KR100411496B1 - 말라리아 진단 시약 - Google Patents

Abstract

본 발명은 삼일열 말라리아 원충의 아종 사이에서 아미노산 서열이 100% 일치하는 표면 단백질 MSP(merozoit surface protein)의 C-말단부위 PV200C 폴리펩타이드를 포함하는 말라리아 진단 시약에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 말라이라 원충 표면 단백질 MSP의 C-말단 부위인 서열번호 1로 기재되는 PV200C 폴리펩타이드를 포함하는 말라리아 진단 시약에 관한 것이다. 본 발명의 삼일열 말라리아 원충 표면 PV200C 폴리펩타이드는 말라리아 항원에 대한 민감도 및 특이성이 높아 위반응의 확률이 현저히 낮으므로 한국형 말라리아의 진단에 효율적으로 사용할 수 있다.

Description

말라리아 진단 시약{Reagent for the detection of malaria}

본 발명은 삼일열 말라리아 원충의 아종 사이에서 아미노산 서열이 100% 일치하는 메로조이트 표면 단백질(merozoit surface protein, 이하 'MSP'라 약칭함) C-말단부위 PV200C 폴리펩타이드를 포함하는 말라리아 진단 시약에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 말라리아 원충 표면 단백질 MSP의 C-말단 부위인 서열번호 1로 기재되는 PV200C 폴리펩타이드를 포함하는 말라리아 진단 시약에 관한 것이다.

말라리아는 모기를 매개로 하여 발생하는 질병으로 원인균인 말라리아 원충이 적혈구내에 감염되어 발생한다. 현재 전세계 인구 중 10억명의 인구가 말라리아 감염 가능지역에 거주하고 있으며, 매년 5억명 이상이 말라리아에 감염되고 그 중 2 백명 이상이 목숨을 잃는 무서운 질병중의 하나이다. 이러한 말라리아는 전 세계적인 분포를 보이고 있으나 1960년대 이후로는 효과적인 방제로 인하여 그 발생율이 꾸준히 감소되어 왔으며 일부 지역에서는 소멸되기도 하였으나, 최근 엘리뇨 현상과 같은 이상 기온 현상, 약제 내성 균주의 증가 및 살충제에 대한 저항성 증가 등의 요인으로 인해 전 세계적으로 말라리아가 다시 확산되고 있는 추세이다.

말라리아는 말라리아 원충이 모기로부터 사람의 적혈구로 이동함으로써 발생하게 되며, 말라리아 원충의 생활사는 사람에서의 분열생식기(Schizogony)와 모기에서의 포자기(Sporogony)로 나누어지는데, 처음 모기가 사람을 물면 말라리아 원충은 혈관을 따라 간으로 이동하여 간세포에서 증식하거나 휴면상태로 존재하다가, 일정한 기간이 지난 후에는 혈중으로 나와 본격적인 증식을 한다. 혈중에서는 적혈구를 숙주 세포로 하여 영양체인 고리형에서 증식형을 거쳐 분열체를 생성하며, 생성된 분열체가 수십개의 분열소체를 방출하면 각각 다시 다른 적혈구로 침입하여 동일한 생활사를 반복하게 된다. 이중 일부가 생식모세포 형태로 존재하게 되는데, 모기가 이런 상태의 사람을 흡혈하게 되면 생식모세포가 모기로 유입되어 증식되고 모기의 위와 침심에 포자상태로 존재하다가 다시 모기에 의해 사람에게 감염되는 과정을 반복하게 된다.

