DE69331549T2 - Nachweiss von anti-hpa antikörpern - Google Patents
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Description
- Die gegenwärtige Erfindung bezieht sich auf ein Immungssayverfahren und System für den immunologischen Nachweis von Antikörpern zu Humanthrombozytenantigen 1 oder 3 (HPA1 oder HPA3) gemäß spezifischen Genotypen und insbesondere auf einen Enzym gekoppelten Immungssay (ELISA) für ihren Nachweis.
- HPA1 ist eine polymorphe Determinante auf dem Thrombozytenmembranglycoprotein (GP)IIb/IIIa Komplex, gelegen an der N-terminalen Region von GPIIIa. Der Komplex besteht aus zwei nicht kovalent assoziierten Untereinheiten GPIIb und GPIIIa. Divalente Kationen wie Ca²&spplus; und Mg²&spplus; werden für Untereinheitsassoziierung benötigt. Die Immunität hervorrufende Eigenschaft von HPA1 führt zu einer Mannigfaltigkeit von immunvermittelten Thrombozytopenien, einschließlich Post-Transfusion Purpura (PTP) und neonatale Alloimmunthrombozytopenie (NAITP) (Entgegenhaltungen 1,2). HPA1 kann als Typen HPA1a und HPA1b existieren. Annähernd 72% der kaukasischen Bevölkerung ist homozygot in bezug auf HPA1a (Thrombozytenantigen 1, d. h. PLA1), 2% in bezug auf HPA1b (Thrombozytenantigen 2, d. h. PLA2), und 26% sind heterozygot (Entgegenhaltung 2). Obwohl PTP ein seltener Zustand ist (annähernd 200% berichtete Fälle weltweit), erscheint NAITP relativ oft mit einer Rate von 1 in 2000 Lebendgeburten, wobei etwa 50% der Fälle in erster Schwangerschaft auftreten (Entgegenhaltungen 2, 3). Bei diesen Bedingungen greifen Anti-HPA1a Antikörper (d. h. Typ 1a Antikörper) Thrombozyten an, die das HPA1a Antigen tragen, was zu Zerstörung von Thrombozyten in dem Patientenblut führt. Im Falle von NAITP offenbart sich dieses als ein Baby mit erhöhter Tendenz, zu bluten im Hinblick auf seine reduzierte Thrombozytenzahl oder verminderte Thrombozytenaktivität und folglich beeinträchtigtes Blutgerinnungssystem.
- Der frühe Nachweis von Anti-HPA1a Antikörpern kann von kritischer Bedeutung sein, da prompte Diagnose Handhabung von Patienten helfen kann, insbesondere das Typisieren der werdenden Mutter. Es gibt verschiedene Verfahren für den Nachweis von Anti-HPA1a Antikörpern, einschließlich Thrombozytensuspensionsimmunfluoreszenztest (PSIFT), monoklonale Antikörperimmobilisierung von Thrombozytenantigenen (MAIPA), Fließzytometrie und Immunsorbensassays (Entgegenhaltungen 4, 5, 6, 7). Obwohl derartige Verfahren gut etabliert sind und im Falle, wenn MAIPA, sehr empfindlich sind, sind sie zeitverbrauchend und nicht Automatisierung und Anwendung im weiten Umfang zugänglich.
- Ogden (WO 89/02079) und Newman et al (J. Cell Biol. (1981) 90, Seite 249-253) beschreiben Immungssays für den Nachweis von Antikörpern gegenüber Humanthrombozytenantigenen unter Verwenden von Thrombozytenlysaten, die an eine feste Matrix gebunden werden.
- Pytela et al (Entgegenhaltung 8) beschreiben die Bindeeigenschaften des Thrombozytenmembranglycoproteins GP IIb/IIIa an Peptide, einschließlich die Aminosäurensequenz Arg- Gly-Asp (RGD). Das Glycoprotein wurde mittels Affinitätschromatographie eines Thrombozytenextrakts unter Verwenden des Heptapeptids GRGDSPK, gekoppelt mit SepharoseRTM gereinigt.
- Kirchhoffer et al. (Entgegenhaltung 9) verwendete ein ähnliches Reinigungsverfahren unter Herstellen von reinem GP ITh/IIIa. Das auf Nitrozellulosefilter übertragene reine Glycoprotein reagierte mit monoklonalem Anti-IIB Antikörper unter Bilden eines Immunkomplexes, der unter Verwenden eines Enzym markierten zweiten Antikörpers offenbart wurde. Das Eluat von der Affinitätschromatographie umfaßt das Hexapeptid, gekoppelt an das Glycoprotein, und kann auch Mg²&spplus; und Mn²&spplus; Ionen einschließen. Das Vorhandensein des Peptids und der Metallionen kann mit Verwendung des Glycoproteins in irgendeinem Test für Anti-HPA Antikörper in Wechselwirkung treten. Ferner schlägt Kirchhoffer nicht die Verwendung von genotypisierten Thrombozyten vor.
- R. Kekomaki et al (J. Clin. Invest., 88, 847-854, 1991) (Entgegenhaltung 10) reinigte GP IIB/IIIa durch Adsorption auf SepharoseRTM unter Erzielen einer groben Trennung, gefolgt von Entfernung von verbleibenden Kontaminanten durch Durchleitung über eine Heparin-SepharoseRTM Säule, Gelitration mit SephacrylRTM S-300 und Entfernung von Spurenmengen von Fibrinogen durch Weizenkeimagglutininaffinitätschromatographie.
- Jedoch offenbaren diese Entgegenhaltungen nicht einen Immungssay, geeignet für den Nachweis von HPA Antikörpern gemäß spezifischer Genotypen.
- Die gegenwärtige Erfindung liefert in einer Hinsicht einen Immungssay für den immunologischen Nachweis eines Antikörpers an Humanthrombozytenantigen 1 und/oder 3 (HPA1 und/oder HPA3), der umfaßt ein festes Substrat, das darauf überzogen hat gereinigtes genotypisiertes Glycoproteinantigen GPIIIa vom Genotyp HPA1a1a oder HPA1b1b und/oder GPIIb vom Genotyp HPA3a3a oder HPA3b3b, wobei das (die) Glycoprotein(e) im wesentlichen frei von Peptid, einschließend eine RGD Sequenz, und von Mg²&spplus; und/oder Mn²&spplus; Ionen ist (sind).
- Die gegenwärtige Erfindung liefert in einem weiteren Aspekt einen Immungssay für den immunologischen Nachweis eines Antikörpers an Humanthrombozytenantigen 1a und/oder 3a (HPA1a und/oder HPA3a), der umfaßt ein festes Substrat, das darauf überzogen hat gereinigtes genotypisiertes Glycoproteinantigen GPIIb/IIIa vom Genotyp HPA1a1a/3a3a, HP1a1a/3b3b und/oder HPA1b1b/3a3a, wobei das (die) Glycoprotein(e) im wesentlichen frei von Peptid, einschließend eine RGD Sequenz, und von Mg²&spplus; und/oder Mn²&spplus; Ionen ist (sind).
- Die gegenwärtige Erfindung bezieht sich auf einen Immungssay für den immunologischen Nachweis eines Antikörpers an Humanthrombozytenantigen 1, 3, 1a, 1b, 3a oder 3b (HPA1, HPA3, HPA1a, HPA1b, HPA3a oder HPA3b), der umfaßt ein festes Substrat mit darauf überzogenem gereinigtem genotypisierten Glycoproteinantigen GPIIIa vom Genotyp HPA1a1a oder HPA1b1b, GPIIb vom Genotyp HPA3a3a oder HPA3b3b und/oder GPIIb/IIIa vom Genotyp HPA1a1a/3a3a, HPA1a1a/3b3b und/oder HPA1b1b/3a3a, wobei das (die) Glycoprotein(e) im wesentlichen frei ist (sind) von Peptid, einschließend eine RGD Sequenz, und von Mg²&spplus; und/oder Mn²&spplus; Ionen.
- Somit ist festgestellt worden, daß Anti-HPA1 und Anti-HPA3 Antikörper eine beträchtliche Rolle spielen, insbesondere bei NAITP.
- Genotypisieren von Thrombozyten wurde durchgeführt unter Verwenden der Techniken, beschrieben in Williamson et al. (1992)(Entgegenhaltung 11). Zuvor ist festgestellt worden, daß die antigenen allelen Unterschiede (HPA-1-4) auf Polymorphismen, enthalten in der DNA, die das Thrombozytenglycoprotein codiert, beruhen.
- Es ist möglich, die Thrombozyten eines Donors oder Patienten unter Verwenden von Molekulartechniken zu typisieren. Dieses wird durch Verstärken von extrahierter genomischer DNA unter Verwenden der Polymerasekettenreaktion (PCR) und dann Aussetzen dieser Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus (RFLP) Analyse erzielt. Auf diese Weise können Thrombozyten, enthaltend das HPA1a, HPA1b, HPA3a oder HPA3b oder HPA3 Antigen, identifiziert und isoliert werden.
- In einem anderen Aspekt liefert die Erfindung ein Immungssayverfahren für den in vitro Nachweis von Antikörpern, spezifisch gegenüber Humanthrombozytenantigen 1a, 1b und/oder 3a, 3b (HPA1a, HPA1b und/oder HPA3a, HPA3b) in Serum, das umfaßt
- - Überziehen einer Mikrotiterplatte mit gereinigtem genotypisierten Glycoproteinantigen GPIIIa vom Genotyp HPA1a1a und/oder HPA1b1b und/oder GPIIb vom Genotyp HPA3a3a und/oder HPA3b3b, wobei das (die) Glycoprotein(e) im wesentlichen frei von Peptid, einschließend eine RGD Sequenz, und von Mg²&spplus; und/oder Mn²&spplus; Ionen ist (sind),
- - nicht spezifisch Blockieren,
- - in Kontakt bringen mit zu testendem Serum und
- - Nachweisen des Vorhandenseins irgendeines Immunkomplexes, gebildet zwischen dem immobilisierten Glycoproteinantigen und irgendeinem Anti-HPA1 oder Anti-HPA3 Antikörper, vorhanden in dem Serum.
- Im allgemeinen wird der Immunkomplex geschätzt mittels Anti-Human IgG oder IgM, markiert mit einer angemessenen Markierung, wie einer Enzymmarkierung (beispielsweise Meerrettichperoxidase HRP), einer Radiomarkierung, einer Fluoreszenzmarkierung oder anderem in der Technik bekanntem Markierungssystem. Unter Verwenden einer Enzymmarkierung kann ein Enzym-gekoppelter Immunsorbensassay (ELISA) zur Verfügung gestellt werden, der empfindlich, spezifisch, billig, schnell ist und potentiell in großem Durchmusterungsumfang in bezug auf Anti-HPA1 Antikörper verwendet werden könnte. Vorteilhafterweise ist festgestellt worden, daß die Inkubationen, verwickelt in die Herstellung des Immunkomplexes, und die Schätzung davon mit markiertem Antikörper bei Raumtemperatur durchgeführt werden können und somit nicht die Verwendung eines Inkubators erfordern.
- Die Erfindung basiert auf der Verwendung von im wesentlichen reinem Humanthrombozytenantigen, um die benötigte HPA Antikörper nachzuweisen. Die antigene Determinante für HPA1 ist auf der GPIIIa Untereinheit vorhanden, so daß irgendein Immungssay für Anti-HPA1 Antikörper das HPAI Antigen der Glycoprotein GPIIIa Untereinheit einschließen muß. Anti-HPA1 Antikörper existieren auch als Typen 1a und 1b, so daß, um Anti-HPA1a Antikörper nachzuweisen, Antigen HPA1a von Glycoprotein GPIIIa Untereinheit ausgewählt werden muß. Es ist festgestellt worden, daß etwa 98% des Vorkommens von NAITP auf dem Vorhandensein von Anti-HPA1a oder Anti-HPA3a Antikörpern beruht, wobei das Vorherrschen der erstgenannten etwa vierfach der letztgenannten ist. Somit sollte ein definitiver Test für NAITP auch Anti-HPA3a Antikörper einschließen (HPA3 existiert analog als Antigene 3a und 3b). Die antigene Determinante für HPA3 liegt auf der GPIIb Untereinheit, die deshalb in einem Immungssay für Anti-HPA3a Antikörper eingeschlossen sein sollte.
- Um zu prüfen, ob die Antikörper auf HPAIa oder HPA1b (oder HPA3a oder HPA3b) gelenkt sind, kann das entsprechende Antigen oder Antigenmischung in getrennten Vertiefungen der Mikrotiterplatte, beispielsweise HPA1a1a/3a3a, HPA1b1b/3b3b, HPA1a1a/3b3b oder HPA1b1b/3a3a (jedes gereinigt aus entsprechenden genotypisierten apherisierten Thrombozyten) zur Verfügung gestellt werden.
- Eine praktische Ausführungsform der Erfindung, wie in den Ansprüchen definiert, umfaßt eine Multivertiefungsmikrotiterplatte für enzymgekoppelten Immungssay (ELISA) mit einer Vertiefung, enthaltend HPA1a1a/3b3b Antigen (zum Nachweisen von Anti-HPA1a Antikörpern) und eine Vertiefung, getrennt enthaltend HPA1b1b/3a3a Antigen (zum Nachweisen von Anti-HPA3a Antikörpern), und wahlfrei eine Vertiefung ohne Antigen, als eine Kontrolle zu wirken. Typischerweise enthält jede Vertiefung 0,05 bis 0,5 Mikrogramm pro Vertiefung, vorzugsweise 0,1 Mikrogramm, Glycoprotein.
- Die Vertiefungen werden im allgemeinen mit einer nicht-spezifischen Proteinmischung blockiert, wie Rinderserumalbumin, vor in Kontakt treten mit Blutserum.
- Es wird auch ein Verfahren für die Reinigung von Humanthrombozytenantigenglycoprotein GPIIb und/oder GPIIIa beschrieben, das umfaßt:
- (a) zur Verfügung stellen von genotypisierten Humanthrombozyten,
- (b) Lysieren der Thrombozyten unter Bilden eines Lysats,
- (c) Anwenden des Lysats auf ein Affinitätschromatographiesubstrat, das ein Peptid, einschließend die Sequenz Arg-Gly-Asp (RGD), daran gekoppelt hat, und
- (d) Eluieren von genotypisiertem Glycoprotein.
- Beispiele der gegenwärtigen Erfindung werden jetzt nur mittels Beispiel beschrieben unter Bezugnahme auf die Figuren, die zeigen;
- Fig. 1 zeigt das Binden von Anti-GPIIIa, IIb und Ib monoklonalen Antikörpern (MAb) (50, 250 und 1000 ng/ml) an verschiedene Mengen von aufgetragenem HPA;
- Fig. 2 zeigt die Empfindlichkeit des HPA1a ELISA unter Verwenden von zwei Anti-HPA1a Seren, und
- Fig. 3 zeigt ein praktisches Beispiel von HPA1a ELISA als einen diagnostischer Test.
- Reagenzien waren von dem Analar Grad und wurden von BDH Chemicals Ltd. (UK) oder Aldrich Chemicals Ltd (UK) gekauft: Anti-GPIIb und IIb/IIIa monoklonale Antikörper (MAb) wurden von dem Institute for Clinical Immunology and Transfusion Medicine, Justus Liebig Universität, Gießen, zur Verfügung gestellt. Anti-GP1b und IIIa MAb wurden von Dakopatts (Dänemark) gekauft. HRPkonjugiertes Schaf Anti-Human IgG und IgM wurden von der Scottish Antibody Production Unit erhalten, während HRP-konjugiertes Ziegen Anti-Maus IgG und IgM von Bio-Rad (UK) gekauft wurden. Anti- HPA1a und normale Seren wurden von Müttern von Babies mit NAITP und freiwilligen Donatoren aus unserem Zentrum erhalten.
- Die Extraktion und Reinigung von GP IIb/IIIa basierte auf den Verfahren von Pytela et al und Kirchhoffer et al mit einigen wenigen Modifikationen (Entgegenhaltungen 8, 9). Kurz, eine Einheit von genotypisierten, apherisierten Thrombozyten (erhalten von dem Cambridge Transfusion Centre) wurde gewaschen und die Thrombozyten mit 10 ml 100 mM Octylglucopyranosid (OG) und 2 mM Phenylmethylsulfonylfluorid (Sigma, UK) in Puffer, enthaltend 50 mM Tris/HCl und 150 mM NaCl, pH 7,5 (TBS), extrahiert. Der Extrakt wurde dann zentrifugiert und der Überstand mit Kationen (Entgegenhaltung 9) ergänzt und Ende-über-Ende mit 2 g immobilisiertem Heptapeptid von Sequenz GRGDSPK (Peptid von Novablochem, UK; und CNBr aktivierte SepharoseRTM 4B von Pharmacia) bei 12 mg Peptid/g SepharoseRTM 4B über Nacht bei 4ºC gemischt. Die Kugeln wurden dann in einer Bankzentrifuge (MSE, UK) bei 1000 Upm 5 Minuten bei Raumtemperatur (RT) zentrifugiert und der Überstand entfernt. Die Kugeln wurden mittels Zentrifugation gewaschen, bis Absorptionsvermögen bei 280 nm auf < 0,05 (Pye Unicam Philips, UK) fiel, anzeigend, daß nicht spezifisch-gebundene Proteinverunreinigung weggewaschen worden war. Das Glycoprotein bindet an das auf die SepharoseRTM Kugeln immobilisierte Heptapeptid. Dann wurde das gebundene GP IIb/IIIa eluiert durch Mischen der Kugeln dreimal mit 5 ml 1 mM MgCl&sub2; und 1 mM MnCl&sub2; in TBS Ende-über-Ende für 15 Minuten bei Raumtemperatur, wobei der erste Mischpuffer 1 mg/ml GRGDSP Hexapeptid (Novablochem, UK) enthielt. Die Verwendung von Hexapeptid in dem Elutionspuffer konkurriert mit dem immobilisierten Peptid und befreit einen Hexapeptid-Glycoproteinkomplex. Die Elution wurde dreimal wiederholt. Die drei Eluatüberstände, geerntet durch Zentrifugation, wie zuvor angegeben, wurden gesammelt und einmal zentrifugiert unter Entfernen von restlichen Kugelteilchen. Nach Aufzeichnen des Absorptionsvermögens des Eluats wurde es zweimal bei 4ºC gegen 11 10 mM Tris/HCl, 150 mM NaCl, pH 7,4 dialysiert. Dialyse ist wirksam zum Entfernen des Peptids und restlicher Metallionen und zum Belassen von freiem Glycoprotein. Peptidmoleküle gehen durch die Dialysemembran und zerstören das Bildungs- /Dissoziationsgleichgewicht des Komplexes zugunsten von Dissoziation zu dem freien GP IIb/IIIa. Somit wird das Glycoprotein im wesentlichen frei von Peptid und frei von Metallionen sein. Ein monoklonaler Antikörper zum GP IIb/IIIa Komplex, gekauft von Binding Site Ltd., Birmingham, UK, band mit größerer Affinität an nicht-dialysiertes GP IIb/IIIa als an dialysiertes Glycoprotein. Dieses zeigt an, daß das Glycoprotein im wesentlichen frei von Peptid und Metallionen war, somit größtenteils nicht-komplexiert. Letztendlich wurde das Absorptionsvermögen des dialysierten Eluats aufgezeichnet, und es wurde in Aliquoten bei -40ºC gelagert. Das immobilisierte RGD Peptid wurde gewaschen und bei 4ºC für Wiederverwendung gelagert. Die Proteinkonzentration und Reinheit des GP IIb/IIIa wurde mit dem Bicinchoninic Assay (Pierce, UK) und SDA-PAGE (Silberfärbung) wie zuvor untersucht (10). Bis zu 1,4 mg GP IIb/IIIa konnten von einer Einheit von apherisiertem Thrombozytenkonzentrat mit über 90% Reinheit erhalten werden.
- Mikrotiterplatten (Greiner, Deutschland) wurden mit 1, 2 oder 3 ug/ml (100 ul pro Vertiefung) von einem der folgenden genotypisierten ITh/IIIa Glycoproteine überzogen: HPA1a1a/3a3a, HPA1b1b/3b3b, HPA1a1a/3b3b oder HPA1b1b/3a3a (Überzugspuffer nur eingeschlossen auch für Hintergrund) über Nacht bei 37ºC (ELISA Überziehen, Waschen und Farbentwicklungspuffer und Waschverfahren waren wie in Entgegenhaltung 12). Die Vertiefungen wurden gewaschen und mit 5% Rinderserumalbumin (Boseral; Organon Technika) in Überzugspuffer (300 ul/Vertiefung) 1 Stunde bei 37ºC blockiert. Nach Waschen wurden die Platten mit Verdünnungen von Humanseren oder Maus MAbs bei 100 ul/Vertiefung als Triplikat 1 Stunde bei 37ºC inkubiert. Die Vertiefungen wurden erneut gewaschen und mit HRP- konjugiertem Anti-Human IgG oder IgM oder Anti-Maus IgG oder IgM 1 Stunde bei 37ºC inkubiert. Alternativ können alle Inkubationen bei Raumtemperatur durchgeführt werden. Letztendlich wurden die Platten gewaschen und farbentwickelt unter Verwenden von Tetramethylbenzidin als kolorimetrisches Substrat (Farbentwicklung wird bei 37ºC verstärkt). Spezifisches Absorptionsvermögen bei 450 nm war gleich dem Absorptionsvermögen in GP überzogenen Vertiefungen minus dem Absorptionsvennögen in Vertiefungen mit nur Überzugspuffer. Humantest- und Kontrollproben wurden unter Verwenden von Serumverdünnungen von 1 in 5 durchgemustert.
- Es gab ein spezifisches und dosisabhängiges Binden von überzogenem GP IIb/IIIa an entsprechende MAbs (Fig. I), das das Vorhandensein von GPIIIa und GPIIb zeigt. Zum Vergleich band Anti-GPIb bei relativ hohen Konzentrationen nicht an die höchste Menge von aufgetragenem GP IIb/IIIa. Spezifisches Binden wurde auch mit Anti-GP IIb/IIIa MAb (Daten nicht gezeigt) beobachtet. Ferner wurde unter Verwenden von zwei Human Anti-HPA1a positiven Seren (mit normalem Serum als negativer Kontrolle) der Assay befunden, hoch empfindlich bei Verdünnungen von 1 : 80 bis 1 : 160 zu sein (Fig. 2). Tatsächlich ist der Assay befunden, fähig zu sein, bei Verdünnungen von positiven Seren von 1 : 1000 bis 1 : 3000 durchgeführt zu werden. Die Spezifität des Assays wurde ferner gezeigt, als Anti-HPA1a Antiseren nur an HPA1a1a/3a3a und HPA1a1a/3b3b und nicht an HPA1b1b/3a3a und HPA1b1b/3b3b (Daten nicht gezeigt) banden.
- Mikrotiterplatten, überzogen mit HPA1a1a/3a3a oder HPA1b1b/3b3b über Nacht, gewaschen, luftgetrocknet und verschlossen, wurden bei 4ºC belassen. Assays, durchgeführt wöchentlich danach bis zu 12 Wochen unter Verwenden dieser Platten, zeigten konsistentes und spezifisches Binden von zwei Anti- HPA1a Seren aber nicht normalem Serum (Daten nicht gezeigt). Weitere Ergebnisse bis heute zeigen an, daß Platten, gelagert bis zu 11 Monate bei -20ºC, ähnlich wirken, und die Prüfung von überzogenen Platten, gelagert bei 4ºC und -20ºC, ist fortführend.
- Die Geeignetheit von ELISA für das Durchmustern von Human Anti-HPA1a Seren wurde untersucht unter Verwenden von Seren von Müttern und Babies mit NAITP. Eindunddreißig Seren positiv in bezug auf Anti-HPA1a Antikörper, zwei und acht Seren, die negativ und schwach in bezug auf Anti- HPA1a waren, und vier Seren, deren Antikörperstatus unbekannt war (alle bestimmt mittels PSIFT und MAIPA), wurden von CLB, Amsterdam zur Verfügung gestellt und blind in dem ELISA getestet. Anschließende Analyse der Ergebnisse zeigte 29/31 Übereinstimmung von positiven Seren; 6/8 Übereinstimmung von schwachen Seren, wobei die anderen zwei negativ in dem ELISA waren; die zwei negativen Seren waren positiv in dem ELISA; und von den vier unklaren Seren waren zwei schwach positiv und zwei reagierten mit nicht überzogenen Vertiefungen (ähnliche Korrelationen wurden beobachtet, als überzogene Platten zu CLB für ELISA geschickt wurden). Folgende Ergebnisse haben eine vollständige Korrelation zwischen dem ELISA und dem Fang-P Assay (Immucor Inc., USA) gezeigt, der ein Hämagglutinationsassay unter Verwenden behandelter roter Blutzellen ist.
- Ein weiterer Nutzen des ELISA ist in Fig. 3 gezeigt.
- Ein sechzig Jahre alter weiblicher Patient, der sich einem Koronarbypass unterzogen hatte, gefolgt von Thrombozytentransfusion, erlitt eine schwere Thrombozytopenie etwa eine Woche später. Weil sie Heparin empfing, war es wichtig, die Ursache der Thrombozytopenie zu bestimmen. Unter Verwenden des ELISA waren wir fähig, innerhalb von 3,5 Stunden von Erhalten ihrer Serumprobe festzustellen, das sie starken Anti-HPA1a Antikörper enthielt.
- Andere Ergebnisse zeigen, daß der neu entwickelte ELISA ein einfacher, billiger, schneller, spezifischer und empfindlicher Assay ist. In Ausnahmefällen, wo hohe nicht-spzifische Reaktivität bei nicht überzogenen Vertiefungen auftritt, können höhere Verdünnungen verwendet werden, oder Bestätigung kann unter Verwenden eines anderen Assays gesucht werden. Jedoch sollte die Stabilität von überzogenen Platten, das Potential vom Entwickeln des ELISA für andere HPA Antikörper und seine Zugänglichkeit zu Automatisierung es ermöglichen, daß der ELISA umfassend für das Durchmustern von Anti- Thrombozytenantikörpern, einschließend Populationsuntersuchungen in großem Maßstab in bezug auf NAITP, verwendet wird.
- Ferner zeigt die Beobachtung von hoher Korrelation zwischen PSIFT/MAIPA und dem ELISA an, daß der ELISA als ein diagnostischer Test entwickelt werden könnte. Letztendlich ist es möglich, daß der ELISA aufgrund seiner erhöhten Empfindlichkeit und Zugänglichkeit Antikörper, vermißt von anderen Assays, nachweisen kann.
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- 4. BORNE, D. E. G. KR VON DEM, VER HEUGHT, F. W. A., OOSTERHOF, F., RIESZ, E. VON, BRUTEL DE LA RIVIERE, A., AND ENGELFRIET, C. P. A simple immunofluorescence test for the detection of platelet antibodies. Br. J. Haem., 39, 195-207 (1978).
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Claims (13)
1. Immungssay für den immunologischen Nachweis eines Antikörpers für
Humanthrombozytenantigen 1 und/oder 3 (HPA1 und/oder HPA3), der umfaßt ein festes Substrat mit
darauf überzogenem gereinigtem genotypisierten Glycoproteinantigen GPIIIa vom Genotyp HPA1a1a oder
HPA1b1b, und/oder GPIIb vom Genotyp HPA3a3a oder HPA3b3b, wobei das (die) Glycoprotein(e) im
wesentlichen frei ist (sind) von Peptid, einschließend eine RGD Sequenz, und von Mg²&spplus; und/oder Mn²&spplus;
Ionen.
2. Immungssay nach Anspruch 1, wobei das Substrat mit gereinigtem genotypisierten
Glycoproteinantigen GPIIb/IIIa vom Genotyp HPA1a1a/3a3a, HPA1a1a/3b3b, HPA1b1b/3a3a und/oder
HPA1b1b/3b3b überzogen ist.
3. Immungssay für den immunologischen Nachweis eines Antikörpers für
Humanthrombozytenantigen 1a und/oder 3a (HPA1a und/oder HPA3a), der umfaßt ein festes Substrat mit
darauf überzogenem gereinigten genotypisierten Glycoproteinantigen GPIIb/IIIa vom Genotyp
HPA1a1a/3a3a, HPA1a1a/3b3b und/oder HPA1b1b/3a3a, wobei das (die) Glycoprotein(e) im wesentlichen
frei ist (sind) von Peptid, einschließend eine RGD Sequenz, und von Mg²&spplus; und/oder Mn Ionen.
4. Immungssay nach einem vorhergehenden Anspruch, wobei das Glycoproteinantigen gereinigt
worden ist durch Chargenaffinitätschromatographie auf einem Affinitätssubstrat, mit einem daran
gekoppelten Peptid, einschließend die Sequenz Arg-Gly-Asp (RGD).
5. Immungssay nach Anspruch 4, wobei das Peptid die Sequenz Gly-Arg-Gly-Asp-Ser-Pro-Lys
(GRGDSPK) hat.
6. Immungssay nach einem vorhergehenden Anspruch, wobei das feste Substrat eine
Multivertiefungsmikrotiterplatte ist.
7. Immungssay nach Anspruch 6 zum Durchführen eines Enzym gekoppelten Immungssays, der
ferner umfaßt
- ein nicht spezifisches Blockierungsmittel,
- ein Anti-Human-Immunglobulin, markiert mit einer Enzymmarkierung, und
- ein Substrat, fähig zum Geben einer kolorimetrischen Reaktion mit der Enzymmarkierung.
8. Immungssay nach Anspruch 7, der umfaßt eine Vertiefung, überzogen mit HPA1a1a/3b3b
Glycoprotein zum Nachweisen von Anti-HPA1a Antikörpern, und eine Vertiefung, überzogen mit
HPA1b1b/3a3a Glycoprotein zum Nachweisen von Anti-HPA3a Antikörpern.
9. Immungssay nach einem vorhergehenden Anspruch, wobei das genotypisierte Glycoproteinantigen
GPIIb und/oder GPIIIa gemäß dem folgenden Verfahren gereinigt worden ist:
(a) zur Verfügung stellen von genotypisierten Humanthrombozyten,
(b) Lysieren der Thrombozyten unter Bilden eines Lysats,
(c) Anwenden des Lysats auf ein Affinitätschromatographiesubstrat mit einem daran
gekoppelten Peptid, einschließend die Sequenz Arg-Gly-Asp (RGD), und
(d) Eluieren von genotypisiertem Glycoprotein.
10. Immungssay nach Anspruch 9, wobei das an das Affinitätssubstrat gekoppelte Peptid Gly-Arg-
Gly-Asp-Ser-Pro-Lys (GRGDSPK) ist.
11. Immungssay nach entweder Anspruch 9 oder 10, wobei das Glycoprotein eluiert wird unter
Verwenden eines Elutionsmediums, enthaltend ein Peptid, einschließend die Sequenz RGD.
12. Immungssay nach einem der Ansprüche 9 bis 11, wobei das eluierte Glycoprotein, enthaltend
daran gekoppeltes Peptid, dialysiert wird unter Entfernen von Peptid und Erzeugen von Glycoprotein ohne
gekoppeltes Peptid.
13. Immungssayverfahren für den in vitro Nachweis von Antikörpern, spezifisch für
Humanthrombozytenantigen 1a, 1b und/oder 3a, 3b (HPA1a, HPA1b und/oder HPA3a, HPA3b) in Serum,
der umfaßt
- Übeziehen eine Mikrotiterplatte mit gereinigtem genotypisiertem Glycoproteinantigen GPIIIa
vom Genotyp HPA1a1a und/oder HPA1b1b und/oder GPIIb vom Genotyp HPA3a3a und/oder HPA3b3b,
wobei das (die) Glycoprotein(e) im wesentlich frei ist von Peptid, einschließend eine RGD Sequenz, und
von Mg²&spplus; und/oder Mn²&spplus; Ionen,
- nicht spezifisch blockieren,
- in Kontakt bringen mit zu testendem Serum und
- Nachweisen des Vorhandenseins irgendeines Immunkomplexes, gebildet zwischen dem
immobolisierten Glycoproteinantigen und irgendeinem Anti-HPA1 oder Anti-HPA3 Antikörpern,
vorhanden in dem Serum.
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