DE102006030566B4

DE102006030566B4 - Verfahren und Reagenzien zur Diagnose entzündlicher Lebererkrankungen

Info

Publication number: DE102006030566B4
Application number: DE200610030566
Authority: DE
Inventors: Lars Komorowski; Winfried Stöcker; Christian Probst
Original assignee: Euroimmun Medizinische Labordiagnostika AG
Current assignee: Euroimmun Medizinische Labordiagnostika AG
Priority date: 2006-07-03
Filing date: 2006-07-03
Publication date: 2013-01-24
Anticipated expiration: 2026-07-04
Also published as: DE102006030566A1

Abstract

Verfahren zur Diagnose von Autoimmunhepatitis, dadurch gekennzeichnet, dass eine biologische Probe eines Patienten mit mindestens einem Fragment von Myosin-9 und/oder Filamin A in Kontakt gebracht und die Bindung von Antikörpern an die Fragmente nachgewiesen wird, wobei durch den Nachweis von Antikörpern gegen eines dieser Fragmente in der Probe eine Autoimmunhepatitis diagnostiziert wird.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die schwere Kette von Myosin-9 und Filamin A (beides Bestandteile des Zytoskeletts), Fragmente von beiden, ein Verfahren zum Nachweis von Antikörpern gegen solche Polypeptide für die serologische Diagnostik autoimmuner Lebererkrankungen und entsprechende Testreagenzien.
Die Erfindung trägt dazu bei, die unterschiedlichen Formen entzündlicher Lebererkrankungen klar voneinander abzugrenzen, wodurch je nach Erkrankung grundsätzlich unterschiedliche Therapiekonzepte anzuwenden sind.
Stand der Technik:
Charakteristisch für die Autoimmunhepatitis ist das Vorkommen von Antikörpern gegen Zellkerne (ANA), glatte Muskulatur (ASMA), Mikrosomen von Leber- und Nierenzellen (LKM) oder ein lösliches Leberprotein (SLA). ASMA finden sich gelegentlich auch bei anderen Krankheiten, u. a. bei der Virushepatitis.
ASMA werden im Wesentlichen mit Hilfe des indirekten Immunfluoreszenztests (IIFT) untersucht. Dabei verwendet man z. B. Dünnschnitte gefrorenen Gewebes (Leber, Niere und Magen von Ratten) oder kultivierte humane Epithelzellen, die man auf Glasobjektträger aufbringt. Dann wird verdünntes Patientenserum oder anderes Probenmaterial auf die Gewebeschnitte getropft. Nach 30 Minuten wird überschüssige Probe abgespült und der Gewebeschnitt mit einem Farbstoff inkubiert, der die gebundenen Antikörper markiert. Gebundener Farbstoff wird im Fluoreszenzmikroskop lokalisiert. Positive Reaktionen zeichnen sich dadurch aus, dass die entsprechenden Strukturen Farbstoff aufgenommen haben. Der IIFT gibt allerdings nur die globale Auskunft darüber, ob Antikörper gegen glatte Muskulatur vorliegen, aber sie informiert nicht über die genaue Spezifität der Zielantigene: dieses ist die Domäne bspw. der monospezifischen Enzymimmuntests, von denen die ELISA-Tests (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) die größte Bedeutung erlangt haben. In einem ELLSA koppelt man die einzelnen, definierten Antigene bspw. an die Innenwand eines Gefäßes oder an die Oberfläche einer Membran und inkubiert in ähnlicher Weise wie beim IIFT. An Stelle des Fluoreszenzfarbstoffs wird hier ein Enzym eingesetzt, das eine Farbstoffreaktion katalysiert.
Mit Hilfe solcher Enzymimmuntests wurden unterschiedliche Proteine des Zytoskeletts als Ziele für ASMA beschrieben – darunter Aktin, Troponin, Desmin, Keratin, Vimentin, Tubulin, alpha-Aktinin, Tropomyosin, Filamin und die leichte Kette des Myosins (Girard und Senecal, 1995, Clin Immunol Immunpathol, 74: 193–201; Zamanou et al, 2002 J Clin Lab Anal, 16: 194–201; Liaskos et al., 2006 J Clin Pathol, Publikation akzeptiert). Außer für Aktin konnte für keines von diesen biochemisch charakterisierten Substanzen eine Rolle als Zielantigen für mit der Autoimmunhepatitis assoziierte Autoantikörper festgestellt werden.