말라리아는 그 원충의 지리적 분포의 차이, 원충간의 종적 특성 및 유전적 성향에 따라 크게 중남미를 중심으로 한 아메리카형, 아프리카 대륙 전체를 중심으로 한 아프리카형, 그리고 인도와 동남아시아를 중심으로 한 아시아형으로 나뉜다. 국내에서 발병하는 한국형 말라리아는플라스모디움 비백스(Plasmodium vivax)라는 말라리아 원충에 의해서만 감염된다(Chom. S. Y.,Korean J Parasit.,32(4), 281-284)고 알려져 있는데, 국내에서 유행되고 있는플라스모디움 비백스는 오랜 잠복기를 거치고 혈액내 적은 원충수가 존재하는 특징을 가지고 있어 진단에 어려움을 초래한다. 국내에서 말라리아는 학질이라는 질병으로 오래 전부터 알려져 왔는데, 1960년대부터 시작된 말라리아 박멸사업으로 1970년대 이후에는 거의 박멸되어 보고 되지 않았다. 하지만, 최근 1993년에 휴전선 부근에서 1명의 말라리아 환자가 발생한 이후 말라리아가 급속히 확산되어 1998년에는 300명에 이르는 환자가 발생된 것으로 보고되었다. 이러한 말라리아의 급속한 증가 추세에도 불구하고 국내에서는 말라리아의 감염을 진단하는 진단시약이나 진단방법이 아직까지 자체 개발되지 못하고 있기 때문에 대부분의 말라리아 진단은 수입된 진단시약에 의존하고 있다. 하지만, 외국에서 수입된 진단시약은 말라리아의 젖산 환원효소(Lactate Dehydrogenase) 등의 항원를 검출하는 방식으로 진단하는 것이므로, 혈액내 적은 원충수가 존재하여 상대적으로 항원 생성이 적은 한국형 말라리아를 진단하기에는 그 민감도가 약 50% 수준에 머물고 있는 실정이므로 한국형 말라리아를 진단할 수 있는 진단시약의 자체 개발에 대한 요구가 증가되고 있다.

말라리아의 진단 방법으로는 고전적 방법인 혈액 도말법이 가장 많이 사용되고 있는데, 이 진단방법은 현미경으로 염색된 말라리아 감염 혈구를 관찰하는 방법이다. 그러나 이 진단방법은 시간이 많이 소요되고 말라리아에 감염된 혈구를 판별해내기 위하여 검사자의 전문교육이 요구된다는 문제점이 있다. 최근에는 이러한 문제점을 해결하기 위해 말라이아의 항원을 검출하는 시약이 시판 되고 있으나, 이들 시약들 역시 민감도가 낮기 때문에 상기 혈액 도말법과 동시에 사용하도록 권고되고 있다. 또 다른 진단방법으로서 말라리아 원충의 유전자를 검사하는 PCR 방법은 민감도는 높지만 과정상의 어려움으로 아직 실용화되지 못하고 실험실에서만 행하여 지고 있는 실정이다. 또한, 이와 같은 종래의 진단방법은 특히플라스모디움 비박스에 의해 감염되어 잠복기가 길고 혈액내 원충수가 적은 한국형 말라리아를 진단하는데는 더욱 어려움이 있다.

이에 상기 문제점을 극복하기 위하여 본 발명자들은 삼일열 말라리아 원충인플라스모디움 비박스의 특이한 표면 단백질 MSP의 C-말단을 항원으로 이용하여 환자의 혈액내에 존재하는 항체를 검출하여 말라리아를 진단하는 방법을 개발하였다.

MSP는 말라리아 원충플라스모디움 비박스의 표면에 특이적으로 존재하는 표면 항원 단백질로서, 특히 MSP의 C-말단 부위를 코딩하는 PV200C 폴리펩타이드는 그 서열이 108개 아미노산으로 구성되며플라스모디움 비박스원충들의 아종 사이에서 100 %의 상동성을 보이는 것으로 알려져 있어서, PV200C 폴리펩타이드를 말라리아 진단을 위한 목적 항원 단백질로 사용할 경우 한국형 삼일열 말라리아를 진단하는데 매우 유용하다.

현재 말라리아 항원 자체의 발현에 관한 연구는 많이 이루어지지 않은 상태이며, 일반적으로 항원 단백질을 코딩하는 유전자를 과발현시켜 단백질을 얻는 방법이 많이 연구되었는데, 제조된 대부분의 항원들은 혈액응고인자 Xa (Ellinger et al.,Virol. 180, 81, 1991)나스타필로코커스(Staphylococcus)의 단백질 A (Marczinovits et al.,J. Biochem., 31, 225, 1993) 또는 β-갈락토시데이즈(β-galactosidase) 등과 같은 단백질에 융합시켜 발현한 것이었다. 그 결과 이렇게 융합된 항원 단백질의 발현양은 증가하였지만, 항원 단백질로부터 융합된 단백질을 제거하기 위한 정제 과정이 많아져 수율이 감소하고 제조원가가 상승하는 문제점을 야기하며, 진단시약으로 사용 시 융합 파트너로 사용된 단백질에 의해 정상인을 환자로 오진하게 되는 위양성(pseudo-positive signal)율도 증가하는 문제점을 나타내었다.

