CN116425850A - 一种吉氏巴贝斯虫特异性诊断抗原及其应用 - Google Patents

一种吉氏巴贝斯虫特异性诊断抗原及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN116425850A
CN116425850A CN202310534726.2A CN202310534726A CN116425850A CN 116425850 A CN116425850 A CN 116425850A CN 202310534726 A CN202310534726 A CN 202310534726A CN 116425850 A CN116425850 A CN 116425850A
Authority
CN
China
Prior art keywords
protein
babesia
recombinant
nucleic acid
serum
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202310534726.2A
Other languages
English (en)
Inventor
刘晶
陈慧娴
刘群
韦欣欣
冯子轩
王丽芳
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
China Agricultural University
Original Assignee
China Agricultural University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by China Agricultural University filed Critical China Agricultural University
Priority to CN202310534726.2A priority Critical patent/CN116425850A/zh
Publication of CN116425850A publication Critical patent/CN116425850A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/44—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from protozoa
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/20—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans from protozoa
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56905—Protozoa
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
    • G01N33/581—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with enzyme label (including co-enzymes, co-factors, enzyme inhibitors or substrates)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6854—Immunoglobulins
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/44—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans from protozoa
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2469/00—Immunoassays for the detection of microorganisms
    • G01N2469/20—Detection of antibodies in sample from host which are directed against antigens from microorganisms
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

本发明公开了一种吉氏巴贝斯虫特异性诊断抗原及其应用。本发明所提供的吉氏巴贝斯虫特异性诊断抗原为氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的蛋白质。本发明利用其作为包被抗原建立了间接ELISA检测方法，操作简单、快速高效，特异性好、敏感性高，重复性好，可用于检测犬吉氏巴贝斯虫感染情况，可检出血涂片与PCR无法检出的阳性样本，对于犬巴贝斯虫病的诊断以及防治具有重要意义。