Die herausragende Bedeutung des Aktins für die serologische Diagnostik der Autoimmunhepatitis veranlasste uns, nach einer Zelllinie zu suchen, mit der sich Autoantikörper gegen Aktin von Antikörpern gegen die übrigen in der glatten Muskulatur der oben genannten Gewebeschnitte enthaltenen Substanzen unterscheiden lassen. Dabei sind wir auf die Zelllinie VSM47 gekommen, die der vaskulären glatten Muskulatur einer Ratte entstammt und mit der man Autoantikörper gegen Aktin spezifisch identifizieren kann (Bogdanos, Komorowski et al., 2006, Jahrestagung der amerikanischen Vereinigung zur Untersuchung von Lebererkrankungen, eingereicht). Liegen Autoantikörper gegen Aktin vor, ergibt sich im IIFT ein typisches Fluoreszenzmuster mit der Zelllinie VSM47.
Beschreibung der Erfindung:
Zufällig stellten wir später fest, dass einige der Seren von Patienten mit Autoimmunhepatitis, die mit der VSM47-Zelllinie ein typisches Aktinmuster ergaben, mit den sonst Anti-Aktinreaktiven humanen Epithelzellen nicht reagierten. Wir sind daraufhin der Ursache für diese Diskrepanz nachgegangen und haben zwei neue Autoimmunhepatitis-relevante Autoantigene identifizieren können: Die biochemische Isolierung und anschließende massenspektroskopische Analyse ergab, dass es sich dabei um die schwere Kette des Myosin-9 (Uniprot-Zugriffsnummer für das humane Genprodukt: P35579) und um Filamin A (Uniprot-Zugriffsnummer für das humane Genprodukt: P21333) handelt. Beide Substanzen stellen gemäß dieser Erfindung neue relevante Zielantigene bei der Autoimmunhepatitis dar.
Die korrekte Identifikation beider Substanzen ergibt sich daraus, dass sie als in E. coli rekombinant exprimierte Proteine die gleiche immunologische Reaktivität wie die nativen, aus VSM47 aufgereinigten Proteine aufweisen und ebenfalls spezifisch mit Autoantikörpern von Autoimmunhepatitis-Patienten reagieren. Darüber hinaus zeigten auch rekombinant exprimierte Teilstücke dieser Proteine gemäß SEQ ID NO 1 bzw. SEQ ID NO 2 die gleiche Reaktivität. Diese Antigene werden im Weiteren als Myh-9-3 bzw. FInA-2c bezeichnet. Die vorliegende Erfindung ermöglicht erstmalig die gezielte Herstellung und die Aufreinigung von Myh-9-3 bzw. FInA-2c. Im Rahmen dieser Erfindung werden daher Myh-9-3 bzw. FInA-2c umfassende Polypeptide zur Verfügung gestellt, die sowohl durch biochemische Präparation aus nativem Gewebe von Vertebraten als auch durch rekombinante Expression erhältlich und mit Autoantikörpern von Autoimmunhepatitis-Patienten nachweisbar sind.
Die erfindungsgemäßen Myh-9-3 bzw. FInA-2c sind bevorzugt nicht mit Antikörpern von Patienten mit Virushepatitis oder Primär Biliärer Zirrhose nachweisbar. Weiterhin sind sie bevorzugt auch nicht mit Antikörpern von Patienten mit anderen Autoimmunerkrankungen (außer Autoimmunhepatitis) nachweisbar.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird Myh-9-3 bzw. FInA-2c durch rekombinante Expression zur Verfügung gestellt. Die Klonierung der cDNA in einen Expressionsvektor erlaubt eine rekombinante Herstellung des Antigens. Eine Expression des Proteins ist in verschiedenen Systemen möglich, z. B. bakteriellen Systemen wie Escherichia coli oder Bacillus subtilis, in Hefen wie Saccharomyces cerevisiae oder Pichia pastoris oder anderen eukaryotischen Zellen, wie 293-, CHO-, COS oder Insektenzellen. Verschiedene Expressionsvektoren für die jeweiligen Systeme sind bekannt.
