DE69733828T2 - Zusammensetzungen und verfahren zum nachweis der bindung von antikörpern in zellen - Google Patents

Zusammensetzungen und verfahren zum nachweis der bindung von antikörpern in zellen Download PDF

Info

Publication number
DE69733828T2
DE69733828T2 DE69733828T DE69733828T DE69733828T2 DE 69733828 T2 DE69733828 T2 DE 69733828T2 DE 69733828 T DE69733828 T DE 69733828T DE 69733828 T DE69733828 T DE 69733828T DE 69733828 T2 DE69733828 T2 DE 69733828T2
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
cells
antibody
antigen
bacteriophage
phage
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
DE69733828T
Other languages
English (en)
Other versions
DE69733828D1 (de
Inventor
L. Donald SIEGEL
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
University of Pennsylvania Penn
Original Assignee
University of Pennsylvania Penn
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by University of Pennsylvania Penn filed Critical University of Pennsylvania Penn
Application granted granted Critical
Publication of DE69733828D1 publication Critical patent/DE69733828D1/de
Publication of DE69733828T2 publication Critical patent/DE69733828T2/de
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/34—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against blood group antigens
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Description

  • GEBIET DER ERFINDUNG
  • Das Gebiet der Erfindung ist die Agglutination von Zellen.
  • HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • Jedes Jahr werden 10 Millionen von Blutkonserven weltweit gesammelt und eine gleiche Anzahl von Patienten empfängt diese Blutkonserven als Transfusionen. Jede Konserve an gesammeltem Blut und jeder Patient müssen im Hinblick auf das Rh-Antigen typisiert werden, um ein Zusammenpassen vor der Transfusion sicherzustellen. Das ID-Mikro-Typisierungssystem, offenbart in US-Patent Nr. 5,338,689 (Ortho Diagnostics, Inc.) stellt ein simplifiziertes Verfahren zum Antigen-Typifizieren von roten Blutzellen zur Verfügung. Weitere mikro-typisierende Kartierungssysteme sind im Stand der Technik auch bekannt. Beispielsweise ist ein DiaMed AG Kartierungssystem von Cressier, Schweiz, verfügbar, welches als das DiaMed-ID Mikro-Typisierungssystem bekannt ist. Darüber hinaus ist eine Bio Vue-Karte verfügbar von Ortho Diagnostics.
  • In einem konventionellen Blut-Typisierungstest werden Tropfen von zu typisierendem Serum rote Blutzellen von Spendern oder Empfängern in Testtuben (Testtubes) platziert und gemeinsam inkubiert. Überschüssiges unreagiertes Serum wird weggewaschen und ein Tropfen von Kaninchen anti-IgG-Antikörper (Coomb's Reagenz) wird zur Mischung hinzugegeben, um Agglutination zwischen Zellen zu induzieren, welche das Typisierungsreagenz gebunden haben können. Dieser Test ist als ein indirekter Agglutinationstest oder ein indirekter Coomb's-Test bekannt. Die Agglutination wird ausgewertet durch kurzes Zentrifugieren der Zellen und mildes Schütteln der einzelnen Tuben nacheinander über einem konkaven Spiegel und Beobachten des Vorliegens von roten Blutkörper-Agglutinationen, wenn die Zellen zu einer Suspension zurückkehren. Mikrowell-Arrays in Mikroplatten können anstelle der Testtuben verwendet werden.
  • In dem Mikro-Typisierungssystem werden die roten Blutkörperchen in einer gesteuerten Art und Weise durch ein Dextran-Acrylamidgel und Coomb's-Reagenz vorgelegt in einer speziell konzipierten Mikrotube zentrifugiert. Gemessene Volumina von Serum oder Plasma und/oder roten Blutkörperchen werden in die Reaktionskammer der Mikrotube eingebracht. Falls nötig wird die Karte inkubiert und anschließend zentrifugiert. Die agglutinierten roten Blutkörperchen werden in oder oberhalb des Gels eingefangen und nicht agglutinierte rote Blutkörperchen wandern durch die Gelpartikel und bilden einen Niederschlag am Boden der Mikrotube.
  • In einem zweiten Typ eines Blutgruppenbestimmungs-Systems beschrieben in WO9531731 A wird ein Verfahren zum Detektieren von Blutgruppen-Antigenen offenbart. Das Verfahren umfasst das Zugeben einer Probe von roten Blutkörperchen zu einer Reaktionstube, welche eine Längsachse aufweist und ein Reaktionsmedium enthält, das aus verschiedenen Partikeln besteht, welche Immunoglobulin-bindende Liganden ausgewählt aus Protein A, Protein G, Protein A/G, oder ein universelles Kappa-leichte Ketten-bindendes Protein aufweisen, wobei die Liganden an die Oberfläche der Partikel gekoppelt sind sowie einen Antikörper, optional einen verbrückender Antikörper spezifisch für das Antigen, gekoppelt an den Liganden auf den Partikeln. Die Reaktionstube wird über eine Zeit zentrifugiert, welche hinreichend ist, um die roten Blutkörperchen zu entfernen, welche nicht an den Antikörper in der Form eines Niederschlages am Boden der Tube gebunden sind. Das Anbinden der roten Blutkörperchen oder das fehlende Anbinden der roten Blutkörperchen wird nachgewiesen und das Anbinden wird mit dem Vorliegen des Antigens korreliert.
  • Jedes dieser Verfahren ist konzipiert, um rote Blutkörper (rote Blutzell-)-Antigene unter Verwendung von Antikörpern nachzuweisen, welche in Eukaryonten-Zellen erzeugt wurden, entweder als monoklonale oder polyklonale Antikörper. Diese Verfahren können nicht verwendet werden, um Antikörper zu detektieren, welche an der Oberfläche von Viruspartikeln exprimiert werden.
  • Die Fähigkeit, monoklonale Antikörper herzustellen, hat die diagnostische und therapeutische Medizin revolutioniert. Monoklonale Antikörper werden typischerweise durch die Immortialisierung von Antikörper-erzeugenden Mausleukozyten erzeugt, wodurch eine unendliche Versorgung von Zellen gewährleistet wird, welche Maus-Antikörper erzeugen. Jedoch ist es für viele menschliche Anwendungen wünschenswert, menschliche Antikörper zu erzeugen. Beispielsweise ist es bevorzugt, dass Antikörper, welche Menschen verabreicht werden, entweder für diagnostische oder therapeutische Zwecke menschliche Antikörper sind, da die Verabreichung von menschlichen Antikörpern an einen Menschen potentielle Immunreaktionen gegen den verabreichten Antikörper umgehen, wobei diese Reaktionen den Zweck, für welchen der Antikörper verabreicht wurde, zunichte machen.
  • Darüber hinaus existieren bestimmte Situationen, wo es aus diagnostischen Gründen essentiell ist, dass menschliche Antikörper verwendet werden können, da andere Tiere nicht in der Lage sind, Antikörper gegen das Antigen, das detektiert werden soll, in dem diagnostischen Verfahren zu erzeugen. Beispielsweise müssen zur Bestimmung des Rh-Phenotyps an menschlichen roten Blutkörperchen, menschlichen Seren, welche Anti-Rh-Antikörper enthalten, verwendet werden, da keine anderen Tiere einen Antikörper erzeugen können, welche in der Lage ist, menschliches Rh-Antigen zu erkennen.
  • Die Produktion von menschlichen Antikörpern in vitro durch Immortalisierung von menschlichen B-Lymphozyten unter Verwendung von Epstein Barr Virus (EBV)-mediatisierter Transformation oder Zellfusion ist bislang mit technischen Schwierigkeiten verbunden, herrührend von der relativ geringen Effizienz sowohl von der EBV-induzierten Transformation als auch der Zellfusion im Vergleich mit dem murinen System. Um diese Probleme zu lösen, wurden Prozesse entwickelt, zur Herstellung von menschlichen Antikörpern unter Verwendung von M13 Bakteriophagen-Display (Burton et al., 1994, Adv. Immunol. 57:191–280). Essentiellerweise wird eine cDNA-Bibliothek erzeugt aus mRNA erhalten von einer Population von Antikörper erzeugenden Zellen. Die mRNA kodiert wiederangeordnete Immunoglobulin (Ig)-Gene und folglich kodiert die cDNA das gleiche. Amplifizierte cDNA wird in M13 Expressionsvektoren kloniert, welche eine Phagenbibliothek erzeugen, welche menschliche Fab-Fragmente auf ihrer Oberfläche exprimieren. Phagen, welche die Antikörper von Interesse präsentieren, werden durch Antigen-Binden ausgewählt und in Bakterien propagiert, um lösliche menschliche Fab-Ig's zu erzeugen. Folglich immortalisiert diese Prozedur im Gegensatz zu konventionellen monoklonalen Antikörpersynthesen DNA, welche menschliches Ig kodiert und nicht Zellen, welche menschliches Ig exprimieren.
  • Es bestehen verschiedene Schwierigkeiten, assoziiert mit der Erzeugung an Antikörpern unter Verwendung von Bakteriophagen. Beispielsweise können viele Proteine nicht in einem nicht-denaturtierten Zustand aufgereinigt werden, da die Aufreinigungsprozedur notwendigerweise das Lösen von Protein involviert, was einige Proteine permanent denaturiert, mit einhergehender Zerstörung von Antigenstellen, die darauf präsentiert werden. Solche Proteine können folglich nicht an eine feste Phase gebunden werden und können folglich nicht verwendet werden, um Phagen, welche Antikörper tragen, welche an diese binden, zu pannen. Ein Beispiel eines solchen Proteins ist menschliches Rh-Antigen.
  • Um dieses Problem zu lösen, wurde ein Verfahren entwickelt, worin intakte rote Blutkörperchen als das Panning-Antigen verwendet wurden (Siegel et al., 1994, Blood 83:2334–2344). Jedoch wurde festgestellt, dass, da Phagen inhärent „klebrig" sind, und rote Blutkörperchen eine Vielzahl von Antigenen auf ihrer Zelloberfläche exprimieren, eine hinreichende Menge an Phagen, welche keine geeigneten Antikörper auf der Oberfläche exprimieren, auch an rote Blutkörperchen binden und dadurch das Verfahren impraktikabel zur Isolierung von Phagen machen, welche Antikörper der gewünschten Spezifität exprimieren.