Description

一种吉氏巴贝斯虫特异性诊断抗原及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种吉氏巴贝斯虫特异性诊断抗原及其应用。
背景技术
犬巴贝斯虫病是一种经硬蜱传播，由梨形虫目(Piroplasmida)、巴贝斯科(Babesiida)、巴贝斯属(Babesia)原虫寄生于犬的红细胞所引起的血液寄生虫病，是宠物临床上重要的疾病之一。巴贝斯虫可通过机械作用、引起宿主对寄生虫血症的强免疫应答从而破坏红细胞，使发病犬出现贫血、溶血、血小板减少、全身性炎症反应综合征等症状，并伴随有死亡风险。我国流行的虫种主要是吉氏巴贝斯虫(B.gibsoni)。
对犬巴贝斯虫病的诊断方法包括病原学、血清学和分子生物学等。病原学诊断包括血涂片染色检查、动物接种等。分子生物学诊断方法如聚合酶链式反应(PCR)、环介导等温扩增(LAMP)技术。血清学诊断方法主要有间接荧光抗体试验(IFAT)和酶联免疫吸附试验(ELISA)等。
目前临床上对犬巴贝斯虫病的诊断以血涂片检查虫体为主，少数条件较好的医院具备PCR诊断的设备条件。血涂片检查技术虽然成熟、成本低廉、操作简单，但该方法对检验者的技术要求高，存在较高漏诊率，在早期感染和慢性感染阶段寄生虫血症低的时候难以检出，且难以应用于隐性感染、无症状携带犬和循环衰竭患犬。分子生物学技术的局限性在于筛查潜在携带者和其他无症状犬可能会出现假阴性结果，再加上其步骤繁琐、使用的试剂及仪器价格昂贵，难以普及到不同规模的宠物医院，或被应用于大规模筛查。实验室检查中IFAT是检测巴贝斯虫抗体的金标准，但容易出现交叉反应，且由于巴贝斯虫的体外培养难度较高，难以普及于临床诊断。间接ELISA是一种常被用于流行病学调查的血清学诊断方法，具有敏感性高、特异性好、便捷等特点，可用于染虫率较低的带虫免疫犬的检出和疫区流行病学的调查。
综上所述，建立一种具备高特异性、高灵敏度的间接ELISA方法对于我国犬巴贝斯虫病的诊断与筛查具有重要的意义。
发明内容
本发明要求保护一种吉氏巴贝斯虫特异性诊断抗原及其应用。
第一方面，本发明要求保护一种蛋白质。
本发明所要求保护的蛋白质可作为吉氏巴贝斯虫特异性诊断抗原，为吉氏巴贝斯虫BgSBP3蛋白的截短体，具体可为如下任一：
(A1)氨基酸序列为SEQ ID No.1的蛋白质；
(A2)将SEQ ID No.1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；
(A3)与(A1)-(A2)中任一所限定的氨基酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且具有相同功能的蛋白质；
(A4)在(A1)-(A3)中任一所限定的蛋白质的N端和/或C端连接标签后得到的融合蛋白。
上述蛋白质中，所述标签是指利用DNA体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和/或纯化。所述蛋白标签可为His标签、Flag标签、MBP标签、HA标签、myc标签、GST标签和/或SUMO标签等。
上述蛋白质中，同一性是指氨基酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如NCBI主页网站的BLAST网页。例如，可在高级BLAST2.1中，通过使用blastp作为程序，将Expect值设置为10，将所有Filter设置为OFF，使用BLOSUM62作为Matrix，将Gap existence cost，Per residue gap cost和Lambda ratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索一对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。
在本发明的具体实施方式中，所述蛋白质的氨基酸序列具体与“将SEQ ID No.2所示DNA分子插入到pET28a(+)质粒的酶切位点HindIII和BamHI之间后表达所得的重组蛋白”的氨基酸序列相同。
第二方面，本发明要求保护编码前文所述蛋白质的核酸分子。
其中，所述核酸分子可为如下任一所述的DNA分子：
(B1)SEQ ID No.2所示的DNA分子；
(B2)在严格条件下与(B1)限定的DNA分子杂交且编码前文第一方面中所述蛋白质的DNA分子；
(B3)与(B1)或(B2)限定的DNA序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且编码前文第一方面中所述蛋白质的DNA分子。