Durch PCR-Amplifikation der den Myh-9-3 bzw. FInA-2c entsprechenden cDNAs mit den Primern entsprechend den Sequenzen SEQ ID NO 3 und SEQ ID NO 4 bzw. SEQ ID NO 5 und SEQ ID NO 6, Restriktion mit den Enzymen NcoI und SalI und Ligation in einen entsprechend vorbereiteten pEP24d-Vektor (Novagen) bzw. Vektor gemäß SEQ ID NO 7 wurden Expressionplasmide entsprechend den Sequenzen SEQ ID NO 8 bzw. SEQ ID NO 9 hergestellt, die neben der für die jeweiligen rekombinanten Konstrukte kodierenden Sequenzen auch noch solche für C-terminale bzw. N-terminale Polyhistidin-Anhänge kodierende Sequenzen enthalten. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform werden Myh-9-3 bzw. FInA-2c oder mit Autoantikörpern reagierende Teile davon deswegen als Fusionsproteine exprimiert, z. B. als Ig-Fusionsprotein oder unter Verwendung eines Anhangs zur Proteinaufreinigung, z. B. eines Polyhistidin-Anhangs (His-Tag).
Die Plasmide wurden erfolgreich in den E. coli-Stamm BL21 (DE3) überführt und die rekombinanten Konstrukte anschließend durch Kultivierung in Luria-Bertani-Medium und Induktion mit Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranosid (IPTG) exprimiert. Am Ende der Expressionszeit wurden die Zellen geerntet, mittels Hochdruckhomogenisation aufgeschlossen und durch Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) und Westernblot mit einem Antikörper gegen den Polyhistidin-Anhang analysiert. Die Analyse zeigte, dass die rekombinanten Proteine in großen Mengen als unlösliche Einschlusskörperchen vorlagen.
Diese wurden durch differentielle Zentrifugation von sonstigen Zellbestandteilen abgetrennt und mittels eines Puffers mit 8 M Harnstoff in Lösung überführt. Die. enthaltenen rekombinanten Proteine wurden anschließend durch Immobilisierte-Metallchelat-Chromatographie von restlichen E. coli-Proteinen befreit.
Die aufgereinigten Proteine zeigten im Westernblot eine Reaktivität mit Autoantikörpern aus den Seren von Patienten mit Autoimmunhepatitis. Dass diese Proteine im Westernblot reagieren, deutet auf das Vorliegen von Epitopen, die weder eine Abhängigkeit von der dreidimensionalen Struktur des Proteins noch von posttranslationalen Modifikationen, die im bakteriellen Expressionssystem nicht reproduzierbar sind, aufweisen, in Myh-9-3 bzw. FInA-2c hin. Für die Generierung von Antikörpern (s. u.) gegen Myh-9-3 bzw. FInA-2c sind in E. coli rekombinant hergestellte Proteine ebenfalls geeignet.
In einer bevorzugten Ausführungsform sind Myh-9-3 bzw. FInA-2c oder mit Autoantikörpern reagierende Teile davon in E. coli rekombinant exprimiert. Myh-9-3 bzw. FInA-2c können auch in eukaryotischen Expressionssystemen rekombinant hergestellt werden. Weitere Methoden zur rekombinanten Expression von Proteinen in Bakterien sind z. B. in Lottspeich und Zorbas (Bioanalytik, 1998, Spektrum akademischer Verlag, Heidelberg, Berlin) oder Sambrook et al. (Molecular cloning: a laboratory manual, 2000, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY) beschrieben.
