DE10161051B4

DE10161051B4 - Diagnose der Malaria

Info

Publication number: DE10161051B4
Application number: DE10161051A
Authority: DE
Inventors: Wolfgang Kreisel
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2001-12-12
Filing date: 2001-12-12
Publication date: 2005-09-15
Anticipated expiration: 2021-12-13
Also published as: WO2003050541A3; AU2002356652A8; WO2003050541A2; AU2002356652A1; DE10161051A1

Abstract

Verfahren zur Diagnose der Malaria, dadurch gekennzeichnet, dass Autoantikörper gegen Calreticulin bestimmt werden.

Description

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Diagnose von Malaria. Die Erfindung bezieht sich ferner auf die Verwendung einer nützlichen Substanz sowie auf einen Kit zur Diagnose der Malaria.

Eine Früherkennung der Malaria ist für den Erfolg einer therapeutischen Behandlung von entscheidender Bedeutung. Es gibt eine Reihe herkömmlicher Tests zur Diagnose der Malaria (s. z.B. G.L. Mandell et al., „Principles and practice of infectious diseases", 5. Ausgabe, 2000; B.J. Bain et al., Clin. Lab. Haematol. 19, 165–170 (1997); G.D. Heppner et al., Current Opinion in Infectious Diseases 11, 519–530 (1998); N.J. White, N. Engl. J. Med. 335, 800–806 (1996)). Hierzu gehören mikroskopische Untersuchungen nach Blutausstrich, insbesondere nach der Romanowsky-Anfärbung, das "Quantitative Buffy Coat"- (QBC-) Zentrifugations-Hematologiesystem, Fluoreszenz-Methoden auf de r. Basis Acridin-Orange- oder Benzothiocarboxypurin-Anfärbungen, Direktnachweise von Plasmodium-DNA mittels PCR ("Polymerase Chain Reaction") sowie die immunologische Bestimmung bestimmter Antigene des Malariaer regers Plasmodium, die teilweise gezielt auf einzelne Subspezies wie Plasmodium falciparum gerichtet sind.

Aufgrund der relativ aufwendigen und üblicherweise von geschultem Personal durchzuführenden diagnostischen Tests hat in den letzen Jahren der immunologische Nachweis bestimmter Antigensubstanzen des Malariaerregers Plasmodium zunehmend an Bedeutung gewonnen. In diesem Zusammenhang sind Schnelltests entwickelt und kommerziell angeboten worden, wobei die immunologischen Nachweise zum Beispiel auf die Antigensubstanz Histidin-reiches Protein 2 (HRP2) von Plasmodium falciparum, die Plasmodium-Aldolase, die bei allen vier Malariaerregern vorkommt, und/oder die Lactatdehydrogenase (LDH) von P. falciparum oder P. vivax gerichtet sind. Kommerziell erhältliche immunologische Schnelltests sind zum Beispiel RIDA^® MalaQuick Kombi (R-Biopharm, Darmstadt, Deutschland), Para-Sight F (Becton Dickinson), ICT Malaria Pf (ICT Diagnostics, Sidney, Australien) und OptiMAL (Flow Inc., Portland, Oregon, USA). Über aktuelle Arbeiten zur nicht-mikroskopischen Schnelldiagnose der Malaria berichten zum Beispiel T. Jelinek et al. in Lancet 354, 1609 (1999), P.L. Chiodini in Lancet, 351, 80–81 (1998), R. Leke et al. in J. Clin. Microbiol. 37, 2992–2996 (1999), C. Beadle et al. in Lancet 343, 1502–1503 (1994), T. Jelinek et al. in J. Travel Med. 7, 175–179 (2000), D. Wolday et al. Trop. Doct. 31, 19–21 (2001) und T. Jelinek et al. in J. Clin. Microbiol. 37, 721–723 (1999). Es wird über teilweise falsch-positive und falsch-negative Ergebnisse berichtet.

Aus der DE 693 28 489 T2 ist ein Verfahren zur Diagnose von Malaria bekannt, in dem Antikörper gegen eine spezielle Aminosäuresequenz eines Stressproteins (HSP 90) nachgewiesen werden.

C.T.Daniel-Ribeiro und G.Zanini diskutieren in Acta Tropica 2000, Vol. 76(3), S. 205–221, "Autoimmunity and malaria: what are they doing together?", die Rolle von Autoantikörpern im Zusammenhang mit einer Malariainfektion.

Es ist Aufgabe der Erfindung, die Möglichkeiten zur Diagnose der Malaria zu verbessern.

