CN1406284A - 疟疾免疫检测和诊断试剂 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用疟原虫抗原进行的疟疾免疫检测和诊断试剂。优选地，本发明涉及一种用疟原虫Vivax裂殖子表面蛋白检测血中疟疾特异性抗体的疟疾免疫检测和诊断试剂。根据本发明的检测血中疟疾特异性抗体的疟疾免疫检测和诊断试剂具有高的特异性和敏感性，可用于诊断潜伏期长、血中疟原虫数目少的类型的疟疾。本发明还涉及一种用酵母菌或大肠杆菌制备疟原虫表面蛋白的方法。优选地，本发明提供了一种表达载体，包括有疟原虫Vivax裂殖子表面蛋白基因和组氨酸残基，及用该表达载体转化的转化体。本发明还提供了一种用该转化体制备疟原虫裂殖子表面蛋白方法。根据本发明方法用酵母菌或大肠杆菌制备的疟原虫裂殖子表面蛋白对抗体具有高的敏感性和特异性，且具有高纯度。此外，本发明的制备方法制备的表面蛋白用于诊断疟疾时具有显著低的假阳性信号。

Description

疟疾免疫检测和诊断试剂
技术领域
本发明涉及一种疟疾免疫检测和诊断试剂。特别是，本发明涉及一种用疟原虫抗原检测血中疟疾特异性抗体的疟疾免疫检测和诊断试剂。本发明还涉及一种用疟原虫抗原检测血中疟疾特异性IgM和/或IgG的疟疾免疫检测和诊断试剂。另外，本发明还涉及一种用酵母菌或大肠杆菌制备疟原虫表面蛋白的方法。
技术背景
疟疾是由一种在人身红细胞内感染，并由蚊虫携带的疟原虫引起的疾病。世界上有十亿人处于疟疾危险区，每年有五亿人被感染上疟疾。
每年有200万人死于疟疾。疟疾在全世界广泛传播。然而，在一些地区，从20世纪60年代以来，由于采取有效控制，疟疾已得到根除或减少。但近年来，由于抗药菌株的增加，对杀虫剂抗性的增加，非正常气候，如厄尔尼诺性气候等，疟疾在全世界范围内又有所增加。
疟疾可分为非洲型、美洲型和亚洲型。
每种类型的地理分布、种属特性以及疟原虫表现的遗传倾向均不同。
疟疾的生活周期分为分裂生殖和孢子生殖。
在人类宿主中的生活周期是分裂生殖，在蚊虫宿主中的生活周期是孢子生殖。人被感染的蚊虫叮咬后，可被孢子感染。孢子通过人的血管转移到肝脏，或以休眠状态存在，或在肝细胞中繁殖发展为裂殖体。
一定时期后，裂殖体进入血循环并全面繁殖。当裂殖体成熟时，发生分裂并释放出成千上万裂殖子进入血流中。裂殖子侵入红细胞，大部分裂殖子进入又一轮无性繁殖，再形成裂殖体。一些裂殖子变为配子母细胞。该配子母细胞随人体血流循环。当蚊虫叮咬受感染的人时，同时吸取了血中的配子母细胞，然后，雄性配子母细胞和雌性配子母细胞在蚊子腹中融合，形成受精卵。作为卵母细胞在腹壁中生长的受精卵，逐渐成为感染性孢子体，进入蚊子的唾液腺和胃。然后，此蚊子能感染另一个人类宿主。
药物，如氯喹和首喹已用于治疗疟疾。然而，近来疟原虫对这些药产生了抗性。因此，在疟疾治疗中，药物抗性是个大难题。
在韩国，疟疾称为Hakjil。从上世纪60年代开始，做了很大努力根除此病，到70年代后，疟疾发生已很少报道。
然而，自从1993年报道了在非军事区(DMZ)附近一个被疟原虫感染的病例后，疟疾开始迅速传播，在1998年，被疟原虫感染的病人数量就达3,800人。
人类疟疾可被以下四种之一寄生虫引起：疟原虫vivax，疟原虫falciparum，疟原虫malariae和疟原虫ovale。
其中，发生在韩国的疟疾由疟原虫vivax引起(Choi.S.Y.，KoreanJ Parasit.，32(4)，281-284)。疟原虫vivax的特点是诊断较难，因其潜伏期长，且血中原虫数目少。用进口疟疾诊断试剂检测疟疾抗原，如疟疾乳酸盐脱氢酶。然而进口疟疾诊断试剂诊断潜伏期长、血中原虫数目少的韩国型疟疾较困难，因为诊断试剂的敏感度仅有50％。
最常用的诊断疟疾方法是血痕法。该方法是一种经典方法，将被疟原虫感染的血细胞染色，然后用显微镜观察被染色的样品。然而，这种方法花费较长时间，并且需要培训检查人员学会判断被疟原虫感染的血细胞。
近来可购到一种检测疟疾抗原的诊断试剂。但因此诊断试剂敏感性低，需与血痕法配合使用。另一种检测疟原虫基因的方法是PCR方法，敏感性高但过程复杂。因此不能实际应用，仅可用于实验室研究。此外，常规方法均难以诊断潜伏期长且血中原虫数目少的韩国型疟疾。
迄今有关疟疾抗原本身表达的研究较少，而对开发通过超表达编码抗原蛋白的基因获得蛋白的方法的研究已经很发达。大多数抗原在与蛋白，如血凝因子Xa(Ellinger et al.，Virol.180，81，1991)，葡萄球菌蛋白A((Marczinovits et al.，J.Biochem.，31，225，1993)及Bgalactosidase(β-半乳糖苷酶)融合后被表达。其结果使融合抗原量增加。
然而，当它们作为诊断试剂时，因蛋白是融合配偶体，假阳性信号也增加了。虽然有人用切割融合蛋白来解决此问题  (Chang et al.，Biotechnology 3，985-990，1985；Ellinger et al.，Virology，180，811-813，1991)，但在进一步减少假阳性信号方面没有什么效果，且产量减少，制备成本增加，因为从抗原中除去融合蛋白的切割和纯化方法非常复杂。
发明内容
为解决上述问题，本专利发明人开发了一种通过检测疟疾患者血中疟疾特异性抗体的疟疾免疫测定方法，本发明更涉及一种用疟原虫抗原检测血中疟疾特异性抗体的疟疾免疫检测和诊断试剂。优选地，本发明提供了一种用抗人IgG抗体和/或抗人IgM抗体，及用一部分或整个疟疾裂殖子表面蛋白(MSP)抗原夹层免疫检测的间接免疫检测方法。
另外，本发明开发了一种疟疾免疫检测和诊断试剂，用疟原虫抗原特定检测疟疾患者血中疟疾特异性IgM。在疟疾抗体中，IgG可在出现疟疾后维持几年或几十年。因此，长期以来，在疟疾流行地区，检测包括IgG的疟疾抗体时，出现许多假阳性信号，引起混淆。在本发明的抗原夹层免疫检测中，在正常未感染疟疾人中，十多岁到三十多岁人的受试者，很少有发现疟疾抗体阳性反应出现，然而，在四十多岁或更大年龄人中，出现5％或更高疟疾抗体阳性反应。即在四十多岁或更大年龄人中发生相对较高IgG假阳性信号。这是因为四十多岁人在60代年以前暴露于感染疟疾蚊子的概率高。
同样，在疟疾流行地区，疟疾特异性IgGs在完全恢复健康的疟疾患者体内存留，相对高的假阳性信号在疟疾抗体试验中出现。因此，用抗疟疾抗体试验诊断疟疾的效果较差。所以在疟疾流行地区或对40岁以上人诊断疟疾，检测IgM比检测IgG的方法更为有效。IgM值在治疗疟疾后随时间消失，而IgG甚至在疟疾治疗后仍存在。
根据本发明，用疟原虫抗原检测血中疟疾特异性IgM的疟疾免疫检测比现有技术中检测特异性抗原的免疫检测方法更灵敏，从而使早期诊断出疟疾的病人成为可能。而且根据本发明检测疟疾特异性IgM的疟疾免疫检测法，可以从已完全恢复健康的人中区别出疟疾患者。
另一方面，为了克服现有技术中获得抗原蛋白的上述问题和为了开发能诊断韩国型疟疾的免疫诊断方法和诊断试剂，本发明研究了一种制备方法，该方法从国内患疟疾人血中克隆疟原虫vivax裂殖子表面蛋白，优选疟原虫Vivax裂殖子表面蛋白C-端，更优选多肽PV200C，然后从酵母菌或大肠杆菌表达，并不切割纯化。
本发明的制备方法可以通过酵母菌或大肠杆菌的疟原虫重组表面蛋白的表达，然后用一种简单方法分离纯化大量生产对抗体高灵敏性及高纯度的抗原。由此产生的抗原可通过检测疟疾抗原的抗体，成为判断疟疾患者的诊断试剂。
另外，如此产生的抗原可用作疫苗。
本发明的第一目的是提供一种疟疾免疫检测和诊断试剂，用疟原虫抗原检测血中疟疾特异性抗体。本发明的第二目的是提供一种间接免疫测定方法，用抗人IgG抗体和/或抗人IgM抗体作为标记的抗原结合物的抗原。本发明第三目的是提供一种抗原夹层免疫检测方法，用部分或完整的疟疾裂殖子表面蛋白作为标记的抗原结合物的抗原。
本发明的第四目的是提供一种疟疾免疫检测和诊断试剂，用疟原虫抗原检测血中疟疾特异性IgM。本发明的第五目的是提供一种疟疾免疫检测和诊断试剂，用抗人IgM抗体检测血中疟疾特异性IgM。
本发明的第六目的是提供一种制备方法，通过克隆疟原虫vivax裂殖子表面蛋白基因制备重组表达载体，并转移至酵母菌，然后将酵母菌转化体表达的表面蛋白分离纯化至高纯度。本发明的第七目的是用上述方法提供一种大量生产诊断疟原虫vivax抗原的方法，用该方法制备的抗原敏感性高，特异性强，并具有明显低的假阳性信号。
本发明的第八目的是提供一种制备方法，通过克隆疟原虫vivax裂殖子表面蛋白基因制备重组表达载体，并转移至大肠杆菌，然后将大肠杆菌转化体表达的表面蛋白分离纯化至高纯度。本发明的第九目的是用上述方法提供一种大量生产诊断疟原虫vivax抗原的方法，用该方法制备的抗原敏感性高，特异性强，并具有明显低的假阳性信号。
本发明提供了一种疟疾免疫检测和诊断试剂，检测血中疟疾特异性抗体，比现有技术免疫检测特异性抗原更灵敏，可以检测疟疾携带者及疟疾患者，用于诊断潜伏期长且血中原虫数目少的韩国型疟疾。
本发明还提供了一种疟疾免疫检测和诊断试剂，检测血中疟疾特异性IgM，使用该试剂检测可将痊愈疟疾患者与疟疾患者区别出来。
本发明还提供了一种制备方法，可以比现有技术方法方便快速地生产高纯度的疟原虫表面抗原。通过本发明的制备方法纯化的疟原虫表面蛋白纯度、敏感性及特异性高，并具有明显低的假阳性信号，适用于疟疾诊断试剂。
附图说明
图1表示了酵母菌制成的疟原虫表达表面抗原表达载体pYLJ-MSP的制备方法。
图2是SDS-聚丙烯酰胺凝胶用Probond吸附树脂纯化表面抗原的电泳结果的照片。
泳道1是细胞培养物离心后的颗粒沉淀；
泳道2是细胞培养物离心后浓缩的上清液；
泳道3是用Probond柱纯化的浓缩上清液。
图3是疟疾患者血清用蛋白印迹法进行抗原性检测结果的照片
泳道4是浓缩的细胞培养物；
泳道5是纯化的裂殖子表面蛋白。
图4示出了大肠杆菌制成的疟原虫裂殖子表面蛋白C-端的表达PV200C多肽的表达载体pELK-MSP的制备方法
图5是在SDS-PAGE上用组氨酸亲和树脂纯化的PV200C多肽电泳结果的照片。
