsvis en oksazolyl-, isoksazolyl-, tienyl-, dihydrofuryl-, furyl-, pyrrolyl-, pyrazolyl-, tiazolyl-, imidazolyl-, isotiazolyl-, cyklopentenyl-, fenyl- eller pyridylgruppe;

n er et heltall fra 0 til 3;

m er et heltall fra 0 til 4;

R6representerer en ketocyklyl-, cykloalkyl- eller arylgruppe, hvor gruppen eventuelt kan være substituert med én eller flere grupper eller atomer, fortrinnsvis med ett eller flere halogenatomer;

R7representerer hver uavhengig en substituent som kan være en hvilken som helst funksjonell gruppe, fortrinnsvis et hydrogen- eller halogenatom, eller en alkylgruppe hvor alkylgruppen kan være substituert med én eller flere grupper eller atomer;

Re representerer en alkylgruppe eller NHR10;

R9representerer halogenatom; og

R10representerer et hydrogenatom eller en alkylgruppe som eventuelt er substituert med én eller flere grupper eller atomer, fortrinnsvis med en acylgruppe;

eller et derivat eller farmasøytisk akseptable salter derav ved fremstillingen av et medikament til behandling eller forebyggelse av HIV eller et beslektet virus eller

AIDS.

Foreliggende oppfinnelse vedrører videre farmasøytisk blanding, kjennetegnet ved at den omfatter en COX-2-inhibitor eller et derivat eller farmasøytisk akseptabelt salt derav, som angitt i hvilket som helst av kravene 1 til 11, og et farmasøytisk akseptabelt fortynningsmiddel, bærer eller hjelpestoff for behandling eller forebyggelse av en lidelse som angitt i krav 1 eller 2. Den farmasøytiske blandingen ifølge foreliggende oppfinnelse omfatter ytterliggere én eller flere ytterligere COX-2-inhibitorer, derivater eller farmasøytisk akseptable salter derav, og/eller ett eller flere ytterligere virkestoffer.

Foreliggende oppfinnelse vedrører videre produkt, kjennetegnet ved at de omfatter en COX-2-inhibitor eller et derivat eller farmasøytisk akseptabelt salt derav, ifølge hvilket som helst av kravene 1 til 11, og én eller flere ytterligere COX-2-inhibitorer, derivater eller farmasøytisk akseptable salter derav, og/eller ett eller flere ytterligere virkestoffer som et kombinert preparat for samtidig, separat eller suksessiv anvendelse ved behandling eller forebyggelse av en lidelse som angitt i krav 1 eller 2.

Foreliggende oppfinnelse vedrører også anvendelse av en farmasøytisk blanding ifølge krav 12 eller 13 ved fremstillingen av et medikament for behandling eller forebyggelse av en lidelse som angitt i krav 1 eller 2.

I denne sammenheng refererer øket COX-2-aktivitet seg til økede aktivitets-nivåer, enten gjennom produksjonen av flere COX-2-molekyler (f.eks. øket ekspresjon), og/eller mer aktive molekyler (f.eks. omdannelse fra latente til aktive former eller opphevelse av inhiberingen av den aktive form). Fortrinnsvis kjennetegnes nevnte forstyrrelse ved nedsatt immunfunksjon, dvs. er en immunsvikt-tilstand, f.eks. oppviser lymfocytt-dysfunksjoner. I denne sammenheng refererer "immunsvikt" seg til nedsatt funksjon av celler som er involvert i normale immunresponser, særlig B- og T-celler. De her beskrevne forbindelsene som anvendes heri kan således benyttes til å oppnå immunstimulerende effekter for å forbedre immunresponser. COX-2-inhibitorer ansees derfor å ha immunmodulerende effekter.

Tilstander som kan behandles i henhold til foreliggende oppfinnelse er infeksjon med HIV (og infeksjon med beslektede virus i andre dyr, f.eks. SIV, FIV, MAIDS) og den resulterende AIDS.

Individer som kan behandles er fortrinnsvis pattedyr, fortrinnsvis mennesker, og selskapsdyr eller husdyr, så som hunder, katter, aper, hester, sauer, geiter, kyr, kaniner, rotter og mus.

I denne sammenheng refererer "behandling" seg til reduksjonen eller nedsettelsen, fortrinnsvis til normale nivåer, av ett eller flere av forstyrrelsens symptomer, f.eks. infeksiøsitet eller en reduksjon eller dempning av immun-dysfunksjon. "Forebyggelse" refererer seg til absolutt forebyggelse, dvs. fravær av påvisbart infeksiøst agens, f.eks. virus og/eller oppretthold av normale nivåer med hensyn til et bestemt symptom (f.eks. COX-2-aktivitet) eller reduksjon eller dempning av graden eller tidspunktet (f.eks. forsinkelse) av inntreden av vedkommende symptom.

Enzymet cyklooksygenase 2 er et nytt mål for HIV/AIDS-terapi. Betegnelsen "COX-2-inhibitor" står for en forbindelse som kan inhibere enzymet cyklooksygenase 2 uten vesentlig inhibering av cyklooksygenase 1 når det administreres i en bestemt konsentrasjon. Fortrinnsvis inkluderer det forbindelser som har selektivitet for cyklooksygenase-2-inhibering i forhold til cyklooksygenase-1-inhibering (f.eks. som bestemt ved COX-1 :COX-2 IC8o-forholdet i henhold til WHMA-testen, se nedenfor) på minst 10, mer foretrukket minst 50, og enda mer foretrukket minst 100.

(Selektivitetsforholdet for én bestemt forbindelse vil variere med den biologiske bestemmelse og den form som den uttrykkes i (fortrinnsvis uttrykt som forholdet COX-1 :COX-2 IC50eller IC80), se Tabell 1-4). De forhold som her er beskrevet,

refererer seg til data oppnådd gjennom én eller flere relevante velkjente COX-bestemmelser, fortrinnsvis ved å benytte rensede humanenzymer, f.eks. forholdet mellom ICso-verdier, for eksempel som bestemt av Engelhart er al., 1995, supra. Fortrinnsvis er imidlertid testen den WHMA-test som er beskrevet nedenfor.

Det er blitt foretatt en rekke analyser av relative styrker av COX-1 og COX-2 ved å benytte et stort utvalg testsystemer fra isolerte rensede enzymer på intakte celler og cellemodeller fra forskjellige arter. For tiden er imidlertid den mest generelt aksepterte modell den humane WBA (whole blood assay) og en modifisert versjon WHMA (William Harvey human modified whole blood assay) som er den foretrukne test. Disse testene gjør bruk av lett tilgjengelige humanceller for testing som fortrinnsvis er for human anvendelse av forbindelsene. De tar også hensyn til bindingen av NSAID til plasmaproteiner. Bestemmelse av selektivitet foretas dessuten fortrinnsvis ved ICeofremfor ved IC50siden konsentrasjonskurvene for inhibering av COX-2 og COX-1 ikke er parallelle, og siden de fleste forbindelser benyttes i doser som gir steady-state plasmakonsentrasjoner ved nærmere 80% inhibering (Warner et al., 1999, PNAS USA, 96, s. 7563-7568).

I WBA-testen behandles blod for COX-1-analyse med testmiddel etterfulgt 60 minutter senere av kalsium-ionofor og inkuberes i 30 min, hvoretter plasma oppsamles. For COX-2-analyse behandles blod med aspirin for å inhibere COX-1, og 6 timer senere med lipopolysakkarid og testmiddel og inkuberes i 18 timer, hvoretter plasmaet oppsamles. Deretter måles innholdet av tromboksan B2 i plasma ved radioimmunoassay, som et mål for COX-aktivitet.

I WHMA-testen foretas COX-1-analyse som ovenfor. For COX-2-analyse behandles blod med kondisjonert medium fra dyrkning av humane luftveis-epitelceller (A549) eksponert for interleukin 1 p i 24 timer og inkuberes med dette medium sammen med testmiddel i 60 min, hvoretter kalsium-ionofor tilsettes, etterfulgt 30 minutter senere av diklofenak for å stanse produksjon av prostanoider. Deretter oppsamles plasma som analyseres med henblikk på dets innhold av prostaglandin E2 i plasma, ved radioimmunoassay som et mål på COX-2-aktivitet. Inkuberingstiden for bestemmelse av COX-1- og COX-2-aktiviteter er like i sistnevnte test, hvilket gjør aktivitetene mer sammenlignbare, og WHMA er den foretrukne test.

Ved anvendelse av denne test, er selektivitet basert på C0X-2/WHMA-C0X-1 ved ICeovist i Tabell 4, hvor 0,2 og 0,02 representerer henholdsvis 5 og 50 gangers selektivitet for COX-2.

I henhold til et foretrukket trekk bestemmes derfor selektivitetsforholdet i henhold til WHMA-testen ved ICsoog forbindelser som har et selektivitetsforhold COX-2:COX-1 på mindre enn 0,2, fortrinnsvis mindre enn 0,05, f.eks. mindre enn 0,02, fortrinnsvis mindre enn 0,01, f.eks. <0,005, er særlig foretrukne for bruk i fremgangsmåtene ifølge oppfinnelsen. Uttrykt på en annen måte, har foretrukne forbindelser et COX-1 :COX-2 selektivitetsforhold (i henhold til WHMA-testen ved IC8o) på mer enn 2, fortrinnsvis mer enn 5, spesielt foretrukket mer enn 50 eller 100, som nevnt tidligere.

"Inhibering" refererer seg i denne sammenheng til en reduksjon i målbar cyklooksygenase-2-aktivitet. Dette kan oppnås ved å påvirke transkripsjon, translasjon, post-translasjonell modifikasjon eller aktivitet av COX-2. Fortrinnsvis oppnås imidlertid inhibering ved å inhibere enzymaktiviteten, dvs. interferere med det aktive setet av pre-eksisterende aktive COX-2-molekyler.

Fortrinnsvis har COX-2-inhibitorer en COX-2 IC50på mindre enn ca.

0,5^mol/liter, mer foretrukket mindre enn ca. 0,2 pmol/liter.

Denne klasse av forbindelser er i US-patent 6.025.353 angitt som anti-angiogene midler, og en videre beskrivelse av foretrukne substituenter og forbindelser i henhold til foreliggende oppfinnelse er den samme som i US-patent 6.025.353.

I slike forbindelser er Ra fortrinnsvis -NH2eller -CH3.1 videre foretrukne forbindelser er Y en pyrazolyl-, furyl- eller tienylgruppe. Fortrinnsvis er R6en arylgruppe som eventuelt er substituert med ett eller flere fluoratomer. Fortrinnsvis står n for 1 eller 2. Fortrinnsvis er R7et bromatom, en acylgruppe eller en substituert alkylgruppe så som -CF3.

Spesielt foretrukne forbindelser med formel B for anvendelse i henhold til oppfinnelsen er forbindelser som her er beskrevet og betegnet celecoxib, rofecoxib, DuP-697, SC-58125, DFU og MF tricyklisk.