Da die Homologien von Myosin-9 und Filamin A innerhalb der Klasse Mammalia, d. h. auch zu den humanen Myosin-9 bzw. Filamin A (Uniprot Zugriffsnummern für Myosin-9: Huhn: P14105; Maus: Q8VDD5; Ratte: Q62812; Mensch: P35579; für Filamin A: Maus: Q8BTM8; Mensch: P21333) sehr hoch sind, lässt sich vermuten, dass, wie auch für andere Proteine gezeigt, die Myh-9-3 bzw. FInA-2c entsprechenden Polypeptide anderer Spezies der Klasse Mammalia verwendet werden können. In einer bevorzugten Ausführungsform entsprechen Myh-9-3 bzw. FInA-2c deswegen den Fragmenten von Myosin-9 und Filamin A aus anderen Spezies der Klasse Mammalia, die den humanen Myh-9-3 bzw. FInA-2c entsprechen.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform werden nur die Teile der Antigene exprimiert, an die sich die Antikörper von Autoimmunhepatitis-Patienten binden, um z. B. unspezifische Reaktionen zu vermeiden oder die Expression der Antigene zu optimieren. Solche Teile können sowohl einzelne reaktive Teilbereiche der Antigene umfassen als auch Fusionsproteine aus mehreren reaktiven Teilbereichen der Antigene oder Fusionsproteine aus einem oder mehreren reaktiven Teilbereichen der Antigene und nicht zu Myh-9-3 bzw. FlnA-2c gehörenden Sequenzen.
Für den Fachmann ergeben sich weitere Verfahren zur Aufreinigung und Isolierung von rekombinantem Myh-9-3 bzw. FlnA-2c mit oder ohne Fusionspartner, wie etwa Filtrations-, Chromatographie-, Elektrophorese- und Zentrifugationsverfahren oder Kombinationen aus diesen. Solche Verfahren zur Aufreinigung von Proteinen sind z. B. in Lottspeich und Zorbas (Bioanalytik, 1998, Spektrum akademischer Verlag, Heidelberg, Berlin) oder Sambrook et al. (Molecular cloning: a laboratory manual, 2000, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY) beschrieben. Gegenstand der Erfindung sind deshalb auch mit solchen Verfahren aufgereinigtes oder isoliertes Myh-9-3 bzw. FlnA-2c, das von ASMA gebunden wird.
Gegenstand der Erfindung sind auch mit einem Reportermolekül markiertes Myh-9-3 bzw. FlnA-2c, die in der Lage sind, mit Antikörpern von Patienten mit Autoimmunhepatitis zu reagieren.
Als chemische Kopplungsverfahren sind dem Fachmann eine Reihe unterschiedlicher Verfahren wie solche, die die Reportermoleküle zunächst mit einer reaktiven Gruppe, bspw. Pentafluorophenylester, N-Hydroxysuccinimid oder Maleimid, versehen und die so aktivierten Reportermoleküle dann mit dem zu markierenden Zielmolekül, bspw. einem Antigen oder Protein, in Kontakt bringen, bekannt. Nach der Verbindung von Reportermolekül und Zielmolekül kann überschüssiges Reportermolekül anschließend durch chemische, biochemische oder physikalische Trenntechniken, bspw. Chromatographie oder Filtration, entfernt werden.
Als Reportermoleküle sind dem Fachmann eine Reihe unterschiedlicher Verbindungen wie Fluorophore, bspw. Fluorescein oder Tetramethylrhodamin, Haptene, bspw. Biotin, und Enzyme, bspw. Meerrettich-Peroxidase oder alkalische Phosphatase, bekannt. Zur Nutzung der verschiedenen Kopplungsverfahren sind zu diesem Zweck bereits aktivierte Reportermoleküle kommerziell erhältlich.
Der Fachmann kennt weitere Reportermoleküle und Kopplungsverfahren zur Markierung von Proteinen mit Reportermolekülen. Gegenstand der Erfindung sind deshalb auch mit solchen Verfahren hergestellte mit Reportermolekülen markiertes Myh-9-3 bzw. FInA-2c, die in der Lage sind, mit Antikörpern von Patienten mit Autoimmunhepatitis zu reagieren.
Gegenstand der Erfindung sind auch polyklonale Antikörper, die Myh-9-3 bzw. FInA-2c erkennen. Eine bevorzugte Methode zur Gewinnung solcher Antikörper ist die Immunisierung eines Säugetiers, wie Maus, Ratte, Kaninchen, Ziege, Schaf, oder eines Vogels, wie Huhn, mit aufgereinigtem Myh-9-3 bzw. FInA-2c, evtl. in einer Mischung mit einem die Immunantwort stimulierenden Agens, wie Freudsches-Adjuvans, und Gewinnung von Serum nach einiger Zeit. Diese Antikörper können durch Affinitätsreinigung mit einer Protein-A-Sepharose oder dem an eine inerte Matrix gekoppelten zur Immunisierung verwendeten Protein isoliert werden. Bevorzugt wird deshalb eine isolierte Antikörperfraktion eingesetzt.