M是尺寸标记；
泳道1是诱导表达的细胞培养物；
泳道2未诱导表达的细胞培养物；
泳道3是在柱上被纯化的蛋白。
图6是疟疾患者的血清的PV200C多肽的蛋白印迹法的结果的照片。
M是尺寸标记；
泳道4是诱导表达的细胞培养物；
泳道5是纯化的裂殖子表面蛋白。
图7是根据疟疾特异性的IgM捕捉酶免疫试验方法测定的216个疟疾-阳性样品和353个疟疾-阴性样品的诊断结果图。
图8是根据疟疾特异性的IgM捕捉酶免疫试验和间接酶免疫试验方法测定的75个疟疾-阳性样品和92个疟疾-阴性样品的诊断结果图。
图9是根据疟疾特异性的IgM捕捉酶免疫试验和抗原夹层酶免疫试验方法测定的不同年龄的129个疟疾-阴性样品的诊断结果图。
实现本发明的最佳实施例
为达到上述目的，本发明提供了一种用疟原虫抗原检测血中疟疾特异性抗体的疟疾免疫测定方法，和一种检测血中疟疾特异性抗体的疟疾诊断试剂，包括有疟原虫抗原的疟疾诊断试剂。
本发明还提供了一种用疟原虫抗原检测血中疟疾特异性IgM的疟疾免疫测定方法，及一种检测血中疟疾特异性IgM的疟疾诊断试剂，包括有疟原虫抗原的疟疾诊断试剂。
优选地，本发明提供了一种检测血中疟疾特异性抗体的疟疾免疫测定方法，该方法包括(a)将疟原虫表面抗原固定在一个固体支持体上；(b)倾入血清或血浆样品，使疟疾特异性抗体与固定在该固体支持体上的抗原结合；(c)加入抗原和标记物组成的标记抗原结合物，使该标记抗原结合物与疟疾特异性抗体结合；(d)用结合到疟疾特异性抗体的标记抗原结合物的标记物进行分析。
优选地，本发明提供了一种通过检测血中疟疾特异性IgM的疟疾IgM捕捉免疫测定方法，该方法包括：(i)将抗人IgM抗体固定在一个固体支持体上；(ii)倾入血清或血浆样品，使疟疾特异性IgM与固定在该固体支持体上的抗人IgM抗体结合；(iii)加入由标记物和疟原虫抗原组成的标记抗原结合物，使该标记抗原结合物与疟疾特异性IgM结合；(iv)用结合在疟疾特异性IgM上的标记的抗原结合物的标记物进行分析。
优选地，本发明提供了一种通过检测血中疟疾特异性抗体的疟疾诊断试剂，该诊断试剂包括覆盖有疟原虫表面抗原的固体支持体；由抗原和标记物组成的标记的抗原结合物；及含有一种着色固定剂的底物溶液。
优选地，本发明提供了一种检测血中疟疾特异性IgM的疟疾诊断试剂，该试剂包括：包括覆盖有抗人IgM抗体的固体支持体；由标记物和疟原虫抗原组成的标记的抗原结合物；及含有一种着色固定剂的底物溶液。
本发明还提供了一种表达载体，该载体包括疟原虫Vivax裂殖子表面蛋白基因，酵母菌的α因子前导肽和组氨酸残基。本发明提供了一种用上述表达载体转化的酵母菌转化体pYLJ-MSP/S.cerevisiae INVSC1(保藏号KCTC 0937BP)。本发明提供了一种用酵母菌转化体制备疟原虫裂殖子表面蛋白的方法。本发明提供了一种疟疾诊断试剂，该试剂包括用上述制备方法生产的表面蛋白。
本发明还提供了一种表达载体，该载体包括疟原虫Vivax裂殖子表面蛋白基因，组氨酸标记物和T7启动子。本发明提供了用上述表达载体转化的大肠杆菌转化体pELK-MSP/BL21(保藏号KCTC(0936BP)。本发明提供了一种用大肠杆菌转化体制备疟原虫裂殖子表面蛋白的方法。本发明提供了一种疟疾诊断试剂，该试剂包括用上述制备方法生产的表面蛋白。
本发明详述
本发明提供了一种用疟原虫抗原检测血中疟疾特异性抗体的疟疾免疫测定方法，和一种检测血中疟疾特异性抗体，包括疟原虫抗原的疟疾诊断试剂。本发明还提供了一种用疟原虫抗原检测血中疟疾特异性IgM的疟疾免疫测定方法，和一种检测血中疟疾特异性IgM，包括疟原虫抗原的疟疾诊断试剂。
优选地，在本发明上述免疫测定方法和诊断试剂中，疟原虫抗原是重组抗原。
优选地，在本发明上述免疫测定方法和诊断试剂中，疟原虫表面抗原可被用作疟原虫抗原。优选的疟原虫表面抗原包括部分或完整的疟原虫Vivax裂殖子表面蛋白，更优选的包括疟原虫Vivax裂殖子表面蛋白C-端。上述疟原虫Vivax裂殖子表面蛋白C-端包括疟原虫Vivax亚种共同的氨基酸序列，特别是包括了含有108个氨基酸的多肽(以下指″PV200C″)，它显示100％疟原虫Vivax亚种的同源性，如SEQ.ID NO：1所示。优选的疟原虫Vivax裂殖子表面蛋白C-端例子包括在疟原虫Vivax裂殖子表面蛋白C-端的部分或完整的PV200C多肽。而且，优选的PV200C多肽氨基酸序列包括如SEQ.ID NO：1所示的氨基酸序列。
该PV200C多肽可从重组转化体大量表达。本发明制备了一种表达PV200C多肽的酵母菌转化体和大肠杆菌转化体，并已于1999年12月18日保藏在Korean Collection for Type Cultures of Korea ResearchInstitute of Bioscience and Biotechnology(保藏号KCTC 0937BP，KCTC 0936BP)。
本发明提供了一种用疟原虫抗原检测血中疟疾特异性抗体的疟疾免疫测定方法。优选地，本发明上述检测血中疟疾特异性抗体的免疫测定可以是酶免疫测定法。
优选地，本发明提供了一种检测血中疟疾特异性抗体的疟疾免疫测定方法，该方法包括(a)将疟原虫表面抗原固定在一个固体支持体上；(b)倾入血清或血浆样品，使疟疾特异性抗体与固定在该固体支持体上的抗原结合；(c)加入由抗原和标记物组成的标记的抗原结合物，将该标记抗原结合物与疟疾特异性抗体结合；(d)用结合到疟疾特异性抗体上的标记抗原结合物的标记物进行分析。
优选地，在上述免疫测定方法中，本发明提供了一种间接疟疾免疫测定方法，其中步骤(C)中标记了抗原结合物的抗原是抗人IgG抗体和/或抗人IgM抗体。
优选地，在上述免疫测定方法中，本发明提供了一种疟疾的抗原夹层免疫检测方法，其中步骤(C)中标记了抗原结合物的抗原是疟原虫表面抗原。优选的疟原虫表面抗原包括部分或完整的疟原虫Vivax裂殖子表面蛋白，更优选的包括疟原虫Vivax裂殖子表面蛋白(C-端。
优选的疟原虫Vivax裂殖子表面蛋白C-端例子包括在疟原虫Vivax裂殖子表面蛋白C-端部分或完整的PV200C多肽。而且，优选的PV200C多肽氨基酸序列包括如SEQ.ID NO：1所示的氨基酸序列。
优选地，作为疟疾免疫测定方法，本发明提供了一种检测血中疟疾特异性抗体的免疫测定方法，该方法包括(a′)表达从转化体得到的疟原虫Vivax裂殖子表面抗原并纯化；(a)将纯化的表面抗原固定在一个固体支持体上；(b)倾入血清或血浆样品，使疟疾特异性抗体与固定在该固体支持体上的表面抗原结合；(c)加入由抗原和标记物组成的标记抗原结合物，将该标记抗原结合物与疟疾特异性抗体结合；(d)用结合在疟疾特异性抗体上的标记抗原结合物的标记物诱导显色；(e)用96孔板读出器测定吸光率。
上述优选的固体支持体包括孔板的孔。上述优选的方法还可进一步包括在标记抗原结合物与疟疾特异性抗体结合步骤后洗涤固体支持体如孔板的步骤。用标记抗原结合物的标记物分析的步骤包括，如，用结合到疟疾特异性抗体上的标记抗原结合物的标记物诱导显色及96孔板读出器测定吸光率的步骤。用标记抗原结合物的标记物诱导显色的步骤包括，如，加入一种由缓冲液和着色固定剂组成的底物溶液。
作为一个实施例，本发明提供了一种疟疾间接免疫测定方法，用覆盖有疟原虫抗原，优选疟原虫表面抗原的固体支持体检测血中疟疾特异性抗体。上述免疫测定方法采用结合了标记物的源自山羊的抗人IgG抗体和/或抗人IgM抗体，优选辣根过氧化物酶(HRP)作为标记抗原结合物。
在本发明疟疾间接免疫测定方法的一个实施例中，患者血中疟疾特异性抗体与固定在固体支持体上的疟原虫表面抗原结合，然后标记了抗原结合物的HRP-抗人IgG抗体or HRP-抗人IgM抗体与抗原-抗体复合物结合。
之后，所加入的底物溶液中的着色固定剂被标记的抗原结合物的HRP分解，诱导显色，然后用96孔板读出器测定吸光率，以检测疟疾特异性抗体的存在以及抗体的量。在上述间接免疫测定方法中，可诊断疟疾-阳性样品(疟疾患者血浆)和疟疾-阴性样品(正常人血浆)。结果表明，上述方法显示出约90％敏感性及95.8％特异性。
作为另一实施例，本发明提供了一种抗原夹层免疫检测疟疾方法，用覆盖有疟原虫抗原，优选疟原虫表面抗原的固体支持体检测血中疟疾特异性抗体。上述免疫测定方法用疟原虫表面抗原，优选结合了标记物的部分或完整的疟原虫Vivax裂殖子表面蛋白，优选辣根过氧化酶(HRP)作为标记抗原结合物。
在本发明抗原夹层免疫检测疟疾实施例中，患者血中疟疾特异性抗体与固定在固体支持体上的疟原虫表面抗原结合，然后标记抗原结合物的疟原虫HRP表面抗原与抗原-抗体复合物结合。之后，底物溶液中含有的着色固定剂被标记的抗原结合物的HRP分解，诱导显色，然后用96孔板读出器测定吸光率，以检测疟疾特异性抗体的存在以及抗体的量。在上述抗原夹层免疫检测方法中，诊断疟疾-阳性样品(疟疾患者血浆)和疟疾-阴性样品(正常人血浆)。结果表明，上述方法显示出约98.5％敏感性及99.6％特异性。
上述间接免疫测定方法用源自山羊抗人IgG抗体和/或抗人IgM抗体作为标记抗原结合物的抗原，间接检测患者血中疟疾特异性抗体。同时，上述抗原夹层免疫检测，用源自疟原虫表面抗原本身作为标记了抗原结合物的抗原，可检测所有患者血中疟疾特异性抗体。
本发明免疫检测疟疾的方法提供了一种覆盖有疟原虫抗原的固体支持体。当可能为疟疾患者的血样倾入该支持体上时，血中疟疾特异性抗体抗原专一地与固定在固体支持体上的抗原结合。加入标记抗原结合物后，通过识别与固定在固体支持体上的抗原结合的疟疾特异性抗体的Fc(fragment crystallization)区，标记抗原结合物与疟疾特异性抗体结合。然后，该标记抗原结合物的标记物分解该底物溶液中的着色固定剂，产生显色反应。最后，通过用测量吸光率检测血中抗体的存在和抗体量，本发明可用疟疾免疫检测方法诊断疟疾的感染情况。