I denne sammenheng innbefatter betegnelsen "alkyl" en hvilken som helst lang eller kort kjede, rettkjedet, forgrenet eller cyklisk alifatisk mettet eller umettet hydrokarbongruppe, eventuelt mono- eller polysubstituert med hydroksy-, alkoksy-, acyloksy-, nitro-, alkoksykarbonyloksy-, amino-, aryl-, okso- eller halogengrupper om intet annet spesifikt er angitt. De umettede alkylgruppene kan være mono- eller polymettede og kan innbefatte både alkenyl- og alkylgrupper. Slike grupper kan inneholde opptil 40, men fortrinnsvis 1 til 10 karbonatomer.

I denne sammenheng er cykliske ringer fortrinnsvis C5-7og inneholder eventuelt ett eller flere heteroatomer valgt fra oksygen, nitrogen og svovel.

Den her benyttede betegnelse "acyl" inkluderer både karboksylat- og karbonatgrupper, og for eksempel inkluderer acyloksy substituerte alkylgrupper for eksempel alkylkarbonyloksyalkyl. I slike grupper har enhver alkylendel fortrinnsvis karbonatominnhold som definert for alkylgrupper ovenfor. Foretrukne arylgrupper innbefatter fenyl og monocykliske 5-7-leddede heteroaromater, spesielt fenyl, og slike grupper kan selv eventuelt være substituert.

Representative substituerte alkylgrupper Ri inkluderer alkoksyalkyl, hydroksy-alkoksyalkyl, polyhydroksyalkyl, hydroksy-polyalkylenoksyalkyl og lignende, så som alkoksymetyl-, alkoksyetyl- og alkoksypropylgrupper eller acyloksymetyl-, acyloksy-etyl- og acyloksypropylgrupper, f.eks. pivaloyloksymetyl.

I denne sammenheng kan substituerte grupper være mono- eller polysubstituert med hydroksy-, alkoksy-, acyloksy-, nitro-, alkoksykarbonyloksy-, amino-, aryl-, okso- eller halogengrupper om intet annet spesifikt er angitt.

Særlig foretrukne forbindelser er imidlertid: rofecoxib, SC 58125 og celecoxib.

Fremgangsmåter for fremstilling av COX-2 inhibitorer for anvendelse i henhold til oppfinnelsen, er velkjent for fagmannen, særlig som beskrevet i litteraturen nevnt ovenfor.

En COX-2-inhibitor for anvendelse i foreliggende oppfinnelse kan inneholde ett eller flere asymmetrisentra og/eller én eller flere dobbeltbindinger, dvs. oppfinnelsen omfatter også anvendelsen av isomerer og racemater av de forbindelsene som her er beskrevet. Alle slike mulige isomerer ligger innenfor rammen av foreliggende oppfinnelse. COX-2-inhibitoren kan være i form av en isomerblanding av forbindelser eller mer foretrukket, i form av en renset isomer eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav.

Den farmasøytiske blanding av COX-2 inhibitorer til behandling av tilstander i henhold til oppfinnelsen kan formuleres som farmasøytisk akseptable salter og kan også inneholde farmasøytisk akseptable bærere som er velkjente på området.

Foreliggende oppfinnelse omfatter således også farmasøytiske blandinger som omfatter en COX-2-inhibitor eller et derivat eller farmasøytisk akseptabelt salt derav, som definert i kravene og et farmasøytisk akseptabelt fortynningsmiddel, bærer eller hjelpestoff for behandling eller forebyggelse av HIV eller et beslektet virus eller AIDS. Med "farmasøytisk akseptabelt" menes at hver ingrediens må være forlikelig med andre ingredienser i blandingen, så vel som fysiologisk akseptabelt for mottageren.

Dersom COX-2-inhibitoren er basisk, kan det fremstilles salter fra farma-søytisk akseptable ugiftige syrer, inklusivt uorganiske og organiske syrer. Særlig foretrukne salter er hydroklorid-, hydrobromid-, fosfor-, svovel-, sitron-, malein-, sitron- og vinsyresalter.

Dersom COX-2-inhibitoren er sur, kan det fremstilles salter fra farmasøytisk akseptable ugiftige baser, inklusivt uorganiske eller organiske baser. Særlig foretrukne salter er natrium-, kalium- og megluminsalter.

For behandlingen og forebyggelse av de her beskrevne lidelser kan COX-2-inhibitoren administreres peroralt, rektalt, topisk, bukkalt, ved inhalasjon eller parenteralt (f.eks. intramuskulært, subkutant, intraperitonealt eller intravenøst) i form av en injeksjon eller infusjon. De foretrukne administrasjonsformer vil være administrering peroralt, rektalt og ved injeksjon eller infusjon. Den mest foretrukne administrasjonsform vil hensiktsmessig være peroral administrering.

For alle administrasjonsformer administreres COX-2-inhibitoren i enhetsdose-formuleringer som vanligvis inneholder velkjente farmasøytisk akseptable bærere, adjuvanser og konstituenter. Virkestoffet kan således inkorporeres, eventuelt sammen med andre virkestoffer, som et kombinert preparat, med én eller flere konvensjonelle bærere, fortynningsmidler og/eller hjelpestoffer, for å fremstille konvensjonelle galeniske preparater så som tabletter, piller, pulvere, sugetabletter, doseposer, oblatkapsler, miksturer, suspensjoner, emulsjoner, løsninger, siruper, aerosoler (som et faststoff eller i et flytende medium), salver, myke og harde gelatinkapsler, suppositorier, sterile injiserbare løsninger, sterile pakkede pulvere og lignende. Bionedbrytbare polymerer (så som polyestere, polyanhydrider, poly-melkesyre eller polyglykolsyre) kan også benyttes for faste implantater. Blandingene kan stabiliseres ved bruk av frysetørking, underkjøling eller Permazyme.

Passende hjelpestoffer, bærere eller fortynningsmidler er laktose, dekstrose, sakkarose, sorbitol, mannitol, stivelser, akasiegummi, kalsiumfosfat, alginater, tragant, gelatin, kalsiumsilikat, mikrokrystallinsk cellulose, polyvinylpyrrolidon, cellulose, vann sirup, vann, vann/etanol, vann/glykol, vann/polyetylen, glykol, propylenglykol, metylcellulose, metylhydroksybenzoater, propylhydroksybenzoater, talk, magnesiumstearat, mineralolje eller fettsubstanser, som f.eks. hårdfett eller egnede blandinger derav. Sammensetningene kan dessuten innbefatte smøremidler, fuktemidler, emulgeringsmidler, suspenderingsmidler, konserveringsmidler, søtnings-midler, aromastoffer, adsorpsjonsforbedrere, f.eks. for nasal avlevering (gallesalter, lecitiner, surfaktanter, fettsyrer, chelatorer) og lignende. Blandingene ifølge oppfinnelsen kan formuleres slik at de gir hurtig, vedvarende eller forsinket frigjøring av virkestoffet etter administrering til pasienten ved å benytte velkjente fremgangsmåter.

Virkestoffet for administrering kan modifiseres hensiktsmessig for bruk i en farmasøytisk blanding. For eksempel kan virkestoffet stabiliseres ved for eksempel å benytte passende tilsetningsstoffer, som f.eks., salter eller ikke-elektrolytter, acetat, SDS, EDTA, citrat- eller acetatbuffere, mannitol, glycin, HSA eller polysorbat.

Konjugater kan formuleres for å gi forbedret lipofilitet, øket cellulær transport, øket løselighet eller for å muliggjøre målsøking. Disse konjugatene kan være spalt- bare slik at konjugatet oppfører seg som et prodrug. Stabilitet kan også oppnås ved å benytte passende metallkomplekser, f.eks. med Zn, Ca eller Fe.

Virkestoffet kan formuleres i en passende bærer for avlevering til, eller for målsøking av, bestemte celler, organ eller vev. De farmasøytiske blandingene kan således ha form av mikroemulsjoner, liposomer, niosomer eller nanopartikler som virkestoffet kan absorberes, adsorberes, inkorporeres eller bindes til. Dette kan effektivt omdanne produktet til en uløselig form.

Disse partiklene kan bære passende overflatemolekyler for å forbedre sirkula-sjonstiden (f.eks. serumkomponenter, surfaktanter, polyoksamine908, PEG, etc.) eller deler for stedsspesifikk målsøking, så som ligander til bestemte cellebårne reseptorer. Passende teknikker for medikamentavlevering og for målsøking er velkjent på området, men se for eksempel Kreuter, 1994, Eur. J. Drug Metab. Pharmacokinet., 3, s. 253-256; Shen, 1997, J. Drug Targeting, 5(1), s. 11-13; Mrsny, 1997, J. Drug Targeting, 5(1), s. 5-9; Pettit & Gombotz, 1998, TIBTECH, 16, s. 343-349; og Duncan, 1997, J. Drug Targeting, 5(1), s. 1-4, angående medikament-målsøking, og Simari & Nabel, 1996, Semin. Intervent. Cardiol., 1, s. 77-83; Torchilin, 1998, J. Microencapsulation, 15(1), s. 1-19; Klyashchitsky & Owen, 1998, J. Drug Targeting, 5(6), s. 443-458; Kreuter, 1996, J. Anat., 189, s. 503-505; Fasano, 1998, TIBTECH, 16, s. 152-157; Kataoka et al., 1993, 24, s. 119-132; Anderson, 1998, Nature, 392 (suppl.), s. 25-30; Langer, 1998, Nature, 392 (suppl.), s. 5-10; Gregoriadis, 1995, TIBTECH, 13, s. 527-536; Gregoriadis et al., 1997, FEBS Lett., 402, s. 107-110; Rolland, 1998, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 15(2), s. 143-198; Hope et al., 1998, Molec. Memb. Biol., 15, s.1-14; og Scherman et al., 1998, Curr. Opinion Biotech., 9(5), s. 480-485, angående peptid- og nukleinsyremolekyl-avlevering. Som et eksempel på spesifikk stedsrettet målsøking, se for eksempel Schåfer et al., 1992, Pharm. Res., 9, s. 541-546, hvor nanopartikler kan akkumuleres i HIV-infiserte makrofager. Slike metoder har klart særlige anvendelser i fremgangsmåtene heri.

Slike derivatiserte eller konjugerte virkestoffer er ment å falle innenfor definisjonen av inhiberende molekyler som benyttes i henhold til oppfinnelsen.

Den farmasøytiske blanding for peroral anvendelse inneholder således for eksempel virkestoffene og egnede fysiologisk akseptable midler til å danne tabletter, kapsler, løsninger, suspensjoner eller andre velkjente formuleringer for peroral administrering. Slike blandinger kan fremstilles etter en hvilken som helst kjent metode for fremstilling av perorale farmasøytiske blandinger. Slike blandinger kan inneholde ett eller flere biologisk virksomme midler og ett eller flere midler valgt fra gruppen av konserveringsmidler, inerte fortynningsmidler, viskositetsøkende midler, fargestoffer, søtningsmidler, granuleringsmidler, sprengningsmidler, bindemidler, osmotisk aktive midler, fuktemidler, suspenderingsmidler, materialer for fremstilling av formuleringer med forsinket frigjøring, oljer og vann.