Die Aufgabe wird gelöst durch ein Verfahren gemäß Anspruch 1 zur Diagnose der Malaria. Das charakteristische Merkmal der Erfindung besteht darin, dass bei dem Verfahren Autoantikörper gegen das Protein Calreticulin bestimmt werden. Bevorzugte Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens sind in den Unteransprüchen des Anspruchs 1 angegeben. Weitere Gegenstände der Erfindung ergeben sich aus der Verwendung nach Anspruch 10 sowie aus dem Diagnose-Kit nach Anspruch 12.

Es wurde überraschend festgestellt, dass im Fall einer Malaria-Erkrankung bzw. einer Malaria-Infektion mit Plasmodien im Körper des betroffenen Individuums nachweisbare Mengen an im eigenen Körper erzeugten Autoantikörpern gegen Calreticulin vorliegen. Eine Bestimmung des Vorliegens und/oder einer Erhöhung von Autoantikörpern gegen Calreticulin stellt daher erfindungsgemäß einen ausgezeichneten Indikator für eine Malariaerkrankung bzw. eine Infektion durch Plasmodien dar. Mit dem erfindungsgemäßen diagnostischen Verfahren ist eine ausgezeichnete Sensitivität, die bis an 100% heranreicht, erreichbar. Ein weiterer signifikanter Vorteil des erfindungsgemäßen Diagnoseverfahrens besteht darin, dass das erfindungsgemäße Diagnosekonzept auf einer Untersuchung der körpereigenen Reaktion auf eine Malariaerkrankung bzw. einen Plasmodienbefal1 beruht, wohingegen die herkömmlichen immunologischen Tests auf Antigennachweise des Malariaerregers selbst abzielt.

Die Erfindung stellt somit ein neues Diagnosekonzept zur Verfügung, das eigenständig oder auch ergänzend zu beliebigen herkömmlichen Verfahren zur Diagnose der Malaria angewandt werden kann. Die diagnostischen Möglichkeiten und die Aussagekraft zur Diagnose der Malaria können daher durch das erfindungsgemäße Verfahren, allein oder in Kombination mit herkömmlichen Mitteln oder Verfahren zur Diagnose der Malaria, signifikant verbessert werden.

Das natürlich vorkommende Protein Calreticulin befindet sich normalerweise im Körper von Organismen im endoplasmatischen Reticulum zahlreicher Zellen (Skelettmuskelzelle, glatte Muskelzellen, Herzmuskel, Hepatozyten etc.), wie im Übersichtsartikel von M. Michalak et al. in Biochem. J. 285, 681–692 (1992) beschrieben. Es ist das wichtigste Calcium-bindende Protein dieser Zellorganellen. Darüber hinaus kommt das Calreticulin im Zellkern und in der Kernmembran vor. Neben der Calium-Bindung werden diesem Protein weitere Funktionen zugeschrieben: Bindung von Zink, Protein-Protein-Interaktionen nach Art der sogenannten Chaperonine, Beteiligung an der Eisenresorption im Dünndarm und Bindung an Steroidhormonrezeptoren. Das Vorliegen von Autoantikörpern gegen Calreticulin wurde bisher lediglich im Zusammenhang mit dem Auftreten von Autoimmunphänomenen, zum Beispiel Autoimmunenlebererkrankungen und chronisch entzündlichen Darmerkrankungen, sowie bei der Yersiniose gefunden, wie in der DE 195 34 348 A1 beschrieben, ohne dass jedoch ein Zusammenhang mit Malaria in Betracht gezogen wurde oder vermutet oder erwartet werden konnte.

Die Bestimmung des Autoanitkörpers gegen Calreticulin kann auf der Grundlage jeglicher immunologischer Bestimmungsverfahren ausgeführt werden, die auf die Bestimmung der speziellen Autoantikörper angepasst sind. Es sind immunologische Bestimmungsverfahren in homogener, flüssiger Phase oder solche unter Verwendung einer geeigneten festen Phase möglich. Die immunologische Bestimmung kann z.B. nach dem Prinzip des ELISA-Verfahrens und ähnlicher Verfahren, Western-Blot-Verfahren, dem Antigeneinfang-Ansatz ("Antigen Capture Assay") oder dem Sandwich-Assay durchgeführt werden. Die Bestimmung des Antikörpers gegen Calreticulin gemäß dem Western-Blot-Verfahren ist aufgrund der dadurch erzielbaren ausgezeichneten Sensitivität besonders geeignet, während der Antigeneinfang-Ansatz aufgrund der Schnelligkeit und einfachen Handhabung bevorzugt wird. Im Hinblick auf die Art der Detektion bei der immunologischen Bestimmung kommen generell z.B. Radioimmunoassays, Elektrolumineszenzassays, Fluoroimmunoassays (auf der Basis von Fluoresenz-, Chemolumineszenz- und/oder Phosphoreszenzmessungen) und Enzymimmunoassays in Frage.

