KR100380306B1 - 말라리아 항체조성물 및 그 검출방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 말라리아 항체 조성물 및 그 조성물을 이용한 말라리아 항체의 검출방법에 관한 발명으로 더욱 상세하게는 말라리아 항원 중 말라리아의 circumsporozoite protein(CSP), merozoite surface protein(MSP), duffy binding protein(DBP)의 항원성이 높은 부위를 선별하여 클로닝하고, 이를 대장균에서 발현시킨 후, 이 유전자 재조합 말라리아 항원을 혼합한 항체 검사용 조성물과 그 조성물을 이용하여 말라리아 감염 여부를 신속하고 대량으로 검사 할 수 있는 검출방법에 관한 발명이다.
Description
본 발명은 말라리아 항체 조성물 및 그 조성물을 이용한 말라리아 검출방법에 관한 발명으로 더욱 상세하게는 말라리아 항원 중 말라리아의 circumsporozoite protein(CSP), merozoite surface protein(MSP), duffy binding protein(DBP)의 항원성이 높은 부위를 선별하여 클로닝하고, 이를 대장균에서 발현시킨 후, 이 유전자 재조합 말라리아 항원을 혼합한 항체 검사용 진단 시약 조성물과 그 조성물을 이용하여 말라리아 감염 여부를 신속하고 대량으로 진단 할 수 있는 검출방법에 관한 발명이다.
일반적으로, 말라리아는 고열, 두통, 구토, 설사 등의 임상 증상을 나타내는 기생충성 질환으로써 세계적으로 매년 1억 1천만 명이 감염되어 2백만 명이 사망하는 무서운 질병이다. 이것은 모기에 의해 매개되는 원충성 질환으로 열대와 아열대 지방에서 주로 발생한다(Curtis 등).
말라리아는 적혈구나 간세포 내에서Plasmodium종에 속하는 원충이 감염되어 일으키는 질병으로 모기에 의하여 전파되며 사람에서 발생하는 말라리아는Plasmodium falciparum, Plasmodium vivax, Plasmodium malariae, Plasmodium ovale등 4종이 알려져 있다. 그 중에서도P. falciparum과P. vivax가 전세계에서 발생되는 말라리아의 95% 이상을 차지하며,P. vivax가Plasmodium종 중에서 온대, 아열대, 열대 지역에서 호발하며, 최근 우리나라에서 발생한 토착형 말라리아는 모두P. vivax이었다. 말라리아의 생활사는 다음과 같다.
모기 sporozoites→사람 혈류→간 실질성(parenchymal) 세포(무성 증식)→간세포의 분열소체(merozoite)→혈류의 분열소체→적혈구→trophozoite 및 shizont 단계→무성 생식→접합체→단상접합체→난모세포→포자소체→사람 혈류:
즉 merozoite가 반복 싸이클을 통해 적혈구에 감염되어 치명적인 임상증상을 초래한다. 일부 merozoite는 암과 숫 생식모세포로 분화되고, 이 상태에서 모기가 사람의 혈액을 흡혈하여 모기의 장에서 수정된다. MSP는 적혈구 상태 항원으로 merozoite의 주요 표면 항원으로 적혈구에 침입하는 과정에서 195 kDa merozoite 표면 단백질의 많은 부위가 떨어져 나가고, 크게 보존된 C 말단 프로세싱(processing) 절편(MSP-1)이 남게 되며, 이 절편이 큰 항원성을 갖는 것으로 알려졌다(Lyon, Cavanagh 등). Duffy 결합 단백질(DBP)은 135 kDa의 merozoite 단백질로 알려져 있는데, P. vivax의 merozoite는 duffy blood group 양성 인간 적혈구에만 침입한다. CSP는 전(pre) 적혈구에서 나타나는 sporozoite 단계의 주요한 코트 단백질로 여러 말라리아 종에 동시에 존재하며, 면역원성이 매우 높은 반복 서열이 중심 부위를 구성하고 있다(Doolan 등).
국내에서는 1913년 일본인 하세가와에 의해서 최초로 보고가 이루어진 이래 1983년의 보고를 마지막으로 토착형 말라리아는 보고되지 않았으나, 최근 1993년 휴전선 철책선 부근의 병사에서 말라리아가 발생한 후 1997년까지 약 2,000명 이상의 환자가 발생하고 1997년에는 무려 1,400명 이상의 환자가 발생하였다. 주요 발생 지역은 경기도 북부 지방으로 그 분포가 점차 서울 인천까지 남하하고 있다(채 등).