上述核酸分子中，所述严格条件可为如下：50℃，在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M Na3PO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，2×SSC，0.1％ SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M Na3PO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，1×SSC，0.1％ SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M Na3PO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.5×SSC，0.1％ SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M Na3PO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.1×SSC，0.1％ SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M Na3PO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在65℃，0.1×SSC，0.1％ SDS中漂洗；也可为：在6×SSC，0.5％ SDS的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％ SDS和1×SSC，0.1％ SDS各洗膜一次。
第三方面，含有前文所述核酸分子的表达盒或重组载体或重组菌或重组细胞。
其中，所述表达盒由启动子(如T7启动子)、所述核酸分子和终止序列(如T7终止子)组成。所述重组载体可为含有所述表达盒的重组质粒。
在本发明中，所述重组载体中启动所述核酸分子转录的启动子为T7启动子。更加具体的，所述重组载体为将前文所述核酸分子插入到pET28a(+)质粒的多克隆位点(如HindIII和BamHI之间)后得到的重组质粒。
在本发明中，所述重组菌为导入前文所述重组载体后的大肠杆菌(如大肠杆菌BL21(DE3))。
第四方面，本发明要求保护前文第一方面中所述蛋白质或前文第二方面中所述核酸分子或前文第三方面中所述表达盒或重组载体或重组菌或重组细胞在如下任一中的应用：
(C1)制备用于检测吉氏巴贝斯虫抗体的产品；
(C2)制备用于诊断犬巴贝斯虫病的产品。
第五方面，本发明要求保护前文第一方面中所述蛋白质或前文第二方面中所述核酸分子或前文第三方面中所述表达盒或重组载体或重组菌或重组细胞在如下任一中的应用：
(D1)制备用于检测待测犬的血清中是否含有吉氏巴贝斯虫抗体的产品；
(D2)制备用于筛查待测犬是否被吉氏巴贝斯虫感染的产品。
第六方面，本发明要求保护一种用于犬血清中吉氏巴贝斯虫抗体的ELISA试剂盒。
本发明要求保护的用于犬血清中吉氏巴贝斯虫抗体的ELISA试剂盒，包括包被原和酶标二抗；所述包被原为前文第一方面中所述蛋白质；所述酶标二抗为辣根过氧化酶标记的抗犬IgG抗体(如辣根过氧化酶标记的兔抗犬IgG抗体)。
进一步地，所述试剂盒中还可含有如下中的全部或部分：
(E1)底物显色液：TMB底物显色液；
(E2)终止液：2M浓硫酸；
(E3)洗涤液：PBST，即含有体积百分含量为0.1％的Tween-20的PBS溶液；
(E4)包被缓冲液：pH为9.6的碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液；
(E5)封闭液：3％BSA，即3g BSA(牛血清白蛋白)粉末溶于100mL PBS；
(E6)样品稀释液：3％BSA(同上)。
第七方面，本发明要求保护前文第六方面中所述的ELISA试剂盒在通过间接ELISA法检测犬血清中吉氏巴贝斯虫抗体中的应用；所述应用可为非疾病诊断性应用。如单纯的检测用于犬血清制品的质控。
第八方面，本发明要求保护前文第一方面中所述蛋白质作为免疫原在制备吉氏巴贝斯虫抗体中的应用；所述应用可为非疾病治疗性应用。如用于生产抗体。
本发明表达了一种新的吉氏巴贝斯虫诊断抗原，利用其重组蛋白作为包被抗原建立了间接ELISA检测方法，操作简单、受环境因素影响小、需要样品量少，并且快速高效、特异性好、敏感性高、重复性好，可用于检测犬吉氏巴贝斯虫感染情况，可检出血涂片与PCR无法检出的阳性样本，对于犬巴贝斯虫病的诊断以及防治具有重要意义。
附图说明
图1为重组蛋白rBgSBP3-His的表达。M：蛋白marker；1：包涵体；2：上清；3：诱导后菌液；4：未诱导菌液。
图2为rBgSBP3-His的复性及纯化。M：蛋白marker；1：包涵体蛋白样对照；2-4：包涵体洗涤液；5：纯化后蛋白。
图3为重组蛋白rBgSBP3-His的反应原性鉴定。M：蛋白Marker；1：鼠源His单抗；2：犬吉氏巴贝斯虫阳性血清；3-6：犬吉氏巴贝斯虫阴性血清。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