Der Nachweis von gegebenenfalls vorhandenem Autoantikörper gegen Calreticulin kann in bekannter Weise in homogener Phase oder mit Hilfe einer festen Phase erfolgen.

Das Bestimmungsverfahren an fester Phase kann geeigneterweise durchgeführt werden, indem Calreticulin an eine feste Phase gebunden wird, das an die feste Phase gebundende Calreticulin mit einer zu untersuchenden Probe in Kontakt gebracht wird und anschließend ein Nachweis von gegebenenfalls vorhandendem Autoantikörper gegen Calreticulin durchführt wird. Eine solche Bestimmung an fester Phase wird nachfolgend näher erläutert.

Die Bindung von Calreticulin an die feste Phase kann auf übliche Weise erfolgen, zum Beispiel mittels Adsorption oder Blotten, wobei das Blotten üblicherweise eine elektrophoretische Übertragung an ein geeigntes Trägermaterial einschließt. Geeignete feste Phasen schließen geformte Träger auf der Basis geeigneter Kunststoffe wie Polystyrol, zum Beispiel in Form der weit verbreiteten Mikrotiterplatten, Polycarbonat oder dergleichen, Kunststoffkügelchen (Beads), Fasermaterialien wie Nitrozellulose, fluorierte Polymere oder alternative faserhaltige Materialien, wobei die faserhaltige Materialien zum Beispiel in Form von Blättern, Streifen oder Scheiben vorliegen, sowie Siliziumoxid-Träger beliebiger Form ein.

Das so gebundene Calreticulin kann dann mit der zu untersuchenden Probe in Kontakt gebracht und für eine gewünschte Zeit inkubiert werden, damit in der zu untersuchenden Probe gegebe nenfalls vorliegenden Autoantikörper gegen Calreticulin an das Calreticulin binden können. Als Ausgangsmaterialien der zu untersuchenden Probe kommen in erster Linie Blutproben wie Vollblut oder Blutserum in Frage. Andere Körperflüssigkeiten wie Urin und Ascites sind ebenfalls geeignete Ausgangsmaterialien für die Untersuchung. Die zu untersuchenden Körperflüssigkeiten werden in der Regel vor dem in Kontakt bringen mit dem Calreticulin auf eine geeignete Verdünnung gebracht.

Nach einer gewünschten Inkubationszeit werden die gegebenenfalls vorhandenen Autoantikörper gegen Calreticulin nachgewiesen, wobei der Nachweis auf der Basis der bereits beschriebenen, immunologischen Analysemethoden erfolgen kann. Zum Nachweis der gegebenenfalls gebildeten Komplexe aus Calreticulin und Autoantikörper wird geeigneterweise ein Sekundärantikörper eingesetzt, der an den Autoantikörper binden kann. Hierzu eignen sich gegen Immungluboline (Ig) gerichtete Sekundärantikörper. Diese Anti-Ig-Antikörper können polyvalent, das heißt im Hinblick auf Ig-Unterklassen unspezifisch sein. Alternativ kann die Bestimmung von Autoantikörpern gegen Calreticulin selektiv durchgeführt wird mit Hilfe von wenigstens einem Igspezifischen Sekundärantikörper. Vorzugsweise wird eine Kombination von drei selektiven IgA-, IgG- und IgM-spezifischen Autoantikörper-Bestimmungen durchgeführt, wonach untersucht wird, ob wenigstens einer dieser spezifischen, auf Ig-Unterklassen gerichteten Autoantikörper das Vorliegen von Calreticulin-Autoantikörpern anzeigt. Die erfindungsgemäße Malariadiagnose zeichnet sich durch eine besonders hohe Sensitivität aus, die der herkömmlichen Antigen-Diagnostik überlegen ist.

Der einsetzbare Anti-Immunglobulin(Ig)-Antikörper (Sekundärantikörper) kann erfindungsgemäß allgemein ein vollständiger Antikörper oder ein Derivat oder ein Fragment, z.B. ein F(ab')₂-Fragment oder eine beliebige andere Modifikation eines gegen Autoantikörper reaktiven Antikörpers sein. Zum Zweck der Detektion weist der Sekundärantikörper eine geeignete Markierung auf, die je nach gewünschtem Detektionssystem bzw. je nach gewünschter Analysmethode frei wählbar ist. Geeignete Markierungsmittel sind zum Beispiel Enzyme, die eine Nachweisreaktion katalysieren, Chromophore, Fluorophore, detektierbare Partikel, Radionuklide etc.

Obgleich vorstehend einige Ausführungsformen für die Bestimmung von Autoantikörpern gegen Calreticulin beschrieben wurden, ist die Erfindung keinesfalls darauf beschränkt. Vielmehr können jegliche Mittel und Verfahren, die grundsätzlich zur Bestimmung von Antikörpern geeignet sind, angewandt werden.