최근 들어 증가하는 말라리아는 우리나라 헌혈자의 57.2%(1992년)를 차지하는 군인에게 특히 문제가 되고 있으며 헌혈된 혈액에 의한 전파 사례가 보고되는 등 사회적 문제를 야기하고 있다. 이런 측면에서 헌혈 혈액의 말라리아 선별 검사가 필요하게 되었다. 말라리아 진단법은 말초 혈액 염색법인 후층 도말법이 표준 방법으로 사용되고 있으며, 아크리딘오렌지(acridine orange)를 이용한 형광 염색법도 사용되고 있다(임 등). 이 염색법은 말라리아 원충 자체를 검사하는 방법이지만 대량 검사나 선별검사법으로는 부적합한 방법이다. 항체 검사법으로 말라리아 감염자 적혈구를 이용한 간접형광 항체법이 개발되어 선별검사법으로 사용되었다. 그러나 이 방법은 사용항원의 종류에 따라 그 결과의 차이를 보일 수 있는 단점이 있다. 또한 말라리아 원충에서 분비하는 pLDH, GDH, ICH 등 각종 효소를 측정하여 말라리아 감염 여부를 진단하는 방법도 있으나 널리 쓰이지는 않는다(Ramasamy 등). 항원 검사에서는 원충이나 효소에 대한 단클론 항체를 개발하여 원충의 항원성분이나 효소를 측정하는 ELISA 방법이 개발되었으나 혈액 중의 말라리아 원충의 숫자에 따라 검출 감도가 좌우되기 때문에 한계성이 있다. 항원검사법에는 ELISA 방법이 아닌 rapid 진단 방법이 상품화 되어 있으나 이 검사법 역시 검출감도가 문제가 된다. ELISA 법을 이용한 항체 검사법은 말라리아 원충을 적혈구에서 배양하여 정제한 항원을 사용하는 방법이 일반적이다. 이 검사법을 이용하여 수혈 혈액에 대한 검사가 시험적으로 일부 국가에서 이루어졌다. 그런데 이 방법은 전체 균주를 항원으로 사용해야하므로 항원성이 높은 부위를 선별하여 사용할 수 없는 단점과 적혈구에서 배양을 하기 때문에 혼입된 적혈구 성분이나 배지 성분에 의한 비특이 반응이 문제가 된다.
또한 과거 국내에 크게 유행하던 토착형 삼일열 말라리아 소멸 이 후 1993년 7월 경기도 파주군 지역 비무장지대에 주둔한 병사에서 첫 말라리아 환자가 발생하고, 계속해서 매년 환자수가 기하급수적으로 늘어나고 있으며, 분포지역도 매우 광범위해지고 있다. 따라서 환자 감시 체계 수립, 모기 방제 등 적극적인 예방 및 관리 대책이 필요하다. 그러나 혈액도말법 이외에는 특별한 진단법이 없기 때문에 군대와 같은 고위험 지역의 역학 조사사업이나 혈액사업 같은 대량 검사에 사용하기 용이한 진단법을 개발하고자 하였다.
본 발명은 상기한 문제점을 해결하고, 상기한 필요성에 의해 안출된 것으로, 본 발명의 목적은 사람의 혈장이나 혈청 내 존재하는 말라리아 항체를 헌혈혈액과 같은 대량검사에 적용이 가능하고, 신속하게 감별이 가능한 말라리아 항체 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 말라리아의 감염여를 대량으로 신속하게 검출하는 방법을 제공하는 것이다.
도 1은 프라스미드의 제한 효소 패턴을 나타낸다. M은 사이즈 마커이고, 1 레인은 pA13U-MSP 프라스미드(BglⅡ/XbaⅠ)이고, 2 레인은 pMal-DBP 프라스미드(XbaⅠ/HindⅢ)이며, 3 레인은 pMal-CSP 프라스미드(XbaⅠ/HindⅢ)이다.
도 2는 각 재조합 단백질에 대한 프라스미드의 구조이다. 도 2-a는 MSP-malari의 재조합 프라스미드이다. 숙주는 MC1061, 벡터는 pA13U, 삽입된 유전자는 Plasmodium vivax의 merozoite 표면 항체로, 그 크기는 631-2,409bp 사이인 1,778bp이고, 융합단백질은 11kDa인 IciA 결합 단백질이고, 유전자 발현 후의 산물의 크기는 77.2kDa이며,
도2-b는 DBP-malari의 재조합 프라스미드이다. 숙주는 Top10F'이고, 벡터는 pMal, 삽입된 유전자는 Plasmodium vivax의 duffy 수용체 유전자로, 그 크기는 890-2,557bp 사이인 1,667bp이고, 융합단백질은 42kDa인 말토스 결합 단백질이고, 유전자 발현 후의 산물의 크기는 약 97.8kDa이고,
도 2-c는 CSP-malari의 재조합 프라스미드이다. 숙주는 Top10F'이고, 벡터는 pMal, 삽입된 유전자는 Plasmodium vivax의 circumsporozoite 단백질 유전자로, 그 크기는 422-1,075bp 사이인 653bp이고, 융합단백질은 42kDa인 말토스 결합 단백질이고, 유전자 발현 후의 산물의 크기는 약 63.8kDa이다.