Farmasøytiske blandinger for annen enn oral bruk, for eksempel suppositorier for rektal administrering eller løsninger for injeksjon eller infusjon, kan fremstilles ved å benytte velkjente metoder og tilsetningsstoffer for slike formuleringer. Alle formuleringer for injeksjon og infusjon må være sterile formuleringer.

Virkestoffer i slike blandinger kan omfatte fra ca. 0,01% til ca. 99 vekt.% av formuleringen, fortrinnsvis fra ca. 0,1 til ca. 50%, for eksempel 10%.

For behandling av lidelser i henhold til oppfinnelsen er dosen per dag i området 0,005 til ca. 150 mg/kg kroppsvekt. Dosen avhenger sterkt av valget av COX-2-inhibitorforbindelsen, den kliniske situasjon (type av virus, infeksjonsstatus og pasientens tilstand), pasientens alder og vekt, administrasjonsmåte og pasientens samlede bruk av medikamenter, inklusivt lengden av behandlingstiden. Mer foretrukne doser vil i alminnelighet være mellom 0,01 mg og 50 mg/kg kroppsvekt per dag, og enda mer foretrukket 0,05 mg til 20 mg/kg kroppsvekt per dag. Således kan for eksempel 25 mg rofecoxib eller 200 mg celecoxib administreres daglig ved peroral administrering til en voksen person.

Doseringsenheter utgjør i alminnelighet mellom 1 mg og 500 mg virkestoff.

I henhold til et aspekt ved foreliggende oppfinnelse kan én COX-2-inhibitor kombineres med én eller flere andre COX-2-inhibitorer for å behandle slike for-styrrelser som her beskrevet.

I henhold til et annet aspekt ved foreliggende oppfinnelse kan COX-2-inhibitoren som definert i kravene kombineres med én eller flere ytterligere COX-2-inhibitorer eller én eller flere andre medikamenter med forskjellige virkningsmåter for å behandle lidelsen, f.eks. HIV-infeksjonen eller AIDS. Eksempler på slike kombinasjoner kan være COX-2-inhibitor i kombinasjon med én eller flere NNRTI eller i kombinasjon med én eller flere NRTI eller i kombinasjon med én eller flere HIV protease- inhibitorer eller én eller flere HAART i kombinasjon med COX-2-inhibitoren.

I henhold til et ytterligere aspekt tilveiebringer foreliggende oppfinnelse blandinger som kombinerer én eller flere COX-2-inhibitorer med forbindelser som forbedrer tolererbarheten av virkestoffet, spesielt under langvarig behandling. Typiske forbindelser omfatter antihistamin og protonpumpe-inhibitorer for behandling eller forebyggelse av HIV eller et beslektet virus eller AIDS.

Oppfinnelsen retter seg således også mot en blanding omfattende en COC-2-inhibitor som definert i kravene sammen med én eller flere ytterligere COX-2-inhibitorer og/eller ett eller flere ytterligere virkestoffer for behandling eller forebyggelse av HIV eller et beslektet virus eller AIDS.

Oppfinnelsen er ytterligere rettet mot anvendelsen av slike blandinger slik som ovenfor beskrevet. Oppfinnelsen retter seg videre mot et produkt som omfatter de ovenfor beskrevne komponenter som et kombinert preparat for samtidig, separat eller suksessiv anvendelse ved behandling eller forebyggelse av HIV eller et beslektet virus eller AIDS.

Oppfinnelsen er beskrevet videre gjennom de følgende eksempler under henvisning til de følgende figurer: Figur 1 viser cykliske AMP-nivåer etter MAIDS-infeksjon i CD8+ celler (A), CD4+ celler (B) og B-celler (C). Mononukleære celler ble isolert fra lymfeknuter i mus infisert med MAIDS i forskjellige tidsrom og separert i CD4+, CD8+ og B-celler ved negativ seleksjon under bruk av en FACS-cellesorterer. Intracellulære cAMP-nivåer ble bestemt ved ultralydbehandling og radioimmunoassay. Søyler representerer gjennomsnitt ± SD (n=3 individuelle mus); Figur 2 viser MAIDS cAMP-nivåer i CD4+, Thy-1.2-negative og positive populasjoner. Lymfeknuteceller fra tre infiserte og tre alders-overensstemmende kontrollmus ble FACS-sortert i CD4+, Thy-1.2+ (åpne søyler) og CD4+, Thy-1.2-(fylte søyler) populasjoner, og intracellulære cAMP-nivåer ble bestemt som i Figur 1. Søyler representerer gjennomsnitt ± SD (n=3);

Figur 3 viser nivåer av proteinkinase A aktivitet i MAIDS versus villtype-mus.

(A) Kinaseaktiviteter ved bruk av Kemptide som substrat i nærvær (totalaktivitet, skraverte søyler) eller fravær (fri aktivitet, fylte søyler) av 5 \ iM cAMP ble undersøkt i

detergent-solubiliserte ekstrakter av lymfeknuteceller renset fra musemilt. Fosfo-transferaseaktivitet ikke inhibert av den PKA-spesifikke proteinkinaseinhibitor (PKI,

1 jiM) ble subtrahert for å vise bare den PKA-spesifikke aktivitet. Aktiviteter i infiserte mus (MAIDS; n=4) er vist i forhold til de for villtype-søsken av samme kull. (B) [<3>H-cAMP]-binding ble målt i det samme ekstrakt som under (A), og molmengder av R-monomer ble beregnet; Figur 4 viser immunlokalisering av PKA C-subenhet i celler av MAIDS og villtype-mus. Mononukleære celler fra kontrollmus (øvre rute) og mus infisert med MAIDS (de to nedre ruter) ble festet til objektglass ved cytospin (400 x g), fiksert og immunfarvet med anti-PKA-C polyklonalt antistoff og HRP-konjugert sekundært antistoff (brun flekk). Kontrastfarving er foretatt med hematoksylin (blåfarge på kromatin); Figur 5 viser effekten av PKA type I antagonisten Rp-8-brom-cAMP-fosfortioat (Rp-8-Br-cAMP) på T-cellefunksjon i MAIDS og villtype-mus. TCR/CD3-stimulert T-celleproliferasjon ble bestemt med isolerte T-celler fra MAIDS mus (A) og uinfiserte kontrollmus (B). Effekten av økende konsentrasjoner av cAMP-agonist (8-CPT-cAMP) på TCR/CD3-stimulert proliferasjon av CD3+ T-celler isolert fra MAIDS (åpne sirkler, stiplet linje) og kontrollmus (fylte sirkler og heltrukket linje) ble undersøkt hver for seg i de samme forsøk (C). Middelverdier av trippelbestemmelser ± SD er vist. Se Tabell 4 angående sammenslåtte data (n=11). Anmerkning: skalaforskjeller i A og B, mens i C er den TCR/CD3-induserte proliferasjon i fravær av cAMP-agonist normalisert til 100% for både MAIDS og kontroll T-celler; Figur 6 viser sekresjon av PGE2av normale og MAIDS-lymfeknuteceller in vitro. Usorterte lymfeknuteceller fra MAIDS-infiserte mus (fylte søyler, n =9) 20 uker etter infeksjon og alders-overensstemmende kontrollmus (skyggelagte søyler, n=4) ble dyrket i 48 timer i komplett medium, hvoretter utskilte nivåer av PEG2ble målt i supernatantene ved ELISA; Figur 7 viser effekten av en ikke-selektiv COX-inhibitor på T-celle immunfunksjon i normale og MAIDS-infiserte mus. Søyle 1 - kontrollmus + anti-CD3;

søyle 2 - kontrollmus + anti-CD3+ indometacin; søyle 3 - MAIDS-mus + anti-CD3; søyle 4 - MAIDS-mus + anti-CD3 + indometacin. T-celleproliferative responser ble bestemt i en blandet populasjon av usorterte lymfeknute-mononukleære celler gjennom [<3>H]-tymidininkorporering uten og i nærvær av den ikke-selektive COX-inhibitoren indometacin (50 ng/mL). T-celleaktivering ble oppnådd ved kryssligering av anti-CD3 (mAb 2C11; 4 ng/mL). Søyler viser gjennomsnittsverdier ± SD fra

kontroll- (n=3) og MAIDS-infiserte (n=5) mus, se Tabell 5 angående ytterligere data. Celler ble dyrket i 72 timer hvorunder [<3>H]-tymidin ble inkludert i de siste 4 timene; Figur 8 viser ekspresjon av COX-2 i forskjellige subsett av lymfeknutelymfocytter i normale (A) og MAIDS-infiserte (B) mus. CD4+ T-, CD8+ T- og B-celler ble FACS-sortert ved positiv seleksjon på grunnlag av ekspresjon av henholdsvis CD4-, CD8-og B220-molekyler. CD11 b- celler ble sortert ved negativ seleksjon (på grunnlag av fravær av CD11b). Celler fra MAIDS-infiserte og normale mus ble deretter lysert og 10fxg protein fra hver prøve underkastet immunblott-analyse med henblikk på ekspresjon av COX-2. Blottene ble samtidig omsatt med antistoffer mot aktin som kontroll; Figur 9 viser ekspresjon av CD11b i MAIDS- og villtype-lymfeknuteceller. Ekspresjon av CD11 b (ved strømningscytometri) av de forskjellige subsett av lymfeknutelymfocytter (CD4+, CD8+ T-celler og B220+ B-celler) fra MAIDS-infiserte mus og kontrollmus er vist. R1: CD11 b high; R2: CD11 b dim og R3: CD11 b -. Figur 10 viser ekspresjonsnivåer av COX-2 i lymfeknuter av MAIDS-infiserte mus og villtype-mus. Lymfeknuter ble fryse-snittet og underkastet COX-2 immunhistokjemisk farving (brunfarving). (a) Normal kontroll-lymfeknute med germinalsentrum farvet for COX-2. (b) Normal lymfeknute ved høyere forstørrelse. Celler som farvet positivt for HRP-farvereaksjon er "tingerbart legeme" makrofager med ingesjons-materiale (piler), (c) Lymfeknute fra MAIDS-infiserte mus (uke 20 etter infeksjon). Anmerkning: endret morfologi og arkitektur, (d) Høyere forstørrelse av MAIDS lymfeknutefarvet for COX-2. Anmerkning: antall celler med brun immunfarving i cyto-plasmaet og tallrike mitotiske figurer; Figur 11 viser effekten av in vivo administrering av en ikke-selektiv COX-inhibitor på T-celle immunfunksjon hos HIV-infiserte pasienter. T-celleproliferative responser ble bestemt i CD3+ T-celler som [<3>H]-tymidininkorporering fra 3 pasienter (pat. 1 til 3) som deltok i en fase II klinisk utprøvning og som fikk indometacin 25 mg tre ganger per dag peroralt i 14 dager i tillegg til trippel-kombinasjonsterapi. Det øvre diagram viser T-celle immunfunksjon på dag 0, dag 14 (etter 2 ukers behandling) og på dag 28 (2 uker etter avslutning), merket henholdsvis som søyle 1, 2 og 3. T-celleaktivering ble oppnådd ved kryssligering av anti-CD3 (mAb SpVT3b). A: Basal proliferasjon etter T-celleaktivering; B: proliferasjon i nærvær av Rp-8-Br-cAMP