通过用标记物-抗人IgG抗体和/或标记物-抗人IgM抗体，本发明上述间接免疫测定方法检测与固定在固体支持体上的抗原结合的疟疾特异性抗体。用包括有疟原虫抗原的标记抗原结合物，本发明上述抗原夹层免疫检测方法还可检测与固定在固体支持体上的抗原结合的疟疾特异性抗体。在上两种方法中，都采用了疟疾患者和正常人血浆都进行了疟疾诊断。结果表明，两种方法均显示出高于90％的敏感性和特异性。
本发明提供了一种疟疾诊断试剂，用以检测血中疟疾特异性抗体，该试剂包括覆盖有疟原虫表面抗原的固体支持剂；由抗原和标记物组成的标记抗原结合物；及含有一种着色固定剂的底物溶液。
疟原虫表面抗原的一个优选的实例包括部分或完整的疟原虫Vivax裂殖子表面蛋白，优选的实例包括疟原虫Vivax裂殖子表面蛋白C-端。疟原虫Vivax裂殖子表面蛋白C-端的一个优选的实例包括疟原虫Vivax裂殖子表面蛋白C-端部分或完整的PV200C多肽。并且，一个优选的PV200C多肽氨基酸序列的实例包括SEQ.ID NO：1所示的氨基酸序列。
优选地，在上述诊断试剂中，本发明可用抗人IgG抗体和/或抗人IgM抗体，作为标记了抗原结合物的抗原。
优选地，在上述诊断试剂中，本发明可用疟原虫表面抗原作为标记了抗原结合物的抗原。疟原虫表面抗原优选的例子包括部分或完整的疟原虫Vivax裂殖子表面蛋白，更优选的例子包括疟原虫Vivax裂殖子表面蛋白C-端。疟原虫Vivax裂殖子表面蛋白C-端的优选的例子包括在疟原虫Vivax裂殖子表面蛋白C-端部分或完整的PV200C多肽。并且，一个优选的PV200C多肽氨基酸序列的实例包括SEQ.ID NO：1所示的氨基酸序列。
优选地，本发明可用一种酶，如辣根过氧化酶(HRP)和碱性磷酸酶，胶体金，荧光物质，染色剂等作为该标记抗原结合物的标记物。更优选地，本发明可用辣根过氧化酶(HRP)作为该标记抗原结合物的标记物。
在本发明上述诊断试剂中，标记抗原结合物通过将疟疾特异性抗体结合到疟疾特异抗体改变不大的Fc(fragment crystallization)区来检测疟疾特异性抗体的存在。
作为优选的标记抗原结合物，本发明提供了HRP-抗人IgG抗体和/或HRP-抗人IgM抗体，其中抗人IgG抗体和/或HRP-抗人IgM抗体源自山羊。作为优选的标记抗原结合物，本发明也提供了HRP表面抗原结合物。其中该表面抗原是部分或完整的疟原虫表面蛋白。
本发明的诊断试剂包括当与该标记抗原结合物的标记物产生反应时的诱导显色的底物溶液。优选地，该底物溶液由一种缓冲溶液和一种当与该标记抗原结合物的标记物产生反应时的诱导显色的着色固定剂组成。优选的着色固定剂包括四甲基对二氨基联苯等。该底物溶液中的着色固定剂如四甲基对二氨基联苯被HRP分解，(HRP是优选的标记抗原结合物的标记物)产生显色。然后，用吸光率测定疟疾特异性抗体的存在及量。
本发明提供了一种用疟原虫抗原检测血中疟疾特异性IgM的疟疾免疫测定方法。优选地，本发明提供了一种用疟原虫抗原检测血中疟疾特异性IgM的IgM捕捉免疫测定方法。更优选地，本发明提供了一种用疟原虫抗原检测血中疟疾特异性IgM的IgM捕捉酶免疫测定方法。优选地，本发明也提供了一种用疟原虫抗原和抗人IgM抗体检测血中疟疾特异性IgM的免疫测定方法。
本发明提供了一种覆盖有源自山羊的抗人IgM抗体的96孔板，该板作为优选的固体支持剂，用于诊断疟疾。本发明还提供了一种由标记物和疟原虫抗原组成的标记抗原结合物，以检测疟疾特异性IgM。本发明该标记抗原结合物由标记物和抗原组成，该抗原优选地可以是从酵母菌或大肠杆菌转化体纯化的疟原虫重组表面抗原，用以检测疟疾特异性IgM。该标记抗原结合物的标记物包括，但不限于，一种酶，如辣根过氧化酶(HRP)和碱性磷酸酶，胶体金，荧光物质，染色剂等。优选地，该标记抗原结合物的标记物是一种酶，更优选地，是辣根过氧化酶(HRP)。
本发明优选的疟疾IgM捕捉免疫测定方法检测血中疟疾特异性IgM，包括(i)将抗人IgM抗体固定在一个固体支持体上；(ii)倾入血清或血浆样品使疟疾特异性IgM与固定在固体支持体上的抗人IgM抗体结合；(iii)加入由标记物和疟原虫抗原组成的标记抗原结合物，使标记抗原结合物与疟疾特异性IgM结合；(iv)用与疟疾特异性IgM的结合的标记抗原结合物的标记物进行分析。
优选地，在上述IgM捕捉免疫测定方法中，本发明可用疟原虫表面抗原作为步骤(iii)中标记了抗原结合物的抗原。优选的表面抗原包括部分或完整的疟原虫Vivax裂殖子表面蛋白，更优选的例子包括疟原虫Vivax裂殖子表面蛋白C-端。优选的疟原虫Vivax裂殖子表面蛋白C-端包括疟原虫Vivax裂殖子表面蛋白C-端部分或完整的PV200C多肽。并且，优选的PV200C多肽氨基酸序列包括SEQ.ID NO：1示出的氨基酸序列。
本发明更优选的疟疾IgM捕捉免疫测定方法检测血中疟疾特异性IgM包括(1)倾入血清或血浆样品在覆盖有源自山羊的抗人IgM抗体的多孔板的每个孔中；(2)洗涤该多孔板；(3)加入由HRP和重组表面抗原组成的标记抗原结合物，使该标记抗原结合物与与抗人IgM抗体结合的IgM结合；(4)洗涤该多孔板；(5)加入一种缓冲液和一种着色固定剂组成的底物溶液以显色；(6)用96孔板读出器测定吸光率。
本发明疟疾免疫测定方法的优选实施例是，提供了一种覆盖有源自山羊的抗人IgM抗体的固体支持物。本发明疟疾免疫测定方法的更优选实施例是提供如下述实施例3-3所记录的结合HRP的抗原蛋白的标记抗原结合物。抗原蛋白由酵母菌和大肠杆菌的转化体表达的，转化体由疟疾疟原虫的编码抗原蛋白的基因嵌入制成的表达载体制备，纯化而得。
当可能是疟疾患者的血样被倾入覆盖有源自山羊的抗人IgM抗体的固体支持物中时，血液中的人类IgM和固定在固体支持物上的抗人IgM抗体结合。将由HRP和疟疾疟原虫表面抗原组成的标记抗原结合物加入固体支持物之后，结合物开始和疟疾患者的IgM发生结合反应，患者的IgM来自结合在抗人IgM抗体上的IgMs，该抗人IgM抗体固定在固定固体支持物上。在底物溶液中，与疟疾患者的IgM抗体结合的HRP结合物分解着色固定剂，诱导显色。最后，本发明的疟疾免疫检测方法采用吸光度方法检测血液中的IgM的存在以及IgM的数量来诊断疟疾感染情况。
在本发明的上述免疫检测中，同时检测了疟疾患者和正常人的血浆。结果显示，上述方法有98％以上的敏感性，以及99％以上的特异性。优选是，四十岁或四十岁以上的正常人或曾被疟疾感染过的人以及怀疑有IgG疟疾抗体的人的血浆均被诊断为阴性。
本发明提供了一种疟疾诊断试剂，可用于测定血液中的疟疾特异性的IgM，包括疟原虫抗原。本发明提供了一种可测定血液中的疟疾特异性的IgM的疟疾诊断试剂，其组成为：覆盖有抗人IgM抗体固体支持体，由标记物和疟原虫抗原组成的标记的抗原结合物，以及含有着色固定剂的底物溶液。
优选地，本发明所述的上述诊断试剂可用疟原虫表面蛋白作为标记的抗原结合物的抗原。疟原虫表面蛋白优选包括疟原虫的部分或完整的疟原虫vivax裂殖子表面蛋白，优选包括疟原虫vivax裂殖子表面蛋白C端。在疟原虫vivax裂殖子表面蛋白C端优选包括在C为末端的疟原虫vivax裂殖子表面蛋白中有部分或完整的PV200C多肽。在PV200C多肽中，氨基酸顺序优选包括SEQ.ID NO：1所示的氨基酸顺序。
本发明所述的作为诊断试剂的抗人IgM抗体包括，但不仅仅限于如：从山羊中提取的抗人IgM抗体，优选是根据与抗原和抗体的亲合作用进行纯化的、对IgM的mu链具有特异性的抗人IgM抗体，并且不与人体IgG或其它免疫球蛋白进行交叉反应。
本发明所述的作为诊断试剂的被标记的抗原结合物的标记物包括，但不仅仅限于酶，如：辣根过氧化物酶(HRP)和碱性磷酸酯酶，胶体金，荧光物质，染色剂或其他类似物等。被标记的抗原结合物的标记物优选为辣根过氧化物酶(HRP)。
本发明所述的诊断试剂包括底物溶液，该底物溶液在与被标记的抗原结合物的标记物反应时，诱导显色。底物溶液的组成优选为缓冲溶液和着色固定剂，该着色固定剂当与被标记的抗原结合物反应时，诱导显色，着色固定剂优选包括N-四甲联苯胺及类似物。底物溶液中的着色固定剂如：N-四甲联苯胺由HRP分解，HRP是可引导显色的被标记的抗原结合物的较好标记物。由此，通过测定吸光率可检测IgM的存在及其数量。
本发明提供了一种表达载体，其组成为：疟原虫vivax裂殖子表面蛋白基因，酵母菌的α因子前导肽，以及组氨酸残基。本发明的表达载体中的裂殖子表面蛋白基因优选包含部分或完整的疟原虫vivax裂殖子表面蛋白基因。以疟原虫vivax裂殖子表面蛋白的C端PV200C多肽的基因中优选含有部分或完整的疟原虫vivax裂殖子表面蛋白基因，已知PV200C多肽的氨基酸序列与一些疟原虫的亚种相同。在本发明的表达载体中，PV200C多肽的氨基酸序列优选是SEQ.ID NO：1所示的序列。
本发明优选提供一种具有图1所示克隆图(或限制酶位点图)的表达载体pYLJ-MSP。同时，本发明还提供一种用上述表达载体转化的酵母菌转化体pYLJ-MSP/S.cerevisiae INVSC1(保藏号KCTC 0937BP)。pYLJ-MSP的组成包括与PV200C多肽的N-末端相连的酵母菌α因子前导肽，PV200C多肽，以及与PV200C多肽的C-末端相连的6个组氨酸残基。
为克隆PV200C多肽，本发明对疟疾阳性血液的RNA进行纯化，并用获得的RNA制备cDNA。之后，本发明用对PV200C具有特异性的一对引物和上述cDNA做模板，来进行聚合酶链反应(PCR)，从而获得放大的PV200C的DNA片段。
同时，使PV200C多肽在酵母菌中表达，使其分泌至细胞外，从而可以得到糖基化活性态的蛋白质，为了获得这种糖基化活性态的蛋白质，将酵母菌的α因子前导肽序列与PV200C多肽的N-末端相连。酵母菌的α因子前导肽序列的放大的DNA片段可使用含有酵母菌α因子前导肽序列的质粒根据聚合酶链反应(PCR)制得。
为了使酵母菌α因子前导肽的DNA片段和按上述方法制得的PV200C多肽连接起来，用2个PCR产物做模板重叠PCR。结果发现，这些基因由108个氨基酸编码组成，见SEQ.ID NO：1。本发明可制备pYLJ-MSP，它是在pYES-2载体(见图1)中插入基因片段的重组表达载体。同样，本发明也可获得一种转化体pYLJ-MSP/S.cerevisiae INVSC1，用转化带有重组表达载体pYLJ-MSP的酵母菌制成。转化体在1999年12月18日被保藏在韩国生物科学和生物技术研究所的典型培养物中心中(Korean Collection for Type Cultures of Korea Research Instituteof Bioscience and Biotechnology)(保藏号.KCTC 0937BP)。
本发明也可提供一种使用酵母菌转化体制备疟原虫裂殖子表面蛋白的方法。本发明也可提供一种疟疾诊断试剂，其组成是由该制备方法制成的表面蛋白。本发明优选提供一种使用酵母菌转化体制备疟原虫裂殖子表面蛋白的方法，该方法包括：(i)制备疟原虫裂殖子表面蛋白的表达载体；(ii)将表达载体转化为酵母菌，以得到酵母菌转化体；(iii)培养酵母菌转化体，得表面蛋白；(iv)分离纯化表面蛋白。在上述制备方法中，本发明在步骤iv中优选使用对组氨酸具有亲和作用的柱和凝胶过滤层析法。疟原虫裂殖子表面蛋白优选为活性态的PV200C多肽。上述转化体表达的PV200C多肽可由与PV200C的N-末端偶合的α因子前导肽分泌到细胞外。分泌后，α因子前导肽可用存在与细胞膜中的肽酶进行转移。由此可证明，只有表面蛋白可被分泌到培养介质中。
因为酵母菌转化体表达的表面蛋白被分泌到培养介质中，本发明利用表面蛋白的C-末端连接着6个组氨酸残基的特性，采用Probond柱对表面蛋白的吸收作用来分离表面蛋白。用凝胶过滤层析法进行纯化，可得到纯度为99％或更高纯度的裂殖子表面蛋白，(见图2)。分离纯化的裂殖子表面蛋白约为18KDa，对表面蛋白N-末端的氨基酸序列进行分析证明，表达表面蛋白是疟原虫的PV200C多肽。
同时使用蛋白质印迹法检测疟疾患者的血清，以测定用酵母菌转化体分离和纯化的表面蛋白的抗原性。结果显示，只有具有18KDa的MSPPV200C多肽被检测到(见图3)。由此证明，按本发明制备方法从酵母菌转化体分离纯化的蛋白质是具有高敏感性和高特异性的抗原。
本发明提供一种表达载体，该载体包括：疟原虫裂殖子表面蛋白基因，组氨酸标记物和T7启动子。在本发明表达载体中，裂殖子表面蛋白的基因可由部分或完整的疟原虫Vivax裂殖子表面蛋白基因组成。疟原虫vivax裂殖子表面蛋白的C-末端中PV200C多肽的基因优选为部分或完整的疟原虫Vivax裂殖子表面蛋白基因。在本发明的表达载体中，PV200C多肽的氨基酸序列优选为SEQ.ID NO：1中所示的氨基酸序列。本发明优选提供一种具有图4所示的卵裂图的表达载体pELK-MSP。本发明也提供用上述表达载体转化的大肠杆菌转化体pELK-MSP/BL21(保藏号：KCTC 0936BP)。本发明的优选实施例中，使用体积330bp的基因，该基因由疟疾患者血液通过聚合酶链反应(PCR)得到。很明显，对本领域的普通技术人员来说，采用现有技术手段改变表达载体的不定基因插入片段的被插入的基因的体积、碱基对序列等，是显而易见的。
为了用大肠杆菌制备大量的可产生PV200C多肽的表达载体，对pET-19b(见图4)的T7启动子下游中的PV200C基因进行克隆，制备pELK-MSP。由于有起始基因pET-19b中lacZ基因，当异丙基硫-B-D-半乳糖苷(IPTG)被加入后，IPTG成为表达引导体，引导lacZ的表达。由此可诱导T7启动子产生的PV200C表达。
另外，不出现假阳性信号的10个组氨酸残基可以在这样一种状态下被表达：当这些残基与由表达载体表达的PV200C多肽的N-末端融合时。由表达载体表达的PV200C多肽的特性是易于被组氨酸亲和树脂纯化。当重组蛋白质在大肠杆菌中的被表达时，可表明收率占总蛋白质的15-20％。
另外，本发明提供了pELKMSP转化的大肠杆菌，在pELK-MSP中引入大肠杆菌株BL21(DE3)lysS可制备大肠杆菌转化体。导入技术可以是已有技术，如热激法和电穿孔法等。除BL21(DE3)lysS外，在转化时也可使用其它大肠杆菌株。
1999年12月18日，E.Coli/BL21(DE3)lysS/pELK-MSP被韩国生物科学和生物技术研究所的典型培养物中心保藏(Korean Collectionfor Type Cultures of Korea Research Institute of Bioscience andBiotechnology)(保藏号：KCTC 0936BP)。
同样，本发明可提供一种用大肠杆菌转化体制备疟原虫裂殖子表面蛋白的方法。另外，本发明也提供一种疟疾诊断试剂，其组成是该制备方法制成的表面蛋白。
本发明优选提供一种使用大肠杆菌转化体制备疟原虫裂殖子表面蛋白的方法，该方法包括：(i)制备疟原虫裂殖子表面蛋白的表达载体；(ii)转化表达载体至大肠杆菌，以获得大肠杆菌转化体；(iii)切割该大肠杆菌转化体以获得表面蛋白；(iv)分离并纯化表面蛋白。在上述制备方法中，本发明在步骤iv中优选使用对组氨酸具有亲和作用的柱和凝胶过滤层析法。疟原虫裂殖子表面蛋白优选为活性态的PV200C多肽。由于10个组氨酸残基在它们与表达载体表达的PV200C多肽的N-末端连接时，才能获得表达，所以，首先用组氨酸亲和树脂纯化表达载体表达的PV200C多肽。被分离的蛋白质被浓缩后，再用凝胶过滤层析法进行纯化。结果表明，用上述方法可制成纯度为99％或更高的疟原虫抗原。
用上述纯化方法得到的PV200C蛋白质包括108个氨基酸，大小为15KDa，以及未切断的多肽(见图5)。用疟疾患者的血清检测了上述抗原的抗原性和敏感性。结果显示，使用蛋白质印迹法处理后，疟疾患者具有PV200C抗体，且敏感性很高，因此，可用上述抗原做为诊断试剂(见图6)。
本发明上述的内容具有如下优点。
本发明提供的疟疾的免疫检测和诊断试剂检测血液中疟疾特异性抗体，比现有技术中免疫检测和诊断试剂特异性抗原敏感性高，也可用来诊断疟疾携带者及疟疾患者，用于潜伏期长、血液中的疟原虫和抗原量少，复发的可能性高的韩国类型疟疾的诊断。
在做间接免疫测定时，使用抗人IgG抗体和/或抗人IgM抗体，以及做抗原夹层免疫测定时，使用标记的抗原结合物，结合物由标记和表面抗原组成，此为本发明的具体实施，可进行高敏感性的疟疾携带者诊断，因为这些方法可测定疟疾特异性抗体。另外，本发明间接免疫测定和抗原夹层免疫测定也可简化分析，因为血样和标记的抗原结合物可同时反应。
而且，本发明的疟疾诊断试剂的组成为：覆盖有疟原虫表面蛋白的固体支持体，由抗原和标记物组成的标记的抗原结合物，以及含有着色固定剂的底物溶液。可简单精确的检测血液中存在的疟疾特异性抗体及其数量。
使用本发明的疟原虫抗原测定血液中的疟疾特异性IgM展开的免疫测定方法，以及疟疾诊断试剂能区分疟疾患者和疟疾完全康复的正常人。因为它们只检测血液中的疟疾特异性IgM。另外，也可有效的检测老年人体内以及疟疾长期流行地区人群的疟疾。
本发明所述的免疫测定方法和诊断试剂可测定血液中的疟疾特异性的IgM可有效检测潜伏期长、血液中的疟原虫和抗原量少，复发的可能性高的韩国类型疟疾，因为它们可检测潜伏期的疟疾。另外，本发明所述的免疫测定方法和诊断试剂可测定血液中的疟疾特异性的IgM可用于疟疾患者的早期诊断。
与已有技术相比，使用本发明所述的制备方法，可比较容易、快速的制备高纯度的疟原虫的裂殖子表面蛋白，本发明使用重组DAN技术将酵母菌转化体制成活性态的疟原虫表达MSP。用本发明制备的纯化的表面蛋白对抗体的灵敏性高，特异性高，且纯度高。同时本发明制备方法纯化的表面蛋白可显著降低假阳性信号，可被用做诊断试剂和疟疾疫苗。
另外，与已有技术相比，使用本发明所述的制备方法，可比较容易、快速的制备高纯度的疟原虫的裂殖子表面蛋白，可通过用大肠杆菌的转化体大量制备疟原虫表达MSP。
用本发明所述方法制备的纯化的表面蛋白对抗体的灵敏性高，特异性高，纯度高。同样，本发明制备的纯化的表面蛋白可显著降低假阳性信号，可被用做疟疾诊断试剂。
本发明将用下列实施例进一步说明。本领域的技术人员十分清楚这些实施例仅是对本方面的更详细的描述，但本发明并不限于这些实施例。实施例1-1用疟疾阳性血液制备cDNA
用TRI试剂TM(Sigma Co.)纯化疟疾阳性血液中的RNA。下列纯化方法由Sigma Co.提供。
室温下，将0.1ml的TRI试剂TM和0.1ml的疟疾阳性血液静置5min，在混合物中加入20微升BCP，室温下将最终混合物静置5min，在12,000rpm和4℃的条件下离心15min，离心产物分3层。将含有RNAs的最上层部分转移至一个新试管中，然后往试管中加50微升异丙醇，室温下静置5min，再在12,000rpm和4℃的条件下离心结果混合物10min，去除上清液，用75％的乙醇洗涤小球，然后再用20微升去离子蒸馏水溶解，以用于制备cDNA。
将上述9微升纯化RNA和1微升N6随机引物(基因技术)混合，在65℃下，反应5min，然后转移至冰中冷却。
将4微升RT缓冲液，2微升0.1M DTT(DL-二硫苏糖醇)(Sigma，Cal No.D5545)，1微升10mM dNTP，1微升逆转录酶(Gibco Co)，1微升RNase抑制剂(Promega)以及微升去离子蒸馏水加入上述混合物中，在42℃反应1h，然后在70℃下反应10min，制备cDNA。实施例1-2制备含有编码PV200C基因的重组质粒
用实施例1-1中制备的cDNAs作为模板和一对下述引物SEQ.ID.NO：2和SEQ.ID.NO：4进行聚合酶链反应如下。
反应混合物含有5微升PCR缓冲液，5微升2.5mM dNTP，1微升敏感引物，1微升抗敏感引物，2微升cDNA模板以及35微升去离子蒸馏水，在94℃下反应30秒。然后在混合物中加入1微升Vent聚合酶(BioLab)，然后将反应按下列循环重复36次：变性94℃，30sec；引物退火55℃，30sec；伸展72℃，30sec。然后用上述增强的DNAs做模板，和一对引物SEQ.ID.NO：3和SEQ.ID.NO：4.进行聚合酶链反应。
Vent聚合酶(BioLab)PCR按上述的同样条件进行。通过在1％的琼脂糖凝胶中进行电泳可确认增强的DNAs，用限制酶剪切增强的DNAs(指Pv200-ct657)和pBluscript KS(+)(Stratagene)载体，使用T4 DNA连接酶(Promega)。将EcoR V和Pv200-ct657嵌入pBluscript KS(+)载体中。结果制得重组质粒(即pBC-Pv200ct657)。然后用pBC-Pv200ct657转化大肠杆菌株JM 109。实施例1-3表达载体pYLJ-MSP的制备
用实施例1-2中制得的pBC-Pv200-ct657做模板，和一对引物SEQ.ID.NO：5和SEQ.ID N0：6进行聚合酶链反应。PCR按上述的同样条件进行。在1％的琼脂糖凝胶中进行电泳确认增强的DNAs(即PV200-19)。
为获得与PV200C多肽N-末端相连的酵母菌α因子前导肽序列，使用IFN pYLBC(保藏号：KCTC 0051BP)进行PCR，IFN pYLBC的组成是作为模板的酵母菌α因子前导肽序列和一对引物SEQ.ID.NO：7 andSEQ.ID.NO：8。PCR按上述的同样条件进行。在1％的琼脂糖凝胶中进行电泳确认增强的DNAs(即酵母菌α-前导)。
为连接上述增强的PV200-19和酵母菌α因子前导肽，用上述两个PCR产物作为模板，和一对引物SEQ.ID.NO：6和SEQ.ID.NO：7进行重叠PCR。反应混合物含有5微升PCR缓冲液，5微升2.5mM dNTP，1微升敏感引物，1微升抗敏感引物，1微升Pv200-19的PCR产物，1微升酵母菌α因子前导肽的PCR产物，以及35微升去离子蒸馏水，在94℃下反应30秒。然后在混合物中加入1微升Vent聚合酶(BioLab)，然后将反应按下列循环重复36次：变性94℃，30sec；引物退火55℃，30sec；伸展72℃，30sec。在1％的琼脂糖凝胶中进行电泳确认增强的DNA s(即α-Pv200-19)。
分别用限制酶HindIII和Xho I剪切增强的α-Pv200-19和pYES-2载体。然后，通过T4连接酶连接α-Pv200-19和pYES-2载体，得到所要的重组表达载体pYLJ-MSP(见图1)。对pYLJ-MSP中的α-Pv200-19序列进行分析，结果表明，α-Pv200-19的组成基因的编码为108个如SEQ.ID.NO：1所示的氨基酸，使用Hinnen法(Proc.Natl.Acad.Sci.，U.S.A 75，1929-1933，1978)可用pYLJ-MSP转化酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)INVSC1，然后在不含有尿嘧啶的小量介质中过夜培养酵母菌转化体。该酵母菌转化体在1999年12月18日被保藏在韩国生物科学和生物技术研究所的典型培养物中心保藏(KoreanCollection for Type Cultures of Korea Research Institute ofBioscience and Biotechnology)(保藏号：KCTC 0937BP)。实施例1-4 MSP从酵母菌表达和纯化
为了从酵母菌制备MSP的表面蛋白，将转化体pYLJ-MSP/Scerevisiae INVSC1接种到含有2％葡糖的100ml的YEPD介质中，过夜培养。然后，将培养介质转移到分别含有1％葡糖和1％半乳糖的2L的YEP介质中。在30℃下培养72h，酵母菌转化体表达为PV200C多肽，耗尽了葡糖。在与PV200C多肽的N-末端连接的α因子前导肽的作用下，表达PV200C多肽被分泌到细胞外。而后，α因子前导肽被细胞膜中的肽酶移走。因此，只有PV200C多肽被分泌到培养介质中。
为获取被分泌到培养介质中的PV200C多肽，对培养2天的培养介质进行离心，除去生物量。然后只取培养介质的流动部分，在超滤液容器中浓缩(Amicon，U.S.A.)。为易于得到纯化的浓缩液，用Probond柱(Invitrogen)吸收与阳离子组氨酸相连的表面蛋白，阴离子镍用上述与增强的Pv200-19的C-末端相连的6个组氨酸残基偶合。
用含有10mM咪唑的磷酸盐缓冲液去除未被柱吸收的污染物，然后将被柱吸收的表面蛋白解除吸附，用500mM咪唑和磷酸盐缓冲液进行分离。如图2所示，此分离过程可得到90％或纯度更高的表面蛋白。然后，浓缩分离液，用Sephacryl S-200凝胶过滤层析法进行浓缩，可得到这些99％或纯度更高的表面蛋白。实施例1-5 由酵母菌纯化制成的疟原虫表面蛋白的抗原性测定
用12％的SDS-PAGE分析实施例1-4中得到的表面蛋白PV200C多肽。结果显示，可在18kDa位置检测到，由此证明，本发明的目标蛋白质是N-末端的氨基酸序列。
另外，还使用蛋白质印迹法处理疟疾患者的血清，以测定酵母菌纯化得到的疟原虫表面蛋白的抗原性。按Towbin等(Proc.Natl.Acad.Sci.，USA,76,4350-4354，1979)提供的方法进行蛋白质印迹试验。将电泳凝胶浸入缓冲溶液30min，缓冲溶液含25mM的Tris缓冲液，190mM的甘氨酸(pH8.3)和20％的甲醇。用同样的缓冲液进行电泳，可将蛋白质转移到硝化纤维膜中。然后，在室温条件下，用含有3％脱脂奶的磷酸盐缓冲溶液(PH7.4)孵育结合硝化纤维膜的蛋白质1h。将稀释至1/100的疟疾患者的血清加入膜内，室温下孵育1h。然后，用0.05％吐温20/磷酸盐缓冲溶液清洗5次，每次清洗的时间间隔5min，将可以偶合HRP的第二个抗体(Vector Labs)稀释至1/2000，加入到膜中，室温下孵育1h。孵育结束后，用上述溶液清洗硝化纤维膜，然后，将4-氯-萘酚和过氧化氢同时加入膜中，以诱导显色。结果显示，只有在18KDa位PV200C多肽被检测到。由此证明，本发明所述方法制成的表达和纯化的表面蛋白PV200C多肽是具有高特异性的抗原。(见图3)实施例2-1用疟疾阳性血液制备cDNA
用TRI试剂TM(Sigma Co.)纯化疟疾阳性血液中的RNA。下列纯化方法由Sigma Co.提供。室温下，将0.1ml的TRI试剂TM(Sigma Co.，Cat.No.T9424)和0.1ml的疟疾阳性血液的混合物静置5min，在混合物中加入20微升BCP，室温下将最终混合物静置5min，在12,000rpm和4℃的条件下离心15min，离心产物分3层。将含有RNAs的最上层部分转移至一个新试管中，然后往试管中加50微升异丙醇，室温下静置5min，在12,000rpm和4℃的条件下对结果混合物进行离心10min，去除上清液，用75％的乙醇洗涤小球，然后再用DEPC(焦碳酸二乙酯)处理的20微升去离子蒸馏水溶解，以用于制备cDNA。
将上述9微升上述纯化的RNA和1微升N6随机引物(Genotech)混合，在65℃下，反应5min，然后转移至冰中冷却。将4微升PCR缓冲液，2微升0.1M DTT(DL-二硫苏糖醇)(Sigma，Cal No.D5545)，1微升10mM dNTP，1微升逆转录酶(Gibco Co)，1微升RNase抑制剂(Promega)以及1微升去离子蒸馏水加入上述混合物中，在42℃反应1h，然后在70℃下反应10min，制备cDNA。实施例2-2制备含有PV200C编码基因的重组质粒
用实施例2-1中制备的cDNAs作为模板和一对序列为SEQ.ID.NO：9和SEQ.ID.NO：10引物，敏感性引物和抗敏感性引物进行聚合酶链反应。
反应混合物含有5微升PCR缓冲液，5微升2.5mM dNTP，1微升敏感引物，1微升抗敏感引物，2微升cDNA模板以及35微升去离子蒸馏水，在94℃下反应30秒。然后在混合物中加入1微升Vent聚合酶(BioLab)，然后将反应按下列循环重复36次：变性94℃，30 sec；引物退火55℃，30sec；伸展72℃，30sec。然后用上述增强的DNAs做模板，和一对引物，敏感性引物和抗敏感性引物SEQ.ID.NO：10和SEQ.ID.NO：11.进行聚合酶链反应。PCR按上述的同样条件进行。通过在1％的琼脂糖凝胶中进行电泳可确认增强的DNAs的体积约为657bp。
用限制酶剪切增强的DNAs(指Pv200-ct657)和pBluscript KS(+)(Stratagene)载体，使用T4 DNA连接酶(Promega)，将EcoR V和Pv200-ct657嵌入pBluscript KS(+)载体中。结果制得重组质粒(即pBC-Pv200ct657)。然后用pBC-Pv200ct657转化大肠杆菌株JM 109，以备储藏。实施例2-3表达载体pELK-MSP的制备
用实施例2-2中制得的pBC-Pv200-ct657做模板，和一对引物，敏感性引物和抗敏感性引物，SEQ.ID.NO：12和SEQ.ID NO：13进行聚合酶链反应。用1％的琼脂糖凝胶进行电泳，证明增强的DNA碎片的体积约为330bp。
用酚/氯仿的混合物纯化增强的DNA碎片，得到高纯度的DNA碎片。用NdeI和BamHI剪切DNA碎片、载体和pET-19b(Novagen)。然后，DNA碎片被嵌入到pET-19b，制成表达载体，pELK-MSP的体积约为6.0kb(见图4)。
用CaCl2进行处理，使pELK-MSPs和大肠杆菌株BL21(DE3)lysS发生转化。1999年12月18日，转化体被保藏在韩国生物科学和生物技术研究所的典型培养物中心(Korean Collection for Type Cultures ofKorea Research Institute of Bioscience and Biotechnology)(保藏号：KCTC 0936 BP)实施例2-4在大肠杆菌中PV200C多肽的大量制备和纯化
用含有50微克/ml氯霉素和100微克/ml的amphiciline的LB介质培养转化体pELK-MSP/株BL21(KCTC 0936BP)，时间为12h。然后，取50ml结果培养物，再接种到1L的LB介质中，在37℃下培养2h。当培养物的吸光率(OD600)变为0.3时，往介质中加IPTG(异丙基硫-P-D-半乳糖苷)，使最终浓度达到0.2mM。然后再对培养物培养7h。
培养过程结束后，离心，只分离出细胞。将得到的细胞悬浮在30ml磷酸盐缓冲液中(PBS)，用超声波仪(Branson，Sonifier 450)破裂悬浮液中大肠杆菌，用5000rpm的速度离心。因为部分表达MSP蛋白质溶在上清液中，剩余部分在颗粒内，将上清液和颗粒都悬浮在4M尿素缓冲液中，(PH7.5)，尿素缓冲液是将4M尿素溶解在PBS制得。然后离心，只收集上清液。
由于过度表达的表面蛋白在N-末端有10个组氨酸组成的His标记，因此，可用组氨酸亲和柱(Invitrogen)的吸收作用进行纯化。反复用清洗缓冲液去除柱不吸收的污染物，清洗液是将10mM咪唑和0.1M的NaCI溶解在PBS中制得。如图5所示，用15％的SDS PAGE证明，此过程可制得约90％或更高纯度的表面蛋白。
因此证明，浓缩分离溶液，并用Sephacryl S-200(Pharmacia Co.，瑞典)凝胶过滤层析法进行浓缩，从重组大肠杆菌可制成大约99％或更高纯度的PV200C多肽。实施例2-5由大肠杆菌纯化制成的疟原虫表面蛋白的抗原性的测定
使用蛋白质印迹法(Towbin等，Proc.Natl.Acad.Sci.76，4350-4354，1979)处理疟疾患者的血清，以测定实施例2-4中制成的MSP PV200C的抗原性。
将实施例2-4中制成的PV200C每孔5微克加到15％SDS-PAGE凝胶中，电泳。将电泳凝胶浸入转移缓冲溶液30min，缓冲溶液含25mM的Tris-HCI，190mM的甘氨酸(pH8.3)和20％的甲醇，蛋白质被转移到硝化纤维膜中(Hafer Transphor Power Lid，Pharmacia Co.)。然后，在室温条件下，用阻断缓冲液(3％脱脂奶/PBS，pH7.4)阻断结合蛋白质的硝化纤维膜，将疟疾患者的血清稀释至1/100，添加到膜中，室温条件下，孵育1h。
然后，用洗涤缓冲溶液(0.05％吐温20/PBS)清洗硝化纤维膜5次，每次清洗的时间间隔5min。将可以偶合HRP的第二个抗体(VectorLabs，U.S.A.)稀释至1/2000，加入到膜中，室温下孵育1h。孵育结束后，用清洗缓冲溶液洗涤硝化纤维膜，然后，将4-氯-萘酚和过氧化氢同时加入膜中，以诱导显色。
结果显示，只有在15KDa位置的表面蛋白PV200C多肽有污痕。由此证明，本发明所述方法制成的表达和纯化的表面蛋白PV200C多肽是具有高特异性的抗原。(见图6)实施例3-1用覆盖有疟原虫表面蛋白孔板制备
为提供疟疾诊断使用的固体支持，用0.1M碳酸盐缓冲溶液(pH9.5)稀释实施例1-4或2-4制备的疟原虫的重组表面抗原的溶液，稀释至0.5微克/ml，然后在96孔板的每个孔中加入100微升溶液。为吸附孔中的表面抗原，密封孔板，在4℃下放置18h。
在每个孔中加入含有5％普通山羊血清的磷酸盐缓冲溶液300微升，去除不能被孔吸附的表面抗原，然后在4℃下放置18h。当去除孔中的剩余溶液后，将孔板在室温下放置1h除水分。然后将孔板转移到一个含有除湿剂的密闭容器中，存放在4℃的冰箱中。
本发明的实施中，上述方法制备的覆盖有疟原虫表面蛋白孔板可被用作疟疾诊断试剂和疟疾免疫测定的固体支持体。实施例3-2用间接的酶免疫测定方法诊断疟疾
为使用间接酶免疫测定方法诊断疟疾，使用实施例3-1所述的在实施例1-4或2-4制得的覆盖有重组表面抗原制成的96孔板(Nunc)固体支持，以及由HRP和山羊的抗人IgM抗体或抗人IgG抗体组成的标记抗原结合物。
将100微升样品稀释溶液加入实施例3-1制得的覆盖有重组表面抗的96孔板(Nunc)的每个孔中，稀释溶液含有1.15mg/ml的NaOH，0.2mg/ml的KH2PO4，0.2mg/ml的KCl，8mg/ml的NaCl，300微升/ml牛血清，0.2mg/ml的硫汞撒等物质。然后再往孔中加10微升抗体阴性的血样品或10微升抗体阳性的血样品，充分混合反应混合物。37℃下，在反应器中孵育孔板60min。反应结束后，将孔板用300微升磷酸盐缓冲溶液清洗5次。缓冲溶液含0.05％的吐温20。稀释HRP结合的山羊抗人IgG抗体(Cappel)或抗人IgM抗体(Bethyl)至1/40,000，稀释溶液含有10mM Tris，0.5M NaCl，1mM CaCl2，0.5％甘油，0.2微升/ml牛血清，100微升/ml山羊血清，0.05％吐温20，0.2mg/ml硫汞撒和50微克/ml的酚红。在96孔板(Nunc)的每个孔中加入100微升稀释的结合物中，37℃下，孵育孔板60min。反应结束后，用0.05％的吐温20/磷酸盐缓冲溶液清洗孔板5次。在每个孔中加入加入100微升底物溶液，底物溶液中含100微克/ml N-四甲联苯胺，0.006％过氧化氢，以及柠檬酸磷酸盐缓冲溶液(pH4.5)。在暗处显色30min后，在每个孔中加100微升反应终止溶液(2N硫酸溶液)终止显色反应。用96孔板读出器(分子设备，USA).测定450nm(参考波长650nm)的吸光率。底物溶液中作为着色固定剂的N-四甲联苯胺在显色过程中被HRP结合的抗人IgG抗体或抗人IgM抗体分解。因此，通过测定吸光率可检测疟疾特异性抗体的存在及数量。
用上述方法，对20例疟疾阳性(疟疾患者血浆)和48例疟疾阴性(正常人血浆)进行测定。在阴性样本的平均值加0.5可决定阳性截断值的情况下，使用本发明所述的用疟原虫的重组表面抗原所做的间接酶免疫测定法进行测定，在20例疟疾患者中可判断18例呈现阳性，48例正常人中可判断46例呈现阴性。由此可看出，本发明所述的间接酶免疫测定法具有90％的敏感性和95.8％的特异性。实施例3-3与HRP结合的疟原虫表面抗原的制备
制备用作用抗原夹层酶免疫测定的标记的抗原结合物。
在4℃下，将实施例1-4或2-4中制成的疟原虫的重组表面抗原用1L的0.01M的碳酸钠缓冲溶液(PH9.6)渗析1天，在渗析过程中，更换缓冲溶液3次。
在试管中将5mg的HRP溶解在0.5ml的蒸馏水中，而后在HRP溶液中加100微升42mg/ml的NaIO4，用箔包扎试管，室温下振摇试管30min，发生氧化反应。HRP被充分氧化后，往反应溶液中加60微升1M甘油。然后，仍用用箔包扎试管，室温下振摇试管30min，至氧化反应终止。
为了让HRP和表面抗原发生结合反应，用0.01M碳酸钠缓冲溶液(PH9.6)饱和的PD10柱(Pharmacia)去除HRP反应溶液中的盐。将上述表面抗原溶液加入氧化的HRP反应溶液。用箔包扎试管，室温下振摇试管，制得HRPs和表面抗原的结合物。当HRP和表面抗原的共聚反应结束后，为稳定HRP表面抗原结合物，往试管中加40.8微升4mg/ml的NaIO4，仍用箔包扎试管，4℃下振摇2h进行反应。
为去除反应溶液中没有结合的HRPs，用Probond柱吸附结合HRPs的表面蛋白，通过用与表面蛋白的C-末端的连接的组氨酸残基，使用磷酸盐缓冲溶液进行平衡。没有结合的HRPs被磷酸盐缓冲溶液移走，Probond柱吸附的HRPs表面抗原结合物被含有1M咪唑的磷酸盐缓冲溶液洗脱。收集结合物，用购买的有效BSA蛋白质定量检测盒测定收集的HRP-表面抗原结合物中蛋白质的浓度。在终浓度为1％的样品中加入牛血清白蛋白(BSA)，储存在冰箱中。
上述过程制备的HRP-表面抗原结合物在抗原夹层酶免疫测定和疟疾诊断试剂中可被用作标记抗原结合物。实施例3-4在抗原夹层酶免疫测定中，使用HRP-表面抗原结合物诊断疟疾
使用实施例3-3中制备的HRP-表面抗原结合物进行疟疾的抗原夹层酶免疫测定。
将实施例3-1制得的覆盖有重组表面抗原的96孔板(Nunc)的每个孔都加入30微升HRP-表面抗原结合物溶液，然后往孔中加100微升疟疾阳性样品(疟疾患者血浆)或100微升疟疾阴性样品(正常人血浆)，充分混合结果混合物。37℃下，孵育孔板90min。反应终止后，用300微升含有吐温20的磷酸缓冲溶液清洗5次，在孔板的每个孔中加入100微升含有100微克/ml的N-四甲联苯胺，0.006％的过氧化氢，及柠檬酸磷酸盐缓冲溶液(pH4.5)的底物溶液。在暗处显色30min后，在每个孔中加100微升反应终止溶液(2N硫酸溶液)终止显色反应。用96孔板读出器(分子设备，USA)测定450nm(参考波长650nm)的吸光率。底物溶液中作为着色固定剂的N-四甲联苯胺被HRP结合的表面抗原分解而显色。因此，通过测定吸光率可检测疟疾特异性抗体的存在及抗体的数量。
用上述方法，对202例疟疾阳性(疟疾患者血浆)和400例疟疾阴性(正常人血浆)进行疟疾检测。在阴性样本的平均值加0.5可决定阳性截断值的情况下，使用本发明所述的用HRP表面抗原聚合物所展开的抗原夹层酶免疫测定法进行测定，在202例疟疾患者中可判断199例呈现阳性，400例正常人中可判断398例呈现阴性。由此可看出，本发明所述的抗原夹层酶免疫测定法具有98.5％的敏感性和99.6％的特异性。实施例4-1用IgM捕获酶免疫测定方法诊断疟疾
在IgM捕获酶免疫测定方法中，诊断疟疾时，需要使用覆盖有山羊的抗人IgM抗体的固体支持体、HRP和重组表面抗原组成的标记抗原结合物，其中，重组表面抗原是用大肠杆菌转化体纯化制得。
用下列方法制板：将山羊的抗人IgM抗体(亲和纯化的抗人IgM mu特异性链，Bethyl Co.，USA)用磷酸盐缓冲溶液(PH7.0)稀释至1-10微克/ml，然后将100-200微升混合物加入到聚苯乙烯板的每个孔中。室温下，将孔板放置约12-18h，吸除孔中的剩余溶液。在每个孔中加入250微升0.1％凝胶或0.1％酪蛋白的磷酸盐缓冲溶液。室温下，将孔板放置约2h。吸除孔中的剩余溶液，在冷室中干燥孔板18h，备用。
将100微升样品含有0.1％牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液的稀释溶液加到每个孔板中，孔板是用覆盖有山羊的抗人IgM抗体的孔板。然后将2-20微升抗体阴性血浆样品或2-20微升抗体阳性血浆样品加入孔中，充分混合结果混合物。37℃下，在反应器中孵育孔板60min，反应结束后，用300微升磷酸盐缓冲溶液冲洗5次，磷酸盐缓冲溶液含0.05％的吐温20。
实施例1-4或2-4中制备的酵母菌纯化的或大肠杆菌转化体纯化的疟原虫表面抗原可以按照实施例3-3中所述的方法与HRPs进行结合，备用。
上述方法制备的由HRPs和表面抗原组成的结合物可用磷酸盐缓冲溶液(PH7.0)稀释，稀释程度为1∶100至1∶1,000，磷酸盐缓冲溶液含有1％BSA和0.05％吐温20。然后将100微升HRP表面抗原结合物的溶液加到孔板的每个孔中。37℃下，孵育孔板30min。反应结束后，孔板用含有0.05％吐温20的磷酸缓冲溶液清洗5次，在孔板的每个孔中加入100微升含有100微克/ml的N-四甲联苯胺，0.006％的过氧化氢，及柠檬酸磷酸盐缓冲溶液pH4.5)的底物溶液。在暗处显色30min后，在每个孔中加100微升反应终止溶液(1N硫酸溶液)终止显色反应。用96孔板读出器(分子设备，USA)测定450nm(参考波长650nm)处的吸光率。底物溶液中作为着色固定剂的N-四甲联苯胺在显色过程中被标记抗原结合物的HRP的显色引导作用而分解。因此，通过测定吸光率可检测疟疾特异性抗体IgM的存在及其数量。
用上述方法，对216例疟疾阳性(疟疾患者血浆)和353例疟疾阴性(正常人血浆)进行疟疾检测。在阴性样本的平均值加0.5可决定阳性截断值的情况下，使用本发明所述的使用疟原虫重组表面抗原开展的IgM捕获酶免疫测定方法进行测定，在216例疟疾患者中可判断212例呈现阳性，353例正常人中可判断351例呈现阴性。由此可看出，本发明所述的IgM捕获酶免疫测定方法具有98.1％的敏感性和99.4％的特异性(见图7)。实施例4-2 IgM捕获酶免疫测定方法与间接酶免疫测定方法的比较
在IgM捕获酶免疫测定方法中，需使用覆盖有山羊的抗人IgM抗体的固体支持，由HRPs和重组表面抗原组成的标记抗原结合物，其中，重组表面抗原是用酵母菌或大肠杆菌转化体纯化制得。IgM捕获酶免疫测定的步骤按照实施例4-1所述进行。
同样，按照实施例3-2所述的步骤开展间接酶免疫测定方法。
为比较IgM捕获酶免疫测定方法和间接酶免疫测定方法，对75例疟疾阳性(疟疾患者血浆)和92例疟疾阴性(正常人血浆)进行疟疾检测。在阴性样本的平均值加0.05可决定阳性截断值的情况下，使用本发明所述的使用疟原虫重组表面抗原开展的IgM捕获酶免疫测定方法进行测定，在75例疟疾患者中可判断73例呈现阳性，92例正常人中可判断92例呈现阴性。由此可看出，本发明所述的IgM捕获酶免疫测定方法具有99.3％的敏感性和100％的特异性。
同时，在阴性样本的平均值加0.2可决定阳性截断值的情况下，使用本发明所述的间接酶免疫测定方法进行测定，则75例疟疾患者中可判断59例呈现阳性，92例正常人中可判断85例呈现阴性。由此可看出，本发明所述的间接酶免疫测定方法具有78.6％的敏感性和92.4％的特异性(见图8)。实施例4-3将正常人群按年龄分组，比较IgM捕获酶免疫测定方法和抗原夹层酶免疫测定方法
在IgM捕获酶免疫测定方法中，需使用覆盖有山羊的抗人IgM抗体的固体支持，由HRPs和重组表面抗原组成的标记抗原结合物，其中，重组表面抗原是用酵母菌或大肠杆菌转化体纯化制得。IgM捕获酶免疫测定的步骤按照实施例4-1所述进行。
同样，按照实施例3-4的步骤实施抗原夹层酶免疫测定方法。
为了比较IgM捕获酶免疫测定方法和抗原夹层酶免疫测定方法，对129名正常受试者的血浆样品进行诊断，129名受试者中，10多岁年龄段的有26人，20多岁年龄段的有43人，30多岁年龄段的有33人，40多岁年龄段的有27人。
当阴性样本的平均值加0.05可决定阳性截断值的情况下，使用本发明所述的使用疟原虫重组表面抗原开展的IgM捕获酶免疫测定方法进行测定，则129例正常受试者中可判断129例呈现阴性。由此可看出，本发明所述的IgM捕获酶免疫测定方法具有100％的特异性。
同时，在阴性样本的平均值加0.05可决定阳性截断值的情况下，使用本发明所述的抗原夹层酶免疫测定方法进行测定，则129例正常受试者中可判断127例呈现阴性。由此可看出，本发明所述的抗原夹层酶免疫测定方法具有98.4％的特异性。特别是对疟疾流行之后出生的30多岁或更年轻的受试者进行诊断时，本发明所述的抗原夹层酶免疫测定方法的特异性达到100％。但对疟疾流行期出生的40多岁的受试者进行诊断时，27名正常受试者中，有2名呈现阳性，则本发明所述的抗原夹层酶免疫测定方法的特异性为92.6％。因此，本发明所述的抗原夹层酶免疫测定方法的特异性随着特定的年龄人群而降低(见图9)。
                         序列表
                          序列表<110>株式会社LGCI<120>疟疾免疫检测和诊断试剂<130>P02KR07841<150>KR 10-2000-7648<151>2000-02-17<150>KR 10-2000-7649<151>2000-02-17<150>KR 10-2000-7650<151>2000-02-17<150>KR 10-2000-12172<151>2000-03-10<150>KR 10-2000-45806<151>2000-08-08<160>13<170>KopatentIn 1.71<210>1<211>108<212>PRT<213>疟原虫vivax裂殖子表面蛋白的羧端基多肽<220><221>缩胺酸<222>(1)..(108)<223>疟原虫vivax<400>1Asn Glu Ser Lys Glu I1e Leu Ser Gln Leu Leu Asn Val Gln Thr Gln1               5                   10                  15Leu Leu Thr Met Ser Ser Glu His Thr Cys Ile Asp Thr Asn val Pro
         20                  25                  30Asp Asn Ala Ala Cys Tyr Arg Tyr Leu Asp Gly Thr Glu Glu Trp Arg
     35                  40                  45Cys Leu Leu Thr Phe Lys Glu Glu Gly Gly Lys Cys Val Pro Ala Ser
 50                  55                  60Ash Val Thr Cys Lys AsP Asn Asn Gly Gly Cys Ala Pro Glu Ala Glu65                  70                   75                  80Cys Lys Met Thr Asp Ser Asn Lys Ile Val Cys Lys Cys Thr Lys Glu
             85                  90                  95Gly Ser Glu Pro Leu Phe Glu Gly Val Phe Cys Ser
        100                 105<210>2<211>31<212>DNA<213>人工序列<220><223>用于MSP蛋白特定PCR引物<400>2aaaaaagtcg acgccaaaaa ggccgagctg g                        31<210>3<211>31<212>DNA<213>人工序列<220><223>用于MSP蛋白特定PCR引物<400>3aaaaaagtcg acgagaaqta cctcccgttc c                        31<210>4<211>31<212>DNA<213>人工序列<220><223>用于MSP蛋白特定PCR引物<400>4aaaaaaatcg atttaaagct ccatgcacag g                        31<210>5<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>用于MSP蛋白特定PCR引物<400>5tctctagata agagaaacga gtccaaggaa                          30<210>6<211>45<212>DNA<213>人工序列<220><223>用于MSP蛋白特定PCR引物<400>6aaactcgagt cagtggtggt ggtggtggtg gctacagaaa actcc         45<210>7<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>用于MSP蛋白特定PCR引物<400>7aaaaagctta tgagatttcc ttca                                24<210>8<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>用于MSP蛋白特定PCR引物<400>8tctcttatct agagataccc                                     20<210>9<211>31<212>DNA<213>人工序列<220><223>PCR引物<400>9aaaaaagtcg acgccaaaaa ggccgagctg g                        31<210>10<211>31<212>DNA<213>人工序列<220><223>PCR引物<400>10aaaaaagtcg acgagaagta cctcccgttc c                        31<210>11<211>31<212>DNA<213>人工序列<220><223>PCR引物<400>11aaaaaaatcg atttaaagct ccatgcacag g                        31<210>12<211>34<212>DNA<213>人工序列<220><223>PCR引物<400>12ggtccatatg aacgagtcca aggaaatatt atcc                     34<210>13<211>40<212>DNA<213>人工序列<220><223>PCR引物<400>13ggacggatcc tcattagcta cagaaaactc cctcaaagag               40