도 3은 발현된 재조합 단백질의 SDS-PAGE 패턴이다. A는 MSP이고, B는 DBP이며, C는 CSP를 나타낸다. M은 사이즈마커로 그 크기는 위에서부터 각각 200, 97, 68, 43, 29, 18, 14kDa이며, 레인 1은 유도전의 숙주추출액이고, 레인 2는 5시간 유도 후의 숙주추출액이며, 레인 3은 정제된 단백질을 나타낸다.
상기한 목적을 달성하기 위하여 본발명은 서열정보 1의 MSP을 포함하는 말라리아 항체 조성물을 제공한다.
또 본 발명은 서열정보 2의 CSP를 포함하는 말라리아 항체 조성물을 제공한다.
또 본 발명은 서열정보 3의 DBP를 포함하는 말라리아 항체 조성물을 제공한다. 또한 본 발명은 상기의 MSP, CSP 및 DBP의 혼합에 의한 말라리아 항체 조성물을 제공한다.
본 발명의 조성물에서, 상기의 세 재조합 단백질은 하기에서 정한 하한값 아래에서는 효과가 미약하고, 그 상한값 이상에서는 오히려 특이성이 낮아지므로, 상기 MSP는 0.05 ~ 0.20 ㎍/ml이고, 상기 DBP는 0.01 ~ 0.15 ㎍/ml이며, 상기 CSP는 0.10 ~ 0.30 ㎍/ml인 것이 바람직하다.
또한 본 발명은 본 발명의 말라리아 항체 조성물을 이용한 말라리아 항체의 검출방법을 제공한다.
본 발명에서의 검출방법은 상기의 말라리아 항체 조성물을 완충액에 넣는 단계; 상기 단백질을 카제인, Bovine serum albumin 및 Tween20 등으로 구성된 군으로부터 선택된 1종의 blocker로 봉쇄 하는 단계; 검체를 희석하여 항면역글로불린과 퍼옥사이데이즈 접합체액에서 반응시키는 단계; 및 반응물을 트리메틸벤자딘 및 오쏘페니렌다이아민(orthophenylenediamine) 등으로 구성된 군으로부터 선택된 1종의 화합물을 첨가하여 발색시키고, 흡광도를 측정하는 단계:를 포함하는 방법이거나,
본 발명의 말라리아 항체 조성물을 나이트로셀룰로스 막의 반응선에 흡착시키고, 항면역글로불린을 대조선에 흡착시키는 단계; 상기의 막에 검체를 흡수시킨 후 항면역글로불린 접합 금 콜로이드를 흡수시키는 단계:를 포함하는 방법이 바람직하다.
이하 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 발명자들은 말라리아 백신 연구에서 밝혀진 각 단계별 항원 중 말라리아의 circumsporozoite protein(CSP), merozoite surface protein(MSP), duffy binding protein(DBP)의 항원성이 높은 부위를 선별하여 클로닝하여 이를 대장균에서 발현시켰으며, 이 유전자 재조합 말라리아 항원을 항체 검사용 진단 원료로 이용하여 사람의 말라리아 감염 여부를 진단할 수 있도록 ELISA 법과 Immunoconcentration(Rapid)법에 근거한 Genedia malaria(Ab) ELISA 및 Genedia malaria(Ab) Rapid 시약을 개발하였다.
Merozoite surface protein(이하 "MSP"라 한다)과 Circumsporozoite protein(이하 "CSP"라 한다) 및 Duffy binding protein(이하 "DBP"라 한다)의 유전자를 증폭하여, MSP 유전자의 클로닝에는 Para프로모터를 가지고 있는 pAI3U 벡터를 이용하였고, DBP와 CSP의 클로닝에는 Ptac프로모터를 가지고 있는 pMal 벡터를 이용하여 클로닝을 실시하였으며, 또한 DNA로부터 단백질의 발현을 위하여 MSP 유전자가 삽입된 프라스미드는 대장균 MC1061를 숙주로, DBP와 CSP 유전자가 삽입된 프라스미드는 대장균 Top10F'를 숙주로 하여, 각각 형질전환하여 단백질을 발현시켰다. 발현된 단백질은 3가지를 혼합하여 제조된 Genedia malaria (Ab) ELISA 및 Genedia malaria(Ab) Rapid로 시험하였으며, 86명의 말라리아 현증 환자와 50명의 정상인을 대상으로 IgG, IgM 항체가를 측정하여 각각의 감도와 특이도를 구하였다. 그리고 현재까지 보급된 말라리아 진단시약인 ICT malaria P.f./P.v.(Amrad, Australia)의 검사결과와 비교하여 분석하였다. Genedia malaria(Ab) ELISA 및 Genedia malaria(Ab) Rapid의 감도는 83.9%(72/86)이었고, 특이도는 100%(50/50)이었다. ICT malaria P.f./P.v.의 경우 감도는 51.2% (44/86), 특이도는 100%(50/50)이었다. 또한 Genedia malaria(Ab) ELISA와 Genedia malaria(Ab) Rapid의 진단 효율은 91.9%이었고, ICT malaria P.f./P.v.의 진단 효율은 75.5%이었다. 따라서 본 연구진이 진단에 이용한 3종의 항원은 말라리아 항체 검출에 있어 필수적인 항원이며, 이를 이용한 시약은 말라리아 진단에 있어 타 외국진단 시약에 비해 더 높은 분별력을 나타내 말라리아 항체 선별 검사 시 유용하게 이용될 수 있을 것으로 사료된다.