(1 mM); anmerkning: grad av cAMP-mediert immunsvikt fremgår klart ved sammenligning av øvre og nedre diagram. Søyler viser gjennomsnittsverdier ± SD fra trippel-

bestemmelser. Celler ble dyrket i 72 timer, hvorunder [<3>H]-tymidin ble inkludert i de siste 16 timene; Figur 12 viser effekten av in vivo administrering av en ikke-selektiv COX-inhibitor indometacin på T-celleproliferasjon av HIV-infiserte pasienter, som beskrevet i Figur 11, men for 7 pasienter, angitt henholdsvis for pasientene 1 til 7, med fylte sirkler, åpne sirkler, fylte triangler, åpne triangler, fylte kvadrater, åpne kvadrater og fylte ruter. Gjennomsnittsverdier fra trippelbestemmelser er plottet inn, forbindelseslinjer viser utvikling hos hver pasient. Figur 13 viser effekten av rofecoxib, en COX-2 spesifikk inhibitor, på T-celle immunfunksjon i MAIDS infiserte mus. T-celleproliferative responser ble bestemt i en blandet populasjon av usorterte mononukleære lymfeknuteceller ved [<3>H]-tymidin-inkorporering uten og i nærvær av økende konsentrasjoner (1,9 til 500 nM) av den COX-2 spesifikke inhibitor, rofecoxib. T-celleaktivering ble oppnådd ved kryssligering av anti-CD3 (mAb 2C11; 4 ng/mL). Middelverdier fra trippelbestemmelser er vist sammen med en sigmoid kurvetilpasning. Celler ble dyrket i 72 timer hvorunder [<3>H]-tymidin ble inkludert i de siste 4 timene; Figur 14 viser effekten av celecoxib, en COX-2 spesifikk inhibitor, på T-celle immunfunksjon i MAIDS infiserte mus, som beskrevet i Figur 13 for rofecoxib; Figur 15 viser effekten av rofecoxib og celecoxib sammenlignet med indometacin, på sekresjonen av PGE2av lymfeknute- (LN) celler ex vivo for kontrollmus (1) eller MAIDS-mus (2). Usorterte LN-celler ble dyrket i komplett medium i eller uten nærvær av PGE2-indusere, lipopolysakkarid (LPS; 4 ng/mL); den uspesifikke cyklooksygenase-inhibitoren indometacin (50 ng/mL); og de COX-2 spesifikke inhibitorene rofecoxib (0,125 \ M) og celecoxib (0,125 Etter 48 timer ble konsentrasjonen av PGE2målt ved EIA i supernatantene. Tre individuelt infiserte mus (uke 20) og tre sammenslåtte alders-overensstemmende kontroller ble analysert. Gjennomsnitt standardavvik er vist; og Figur 16 viser effekten av in vivo behandling av MAIDS-mus med rofecoxib på T-celle immunfunksjon. MAIDS-mus forble enten ubehandlet (ubehandlet 1 til 3) eller behandlet med rofecoxib per os i 7 dager (3 mg/kg/dag administrert én gang per dag, behandlet 1 og 2) administrert via sonde innført i ventrikkelen. Deretter ble T-celleproliferative responser bestemt in vitro i en blandet populasjon av usorterte mononukleære lymfeknuteceller fra behandlede og ubehandlede dyr, ved [<3>H]- tymidininkorporering uten (kolonne A) og i nærvær av Rp-8-Br-cAMP (0,5 eller 1,0 mM, henholdsvis kolonne B og C). T-celleaktivering ble oppnådd i alle prøver ved kryssligering av anti-CD3 (mAb 2C11; 4 jig/mL). Kontroll representerer T-celle proliferasjon i uinfiserte mus. Middelverdier fra trippelbestemmelser er vist. Celler ble dyrket i 72 timer, hvorunder [<3>H]-tymidin ble inkludert i de siste 4 timene; Figur 17 viser effekten av in vivo behandling av MAIDS-mus med rofecoxib eller celecoxib på T-celle immunfunksjon. MAIDS-mus ble injisert bærer (intralipid), behandlet med rofecoxib i intralipid ved intraperitoneal injeksjon (3 mg/kg/dag administrert én gang per dag, n=6) eller behandlet med celecoxib ved intraperitoneal injeksjon (20 mg/kg/dag administrert én gang per dag, n=5) i 18 til 20 dager. Deretter ble T-celleproliferative responser bestemt in vitro som beskrevet for Figur 16, men uten Rp-Br-cAMP. Kontroll representerer T-celleproliferasjon i uinfiserte mus. Gjennomsnittsverdier fra trippelbestemmelser er vist (sorte sirkler) sammen med 25 til 75% prosentil (innrammede områder) og medianverdi (linje i innrammingen). Søyler representerer spredning; og Figur 18 viser effekten av in vivo behandling av MAIDS-mus med meloxikam på T-celle immunfunksjon. Osmosepumper (Alzet, 100 \ iL) med meloxikam (frigjørings-hastighet på 70 ng/dyr/dag) eller fosfatbuffret saltvann (PBS) ble implantert subkutant på MAIDS-mus (14 uker etter infeksjon) og friske mus i 14 dager. A) Deretter ble T-celle proliferative responser bestemt in vitro som beskrevet for Figur 17. Gjennomsnittsverdier ± s.e.m. (standard error of the mean) fra hver gruppe er vist. Effekten av meloxikambehandling på anti-CD3 stimulert proliferasjon av celler fra MAIDS-mus (fylte søyler) sammenlignet med tilsvarende av MAIDS-mus som fikk PBS (åpne søyler) er signifikant (p<0,05). B) Blandede lymfeknutekulturer fra gruppen av mus under A) behandlet in vivo med meloxikam eller PBS ble igjen tilsatt meloxikam (2,5 ng/ml_) i cellekultur in vitro, anti-CD3 indusert T-celleproliferasjon ble bestemt som under A), og effekten av meloxikam igjen tilsatt in vitro (åpne søyler), ble sammenlignet med responsen av cellene uten noen in vitro tilsetning (fylte søyler) (p=0,005). C) Rp-8-Br-cAMP (0,5 mM) ble tilsatt til in vitro cellekulturer av blandede lymfeknutekulturer fra gruppene av mus i A) behandlet in vivo med meloxikam eller PBS, anti-CD3 indusert T-celle proliferasjon ble bestemt som under A), og effekten av Rp-8-Br-cAMP in vitro (åpne søyler) ble uttrykt som antall ganger induksjon over den for celler som ikke fikk noen in vitro tilsetning (fylte søyler).

Statistikk ble foretatt etter Mann-Whitney U-test for sammenligning av to grupper av dyr og med Wilcoxon Matched Pairs Test for sammenligning av samme gruppe med to forskjellige behandlinger.

EKSEMPLER

EKSEMPEL 1

Mus med MAIDS (murine acquired immunodeficiency syndrome) har en cAMP/PKA-type l-indusert T-celle-dysfunksjon.

MAIDS (Murine acquired immunodeficiency syndrome).

En rekke studier har ansett MAIDS som en mulig modell for HIV-infeksjon av mennesker. Dette syndrom utvikles etter infeksjon med et replikasjonsdefekt retrovirus som koder for en Pr60<9ag>polyproteinvariant (Chattopadhyay er al., 1991, J. Virol., 65, s. 4232-4241; Jolicoeur, 1991, FASEB J., 5, s. 2398-2405). Dette syndrom er assosiert med progressiv lymfeproliferasjon i milten og lymfeknutene og alvorlige immundefekter. Selv om det defekte retrovirus som er ansvarlig for MAIDS for det meste infiserer B-celler (Aziz, 1989, Nature, 338, s. 505-508), oppviser CD4<+>T-celler en alvorlig dysfunksjon og anergi av mitogenstimulering in vitro. En stor andel CD4<+>T-celler (men ikke CD8<+>T-celler) hos infiserte mus kjennetegnes også av en uvanlig Thy-1 negativ fenotype (Holmes et al., 1990, Eur. J. Immunol., 20, s. 2783-2787; Moutschen et al., 1994, Scand. J. Immunol., 39, s. 216-224 (MAIDS)). I normale uinfiserte mus finnes CD4<+>Thy-1" T-celler selektivt i de germinale sentrene hvor de korresponderer med nylige antigen-spesifikke emigranter.

Den mekanisme som Pr60<9ag>proteinvarianten induserer T-celle abnormiteter etter, er ikke kjent. Løselige faktorer utskilt av infiserte celler har vært hevdet å påvirke funksjonen av T-celler (Simard, J. Virol., 68, s. 1903-1912) i en avstand, men naturen til slike mediatorer har aldri vært utforsket. Andre studier har antydet at direkte, beslektede interaksjoner mellom CD4<+>T-celler og antigenpresenterende celler er nødvendige for induksjonen av T-celledefekter (Green, 2001, J. Virol., 70, s. 2569-2575; de Leval, 1998, J. Virol., 72, s. 5285-5290.

Adenylatcyklase-cAMP-proteinkinase A-veien spiller en viktig rolle ved reguleringen av immunresponser (Kammer, 1991, Immunol. Today, 9, s. 222-229). Øket konsentrasjon av cAMP er kjent å inhibere proliferative responser av T-celler overfor forskjellige stimuli som f.eks. anti-CD3 mAb og interleukin-2. En nylig rapport har antydet at nedregulering av JAK3-tyrosinkinasen kunne representere en mekanisme som cAMP inhiberer T-celleproliferasjon etter (Kolenko, 1999, Blood, 93, s. 2308-2318). Cyklisk AMP kunne også indusere nedreguleringen av membran-proteiner siden murine tymocytter eller tymonceller eksponert for cAMP-induserende midler, så som norepinefrin, nedregulerer Thy-1-ekspresjon etter en mekanisme som involverer destabilisering av mRNA (Wajeman-Chao, J. Immunol., 161, s. 4825-4833).

Prostaglandin E2(PGE2), en potent induser av cAMP, utskilles hovedsakelig av monocytter, makrofager og aktiverte T-celler. PGE2forskyver balansen fra T-hjelper type 1-celler mot T-hjelper type 2-celler ved å inhibere IL-2- og å øke Is-produksjon (Betz& Fox, 1991, J. Immunol., 146, s.108-113; Meyaard, 1997, Blood, 89, s. 570-576). Det vrir også differensieringen av B-celler i retning av IgE-produksjon (Fedyk & Phipps, 1996, PNAS USA, 93, s. 10978-10983). Prostaglandin-syntese er resultat av den suksessive virkning av cyclooksygenase-1 og -2 (COX-1 og COX-2) og spesifikke PG-syntaser (Smith & DeWitt, 1996, Adv. Immunol., 62, s. 167-215). Mens COX-1-ekspresjon i stor grad er konstitutiv og ubikvitær, induseres COX-2 bare i visse celletyper (makrofager, fibroblaster, glattmuskelceller) av NO og inflammatoriske cytokiner så som IL-1 og TNF-a.