  • De Kruif et al. (1995, Proc. Natl. Acad. Sci USA 92:3938–3942) offenbart ein Verfahren zum Isolieren von Phagen, welche Antikörper kodieren, wobei Antikörper exprimierende Phagen mit einer Mischung von Antigen-exprimierenden Zellen inkubiert werden, sowie von Zellen, welche kein Antigen exprimieren. Der Antikörper exprimierende Phage bindet an die Antigen-exprimierenden Zellen. Auf das Binden mit den Phagen wird ein fluoreszent gelabelter Antikörper spezifisch zu den Antigen-exprimierenden Zellen hinzugegeben, wobei diese Zellen von der Mischung entfernt werden, welche einen Antikörper exprimierenden Phagen daran gebunden, aufweisen. Die Isolation von fluroreszent gelabelten Zellen wird vervollständigt unter Verwendung der Technik des fluoreszent aktivierten Zell-Sortierens (FACS, fluorescently-activated cell sorting), einer teueren und zeitraubenden Prozedur.
  • Es besteht ein Bedürfnis für ein Verfahren zum Isolieren von rekombinanten Proteinen, vorzugsweise Antikörpern, welches schnell und ökonomisch ist, und welches ein ausgedehntes Array von Protein-bindenden Proteinen zur Verfügung stellen wird, welche geeignet zur diagnostischen und therapeutischen Anwendung an Menschen sind.
  • Es besteht auch ein Bedürfnis für schnelle und akkurate Assays zum Typisieren von roten Blutkörperchen unter Verwendung von rekombinanten Proteinen, welche auf einer Virusoberfläche exprimiert werden. Die vorliegende Erfindung erfüllte diese Bedürfnisse.
  • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Agglutinieren von Zellen umfassend das Bereitstellen einer Mischung umfassend eine Population von Zellen und eine Population eines Bakteriophagen exprimierend einen ersten Antikörper auf der Oberfläche des Bakteriophagen, wobei der erste Antikörper spezifisch für eine Antigen-tragende Gruppe ist, welche von zumindest einem Teil der Zellen in der Zellpopulation exprimiert wird, wobei der erste Antikörper an den Teil der Zellen bindet und verursacht, dass der Bakteriophage auch an den Teil der Zellen bindet, das Hinzugeben eines zweiten Antikörpers spezifisch für den Bakteriophagen zu der Mischung, wobei das Binden des zweiten Antikörpers an den Bakteriophagen, gebunden an den Teil der Zellen verursacht, dass der Teil der Zellen agglutiniert.
  • Auch eingeschlossen in die Erfindung ist ein Verfahren zum Nachweis der Zellagglutination, umfassend
    das Bereitstellen einer Mischung, umfassend eine Population von Zellen und eine Population eines Bakteriophagen exprimierend einen ersten Antikörper auf der Oberfläche eines Bakteriophagen, wobei der erste Antikörper spezifisch für ein Antigen, exprimiert von zumindest einem Teil der Zellen in der Zellpopulation, ist, wobei der erste Antikörper an den Teil der Zellen bindet und verursacht, dass der Bakteriophage auch an den Teil der Zellen bindet,
    das Hinzugeben der Mischung zu einer Mikrotube enthaltend inerte Partikel und einen zweiten Antikörper spezifisch für den Bakteriophagen,
    das Ermöglichen, dass die Mischung unter dem Einfluss von Schwerkraft sedimentiert und
    das Beobachten der Lokalisierung des Teils der Zellen, wobei starke Agglutination des Teils der Zellen angezeigt wird dadurch, dass die Zellen oberhalb oder innerhalb der obersten Schicht der inerten Partikel lokalisiert sind und schwache Agglutination der Zellen angezeigt wird durch Zellen, welche innerhalb einer unteren Schicht von inerten Partikeln lokalisiert sind, und keine Agglutination angezeigt wird durch die Zellen, welche am Boden der Mikrotube lokalisiert sind.
  • In einem Aspekt wird der Schritt der Sedimentation durch Zentrifugation durchgeführt.
  • Die Erfindung betrifft des weiteren ein Verfahren zum Einfangen von Zellen, umfassend
    das Bereitstellen einer Mischung, umfassend eine Population von Zellen und eine Population eines Bakteriophagen, wobei ein erster Antikörper auf der Oberfläche von besagtem Bakteriophagen exprimiert wird, besagter erster Antikörper spezifisch für ein Antigen ist, welches durch zumindest einen Teil der Zellen in besagter Zell-Population exprimiert wird, wobei der erste Antikörper an den Teil der Zellen bindet und verursacht, dass der Bakteriophage auch an den Teil der Zellen bindet,
    das Hinzugeben besagter Mischung zu einer Mikrotube enthaltend inerte Partikel, welche daran gebunden einen zweiten Antikörper aufweisen, welcher spezifisch für besagten Bakteriophagen ist,
    das Ermöglichen des Sedimentierens der Mischung unter Einfluss von Schwerkraft, wobei eingefangene Zellen oberhalb oder innerhalb einer obersten Schicht von den inerten Partikeln lokalisiert sind.
  • In einem Aspekt wird der Sedimentationsschritt durch Zentrifugation realisiert.
  • Des weiteren betrifft die Erfindung ein Verfahren zum Nachweis des Einfangens von Zellen umfassend
    das Bereitstellen einer Mischung umfassend eine Population von Zellen sowie eine Population eines Bakteriophagen, welcher einen ersten Antikörper auf der Oberfläche des Bakteriophagen exprimiert, und der erste Antikörper spezifisch für ein Antigen ist, welches von zumindest einem Teil der Zellen in der Zellpopulation exprimiert wird, wobei der erste Antikörper an den Teil der Zellen bindet und verursacht, dass der Bakteriophage auch den Teil der Zellen bindet,
    das Hinzugeben der Mischung zu einer Mikrotube enthaltend inerte Partikel, welche daran gebunden einen zweiten Antikörper aufweisen, welcher spezifisch für den Bakteriophagen ist, was erlaubt, dass die Mischung unter dem Einfluss von Schwerkraft sedimentiert, und
    das Beobachten der Lokalisation des Teils der Zellen, wobei das Einfangen des Teils der Zellen angezeigt wird dadurch, dass die Zellen oberhalb oder innerhalb der obersten Schicht der Gel-Partikel lokalisiert sind und die Abwesenheit des Einfangens der Zellen angezeigt wird, dadurch, dass die Zellen vom Boden der Mikrotube lokalisiert sind.
  • In diesem Verfahren der Erfindung kann der Sedimentationsschritt auch durch Zentrifugation realisiert werden.
  • Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zum Nachweisen des Vorliegens einer Antigen-tragenden Gruppe auf einer Zelle, umfassend
    das Bereitstellen einer Mischung umfassend eine Population von Zellen und eine Population eines Bakteriophagen, wobei ein erster Antikörper auf der Oberfläche von besagtem Bakteriophagen exprimiert wird, wobei das Vorliegen der Antigen-tragenden Gruppe auf den Zellen angezeigt wird durch das Binden des ersten Antikörpers an zumindest zwei der Zellen, was verursacht, dass der Bakteriophage auch an zumindest zwei der Zellen bindet, wobei, wenn ein zweiter Antikörper zur Mischung hinzugegeben wird, welcher spezifisch für den Bakteriophagen ist, der zweite Antikörper an den Bakteriophagen bindet, welcher an zumindest zwei der Zellen gebunden ist, was verursacht, dass die Zellen agglutinieren, wobei die Agglutination ein Zeichen für das Vorliegen der Antigen-tragenden Gruppe auf der Zelle ist, und diese Antigen-tragende Gruppe spezifisch für den ersten Antikörper ist.
  • Ein Verfahren zum Identifizieren einer Antigen-tragenden Gruppe auf einer Zelle ist auch von der Erfindung eingeschlossen. Dieses Verfahren umfasst
    das Bereitstellen einer Mischung umfassend eine Population von Zellen und eine Population eines Bakteriophagen, welcher ein einen ersten bekannten Antikörper auf der Oberfläche des Bakteriophagen exprimiert, wobei das Vorliegen der Antigen-tragenden Gruppe auf den Zellen angezeigt wird durch das Binden des ersten Antikörpers an zumindest zwei der Zellen, was verursacht, dass der Bakteriophage auch an die zumindest zwei der Zellen bindet, wobei, wenn der zweite Antikörper zur Mischung hinzugegeben wird, welcher spezifisch für den Bakteriophagen ist, der zweite Antikörper an den Bakteriophagen bindet, welcher an die zumindest zwei Zellen gebunden ist, was verursacht, dass die Zellen agglutinieren, wobei die Agglutination die Antigen-tragende Gruppe als eine Antigen-tragende Gruppe identifiziert, welche spezifisch für den ersten Antikörper ist.
  • Die Erfindung betrifft des weiteren ein Verfahren zum Nachweis des Vorliegens einer Antigen-tragenden Gruppe auf einer Zelle umfassend
    das Bereitstellen einer Mischung umfassend eine Population von Zellen und eine Population eines Bakteriophagen, wobei ein erster bekannter Antikörper auf der Oberfläche des Bakteriophagen exprimiert wird, wobei das Vorliegen der Antigen-tragenden Gruppe auf der Zelle angezeigt wird durch das Binden des ersten Antikörpers an zumindest zwei der Zellen und verursacht, dass der Bakteriophage auch an zumindest zwei der Zellen bindet,
    das Hinzugeben der Mischung zu einer Mikrotube enthaltend inerte Partikel und einen zweiten Antikörper spezifisch für den Bakteriophagen,
    das Ermöglichen, dass die Mischung sedimentiert unter dem Einfluss von Schwerkraft und
    das Beobachten der Lokalisierung der Zelle in der Mikrotube, wobei starke Agglutination der Zellen angezeigt wird, dadurch, dass die Zellen oberhalb oder innerhalb der obersten Schicht der inerten Partikel lokalisiert sind, wobei starke Agglutination ein Anzeichen des Vorliegens der Antigen-tragenden Gruppe auf der Zelle ist, und die Antigen-tragende Gruppe spezifisch für den ersten Antikörper ist.