Claims (60)

1.一种用疟原虫抗原检测血中疟疾特异性抗体的疟疾免疫检测方法。
2.根据权利要求1的疟疾免疫检测方法，其中所述被检测的疟疾特异性抗体是疟疾特异性IgM。
3.根据权利要求2的疟疾免疫检测方法，其中所述检测血中疟疾特异性IgM的免疫检测方法是IgM捕捉免疫检测方法。
4.根据权利要求3的疟疾免疫检测方法，其中所述IgM捕捉免疫检测方法是IgM捕捉酶免疫检测方法。
5.根据权利要求2的疟疾免疫检测方法，其中所述血中疟疾特异性IgM是用抗人IgM抗体检测的。
6.根据权利要求1的疟疾免疫检测方法，其中所述检测血中疟疾特异性抗体的免疫检测方法是酶免疫检测方法。
7.根据权利要求1或2的疟疾免疫检测方法，其中所述疟原虫抗原是疟原虫表面抗原。
8.根据权利要求7的疟疾免疫检测方法，其中所述疟原虫表面抗原是部分或完整的疟原虫vivax裂殖子表面蛋白。
9.根据权利要求8的疟疾免疫检测方法，其中所述部分或完整的疟原虫vivax裂殖子表面蛋白是疟原虫vivax裂殖子表面蛋白的C端。
10.根据权利要求9的疟疾免疫检测方法，其中所述疟原虫vivax裂殖子表面蛋白的C端是部分或完整的疟原虫Vivax裂殖子表面蛋白C-端的PV200C多肽。
11.根据权利要求10的疟疾免疫检测方法，其中PV200C多肽氨基酸序列是SEQ.ID NO：1所示的氨基酸序列。
12.根据权利要求1或2的疟疾免疫检测方法，其中所述疟原虫抗原是重组抗原。
13.检测血中疟疾特异性抗体的疟疾免疫检测方法，该方法包括：(a)将疟原虫表面抗原固定在一个固体支持体上；(b)倾入血清或血浆样品，使疟疾特异性抗体与固定在该固体支持体上的抗原结合；(c)加入由抗原和标记物组成的标记抗原结合物，将该标记抗原结合物与疟疾特异性抗体结合；(d)用结合到疟疾特异性抗体的标记抗原结合物的标记物进行分析。
14.根据权利要求13的疟疾免疫检测方法，该方法包括：(a′)表达来自转化体的虐原虫Vivax的裂殖子表面抗原Vivax并将其纯化；(a)将纯化的表面抗原固定在一个固体支持体上；(b)倾入血清或血浆样品，使疟疾特异性抗体与固定在该固体支持体上的表面抗原结合；(c)加入由抗原和标记物组成的标记抗原结合物，将该标记抗原结合物与疟疾特异性抗体结合；(d)用结合到疟疾特异性抗体的标记抗原结合物的标记物诱导显色；(e)用96孔板读出器测定吸光率。
15.根据权利要求13的疟疾免疫检测方法，其中所述疟疾免疫检测方法是间接免疫检测方法，且步骤(C)中所述标记抗原结合物的抗原是抗人IgG抗体和/或抗人IgM抗体。
16.根据权利要求13的疟疾免疫检测方法，其中所述疟疾免疫检测方法是抗原夹层免疫检测方法，其中步骤(C)中所述标记了抗原结合物的抗原是疟原虫表面抗原。
17.根据权利要求16的免疫检测方法，其中步骤(C)中标记了抗原结合物的抗原是部分或完整的疟原虫Vivax裂殖子表面蛋白。
18.一种检测血中疟疾特异性IgM的IgM捕捉免疫检测疟疾方法，该方法包括：(i)将抗人IgM抗体固定在一个固体支持体上；(ii)倾入血清或血浆样品使疟疾特异性IgM与固定在固体支持体上的抗人IgM抗体结合；(iii)加入由标记物和疟原虫抗原组成的标记抗原结合物，使标记抗原结合物与疟疾特异性IgM结合；(iv)用结合到疟疾特异性IgM的标记抗原结合物的标记物进行分析。
19.根据权利要求18的疟疾免疫检测方法，其中步骤(iii)所述标记抗原结合物的抗原是疟原虫表面抗原。
20.根据权利要求19的疟疾免疫检测方法，其中步骤(iii)所述标记抗原结合物的抗原是部分或完整的疟原虫Vivax裂殖子表面蛋白。
21.一种检测血中疟疾特异性抗体的疟疾诊断试剂，该试剂包括疟原虫抗原。
22.根据权利要求21的疟疾诊断试剂，其中所述被检测的疟疾特异性抗体是疟疾特异性IgM。
23.根据权利要求21或22的疟疾诊断试剂，其中所述疟原虫抗原是疟原虫表面抗原。
24.根据权利要求23的疟疾诊断试剂，其中所述疟原虫表面抗原是部分或完整的疟原虫Vivax裂殖子表面蛋白。
25.根据权利要求24的疟疾诊断试剂，其中所述部分或完整的疟原虫vivax裂殖子表面蛋白是疟原虫Vivax裂殖子表面蛋白的C端。
26.根据权利要求25的疟疾诊断试剂，其中所述疟原虫Vivax裂殖子表面蛋白的C端是疟原虫Vivax裂殖子表面蛋白C-端部分或完整的PV200C多肽。
27.根据权利要求26的疟疾诊断试剂，其中PV200C多肽氨基酸序列是SEQ.ID NO：1所示的氨基酸序列。
28.根据权利要求21或22的疟疾诊断试剂，其中所述疟原虫抗原是重组抗原。
29.一种检测血中疟疾特异性抗体的疟疾诊断试剂，该试剂包括：覆盖有疟原虫表面抗原的固体支持体；抗原和标记物组成的标记抗原结合物；及含有一种着色固定剂的底物溶液。
30.根据权利要求29的疟疾诊断试剂，其中所述疟原虫表面抗原是部分或完整的疟原虫Vivax裂殖子表面蛋白。
31.根据权利要求29的疟疾诊断试剂，其中所述标记抗原结合物的标记物是辣根过氧化酶，碱性磷酸酶，胶体金，荧光物质，染色剂等。
32.根据权利要求29的疟疾诊断试剂，其中该底物溶液由一种缓冲液和一种当与该标记抗原结合物的标记物反应时诱导显色的着色固定剂组成。
33.根据权利要求29的疟疾诊断试剂，其中所述标记抗原结合物的抗原是抗人IgG抗体和/或抗人IgM抗体。
34.根据权利要求29的疟疾诊断试剂，其中所述标记抗原结合物的抗原是疟原虫表面抗原。
35.根据权利要求34的疟疾诊断试剂，其中所述标记抗原结合物的抗原是部分或完整的疟原虫Vivax裂殖子表面蛋白。
36.一种检测血中疟疾特异性IgM的疟疾诊断试剂，该试剂包括：覆盖有抗人IgM抗体的固体支持体；由标记物和疟原虫抗原组成的标记抗原结合物；及含有一种着色固定剂的底物溶液。
37.根据权利要求36的疟疾诊断试剂，其中所述标记抗原结合物的抗原是疟原虫表面抗原。
38.根据权利要求37的疟疾诊断试剂，其中所述标记抗原结合物的抗原是部分或完整的疟原虫Vivax裂殖子表面蛋白。
39.根据权利要求36的疟疾诊断试剂，其中所述标记抗原结合物的标记物是辣根过氧化酶，碱性磷酸酶，胶体金，荧光物质，染色剂等。
40.根据权利要求36的疟疾诊断试剂，其中该底物溶液由一种缓冲液和一种当与该标记抗原结合物的标记物反应时诱导显色的着色固定剂组成。
41.一种表达载体，该载体由疟原虫Vivax裂殖子表面蛋白基因、酵母菌的α因子前导肽和组氨酸残基组成。
42.根据权利要求41的表达载体，其中裂殖子表面蛋白基因包括部分或完整的疟原虫Vivax裂殖子表面蛋白基因。
43.根据权利要求42的表达载体，其中裂殖子表面蛋白基因是裂殖子表面蛋白C-端PV200C多肽的基因。
44.根据权利要求43的表达载体，其中PV200C多肽氨基酸序列是SEQ.ID NO：1所示的氨基酸序列。
45.根据权利要求44的表达载体，其中所述表达载体是具有图1所示的克隆图谱的pYLJ-MSP。
46.用根据权利要求45的表达载体转化的酵母菌转化体pYLJ-MSP/S.cerevisiae INVSC1(保藏号KCTC 0937BP)。
47.用酵母菌转化体制备疟原虫裂殖子表面蛋白的方法。
48.根据权利要求47的方法，该方法包括(i)制备疟原虫裂殖子表面蛋白的表达载体；(ii)转化表达载体成为酵母菌，以获得酵母菌转化体；(iii)切割该酵母菌转化体以获得表面蛋白；(iv)分离并纯化该表面蛋白。
49.根据权利要求的48方法，其中步骤(iv)用具有对组氨酸有亲和作用的柱及凝胶过滤层析进行。
50.一种疟疾诊断试剂，该试剂包括根据权利要求的47制备方法生产的表面蛋白。
51.一种包括疟原虫Vivax裂殖子表面蛋白基因，组氨酸标记物和T7启动子的表达载体。
52.根据权利要求51的表达载体，其中裂殖子表面蛋白基因包括部分或完整的疟原虫Vivax裂殖子表面蛋白基因。
53.根据权利要求52的表达载体，其中裂殖子表面蛋白基因是裂殖子表面蛋白C-端PV200C多肽的基因。
54.根据权利要求53的表达载体，其中PV200C多肽氨基酸序列是SEQ.ID NO：1所示的氨基酸序列。
55.根据权利要求54的表达载体，其中表达载体是具有图4所示的克隆图谱的pELK-MSP。
56.用根据权利要求55的表达载体转化的大肠杆菌转化体pELK-MSP/BL21(保藏号KCTC 0936BP)。
57.用大肠杆菌转化体制备疟原虫裂殖子表面蛋白的方法。
58.根据权利要求57的方法，该方法包括(i)制备疟原虫裂殖子表面蛋白的表达载体；(ii)转化表达载体至大肠杆菌，以获得大肠杆菌转化体；(iii)切割该大肠杆菌转化体以获得表面蛋白；(iv)分离并纯化该表面蛋白。
59.根据权利要求58的方法，其中步骤(iv)用具有对组氨酸有亲和作用的柱及凝胶过滤层析进行。
60.一种疟疾诊断试剂，该方法包括根据权利要求的57制备方法生产的表面蛋白。
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