E.coli BL21(DE3)菌株、E.coli DH5α菌株、Phanta Max Super-Fidelity DNAPolymerase，10×DNA Loading Buffer，ClonExpress Ultra One Step Cloning Kit V2重组克隆试剂盒：均购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司。
pET28a(+)原核表达质粒：由本实验室保存，该载体为卡那霉素抗性，由T7启动子启动表达融合His标签的目的蛋白。
His融合蛋白纯化柱(Ni2+)、PVDF膜：购自德国Merck Millipore Novagen公司。
Super ECL PLus超敏发光液，HRP标记兔抗犬IgG二抗：购自北京华兴博创基因技术有限公司。
实施例1、BgSBP3的表达与鉴定
一、BgSBP3截短基因片段的克隆
本发明中吉氏巴贝斯虫诊断抗原为截短的BgSBP3蛋白。用牛巴贝斯虫SBP3蛋白序列在吉氏巴贝斯虫的全基因组中进行比对搜索，得到吉氏巴贝斯虫BgSBP3蛋白，根据其氨基酸序列的理化性质、抗原表位和结构域的预测结果，选择截短表达(721bp-1863bp)。选择该段序列首尾各18个碱基，连接pET-28a(+)原核表达载体的同源臂，设计引物F和R，引物序列如下，下划线部分为同源臂。
F：5’-AGCAAATGGGTCGCGGATCCGGATACAACCTAATTAGC-3’(粗体为限制性内切酶BamHI的识别序列)；
R：5’-TCGAGTGCGGCCGCAAGCTT AAGATGTTCTTCGTTTGG-3’(粗体为限制性内切酶HindIII的识别序列)。
以吉氏巴贝斯虫(Babesia gibsnoi)的cDNA为模板，扩增截短的BgSBP3基因片段。反应体系如表1所示：
表1、BgSBP3截短片段扩增PCR体系
组分 用量(μL)
吉氏巴贝斯虫cDNA 2
上游引物(F) 2
下游引物(R) 2
dNTPs 1
2×Phanta Max Buffer 25
Phanta高保真DNA聚合酶 1
ddH2O 17
总体积 50
PCR反应条件：94℃预变性10min，进行35轮循环，循环包括94℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸1min。最后72℃延伸10min。
PCR产物取样进行琼脂糖凝胶电泳检测，鉴定其是否扩增成功。将与目的片段大小相符的PCR产物利用胶回收试剂盒回收，-20℃保存。
二、pET-28a-BgSBP3质粒的构建与蛋白表达
以pET-28a(+)质粒为模板，以如下引物F/R进行PCR扩增，得到pET-28a(+)骨架片段。
F：5’-AAGCTTGCGGCCGCACTCGA-3’(粗体为限制性内切酶HindIII的识别序列)；
R：5’-GGATCCGCGACCCATTTGCT-3’(粗体为限制性内切酶BamHI的识别序列)。
用重组克隆试剂盒将步骤一回收的目的基因片段与pET-28a(+)骨架片段进行同源重组。重组克隆反应体系如表2：
表2、重组克隆反应体系
组分 用量(μL)
2×CE Mix 5
目的基因片段 2
pET-28a(+)骨架片段 3
总体积 10
注：2×CE Mix来自于南京诺唯赞公司的ClonExpress Ultra One Step CloningKit V2，货号是C116。
加入各组分后，50℃连接15min。反应结束后，将离心管立即置于冰上冷却，获得产物转入DH5α克隆感受态细胞中，冰浴30min，42℃热激30s，冰浴3-5min，加入500μL无抗性的LB液体培养基，37℃摇菌1h，3500rpm离心3min，弃上清，留100-200μL上清重悬菌体沉淀，再涂布于含有卡那霉素抗性的LB固体培养基上，37℃过夜培养。次日挑取单个菌落，加入含抗性的LB液体培养基培养，并对菌液进行PCR鉴定。鉴定体系如表3：
表3、菌液PCR反应体系
组分 用量(μL)
2×Rapid Taq Master Mix 10
目的片段扩增引物F 1
pET28a骨架通用鉴定引物T7ter 1
ddH20 5
菌液模板 3
总体积 20
表3中，目的片段扩增引物F和pET28a骨架通用鉴定引物T7ter的具体序列如下：
引物F：5'-AGCAAATGGGTCGCGGATCCGGATACAACCTAATTAGC-3'；
引物T7ter：5'-GCTAGTTATTGCTCAGCGG-3'。
理论扩增产物大小1273bp。
PCR反应条件同上。
PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，鉴定是否有阳性克隆。选取阳性克隆测序，获得重组原核表达质粒pET-28a-SBP3。