  • Die Erfindung schließt des weiteren ein Verfahren zum Identifizieren einer Antigen-tragenden Gruppe auf einer Zelle ein, umfassend
    das Bereitstellen einer Mischung umfassend eine Population von Zellen und eine Population eines Bakteriophagen exprimierend einen ersten Antikörper auf der Oberfläche von besagten Bakteriophagen, wobei das Vorliegen der Antigen-tragenden Gruppe auf der Zelle angezeigt wird durch das Binden des ersten Antikörpers an zumindest zwei der Zellen, was verursacht, dass der Bakteriophage auch an zumindest zwei der Zellen bindet,
    das Hinzufügen der Mischung zu einer Mikrotube enthaltend inerte Partikel und einen zweiten Antikörper spezifisch für den Bateriophagen, was ermöglicht, dass die Mischung unter dem Einfluss von Schwerkraft sedimentiert und
    das Beobachten der Lokalisierung der Zellen in der Mikrotube, wobei starke Agglutination der Zellen angezeigt wird, dadurch, dass Zellen oberhalb oder innerhalb der oberhalb der obersten Schicht von inerten Partikeln lokalisiert sind, wobei starke Agglutination die Antigen-tragende Gruppe als eine Antigen-tragende Gruppe identifiziert, welche spezifisch für den ersten Antikörper ist.
  • Auch bereitgestellt wird ein Verfahren zum Nachweis des Vorliegens einer Antigen-tragenden Gruppe auf einer Zelle umfassend
    das Bereitstellen einer Mischung umfassend eine Population von Zellen und einer Population eines Bakteriophagen, wobei ein erster bekannter Antikörper auf der Oberfläche des Bakteriophagen exprimiert wird, wobei das Vorliegen der Antigen-tragenden Gruppe auf der Zelle angezeigt wird, durch das Binden des ersten Antikörpers an zumindest zwei der Zellen, was verursacht, dass der Bakteriophage auch an zumindest zwei der Zellen bindet,
    das Hinzufügen der Mischung zu einer Mikrotube umfassend inerte Partikel, welche daran gebunden einen zweiten Antikörper spezifisch für den Bakteriophagen aufweisen, was ermöglicht, dass die Mischung unter dem Einfluss der Schwerkraft sedimentiert, wobei die eingefangenen Zellen oberhalb oder innerhalb der obersten Schicht der inerten Partikel lokalisiert sind, und das Vorliegen der eingefangenen Zellen ein Hinweis auf das Vorliegen einer Antigen-tragenden Gruppe auf den Zellen ist, wobei die Antigen-tragende Gruppe spezifisch für den ersten Antikörper ist.
  • Darüber hinaus schließt diese Erfindung ein Verfahren zum Identifizieren einer Antigen-tragenden Gruppe auf einer Zelle ein, umfassend
    das Bereitstellen einer Mischung umfassend eine Population von Zellen und eine Population eines Bakteriophagen exprimierend einen ersten Antikörper auf der Oberfläche der Bakteriophagen, wobei das Vorliegen der Antigen-tragenden Gruppe auf der Zelle angezeigt wird durch das Binden des ersten Antikörpers an zumindest zwei der Zellen, was verursacht, dass das Bakteriophage auch an die zumindest zwei der Zellen bindet,
    das Hinzugeben der Mischung zu einer Mikrotube enthaltend inerte Partikel, welche daran gebunden einen zweiten Antikörper spezifisch für den Bakteriophagen aufweisen, was ermöglicht, dass die Mischung sedimentiert unter dem Einfluss von Schwerkraft, wobei die eingefangenen Zellen oberhalb oder innerhalb der obersten Schicht der inerten Partikel lokalisiert sind und das Vorliegen der eingefangenen Zellen eine Antigen-tragende Gruppe auf den Zellen als spezifisch für den ersten Antikörper identifiziert.
  • In einem Aspekt der Verfahren der Erfindung werden die Zellen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus roten Blutzellen (roten Blutkörperchen) und weißen Blutzellen (weißen Blutkörperchen). Vorzugsweise sind die Zellen rote Blutzellen.
  • In einem weiteren Aspekt ist der Bakteriophage M13 und der zweite Antikörper ist ein Anti-M13-Antikörper.
  • In noch einem anderen Aspekt ist der erste Antikörper ein anti-roter Blutkörperchen-Antikörper, vorzugsweise ein Anti-Rh-Antikörper.
  • In einem weiteren Aspekt ist die Antigen-tragende Gruppe ein rotes Blutkörperchen-Antigen oder ein HLA-Antigen.
  • KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
  • 1 ist ein Diagramm einer Strategie für Zelloberflächen-Fab-Phagen-Panning unter Verwendung von magnetisch aktiviertem Zellsorting.
  • 2 ist ein Graph, welcher Zelloberflächen-Biotinylierung von menschlichen roten Blutkörperchen darstellt.
  • 3 ist eine Serie von Grafiken, welche die Antigen-positive, Antigen-negative Zell-Separation-Prozedur der Erfindung validieren.
  • 4 ist ein Bild eines Mikroplatten-Agglutinations-Assays, wobei Anti-Rh(D)-Fab/Phagen-Agglutinations-Titer gemessen wurden.
  • 5 ist ein Bild eines Mikroplatten-Agglutinationsassays, in welchem die Bestimmung von Rh(D)-bindendem Epitop für ausgewählte Anti-Rh(D)-Fab/Phagenklone gezeigt wird.
  • 6 ist ein Bild, welches die Verwendung von Fab/Phagen-Antikörpern in einem Gelkartierungsassay zeigt.
  • DETAILLIERTE BESCHREIBUNG
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung werden schnelle Verfahren zum Typisieren von Zellen im Hinblick auf die Antigene bereitgestellt, welche auf diesen exprimiert werden, wobei die Verfahren auf der Anwendung von Antikörpern basieren, welche auf der Oberfläche eines Virus exprimiert werden. Das Typifizieren von Zellen unter Verwendung von Phagen-exprimierenden Antikörpern basiert auf der Anwendung eines Anti-Phagen-Antikörpers in einer Agglutinations-Reaktion.
  • Typischerweise sind die zu typisierenden Zellen rote Blutkörperchen, obwohl, wie hier diskutiert, die Erfindung nicht einzig auf das Typisieren von roten Blutkörperchen limitiert ist.
  • Es gibt signifikante Vorteile für das Typisieren von Zellen unter Verwendung eines Phagensystems, insbesondere in dem Fall des Typisierens von roten Blutkörperchen. Beispielsweise weisen ungefähr 10% der Blutspender und -empfänger rote Blutkörperchen auf, welche mit einigen von ihren eigenen IgG-Antikörpern überzogen sind. Während der Mechanismus, durch welchen dies auftritt, nicht von Interesse ist, erzeugt das Vorliegen dieser Antikörper auf den roten Blutkörperchen, dass die Zellen nicht mit konventionellen Verfahren typisierbar sind, welche IgG-Anti-Rh-typisierendes Serum einsetzen. Beispielweise wird in einem konventionellen Assay IgG-Anti-Rh-typisierendes Serum zu den roten Blutkörperchen hinzugegeben. Das ungebundende typisierte Serum wird abgewaschen und Coombs-Reagenz wird hinzugegeben, um die Agglutination zu induzieren. Coombs-Reagenz ist Kaninchen-anti-menschliches IgG. Rote Blutkörperchen, welche bereits mit IgG überzogen sind, werden agglutinieren, egal, ob das Anti-Rh-Serum daran gebunden ist oder nicht, d.h. die Agglutination wird auftreten, egal ob die Zellen Rh-positiv oder Rh-negativ sind. Dies erzeugt ein Dilemma, dass es nicht möglich ist, den Rh-Phenotyp des Subjekts zu bestimmen. Jedoch wenn der Phagen-Antikörper in dem Assay verwendet wird, ist der Agglutinations-Antikörper (der verbrückende Antikörper) ein Anti-Phagen-Antikörper. Folglich wird es für die Ergebnisse des Assays irrelevant, dass die Zellen bereits mit IgG überzogen sind. Folglich ermöglicht das Typisieren von roten Blutkörperchen unter Verwendung der Phagen-Antikörper das Typisieren von Zellen, welche falsch-positive Testergebnisse gegen direktes Coombs aufweisen.
  • Ein weiterer Vorteil des Anwendens eines Phagen-typisierenden Systems wird in der überlegenen Sensitivität des Phagen-typisierenden Systems gegenüber konventionellen Systemen gefunden. Der Standard indirekte Coombs-Tests benötigt ungefähr 150 bis 3000 IgG-Moleküle pro rotem Blutkörperchen, um ein positives Ergebnis zu erzielen. Wenn ein Anti-Rh(D)-Phagen-Antikörper in den hier beschriebenen Assays eingesetzt wurde, waren ungefähr nur 10 bis 20 Antikörper für ein positives Ergebnis vonnöten. Während nicht gewünscht wird, an eine spezielle Theorie gebunden zu sein, rührt diese ungefähr 10 bis 100fache Verbesserung der Sensitivität vermutlich von der großen Länge (ungefähr 0,5 μm) des Phagen her, welcher eine vergrößerte Oberfläche für den zweiten Antikörper (d.h. den Anti-Phagen-Antikörper) zur Verfügung stellt, wodurch die Zellen gebunden und quer-vernetzt werden.
  • Verfahren zum Erzeugen von Antikörpern, welche auf der Oberfläche eines Virus exprimiert werden, werden zuerst hier beschrieben, gefolgt von einer Beschreibung von Verfahren zum Typisieren von roten Blutkörperchen unter Verwendung von Virus-exprimierten Antikörpern und Anti-Phagen-Antikörpern.
  • Ein neues Verfahren wurde entdeckt für die Isolation von DNA kodierend für ein Protein und des Proteins kodiert dadurch, wobei das Protein vorzugsweise ein Antikörper ist, wobei das Protein in der Lage ist, spezifisch an eine Antigen-tragende Gruppe, wie beispielsweise ein Protein, ein Lipid, ein Kohlenhydrat, eine Nukleinsäure und einen Komplex von zumindest einem von einem Protein, einem Lipid, einem Kohlennitrat und einer Nukleinsäure zu binden. Die Antigen-tragende Gruppe kann ein Membran-gebundenes Protein sein, welches ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus einem Antigen und einem Rezeptor. In einem anderen Aspekt ist das Membran-gebundene Protein ein Antigen, wie z.B. ein rotes Blutkörperchen-Antigen, wie z.B. Rh-Antigen. Wenn die Antigen-tragende Gruppe ein Kohlenhydrat ist, kann sie ein Kohlenhydrat sein exprimiert auf einem Glyko-Lipid, beispielsweise ein P-Blutgruppen-Antigen oder ein anderes Antigen.