이하 본 발명을 비한정적인 실시예 및 실험예를 통하여 더욱 상세하게 설명한다.
본 발명에서는 말라리아 환자로부터 분리하여 고려대학교 안산병원에서 보관 중인 혈액을 사용하여 Plasmodium vivax의 유전자를 추출하여 분리하였다.
본 발명에 사용된 균주 및 발현벡터는 다음과 같다.
일반적인 DNA 조작과 프라스미드 분리를 위하여 대장균 DH5α(F-, Φ80dlacZΔM15,recA1, endA1, gryA96, thi-1, hsdR17(rK -mK +), supE44, deoR, relA1, Δ(lacZYA-argF)U169,λ-)를 이용하였으며, 양성 클론의 증폭 및 단백질 발현을 위하여 대장균 MC1061(F-, araD139, Δ(ara-leu)7696, galE15, galK16, Δ(lac)X74, rpsL(Strr), hsdR2(rK -mK +), mcrA, mcrB1) 및 Top10F＇을 사용하였다. 발현벡터로써, MSP 유전자의 클로닝에는 Para 프로모터를 가지고 있는 pA13U 벡터를 (재) 목암생명공학연구소로부터 분양받아 사용하였으며, DBP와 CSP 유전자의 클로닝에는 Ptac 프로모터를 가지고 있는 pMal 벡터를 NEB 사로부터 구입하여 사용하였다.
본 발명에 사용된 배지 및 시약은 다음과 같다.
각 균주들의 배양을 위하여 Luria-Bertani(LB)배지(Bacto tryptone, 10g/L;Bacto yeast extract, 5g/L; NaCl, 5g/L, pH 7.0)를 사용하였고, 고체배지의 경우는 한천을 2%로 첨가하여 사용하였다.
본 발명에 사용한 T4 DNA 라이게이즈와 제한효소 등은 Promega 사(USA)에서 구입하였고, PCR에 사용된 Vent DNA polymerase는 NEB사(USA)에서 구입하였으며, 완충용액에 사용한 시약과 항생제, IPTG 및 아라비노스는 Sigma 사(USA)로부터 구입하였다. 프라스미드 DNA의 분리는 QIAprep Spin Miniprep Kit(Qiagen 사, 독일)을, 혈액에서 DNA의 분리는 QIAamp Tissue Kit(Qiagen 사, 독일)을 사용하였다. 아가로스 젤로부터 DNA의 정제는 Concert Rapid Plasmid Miniprep 시스템(GibcoBRL, 독일)을 사용하였다.
본 발명에 사용된 기기는 다음과 같다.
MSP, DBP 및 CSP 단백질의 정제에는 Protein purification system(Amersham-Pharmacia USA)을 사용하였고, Genedia malaria(Ab) Rapid의 제조를 위한 막에 항원의 코팅은 Biodot Quanti 3000(Biodot, USA)를 사용하였다.
실시예 1
(말라리아 환자 혈액에서 DNA 의 추출 및 재조합 유전자의 제조)
Plasmodium vivax의 DNA의 추출을 위하여 원충 농도가 높은 한국형 말라리아 환자의 혈액으로부터 QIAamp Tissue Kit(Qiagen 사, 독일)을 이용하여 제조회사의 사용방법에 따라 분리하였다. 그 중 MSP, DBP 및 CSP 유전자를 특이적으로 얻기 위하여 PCR을 하였다. 이 때 사용된 프라이머는 이미 알려진 각 유전자의 염기서열을 근거로 하여 한국생공으로부터 주문 제작하였다(표 1). 즉 MSP는 Genbank Accession No. M60807에서 글루타민 반복 지역을 포함한 631bp에서 2407bp, DBP는 Genbank Accession No. M61095에서 히스티딘 리치 지역을 포함한 890bp에서 2557bp, CSP는 Genbank Accession No. M11926에서 탠덤 리피트 지역을 포함한 422bp에서 1075bp를 증폭하였다.