Das Calreticulin, welches zur Konjugation von gegebenenfalls vorliegenden Autoantikörper gegen Calreticulin für das erfindungsgemäße Bestimmungsverfahren dient, kann in unterschiedlichen Arten eingesetzt werden. Es schließt Calreticulin natürlichen Ursprungs, rekombinantes oder gentechnologisch erzeugtes und gegebenenfalls gentechnologisch modififziertes Calreticulin sowie chemisch und/oder biochemisch modifiziertes oder synthetisiertes Calreticulin ein. Vorzugsweise wird ein natives, humanes Calreticulin verwendet, um eine sehr hohe Sensitivität und Spezifität der Diagnose zu erzielen. Das native, humane Calreticulin kann aus geeigneten menschlichen Gewebe, zum Beispiel der menschlichen Leber, isoliert werden. Das gentechnologisch hergestellte Calreticulin kann in geeigneten prokariotischen Expressionssystemen, z.B. in E. coli, oder, was zum Erhalt einer Glykoproteinstruktur günstiger ist, in eukariotischen Expressionssystemen wie in Hefe oder Insekten exprimiert werden. Das wahlweise chemisch und/oder biochemisch modifizierte oder synthetisierte Calreticulin liegt in einer Form vor, dass eine Konjugation mit den Autoantikörpern stattfinden kann. Zum Beispiel wird ein Polypetid-Bruchstück des nativen Calreticulins bereitgestellt, welches wenigstens eine zur Konjugation mit dem Autoantikörper definierte epitope Struktur aufweist.

Aufgrund des überraschenden Auffindens von Autoantikörpern gegen Calreticulin als körpereigenem Marker für das Vorliegen einer Malariaerkrankung oder Plasmodieninfektion stellt die Erfindung in einem weiteren Gegenstand die Verwendung von Calreticulin zur Diagnose der Malaria zur Verfügung. Calreticulin dient dabei als die Substanz, die die körpereigenen Autoantikörper feststellbar bzw. identifizierbar macht. Das verwendbare Calreticulin schließt normalerweise die oben beschriebenen unterschiedlichen Formen ein, wie natives, insbesondere humanes Calreticulin, rekombinantes Calreticulin sowie chemisch und/oder biochemisch modifiziertes oder synthetisiertes Calreticulin.

Als weitere nützliche Anwendung bezieht sich die Erfindung ferner auf die Verwendung von Anti-Immunglubolin (Ig)-Antikörpern zur Diagnose der Malaria. Wie oben beschrieben sind diese speziellen Antikörper bei der Diagnose der Malaria nützlich einsetzbar als Mittel zum Nachweis der Autoantikörper gegen Calreticulin. Für Detektionszwecke ist der gegen Immunglobuline gerichtete Antikörper üblicherweise wie oben beschrieben markiert, zum Beispiel mit Detektionsenzymen, Chromophoren, Fluorophoren, Radionukliden und/oder Markierungspartikeln.

Das erfindungsgemäße diagnostische Verfahren ist in allen denkbaren Ausführungsformen von besonders großem Nutzen, wenn es mit einem herkömmlichen diagnostischen Verfahren zur Diagnose der Malaria kombiniert wird. Die Kombination kann so erfolgen, dass das herkömmliche diagnostische Verfahren ergänzend in einem parallelen oder in einem getrennten Schritt durchgeführt wird. Bei einer solchen Kombination eignet sich die erfindungsgemäße Bestimmung von Autoantikörpern gegen Calreticulin insbesondere als Ausschlußkriterium, das heißt zur Stütze des diagnostischen Befundes, dass keine Malariaerkrankung vorliegt. So erlaubt es die Erfindung, dass relativ frühzeitig eine vorläufige Entwarnung gegeben werden, bevor eine endgültigen Abklärung durch andere diagnostische Verfahren, insbesondere durch die mikroskopische Diagnose, erfolgt. Eine Kombination ist wahlweise mit jeglichen herkömmlichen diagnostischen Verfahren möglich, z.B. mit einem immunologischen Direktnachweis von Plasmodien-Antigenen wie dem Histidin-reichen Protein (HRP-2), der Aldolase und/oder der Lactatdehydrogenase (LDH). Es wird ausdrücklich Bezug genommen auf den eingangs zitierten Stand der Technik der herkömmlichen diagnostischen Verfahren zur Diagnose der Malaria.