Weiterhin werden im Rahmen der Erfindung Testreagenzien zur Diagnose entzündlicher Lebererkrankungen zur Verfügung gestellt, die Myh-9-3 und FInA-2c jeweils einzeln, beide Antigene oder eines oder beide Antigene in Kombination mit anderen Antigenen sowie z. B. eine Anleitung zur Diagnose entzündlicher Lebererkrankungen enthalten.
Im Rahmen dieser Erfindung wird auch ein Verfahren zum Nachweis von Antikörpern gegen Myh-9-3 bzw. FInA-2c zur Verfügung gestellt, bei dem man eine biologische Probe mit dem erfindungsgemäßen Antigen in Kontakt bringt und die Bindung von Antikörpern an das Antigen nachweist.
Das Verfahren ist besonders zur Diagnose der Autoimmunhepatitis geeignet, indem man bei den zu untersuchenden Proben feststellt, ob Autoantikörper insbesondere gegen Myh-9-3 bzw. FInA-2c vorliegen. Bevorzugte Probenmaterialien sind im allgemeinen Serum oder Plasma. Es kann sich jedoch auch um Überstände von Hybridom-Kulturen handeln, oder auch um Proben, in denen Antikörper-ähnliche Produkte nachgewiesen werden sollen, die man z. B. mit Hilfe von Phage-Display-Bibliotheken gewonnen hat.
In dem erfindungsgemäßen Verfahren können verschiedene Methoden eingesetzt werden, um die Bindung der Antikörper an das Antigen nachzuweisen. Bevorzugt erfolgt dies durch IIFT, ELISA, Lumineszenzimmuntest, Microarray oder Blot (Western Blot oder Dot Blot).
Darüber hinaus können auch Schnelltests zum qualitativen Nachweis von Antikörpern zum Ablesen einer Farbreaktion auf einem Teststreifen verwendet werden. Solche Tests basieren im allgemeinen auf einem Sandwich-Festphasen-Immunoassay, bei dem Myh-9-3 bzw. FInA-2c an ein Testfeld oder in einer Linie auf dem Teststreifen gekoppelt wird. Der Teststreifen wird z. B. mit einer Blutprobe oder verdünntem Patientenserum in Kontakt gebracht, die eventuell anti-Myh-9-3 bzw. FInA-2c-Antikörper enthält. Sekundäre anti-human-Immunglobulin-Antikörper der geeigneten Spezifität, z. B. mit Goldkonjugat oder mit einem Enzym wie Alkalischer Phosphatase oder Meerrettich-Peroxidase konjugiert, sammeln sich nur dann in dem Testfeld, wenn in der Probe antigenspezifische Antikörper enthalten waren. Gegebenenfalls muß das Ergebnis noch mit einem chromogenen Substrat sichtbar gemacht werden.
Gegenstand der Erfindung ist weiterhin ein Immunfluoreszenzverfahren zum Nachweis von Antikörpern gegen Myh-9-3 bzw. FInA-2c, bei dem man eine Probe mit einer gentechnisch veränderten Zelllinie in Kontakt bringt und die Bindung von Antikörpern an das Antigen nachweist. Das unter diesen Bedingungen von den Zellen exprimierte erfindungsgemäße Myh-9-3 bzw. FInA-2c reagiert spezifisch mit Autoantikörpern von Autoimmunhepatitis-Patienten.
Die folgenden Versuche zeigen besondere Ausführungsformen der Erfindung. Zunächst wurden Myosin-9 und Filamin A nativ aufgereinigt und im Westernblot zum Nachweis der entsprechenden Serumantikörper eingesetzt. Es gelang aber auch für den gleichen Zweck Myh-9-3 bzw. FInA-2c rekombinant in E. coli zu exprimieren und dann bis zur Homogenität aufzureinigen und sowohl im ELISA als auch im Westernblot die Autoimmunhepatitis zu diagnostizieren.