Den mekanisme som er ansvarlig for T-celle-dysfunksjon ved MAIDS er fortsatt lite klarlagt. CD44 T-celler er fortrinnsvis involvert, mens flere rapporter har antydet at endringen av CD8<+>T-celler bare skyldes mangelen på adekvat CD4<+>T-cellehjelp. Inhiberingen av B-celleresponser er derimot intrinsisk og kan ikke ute-lukkende forklares av defekte CD4<+>lymfocytter. Oppfinnernes observasjon av en selektiv økning av cAMP i B-celler og CD44 T-celler og ikke i CD8<+>T-celler er derfor forenelig med involveringen av cAMP i den anerge prosess som er assosiert med

MAIDS.

Så vidt oppfinnerne kjenner til er dette den første demonstrasjon av et sub-setts selektive økning av cAMP i en sykdomsmodell. Dersom en løselig faktor som f.eks. prostaglandin E2virkelig er ansvarlig for cAMP-induksjon, hva kunne da forklare subsett-selektiviteten av dets virkning? Tidligere studier har sammenlignet ekspresjonen av forskjellige prostanoide reseptorer på CD4<+>og CD8<+>T-celler og konkludert med lignende ekspresjonsmønster i begge subsett. Normale CD8<+>T-celler er fullstendig følsomme for de cAMP-induserende effekter av PGE2. En mulig forklaring kunne skje på post-reseptornivået, idet hukommelse/aktiverte T-celler er mer responsive for PGE2enn naive T-celler. I MAIDS, hvor MHC klasse ll-avhengige prosesser er involvert, kunne CD4<+>T-celler oppnå en spesiell aktiveringstilstand som gjør dem mer følsomme overfor effekten av en gitt konsentrasjon av PGE2. Post-reseptor modulering av prostanoide effekter medieres i prinsippet av G-reseptor-kinaser (GRK) som frakobler protein G fra den tilsvarende membranreseptor. Inflammatoriske tilstander som f.eks. reumatoid artritt, kjennetegnes ved en nedregulering av GRK og derfor av en øket lymfocyttfølsomhet overfor cAMP-induserende midler, så som katekolaminer. Graden av GRK-aktivitet i CD4<+>og CD8<+>T-celler fra infiserte mus er ukjent.

Metoder benyttet i Eksempel 1 og 2

Mus og cellesuspensjon.

C57BL/6 hannmus ble oppformert i oppfinnernes egen dyrestall. Mus ble 4 og 5 uker gamle to ganger injisert i.p. 0,25 ml_ av det cellefrie virusekstrakt. Aldersover-ensstemmende kontrollmus ble to ganger injisert i.p. 0,25 ml_ fosfatbuffret saltvann (PBS). Til ulike tidspunkter etter infeksjon ble musene avlivet med CO2. Perifere lymfeknuter (inguinale, aksillare og cervikale) ble skilt med sprøyter for å oppnå enkeltcelle-suspensjoner og sendt gjennom en nylon cellefarver, vasket tre ganger med RPMI 1640 komplett medium og tellet på et Thoma cytometer etter trypanblått eksklusjon.

Virus.

Virale ekstrakter ble fremstillet fra lymfeknuter fra mus injisert 2 måneder tidligere med RadLV-Rs som tidligere beskrevet. Lymfeknuter ble oppsamlet, malt i PBS og sentrifugert ved 1,5 x 10<4>g i 30 min. Supernatanten ble sentrifugert på nytt i 30 min ved 1,5 x 10<4>g. Dette acellulære virale ekstraktet ble oppbevart i flytende nitrogen. XC-plakkbestemmelse ble benyttet til å kvantifisere de virale partiklene. Den virale tilberedning inneholdt 10<3>PFU (particle forming units) økotropisk virus/mL.

Antistoffer.

De følgende polyklonale antistoffene ble benyttet for western blotting forsøk; primært: polyklonalt kanin anti-COX-1- eller kanin anti-COX-2-antistoff. (Santa Cruz Biotechnology); 2.trinn: Pepperrot-peroksydase konjugert anti-kanin ble anskaffet fra Transduction Laboratories (Transduction Laboratories, UK). For strømningscytometri er de anvendte moAbs som følger: PE-konjugert CD4/L3T4 (YTS.191.1), FITC-konjugert CD45R/B220 (RA3-6B2), FITC-konjugert CD11 b/Mac-1 (M1/70), FITC-konjugert CD161/NK-1.1 (PK136), FITC-konjugert CD8a (Ly-2) og CD16/CD32 (Fcylll/ll-reseptor) (2.4G2) (alle fra Pharmingen: San Diego, CA, USA). CD3 moAb (145-2C11) ble renset i oppfinnernes laboratorium. Konkanavalin A (ConA) ble anskaffet fra Boehringer Mannheim Biochemica og fytohemagglutinin-M (PHA) fra Difco.

Strømningscytometri og cellesortering.

Analyser ble foretatt ved å benytte FACStar-plus strømningscellesorterer med Cellquest programvaren (Becton Dickinson). Forover og side «scatters» ble benyttet til å lede levedyktige lymfocytter. For dobbelt-farve analyse av FITC (grønt) og PE (orange), ble eksitasjon i blått ved 488 nm besørget av en argonlaser (luft-til-vannkjølt modell Spinnaker 1161; Spectra Physics, Mountain View, CA). For cellesortering ble 60 x 106 celler inkubert med anti-FcyRII (Fc Block) for å forebygge uspesifikke interaksjoner før merking i 20 min på is med de fluorokrom-konjugerte antistoffene. CD4<+>T-celler ble negativt selektert ved utarming av CD8<+>B220<+>CD11b<+>celler. Tilsvarende ble CD8<+>T-celler negativt selektert ved utarming av CD4<+>B220<+>CD11b<+>celler, og B-celler ved utarming av CD8<+>CD4<+>CD11b<+>celler. For hver sortering ble den selekterte fraksjon analysert på nytt ved strømningscytometri for å måle renheten, som alltid var høyere enn 97%.

Cyklisk AMP kvantifisering.

Lymfeknute éncelle-suspensjoner ble fremstilt som beskrevet ovenfor, vasket to ganger med RPMI 1640 og sentrifugert ved 1500 x g i 3 min. Celler ble deretter sprengt ved ultralydbehandling for å lette frigjøringen av intracellulært cAMP til ekstraksjonsløsningen (0,01 N HCI, 95% etanol). Løsningen inneholdende celle-lysatet, ble sentrifugert ved 13 x 104 x g i 15 min, og supernatanten ble overført til et ubrukt rør. Ekstraktet ble inndampet i en Speed Vac konsentrerer ved 45°C og pelleten oppbevart ved -20*C. Umiddelbart før bruk ble pelleten resuspendert i test-bufferen og cAMP-nivåer målt ved RIA (radioimmunoassay) ved å benytte12<5>l-merket cAMP testsystem (Amersham, England). Konsentrasjonen av cAMP i testprøver ble bestemt ved sammenligning med en buet standardkurve. For positive og negative kontroller ble lymfeknuteceller (1 x 10<6>) inkubert henholdsvis med 1 mM dDibutyryl-cAMP og 0,5 mM DDA (Adenylyl cyclase inhibitor) i 30 min ved 37°C i et varmeskap med fuktregulert 5% COrluft før måling av cAMP konsentrasjon.

Cellehomogenisering og immunblotting.

Celler (50 x 106) ble homogenisert ved ultralydbehandling (2x15 sek) på is i en buffer inneholdende 10 mM kaliumfosfat, pH 7,1, 250 mM sakkarose, 1 mM EDTA, 0,1% triton X-100 og 10 ng/mL hver av protease-inhibitorene kymostatin, leupeptin, pepstatin A og antipain (Tasken et al., 1993, J. Biol. Chem., 268, s. 21276-21283), og sentrifugert i 30 min (15.000 x g) for å fjerne uløselig materiale. Proteinkonsentrasjoner ble bestemt ved Bradford-målinger (BioRad). For immunblotting ble 40 ug protein separert ved 10% SDS-PAGE, overført til PVDF-membraner og inkubert med antistoffer i TBS/Tween med 5% fettfri tørrmelk og 0,1 % BSA (Blotto). Primære antistoffer ble påvist med HRP-konjugerte sekundære antistoffer (Jackson Laboratories/Transduction Laboratories) og ECL (Amersham).

Fosfotransferase-aktivitet av PKA.

Katalytisk aktivitet av PKA ble bestemt ved fosforylering av et PKA-spesifikt substrat (Leu-Arg-Arg-Ala-Ser-Leu-Gly) (Kemp et al., 1976, PNAS USA, 73, s.1038-1042) Kemptide, Peninsula Laboratories INC.) ved å benytte [y-<32>P]-ATP (spesifikk aktivitet 0,25 Ci/mMol, Amersham) i en testblanding beskrevet av R. Roskoski (Methods Enzymol., 1983, 99, s. 36). Fosfotransferase-aktivitet ble målt både med og uten nærvær av cAMP (5 jaM) og PKI (1 jaM), og de lave aktivitetsnivåene som ikke ble inhibert av PKI, ble subtrahert for å bestemme PKA-spesifikk aktivitet.

Cyklisk AMP-bindingsmålinger.

Kvantifisering av spesifikk [<3>H]cAMP-binding av solubilisert PKA-regulerende subenheter ble foretatt som beskrevet av Cobb & Corbin (Methods in Enzymology, 159, s. 202-208, 1988) i en blanding inneholdende [2,8-<3>H]cAMP (2,25 \ iM; spesifikk aktivitet på 5 Ci/m Mol; Du Pont-New England Nuclear). Molare forhold av R-subenheter ble beregnet på grunnlag av to cAMP-bindingsseter på hver regulatorisk subenhet-monomer.

Immuncytokjemi.

Kontroll- og infiserte lymfeknutelymfocytter ble fiksert med kald aceton i 5 min og vasket to ganger i 5 minutter hver gang i 0,1 % saponin i PBS. Endogen peroksydase ble blokkert ved inkubering med 0,3% hydrogenperoksyd i 0,1% saponin/PBS i 15 min. Etter rensing i saponin/PBS, ble objektglassene inkubert i 30 min ved RT med blokkeringsbuffer (1,5% normalt geiteserum i 0,1% saponin/PBS) etterfulgt av inkubering i 60 min med primær antistoffløsning ved RT i et fuktregulert skap. Antistoff mot Ca var fra Santa Cruz og ble fortynnet til 1:1000 i PBS inneholdende 0,1% saponin og 0,5% normalt geiteserum. Objektglassene ble deretter vasket som tidligere og inkubert med biotinylert geit antikanin antistoff. Dette ble senere påvist med ABC-kompleks (Novastain Super ABC Kit, Novocastra). Peroksydase ble påvist ved å benytte diaminobenzidin (DAB) (Dako) som gir et brunt bunnfall i nærvær av H2O2. Objektglass ble kontrastfarvet med hematoksylin-eosin (Sigma). Spesifisiteten ble testet ved inkubering av cytospin med spesifikt peptid mot PKA-Ca subenheten.