  • Wie hier beispielhaft ausgeführt, jedoch nicht darauf limitiert, umfasst das Verfahren das Erzeugen eines Bakteriophagen, welcher menschliche Antikörper kodiert. Genauer gesagt, werden anti-Rh(D)-rote-Blutzellen Fab-Phagen-Antikörper kodiert durch eine M13-filamentöse Phagen-Bibliothek erhalten. Die Bibliothek wird erzeugt aus Antikörper-produzierenden Zellen von einem hyperimmunisierten Spender durch zuerst Erhalten der cDNA, abgeleitet von der mRNA, exprimiert in den Antikörper erzeugenden Zellen. Ig-kodierende Fragmente der cDNA werden erhalten unter Verwendung der Polymerase Kettenreaktion (PCR) und Primern spezifisch für solche Fragmente an DNA. Ig-spezifische DNA, die so erhalten wurde, wird in einen Bakteriophagen kloniert. Bakteriophagen kodierend die Ig-Fragmente werden gegen eine Mischung von Antigen-positiven, biotinylierten roten Blutzellen-Targetzellen vor-gecoated mit Streptavidin-konjugierten magnetischen Mikrobeads und überschüssigen ungelabelten roten Blutkörperchen gescreent. Bakteriophagen, welche Antikörper auf der Phagen-Oberfläche exprimieren, wobei die Antikörper spezifisch für das Targetzell-Antigen sind, binden an die gelabelten Zellen. Diese Phagen werden von Phagen separiert, welche an ungelabelte Zellen gebunden sind und von Phagen, welche nicht an die Zellen gebunden sind und zwar unter Verwendung einer magnetischen Säule. So abgetrennte Phagen kodieren und präsentieren Antikörper spezifisch für Antigene aus den Targetzellen.
  • Um eine Phagen-Antikörper-Bibliothek zu erzeugen, wird eine cDNA-Bibliothek zuerst erhalten aus mRNA und aus Zellen isoliert, welche das gewünschte Protein exprimieren, das auf der Phagenoberfläche exprimiert werden soll, beispielsweise den gewünschten Antikörper. cDNA-Kopien der mRNA werden produziert unter Verwendung der reversiblen Transkriptase. cDNA, welche Ig-Fragmente spezifiziert, werden durch PCR erhalten und die resultierende DNA wird in einen geeigneten Bakteriophagen-Vektor kloniert, um eine Bakteriophagen-DNA-Bibliothek zu erzeugen, umfassend DNA, welche Ig-Gene spezifiziert. Die Prozeduren zum Erzeugen einer Bakteriophagen-Bibliothek umfassend heterologe DNA sind wohl bekannt auf dem Gebiet und werden beispielsweise beschrieben in Sambrook et al. (1989, Molecular Cling: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY).
  • Eine Bakteriophagen-Bibliothek kann auch erhalten werden unter Verwendung von cDNA anstelle von PCR-amplifizierten Ig kodierenden Fragmenten von cDNA. Die Erzeugung einer cDNA-Bibliothek ist bedeutsam für die Isolation von Proteinen, welche keine Antikörper darstellen, wie z.B. Liganden und dergleichen.
  • Bakteriophagen, welche das gewünschte Protein kodieren, beispielsweise einen Antikörper, können maßgeschneidert werden, so dass Protein auf der Oberfläche davon präsentiert wird in solch einer Art und Weise, dass es zum Binden an sein korrespondierendes Bindungsprotein verfügbar ist, beispielsweise das Antigen, gegen welches der Antikörper gerichtet ist. Folglich wird, wenn die Bakteriophagen, welche einen spezifischen Antikörper exprimieren, in der Gegenwart einer Zelle inkubiert werden, welche das korrespondierende Antigen exprimiert, die Bakteriophagen an die Zelle binden. Bakteriophagen, welche keinen Antikörper exprimieren, werden nicht an die Zelle binden.
  • Zum Panning der Bakteriophagen, d.h. zur Auswahl der Phagen, welche den gewünschten Antikörper exprimieren, werden Zellen, welche das konjugierte Antigen exprimieren, mit einem nachweisbaren Label, wie z.B. Biotin gelabelt. Streptavidin-konjugierte magnetische Beads werden dann zu den Zellen hinzugegeben. Zellen werden vermischt mit einem Überschuss an ungelabelten Zellen, welche kein Antigen exprimieren. Diese Zellenmischung wird dann mit einer Phagen-Bibliothek inkubiert, wobei der Phage, welcher den Antikörper exprimiert, an Zellen bindet, welche das Antigen exprimieren. Das Vorliegen der überschüssigen ungelabelten Zellen in der Mischung dient als ein Mittel zum Entfernen von Bakteriophagen, welche den Antikörper nicht exprimieren, welche jedoch anderweitig an Antigen-exprimierende Zellen in nicht-spezifischer Art und Weise binden könnten. Die Details der experimentellen Prozeduren werden hier im Abschnitt der experimentellen Details zur Verfügung gestellt.
  • Antigen-exprimierende Zellen, welche Antikörper-exprimierende Phagen daran gebunden aufweisen, werden magnetisch aus der Mischung entfernt. Ein Beispiel der magnetischen Entfernung involviert das Ausgießen der Mischung von magnetischen und nicht-magnetischen Zellen auf eine Säule, in der selektiven Anwesenheit oder Abwesenheit eines magnetischen Feldes, welches die Säule umgibt. Alternativ können magnetische Zellen von nicht-magnetischen Zellen in Lösung abgetrennt werden, durch einfaches Halten eines Magnetes gegen die Seite einer Testtube und Anziehen der Zellen an die innere Wand und das anschließende sorgsame Entfernen der nicht-magnetischen Zellen aus der Lösung.
  • Folglich involviert das eben beschriebene Verfahren eine Prozedur zum Anreichern einer Population eines rekombinanten Phagen hinsichtlich denjenigen, welche spezifische Phagen präsentierte Liganden, abgeleitet von natürlichen oder synthetischen Phagen-DNA-Bibliotheken exprimieren, durch gleichzeitiges Durchführen von negativer und positiver Selektion gegen eine Mischung von magnetisch gelabelten Rezeptor-positiven Partikeln (d.h. Zellen) und ungelabelten Rezeptor-negativen Partikeln. Die Bezeichnung „Bakteriophage" und „Phage" werden hier austauschbar verwendet und betreffen Viren, welche Bakterien infizieren. Durch die Verwendung der Bezeichnung „Bakteriophagen-Bibliothek" oder „Phagen-Bibliothek", wie hier verwendet, wird eine Population von bakteriellen Viren gemeint, welche heterologe DNA, d.h. DNA umfasst, die nicht natürlich durch das bakterielle Virus kodiert wird.
  • Die Bezeichnung „Virus-Vektor" enthält einen Virus, in welchem heterologe DNA insertiert worden ist. Der Virus-Vektor kann ein Bakteriophage sein, oder kann ein eukaryontischer Virus sein.
  • Die Bezeichnung „Targetzelle", wie hier verwendet, bezeichnet eine Zelle, welche ein Antigen exprimiert, gegen welches der gewünschte Antikörper gerichtet ist.
  • Durch die Bezeichnung „Assay" oder „geassayd", wie hier verwendet, wird ein Prozess bezeichnet, des Auswählens von Phagen, welche den gewünschten Antikörper kodieren.
  • Durch die Zeichnung „Fab/Phage", wie hier verwendet, wird ein Phagenpartikel bezeichnet, welches den Fab-Teil eines Antikörpers exprimiert.
  • Durch die Bezeichnung „scFv/Phage", wie hier verwendet, wird ein Phagenpartikel spezifiziert, welches den Fv-Teil eines Antikörpers als eine einzelne Kette exprimiert.
  • Durch „Überschuss an ungelabelten Zellen" wird eine Menge von ungelabelten Zellen bezeichnet, welche die Anzahl der gelabelten Zellen überschreitet. Vorzugsweise ist das Verhältnis der gelabelten Zellen zu ungelabelten Zellen ungefähr 1:2. Mehr bevorzugt ist das Verhältnis der gelabelten Zellen zu ungelabelten Zellen größer als ungefähr 1:4. Noch mehr bevorzugt ist das Verhältnis der gelabelten Zellen zu ungelabelten Zellen als ungefähr 1:10.
  • Während das Verfahren, wie hier beispielhaft dargestellt, die Erzeugung von Phagen beschreibt, welches den Fab-Teil eines Antikörpermoleküls kodieren, sollte das Verfahren nicht so konstruiert werden, dass es einzig auf die Erzeugung von Phagen kodierend Fab-Antikörper limitiert ist. Vielmehr sind Phagen, welche einzelkettige Antikörper (scFV/hagen-Antikörper-Bibliotheken) kodieren, auch in dem Verfahren eingeschlossen. Fab-Moleküle umfassen die gesamte Ig-leichte Kette, d.h., sie umfassen sowohl die variable als auch die konstante Region der Kette, schließen jedoch nur die variable Region und die erste konstante Region-Domäne (CH1) der schweren Kette ein. Einzelkettige Antikörpermoleküle umfassen eine Einzelkette von Protein umfassend das Ig-Fv-Fragment. Ein Ig-Fv-Fragment schließt nur die variablen Regionen der schweren und leichten Ketten des Antikörpers ein mit keiner darin enthaltenen konstanten Region. Phagen-Bibliotheken umfassen scFVDNA und können erzeugt werden folgend auf die Prozeduren, wie beschrieben in Marks et al., 1991, J. Mol. Biol. 222:581–597. Das Screening von Phagen, die so erzeugt wurden, auf die Isolation von gewünschten Antikörpern wird durchgeführt, wie hier beschrieben, für Phagen-Bibliotheken umfassend Fab DNA.
  • Das Verfahren sollte auch so konstruiert, werden, dass es synthetische Phagen-Bibliotheken enthält, in welchen die variablen Regionen der schweren und leichten Kette synthetisiert werden können, so dass sie beinahe alle Spezifitäten enthalten. Folglich können die Antikörper präsentierenden Bibliotheken „natürlich" oder „synthetisch" (Barbas, 1995, Natur Medicine 1:837–839; de Kruif et al., 1995, J. Mol. Biol. 248:97–105) sein. Antikörper präsentierende Bibliotheken umfassen „natürliche" Antikörper und werden erzeugt, wie im Abschnitt der experimentellen Beispiele beschrieben. Antikörper präsentierende Bibliotheken umfassend „synthetische" Antikörper und werden erzeugt gemäß der Prozedur, beschrieben in Barbas (1995, supra) und in den dort aufgeführten Literaturverweisen.