重组载体pET-28a-SBP3结构描述：在pET-28a载体的酶切位点HindIII和BamHI之间插入SEQ ID No.2所示DNA片段(截短的BgSBP3蛋白编码基因)的重组质粒。SEQ ID No.2表达SEQ ID No.1所示蛋白质。重组载体pET-28a-SBP3表达N端和C端均融合有6×His标签的重组蛋白rBgSBP3-His。
将构建好的重组原核表达质粒pET-28a-SBP3转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，将PCR鉴定为阳性的单克隆菌在卡那抗性的LB液体培养基中扩大培养，细菌到达对数生长期(OD600为0.4-0.6)时加入0.8mM(终浓度)IPTG，37℃继续培养12小时，诱导重组蛋白的表达。
收集菌体，冰浴超声裂解，4℃离心分离上清和包涵体蛋白，SDS-PAGE电泳分析重组蛋白的表达形式，结果如图1所示，可知重组蛋白rBgSBP3-His主要表达在包涵体中，对包涵体洗涤、复性后以镍亲和层析方法对重组蛋白进行纯化；SDS-PAGE分析蛋白纯度，结果如图2所示，得到纯化后的重组蛋白rBgSBP3-His大小约为50kDa，纯化的蛋白分装后-80℃保存备用。
三、rBgSBP3-His反应原性及特异性鉴定
利用Western Blot对重组蛋白rBgSBP3-His进行反应原性鉴定，具体操作：分别以犬吉氏巴贝斯虫阳性血清(由华中农业大学制备并馈赠，采自确定经犬吉氏巴贝斯虫感染并且处于感染期的实验犬)、阴性血清(来源于确定未经感染的健康比格试验犬)(1:300)、鼠源His单抗(1:5000，只用于带有His标签的重组蛋白)作为一抗进行孵育；二抗使用相对应的HRP标记兔抗犬IgG、HRP标记山羊抗鼠IgG(1:5000)抗体进行免疫印迹试验。
反应原性鉴定结果如图3所示，说明重组蛋白rBgSBP3-His具有良好反应原性。
实施例2、犬血清吉氏巴贝斯虫抗体间接ELISA检测方法的建立
一、反应条件
犬血清吉氏巴贝斯虫抗体间接ELISA反应条件如表4所示：
表4、犬血清吉氏巴贝斯虫抗体间接ELISA反应条件
Figure BDA0004225692930000081
注：3％BSA，即3g牛血清白蛋白(BSA)溶于100mL PBS溶液。PBST，即含有体积百分含量为0.1％的Tween-20的PBS溶液。
以实施例1制备的重组蛋白rBgSBP3-His为包被抗原建立的间接ELISA方法的操作步骤如下：
(1)包被：使用碳酸盐缓冲液将经重组蛋白rBgSBP3-His稀释至0.5μg/mL，向96孔酶标板中每孔加入100μL，4℃过夜包被(＞8h)；
(2)洗涤：甩去板中液体，每孔加入300μL的PBST洗涤，每次5min，重复3次；
(3)封闭：每孔加入100μL 3％BSA封闭液，37℃封闭1h；
(4)洗涤：甩去板中液体，洗涤步骤同(2)，也可省去此步洗涤；
(5)一抗孵育：用3％BSA将待检血清1:200(体积比)稀释，加入对应酶标板中，每孔加入100μL，每组设置一个重复，37℃孵育45min；
(6)洗涤：甩去板中液体，每孔加入100μL的PBST洗涤，每次6min，重复3次；
(7)二抗孵育：用3％BSA将HRP标记兔抗犬IgG抗体1:15000(体积比)稀释，加入对应酶标板中，每孔加入100μL，37℃孵育60min；
(8)洗涤：甩去板中液体，每孔加入300μL的PBST洗涤，每次7min，重复4次；
(9)显色：将TMB底物显色液A液与B液1:1(体积比)混合均匀，每孔加入100μL混合液，避光显色5min；
(10)终止：每孔加入50μL 2M硫酸终止液；
(11)读数：在酶标仪上读出OD450值。
二、ELISA检测方法临界值的确定
用rBgSBP3-ELISA检测12份犬吉氏巴贝斯虫抗体阴性血清样品(收集的临床血清经Western Blot鉴定：在PVDF膜上包被rBgSBP3蛋白，与一抗血清、酶标二抗孵育后，曝光后无条带的判定为阴性)，每个样品设置2个重复，并设阴阳性对照(犬吉氏巴贝斯虫的阴阳性血清，参见实施例1步骤三)，结果如表5所示。计算所有样品的OD450nm值的平均值
Figure BDA0004225692930000091
为0.167，标准差SD为0.057。
表5、rBgSBP3-ELISA临界值的确定
样本序号 OD450
1 0.085
2 0.232
3 0.149
4 0.148
5 0.280
6 0.127
7 0.240
8 0.127
9 0.130
10 0.196
11 0.140
12 0.157
根据以下公式计算出阴阳性临界值为0.315：，若样品的OD450nm值小于0.315，即判定为阴性；若样品的OD450nm值大于等于0.315，则判定为阳性。
Figure BDA0004225692930000092
三、灵敏度实验