Immunhistokjemi.

Immunhistokjemi ble foretatt på 2 nm tynne histologiske snitt foretatt på 4% paraformaldehyd-fikserte og plastinnleirede vev (JB4-JBPolysciences). Snittene ble permeabilisert med trypsin (0,24%) i 1 min ved 37°C og deretter med Tween 20 (2%) i 30 min ved 37<0>C. Endogene peroksydaser ble stanset ved inkubering med H2O2(1%) i 30 min ved romtemperatur. Uspesifikke seter ble mettet med normalt geiteserum (1,5%) i løpet av 1 time ved 37°C. Snitt ble deretter inkubert over natten ved 4°C med primære polyklonale kanin anti-COX-1 eller kanin anti-COX-2-antistoff (Santa Cruz Biotechnology) og deretter i 2 timer med biotinylert geit anti-kanin- antistoff. Sistnevnte ble påvist med ABC-kompleks (Novostain Super ABC Kit, Novocastra). Peroksydase ble påvist ved å benytte diaminobenzidin (DAB) (Dako) som gir et brunt bunnfall i nærvær av H2O2. Snitt ble kontrastfarvet med hematoksylin-eosin (Sigma). Spesifisiteten ble testet ved inkubering av snitt med normalt kaninserum i stedet for primært antistoff.

Proliferasjonsmålinger for MAIDS-mus.

Proliferasjonsmålinger ble foretatt ved inkubering av 0,1 x 10<6>CD3+ T-celler/mL i et 100 jaL volum i flatbunnede 96-brønns mikrotiterplater. Aktivering ble oppnådd ved påfølgende tilsetning av monodisperse magnetiske kuler dekket med sau anti-mus IgG (Dynal, katalog nr. 110.02) i et celle:kule-forhold på 1:1, etterfulgt av tilsetning av anti-CD3 (klon 2C11) i en endelig fortynning på 4 |xg/mL for de forsøk som er vist. Den optimale konsentrasjon av antistoff ble omhyggelige titrert i det innledende oppsett, og parallelle forsøk med flere ulike fortynninger av antistoff ble alltid foretatt. Proliferasjon ble analysert ved inkubering av celler i 72 timer, hvorunder [<3>H]-tymidin (0,4 jiCi) ble inkludert i de siste 4 timene og oppsamlet med en cellehøster (Skatron, Sterling, VA, USA) på glassfiberfiltere. Inkorporert forløper ble tellet i en scintillasjonsteller (Tri-Carb, Packard, Meriden, CT, USA). Eventuelt anvendte cAMP-analoger ble tilsatt 30 min før aktivering ved tilsetning av anti-CD3 antistoffer. 8-CPT-cAMP var fra Sigma (St. Louis, MO) og Sp- og Rp-8-Br-cAMP var fra BioLog Life Science Company (Bremen, Tyskland) og ble alle oppløst til konsentrasjoner på 4 til 10 mM i PBS, og konsentrasjonene ble beregnet ved å benytte de ekstinksjons-koeffisienter som var oppgitt av produsenten. Indometacin ble løst i vann og benyttet

1 en konsentrasjon på 50 ng/mL.

PGE2-bestemmelse.

500 \ iL av en 48 timers kultursupernatant av lymfeknuteceller fra kontroll- og infiserte mus ble pipettert over i 1,5 mL polypropylenrør som så ble tilsatt 500 jaL vann:etanol (1:4) og 10 nL iskald eddiksyre. Rørene ble blandet forsiktig og fikk stå i 5 minutter ved romtemperatur. Deretter ble det foretatt sentrifugering ved 2500 x g i

2 min. Supernatantene ble oppsamlet og sendt gjennom Amprep C18 minikolonner, som var spylt med 2 kolonnevolurner 10% etanol. Kolonnene ble deretter vasket med 1 volum H20 og 1 kolonnevolum heksan. PGE2ble deretter eluert med 2 x 0,75 mL etylacetat. Fraksjonene ble oppsamlet og inndampet til tørrhet under nitrogen. Til slutt ble hver fraksjon rekonstituert i 100 pi. testbuffer, og PGE2ble bestemt ved å benytte Amersham EIA Kit som anbefalt av produsenten.

Statistiske analyser.

For sammenligning av to grupper av individer ble Mann-Whitney U-testen (to-halet) benyttet. Korrelasjonskoeffisienter (r) ble beregnet ved hjelp av Spearman's rangeringstest. Statistikk- og kurvetilpasningsanalyser ble foretatt ved å benytte henholdsvis Statistica (Statsoft. Inc. Tulsa, OK) og Sigma Plot (Jandel Corporation, Erkrath, Tyskland) programvare. Resultater er angitt som medianverdier og som 25. til 75. prosentiler om intet annet er angitt, p-verdier er tosidige og ansees signifikante når <0,05.

Eksperimentell del.

MAIDS-infeksjon fører til forhøyet cAMP i CD4+ T-celler.

Mus inokulert med en blanding av retrovirus, betegnet RadLV-RS, som forårsaker utvikling av MAIDS, ble avlivet til forskjellige tidspunkter etter infeksjon, og lymfeknuteceller ble sortert ved negativ seleksjon under bruk av en strømnings-cytometer/cellesorterer i rene B-celler og CD4+ og CD8+ T-celler. Intracellulære cAMP-nivåer ble målt i forskjellige cellepopulasjoner etter infeksjon. Som det fremgår av Figur 1 var cAMP-nivåene kraftig øket (mer enn 20 ganger) i CD4+ T-celler etter noen få ukers infeksjon. På senere trinn øket også B-celle cAMP-nivåer, mens kun mindre endringer ble observert i CD8+ T-celler. Når CD4+ T-celler ble separert i Thy-1.2+ og Thy-1.2- celler ved positiv sortering, var det videre klart at den vesentlige økning av cAMP-nivåer var i Thy-1.2- celler (Figur 2, 6 ganger). Denne normalt lav-abundante populasjon oppviste også høyere basalnivåer av cAMP enn de for Thy-1.2+ når begge populasjoner ble høstet fra uinfiserte mus.

Undersøkelse av PKA fosfotransferase-aktivitet i postnukleære supernatanter fra detergent-solubiliserte ekstrakter viste at totalnivåene av cAMP-avhengig kinase-aktivitet var redusert i MAIDS lymfeknuteceller, mens mindre endringer i aktiviteten ble observert i fravær av cAMP (Figur 3A). Dette stemmer overens med en kronisk aktivering og dissosiasjon av PKA som fører enten til nedbrytning av C-subenheten eller til translokasjon av C. Måling av cAMP-binding (Figur 3B) viste ingen endringer i totalnivåer av PKA R-subenheter. Immuncytokjemi av lymfeknuteceller fra MAIDS-og kontrollmus viste økede nivåer av immunreaktiv PKA C-subenhet i kjernen (Figur 4). Dette er igjen i overensstemmelse med en aktivering av cAMP-PKA-veien i

MAIDS.

PKA type I antagonist forbedrer T-celleproliferasjon av MAIDS T-celler.

For å undersøke effekten av forhøyet cAMP og aktivering av PKA ved inhibering av TCR/CD3-indusert T-celleproliferasjon, benyttet vi en svovel-substituert cAMP-analog (Rp-8-Br-cAMPS) som virket som en fullstendig antagonist av PKA type I (Gjertsen, Mellgren et al. 1995, 1665/id). Figur 5A viser at TCR/CD3-stimulert proliferasjon i T-celler fra MAIDS-infiserte mus var mindre enn 10% av den for T-celler fra uinfiserte kontrollmus (Figur 5B). Når effekten av PKA type I antagonisten ble bestemt i MAIDS T-celler, observerte vi dessuten en konsentrasjonsavhengig økning i TCR/CD3-indusert proliferasjon som var mer enn 4 ganger ved høyere konsentrasjon (Figur 5A), mens ingen stimulering ble observert ved behandling av kontroll T-celler (Figur 5B). Ved å se på 11 MAIDS-infiserte mus, hadde de alle alvorlig nedsatt T-celleproliferasjon sammenlignet med kontroller (p<0,001), og i 10 av i alt 11 mus forbedret PKA type I antagonisten T-celleproliferasjon (p<0,01; median 2,2 ganger, Tabell 5). Den stimulerende effekt av cAMP antagonisten var ikke uttømt selv ved de høyest anvendte konsentrasjoner (Figur 5A, og lignende data (ikke vist) ble oppnådd for alle mus i Tabell 5). Dette indikerer at løseligheten av for-bindelsen, affiniteten eller tilgjengeligheten for celler, kan være en begrensende faktor for den observerte effekt. En mer permeabel og potent PKA type I antagonist kan når den måtte bli tilgjengelig, ytterligere forbedre TCR/CD3-indusert proliferasjon av MAIDS T-celler.

Deretter ble effekten av cAMP antagonist på TCR/CD3-indusert proliferasjon undersøkt i fem MAIDS-infiserte mus og fire kontroller. T-celler fra MAIDS-infiserte mus viste en tydelig forskyvning av følsomhet mot inhibering av celleproliferasjon ved eksogent tilsatt 8-CPT-cAMP (Figur 5C og Tabell 5). Når den maksimale proliferasjonshastigheten av T-celler fra MAIDS-infiserte mus og de for kontroll T-celler ble normalisert til 100% (Figur 5C og data som ikke er vist), var det dessuten klart at i tillegg til en venstre forskjøvet cAMP-inhiberingskurve var stigningen av kurvene signifikant forskjellig (Hill koeffisienter på 0,6 (0,54 til 1,52) for T-celler fra følsomhet overfor inhibering med cAMP-analog tyder på en medvirkning fra forhøyd endogen cAMP i priming av cAMP-bindingssete B av PKA type I med påfølgende

økning i affiniteten av A-setet for den eksogent tilsatte cAMP-analog. Forandringen i kurvestigning fra en kooperativ, to-ligand setebindings-situasjon til en åpenbar ikke-kooperativ inhiberingskurve med 8-CPT-cAMP tyder også på B-sete okkupering av forhøyet endogen cAMP.

EKSEMPEL 2

Cyklisk AMP-indusert T-celle dysfunksjon av MAIDS skyldes øket PGE2-produksjon av CD11 b-positive celler med økede nivåer av COX-2

Forhøyet produksjon av PGE2i MAIDS.

Blandede lymfeknutecellepopulasjoner ble isolert fra MAIDS-infiserte mus og kontrollmus og dyrket in vitro. Utskilte PGE2-nivåer ble bestemt i medie-supernatanter etter 48 timers dyrkning og viste at MAIDS-infiserte celler utskilte 7 til 8 ganger mer PGE2enn kontrollceller.

Inhibering av PGE2-produksjon gjenoppretter T-celleproliferasjon i MAIDS.