Beispiele
Beispiel 1: Westernblot mit Subfraktionen von VSM47
VSM47-Zellen werden in D-MEM/10% FKS kultiviert und bei Konfluenz durch Abschaben in TBS (25 mM Tris-HCl pH 7,4 150 mM NaCl) geerntet. Der Zellaufschluss erfolgt durch Zugabe von Triton X-1 00 (0,1% (w/v) finale Konzentration) und einen Einfrier-/Auftau-Schritt. Unterschiedliche Zellfraktionen werden anschließend durch differenzielle Zentrifugation bei 1.000 g und 20.000 g gewonnen.
Die Proteine der verschiedenen Zellfraktionen werden nach der Trennung durch SDS-PAGE auf eine Nitrocellulose-Membran transfertiert, erst mit Ponceau S gefärbt und dann mit Seren von Autoimmunhepatitis-Patienten und von Blutspendern inkubiert.
Für die spezifische immunologische Detektion mit Antikörpern wird die Membran, ggf. in Streifen geschnitten, zuerst 15 Minuten mit Universalpuffer (EUROIMMUN) mit 3% (w/v) Milchpulver blockiert. Anschließend wird 3 Stunden mit einem humanen Serum (1:200 in Universalpuffer mit 3% (w/v) Milchpulver) inkubiert. Dann wird dreimal jeweils 5 Minuten mit Universalpuffer gewaschen. In einem zweiten Inkubationsschritt reagieren die im positiven Fall an die Proteine gebundenen Antikörper mit einer Konjugat-Lösung (EUROIMMUN, 1:10 in Universalpuffer verdünnt), die alkalische Phosphatase-markierte Anti-human-IgG-Antikörper enthält. Anschließend wird wie nach der Seruminkubation gewaschen. In einem dritten Inkubationsschritt werden dann die gebundenen Antikörper mit einer NBT/BCIP-Substrat-Lösung (4-Nitrobluetetrazoliumchlorid/Chlorobromoindolylphosphate, EUROIMMUN) nachgewiesen.
Proteine, die in der Lage sind, mit Antikörpern von Autoimmunhepatitis zu reagieren, werden durch Ausschneiden aus einem separaten Elektrophoresegel, anschließenden Trypsin-Verdau und ”MALDI-ToF peptide mass fingerprinting” analysiert. Die Auswertung erfolgt mit Hilfe der nr-Datenbank.
Der Westernblot zeigt, dass Antikörper von Autoimmunhepatitis-Patienten mit zwei im Überstand nach Zentrifugation mit 20.000 g enthaltenen Proteinen von etwa 210 und 280 kDa reagieren, während Seren von Blutspendern keine solchen Antikörper aufweisen.
Die Proteine werden durch ”peptide mass fingerprinting” als Myosin-9 (210 kDa) bzw. Filamin A (280 kDa) der Ratte identifiziert.
Beispiel 2: Klonierung von humanem Myh-9-3 bzw. FInA-2c und Expression in E. coli
Aus Total-RNA aus humaner glatter Muskulatur werden mit Hilfe der Primer gemäß SEQ ID NO 3 und SEQ ID NO 4 bzw. SEQ ID NO 5 und SEQ ID NO 6 und dem Qiagen OneStep RT-PCR-System modifizierte Kopien des Myosin-9- bzw. des Filamin A-Gens amplifiziert. Das Myh-9-3-PCR-Produkt entspricht dem für die Aminosäuren 658–1047 kodierenden Bereich des humanen Myosin-9 (Uniprot Zugriffsnummer P35579), das FInA-2c-PCR-Produkt entspricht dem für die Aminosäuren 1358–1821 kodierenden Bereich des humanen Filamin A (Uniprot Zugriffsnummer P21333). Des Weiteren enthält das PCR-Produkt an den Enden Schnittstellen für die Restriktionsenzyme NcoI und SalI.
Nach NcoI/SalI-Verdau werden die PCR-Produkte mit dem NcoI/XhoI-linearisierten Plasmidvektor pET24d (Novagen) bzw. dem Plasmid gemäß SEQ ID NO 7 ligiert, dass sich die Konstrukte gemäß SEQ ID NO 8 bzw. SEQ ID NO 9 ergeben. Der Ligationsansatz wird in E. coli XL-2 Blue (Stratagene) transformiert.