  • Das Verfahren sollte des weiteren so konstruiert werden, dass es die Erzeugung von Phagendisplay-Bibliotheken umfassend Bateriophagen, welche verschieden von M13 sind, der hier beispielhaft aufgeführt wird, einschließen. Andere Bakteriophagen, wie z.B. Lamda-Phagen, können auch bedeutsam in dem gerade beschriebenen Verfahren sein. Lamda-Phagen-Display-Bibliotheken wurden erzeugt, welche Peptide, kodiert durch heterologe DNA, auf ihrer Oberfläche präsentieren (Sternberg et al., 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:1609–1613). Desweiteren wird angedacht, dass das Verfahren, wie hier beschrieben, so ausgeweitet wird, dass es Viren verschieden von Bakteriophagen enthält, wie z.B. eukaryontische Viren. Tatsächlich können eukaryontische Viren erzeugt werden, welche Gene kodieren, die geeignet sind für die Zufuhr zu Säugetieren, welche einen Antikörper kodieren und präsentieren, der in der Lage ist, auf einen spezifischen Zelltyp oder ein Gewebe abzuzielen, in welches das Gen eingeführt werden soll. Beispielsweise wurden retrovirale Vektoren erzeugt, welche funktionelle Antikörperfragmente präsentieren (Russell et al., 1993, Nucl. Acids Res. 21:1081–1085).
  • Die roten Blutkörper-Antikörper, gegen welche Antikörper erzeugt werden können, schließen ein, sind jedoch nicht limitiert auf Rh-Antigene, einschließend Rh(D), Rh(C), Rh(c), Rh(E), Rh(e) und andere nicht Rh-Antigene einschließend rote Blutzell-Antigene in den Kell-, Duffy-, Lutheran- und Kidd-Blutgruppen.
  • Folglich ist das Verfahren zum Erzeugen von Phagen, welche Antikörper exprimieren, nicht einzig auf die Isolation von DNA limitiert, welche Anti-Rh(D)-Antikörper kodiert, sondern kann auch verwendet werden für die Isolation von DNA kodierend Antikörper gerichtet gegen irgendwelche rote Blutzell-Antigene oder andere Zellantigene, wie z.B., jedoch nicht limitiert auf, tumorspezifisches Antigen, bakterielle Antigene oder dergleichen. Das Verfahren der Erfindung ist auch bedeutsam zum Typisieren von Blutkörperchen durch Erzeugen von Phagen-Antikörpern, spezifisch für eine Vielzahl von klinisch bedeutsamen Blutkörperchen-Antigenen, besonders P1A1/P1A2, Baka/Bakb, PenA/PenB, und dergleichen.
  • Die Erfindung ist des weiteren bedeutsam zum Typisieren von weißen Spenderblutkörperchen hinsichtlich HLA-Antigenen zum Zwecke des Übereinstimmens von Spendern und Empfängern für potentielle Transplantation, welche sowohl im Falle von festen (beispielsweise Niere, Herz, Leber, Lunge) und nicht festen (beispielsweise Knochenmark) Organ- und Gewebetransplanten zusammenpassen.
  • Um das Binden von Phagen zu detektieren, welche Antikörper exprimieren, gerichtet gegen irgendeines der nicht roten Blutzell-Antigene, können die nicht roten Blutkörper agglutiniert oder eingefangen werden, entsprechend den Prozeduren, wie hier beschrieben für die Agglutination oder das Einfangen von roten Blutkörperchen. Vor der Agglutination oder dem Einfangen können die Zellen „sichtbar" gemacht werden durch Anfärben oder andere Labelingstechnik, um die Agglutination bzw. das Einfangen offensichtlich für das bloße Auge, oder einen Scanner zu machen.
  • Das Verfahren ist am meisten bedeutsam für die Erzeugung eines Proteins, welches an eine Antigen-tragende Gruppe bindet, wobei die Antigen-tragende Gruppe nicht leicht in löslicher Form aufgereinigt werden kann. Folglich schließen Antigen-tragende Gruppen diejenigen ein, welche mit anderen Strukturen assoziiert sind, üblicherweise Membranen in der Zelle, wie z.B. Zell-Membranen oder Organell-Membranen.
  • Das Verfahren ist auch bedeutsam für die Erzeugung von Autoimmunantikörpern, wie z.B. diejenigen, involviert in die autoimmune hämolytische Anämie (AIHA, autoimmune hemolytic anemia) (Siegel et al., 1994, Structural analysis of red cell autoantibodies, Garratty (ed.) Immunbiology of Transfusion Medicine, Dekker, New York, New York). Autoimmunantikörper, welche gegen Zellantigene gerichtet sind, welche Zelloberflächen-Membran assoziiert sind, oder Zellorganell-Membran assoziiert sind, können isoliert werden unter Verwendung der hier beschriebenen Technologie. Autoimmunerkrankungen und ihre assoziierten Antigene, gegen welche Antigene isoliert werden können schließen ein, sind jedoch nicht limitiert auf die Folgenden: Myasthenia gravis (Acetylcholin Rezeptor; Neuronen), chronische entzündliche demylinierende Polyneuropathy (Myelin; Neuronen), autoimmune Thyroid-Erkrankungen (Thyroid-stimulierende Hormonrezeptor; Thyroidzellen), primäre biliare Zirrhose (mitrochondriale Autoantigene; Leber-Mitochondrien), idiopathische thrombozytopenische Purpura (Blutplättchenmembran-Integrine; Blutplättchen), Pemphigus Vulgaris (epidermale Antigene; Epidermis) und Goodpasture's Syndrom (Basis-Membran-Antigene; Nieren- oder Lungenzellen).
  • Tatsächlich ist das hier beschriebene Verfahren bedeutsam für die Isolation von DNA-Klonen, welche irgendeinen Antikörper kodieren, welches gegen irgendein Antigen exprimiert auf einer Zelle gerichtet ist, wobei die Zelle mit einem magnetischen Label gelabelt sein kann, und die Zelle in hinreichenden Mengen in einer ungelabelten Form erhalten werden kann, um einen Überschuss von ungelabelten Zellen, wie von dem Assay benötigt, zur Verfügung zu stellen.
  • Desweiteren ist das Verfahren nicht limitiert auf die Isolierung von DNA kodierend für Antikörper, sondern kann eher auch verwendet werden für die Isolation von DNA, welche andere Peptide oder Proteine kodiert mit Spezifität für Zellproteine, wie z.B., jedoch nicht limitiert auf, Liganden, welche Zell-Rezeptorproteine binden, Peptidhormone und dergleichen.
  • Das Verfahren sollte nicht so konstruiert werden als limitierend für die Anwendung von Biotin als dem Zell-labelnden Agens. Andere Label können verwendet werden, vorausgesetzt, dass ihre Zugabe zu einer Zelle nicht die strukturelle Integrität von irgendwelchen Oberflächenproteinen, die darauf exprimiert werden, zerstört und vorausgesetzt, dass solche Label die Zugabe von paramagnetischen Micobeads oder anderen magnetischen Substanzen dazu ermöglichen. Andere solche Label schließen ein, sind jedoch nicht limitiert auf, Zelloberflächenproteine oder Kohlenhydrate, welche direkt mit magnetischen Beads derivatisiert werden können, welche aktivierte Amin-, Carboxy- oder Thiolgruppen aufweisen. Darüber hinaus können Farbstoffe, wie z.B. Fluoreszein oder Rhodamin auch kovalent an Zellen angebunden werden in einer ähnlichen Art und Weise wie Biotin und magnetische Beads, gecoated mit Anti-Farbstoff-Antikörpern können daran angebunden werden.
  • Die Erfindung schließt auch Proteine und DNA, welche diese kodiert, ein, wobei selbige erzeugt werden unter Verwendung der Verfahren, wie hier beschrieben. Um DNA zu isolieren, welche einen Antikörper kodiert, wird beispielsweise die DNA von Antikörpern extrahiert, welche Phagen exprimieren, die gemäß den Verfahren der Erfindung erhalten werden. Solche Extraktionstechniken sind auf dem Gebiet wohl bekannt und werden beispielsweise in Sambrook et al. (supra) beschrieben.
  • Eine „isolierte DNA", wie hier verwendet, bezieht sich auf eine DNA-Sequenz, ein Segment oder Fragment, welches aus Sequenzen aufgereinigt worden ist, welche sie im natürlich vorkommenden Zustand flankieren, beispielsweise ein DNA-Fragment, welches von den Sequenzen entfernt wurde, welche normalerweise benachbart zu dem Fragment sind, beispielsweise Sequenzen benachbart zu dem Fragment in einem Genom, in welchem dieses natürlicherweise vorkommt. Die Bezeichnung gilt auch für DNA, welche substantiell von anderen Komponenten aufgereinigt worden ist, welche natürlicherweise mit der DNA einhergehen, beispielsweise DNA oder RNA oder Proteine, welche natürlicherweise damit in der Zelle einhergehen.
  • Die Erfindung sollte so konstruiert werden, dass sie DNAs einschließt, welche substantiell homolog zur DNA isoliert in Übereinstimmung mit dem Verfahren der Erfindung sind. Vorzugsweise ist eine DNA, die substantiell homolog ist, zu ungefähr 50% homolog, mehr bevorzugt zu ungefähr 70%, sogar noch mehr bevorzugt zu ungefähr 80% homolog, und am meisten bevorzugt zu ungefähr 90% homolog zur DNA erhalten unter Verwendung dieser Erfindung.
  • „Homolog", wie hier verwendet, bezieht sich auf eine Untereinheit-Sequenzähnlichkeit zwischen zwei polymeren Molekülen, beispielsweise zwischen zwei Nukleinsäuremolekülen, beispielsweise zwei DNA-Molekülen oder zwei RNA-Molekülen oder zwischen zwei Polypeptidmolekülen. Wenn eine Untereinheitposition in beiden der zwei Moleküle durch die gleiche monomere Untereinheit okkupiert ist, beispielsweise falls eine Position in jeder der beiden DNA-Moleküle durch Adenin okkupiert ist, dann sind sie an dieser Position homolog. Die Homologie zwischen zwei Sequenzen ist eine direkte Funktion der Anzahl der übereinstimmenden oder homologen Positionen, beispielsweise falls die Hälfte (fünf Positionen in einem Polymer von zehn Untereinheiten an Länge) der Positionen in zwei Verbindungssequenzen homolog sind, dann sind die beiden Sequenzen 50% homolog, falls 90% der Positionen, beispielsweise 9 von 10, übereinstimmend oder homolog sind, teilen die beiden Sequenzen 90% Homologie. Um ein Beispiel zu nennen, sind die DNA-Sequenzen 3'ATTGCC5' und 3'TATGCG5' und 3'TATGCG5' zu 50% homolog.