Blandede lymfeknuteceller ble deretter aktivert med anti-CD3 antistoffer for å indusere proliferasjon av T-celler, og [<3>H]-tymidininkorporering ble undersøkt etter 72 timer. Proliferasjon av celler fra MAIDS-infiserte mus var igjen kun 10 til 20% av T-celleproliferasjonen av uinfiserte celler. Når imidlertid indometacin ble tilsatt til kulturene for å inhibere produksjon av PGE2i blandingskulturene, øket dette sterkt proliferasjon av celler fra 5 MAIDS-infiserte mus til nivåer som var sammenlignbare med de for kontrollmus (Figur 6). Ved å se på 10 ytterligere MAIDS-infiserte mus (Tabell 6), var effekten av indometacin på T-celleproliferasjon av blandede lymfocytt-kulturer meget signifikant (p<0,01). Behandling av kontrollkulturer med indometacin endret derimot ikke proliferasjon.

COX-2 uttrykkes i høye nivåer i lymfeknuter i MAIDS-infiserte mus.

Den konstitutivt uttrykte COX-1 er den normale kilde til cyklooksygenase-aktivitet som produserer PGE2. I MAIDS-mus kunne det ikke sees noen økning i COX-1 som kunne tilskrives de økte nivåene av PEG2(data ikke vist). Ekspresjon av COX-2 er normalt begrenset til hjerne/hjerne-fremspring, til artrittiske synovia og seter for vevsskade. COX-2 finnes ikke i lymfeknuter eller lymfocytter, som vist f.eks. for kontroll-lymfocytter i Figur 8 (øvre rute). Vi gjorde det overraskende funn at rå lymfeknuteceller fra MAIDS-infiserte mus uttrykker høye nivåer av COX-2 (Figur 8, nedre rute). Dessuten inneholdt positivt selekterte CD4+ og CD8+ T-celler så vel som B-celler fra MAIDS-lymfeknuter høye nivåer av COX-2. Derimot inneholdt negativt selekterte CD11b- celler kun lave nivåer av COX-2.

Ved å se på CD4+ og CD8+ T-celler og B-celler (B220-markør) fra MAIDS-infiserte mus og kontrollmus ved strømningscytometri, var det klart at CD11b markøren normalt ikke uttrykkes på T- eller B-celler. En klar andel av både CD4+ T-celler og B-celler fra MAIDS-infiserte mus var imidlertid CD11b bright (gating merket R1) og et ytterligere forråd av CD4+ T-celler og B-celler, så vel som CD8+ T-celler var CD11b dim (gating merket R2), hvilket indikerer at de hadde signifikant, men lavere nivåer av CD11b ekspresjon. Sub-populasjoner av MAIDS-infiserte CD4+ og CD8+ T-celler var henholdsvis CD11b bright og dim, mens majoriteten av B-cellene var positive. Sammen med det faktum at CD11b+ celler, og ikke CD11b- celler uttrykker COX-2, tyder dette på at både B-celler og T-celler i lymfeknuter fra MAIDS-infiserte mus uttrykker COX-2.

Ved å se på intakte lymfeknuter fra MAIDS-infiserte mus ved hjelp av immunhistokjemi er det klart at hovedarkitekturen er endret med tap av germinalsentere i MAIDS (uke 19 etter infeksjon) sammenlignet med kontrollmus (Figur 10, c versus

a). Ved høyere forstørrelse av objektglass immunfarvet for COX-2, er det klart at mens lymfeknuter fra kontrolldyr bare viser brun HRP-farving i ingestions-materialet i

makrofager (falske positive "tingerbare" legemer, Figur 10b), farver en stor andel av lymfeknuteceller i MAIDS positivt for COX-2 (Figur 10d).

EKSEMPEL 3

HIV-pasienter oppviser marginale effekter når de behandles med ikke-selektiv COX-inhibitor in vivo

Metoder

Negativ seleksjon av perifere blod CD3+ T-celler fra HIV-pasienter.

Perifere blod CD3+ T-celler ble renset ved negativ seleksjon fra buffy coats fra normalt friske donorer (Ullevål universitetssykehus, Blodbanken, Oslo, Norge). I korte trekk ble perifere mononukleære blodceller isolert ved densitetsgradient-sentrifugering (Lymphoprep, NycoMed, Oslo, Norge) etterfulgt av negativ seleksjon under bruk av monodisperse magnetiske kuler direkte dekket med antistoffer mot CD14 og CD19, og rotte anti-mus IgG-kuler dekket med antistoffer mot CD56, og en magnet. Magnetkulene var alle fra Dynal (Oslo, Norge, henholdsvis katalog nr. 111.12, 111.04 og 110.11), mens anti-CD56 antistoff var fra Pharmingen (San Diego, CA, kat. nr. 31660.d). Alle trinn ble foretatt ved A°C. Cellesuspensjoner ble analysert ved strømningscytometri og vist å bestå av mer enn 90% CD3+ celler.

Proliferasjonsbestemmelser ved bruk av HIV-pasient T-celler.

Proliferasjonsbestemmelser ble foretatt ved inkubering av 0,75 X 10<6>CD3+ T-celler/mL i et 100 |xL volum i flatbunnede 96-brønns mikrotiterplater. Aktivering ble oppnådd ved påfølgende tilsetning av monodisperse magnetiske kuler dekket med sau anti-mus IgG (Dynal, kat. nr. 110.02) i et celle:kule-forhold på 1:1 etterfulgt av tilsetning av anti-CD3 (klon SpvTab) ved en sluttfortynning på 1:125.000 for de viste forsøk. Den optimale antistoffkonsentrasjon ble omhyggelig titrert i det innledende oppsett og parallelle forsøk ved flere forskjellige antistoff-fortynninger ble alltid foretatt. Proliferasjon ble analysert ved å inkubere celler i 72 timer, hvorunder [<3>H]-tymidin ble inkludert i de siste 16 timene. Cellene ble vasket og høstet på glassfiltere og deretter analysert ved (J-scintillasjonstelling. cAMP-analoger ble når de ble benyttet, tilsatt 30 minutter før aktivering ved tilsetning av anti-CD3 antistoff. 8-CPT-cAMP var fra Sigma (St. Louis, MO).

Eksperimentell del

En pågående fase II klinisk utprøvning tester den immunstimulerende effekt av korttidsbehandling med en ikke-selektiv COX-inhibitor (indometacin) på surrogat-parametere på T-celler fra HIV-infiserte pasienter. I henhold til godkjent protokoll fikk pasientene 50 mg indometacin 3 ganger per dag (totaldose på 150 mg/dag) i 2 uker med prøveuttak på dag 0, dag 14 og dag 28 (2 uker etter seponering). Som følge av uheldige hendelser som f.eks. epigastrisk smerte og dyspepsi og avbrytelse av studien blant de opprinnelige pasientene, måtte imidlertid denne dose settes ned til 25 mg indometacin 3 ganger per dag (totaldose på 75 mg/dag). Figur 11 viser T-celle immunfunksjon (målt som proliferasjon etter aktivering) av de 3 pasienter (pat. 1 til pat. 3) som så langt fullførte undersøkelsen. Det øvre diagrammet viser proliferasjonsnivåer etter T-celleaktivering ved begynnelse (0 dager), ved avslutning av indometacinbehandling (14 dager) og 2 uker deretter (28 dager). Som det fremgår øket ikke pasientene 1 og 2 deres immunfunksjon med en ikke-selektiv COX antagonist administrert in vivo. I pasient 3 øket imidlertid T-celleresponser ca. 2,5 ganger og vedvarte opptil 2 uker etter indometacin-seponering. Figur 11b, nedre diagram, viser T-celleproliferasjon etter inkubering med en PKA-I selektiv cAMP antagonist, Rp-8-Br-cAMPS in vitro i cellekulturer. Graden av cAMP-mediert T-celle-dysfunksjon fremgår klart fra den reversering av proliferasjon som ble oppnådd med antagonisten (sammenlign øvre og nedre diagram; ca. 2x økning i proliferasjon i pasientene 1 og 3 til alle tidspunkter, men ingen effekt i pasient 2). Det er fra Fig. 11 klart at indometacin ikke har en overbevisende effekt som kan tilskrives mangelen på COX-2-selektivitet eller til dosebegrensninger som følge av ugunstige hendelser.

EKSEMPEL 4

HIV-pasienter oppviser marginale effekter etter administrering av ikke-selektiv COX-inhibitor in vivo (fortsettelse av forsøkene i Eksempel 3)

Metoder

Metodene som ble benyttet var som beskrevet i Eksempel 3.

Eksperimentell del

Resultater fra 7 pasienter i et pågående fase II klinisk forsøk (fortsettelse av Eksempel 3) som fikk indometacin peroralt 25 mg tre ganger per dag i 14 dager i tillegg til trippelkombinasjonsterapi er vist i Figur 12. Pasientene 1-3 tilsvarer de beskrevet i Eksempel 3. Problemet med administrering av indometacin er de ovenfor beskrevne ugunstige hendelser (Eksempel 3) som begrenser dosen til 25 mg tre ganger per dag. Med denne tillatte dose er virkningene av denne ikke-selektive COX-inhibitor marginal. Etter 14 dagers behandling hadde kun to av syv pasienter klart forhøyet T-celle immunfunksjon målt som proliferasjon etter T-celleaktivering, mens én pasient hadde nedsatt immunfunksjon og fire pasienter hadde ubetydelige endringer. To uker etter indometacin-seponering hadde fem av syv pasienter forhøyet immunresponsivitet i forhold til dag 0. Bare to pasienter hadde imidlertid mer enn to gangers økning i T-celleproliferasjon.

EKSEMPEL 5

COX-2 inhibitorer forbedrer immunfunksjon av MAIDS T-celler in vitro

Metoder.

De metoder som er benyttet i proliferasjonsbestemmelsen var som beskrevet i Eksempel 1. PGE2-testen var som beskrevet i Eksempel 1.

Eksperimentell del

Proliferasjonsbestemmelse

Blandede lymfeknuteceller ble isolert fra MAIDS-mus 17 uker etter infeksjon. Celler ble aktivert med anti-CD3 antistoff for å indusere proliferasjon av T-celler, og [<3>H]-tymidininkorporering ble undersøkt etter 72 timer som et mål på immunfunksjon. Proliferasjon av celler fra MAIDS-infiserte mus var igjen kun 5 til 20% av T-celle-proliferasjonen i uinfiserte celler (2000 til 12000 cpm i MAIDS-celler versus gjennomsnittlig 55000 cpm i celler fra uinfiserte mus). Når rofecoxib (Figur 13) eller celecoxib (Figur 14) ble tilsatt til kulturene øket dette imidlertid proliferasjonen av celler fra MAIDS-infiserte mus to til tre ganger på en konsentrasjonsavhengig måte. Behandling av kontrollkulturer fra uinfiserte mus med rofecoxib eller celecoxib øket derimot ikke proliferasjon (0,8- til 1,0- gangers økning i nærvær av COX-2-inhibitorer, dvs. ingen økning, ikke vist. I T-celler fra MAIDS-mus varden konsentrasjon av rofecoxib og celecoxib som produserte halvt maksimal effekt (ED50) ca. 0,01 nm for rofecoxib og 0,03 nm for celecoxib. Det at submikromolare konsentrasjoner er effektive tyder klart på at den observerte økning i immunrespons medieres via inhibering av COX-2 og ikke av COX-1, som bare inhiberes ved mikromolare konsentrasjoner av rofecoxib og celecoxib (verdier fra Warner et al., 1999, PNAS USA, 96, s. 7563-7568). Reverseringen av inhibert T-celle immunfunksjon med rofecoxib og celecoxib resulterer således i nedsatt PGE2-produksjon i de blandede kulturene og derved minskede T-celle cAMP-nivåer via inhibering av COX-2.