Positive Klone werden durch Kanamycin selektiert. Aus diesen werden die enthaltenen Plasmide isoliert und durch Restriktionsanalyse und DNA-Sequenzierung überprüft. Korrekte Plasmide werden für die Durchführung der Expression ausgewählt.
Für die Expression wird in E. coli BL21 (DE3) (Stratagene) transformiert. Positive Klone werden wie oben selektiert, anschließend in 20 ml LB-Medium inokuliert und bei 3rC inkubiert. Bei einer OD₆₀₀ (d = 1 cm) von 0,6 werden die Zellen durch Zugabe von IPTG (Endkonzentration: 1 mM) induziert und für weitere 3 Stunden inkubiert. Nach dieser Zeit werden die Zellen durch Zentrifugation bei 2.200 × g für 10 Minuten geerntet, in 20 ml PBS resuspendiert, erneut zentrifugiert und schließlich in 1 ml PBS resuspendiert.
Die Proteine der so geernteten Zellen werden durch Westernblot gemäß Beispiel 1 analysiert mit der Ausnahme, dass an Stelle eines humanen Serums ein Antikörper gegen den Polyhistidin-Anhang (Dianova, 1:1000 in Universalpuffer mit 3% (w/v) Milchpulver) und als Konjugat ein alkalische Phosphatase-markierte Anti-Maus-IgG-Antikörper (Sigma, 1:1000 in Universalpuffer verdünnt) verwendet wird.
Durch die RT-PCR wurden ca. 1200 bp bzw. ca. 1400 bp große Amplifikate erzeugt, die mit den vorhergesagten Größen gut übereinstimmen. Nach der Ligation mit dem pET24d-Plasmid ergibt die DNA-Sequenzierung gegenüber der vorhergesagten Sequenzen keinerlei Unterschied.
Im Westernblot nach Expression sind jeweils eine Bande entsprechend 47 kDa für das Myh-9-3-Konstrukt bzw. entsprechend 50 kDa für das FInA-2c-Konstrukt sichtbar. Diese Größe stimmt gut mit der vorhergesagten Größe auf Basis der Aminosäuresequenz überein. Zellen die den unveränderten Plasmidvektor enthalten, weisen kein entsprechendes Protein auf.
Beispiel 3: Aufreinigung von Myh-9-3 bzw. FInA-2c durch Affinitätschromatographie
Bei der Affinitätssäule handelt es sich um eine NiNTA-Spinsäule (Qiagen), die nach Empfehlungen des Herstellers gehandhabt wird.
Die gemäß Beispiel 1 geernteten Zellen werden erneut wie beschrieben zentrifugiert, in 1 ml TNI-10-Puffer (5 mM Tris-HCl pH 8,0, 300 mM NaCl, 10 mM Imidazol) resuspendiert und durch dreimalige, einminütige Ultraschallbehandlung (Branson Sonifier, Stufe 7, MicroTip) aufgeschlossen. Unlösliche Proteine werden durch Zentrifugation bei 21.250 × g für 10 Minuten abgetrennt und durch Resuspendierung des Sediments in 1 ml TNUI-5-Puffer (10 mM Tris-HCl pH 8,0, 300 mM NaCl, 8 M Harnstoff, 5 mM Imidazol) in Lösung gebracht. Unlösliche Bestandteile werden durch erneute Zentrifugation abgetrennt und 0,5 ml des Überstandes auf eine mit TNUI-Puffer äquilibrierte NiNTA-Spinsäule aufgebracht.
Nicht- oder schwach bindende Proteine werden durch mehrmaliges Waschen mit 0,5 ml TNUI-Puffer von der Säule entfernt. Die Elution erfolgt mit 0,2 ml AU-Puffer (50 mM Natriumacetat pH 4,5, 8 M Harnstoff). Die Elutionsfraktion wird durch Westernblot wie in Beispiel 2 transferiert.
Die Eluate enthalten im Wesentlichen jeweils ein Protein, das nach Färbung der Westernblotmembran mit Ponceau S jeweils einer Bande entsprechend einer Größe von 47 bzw. 50 kDa entspricht. Nach Westernblot ist eine Bande derselben Größe zu sehen. Dieses Ergebnis deutet darauf hin, dass das exprimierte Protein nach der Chromatographie im Wesentlichen frei von E. coli-Bestandteilen vorliegt.