Als weiteren nützlichen Gegenstand stellt die vorliegende Erfindung einen Diagnose-Kit zur Verfügung, welcher zur Bestimmung von Autoantikörpern gegen Calreticulin zur Diagnose der Malaria besonders gut geeignet ist. Ein solcher bevorzugt ausgestalteter Diagnosekit enthält mindestens folgende Bestandteile:

a) eine feste Phase, an die Calreticulin oder eine modifizierte Calreticulin-Art oder ein Calreticulin-Bruchstück gebunden ist,
b) wenigstens ein Anti-Immunglobulin (Ig)-Antikörper, und gegebenenfalls
c) weitere Hilfsreagenzien und Hilfsmittel, wobei zusätzlich Kit-Bestandteile enthalten sind, die zur Bestimmung von Plasmodien-Antigenen geeignet sind.

Die feste Phase ist ein geeigneter Träger, an dem das oben beschriebene native oder rekombinante Calreticulin oder die chemisch und/oder biochemisch modifizierte Form, die eine Reaktivität gegenüber dem zu bestimmenden Autoantikörper auf weist, gebunden ist. Der Träger kann zum Beispiel als Kügelchen (Beads) oder als Teststreifen, als Testscheibe oder als Schicht einer geeigneten Kunststoffaser, wie oben beschrieben, ausgestaltet sein. Das Calreticulin ist an dem Träger wahlweise adsorptiv oder, gegebenenfalls über einen chemischen Abstandshalter (Linker), kovalent gebunden. Bezüglich des Bestandteils des Anti-Ig-Antikörpers als Mittel des Identifizierens und Nachweisens von gegebenenfalls vorhandenem Autoantikörper gegen Calreticulin wird ebenfalls auf die obige Beschreibung verwiesen. Zum Zweck der Detektion ist der Anti-Ig-Antikörper wie oben erwähnt auf geeignete Weise markiert bzw. durch geeignete Detektionssysteme nachweisbar. Die gegebenenfalls zusätzlich vorliegenden Hilfsreagenzien bzw. -mittel können je nach zweckmäßiger Ausgestaltung des Diagnose-Kits ausgewählt werden, wie z.B. Puffer, Blockierlösungen zum Verhindern unspezifischer Bindung, Detektionsreagentien je nach Art der Detektion, Mikropipetten, Reagenzgefäße und dergleichen.

Um die Kombination mit einer herkömmlichen Diagnose der Malaria zu ermöglichen enthält der Diagnose-Kit zusätzlich die für die herkömmlichen Malariatests üblichen Mittel bzw. Testbestandteile. In einer bevorzugten Ausführungsform sind Kit-Bestandteile der Erfindung mit einem herkömmlichen Antigentest auf Plasmodien-Antigene wie HRP2, Aldolase und/oder Lactatdehydrogenase kombiniert. Die hierfür geeigneten, zusätzlichen Kit-Bestandteile ergeben sich aus dem jeweiligen Antigentest des Stands der Technik.

Die Erfindung wird nachfolgend anhand von erläuternden, jedoch nicht einschränkenden Beispielen näher beschrieben.

Beispiel 1
Bereitstellung von nativem, humanen Calreticulin für die Malariadiagnose
Es wurden 100g Humanleber mit einer Schere kleingeschnitten und in einem Gefäß 400 ml Puffer (0,1 M KH₂PO₄, 2,66 M (NH₄)SO₄, 1,0 mM EDTA, mit NaOH auf pH 7,1 eingestellt), 300 μl einer Lösung von 2 mg Leupeptin/ml H₂O, 133,3 einer μl Lösung aus 10 mg Aprotinin/ml H₂O, 250 μl einer Lösung von 0,2 M Phenylmethansulfonylfluorid (PMFF; entsprechend einer Lösung von 3,484 g in 100 Äthanol), 100 μl einer 2 M Benzamidinchlorid-Lösung (entsprechend 31,324 g in 1000 ml Äthanol) sowie 100 μl Mercaptonäthanol zugegeben. Das Gewebe wurde in großen Metallbechern unter Eiswasserkühlung mit einem Omni-Mixer (Fa. Sorvall) auf Stellung 10 bei 30 Sekunden homogenisiert, eine Minute gekühlt, dann weitere 30 Sekunden homogenisiert und schließlich wiederum eine Minute gekühlt. Dann wurde für 30 Minuten bei 900 U/min in einem GSA-Rotor zentrifugiert.
Ein Überstand I von 360 ml wurde kühlgestellt. Das Sediment wurde mit der halben Menge des oben angegebenen Puffers, einschließlich der angegebenen Zusätze, versehen. Dann wurde, wie geschildert, erneut homogenisiert und zentrifugiert, wonach wiederum ein Überstand II von 180 ml erhalten wurde. Die beiden Überstände I und II wurden zu 540 ml vereinigt.
Zu diesen 540 ml wurden 1,35 ml der 0,2 N PMSF-Lösung, 0,135 ml der 2 M Benzamidinchlorid-Lösung, 0,1 ml Mercaptoäthanol sowie 108,1 g (NH₄)₂SO₄ in fester Form (entspricht 200g Ammoniumsulfat pro 1 l Überstand) zugegeben. Das Ammoniumsulfat wurde unter ständigem Rühren zugegeben, während der Becher in Eiswasser stand. Nachdem für 30 Minuten langsam gerührt wurde, wurde die Lösung mit Ortho-Phosphorsäure (98%) auf einen pH-Wert von 4,7 gebracht. Die Mischung wurde über Nacht eisgekühlt rühren gelassen. Dann wurde für 30 Minuten bei 9000 U/min abzentrifugiert (GSA-Rotor). Jedes der Sedimente wurde in 20 ml Puffer aus 01, M KH₂PO₄ und 1, 0 mM EDTA (pH 7,1) re suspendiert. Die Suspension wurde über Nacht bei zweimaligem Auswechseln des Dialysemediums gegen einen Puffer 50 mM NaCl, 0,1 M KH₂PO₄ und 1 mM EDTA (pH 7,1) dialysiert. Das dialysierte Material wird für 10 Minuten bei 3000 U/min in einem SS 34-Rotor zentrifugiert.
Der Überstand nach Zentrifugieren wurde auf eine DEAE-Säule aufgetragen, die mit dem Puffer 50 mM NaCl, 0,1 M KH₂PO₄, 1 mM EDTR, (pH 7,1) äquilibriert war. Die Elution aus der DEAE-Säule erfolgte durch einen NaCl-Gradienten von 50 mM NaCl bis 1000 mM NaCl im gleichen Puffer bei einer Temperatur von 4°C, wobei 80 Tropfen pro Röhrchen aufgefangen wurden. Calreticulin eluierte bei einer Konzentration von 300 mM NaCl. Das Calreticulin konnte zusätzlich durch SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese über das Molekulargewicht des nativen humanen Calreticulins von 60 kDa identifiziert werden. Eine zusätzliche Identifizierung konnte durch Western-Blot-Verfahren mit Anti-Calreticulin-Antikörper durchgeführt werden. Die Calreticulin-haltigen Fraktionen wurden vereinigt und gegen Hepes-Puffer (50 mM Hepes pH 6,9) dialysiert.
Anschließend erfolgte eine weitere Reinigung mittels FPLC-Verfahren mit anschließender Säulen-Chromatographie mittels Mono Q 16/10 Superose HR. Dazu wurden zunächst die Proben der DEAE-Säulenchromatographie auf die Mono Q 16/10 Säule aufgetragen, und die Säule wurde mit 10 mM Tris (pH 7,2) gespült. Die Elution erfolgte in einem NaCl-Gradienten, der aus 10 mM Tris (pH 7,2) und einem Puffer aus 10 mM Tris (pH 7,2) und 1 M NaCl gemischt wurde. Das Vorliegen von Calreticulin konnte wiederum durch SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese überprüft werden. Die entsprechenden Calreticulin-Fraktionen wurden vereinigt und gegen PBS dialysiert.
Anschließend erfolgte eine abschließende Reinigung über der Superose HR-Säule mit einem Laufpuffer aus 0,05 M Na-Phosphat (pH 7,2) und 0,15 M NaCl. Dabei erfolgte eine Trennung des Calreticulins von gegebenenfalls restlichen Proteinen entsprechend des Molekulargewichts. Es wurden Fraktionen reines Calreticulin erhalten, die vereinigt und im Volumen eingeengt wurden.
Beispiele 2 bis 5
Diagnose der Malariaerkrankung
Nachfolgend wird eine Bestimmung von Autoantikörpern gegen Calreticulin zur Diagnose der Malaria aus Blutserum beschrieben. Die ansonsten identisch durchgeführten Schritte unterschieden sich in den Beispielen 2 bis 5 darin, dass entweder polyvalenter (Beispiel 2), IgA-spezifischer (Beispiel 3), IgG-spezifischer (Beispiel 4) oder IgM-spezifischer (Beispiel 5) Sekundärantikörper gegen Human-Antikörper zum Binden an den gegebenenfalls vorhandenen Calreticulin-Autoantikörper verwendet wurde. Der verwendete Sekundärantikörper war mit Peroxidase gekoppelt, um eine Enzym vermittelte Nachweisreaktion hervorzurufen. Als Detektionssystem auf Basis des Peroxidasenachweises wurde ein kommerzieller Detektionskit verwendet.
Parallel wurden an denselben Serumproben kommerziell erhältliche Antigen-Bestimmungsverfahren zur Diagnose der Malaria durchgeführt (MalaQuick^R-Schnelltest)
Die Durchführung des Verfahrens zur Diagnose der Malaria erfolgte im Einzelnen wie folgt.
Nach dem Western-Blot-Prinzip wurde gereinigtes Calreticulin (CRT; 1 μg pro Spur) elektrophoretisch von einem SDS-Gel auf eine Nitrozellulose-Membran transferiert (Protan /Nitrocellulose BA 850, 45 μm, Schleicher Schüll). Danachwurde die Membran in schmale Streifen geschnitten. Die Position der CRT-Bande wurde mittels Farbreagensanfärbung an einem Membranstreifen identifiziert.
Danach wurde die Membran zunächst 15 min in PBS/Tween (PBS mit 0.05% (v/v) Tween 20) und dann zur Blockierung 2 h in PBS/Tween mit 5% (w/v) Rinder-Serumalbumin inkubiert. Anschließend wurde die Membran mehrmals gewaschen. Serum einer Reihe von Patienten wurde in einer unten angegebenen Verdünnung (verdünnt mit PBS/Tween) von 1:100 bis 1:1000 zugegeben. Danach wurde bei 4°C über Nacht unter ständiger Bewegung inkubiert. Nach mehrfachem Waschen in PBS/Tween wurde ein wie unten angegebener, mit Peroxidase gekoppelter Sekundär-Antikörper bei einer Verdünnung von 1:5000 (in PBS/Tween) zugegeben. Nach 1 Stunde wurden die Membranstreifen mehrfach gewaschen. Gebundener Sekundär-Antikörper wurde mit dem Western-Blot Detektions-Reagens RPN 2106 („ECL Western blotting detection reagents" von Amersham, Braunschweig, Deutschland) auf Kodak BioMax MR Film nachgewiesen.
Die Tests wurden mit Serumverdünnungen von 1:100, 1:250, 1:500 oder 1:1000 durchgeführt. Routinemäßig wurde die Verdünnung von 1:100 verwendet. Als Kontrollen dienten: Das Serum einer gesunden Kontrollperson als negative Kontrolle; das Serum eines Patienten mit systemischem Lupus erythematodes (Verdünnung 1:100), alternativ Anti-CRT IgG vom Kaninchen (Verdünnung 1:1000) als positive Kontrolle.
Folgende Sekundär-Antikörper wurden verwendet:

1. Meerrettichperoxidase gekoppelter Esel/Antikaninchen-Gesamt-IgG (Horseradish peroxidase linked donkey anti-rabbit IgG, whole antibody, Amersham, UK). Dieser Sekundär-Antikörper wurde eingesetzt, wenn als positive Kontrolle ein Kaninchen Anti-CRT-Antikörper verwendet wurde.
2. Meerrettichperoxidase gekoppelter Ziege/Anti-IgA+IgG+IgM-human-F(ab')₂-Antikörper (Peroxidase-conjugated AffiniPure F(ab')₂ fragment goat anti-human IgA + IgG + IgM (H + L)). Mit diesem polyvalenten Sekundär-Antikörper wurden menschliche Antikörper gegen CRT (Anti-CRT poly) nachgewiesen. Dieser Test erfaßte Antikörper vom Typ IgG, IgA und IgM (Beispiel 2).
3. Meerrettichperoxidase gekoppelter Ziege/Anti-IgA-human-F(ab')₂-Antikörper (Peroxidase-conjugated AffiniPure F(ab')₂ fragment goat anti-human serum IgA, α-chain specific). Hiermit wurden Anti-CRT-Antikörper vom Typ IgA erfaßt (Beispiel 3).
4. Meerrettichperoxidase gekoppelter Ziege/Anti-IgG-human-F(ab')₂-Antikörper (Peroxidase-conjugated AffiniPure F(ab')₂ fragment goat anti-human IgG, Fc fragment specific). Dieser Ansatz erfaßt Anti-CRT-Antikörper vom Typ IgG (Beispiel 4).
5. Meerrettichperoxidase gekoppelter Ziege/Anti-IgM-human-F(ab')₂-Antikörper (Peroxidase-conjugated AffiniPure F(ab')₂ fragment goat anti-human IgM, Fc5u fragment specific). Mit dieser Variante wurden Anti-CRT-Antikörper vom Typ IgM nachgewiesen (Beispiel 5).

Die unter 2.–5. genannten Antikörper stammten von Jackson Immuno Research Laboratories Inc. (erhältlich über Dianova, Hamburg, Deutschland).
Die Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle gezeigt. Zum Vergleich sind bezüglich derselben Proben die Ergebnisse der Antigen-Bestimmungen gegenüber dem Histidin-reichen Protein von Plasmodium falciparum (HRP-2) und gegenüber der Aldolase, die bei allen Plasmodien vorkommt, sowie die über mikroskopische Methoden gesicherte Malariadiagnose angegeben.
Bei der Auswertung der Antigen-Bestimmungen wurden auch die Ergebnisse als positiv bewertet, die in der Tabelle als schwach positiv „(pos)" angegeben sind. Für den Anti-CRT-Test wurden nur die deutlich positiven Ergebnisse „pospos" gewertet; die „(pos)"-Ergebnisse wurden sicherheitshalber als negativ bewertet. Die Angabe „0" bedeutet „nicht bestimmt".
Beim Einsatz von polyvalentem Anti-CRT-Antikörper (Beispiel 2) ergaben sich Positivnachweise bei 25/26 Seren = 96,2% von an Malaria Erkrankten.
Eine besonders hohe Sensitivität ergab sich ferner, wenn beurteilt wurde, ob mindestens eine der Immunglobulin-Klassen spezifischen Reaktionen positiv war (Beispiele 3 bis 5). Dann waren 29/30 = 96,7% positiv.
Demgegenüber waren nur 11/28 positiv für das HRP-2 = 39,3%. 20/28 = 71,4% der Seren waren positiv für die Aldolase. Besonders auffallend ist die Situation bei Patienten mit Malaria tropica, bei denen der Schnelltest auf HRP-2 negativ ausgefallen war. Alle diese waren in mindestens einer der erfindungsgemäßen Anti-CRT-Reaktionen positiv.
Wird die Antigen-Diagnostik aus dem Serum mit ihrer relativ geringen Sensitivität mit dem Anti-CRT-Test kombiniert, erhält man als Ergebnis eine Sensitivität von praktisch 100%.

Claims

Verfahren zur Diagnose der Malaria, dadurch gekennzeichnet, dass Autoantikörper gegen Calreticulin bestimmt werden.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Bestimmung der Autoantikörper gegen Calreticulin auf der Basis eines ELISA-, Western-Blot-, Antigeneinfang- oder Sandwich-Verfahrens erfolgt.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Bestimmung des Autoantikörpers gegen Calreticulin in homogener, flüssiger Phase oder an fester Phase erfolgt.
Verfahren nach Anspruch 3, wobei die Bestimmung an fester Phase die Schritte umfaßt: – Binden von Calreticulin an eine feste Phase – in Kontakt bingen des an die feste Phase gebundenen Calreticulins mit einer zu untersuchenden Probe, und – Nachweis von gegebenenfalls vorhandenem Autoantikörper gegen Calreticulin.
Verfahren nach Anspruch 4, wobei natives oder gentechnologisch hergestelltes Calreticulin, oder modifiziertes oder fragmentiertes Calreticulin, welches zur Bindung an Autoantikörper gegen Calreticulin in der Lage ist, verwendet wird.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die Bestimmung von Autoantikörpern gegen Calreticulin die Verwendung von Anti-Immunglobulin(Ig)-Antikörper einschließt.
Verfahren nach Anspruch 6, wobei der Anti-Ig-Antikörper polyvalent ist oder IgA-, IgG- und/oder IgM-spezifisch ist.
Verfahren nach Anspruch 6 oder 7, wobei der Anti-Ig-Antikörper eine Markierung zur Detektion besitzt.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei die Bestimmung von Autoantikörpern gegen Calreticulin in Kombination mit einem herkömmlichen diagnostischen Verfahren zur Diagnose der Malaria durchgeführt wird.
Verwendung von Calreticulin zur Diagnose der Malaria.
Verwendung nach Anspruch 10, wobei natives oder gentechnologisch hergestelltes Calreticulin, oder modifiziertes oder fragmentiertes Calreticulin, welches zur Bindung an Autoantikörper gegen Calreticulin in der Lage ist, verwendet wird.
Kit zur Diagnose der Malaria mit: a) einer festen Phase, an welche Calreticulin gebunden ist, b) wenigstens einem Anti-Immunglobulin(Ig)-Antikörper, und c) zusätzlichen Kit-Bestandteilen, die zur Bestimmung von Plasmodien-Antigenen geeignet sind.
Kit gemäß Anspruch 12, wobei die feste Phase in Form von Kügelchen, eines Teststreifens, einer Testscheibe oder einer Schicht auf der Basis eines kunststoffhaltigen Trägers vorliegt.
Kit gemäß Anspruch 12 oder 13, wobei der Anti-Ig-Antikörper eine zur Detektion geeignete Markierung besitzt.
Kit gemäß Anspruch 12, wobei die zusätzlichen Kit-Bestandteile zur Bestimmung der Plasmodien-Antigene HRP2, Aldolase und/oder Lactatdehydrogenase geeignet sind.