[표 1] 한국에서 분리한 Malaria(P. vivax)의 PCR 증폭을 위한 프라이머
| 생성물 | 서열 |
| Merozoite surfaceprotein (MSP) | Forward:5'-AGATCTTCCACCAACACGACTAATGGCCCC-3'(underline:BglⅡ)Reverse:5'-TCTAGACTAGAGCTTTTCGAGGTATTCCAG-3'(underline:XbaⅠ) |
| Duffy binding protein(DBP) | Forward:5'-TCTAGAGAGGGAAATTCTCGTAAAAAT-3'(underline:XbaⅠ)Reverse:5'-AAGCTTCTAATCAACTGCATCAGTAGTAGC-3'(underline:HindⅢ) |
| Circumsporozoite surface protein (CSP) | Forward:5'-TCTAGAGAAAATAAGCTGAAACAACCAGGA-3'(underline:XbaⅠ)Reverse:5'-AAGCTTCTAAACTTTATCTAGGTAGGTATTCTTTCA-3'(underline:HindⅢ) |
분리한 DNA 1㎍에 PCR 반응 혼합액(200 pmol primer, 10mM KCl, 20mM Tris, pH 8.8, 0.1% Triton X-100, 10 mM 황산암모늄, 2 mM 황산마그네슘, 0.2 mM dNTP, 1 mM MgCl2)이 최종 50㎕가 되도록 혼합한 후 Vent DNA 중합효소(NEB사, USA)2.5U를 첨가하였다. PCR은 Gene Cycler(Bio-Rad, USA)를 이용하여 94℃에서 5분간 전(pre)변성을 한 후 94℃에서 1분 변성, 50℃에서 1분 어닐링, 72℃에서 3분 중합을 30회 실시하였으며, 최종 익스텐션(extension)을 72℃에서 10분간 실시하였다. 증폭된 DNA 는 EtBr이 함유된 아가로스 젤에서 100V로 전기영동하여, 1817bp의 MSP, 1667bp의 DBP, 653bp의 CSP의 유전자 산물을 연쇄중합반응 기법을 이용하여 증폭한 후 1% 아가로스 젤에서 확인하였다(도 1참조).
실시예 2: 균주 제조
a. 대장균의 형질전환
LB 배지로 진탕 배양한 대장균 DH5α,MC1061 및 Top10F＇을 각각 LB 배지에 100배 희석하여 흡광도가 600nm에서 0.3에 이를 때까지 재배양하였다. 배양액은 얼음에 10분간 방치하여 원심분리한 후 얼음속에서 보관중이던 0.1M CaCl2로 1회 세척하고 배양한 배지 부피의 1/2에 해당하는 0.1M CaCl2를 첨가하여 대장균을 부유하였다. 얼음에서 1시간 방치한 후 4℃에서 20분간 4,000g 로 원심분리하여 상청액을 버린후 배양한 배지1/10부피의 0.1M CaCl2에 부유하여 형질전환에 이용하였다.
MSP 유전자는 Para 프로모터를 가지고 있는 pA13U 벡터로, DBP와 CSP는 Ptac 프로모터를 가지고 있는 pMal 벡터로 클로닝을 실시하였고, MSP가 삽입된 유전자는 대장균 MC1061로, DBP와 CSP가 삽입된 유전자는 대장균 Top 10F'으로 각각 형질전환하여 MSP-malari, DBP-malari, CSP-malari로 각각 명명하였다(도 2참조). 이들은 r-Malaria D(수탁번호 KFCC-11146), r-Malaria M(KFCC-11147) 및 r-Malaria C(KFCC-11148)로 하여 사단법인 한국종균협회에 2000년 2월 23일에 기탁하였다.
b. 재조합 DNA의 클로닝
MSP 유전자는 제한효소 BglⅡ와 XbaⅠ으로 처리하여 pA13U 벡터의 BglⅡ와 XbaⅠ부위에 라이게이션하였고, DBP와 CSP 유전자는 XbaⅠ과 HindⅢ로 처리하여 pMal 벡터의 XbaⅠ과 HindⅢ 부위에 라이게이션하였다. 라이게이션은 T4 DNA 라이게이즈(Promega사, USA)를 첨가하여 16℃에서 16시간 반응하였다. 각각의 라이게이션된 DNA 5㎕를 100㎕의 형질전환된 대장균 DH5와 혼합하여 얼음속에서 1시간 방치한 후 42℃에서 90초간 열충격을 주었다. LB 배지에서 1mL를 첨가한 후 37℃에서 1시간 더 배양하였다. 12,000g로 원심분리하여, LB 200㎕에 부유한 후 이를 앰피실린 100㎍/mL가 포함된 LB 한천 평판 배지에 도말하였다. 이것을 37℃에서 16시간 배양한 후 얻어진 집락을 각각 선택하여, LB 배지에서 배양하여 프라스미드 DNA를 추출하고, MSP는 BglⅡ와 XbaⅠ으로 DBP와 CSP는 XbaⅠ과 HindⅢ로 절단하여확인하였다. 이들 재조합 DNA로부터 단백질의 발현을 위하여 MSP 유전자가 삽입된 프라스미드는 대장균 MC1061로 DBP와 CSP 유전자가 삽입된 프라스미드는 대장균 Top10F’으로 각각 형질전환하였다. 각각의 형질전환체에서 외래 유전자의 발현여부를 유도체를 이용하여 확인하였다.