  • Um eine substantiell reine Herstellung eines Proteins umfassend beispielsweise einen Antikörper zu erhalten, erzeugt unter Verwendung des Verfahrens der Erfindung, kann das Protein aus der Oberfläche des Phagen, auf welcher es exprimiert wird, extrahiert werden. Die Prozeduren für eine solche Extraktion sind den Fachleuten auf dem Gebiet der Proteinaufreinigung wohl bekannt. Alternativ kann eine substantiell reine Herstellung eines Proteins, umfassend beispielsweise einen Antikörper, erhalten werden durch Klonieren einer isolierten DNA kodierend für einen Antikörper in einen Expressionsvektor und die Expression des Proteins daraus. Das so exprimierte Protein kann erhalten werden von üblichen Proteinaufreinigungs-Prozeduren, die im Stand der Technik wohl bekannt sind.
  • Wie hier verwendet, beschreibt die Bezeichnung „substantiell rein" eine Verbindung, beispielsweise ein Protein oder Polypeptid, welches von Komponenten aufgereinigt wurde, welche mit dieser natürlichen Weise einhergehen. Typischerweise ist eine Verbindung substantiell rein, wenn zumindest 10%, mehr bevorzugt zumindest 20%, mehr bevorzugt zumindest 50%, mehr bevorzugt zumindest 60%, mehr bevorzugt zumindest 75%, mehr bevorzugt zumindest 90% und am meisten bevorzugt zumindest 20% des gesamten Materials (pro Volumen, pro nassem oder trockenem Gewicht oder pro Mol.% oder Mol.-Fraktion) in einer Probe die Verbindung von Interesse darstellen. Reinheit kann gemessen werden durch irgendein geeignetes Verfahren, beispielsweise im Fall von Polypeptiden durch Säulen-Chromatografie, Gel-Elektrophorese oder HPLC-Analyse. Eine Verbindung, beispielsweise ein Protein ist auch substantiell aufgereinigt, wenn sie essentiell frei von natürlich assoziierten Komponenten ist oder wenn sie abgetrennt wird von nativen kontaminierenden Substanzen, welche mit ihrem natürlichen Zustand einhergehen.
  • Die vorliegende Erfindung stellt auch Analoge von Proteinen oder Polypeptiden zur Verfügung, welche in Übereinstimmung mit dem Verfahren der Erfindung erhalten werden. Analoge können sich von natürlich auftretenden Proteinen oder Polypeptiden durch konservative Aminosäuresequenz-Unterschiede unterscheiden oder durch Modifikationen, welche die Sequenz nicht beeinträchtigen oder durch beide. Beispielsweise können konservative Aminosäure-Veränderungen realisiert werden, welche, obwohl sie die primäre Sequenz des Proteins oder Peptids verändern, normalerweise nicht die Funktion verändern. Konservative Aminosäuresubstitutionen schließen typischerweise Substitutionen ein mit den folgenden Gruppen:
    Glycin, Alanin;
    Valin, Isoleucin, Leucin;
    Asparaginsäure, Glutaminsäure;
    Asparagin, Glutamin;
    Serin, Threonin;
    Lysin, Arginin;
    Phenylalanin, Tyrosin.
  • Modifikationen, (welche normalerweise nicht die primäre Sequenz verändern), schließen in vivo oder in vitro chemische Derivatisierungen von Polypeptiden ein, beispielsweise Acetylierung oder Carboxylierung. Auch eingeschlossen sind Modifikationen der Glykosylierung, beispielsweise diejenigen erzeugt durch Modifizieren der Glykosylierungsmuster eines Polypeptids während der Synthese und Verarbeitung oder in weiteren Verarbeitungsschritten; beispielsweise durch Exponieren des Polypeptids gegen Enzyme, welche die Glykosylierung beeinträchtigen, beispielsweise Säugetier-Glykosylierungs- oder Deglykosylierungs-Enzyme. Auch angedacht sind Sequenzen, welche phosphorylierte Aminosäurereste aufweisen, beispielsweise Phosphotyrosin, Phosphoserin oder Phosphothreonin.
  • Auch eingeschlossen sind Polypeptide, welche modifiziert worden sind unter Verwendung von üblichen molekular-biologischen Techniken, um ihre Resistenz gegen proteolytische Degradation zu verbessern oder die Löslichkeitseigenschaften zu optimieren. Analoge solcher Polypeptide schließen diejenigen ein, welche Reste enthalten, die sich von natürlich vorkommenden L-Aminosäuren unterscheiden, beispielsweise D-Aminosäuren oder nicht natürliche auftretende synthetische Aminosäuren. Die Peptide der Erfindung sind limitiert auf Produkte von irgendwelchen der spezifische exemplarischen Prozesse, wie hier aufgelistet.
  • Über die substantiellen Volllängen-Polypeptide hinaus stellt die vorliegende Erfindung aktive Fragmente der Polypeptide zur Verfügung. Ein spezifisches Polypeptid wird als aktiv betrachtet, falls es an eine Antigen-tragende Gruppe bindet, beispielsweise, falls ein Fragment eines Antikörpers an sein korrespondierendes Antigen in der gleichen Art und Weise, wie das Volllängen-Protein bindet.
  • Wie hier verwendet, wird der Begriff „Fragment", angewandt auf ein Polypeptid, üblicherweise zumindest ungefähr fünfzig zusammenhängende Aminosäuren darstellen, typischerweise zumindest ungefähr hundert zusammenhängende Aminosäuren, mehr typischerweise zumindest ungefähr zweihundert zusammenhängende Aminosäuren und üblicherweise zumindest ungefähr dreihundert zusammenhängende Aminosäuren an Länge.
  • Typisierung der roten Blutkörperchen unter Verwendung eines Virus, welcher Antikörper exprimiert
  • Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Typisieren von Zellen im Hinblick auf Antigene, welche darauf exprimiert werden.
  • Die Phagen, welche das Protein exprimieren, das erzeugt wird unter Verwendung der hier beschriebenen Verfahren, sind bedeutsam für das Typisieren von roten Blutkörperchen. Es gibt eine Vielzahl von Assays zum schnellen Testen von roten Blutkörperchen, insbesondere zum Typisieren von roten Blutkörperchen im Hinblick auf die Rh-Antigenexpression. Sowohl konventionelle (Standard-Coomb's indirekte Assays), als auch nicht konventionelle Assays (Micro Typing System., Inc., beschrieben im US-Patent Nr. 5,338,689 und der Protein A basierte Assay, beschrieben in WO 9531731 A) setzen auf die Verwendung eines Antikörpers in dem Assay, welcher in eukaryontischen Zellen exprimiert wird, entweder als ein monoklonaler oder als ein polyklonaler Antikörper.
  • Gemäß der Erfindung werden Antikörper beschrieben, welche auf der Oberfläche eines Virus exprimiert werden, vorzugsweise eines Bakteriophagen, welcher verwendet werden kann, um schnell rote Blutkörperchen zu typisieren im Hinblick auf Antigene, die darauf exprimiert werden, vorzugsweise Rh-Antigene, d.h. dieses Verfahren der Erfindung involviert die Verwendung von durch Phagen erzeugten Antikörpern, um Blut zu typisieren.
  • Das zelltypisierende Verfahren der Erfindung ist nicht limitiert auf die Verwendung eines speziell screenenden Verfahrens zur Isolation von Antikörper exprimierenden Bakteriophagen, wie hier beschrieben (d.h. die Anwendung von magnetischen Beads um die Phaghen zu screenen), sondern vielmehr ist es auch anwendbar, auf Antikörper-exprimierende Phagen, welche erhalten werden unter Verwendung anderer bekannter Phagen screenender Verfahren einschließend, jedoch nicht limitiert auf fluoreszierendes Panning-Verfahren, wie beschrieben, in De Kruif et al., (supra) und ist auch anwendbar auf Phagen, welche erhalten werden unter Verwendung von bislang noch unbekannten Phagen-Screening-Verfahren, welche in der Zukunft verfügbar sein werden. Folglich ist beabsichtigt, dass das rote Blutkörperchen-typisierende Verfahren der vorliegenden Erfindung mit irgendwelchen Bakteriophagen verwendet werden kann, welche Antikörper exprimieren unabhängig von der Art und Weise, auf welcher die Bakteriophagen erhalten werden.
  • Das zelltypisierende Verfahren der Erfindung ist nicht einmal limitiert auf Phagen-Display-Bibliotheken, welche das Panning für das Screenen benötigen. Vielmehr kann ein monoklonales Antikörpersystem in ein Phagensystem wie folgt konvertiert werden, wobei der dadurch erzeugte Antikörper kein Panning benötigt. Dieser Typ des Systems wird in Siegel et al. (1994, Blood 83:2334–2344) beschrieben. Kurz gesagt, wird monoklonale Antikörper produzierende Hybridomzell mRNA in cDNA konvertiert. Diese DNA wird vielmals amplifiziert unter Verwendung der PCR-Technologie, um eine multiple Kopie-Bibliothek zu erzeugen, welche in das hier beschriebene Bakteriophagen-System gepackt wird. Eine so erzeugte Bibliothek benötigt kein Panning per se; vielmehr werden wenige Kolonien aufgesammelt und hinsichtlich der Produktion eines geeigneten Antikörpers gescreent. Derzeit verwenden viele Blutbanken monoklonale Maus-Antikörper gegen A, B, AB und 0-Blutgruppen zum Typisieren von Blut. Da es ultimativ billiger ist, Phagen-Display-Antikörper zu erzeugen und verwenden, welche in Bakterien propagiert werden können, als monoklonale Antikörper zu erzeugen und verwenden, welche in Zellkultur produziert wurden, stellen die Verfahren der vorliegenden Erfindung signifikante Vorteile gegenüber den derzeit verwendeten Verfahren zur Verfügung.
  • Das Verfahren der Erfindung bezieht sich auf den Nachweis eines Antigens auf einem roten Blutkörperchen und umfasst das Inkubieren einer Mischung von roten Blutkörperchen, eines Bakteriophagen mit einem Antikörper, der dadurch auf der Oberfläche des Bakteriophagen exprimiert wird, wobei der Antikörper spezifisch für ein Antigen des roten Blutkörperchens ist, und eines antibakteriophagen Antikörpers, sowie das Bestimmen, ob die roten Blutkörperchen in der Mischung an den Phagen gebunden wurden, wobei das Binden der roten Blutkörperchen an den Phagen ein Hinweis darauf ist, dass das rote Blutkörperchen ein Antigen enthält, welches an den Antikörper, exprimiert durch den Bakteriophagen bindet.
  • Der Nachweis von roten Blutzellen, welche an den Phagen binden, kann realisiert werden in einem Agglutinationsassay. Die Agglutination kann detektiert werden unter Verwendung von konventionellen Agglutinationsassays, wobei die roten Blutzellen entweder zentrifugiert werden, oder anhand der Möglichkeit, sich am Boden der Tube oder eines Wells abzusetzen, wobei die Ausbildung der Agglutinate durch Untersuchen der abgesetzten Zellen in einem konkaven Spiegel ausgewertet wird. Alternativ kann die Agglutination ausgewertet werden unter Verwendung von Micro Typing Systemkarten, wobei ein Anti-Phagen-Antikörper verwendet wird, anstelle von Coomb's Reagenz.
  • Verschiedene verfügbare mikrotypisierende Systeme sind kommerziell verfügbar, welche zur Anwendung einer vorliegenden Erfindung adaptiert werden können.
  • In einem Karten-typisierenden Assay wird beispielsweise, jedoch nicht limitiert, auf den Mikrosystem-typisierenden Assay, eine Mischung von roten Blutzellen und ein Antikörper-exprimierender Phage inkubiert und auf eine Mikrotube angewandt, welche inerte Partikel enthält sowie einen anti-Phagen Antikörper. Der anti-Phagen-Antikörper wird nur diejenigen roten Blutzellen binden, welche Antikörper-exprimierende Phagen daran gebunden aufweisen, wobei die roten Blutzellen dafür selbst ein Antigen exprimieren, an welches der Antikörper exprimiert durch den Phagen bindet. Die Mikrotube wird in einer gesteuerten Art und Weise zentrifugiert, wobei starke Agglutination (Quervernetzung von Zellen/Phagen präsentierend Antikörper und anti-Phagen-Antikörper in der Tube) essentiell keine Bewegung der roten Blutkörperchen/Phagen mit präsentierten Antikörpern/anti-Phagen-Antikörper-Agglitunat durch die Tube erzeugt. Falls keine Agglutination aufgetreten ist, dann werden die roten Blutkörperchen einen sichtbaren Niederschlag am Boden der Mikrotube ausbilden. Falls eine schwache Agglutinationsreaktion aufgetreten ist, dann wird eine gewisse Verteilung an roten Blutkörperchen durch die Tube evident sein.
  • Es ist nicht vollständig notwendig, dass die Mikrotube zentrifugiert wird. Sedimentation der Komponenten des Assays kann realisiert werden dadurch, dass man das Gefäß stehen lässt und den Vorteil des Einflusses der Schwerkraft nutzt. Jedoch ist es mehr von Vorteil, die Tube zu zentrifugieren. Die Mikrotube, verwendet, um die Zellagglutination nachzuweisen, ist eine transparente Mikrotube mit einem oberen und einem unteren Teil, wobei der obere Teil breiter ist als der untere Teil. Die Mikrotube hat ein öffnendes oberes Ende und ein geschlossenes unteres Ende und ist in der Lage, den Zentrifugalkräften zu widerstehen, welche hinreichend sind, um eine Population von Zellen auszufällen.
  • Die Bezeichnung „inert", wie sie hier verwendet wird, bezieht sich auf Partikel, welche in der Mikrotube vorliegen und so bezeichnet werden, weil es sich versteht, dass sie nicht in irgendwelche unspezifischen Reaktionen mit den speziellen Antigenen oder Antikörpern, welche zur Tube hinzugefügt werden, eintreten werden. Inerte Partikel können inerte poröse Partikel umfassen, welche kommerziell für Gas- oder Flüssigkeitschromatographie verfügbar sind. Diese Produkte basieren auf quervernetzten Polymeren, wie z.B. Agarose, Polyacrylamid, Polydextran oder Styren divinylbenzen-Polymeren, wie z.B. Sephadex, Sepharose oder Sephacryl vertrieben von Pharmacia AB, Uppsala, Schweden. Poröse Glas- oder Silikagel-Partikel sind auch geeignet. Die spezielle Größe ist vorzugsweise 10–200 μm.
  • Die Mikrotuben, in welchen der Assay durchgeführt wird, können in einer Form einer Testkarte angeordnet werden, wie z.B. in US-Patent Nr. 5,338,689. Die Tuben können an eine Karte angebunden werden, oder einen integralen Teil der Karte darstellen in der Form von darin enthaltenen Blasen.
  • Das Binden von Antikörpern, welche durch Phagen exprimiert werden, an rote Blutkörperchen, kann auch in einem Assay nachgewiesen werden, welcher kein Agglutinationsassay ist. Dieser Assay wird hier als „Einfang"-Assay bezeichnet. Beispielsweise kann ein Assay durchgeführt werden in einer Mikrotube, welche inerte Partikel enthält, wie z.B., jedoch nicht limitiert auf Gel-Beads, wobei die Beads mit anti-Phagen-Antikörpern überzogen sind. Um Beads zu erzeugen, welche mit anti-Phagen-Antikörpern überzogen sind, können die Beads zuerst mit Avidin oder Streptavidin überzogen werden. Dies wird realisiert durch chemisches Anbinden solcher Verbindungen an Beads unter Verwendung von Gelen, welche mit aminoreaktiven Gruppen aktiviert werden (beispielsweise N-Hydroxysuccidimidylester oder Cyanogenbromid), mit Amino- oder Thiol-reaktive Gruppen (beispielsweise Epoxy-aktivierte Gele), oder Thiol-reaktive Gruppen (beispielsweise Thiopropyl-aktivierte Gele). Viele aktivierte Gelunterlagen sind kommerziell verfügbar, beispielsweise von Pierce Chemical Co. (Rockford, IL) und Pharmacia Biotech (Uppsala, Schweden). Darüber hinaus sind Gelunterlagen, welche bereits chemisch derivatisiert sind mit Avidin- oder Streptavidin von vielen Anbietern, zellverfügbar.
  • Darüber hinaus können Beads, welche mit anti-Phagen-Antikörpern überzogen sind, unter Verwendung von Ziege-Anti-Schaf-Antikörpern erzeugt werden und anti-M13-Antikörpern, welche in Schafen erzeugt wurden (verfügbar von 5-Prime 3-Prime). Alternativ können Beads überzogen werden mit Ziege-anti-Kaninchen-Antikörpern und Anti-M13-Antikörpern, welche in Kaninchen erzeugt worden sind. In ähnlicher Art und Weise können Beads überzogen werden mit Ziege-anti-Maus-Antikörpern und Mauspolyklonalen oder monoklonalen anti-M13-Antikörpern.
  • Beads können auch überzogen werden durch Konjugieren von Anti-M13-Antikörpern mit Fluoreszein oder anderen Verbindungen und Konjugieren der Beads mit anti- Fluoreszein-Antikörpern oder anderen geeigneten Antikörpern abhängig von den Verbindungen konjugiert mit dem anti-M13-Antikörper.
  • Ein biotinylierter anti-Phagen-Antikörper wird zu den so überzogenen Beads hinzugegeben, um das Überziehen der Beads mit anti-Phagen-Antikörpern zu bewirken. Eine Mischung von roten Blutkörperchen und Phagen, welche Antikörper exprimieren, wird in Mikrotuben eingebracht, welche Beads, überzogen mit anti-Phagen Antikörpern, enthalten, die Inkubation wird für einen gewissen Zeitraum ermöglicht, und die Tube wird zentrifugiert. Rote Blutkörperchen, welche Antikörper exprimierende Phagen daran gebunden, aufweisen, werden „eingefangen" durch Anti-Phagen-überzogene Beads und werden folglich nicht auf den Boden der Tube sedimentieren, wohingegen rote Blutkörperchen, welche keine Antikörper-exprimierenden Phagen daran gebunden aufweisen, nicht „eingefangen" werden und auf den Boden der Tube sedimentieren werden.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist das Antigen auf den roten Blutkörperchen das Rh(D)-Antigen, der Antikörper-exprimierende Bakteriophage ist M13, und der anti-Phagen-Antikörper ist der anti-M13-Antikörper.
  • Die Erfindung wird des weiteren beschrieben im Detail durch Verweis auf die folgenden experimentellen Beispiele. Diese Beispiele werden nur zum Zwecke der Illustration zur Verfügung gestellt und sind nicht so gedacht, dass sie limitierend wirken, solange nicht anders spezifiziert. Folglich sollte die Erfindung in keinster Art und Weise so konstruiert werden, dass sie limitiert ist auf die folgenden Beispiele, vielmehr sollte sie so konstruiert werden, dass sie irgendwelche und alle Variationen, welche evident als ein Ergebnis der hier bereitgestellten Lehren werden, mit einschließt.
  • In 1 wird ein Verfahren beschrieben zur Isolation von filamentösen Phagen-präsentierten menschlichen monoklonalen Antikörpern, welche spezifisch für unaufgereinigte Zelloberflächen exprimierte Moleküle sind. Um das Einfangen der Antigen-spezifischen Phagen zu minimieren und das Binden von irrelevanten Phagen-Antikörpern zu optimieren, wurde eine simultane positive und negative Selektionsstrategie eingesetzt. Zellen, welche das Antigen von Interesse tragen, wurden vor-überzogen mit magnetischen Beads und verdünnt in einem Überschuss von unmodifizierten Antigen-negativen Zellen. Auf die Inkubation der Zellmischung mit einer Fab/Phagen-Bibliothek wurde die Antigen-positive Zellpopulation ausgewählt unter Verwendung von magnetisch aktiviertem Zellsorting und die Antigen-spezifischen Fab/Phagen wurden eluiert und in bakterieller Kultur propagiert. Wenn dieses Protokoll eingesetzt wurde mit magnetisch gelabelten Rh(D)-positiven und überschüssig ungelabelten Rh(D)-negativen menschlichen Blutkörperchen und einer Fab/Phagen-Bibliothek, konstruiert von menschlich peripheralen Blutlymphozyten, wurden dutzende von einzigartigen klinisch bedeutsamen γ1κ und γ1λ Anti-Rh(D)-Antikörper von einem einzelnen alloimmunisierten Individuum isoliert.
  • Das Zell-Oberflächen-Selektionsverfahren der vorliegenden Erfindung ist fertig verfügbar zur Anwendung in anderen Systemen, beispielsweise zur Identifikation von putativen tumorspezifischen Antigenen und stellt einen schnellen (weniger als einen Monat) Ansatz mit hoher Ausbeute zum Isolieren von selbst-replikativen Antikörper-Reagenzien, gerichtet auf neu oder konformatorisch abhängige Zelloberflächenepitope, zur Verfügung.