PGE2-produksjon

Effekten av COX-2-inhibitorene rofecoxib og celecoxib på PGE2-nivåer ble også analysert. Som det fremgår av Figur 15 utskilte rå lymfeknuteceller fra MAIDS-mus 5 til 6 ganger mer PGE2enn lymfeknuteceller fra friske mus (se også Fig. 6). PGE2-nivåer som respons på LPS tiltok dessuten 8-10 ganger i infiserte mus sammenlignet med ca. 2 ganger i uinfiserte mus. Når celler ble inkubert i nærvær av COX-2-inhibitorene rofecoxib eller celecoxib, var PGE2-sekresjonen av MAIDS- lymfeknuteceller tilsvarende den for uinfiserte celler. Effekten av indometacin (sammenlign proliferasjon i Fig. 7) er inkludert som kontroll.

EKSEMPEL 6

COX-2-inhibitor forbedrer immunfunksjon av MAIDS T-celler in vivo.

Metodikk og eksperimentell del

Infiserte mus (17 uker etter infeksjon) ble behandlet peroralt i én uke med en dose rofecoxib tilsvarende den anbefalte dose for human anvendelse (ved å ta hensyn til den 7 ganger høyere clearance i gnagere). MAIDS-mus utvikler normalt et immunproliferasjonssyndrom med forstørrede lymfeknuter og milt. I overensstemmelse med dette hadde ubehandlede infiserte dyr en gjennomsnittlig miltvekt på 1,3 g og en gjennomsnittsvekt av sammenslåtte lymfeknuter på 1,7 g. Derimot hadde MAIDS-mus som fikk rofecoxib i 7 dager gjennomsnittlige miltvekter på 0,8 g og en gjennomsnittlig vekt av sammenslåtte lymfeknuter på 0,3 g, hvilket indikerer reversering av lymfoproliferasjon.

Resultatene er vist i Figur 16. Når T-celle immunfunksjon ble bestemt i rå lymfeknuteceller fra infiserte behandlede og ubehandlede mus, fremgikk det klart at mens ubehandlede infiserte dyr hadde anti-CD3-indusert proliferasjon i området 2000 til 10000 cpm (gjennomsnittlig 7300 cpm), hadde infiserte mus som fikk rofecoxib i én uke, T-celleresponser på anti-CD3 som hadde tiltatt 2,7- til 5,6-ganger sammenlignet med infiserte, ubehandlede mus. Mens infiserte ubehandlede mus oppviste øket anti-CD3-indusert T-celleproliferasjon i nærvær av Rp-8-Br-cAMPS, ble dessuten denne 2- til 3-gangers effekt tapt i mus behandlet med rofecoxib, hvilket tyder på at behandlingen med rofecoxib in vivo senket PGE2-nivåer og reverserte cAMP-mediert inhibering av T-cellefunksjon.

EKSEMPEL 7

In vivo behandling av MAIDS-mus med rofecoxib eller celecoxib øker T-celleresponser på anti-CD3 og immunresponser

Metodikk og eksperimentell del

Infiserte mus ble behandlet med rofecoxib og celecoxib tilsvarende den anbefalte dose for human anvendelse (og ved å ta hensyn til den 7 ganger høyere clearance i gnagere, henholdsvis 3 og 20 mg/kg/dag). Parenteral administrering ble oppnådd ved intraperitoneal injeksjon av COX-2-inhibitorer formulert i intralipid. Resultatene er vist i Figur 17.

Når T-celle immunfunksjon ble bestemt i rå lymfeknuteceller fra infiserte behandlede og ubehandlede mus 18 til 20 dager etter infeksjon, var det klart at mens ubehandlede infiserte dyr hadde anti-CD3-indusert proliferasjon i området 10000 cpm, hadde infiserte mus som fikk rofecoxib i 18 til 20 dager, T-celleresponser på anti-CD3 som var øket ca. to ganger sammenlignet med infiserte ubehandlede mus. Tilsvarende forbedret celecoxib immunresponser i celler fra storparten av gruppen av injiserte mus til ca. 3 ganger mer enn ubehandlede uinfiserte mus.

EKSEMPEL 8

In vivo behandling av MAIDS-mus med meloxikam øker T-celle immunfunksjon

Metodikk og eksperimentell del

Infiserte og friske mus ble behandlet med 2,8 mg/kg/dag meloxikam, som tilsvarer til den anbefalte dose for human anvendelse, hvor det er tatt hensyn til den 7 ganger høyere clearance i gnagere. Parenteral administrering ble oppnådd ved subkutan implantasjon av osmosepumper fylt med vannløselig meloxikam-injeksjonsforbindelse. T-cellefunksjon ble bestemt og resultatene er vist i Figur 18.

Når T-celle immunfunksjon ble bestemt i rå lymfeknuteceller fra behandlede dyr og kontroll- (PBS) behandlede infiserte mus etter 2 ukers behandling, var det klart at mens PBS-behandlede infiserte dyr hadde anti-CD3-indusert proliferasjon i området 500 cpm, hadde infiserte mus som fikk meloxikam i 14 dager, T-celle immunresponser på anti-CD3 som var signifikant forhøyet sammenlignet med infiserte mus som bare fikk PBS (Fig. 18a, mer enn 10 ganger; p<0,05).

Når meloxikam ble tilsatt tilbake til cellekulturene var immunresponsen under den 3 dagers in vitro T-celleproliferasjonstesten for å forhindre frigjøring fra in vivo inhiberingen med meloxikam og derved reaktiveringen av COX-2 i den meloxikam-behandlede gruppen, to ganger høyere enn uten tilsetning av meloxikam in vitro

(p=0,005) og sammenlignet med den for MAIDS-mus som fikk PBS in vivo, var effekten igjen signifikant (Fig. 18b, p<0,05).

Derimot oppviste bare MAIDS-mus som fikk PBS in vivo og ikke meloxikam-behandlede mus, økte immunresponser når den PKA type l-selektive cAMP antagonist, Rp-8-Br-cAMPS, ble tilsatt til de anti-CD3-stimulerte blandede lymfe-knutekulturene in vitro (Fig. 18c). Det at effekten av cAMP antagonist er fraværende i meloxikam-behandlede MAIDS-mus, tyder på at in vivo meloxikam-behandling reduserer eller fjerner den cAMP-induserte immunsvikt av MAIDS og gjennoppretter immunfunksjon.

Claims (15)

1. Anvendelse av en COX-2-inhibitor med generell formel B:

hvor Y representerer en cyklisk gruppe, fortrinnsvis en oksazolyl-, isoksazolyl-, tienyl-, dihydrofuryl-, furyl-, pyrrolyl-, pyrazolyl-, tiazolyl-, imidazolyl-, isotiazolyl-, cyklopentenyl-, fenyl- eller pyridylgruppe; n er et heltall fra 0 til 3; m er et heltall fra 0 til 4; R6representerer en ketocyklyl-, cykloalkyl- eller arylgruppe, hvor gruppen eventuelt kan være substituert med én eller flere grupper eller atomer, fortrinnsvis med ett eller flere halogenatomer; R7representerer hver uavhengig en substituent som kan være en hvilken som helst funksjonell gruppe, fortrinnsvis et hydrogen- eller halogenatom, eller en alkylgruppe hvor alkylgruppen kan være substituert med én eller flere grupper eller atomer; Rbrepresenterer en alkylgruppe eller NHR10; R9representerer halogenatom; og R10representerer et hydrogenatom eller en alkylgruppe som eventuelt er substituert med én eller flere grupper eller atomer, fortrinnsvis med en acylgruppe; eller et derivat eller farmasøytisk akseptable salter derav ved fremstillingen av et medikament til behandling eller forebyggelse av HIV eller et beslektet virus eller AIDS.

2. Anvendelse ifølge krav 1, hvor nevnte medikament er for administrering til mennesker eller selskapsdyr eller husdyr.

3. Anvendelse ifølge krav 1 eller 2, hvor nevnte COX-2-inhibitor har et COX-1 :COX-2 selektivitetsforhold på >5, fortrinnsvis >50, i henhold til WHMA-testen ved ICeo ■

4. Anvendelse ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 3, hvor Re er -NH2eller-CH3.

5. Anvendelse ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 4, hvor Y er en pyrazolyl-, furyl- eller tienylgruppe.

6. Anvendelse ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 5, hvor R6er en arylgruppe eventuelt substituert med ett eller flere fluoratomer.

7. Anvendelse ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 6, hvor n er 1 eller 2.

8. Anvendelse ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 7, hvor R7er et bromatom, en acylgruppe eller en substituert alkylgruppe.

9. Anvendelse ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 8, hvor nevnte COX-2-inhibitor er celecoxib, rofecoxib, DuP-697, SC-58125, DFU eller MF tricyklisk.

10. Anvendelse ifølge krav 9, hvor nevnte COX-2-inhibitor er rofecoxib.

11. Anvendelse ifølge krav 9, hvor nevnte COX-2-inhibitor er celecoxib.

12. Farmasøytisk blanding,karakterisert vedat den omfatter en COX-2-inhibitor eller et derivat eller farmasøytisk akseptabelt salt derav, som angitt i hvilket som helst av kravene 1 til 11, og et farmasøytisk akseptabelt fortynningsmiddel, bærer eller hjelpestoff for behandling eller forebyggelse av en lidelse som angitt i krav 1 eller 2.

13. Farmasøytisk blanding ifølge krav 12,karakterisert vedat den ytterligere omfatter én eller flere ytterligere COX-2-inhibitorer, derivater eller farmasøytisk akseptable salter derav, og/eller ett eller flere ytterligere virkestoffer.

14. Produkt,karakterisert vedat det omfatter en COX-2-inhibitor eller et derivat eller farmasøytisk akseptabelt salt derav, ifølge hvilket som helst av kravene 1 til 11, og én eller flere ytterligere COX-2-inhibitorer, derivater eller farmasøytisk akseptable salter derav, og/eller ett eller flere ytterligere virkestoffer som et kombinert preparat for samtidig, separat eller suksessiv anvendelse ved behandling eller forebyggelse av en lidelse som angitt i krav 1 eller 2.

15. Anvendelse av en farmasøytisk blanding ifølge krav 12 eller 13 ved fremstillingen av et medikament for behandling eller forebyggelse av en lidelse som angitt i krav 1 eller 2.