실시예 3 : 단백질 발현 확인 및 단백질 정제
재조합 균주들로부터 각 단백질의 발현을 확인하기 위하여 앰피실린 100㎍/mL가 포함된 LB 배지에 37℃/150 rpm으로 16시간 진탕 배양하였다. 이것을 다시 동일한 배지 500mL가 들어있는 1L baffled 플라스크에 1%씩 접종하고 배양 2시간이 지난 다음 각각의 유도물질을 첨가하여 단백질 발현을 유도시키고, 5시간 추가 배양한 후 회수하였다. 유도물질은 MSP의 경우 1% 아라비노스를 DBP, CSP의 경우 1mM IPTG를 사용하였다. 발현 확인을 위하여 각 시료를 1ml 씩 취하여 2X 시료 버퍼(0.125M Tris-HCl, pH6.2, 4% SDS, 20% 글리세롤, 10% 메캅토에탄올)에 현탁한 후 10% SDS 폴리아크릴아마이드 젤에서 150V로 전기영동을 하였다. 전기영동이 끝난 후 젤은 Comassie blue로 염색하였다.
a. MSP의 정제
MSP의 단백질을 발현하여 회수된 대장균을 융해 완충액(20mM Tris, pH8.3, 10mM EDTA, 10mM DTT, 10mM PMSF)으로 부유하였다. 1mg/ml의 라이소자임을 혼합한 후 얼음속에서 30분간 방치하여 대장균을 융해시켰다. 초음파분쇄기로 최대 출력의 50%에서 5분간 3회 분쇄한 후 4℃에서 8000rpm, 20분간 원심분리하여 침전을 회수하여 완충액(8M의 Urea, 20mM Tris, pH8.6, 2mM DTT)으로 용해시켰다.
DEAE-Sepharose를 3.2X 10.3cm 컬럼에 채운 후 컬럼 버퍼(8M의 Urea, 20mM Tris, pH8.6, 2mM DTT)으로 세척하였다. 대장균 용해약을 1.7ml/분 의 속도로 통과시킨 후 다시 컬럼 완충액으로 세척하고 단백질의 용출을 위하여 컬럼 버퍼에 0∼0.3M NaCl의 농도구배를 주어 용출액을 5 mL씩 수집하였다. 단백질은 SDS-PAGE로 확인하였다.
b. DBP 및 CSP의 단백질의 정제
DBP, CSP의 단백질을 발현하여 회수된 대장균을 융해 완충액(10mM sodium phosphate, 30 mM NaCl, 10mM mercaptoethanol, 10mM EDTA, pH7.2)으로 부유하였다. 1mg/ml의 라이소자임을 혼합한 후 얼음 속에서 30분간 방치하여 대장균을 융해시켰다. 초음파 분쇄기로 최대 출력의 50%에서 5분간 3회 분쇄한 후 4℃에서 8000rpm, 20분간 원심분리하여 상청액을 회수하였다. 상청액에 컬럼 버퍼를 동량 첨가한 후 정제에 사용하였다.
아밀로스 수지(NEB사, USA)을 3.2X 10.3cm 컬럼에 채운 후 컬럼 버퍼(10mM sodium phosphate, 30 mM NaCl, 10mM mercaptoethanol, 10mM EDTA, pH7.2)로 컬럼 부피의 3배 양으로 세척한다. 대장균 용해액을 1ml/분의 속도로 통과시킨 후 컬럼 완충액으로 세척하고, 10mM 말토스가 함유된 컬럼 버퍼로 단백질을 용출하여 5ml 씩 분획을 수집하였다. 단백질은 SDS-PAGE로 확인하였다.
한천배지에서 생성된 각각의 집락을 LB 배지에서 37℃로 16시간 배양한 후 이를 새로운 LB 배지에 1/100 희석하여 O.D600= 0.5까지 배양한 후 유도체(MSP; 아라비노스 1%, DBP,CSP;IPTG)를 이용 5시간 추가 배양하여 1ml씩을 취하여 전기영동하고, Comassie blue로 염색하여 각각 77.2 KDa, 97.8 KDa, 63.8 KDa의 단백질 발현 산물을 확인하였다(도 3 참조).
발효조를 이용 MSP를 10L 배양한 후 용해완충액에 부유하여 파쇄한 후 우레아에 재용해하여 이온교환크로마토그래피를 이용, NaCl로 농도구배를 주어 주 피크를 회수하여 SDS-PAGE로 확인하여 90%이상의 순도를 나타내었다.