将犬吉氏巴贝斯虫抗体标准阳性血清样品从1:100(体积比)开始倍比稀释，进行ELISA实验(方法参见步骤一)，以临界值(参见步骤二)判定血清最高稀释度。结果如表6所示，优化后的间接ELISA方法可以检测到血清最高稀释度达1:6400，说明该方法检测的灵敏度较高。
表6、灵敏性分析
阳性血清稀释比 OD450值 判定结果
1:100 1.643 +
1:200 1.703 +
1:400 1.471 +
1:800 1.295 +
1:1600 1.097 +
1:3200 0.718 +
1:6400 0.507 +
1:12800 0.264 －
1:25600 0.152 －
四、特异性实验
分别以犬的弓形虫、新孢子虫、利什曼原虫抗体阳性血清(犬弓形虫和新孢子虫阳性血清为本实验室制备，IFA和ELISA鉴定结果均为阳性。犬利什曼原虫阳性血清是从临床收集到的，动物医院临床确诊为阳性病例)作为一抗，同时以吉氏巴贝斯虫阳性、阴性血清(参见实施例1步骤三)作为阴阳对照，进行ELISA方法的特异性检测(方法参见步骤一和二)。结果如表7所示，阴阳对照成立且与其他病原无交叉反应，表明所建立的间接ELISA方法具有较高的特异性。
表7、特异性分析
一抗血清 OD450平均值 判定结果
弓形虫阳性血清 0.167 －
新孢子虫阳性血清 0.203 －
利什曼原虫阳性血清 0.164 －
阳性对照 1.471 +
阴性对照 0.156 －
五、比较实验
用建立好的间接ELISA方法(方法参见步骤一和二)、血涂片染色法和PCR检测从临床收集的70份犬血样，将血清学检测结果与病原学诊断结果相比较，所用PCR引物序列如下：
F-BJ1：5’-GTCTTGTAATTGGAATGATGG-3’；
R-BN2：5’-TAGTTTATGGTTAGGACTACG-3’。
结果如表8所示：
表8、ELISA与病原学诊断结果比较
Figure BDA0004225692930000111
目前临床需要通过血液指标指征、血涂片和PCR结果来综合诊断犬巴贝斯虫病。本方法与病原学诊断方法(血涂片染色法和PCR检测)的阳性符合率为92.7％[检测阳性/真阳性，即图中的ELISA结果阳性(38)/血涂片PCR阳性(41)]，且可以检出带虫率低的感染犬，可应用于犬血清吉氏巴贝斯虫抗体的检测。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。

Claims (10)

1.蛋白质,为如下任一：
(A1)氨基酸序列为SEQ ID No.1的蛋白质；
(A2)将SEQ ID No.1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；
(A3)与(A1)-(A2)中任一所限定的氨基酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且具有相同功能的蛋白质；
(A4)在(A1)-(A3)中任一所限定的蛋白质的N端和/或C端连接标签后得到的融合蛋白。
2.编码权利要求1所述蛋白质的核酸分子。
3.根据权利要求2所述的核酸分子，其特征在于：所述核酸分子为如下任一所述的DNA分子：
(B1)SEQ ID No.2所示的DNA分子；
(B2)在严格条件下与(B1)限定的DNA分子杂交且编码权利要求1所述蛋白质的DNA分子；
(B3)与(B1)或(B2)限定的DNA序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且编码权利要求1所述蛋白质的DNA分子。
4.含有权利要求2或3所述核酸分子的表达盒或重组载体或重组菌或重组细胞。
5.权利要求1-4中任一所述的蛋白质或核酸分子或表达盒或重组载体或重组菌或重组细胞在如下任一中的应用：
(C1)制备用于检测吉氏巴贝斯虫抗体的产品；
(C2)制备用于诊断犬巴贝斯虫病的产品。
6.权利要求1-5中任一所述的蛋白质或核酸分子或表达盒或重组载体或重组菌或重组细胞在如下任一中的应用：
(D1)制备用于检测待测犬的血清中是否含有吉氏巴贝斯虫抗体的产品；
(D2)制备用于筛查待测犬是否被吉氏巴贝斯虫感染的产品。
7.一种用于犬血清中吉氏巴贝斯虫抗体的ELISA试剂盒，包括包被原和酶标二抗；所述包被原为权利要求1所述蛋白质；所述酶标二抗为辣根过氧化酶标记的抗犬IgG抗体。
8.根据权利要求7所述的ELISA试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中还含有如下中的全部或部分：
(E1)底物显色液：TMB底物显色液；
(E2)终止液：2M浓硫酸；
(E3)洗涤液：PBST，即含有体积百分含量为0.1％的Tween-20的PBS溶液；
(E4)包被缓冲液：pH为9.6的碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液；
(E5)封闭液：3％BSA，即3g牛血清白蛋白溶于100mL PBS溶液；
(E6)样品稀释液：所述3％BSA。