이에, 본 발명자들은 상기 방법들의 문제점을 극복하면서 한국형 말라리아 진단에 적합한 말라리아 진단시약을 개발하기 위한 연구의 일환으로, 국내 말라리아 환자의 혈액으로부터플라스모디움 비박스표면 단백질 MSP중 원충의 아종 사이에서 100% 상동성을 보이는 108개 아미노산으로 구성되고, MSP의 C-말단에 존재하는 PV200C 폴리펩타이드를 클로닝(cloning)하여 이를 효모로부터 절단없이 발현·정제하는 제조방법을 개발하였으며, 상기 항원 단백질에 대한 항체 유무를 조사하여 말라리아 환자를 판별하는 진단시약으로써 뿐만 아니라 백신으로서도 유용하게 사용될 수 있음을 밝힘으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 한국형 삼일열 말라리아 원충의 표면 단백질 유전자를 클로닝한 재조합 발현벡터를 제작하여 이를 효모에 형질전환시키고, 상기 재조합 발현벡터가 형질전환된 효모 형질전환체로부터 발현된 표면 단백질을 포함하는 말라리아 진단 시약을 제공하는 것이다.

도 1은 효모에서 말라리아 표면을 발현하는 발현벡터 pYLJ-MSP의 제조과정을 나타낸 것이고,

도 2는 프로본드 흡착수지를 이용하여 정제된 표면을 SDS-폴리아크릴아마이드 젤에 전기영동한 결과를 나타낸 것이고,

레인 1 : 세포배양액을 원심분리한 침전물

레인 2 : 세포배양액을 원심분리한 상등액을 농축한 것

레인 3 : 농축한 상등액을 프로본드 칼럼으로 정제한 것

도 3은 항원성 검증을 위해 말라리아 환자혈청을 이용하여 웨스턴 블러팅을 수행하여 항원성을 검정한 결과를 나타낸 것이다.

레인 1 : 농축한 내양액

레인 2 : 정제된 MSP 단백질

상기 목적을 달성하기 의하여, 본 발명은 삼일열 말라리아 원충(Plasmodium vivax)의 표면 단백질 MSP 유전자, 히스티딘 잔기 및 효모의 α-인자 리더 펩타이드를 포함하는 발현벡터, 상기 발현벡터로 형질전환된 형질전환체 및 상기 형질전환체를 이용하여 표면 단백질 MSP를 제조하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 방법으로 제조된 표면 단백질 MSP의 C-말단부위 PV200C 폴리펩타이드를 포함하는 말라리아 진단 시약을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 삼일열 말라리아 원충 표면 단백질 MSP의 C-말단에 위치하는 PV200C 폴리펩타이드의 N-말단에는 효모의 α-인자 리더 펩타이드를 결합시키고, C-말단에는 6개의 히스티딘 잔기를 결합시킨 융합 단백질의 발현벡터 pYLJ-MSP 및 상기 발현벡터를 효모에 형질전환시킨 형질전환체 pYLJ-MSP/S. cerevisiaeINVSC1(수탁번호 : KCTC 8977P)를 제공한다.

본 발명의 표면 단백질 MSP 유전자는 그 유전자의 전부 또는 일부를 사용할 수 있으며, 바람직하기로는플라스모디움 비박스의 여러 종에서 아미노산 서열이 비교적 일정하다고 알려진 말라리아 원충 표면 단백질 MSP의 C-말단 부위 유전자인 PV200C 유전자를 사용하는 것이 바람직하다. 따라서 본 발명에서는플라스모디움 비박스원충의 아종 사이에서도 아미노산 서열이 100% 상동성을 보이는 108개 아미노산으로 구성된 상기 말라리아 원충 표면 단백질 MSP의 C-말단 부위에 위치하는 PV200C 유전자를 사용하였다.

상기 폴리펩타이드 PV200C를 클로닝하기 위하여 본 발명자들은 말라리아 양성 혈액에서 RNA를 정제하여 이로부터 cDNA를 만들고, 상기 cDNA를 주형으로 PV200C에 특이적인 프라이머 쌍을 사용하여 중합효소 연쇄반응(이하 ‘PCR’이라약칭함)을 수행함으로써 증폭된 PV200C DNA 절편을 얻었다.

한편, 효모내에서 발현된 PV200C 폴리펩타이드를 세포밖으로 분비되도록 발현을 유도하여 당쇄화 된 활성형 형태의 단백질을 얻기 위해서 PV200C 폴리펩타이드의 N-말단에 효모의 α-인자 리더 펩타이드 서열을 결합시켰다. 이처럼 PV200C 폴리펩타이드의 N-말단에 결합될 효모의 α-인자 리더 펩타이드 서열은 상기 서열을 함유하는 플라스미드로부터 PCR을 수행함으로써 효모의 증폭된 상기 DNA 절편을 얻을 수 있다.

상기와 같이 얻은 PV200C 유전자와 효모 α-인자 리더 펩타이드 DNA 절편을 연결하기 위하여, 이들 두 PCR 산물들을 주형으로 오버랩핑(overlapping) PCR 을 수행하였다. 그 결과, 상기 유전자는서열번호 8로 기재되는 108개 아미노산을 코딩하는 유전자로 구성되어 있었다. 본 발명자들은 상기 유전자 절편을 pYES-2 벡터에 삽입하여 재조합 발현벡터 pYLJ-MSP를 얻었다(도 3참조).

또한 본 발명자들은 상기의 재조합 발현벡터 pYLJ-MSP를 효모에 형질전환시켜 형질전환체 pYLJ-MSP/S. cerevisiaeINVSC1를 얻었고 이를 생명공학 연구소 유전자은행에 1999년 12월 18일자로 기탁하였다(수탁번호 : KCTC 8977P).

또한, 본발명은 상기의 형질전환체를 이용하여 활성형의 말라리아 항원 PV200C 폴리펩타이드를 제조하는 방법을 제공한다.

상기 형질전환체로부터 발현된 말라리아 표면 PV200C 폴리펩타이드는 N-말단에 붙어있던 α-인자 리더 펩타이드에 의해 세포 밖으로 분비되고, 분비된 후에 N-말단에 붙어있던 α-인자 리더 펩타이드는 세포막에 존재하는 펩티데아제(peptidase)에 의해 제거됨으로써, 표면 단백질만이 배양액으로 분비됨을 확인하였다.

상기와 같이 효모 형질전환체로부터 발현된 표면 단백질은 배양액내로 분비되기때문에, 본 발명자들은 이의 분리·정제를 위해 표면 단백질 C-말단에 붙인 6개 히스티딘 잔기를 이용하여 프로본드 칼럼에 흡착시켜 분리한 후 젤 여과 크로마토그래피를 수행하여 정제함으로써, 99% 이상의 고순도로 분리·정제된 표면 MSP를 얻었다. 이렇게 분리·정제된 표면 MSP는 약 18 KDa이었으며, N-말단의 아미노산 서열 분석에 의해 상기에서 발현된 단백질이 말라리아 항원 PV200C 폴리펩타이드임을 확인하였다.

한편, 상기의 효모 형질전환체로부터 분리·정제된 말라리아 표면의 항원성을 결정하기 위하여 말라리아 환자의 혈청으로 웨스턴 블러팅(Western blotting)을 수행하였다. 그 결과 18 KDa 위치의 표면 단백질 MSP PV200C 만이 검출되었고, 따라서 본 발명의 제조방법에 따라 효모 형질전환체로부터 분리·정제된 단백질이 매우 민감하고 특이성이 높은 항원임을 입증하였다.

이상에서 본 바와 같이 본 발명의 제조방법에 의해 재조합 효모 형질전환체로부터 발현된 말라리아 표면 단백질을 히스티딘-친화 칼럼과 젤 여과 크로마토그라피 방법을 수행하여 분리·정제하면 항체에 대한 민감도 및 특이성이 높고 위반응의 확률이 현저히 적은 고순도의 표면 단백질을 얻을 수 있으며, 상기 표면 단백질은 한국형 말라리아를 진단하는 진단시약의 항원 뿐만 아니라 백신으로 효율적으로 사용할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 말라리아 양성 혈액에서의 cDNA 제조