DBP, CSP의 경우 발효조를 이용하여 10L를 배양한 후 완충 용해액에 부유하여 파쇄한 후 친화 크로마토그래피를 이용하여 정제한 후 SDS-PAGE로 확인하여 90%이상의 순도를 나타내었다(도 3참조).
실시예 4: 코팅항원의 농도 결정
3종류의 말라리아 유전자재조합 항원을 여러가지 농도로 플레이트에 코팅한 후 말라리아 항체 양성 및 음성 검체를 검사하여 코팅 항원의 포화점을 찾아 진단 감도와 특이도 모두에 가장 최적인 조건을 선택하여 코팅 항원의 농도를 결정하였다.
1) 재료
a. 코팅 항원 : MSP, DBP, CSP
b. 코팅 농도
단독코팅: MSP (0.01, 0.05, 0.10, 0.15, 0.20, 0.25 ㎍/ml)
DBP (0.01, 0.05, 0.10, 0.15, 0.20, 0.25 ㎍/ml)
CSP (0.05, 0.10, 0.15, 0.20, 0.25, 0.30 ㎍/ml)
c. 검체 : 말라리아 항체 양성 혈청 20검체, 말라리아 항체 음성 혈청 20검체
2) 시험에 사용한 시약
항원흡착플레이트 : 농도별로 코팅한 플레이트
용액 : G. Malaria (P. vivax) Ab ELISA, 제조번호: EX9810, 제조일자: 1998. 11. 02.
3) 결론
표 2내지 4에서 알 수 있는 바와 같이 3종류의 말라리아 유전자 재조합 항원을 단독 코팅한 결과 MSP는 0.05 ~ 0.20 ㎍/ml의 농도로 코팅할 때 검출 효율이 95%이상이었고, DBP는 0.01 ~ 0.15 ㎍/ml의 농도로 코팅할 때 검출 효율이 95%이상이었으며, CSP는 0.10 ~ 0.30 ㎍/ml의 농도에서 검출 효율이 95% 이상이었다. 따라서 이 농도를 코팅 농도의 범위로 결정하였다.
[표 2] MSP
| 코팅농도(ug/ml) | 감도 | 특이도 | 진단효율 |
| 0.01 | 85 | 95 | 90 |
| 0.05 | 95 | 95 | 95 |
| 0.10 | 95 | 100 | 97.5 |
| 0.15 | 100 | 100 | 100 |
| 0.20 | 100 | 90 | 95 |
| 0.25 | 100 | 80 | 90 |
[표 3] DBP
| 코팅농도(ug/ml) | 감도 | 특이도 | 진단효율 |
| 0.01 | 95 | 95 | 95 |
| 0.05 | 95 | 100 | 97.5 |
| 0.10 | 100 | 100 | 100 |
| 0.15 | 100 | 95 | 97.5 |
| 0.20 | 100 | 80 | 90 |
| 0.25 | 100 | 70 | 85 |
[표 4] CSP
| 코팅농도(ug/ml) | 감도 | 특이도 | 진단효율 |
| 0.05 | 90 | 90 | 90 |
| 0.10 | 90 | 100 | 95 |
| 0.15 | 95 | 100 | 97.5 |
| 0.20 | 100 | 100 | 100 |
| 0.25 | 100 | 95 | 97.5 |
| 0.30 | 100 | 95 | 97.5 |
실시예 5: ELISA 및 Immunoconcentration법(Rapid)
Genedia malaria(Ab)ELISA를 제조하기 위하여 정제된 MSP, DBP 및 CSP 단백질을 우태아혈청알부민(bovine serum albumin)을 표준단백질로 하여 Bradford법에 의하여 595nm에서 비색 정량하여 각 10㎍/ml가 되게 50mM 탄산염완충용액(pH9.6)에 섞어 100㎕을 96웰 마이크로프레이트(Nunc-Immuno Module, 덴마크)에 넣고 25℃에서 16시간 방치하였다. 그리고 카제인으로 2시간 동안 봉쇄를 하였다. 검체를 인산염-카제인 완충액으로 1/20으로 희석하여 100㎕를 넣은 후 37℃에서 1시간 동안 반응시킨 후 인산염완충액으로 5회 세척하고, 항사람면역글로불린 G (Sigma)와 horse radish 퍼옥사이데이즈 접합체액을 37에서 30분간 반응시키고 세척 후 트리메틸벤지딘을 첨가하여 발색시키고, 1.6N 황산용액으로 반응을 정지시킨 후 96웰 플레이트 오토리더(TECAN, 호주)를 사용하여 420nm에서 흡광도를 측정하였다.
또한, Genedia malaria(Ab) Rapid의 제조를 위하여 정제된 MSP, DBP, CSP 단백질을 붕산염 완충액에 희석하여 Biodot Quanti 3000(Biodot, USA)을 이용하여 나이트로셀룰로스 막의 반응선에 흡착시키고, 항-사람면역글로불린 G와 항-사람면역글로불린 M(Sigma, USA)을 대조선에 흡착시킨다. 디바이스에 고정된 막에 검체를 흡수시키고, 물로 1회 세척한 후 항-사람면역글로불린 G 접합 금 콜로이드 및 항-사람면역글로불린 M 접합 금 콜로이드(BBI, UK)를 흡수시켜 붉은 선이 생김을 눈으로 확인하였다.
실험예:
발현산물의 활성측정(효소면역측정법 및 ImmunoConcentration)
본 발명인 Genedia malaria(Ab) ELISA, Genedia malaria(Ab) Rapid 및 비교예로 호주 Amrad사의 ICT malaria P.f/P.v 시약을 각각의 검사방법에 따라 검사하였다.
검체는 고려대 안산병원 및 파주시 보건소로부터 혈액도말법으로 진단하여 양성으로 확인된 86 검체 및 음성으로 확인된 50 검체를 이용하였다. 86검체를 이용하여 검사하였을 때 세 시약 모두에서 양성으로 나타난 검체는 40개, 모두에서 음성으로 나타난 검체는 18개로 일치율은 58.1%(50/86)이었다. 또한 같은 항원을 사용하여 제조된 Genedia malaria(Ab) ELISA 및 Genedia malaria(Ab) Rapid의 일치율은 100%이었다. 본 발명인 Genedia malaria(Ab) ELISA의 감도는 83.9%(72/86)이었고, 비교예인 ICT malaria P.f/P.v의 감도는 51.2%(44/86)이었다. 혈액도말법으로 음성으로 확인된 50검체를 시험하였을 경우 세 시약 모두 50검체 음성으로 나타나 특이도는 100%이었다(표 5 참조)
[표 5] 각 키트내의 86 양성 혈청의 비교 테스트
| ICT malaria P.f/P.v | ||||
| + | - | 계 | ||
| G. malaria(Ab)ELISA Rapid | + | 40 | 32 | 72 |
| - | 4 | 10 | 14 | |
| 계 | 44 | 42 | 86 |
본 발명은 감염초기 간세포에 부착하는 기능을 갖는 Circumsporozoit 단백질(CSP), 사람의 적혈구에 침범하는 분열소포체항원(MSP) 및 적혈구의 Duffy 수용체에 결합하는 Buffy 혈액형부착단백질(DBP)을 유전공학적인 방법을 이용하여 대량으로 발현시켜 정제를 통해 순수 분리한 후, 96웰 마이크로타이터 플레이트와 나이트로셀룰로스 막에 고정하여, 사람의 혈장이나 혈청내 존재하는 말라리아 항체를 헌혈혈액과 같은 대량검사에 적용이 가능한 EIA 법과 3분 내에 감별이 가능한 신속 검출법의 두 가지 형태를 개발하였다.
본 발명인 Genedia malaria(Ab) ELISA, Genedia malaria(Ab) Rapid의 경우 양성으로 확인된 86 검체 및 음성으로 확인된 50 검체를 이용한 실험을 한 결과 모두 83.9%의 감도와 100%의 특이도를 나타내었으며, 두 시약간의 결과 일치율은 100%이었다. 또한 비교예인 ICT malaria P.f/P.v의 감도는 51.2%(44/86)이었고, 특이도는 100%이었으며, Genedia malaria(Ab) ELISA, Genedia malaria(Ab) Rapid와의 일치율은 58.1%(50/86)이었다. ICT malaria P.f/P.v 시약과의 일치율이 낮은 것은 ICT malaria P.f/P.v가 항원 검출용 시약인데 반하여, Genedia malaria(Ab) ELISA, Genedia malaria(Ab) Rapid는 항체 검출용 시약이기 때문인 것으로 생각된다. 또한 본 발명인 Genedia malaria(Ab) ELISA, Genedia malaria(Ab) Rapid의 검출 효율은 91.9%인데 반해, 비교예인 ICT malaria P.f/P.v의 검출효율은 75.6%로 본 발명의 시약이 우수한 것으로 나타났다. 검출효율은 검체의 수가 많아지면 훨씬 높아질 수 있다.
Claims (8)
- 서열정보 1의 MSP를 포함하는 말라리아 항체 조성물.
- 제 1항에 있어서, 상기 조성물은 서열정보 2의 CSP를 더욱 포함하는 것인 말라리아 항체 조성물.
- 제 1항에 있어서, 상기 조성물은 서열정보 3의 DBP를 더더욱 포함하는 것인 말라리아 항체 조성물.
- 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 MSP는 0.05 ~ 0.20 ㎍/ml, 상기 CSP는 0.10 ~ 0.30 ㎍/ml인 것인 말라리아 항체 조성물.
- 제 3항에 있어서, 상기 DBP는 0.01 ~ 0.15 ㎍/ml인 것인 말라리아 항체 조성물.
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