Beispiel 4: Westernblot zur Differenzierung von Seren mit Hilfe des rekombinanten Myh-9-3 bzw. FInA-2c
Gemäß Beispiel 1 wird ein Westernblot mit dem aufgereinigten Myh-9-3 bzw. dem aufgereinigten FInA-2c verwendet.
Nach Westernblot mit dem aufgereinigten Myh-9-3 ist bei drei von 20 ASMA positiven Seren von Patienten mit Autoimmunhepatitis eine Bande bei ca. 47 kDa zu sehen, die an der gleichen Position wie die nach Inkubation mit dem Antikörper gegen den Polyhistidin-Anhang liegt. Demgegenüber zeigt keines von zehn Seren von Patienten mit Virushepatitis, keines von zehn Seren von Patienten mit Primär Biliärer Zirrhose und keines von 20 Seren von gesunden Blutspendern eine positive Reaktion.
Nach Westernblot mit dem aufgereinigten FInA-2c ist bei sechs von 20 ASMA positiven Seren von Patienten mit Autoimmunhepatitis eine positive Reaktion bei ca. 50 kDa zu sehen, die an der gleichen Position wie die nach Inkubation mit dem Antikörper gegen den Polyhistidin-Anhang liegt. Demgegenüber zeigt keines von zehn Seren von Patienten mit Virushepatitis, keines von zehn Seren von Patienten mit Primär Biliärer Zirrhose und keines von 20 Seren von gesunden Blutspendern eine entsprechende Reaktion.
Es zeigt sich, dass eine Unterscheidung von ASMA positiven und ASMA negativen Seren mit dem so aufgebauten Westernblot möglich ist.
Sequenzprotokoll

Claims

Verfahren zur Diagnose von Autoimmunhepatitis, dadurch gekennzeichnet, dass eine biologische Probe eines Patienten mit mindestens einem Fragment von Myosin-9 und/oder Filamin A in Kontakt gebracht und die Bindung von Antikörpern an die Fragmente nachgewiesen wird, wobei durch den Nachweis von Antikörpern gegen eines dieser Fragmente in der Probe eine Autoimmunhepatitis diagnostiziert wird.
Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens ein Fragment von Myosin-9 gemäß SEQ ID NO 1 oder eine Teilsequenz von SEQ ID NO 1 von mindestens zehn in SEQ ID NO 1 aufeinanderfolgenden Aminosäuren als Antigen verwendet wird.
Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens ein Fragment von Filamin A gemäß SEQ ID NO 2 oder eine Teilsequenz von SEQ ID NO 2 von mindestens zehn in SEQ ID NO 2 aufeinanderfolgenden Aminosäuren als Antigen verwendet wird.
Verfahren gemäß Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die verwendeteten Antigene aus Zellen von Vertebraten hergestellt werden.
Verfahren gemäß Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die verwendeteten Antigene rekombinant hergestellt werden.
Verfahren gemäß Anspruch 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die verwendeteten Antigene in E. coli, Insektenzellen, Hefezellen oder Zellen von Vertebraten hergestellt werden.
Verfahren gemäß der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass die verwendeteten Antigene mit einem Reportermolekül verbunden sind.
Verfahren gemäß der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass man die Bindung der Antikörper an das Antigen mit einem Immunfluoreszenztest, Microarray, ELISA, Lumineszenztest, Blot, Western Blot oder Dot Blot nachweist.
Testreagenz zur Diagnose entzündlicher Lebererkrankungen, dadurch gekennzeichnet, dass es mindestens ein Fragment von Myosin-9 gemäß SEQ ID NO 1 oder eine Teilsequenz von SEQ ID NO 1 von mindestens zehn in SEQ ID NO 1 aufeinanderfolgenden Aminosäuren oder ein Fragment von Filamin A gemäß SEQ ID NO 2 oder eine Teilsequenz von SEQ ID NO 2 von mindestens zehn in SEQ ID NO 2 aufeinanderfolgenden Aminosäuren als Antigen umfasst und die Durchführung des Verfahrens gemäß der Ansprüche 1 bis 8 ermöglicht.