말라리아 양성혈액에서 RNA를 정제하기 위하여 TRI 시약 TM(Sigma)을 사용하였다. 정제 방법은 시약 제조사가 제시하는 하기의 방법을 사용하였다. 말라리아 양성혈액 0.1 ml에 TRI 시약 TM 0.1 ml을 혼합하고 상온에서 5분간 방치하였다. 상기 반응용액에 BCP 20 ㎕를 혼합하고 상온에서 5분간 방치한 후, 4℃, 12,000 rpm 조건으로 15분간 원심분리를 하였다. 이때, 원심분리를 하면 3개의 층이 형성되는데 이 중 RNA가 포함된 상층액만을 새 튜브로 옮기고, 여기에 이소프로판올(isopropanol) 50 ㎕를 혼합하여 상온에서 5분간 방치하였다. 상기 반응액을 4℃, 12,000 rpm 조건에서 다시 10분간 원심분리하여 상층액은 버리고 침전물은 75% 에탄올로 세척한 후 증류수 20 ㎕에 녹여서 cDNA 제조에 사용하였다.

상기에서 정제한 RNA 9 ㎕와 N6 무작위 프라이머(random primer, Genotech) 1 ㎕를 혼합하여 65℃에서 5분간 반응시킨 후 얼음에 옮겨 냉각시켰다. 상기 혼합용액에 RT 완충용액 4 ㎕, 0.1 M DTT 2 ㎕, 10 mM dNTP 1 ㎕, 역전사 효소(Reversetranscriptase, Gibco) 1 ㎕, 역전사 저해제(RT inhibitor, Promega) 1 ㎕, D.W. 1 ㎕를 넣어 42℃에서 1시간 반응시키고 이어서 70℃에서 10분간 반응시켜 cDNA를 제조하였다.

<실시예 2> PV200C 코딩 유전자를 포함하는 재조합 플라스미드의 제작

실시예 1에서 제조한 cDNA를 주형으로 하고서열번호 1과서열번호 3으로 기재되는 프라이머 쌍을 이용하여 PCR을 실시하였다. PCR 반응은 PCR 완충용액 5 ㎕, 2.5 mM dNTP 5 ㎕, 순방향 프라이머 1 ㎕, 역방향 프라이머 1 ㎕, 주형 DNA 2 ㎕, 탈이온수 35 ㎕를 혼합한 반응용액을 94℃에서 30초간 반응시킨 후, 상기 반응용액에 벤트 중합효소(Vent polymerase, BioLab) 1 ㎕를 넣고 94℃ 30초, 55℃ 30초, 72℃ 30초로 진행되는 반응을 36회 반복하여 수행하였다.

상기에서 증폭된 DNA를 주형으로 하고서열번호 2와서열번호 3으로 기재되는 프라이머 쌍을 이용하여 다시 PCR을 실시하였다. PCR 반응은 상기와 동일한 반응조건에서 실시하였고, 증폭된 DNA는 1% 아가로즈 젤에서 전기 영동을 실시하여 확인하였다. 증폭된 DNA(‘Pv200-ct657’로 명명함)를 제한효소 EcoR V로 처리한 pBluscript KS(+)(Stratagene) 벡터에 T4 DNA 라이게이즈(ligase,Promega)를 이용하여 삽입(‘pBC-Pv200-ct657’로 명명함)한 후 대장균 JM 109 균주에 형질전환 시켰다.

<실시예 3> 발현벡터 PYLJ-MSP의 제작

상기 실시예 2에서 제작한 재조합 플라스미드 pBC-Pv200-ct657를 주형으로 하고서열번호 4와서열번호 5로 기재되는 프라이머 쌍을 이용하여 PCR을 실시하였다. PCR 반응은 상기와 동일한 반응조건에서 실시하였고, 증폭된 DNA(‘Pv200-19’로 명명함)는 1% 아가로즈 젤에서 전기 영동을 실시하여 확인하였다.

PV200C 폴리펩타이드의 N-말단에 결합될 효모의 α-인자 리더 펩타이드 서열을 얻기 위하여, 효모 α-인자 리더 펩타이드가 포함된 플라스미드인 α-IFN pYLBC(수탁번호 : KCTC 0051BP)를 주형으로 하고서열번호 6과서열번호 7로 기재되는 프라이머 쌍을 이용하여 PCR을 실시하였다. PCR 반응은 상기와 동일한 반응조건에서 실시하였고, 증폭된 DNA(‘효모 α-리더’로 명명함)는 1% 아가로즈 젤에서 전기 영동을 실시하여 확인하였다.

상기 과정에서 증폭된 Pv200-19와 효모 α-인자 리더 펩타이드를 연결하기 위하여, 이 두가지 PCR 산물을 주형으로 하고서열번호 5와서열번호 6으로 기재되는 프라이머 쌍을 이용하여 오버랩핑(overlapping) PCR을 실시하였다. PCR 반응은 PCR 완충용액 5 ㎕, 2.5 mM dNTP 5 ㎕, 순방향 프라이머 1 ㎕, 역방향 프라이머 1 ㎕, Pv200-19 PCR 산물 1 ㎕, 효모 α-인자 리더 펩타이드 PCR 산물 1 ㎕, 탈이온수 35 ㎕를 혼합한 반응용액을 94℃에서 30초간 반응시킨 후, 상기 반응용액에 벤트 중합효소 1 ㎕를 넣고 94℃ 30초, 55℃ 30초, 72℃ 30초로 진행되는 반응을 36회 반복하여 수행하였다. 증폭된 DNA(‘α-Pv200-19’라 명명함)는 1% 아가로즈 젤에서 전기 영동을 실시하여 확인하였다.

상기 과정에서 증폭된 α-Pv-200-19와 pYES-2 벡터를 각각 제한효소 HindIII와 Xho I으로 처리하고 T4 라이게이즈로 연결시켜 pYLJ-MSP라고 명명하였고(도 3), 상기의 α-Pv200-19 염기 배열을 조사한 결과서열번호 8로 기재되는 108개의 아미노산을 코딩하는 유전자로 구성되어 있음을 확인하였다. 재조합 발현벡터 pYLK-MSP를 힌넨(Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A. 75, 1929-1933, 1978)의 방법으로 효모사카로마이세스 세레비세INVSC1 (Sacharomyces cerevisiaeINVSC1)에 형질전환 시킨 후, 효모 형질전환체를 우라실(uracil)이 들어있지 않은 최소 배지에서 하루 밤 배양하였다. 상기의 효모 형질전환체를 생명공학연구소 유전자은행에 1999년 12월 18일자로 기탁하였다(수탁번호 : KCTC 8977P)

<실시예 4> 효모에서 MSP 단백질의 발현 및 정제

효모로부터 표면 단백질 MSP를 발현시키기 위하여 재조합 효모 형질전환체 pYLJ-MSP/S. cerevisiaeINVSC1를 2% 글루코즈(glucose)가 들어있는 YEPD 배지 100 ml에 접종하여 하룻밤 배양한 후, 상기 배양액을 글루코즈와 갈락토즈(galactose)가 각각 1%씩 포함된 YEP 배지 2 L에 옮겨 30℃에서 72 시간 동안 배양하였다. 재조합 효모는 글루코즈를 고갈시키면서 PV200C 폴리펩타이드를 발현하였는데 이때, 발현된 표면 단백질 PV200C 폴리펩타이드는 N-말단에 결합되어 있는 α-인자 리더 펩타이드에 의해 세포 밖으로 분비되고, 상기 표면 단백질이 분비된 후 N-말단에 결합되어 있던 α-인자 리더 펩타이드는 세포막에 존재하는 펩티다아제(peptidase)에 의해 제거됨으로써 목적하는 단백질만이 배양액내로 분비되었다.

이렇게 배양액내로 분비된 표면 단백질 PV200C 폴리펩타이드를 얻기 위하여 2일간 배양한 배양액을 원심 분리하여 균체를 제거한 후 배양액만을 취하여 한외 여과기(Amicon)로 농축하였다. 상기 농축된 배양액을 간단하게 정제하기 위하여 실시예 4에서 증폭된 Pv200-19의 C-말단에 붙인 6개의 히스티딘 잔기를 이용하여 양이온인 히스티딘이 결합된 표면 단백질을 음이온인 니켈이 부착된 프로본드(Probond,Invitrogen) 칼럼에 흡착시켰다. 칼럼에 흡착 되지않은 불순물은 10 mM 이미다졸(imidazol)이 들어있는 인산염 완충용액으로로 제거하고, 칼럼에 흡착되어 있는 표면 단백질은 500 mM 이미다졸과 인산염 완충액으로 탈착시켜 분리하였다.도 2에서 보듯이, 이 과정에서 표면 단백질은 거의 90% 이상 순수하게 분리되었고, 상기 분리용액을 농축하여 세파크릴(Sephacryl) S-200 젤 여과 크로마토그라피를 수행하면 표면 단백질이 거의 99%의 고순도로 분리되었다.

<실시예 5> 효모에서 정제된 말라리아 표면 단백질의 항원성 검정

상기 실시예 4에서 분리·정제된 표면 단백질 PV200C 폴리펩타이드를 12% SDS-PAGE로 분석한 결과 18KDa 위치에서 검출되었고, N-말단의 아미노산 서열 분석을 통해 본 발명의 목적 단백질임이 확인되었다.

또한, 상기 효모에서 정제된 말라리아 표면 단백질의 항원성을 검정하기 위하여, 말라리아 환자혈청으로 웨스턴 블러팅(Western blotting)을 수행하였다. 웨스턴 블러팅은 토우빈 등의 방법(Towbin et al.,Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 76, 4350-4354, 1979)에 의해 수행하였다. 전기영동이 끝난 젤을 25 mM 트리스 완충용액, 190 mM 글리신(glycine, pH 8.3), 20% 메탄올(methanol)을 혼합한 완충용액에 30분 동안 담구어 둔 후, 동일한 완충용액을 이용하여 나이트로셀룰로즈 막(nitrocellulose membrane)으로 전기 영동하여 단백질을 옮겼다. 단백질이 옮겨진 나이트로셀룰로즈 막을 3% Skim milk가 포함된 pH 7.4의 인산염 완충용액으로 상온에서 1시간 동안 반응시킨 후, 1/100로 희석한 말라리아 환자의 혈청을 첨가하여 상온에서 1시간 동안 반응시켰다. 반응이 끝나면 0.05% Tween 20/인산염 완충용액으로 상기의 나이트로셀룰로즈 막을 5분 간격으로 5회 세척한 후 염소에서 만든 고추냉이 과산화효소가 접합된 2차 항체(Vector Labs)를 1/2000로 희석하여 상온에서 1시간 동안 반응시켰다. 반응이 끝나면 다시 나이트로셀룰로즈 막을 상기의 용액으로 세척한 후 4-클로로-나프톨(4-chloro-naphthol)과 과산화수소로 발색을 유도하였다. 그 결과 18 KDa 위치의 표면 단백질 MSP PV200C 만이 검출됨을 확인하였으며, 이로써 본 발명의 제조방법에 의해 발현·정제된 표면 단백질 MSP의 PV200C 폴리펩타이드가 높은 특이성을 가진 항원임을 확인할 수 있었다.

본 발명은 말라리아 원충의 표면 단백질인 MSP의 C-말단부위에 존재하는 PV200C 폴리펩타이드를 N-말단에는 효모의 α-인자 리더 펩타이드와 같은 당쇄를 활성형 단백질의 형태로 제조하여 목적 단백질만이 세포 밖으로 분비되게 발현을 유도하고, C-말단에 6개 히스티딘 잔기를 붙여서 발현시킨 후 히스티딘 잔기가 결합된 목적 단백질을 히스티딘-친화 칼럼과 젤 여과 크로마토그라피 과정을 통해 분리·정제된 표면 단백질을 포함하는 말라리아 진단 시약에 관한 것으로, 본 발명의 유전자 재조합 기술에 의해 효모로부터 발현된 말라리아 표면 단백질 MSP는 활성형 형태의 단백질로 발현시켜 종래보다 훨씬 손쉽고 신속하게 고순도의 표면 단백질로 정제될 수 있으며, 또한 상기 표면 단백질은 항체에 대한 민감도와 특이성이 높아 진단 시약과 백신의 좋은 재료로 사용될 수 있다.

Claims (2)

1. 삼일열 말라리아 원충플라스모디움 비박스(Plasmodium vivax)의 표면 단백질 MSP(merozoit surface protein)의 C-말단 부위인 서열번호 8의 PV200C 폴리펩타이드를 코딩하는 유전자, 효모의 α-인자 리더 펩타이드(α-factor leader peptide) 및 히스티딘(histidine) 잔기를 포함하는 발현벡터로 형질전환된 효모에서 생산되는 서열번호 8의 PV200C 폴리펩타이드를 포함하는 말라리아 진단 시약.
2. 제 1항에 있어서, 상기 형질전환된 효모는 pYLJ-MSP/S. cerevisiae INVSC1(수탁번호 : KCTC 8977P)인 것을 특징으로 하는 말라리아 진단 시약.