9.权利要求7或8所述的ELISA试剂盒在通过间接ELISA法检测犬血清中吉氏巴贝斯虫抗体中的应用；所述应用为非疾病诊断性应用。
10.权利要求1所述蛋白质作为免疫原在制备吉氏巴贝斯虫抗体中的应用；所述应用为非疾病治疗性应用。
CN202310534726.2A 2023-05-12 2023-05-12 一种吉氏巴贝斯虫特异性诊断抗原及其应用 Pending CN116425850A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202310534726.2A CN116425850A (zh) 2023-05-12 2023-05-12 一种吉氏巴贝斯虫特异性诊断抗原及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202310534726.2A CN116425850A (zh) 2023-05-12 2023-05-12 一种吉氏巴贝斯虫特异性诊断抗原及其应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN116425850A true CN116425850A (zh) 2023-07-14

Family

ID=87089156

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202310534726.2A Pending CN116425850A (zh) 2023-05-12 2023-05-12 一种吉氏巴贝斯虫特异性诊断抗原及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN116425850A (zh)

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR102019008B1 (ko) 메르스 코로나바이러스 뉴클레오캡시드 융합 단백질을 이용한 메르스 코로나바이러스 검출 방법
CN113557431A (zh) 诊断SARS-CoV-2感染的方法和试剂
CN104678110B (zh) 一种血清cenpf抗体定量检测试剂盒
WO2012097304A2 (en) Treponema pallidum triplet antigen
US7824909B2 (en) Recombinant antigens for the detection of coxiella burnetii
WO2012163263A1 (en) Reagents and methods for prrsv detection
CN110183527B (zh) 一种新孢子虫NcMIC26抗原及其应用
CN111647055B (zh) 一种用于新型冠状病毒检测的n蛋白及其制备与应用
CN113637056A (zh) 一种用于鉴别牛种布鲁氏菌与其它种布鲁氏菌的试剂盒
Kashyap et al. Development of recombinant nucleocapsid protein-based indirect enzyme-linked immunosorbent assay for sero-survey of porcine reproductive and respiratory syndrome
CN115073613A (zh) 一种融合蛋白GLuc-p30及其制备方法和应用
CN111548423B (zh) 肺炎支原体融合抗原及其制备方法和应用
CN112852840A (zh) 一种牛纽布病毒重组vp1基因、重组蛋白及其应用
CN109970844B (zh) 丝状支原体丝状亚种p35脂蛋白及其在诊断牛传染性胸膜肺炎中的应用
JP5712513B2 (ja) ヒトサイトメガロウイルス感染の検出方法
CN111378034B (zh) 抗恶性疟原虫hrp-ii抗体
CN116425850A (zh) 一种吉氏巴贝斯虫特异性诊断抗原及其应用
CN111965353B (zh) 绵羊痒螨半胱氨酸蛋白酶抑制剂的应用以及一种elisa试剂盒
CN111273005B (zh) 一种检测弓形虫IgG抗体的酶联免疫试剂盒及方法
CN110988340B (zh) 斯氏艾美耳球虫sag8蛋白的应用
CN110794134B (zh) 斯氏艾美耳球虫sag4蛋白的应用
CN111333726B (zh) 抗恶性疟原虫hrp-ii抗体
CN109371043B (zh) 田鼠巴贝虫2d33、2d36抗原蛋白及其应用
CN114524869B (zh) 弓形虫微线体蛋白MIC17a及其应用
CN117843734A (zh) 牛哺乳动物正呼肠孤病毒三型s4蛋白、试剂盒及应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination