DE69331549T2 - Nachweiss von anti-hpa antikörpern - Google Patents
Nachweiss von anti-hpa antikörpernInfo
- Publication number
- DE69331549T2 DE69331549T2 DE69331549T DE69331549T DE69331549T2 DE 69331549 T2 DE69331549 T2 DE 69331549T2 DE 69331549 T DE69331549 T DE 69331549T DE 69331549 T DE69331549 T DE 69331549T DE 69331549 T2 DE69331549 T2 DE 69331549T2
- Authority
- DE
- Germany
- Prior art keywords
- glycoprotein
- peptide
- antigen
- hpa1a1a
- genotyped
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title claims description 15
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 claims description 28
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 claims description 28
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 25
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 claims description 21
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 18
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 18
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 18
- IYMAXBFPHPZYIK-BQBZGAKWSA-N Arg-Gly-Asp Chemical group NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O IYMAXBFPHPZYIK-BQBZGAKWSA-N 0.000 claims description 17
- 102100025306 Integrin alpha-IIb Human genes 0.000 claims description 14
- 101710149643 Integrin alpha-IIb Proteins 0.000 claims description 14
- 102000008607 Integrin beta3 Human genes 0.000 claims description 13
- 108010020950 Integrin beta3 Proteins 0.000 claims description 13
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 13
- 102100024025 Heparanase Human genes 0.000 claims description 12
- 101001047819 Homo sapiens Heparanase Proteins 0.000 claims description 12
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims description 12
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 8
- -1 Mn2+ ions Chemical class 0.000 claims description 7
- 101100231676 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) HPA3 gene Proteins 0.000 claims description 7
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 7
- ZRVZOBGMZWVJOS-VMXHOPILSA-N (2s)-6-amino-2-[[(2s)-1-[(2s)-2-[[(2s)-2-[[2-[[(2s)-2-[(2-aminoacetyl)amino]-5-(diaminomethylideneamino)pentanoyl]amino]acetyl]amino]-3-carboxypropanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]hexanoic acid Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)CN ZRVZOBGMZWVJOS-VMXHOPILSA-N 0.000 claims description 6
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 6
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 6
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 claims description 6
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 claims description 6
- 238000000576 coating method Methods 0.000 claims description 6
- 108010064365 glycyl- arginyl-glycyl-aspartyl-seryl-prolyl-lysine Proteins 0.000 claims description 6
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 claims description 6
- 101710145634 Antigen 1 Proteins 0.000 claims description 5
- 108010072041 arginyl-glycyl-aspartic acid Proteins 0.000 claims description 5
- 239000006166 lysate Substances 0.000 claims description 5
- 101001015004 Homo sapiens Integrin beta-3 Proteins 0.000 claims description 4
- 102000057154 human ITGB3 Human genes 0.000 claims description 4
- 238000010828 elution Methods 0.000 claims description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 2
- 230000002934 lysing effect Effects 0.000 claims description 2
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 claims 1
- 239000002981 blocking agent Substances 0.000 claims 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 claims 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 claims 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 25
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 13
- 108010035030 Platelet Membrane Glycoprotein IIb Proteins 0.000 description 12
- 208000009567 Neonatal Alloimmune Thrombocytopenia Diseases 0.000 description 10
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 6
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 6
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 5
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 5
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 5
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 5
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 description 4
- 208000003441 Transfusion reaction Diseases 0.000 description 3
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 3
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 206010043554 thrombocytopenia Diseases 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- HEGSGKPQLMEBJL-RQICVUQASA-N (2r,3s,4s,5r)-2-(hydroxymethyl)-6-octoxyoxane-3,4,5-triol Chemical compound CCCCCCCCOC1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O HEGSGKPQLMEBJL-RQICVUQASA-N 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 102000015795 Platelet Membrane Glycoproteins Human genes 0.000 description 2
- 108010010336 Platelet Membrane Glycoproteins Proteins 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 2
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 2
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 2
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 2
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 2
- 238000007894 restriction fragment length polymorphism technique Methods 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NTEDOEBWPRVVSG-FQUUOJAGSA-N (2s)-1-[(2r)-2-[[(2s)-2-[[2-[[(2s)-2-[(2-aminoacetyl)amino]-5-(diaminomethylideneamino)pentanoyl]amino]acetyl]amino]-3-carboxypropanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]pyrrolidine-2-carboxylic acid Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](NC(=O)CN)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@H](CO)C(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O NTEDOEBWPRVVSG-FQUUOJAGSA-N 0.000 description 1
- YRNWIFYIFSBPAU-UHFFFAOYSA-N 4-[4-(dimethylamino)phenyl]-n,n-dimethylaniline Chemical compound C1=CC(N(C)C)=CC=C1C1=CC=C(N(C)C)C=C1 YRNWIFYIFSBPAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 102000008946 Fibrinogen Human genes 0.000 description 1
- 108010049003 Fibrinogen Proteins 0.000 description 1
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101100083853 Homo sapiens POU2F3 gene Proteins 0.000 description 1
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 208000035752 Live birth Diseases 0.000 description 1
- 229910021380 Manganese Chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- GLFNIEUTAYBVOC-UHFFFAOYSA-L Manganese chloride Chemical compound Cl[Mn]Cl GLFNIEUTAYBVOC-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 101100058850 Oryza sativa subsp. japonica CYP78A11 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150059175 PLA1 gene Proteins 0.000 description 1
- 102100026466 POU domain, class 2, transcription factor 3 Human genes 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 102100026918 Phospholipase A2 Human genes 0.000 description 1
- 101710096328 Phospholipase A2 Proteins 0.000 description 1
- BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N Silver Chemical compound [Ag] BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010046516 Wheat Germ Agglutinins Proteins 0.000 description 1
- LGDAGYXJBDILKZ-UHFFFAOYSA-N [2-methyl-1,1-dioxo-3-(pyridin-2-ylcarbamoyl)-1$l^{6},2-benzothiazin-4-yl] 2,2-dimethylpropanoate Chemical compound CC(C)(C)C(=O)OC=1C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)N(C)C=1C(=O)NC1=CC=CC=N1 LGDAGYXJBDILKZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 1
- 230000000702 anti-platelet effect Effects 0.000 description 1
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 230000023555 blood coagulation Effects 0.000 description 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N cyanogen bromide Chemical compound BrC#N ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 229940012952 fibrinogen Drugs 0.000 description 1
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 238000001879 gelation Methods 0.000 description 1
- 238000003205 genotyping method Methods 0.000 description 1
- 108010053299 glycyl-arginyl-glycyl-aspartyl-seryl-proline Proteins 0.000 description 1
- 230000035931 haemagglutination Effects 0.000 description 1
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 1
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 1
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 1
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 1
- 239000003547 immunosorbent Substances 0.000 description 1
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011565 manganese chloride Substances 0.000 description 1
- 235000002867 manganese chloride Nutrition 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 210000004897 n-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 102000054765 polymorphisms of proteins Human genes 0.000 description 1
- 230000035935 pregnancy Effects 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 229910052709 silver Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000004332 silver Substances 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 239000003634 thrombocyte concentrate Substances 0.000 description 1
- 230000002747 voluntary effect Effects 0.000 description 1
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
- G01N33/56966—Animal cells
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Virology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
- Die gegenwärtige Erfindung bezieht sich auf ein Immungssayverfahren und System für den immunologischen Nachweis von Antikörpern zu Humanthrombozytenantigen 1 oder 3 (HPA1 oder HPA3) gemäß spezifischen Genotypen und insbesondere auf einen Enzym gekoppelten Immungssay (ELISA) für ihren Nachweis.
- HPA1 ist eine polymorphe Determinante auf dem Thrombozytenmembranglycoprotein (GP)IIb/IIIa Komplex, gelegen an der N-terminalen Region von GPIIIa. Der Komplex besteht aus zwei nicht kovalent assoziierten Untereinheiten GPIIb und GPIIIa. Divalente Kationen wie Ca²&spplus; und Mg²&spplus; werden für Untereinheitsassoziierung benötigt. Die Immunität hervorrufende Eigenschaft von HPA1 führt zu einer Mannigfaltigkeit von immunvermittelten Thrombozytopenien, einschließlich Post-Transfusion Purpura (PTP) und neonatale Alloimmunthrombozytopenie (NAITP) (Entgegenhaltungen 1,2). HPA1 kann als Typen HPA1a und HPA1b existieren. Annähernd 72% der kaukasischen Bevölkerung ist homozygot in bezug auf HPA1a (Thrombozytenantigen 1, d. h. PLA1), 2% in bezug auf HPA1b (Thrombozytenantigen 2, d. h. PLA2), und 26% sind heterozygot (Entgegenhaltung 2). Obwohl PTP ein seltener Zustand ist (annähernd 200% berichtete Fälle weltweit), erscheint NAITP relativ oft mit einer Rate von 1 in 2000 Lebendgeburten, wobei etwa 50% der Fälle in erster Schwangerschaft auftreten (Entgegenhaltungen 2, 3). Bei diesen Bedingungen greifen Anti-HPA1a Antikörper (d. h. Typ 1a Antikörper) Thrombozyten an, die das HPA1a Antigen tragen, was zu Zerstörung von Thrombozyten in dem Patientenblut führt. Im Falle von NAITP offenbart sich dieses als ein Baby mit erhöhter Tendenz, zu bluten im Hinblick auf seine reduzierte Thrombozytenzahl oder verminderte Thrombozytenaktivität und folglich beeinträchtigtes Blutgerinnungssystem.
- Der frühe Nachweis von Anti-HPA1a Antikörpern kann von kritischer Bedeutung sein, da prompte Diagnose Handhabung von Patienten helfen kann, insbesondere das Typisieren der werdenden Mutter. Es gibt verschiedene Verfahren für den Nachweis von Anti-HPA1a Antikörpern, einschließlich Thrombozytensuspensionsimmunfluoreszenztest (PSIFT), monoklonale Antikörperimmobilisierung von Thrombozytenantigenen (MAIPA), Fließzytometrie und Immunsorbensassays (Entgegenhaltungen 4, 5, 6, 7). Obwohl derartige Verfahren gut etabliert sind und im Falle, wenn MAIPA, sehr empfindlich sind, sind sie zeitverbrauchend und nicht Automatisierung und Anwendung im weiten Umfang zugänglich.
- Ogden (WO 89/02079) und Newman et al (J. Cell Biol. (1981) 90, Seite 249-253) beschreiben Immungssays für den Nachweis von Antikörpern gegenüber Humanthrombozytenantigenen unter Verwenden von Thrombozytenlysaten, die an eine feste Matrix gebunden werden.
- Pytela et al (Entgegenhaltung 8) beschreiben die Bindeeigenschaften des Thrombozytenmembranglycoproteins GP IIb/IIIa an Peptide, einschließlich die Aminosäurensequenz Arg- Gly-Asp (RGD). Das Glycoprotein wurde mittels Affinitätschromatographie eines Thrombozytenextrakts unter Verwenden des Heptapeptids GRGDSPK, gekoppelt mit SepharoseRTM gereinigt.
- Kirchhoffer et al. (Entgegenhaltung 9) verwendete ein ähnliches Reinigungsverfahren unter Herstellen von reinem GP ITh/IIIa. Das auf Nitrozellulosefilter übertragene reine Glycoprotein reagierte mit monoklonalem Anti-IIB Antikörper unter Bilden eines Immunkomplexes, der unter Verwenden eines Enzym markierten zweiten Antikörpers offenbart wurde. Das Eluat von der Affinitätschromatographie umfaßt das Hexapeptid, gekoppelt an das Glycoprotein, und kann auch Mg²&spplus; und Mn²&spplus; Ionen einschließen. Das Vorhandensein des Peptids und der Metallionen kann mit Verwendung des Glycoproteins in irgendeinem Test für Anti-HPA Antikörper in Wechselwirkung treten. Ferner schlägt Kirchhoffer nicht die Verwendung von genotypisierten Thrombozyten vor.
- R. Kekomaki et al (J. Clin. Invest., 88, 847-854, 1991) (Entgegenhaltung 10) reinigte GP IIB/IIIa durch Adsorption auf SepharoseRTM unter Erzielen einer groben Trennung, gefolgt von Entfernung von verbleibenden Kontaminanten durch Durchleitung über eine Heparin-SepharoseRTM Säule, Gelitration mit SephacrylRTM S-300 und Entfernung von Spurenmengen von Fibrinogen durch Weizenkeimagglutininaffinitätschromatographie.
- Jedoch offenbaren diese Entgegenhaltungen nicht einen Immungssay, geeignet für den Nachweis von HPA Antikörpern gemäß spezifischer Genotypen.
- Die gegenwärtige Erfindung liefert in einer Hinsicht einen Immungssay für den immunologischen Nachweis eines Antikörpers an Humanthrombozytenantigen 1 und/oder 3 (HPA1 und/oder HPA3), der umfaßt ein festes Substrat, das darauf überzogen hat gereinigtes genotypisiertes Glycoproteinantigen GPIIIa vom Genotyp HPA1a1a oder HPA1b1b und/oder GPIIb vom Genotyp HPA3a3a oder HPA3b3b, wobei das (die) Glycoprotein(e) im wesentlichen frei von Peptid, einschließend eine RGD Sequenz, und von Mg²&spplus; und/oder Mn²&spplus; Ionen ist (sind).
- Die gegenwärtige Erfindung liefert in einem weiteren Aspekt einen Immungssay für den immunologischen Nachweis eines Antikörpers an Humanthrombozytenantigen 1a und/oder 3a (HPA1a und/oder HPA3a), der umfaßt ein festes Substrat, das darauf überzogen hat gereinigtes genotypisiertes Glycoproteinantigen GPIIb/IIIa vom Genotyp HPA1a1a/3a3a, HP1a1a/3b3b und/oder HPA1b1b/3a3a, wobei das (die) Glycoprotein(e) im wesentlichen frei von Peptid, einschließend eine RGD Sequenz, und von Mg²&spplus; und/oder Mn²&spplus; Ionen ist (sind).
- Die gegenwärtige Erfindung bezieht sich auf einen Immungssay für den immunologischen Nachweis eines Antikörpers an Humanthrombozytenantigen 1, 3, 1a, 1b, 3a oder 3b (HPA1, HPA3, HPA1a, HPA1b, HPA3a oder HPA3b), der umfaßt ein festes Substrat mit darauf überzogenem gereinigtem genotypisierten Glycoproteinantigen GPIIIa vom Genotyp HPA1a1a oder HPA1b1b, GPIIb vom Genotyp HPA3a3a oder HPA3b3b und/oder GPIIb/IIIa vom Genotyp HPA1a1a/3a3a, HPA1a1a/3b3b und/oder HPA1b1b/3a3a, wobei das (die) Glycoprotein(e) im wesentlichen frei ist (sind) von Peptid, einschließend eine RGD Sequenz, und von Mg²&spplus; und/oder Mn²&spplus; Ionen.
- Somit ist festgestellt worden, daß Anti-HPA1 und Anti-HPA3 Antikörper eine beträchtliche Rolle spielen, insbesondere bei NAITP.
- Genotypisieren von Thrombozyten wurde durchgeführt unter Verwenden der Techniken, beschrieben in Williamson et al. (1992)(Entgegenhaltung 11). Zuvor ist festgestellt worden, daß die antigenen allelen Unterschiede (HPA-1-4) auf Polymorphismen, enthalten in der DNA, die das Thrombozytenglycoprotein codiert, beruhen.
- Es ist möglich, die Thrombozyten eines Donors oder Patienten unter Verwenden von Molekulartechniken zu typisieren. Dieses wird durch Verstärken von extrahierter genomischer DNA unter Verwenden der Polymerasekettenreaktion (PCR) und dann Aussetzen dieser Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus (RFLP) Analyse erzielt. Auf diese Weise können Thrombozyten, enthaltend das HPA1a, HPA1b, HPA3a oder HPA3b oder HPA3 Antigen, identifiziert und isoliert werden.
- In einem anderen Aspekt liefert die Erfindung ein Immungssayverfahren für den in vitro Nachweis von Antikörpern, spezifisch gegenüber Humanthrombozytenantigen 1a, 1b und/oder 3a, 3b (HPA1a, HPA1b und/oder HPA3a, HPA3b) in Serum, das umfaßt
- - Überziehen einer Mikrotiterplatte mit gereinigtem genotypisierten Glycoproteinantigen GPIIIa vom Genotyp HPA1a1a und/oder HPA1b1b und/oder GPIIb vom Genotyp HPA3a3a und/oder HPA3b3b, wobei das (die) Glycoprotein(e) im wesentlichen frei von Peptid, einschließend eine RGD Sequenz, und von Mg²&spplus; und/oder Mn²&spplus; Ionen ist (sind),
- - nicht spezifisch Blockieren,
- - in Kontakt bringen mit zu testendem Serum und
- - Nachweisen des Vorhandenseins irgendeines Immunkomplexes, gebildet zwischen dem immobilisierten Glycoproteinantigen und irgendeinem Anti-HPA1 oder Anti-HPA3 Antikörper, vorhanden in dem Serum.
- Im allgemeinen wird der Immunkomplex geschätzt mittels Anti-Human IgG oder IgM, markiert mit einer angemessenen Markierung, wie einer Enzymmarkierung (beispielsweise Meerrettichperoxidase HRP), einer Radiomarkierung, einer Fluoreszenzmarkierung oder anderem in der Technik bekanntem Markierungssystem. Unter Verwenden einer Enzymmarkierung kann ein Enzym-gekoppelter Immunsorbensassay (ELISA) zur Verfügung gestellt werden, der empfindlich, spezifisch, billig, schnell ist und potentiell in großem Durchmusterungsumfang in bezug auf Anti-HPA1 Antikörper verwendet werden könnte. Vorteilhafterweise ist festgestellt worden, daß die Inkubationen, verwickelt in die Herstellung des Immunkomplexes, und die Schätzung davon mit markiertem Antikörper bei Raumtemperatur durchgeführt werden können und somit nicht die Verwendung eines Inkubators erfordern.
- Die Erfindung basiert auf der Verwendung von im wesentlichen reinem Humanthrombozytenantigen, um die benötigte HPA Antikörper nachzuweisen. Die antigene Determinante für HPA1 ist auf der GPIIIa Untereinheit vorhanden, so daß irgendein Immungssay für Anti-HPA1 Antikörper das HPAI Antigen der Glycoprotein GPIIIa Untereinheit einschließen muß. Anti-HPA1 Antikörper existieren auch als Typen 1a und 1b, so daß, um Anti-HPA1a Antikörper nachzuweisen, Antigen HPA1a von Glycoprotein GPIIIa Untereinheit ausgewählt werden muß. Es ist festgestellt worden, daß etwa 98% des Vorkommens von NAITP auf dem Vorhandensein von Anti-HPA1a oder Anti-HPA3a Antikörpern beruht, wobei das Vorherrschen der erstgenannten etwa vierfach der letztgenannten ist. Somit sollte ein definitiver Test für NAITP auch Anti-HPA3a Antikörper einschließen (HPA3 existiert analog als Antigene 3a und 3b). Die antigene Determinante für HPA3 liegt auf der GPIIb Untereinheit, die deshalb in einem Immungssay für Anti-HPA3a Antikörper eingeschlossen sein sollte.
- Um zu prüfen, ob die Antikörper auf HPAIa oder HPA1b (oder HPA3a oder HPA3b) gelenkt sind, kann das entsprechende Antigen oder Antigenmischung in getrennten Vertiefungen der Mikrotiterplatte, beispielsweise HPA1a1a/3a3a, HPA1b1b/3b3b, HPA1a1a/3b3b oder HPA1b1b/3a3a (jedes gereinigt aus entsprechenden genotypisierten apherisierten Thrombozyten) zur Verfügung gestellt werden.
- Eine praktische Ausführungsform der Erfindung, wie in den Ansprüchen definiert, umfaßt eine Multivertiefungsmikrotiterplatte für enzymgekoppelten Immungssay (ELISA) mit einer Vertiefung, enthaltend HPA1a1a/3b3b Antigen (zum Nachweisen von Anti-HPA1a Antikörpern) und eine Vertiefung, getrennt enthaltend HPA1b1b/3a3a Antigen (zum Nachweisen von Anti-HPA3a Antikörpern), und wahlfrei eine Vertiefung ohne Antigen, als eine Kontrolle zu wirken. Typischerweise enthält jede Vertiefung 0,05 bis 0,5 Mikrogramm pro Vertiefung, vorzugsweise 0,1 Mikrogramm, Glycoprotein.
- Die Vertiefungen werden im allgemeinen mit einer nicht-spezifischen Proteinmischung blockiert, wie Rinderserumalbumin, vor in Kontakt treten mit Blutserum.
- Es wird auch ein Verfahren für die Reinigung von Humanthrombozytenantigenglycoprotein GPIIb und/oder GPIIIa beschrieben, das umfaßt:
- (a) zur Verfügung stellen von genotypisierten Humanthrombozyten,
- (b) Lysieren der Thrombozyten unter Bilden eines Lysats,
- (c) Anwenden des Lysats auf ein Affinitätschromatographiesubstrat, das ein Peptid, einschließend die Sequenz Arg-Gly-Asp (RGD), daran gekoppelt hat, und
- (d) Eluieren von genotypisiertem Glycoprotein.
- Beispiele der gegenwärtigen Erfindung werden jetzt nur mittels Beispiel beschrieben unter Bezugnahme auf die Figuren, die zeigen;
- Fig. 1 zeigt das Binden von Anti-GPIIIa, IIb und Ib monoklonalen Antikörpern (MAb) (50, 250 und 1000 ng/ml) an verschiedene Mengen von aufgetragenem HPA;
- Fig. 2 zeigt die Empfindlichkeit des HPA1a ELISA unter Verwenden von zwei Anti-HPA1a Seren, und
- Fig. 3 zeigt ein praktisches Beispiel von HPA1a ELISA als einen diagnostischer Test.
- Reagenzien waren von dem Analar Grad und wurden von BDH Chemicals Ltd. (UK) oder Aldrich Chemicals Ltd (UK) gekauft: Anti-GPIIb und IIb/IIIa monoklonale Antikörper (MAb) wurden von dem Institute for Clinical Immunology and Transfusion Medicine, Justus Liebig Universität, Gießen, zur Verfügung gestellt. Anti-GP1b und IIIa MAb wurden von Dakopatts (Dänemark) gekauft. HRPkonjugiertes Schaf Anti-Human IgG und IgM wurden von der Scottish Antibody Production Unit erhalten, während HRP-konjugiertes Ziegen Anti-Maus IgG und IgM von Bio-Rad (UK) gekauft wurden. Anti- HPA1a und normale Seren wurden von Müttern von Babies mit NAITP und freiwilligen Donatoren aus unserem Zentrum erhalten.
- Die Extraktion und Reinigung von GP IIb/IIIa basierte auf den Verfahren von Pytela et al und Kirchhoffer et al mit einigen wenigen Modifikationen (Entgegenhaltungen 8, 9). Kurz, eine Einheit von genotypisierten, apherisierten Thrombozyten (erhalten von dem Cambridge Transfusion Centre) wurde gewaschen und die Thrombozyten mit 10 ml 100 mM Octylglucopyranosid (OG) und 2 mM Phenylmethylsulfonylfluorid (Sigma, UK) in Puffer, enthaltend 50 mM Tris/HCl und 150 mM NaCl, pH 7,5 (TBS), extrahiert. Der Extrakt wurde dann zentrifugiert und der Überstand mit Kationen (Entgegenhaltung 9) ergänzt und Ende-über-Ende mit 2 g immobilisiertem Heptapeptid von Sequenz GRGDSPK (Peptid von Novablochem, UK; und CNBr aktivierte SepharoseRTM 4B von Pharmacia) bei 12 mg Peptid/g SepharoseRTM 4B über Nacht bei 4ºC gemischt. Die Kugeln wurden dann in einer Bankzentrifuge (MSE, UK) bei 1000 Upm 5 Minuten bei Raumtemperatur (RT) zentrifugiert und der Überstand entfernt. Die Kugeln wurden mittels Zentrifugation gewaschen, bis Absorptionsvermögen bei 280 nm auf < 0,05 (Pye Unicam Philips, UK) fiel, anzeigend, daß nicht spezifisch-gebundene Proteinverunreinigung weggewaschen worden war. Das Glycoprotein bindet an das auf die SepharoseRTM Kugeln immobilisierte Heptapeptid. Dann wurde das gebundene GP IIb/IIIa eluiert durch Mischen der Kugeln dreimal mit 5 ml 1 mM MgCl&sub2; und 1 mM MnCl&sub2; in TBS Ende-über-Ende für 15 Minuten bei Raumtemperatur, wobei der erste Mischpuffer 1 mg/ml GRGDSP Hexapeptid (Novablochem, UK) enthielt. Die Verwendung von Hexapeptid in dem Elutionspuffer konkurriert mit dem immobilisierten Peptid und befreit einen Hexapeptid-Glycoproteinkomplex. Die Elution wurde dreimal wiederholt. Die drei Eluatüberstände, geerntet durch Zentrifugation, wie zuvor angegeben, wurden gesammelt und einmal zentrifugiert unter Entfernen von restlichen Kugelteilchen. Nach Aufzeichnen des Absorptionsvermögens des Eluats wurde es zweimal bei 4ºC gegen 11 10 mM Tris/HCl, 150 mM NaCl, pH 7,4 dialysiert. Dialyse ist wirksam zum Entfernen des Peptids und restlicher Metallionen und zum Belassen von freiem Glycoprotein. Peptidmoleküle gehen durch die Dialysemembran und zerstören das Bildungs- /Dissoziationsgleichgewicht des Komplexes zugunsten von Dissoziation zu dem freien GP IIb/IIIa. Somit wird das Glycoprotein im wesentlichen frei von Peptid und frei von Metallionen sein. Ein monoklonaler Antikörper zum GP IIb/IIIa Komplex, gekauft von Binding Site Ltd., Birmingham, UK, band mit größerer Affinität an nicht-dialysiertes GP IIb/IIIa als an dialysiertes Glycoprotein. Dieses zeigt an, daß das Glycoprotein im wesentlichen frei von Peptid und Metallionen war, somit größtenteils nicht-komplexiert. Letztendlich wurde das Absorptionsvermögen des dialysierten Eluats aufgezeichnet, und es wurde in Aliquoten bei -40ºC gelagert. Das immobilisierte RGD Peptid wurde gewaschen und bei 4ºC für Wiederverwendung gelagert. Die Proteinkonzentration und Reinheit des GP IIb/IIIa wurde mit dem Bicinchoninic Assay (Pierce, UK) und SDA-PAGE (Silberfärbung) wie zuvor untersucht (10). Bis zu 1,4 mg GP IIb/IIIa konnten von einer Einheit von apherisiertem Thrombozytenkonzentrat mit über 90% Reinheit erhalten werden.
- Mikrotiterplatten (Greiner, Deutschland) wurden mit 1, 2 oder 3 ug/ml (100 ul pro Vertiefung) von einem der folgenden genotypisierten ITh/IIIa Glycoproteine überzogen: HPA1a1a/3a3a, HPA1b1b/3b3b, HPA1a1a/3b3b oder HPA1b1b/3a3a (Überzugspuffer nur eingeschlossen auch für Hintergrund) über Nacht bei 37ºC (ELISA Überziehen, Waschen und Farbentwicklungspuffer und Waschverfahren waren wie in Entgegenhaltung 12). Die Vertiefungen wurden gewaschen und mit 5% Rinderserumalbumin (Boseral; Organon Technika) in Überzugspuffer (300 ul/Vertiefung) 1 Stunde bei 37ºC blockiert. Nach Waschen wurden die Platten mit Verdünnungen von Humanseren oder Maus MAbs bei 100 ul/Vertiefung als Triplikat 1 Stunde bei 37ºC inkubiert. Die Vertiefungen wurden erneut gewaschen und mit HRP- konjugiertem Anti-Human IgG oder IgM oder Anti-Maus IgG oder IgM 1 Stunde bei 37ºC inkubiert. Alternativ können alle Inkubationen bei Raumtemperatur durchgeführt werden. Letztendlich wurden die Platten gewaschen und farbentwickelt unter Verwenden von Tetramethylbenzidin als kolorimetrisches Substrat (Farbentwicklung wird bei 37ºC verstärkt). Spezifisches Absorptionsvermögen bei 450 nm war gleich dem Absorptionsvermögen in GP überzogenen Vertiefungen minus dem Absorptionsvennögen in Vertiefungen mit nur Überzugspuffer. Humantest- und Kontrollproben wurden unter Verwenden von Serumverdünnungen von 1 in 5 durchgemustert.
- Es gab ein spezifisches und dosisabhängiges Binden von überzogenem GP IIb/IIIa an entsprechende MAbs (Fig. I), das das Vorhandensein von GPIIIa und GPIIb zeigt. Zum Vergleich band Anti-GPIb bei relativ hohen Konzentrationen nicht an die höchste Menge von aufgetragenem GP IIb/IIIa. Spezifisches Binden wurde auch mit Anti-GP IIb/IIIa MAb (Daten nicht gezeigt) beobachtet. Ferner wurde unter Verwenden von zwei Human Anti-HPA1a positiven Seren (mit normalem Serum als negativer Kontrolle) der Assay befunden, hoch empfindlich bei Verdünnungen von 1 : 80 bis 1 : 160 zu sein (Fig. 2). Tatsächlich ist der Assay befunden, fähig zu sein, bei Verdünnungen von positiven Seren von 1 : 1000 bis 1 : 3000 durchgeführt zu werden. Die Spezifität des Assays wurde ferner gezeigt, als Anti-HPA1a Antiseren nur an HPA1a1a/3a3a und HPA1a1a/3b3b und nicht an HPA1b1b/3a3a und HPA1b1b/3b3b (Daten nicht gezeigt) banden.
- Mikrotiterplatten, überzogen mit HPA1a1a/3a3a oder HPA1b1b/3b3b über Nacht, gewaschen, luftgetrocknet und verschlossen, wurden bei 4ºC belassen. Assays, durchgeführt wöchentlich danach bis zu 12 Wochen unter Verwenden dieser Platten, zeigten konsistentes und spezifisches Binden von zwei Anti- HPA1a Seren aber nicht normalem Serum (Daten nicht gezeigt). Weitere Ergebnisse bis heute zeigen an, daß Platten, gelagert bis zu 11 Monate bei -20ºC, ähnlich wirken, und die Prüfung von überzogenen Platten, gelagert bei 4ºC und -20ºC, ist fortführend.
- Die Geeignetheit von ELISA für das Durchmustern von Human Anti-HPA1a Seren wurde untersucht unter Verwenden von Seren von Müttern und Babies mit NAITP. Eindunddreißig Seren positiv in bezug auf Anti-HPA1a Antikörper, zwei und acht Seren, die negativ und schwach in bezug auf Anti- HPA1a waren, und vier Seren, deren Antikörperstatus unbekannt war (alle bestimmt mittels PSIFT und MAIPA), wurden von CLB, Amsterdam zur Verfügung gestellt und blind in dem ELISA getestet. Anschließende Analyse der Ergebnisse zeigte 29/31 Übereinstimmung von positiven Seren; 6/8 Übereinstimmung von schwachen Seren, wobei die anderen zwei negativ in dem ELISA waren; die zwei negativen Seren waren positiv in dem ELISA; und von den vier unklaren Seren waren zwei schwach positiv und zwei reagierten mit nicht überzogenen Vertiefungen (ähnliche Korrelationen wurden beobachtet, als überzogene Platten zu CLB für ELISA geschickt wurden). Folgende Ergebnisse haben eine vollständige Korrelation zwischen dem ELISA und dem Fang-P Assay (Immucor Inc., USA) gezeigt, der ein Hämagglutinationsassay unter Verwenden behandelter roter Blutzellen ist.
- Ein weiterer Nutzen des ELISA ist in Fig. 3 gezeigt.
- Ein sechzig Jahre alter weiblicher Patient, der sich einem Koronarbypass unterzogen hatte, gefolgt von Thrombozytentransfusion, erlitt eine schwere Thrombozytopenie etwa eine Woche später. Weil sie Heparin empfing, war es wichtig, die Ursache der Thrombozytopenie zu bestimmen. Unter Verwenden des ELISA waren wir fähig, innerhalb von 3,5 Stunden von Erhalten ihrer Serumprobe festzustellen, das sie starken Anti-HPA1a Antikörper enthielt.
- Andere Ergebnisse zeigen, daß der neu entwickelte ELISA ein einfacher, billiger, schneller, spezifischer und empfindlicher Assay ist. In Ausnahmefällen, wo hohe nicht-spzifische Reaktivität bei nicht überzogenen Vertiefungen auftritt, können höhere Verdünnungen verwendet werden, oder Bestätigung kann unter Verwenden eines anderen Assays gesucht werden. Jedoch sollte die Stabilität von überzogenen Platten, das Potential vom Entwickeln des ELISA für andere HPA Antikörper und seine Zugänglichkeit zu Automatisierung es ermöglichen, daß der ELISA umfassend für das Durchmustern von Anti- Thrombozytenantikörpern, einschließend Populationsuntersuchungen in großem Maßstab in bezug auf NAITP, verwendet wird.
- Ferner zeigt die Beobachtung von hoher Korrelation zwischen PSIFT/MAIPA und dem ELISA an, daß der ELISA als ein diagnostischer Test entwickelt werden könnte. Letztendlich ist es möglich, daß der ELISA aufgrund seiner erhöhten Empfindlichkeit und Zugänglichkeit Antikörper, vermißt von anderen Assays, nachweisen kann.
- 1. PUIG, N., SAYAS, M. J., MONTORO, J. A., VILLALBA, J. V. AND PLA, A. Post-transfusion purpura as the main manifestation of transfusion reaction, responsive to steroids: flow-cytometric investigation of granulocyte and platelet antibodies. Ann Hemat 62. 232-234 (1991).
- 2. NEWMAN, P. Platelet GPIIb-IIIa: Molecular variations and alloantigens. Thromb Haem., 66, 111-118 (1991).
- 3. KAPLAN, C., DAFFOS, F., FORESTIER, F., MORELL, M. C., CHESNEL, N., AND TCHERNIA, G. Current trends in neonatal allimmune thrombocytopenia: Diagnosis and therapy. In, platelet immunology fundamental and clinical aspects. Herausgeber Kaplan-Gouet, C., Schlegel, N., Salmon, Ch., McGregor, J., Inserm/John Libbey Eurotext Ltd., 206, 267-278 (1991).
- 4. BORNE, D. E. G. KR VON DEM, VER HEUGHT, F. W. A., OOSTERHOF, F., RIESZ, E. VON, BRUTEL DE LA RIVIERE, A., AND ENGELFRIET, C. P. A simple immunofluorescence test for the detection of platelet antibodies. Br. J. Haem., 39, 195-207 (1978).
- 5. KIEFEL, V. The MAIPA assay and ist applications in immunohaematology. Transfusion Med., 2, 181-188 (1992).
- 6. FREEDMAN, J., AND HORNSTEIN, A. Simple method for differentiating between HLA and platelet specific antibodies by flow cytometry. Am. J. Haem., 38, 314-320 (1991).
- 7. BORZINI, P. ELISA procedures for the characterisation of platelet specific antibodies. Evaluation of some variables. Haematologia, 76, 20-27 (1991).
- 8. PYTELA, R., PIERSCHBACHER, M. D., GINSBERG, M. H., PLOW, E. F., AND RUOSLAHTI, E. Platelet membrane glycoprotein IIb/IIIa: member of a family of Arg-Gly-Asp-spezifische Adhäsionsrezeptoren. Science, 231, 1559-1561 (1986).
- 9. KIRCHHOFFER, O., GAILIT, J., RUOSLAHTI, E., GRZESIAK, J., PIERSCHBACHER, M. D. Cation-dependent Changes in the Binding Specificity of the Platelet Receptor GP IIb/IIIa Journal of Biol. Chem. 265, S18525-18530 (1990).
- 10. KEKOMAKI, R., DAWSON, B., McFARLAND, J., and KUNICKI, T. J. Localisation of Human Platelet Auto Antigens to the Cysteine-rich region of glycoprotein IIIa J. Clin. Invest. 88, S847-854 (1991).
- 11. WIILIAMSON, L. M., BRUCE, D., LUBENKO, A., CHANA, H. J., and OUWEHAND, W. H. Molecular biology for platelet alloantigen typing Transfusion medicine 2 S255-264 (1992).
- 12. BESSOS, H., AND MURPHY, W. G. A new competetive binding enzyme-linked immunosorbent assay for glycocalicin in plasma and platelet concentrate supernatants. Thromb. Res., 59, 497-507 (1990).
Claims (13)
1. Immungssay für den immunologischen Nachweis eines Antikörpers für
Humanthrombozytenantigen 1 und/oder 3 (HPA1 und/oder HPA3), der umfaßt ein festes Substrat mit
darauf überzogenem gereinigtem genotypisierten Glycoproteinantigen GPIIIa vom Genotyp HPA1a1a oder
HPA1b1b, und/oder GPIIb vom Genotyp HPA3a3a oder HPA3b3b, wobei das (die) Glycoprotein(e) im
wesentlichen frei ist (sind) von Peptid, einschließend eine RGD Sequenz, und von Mg²&spplus; und/oder Mn²&spplus;
Ionen.
2. Immungssay nach Anspruch 1, wobei das Substrat mit gereinigtem genotypisierten
Glycoproteinantigen GPIIb/IIIa vom Genotyp HPA1a1a/3a3a, HPA1a1a/3b3b, HPA1b1b/3a3a und/oder
HPA1b1b/3b3b überzogen ist.
3. Immungssay für den immunologischen Nachweis eines Antikörpers für
Humanthrombozytenantigen 1a und/oder 3a (HPA1a und/oder HPA3a), der umfaßt ein festes Substrat mit
darauf überzogenem gereinigten genotypisierten Glycoproteinantigen GPIIb/IIIa vom Genotyp
HPA1a1a/3a3a, HPA1a1a/3b3b und/oder HPA1b1b/3a3a, wobei das (die) Glycoprotein(e) im wesentlichen
frei ist (sind) von Peptid, einschließend eine RGD Sequenz, und von Mg²&spplus; und/oder Mn Ionen.
4. Immungssay nach einem vorhergehenden Anspruch, wobei das Glycoproteinantigen gereinigt
worden ist durch Chargenaffinitätschromatographie auf einem Affinitätssubstrat, mit einem daran
gekoppelten Peptid, einschließend die Sequenz Arg-Gly-Asp (RGD).
5. Immungssay nach Anspruch 4, wobei das Peptid die Sequenz Gly-Arg-Gly-Asp-Ser-Pro-Lys
(GRGDSPK) hat.
6. Immungssay nach einem vorhergehenden Anspruch, wobei das feste Substrat eine
Multivertiefungsmikrotiterplatte ist.
7. Immungssay nach Anspruch 6 zum Durchführen eines Enzym gekoppelten Immungssays, der
ferner umfaßt
- ein nicht spezifisches Blockierungsmittel,
- ein Anti-Human-Immunglobulin, markiert mit einer Enzymmarkierung, und
- ein Substrat, fähig zum Geben einer kolorimetrischen Reaktion mit der Enzymmarkierung.
8. Immungssay nach Anspruch 7, der umfaßt eine Vertiefung, überzogen mit HPA1a1a/3b3b
Glycoprotein zum Nachweisen von Anti-HPA1a Antikörpern, und eine Vertiefung, überzogen mit
HPA1b1b/3a3a Glycoprotein zum Nachweisen von Anti-HPA3a Antikörpern.
9. Immungssay nach einem vorhergehenden Anspruch, wobei das genotypisierte Glycoproteinantigen
GPIIb und/oder GPIIIa gemäß dem folgenden Verfahren gereinigt worden ist:
(a) zur Verfügung stellen von genotypisierten Humanthrombozyten,
(b) Lysieren der Thrombozyten unter Bilden eines Lysats,
(c) Anwenden des Lysats auf ein Affinitätschromatographiesubstrat mit einem daran
gekoppelten Peptid, einschließend die Sequenz Arg-Gly-Asp (RGD), und
(d) Eluieren von genotypisiertem Glycoprotein.
10. Immungssay nach Anspruch 9, wobei das an das Affinitätssubstrat gekoppelte Peptid Gly-Arg-
Gly-Asp-Ser-Pro-Lys (GRGDSPK) ist.
11. Immungssay nach entweder Anspruch 9 oder 10, wobei das Glycoprotein eluiert wird unter
Verwenden eines Elutionsmediums, enthaltend ein Peptid, einschließend die Sequenz RGD.
12. Immungssay nach einem der Ansprüche 9 bis 11, wobei das eluierte Glycoprotein, enthaltend
daran gekoppeltes Peptid, dialysiert wird unter Entfernen von Peptid und Erzeugen von Glycoprotein ohne
gekoppeltes Peptid.
13. Immungssayverfahren für den in vitro Nachweis von Antikörpern, spezifisch für
Humanthrombozytenantigen 1a, 1b und/oder 3a, 3b (HPA1a, HPA1b und/oder HPA3a, HPA3b) in Serum,
der umfaßt
- Übeziehen eine Mikrotiterplatte mit gereinigtem genotypisiertem Glycoproteinantigen GPIIIa
vom Genotyp HPA1a1a und/oder HPA1b1b und/oder GPIIb vom Genotyp HPA3a3a und/oder HPA3b3b,
wobei das (die) Glycoprotein(e) im wesentlich frei ist von Peptid, einschließend eine RGD Sequenz, und
von Mg²&spplus; und/oder Mn²&spplus; Ionen,
- nicht spezifisch blockieren,
- in Kontakt bringen mit zu testendem Serum und
- Nachweisen des Vorhandenseins irgendeines Immunkomplexes, gebildet zwischen dem
immobolisierten Glycoproteinantigen und irgendeinem Anti-HPA1 oder Anti-HPA3 Antikörpern,
vorhanden in dem Serum.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GB929223390A GB9223390D0 (en) | 1992-11-07 | 1992-11-07 | Anti-hpa1 testing |
| PCT/GB1993/002297 WO1994011740A1 (en) | 1992-11-07 | 1993-11-08 | Detection of anti-hpa antibodies |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DE69331549D1 DE69331549D1 (de) | 2002-03-21 |
| DE69331549T2 true DE69331549T2 (de) | 2002-09-26 |
Family
ID=10724722
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DE69331549T Expired - Lifetime DE69331549T2 (de) | 1992-11-07 | 1993-11-08 | Nachweiss von anti-hpa antikörpern |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0667961B1 (de) |
| JP (1) | JP3479073B2 (de) |
| AU (1) | AU5425194A (de) |
| DE (1) | DE69331549T2 (de) |
| ES (1) | ES2172518T3 (de) |
| GB (1) | GB9223390D0 (de) |
| WO (1) | WO1994011740A1 (de) |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB9505447D0 (en) * | 1995-03-17 | 1995-05-03 | Common Services Agency | Competitive binding assay |
| US6210904B1 (en) | 1997-10-14 | 2001-04-03 | Merck & Co., Inc. | Anticoagulant test |
| EP1969011B1 (de) | 2006-01-03 | 2012-05-16 | TTO Nord AS | Zubereitung zur behandlung der alloimmunen thrombozytopenie von neugeborenen (neonetal alloimmune thrombocytopenia, nait) |
| JP5042237B2 (ja) * | 2006-02-07 | 2012-10-03 | スティフチュンク フュル ディアグノスティシュ フォルシュンク | 血小板抗原特異抗体の結合を中和するペプチドアプタマー並びにそれを含む診断及び治療への応用 |
| ME03655B (de) | 2014-03-31 | 2020-07-20 | Rallybio Ipa Llc | Antikörper gegen hpa-1a |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4959308A (en) * | 1987-08-27 | 1990-09-25 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Immunoassay for antibodies binding platelets |
-
1992
- 1992-11-07 GB GB929223390A patent/GB9223390D0/en active Pending
-
1993
- 1993-11-08 DE DE69331549T patent/DE69331549T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1993-11-08 JP JP51183994A patent/JP3479073B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1993-11-08 WO PCT/GB1993/002297 patent/WO1994011740A1/en active IP Right Grant
- 1993-11-08 AU AU54251/94A patent/AU5425194A/en not_active Abandoned
- 1993-11-08 EP EP93924720A patent/EP0667961B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1993-11-08 ES ES93924720T patent/ES2172518T3/es not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH08503770A (ja) | 1996-04-23 |
| EP0667961B1 (de) | 2002-02-06 |
| ES2172518T3 (es) | 2002-10-01 |
| AU5425194A (en) | 1994-06-08 |
| JP3479073B2 (ja) | 2003-12-15 |
| WO1994011740A1 (en) | 1994-05-26 |
| DE69331549D1 (de) | 2002-03-21 |
| GB9223390D0 (en) | 1992-12-23 |
| EP0667961A1 (de) | 1995-08-23 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Alderman et al. | Binding of immunoglobulin classes to subpopulations of human red blood cells separated by density-gradient centrifugation | |
| Kiessling et al. | „Natural” ︁ killer cells in the mouse. II. Cytotoxic cells with specificity for mouse Moloney leukemia cells. Characteristics of the killer cell | |
| Falkoff et al. | T cell enrichment and depletion of human peripheral blood mononuclear cell preparations. Unexpected findings in the study of the functional activities of the separated populations | |
| Anstee et al. | Monoclonal antibodies to human erythrocytes | |
| DE69626026T2 (de) | Differentialtest für ulzerative kolitis, primäre sklerosierende cholangitis und autoimmun-hepatitis vom type 1. | |
| DE69424700T2 (de) | Verfahren zum selektiven Nachweis von perinuklearen anti-neutrophilen cytoplasmischen Antikörpern bei ulzerativen Kolitis oder primärer sclerotischer Cholangitis | |
| DE3686474T2 (de) | Diagnostische probe. | |
| Bennett et al. | DNA receptor dysfunction in systemic lupus erythematosus and kindred disorders. Induction by anti-DNA antibodies, antihistone antibodies, and antireceptor antibodies. | |
| DE69733828T2 (de) | Zusammensetzungen und verfahren zum nachweis der bindung von antikörpern in zellen | |
| TW378213B (en) | Basophil-binding monoclonal antibody, method for separation of basophils, method for chemical mediator released from basophils, and testing method for release of basophil-derived chemical mediators | |
| EP0499176A2 (de) | Monoklonale Antikörper gegen humane Pankreas-Inselzellen | |
| DE69331549T2 (de) | Nachweiss von anti-hpa antikörpern | |
| JPH02502942A (ja) | 凝集による黄色ブドウ球菌の検出用試薬 | |
| DE69224134T2 (de) | Monoklonale Antikörper gegen Hepatitis-C-Virus | |
| EP0131424B1 (de) | Antikörperzubereitungen | |
| Tumas et al. | Monoclonal antibodies to the equine CD2 T lymphocyte marker, to a pan-granulocyte/monocyte marker and to a unique pan-B lymphocyte marker | |
| CA2067584C (en) | Agglutinant complex as blood typing reagent | |
| Robinson et al. | Simultaneous demonstration of membrane antigens and cytochemistry at ultrastructural level: a study with the immunogold method, acid phosphatase and myeloperoxidase | |
| DE69208574T2 (de) | Reagenz zur Identifizierung Bakterien der Spezies Staphylococcus aureus | |
| Patel et al. | Separation of T and B lymphocytes from human peripheral blood mononuclear cells using density perturbation methods | |
| DE69625048T2 (de) | Kompetitiver bindungstest zur bestimmung von antigenen auf blutplättchen | |
| JPS63500797A (ja) | 崩壊加速因子に対するモノクロ−ン抗体、その生成方法および使用 | |
| Van Rhenen et al. | Serological characteristics of partial D antigen category VI in 8 unrelated blood donors | |
| Buschmann et al. | A study of porcine lymphocyte populations I. Separation of porcine lymphocyte subpopulations | |
| JPS6070360A (ja) | 抗特異タイプの標識付モノクロ−ナル抗体を用いる受容体測定法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| 8364 | No opposition during term of opposition |