  • Die experimentellen Beispiele, wie hier beschrieben, stellen Prozeduren zur Verfügung und Ergebnisse zur Isolierung und Produktion von Anti-Rh(D) roten Blutkörper-Antikörpern unter Verwendung von Fab/Phagen-Display. Diese Beispiele stellen auch Prozeduren zur Verfügung zur Agglutination von roten Blutkörperchen unter Verwendung von anti-Phagen-Antikörpern.
  • Erzeugung von Fab/Phagendisplay-Bibliotheken
  • Getrennte γ1κ und γ1λ Phagen-Bibliotheken wurden konstruiert von 2 × 107 mononuklearen Zellen, abgeleitet von peripheralem Blut eines Rh(D)-negativen Individuums, welches zuvor mit Rh(D)-positiven roten Blutzellen hyperimmunisiert wurden. Der Phagemidvektor Comb3 (Barbas, 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:7978–7982) wurde verwendet, um Bibliotheken unter Verwendung von zuvor veröffentlichten Verfahren zu erzeugen (Barbas et al., 1991, Combinatorial immunoglobin libraries on the surface of phage (Phabs): Rapid selection of antigen-specific Fabs. Methods: A Companion to Methods in Enzymology 2:119–124; Siegel et al., 1994, Blood 83:2334–2344).
  • Kurz gesagt, wurde die cDNA erzeugt aus der mRNA der Donor-Zellen und schwere Ketten und leichte Ketten-Immunoglobulin (Ig) cDNA-Segmente wurden amplifiziert unter Verwendung der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) und der Batterie der menschlichen Ig-Primern beschrieben von Kang et al. (1991), „Combinatorial Immunoglobulin Libraries on the Surface of Phage (Phabs): Rapid Selection of Antigen-Specific Fabs. Methods: A Companion to Methods" in Enzymology 2:111–118, beschrieben von Silverman et al. (1995, J. Clin. Invest. 96:417–426). Die schweren und leichten Ketten PCR-Produkte wurden in einen E. coli. elektropoliert. Nach Co-Infektion mit VCSM13 Helferphagen (Stratagene, La Jolla, CA), wurde Ig DNA in filamentöse Phagenpartikel gepackt, welche menschliche Fab-Moleküle exprimieren, fusioniert an Gen III Bakteriophagen-Coat-Protein.
  • Panning von Fab-Phagendisplay-Bibliotheken hinsichtlich Anti-Rh(D)-Klonen
  • Rh(D)-positive rote Blutkörper wurden an der Zelloberfläche biotinyliert durch Inkubieren der Zellen bei einem Hämatokrit von 10% mit 5 μg/ml Sulfo-NHS-LC-Biotin (Pierce Chemical, Rockford, IL) für 40 Minuten bei Raumtemperatur (RT).
  • Auf fünf folgende Waschvorgänge mit Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS) wurden 8 × 106 biotinylierte Rh(D)-positive rote Blutkörperchen inkubiert mit 10 μl an Streptamycin gecoateten paramagnetischen Mikrobeads (MACS Streptavidin Mikrobeads, Mitenyi Biotec, Sunnyvale, CA) für 1 Stunde bei Raumtemperatur in einem Gesamtvolumen von 100 μl PBS. Unreagierte Beads wurden durch Waschen entfernt, und anschließend wurden die mit magnetischen Beads überzogenen Rh(D)-positiven roten Blutkörperchen mit einem 10fachen Überschuss (8 × 107) von Rh(D) negativen (unmodifizierten) roten Blutkörperchen und ungefähr 3 × 1011 kolonieausbildenden Einheiten (cfu) entweder der γ1κ und γ1λ Fab/Phagen Bibliotheken (hergestellt, wie oben beschrieben) in einem letztendlichen Volumen von 40 μl PBS enthaltend 2% nicht-fette trockene Milch (MPBS, Carnation, Nestle Food Products, Glendale, CA) vermischt.
  • Auf eine zweistündige Inkubation bei 27°C wurde die rote Blutkörperchen/Phagensuspension bei einer Fließrate von 10 μl/Minuten auf eine MiniMACS-Magnetische-Typ-MS-Säule (Mitenyi Biottec, Sunnyvale, CA) geladen, welche mit 2% MPBS pre-equilibriert worden war. Der Beladungsschritt wurde durchgeführt, ohne ein magnetisches Feld auf die Säule, um damit zu verhindern, dass rote Blutkörperchen, die mit magnetischen Beads überzogen worden waren, instant an den oberen Abschnitt der Säule anhafteten, diese verstopften und das Einfangen von Rh(D)-negativen unbiotinylierten roten Blutkörperchen erzeugten. Das Beladen der roten Blutkörperchen/Phagen-Inkubations-Mischung in der Abwesenheit eines magnetischen Feldes verursacht, dass Antigen-negative und Antigen-positive rote Blutkörperchen sich gleichmäßig über die Säule verteilen, ohne auszulaufen, da das ausgeschlossene Volumen der Säule etwas größer als 40 μl ist. Sobald sie beladen wurde, wurde die Säule in ein magnetisches Feld platziert (MiniMACS magnetic separation unit, Mitenyi Biotec, Sunnyvale, CA) für zwei Minuten, um zu ermöglichen, dass die Rh(D)-positiven roten Blutkörperchen anhafteten und eine Serie von 50 μl Waschungen wurde durchgeführt mit eiskaltem MPBS, gefolgt von einem letztendlichen Waschschritt mit PBS. Insgesamt drei Waschungen wurden durchgeführt für die ersten beiden Runden des Pannings und insgesamt sechs Waschungen wurden durchgeführt für alle folgenden Panning-Schritte. Für jeden Panning-Schritt wurde der erste Waschschritt durchgeführt bei einer Fließgeschwindigkeit von 10 μl/Minute, wobei während dieser Zeit die Menge von Rh(D)-negativen roten Blutkörperchen aus der Säule ausgewaschen wurde. Alle nachfolgenden Waschschritte wurden bei 200 μl/Minuten durchgeführt. Folgend auf den letzten Waschschritt wurde die Säule aus dem magnetischen Feld entfernt und die Bead-überzogenen Phagen/überzogenen Rh(D)-positiven roten Blutkörperchen wurden von der Säule per Flash-Chromatographie abgetrennt mit 500 μl PBS unter Verwendung des Stempels aus einer 5 cc Spritze (Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ).
  • Die roten Blutzellen wurden sofort zentrifugiert für 5 Sekunden bei 13.000 × g und dann re-suspendiert in 200 μl an 76 mM Citrat, pH 2,4, um das Rh(D)-Antigen zu denaturieren und in gebundenen Phagen zu eluieren. Auf einen 10minütigen Inkubationszeitraum bei RT mit vorübergehendem Vortexing wurde das Phageneluat und die zelluläre Debris neutralisiert mit 18 μl 2 M Trisbase und anschließend mit 10 ml an O.D.=1,0 XL 1-Bluestrain von E. coli (Stratagene, La Jolla, CA) kultiviert in Superbroth (SB) (Barbas et al., 1991, supra) angereichert mit 10 μg/ml Tetracyclin kultiviert. Nach der Inkubation von 15 Minuten bei Raumtemperatur, währenddessen die Phagenbibliothek angereichert mit Rh(D) bindenden Elementen, Gelegenheit gegeben wurde, die bakterielle Kultur zu infizieren, wurden 10 ml an vorgewärmtem, 37°C SB enthaltend 40 μg/ml Carbenicillin/10 μg/ml Tetracyclin hinzugesetzt, um letztendliche antibiotische Konzentrationen von 20 μg/ml bzw. 10 μg/ml zu liefern. Ein kleines Aliquot an Kultur (etwa 100 μl) wurde sofort entfernt und auf LB/Carbenicillinplatten getitert, um die Anzahl von Phagen enthalten in dem gesamten Eluat zu bestimmen. Der Rest der Kultur wurde bei 37°C für eine Stunde bei 300 RPM geschüttelt. Weitere Antibiotika, zusätzliche SB und VCSM13 Helferphagen wurden anschließend hinzugegeben und die Kultur wurde über Nacht bei 30°C, wie bei (Siegel et al., 1994, supra) beschrieben, gezüchtet.
  • Phagemid-Partikel wurden aus dem Kultivierungsüberstand durch Polyethylen-Glycol 8000 (PEG)-Präzipitation (Barbas et al., 1991, supra) aufgereinigt in 1 Bovinserumalbumin (BSA)/PBS resuspendiert und über Nacht dialysiert, um verbleibendes PEG zu entfernen, welches rote Blutkörperchen lysieren kann, während der nachfolgenden Runden des Pannings. Folglich dienen die resultierenden Phagenherstellungen als Ausgang für die nächste Runde des Pannings. Die γ1κ und γ1λ Phagen-Bibliotheken wurden separat gepanned, um irgendwelche Neigungen in der Leichtketten-Isotyp-Replikation zu vermeiden, welche möglicherweise durch bakterielle Amplifikation eingefügt werden könnten.
  • Screenen von polyklonalen Fab/Phagen-Bibliotheken und individuellen Phagen-Kolonien hinsichtlich der Anti-Rh(D)-Reaktivität
  • Die Spezifität der Fab/Phagen für Rh(D)-Antigen wurde ausgewertet unter Verwendung eines Anti-M13-Antikörpers als verbrückender Antikörper, um die Agglutination zwischen roten Blutkörperchen, welche Anti-Rh(D) Fab/Phagen gebunden hatten, zu induzieren. Hundert μl Aliquots von polyklonalen Fab/Phagen von Runden des Pannings oder monoklonalen Fab/Phagen abgeleitet von individuellen Fab/Phagen-Eluatklonen wurden inkubiert mit 50 μl einer 3%-Suspension von roten Blutzellen eines definierten Phenotyps (d.h. Rh(D)-negativ oder -positiv).
  • Auf eine einstündige Inkubation bei 37°C wurden die roten Blutkörperchen 3 mal mit 2 ml kaltem PBS gewaschen, um gebundene Fab/Phagen zu entfernen. Die resultierenden roten Blutkörperchen-Niederschläge wurden re-suspendiert in 100 μl an einer 10 μg/ml-Lösung von Schaf-Anti-M13-Antikörper (5-Prime 3-Prime, Boulder, CO) und auf die rund-vertieften Wells einer 96 Wellen-Mikrotiterplatte transferiert. Die Platten blieben unbeeinträchtigt (ungefähr 2 Stunden) und wurden dann ausgelesen. Wells mit einer negativen Reaktion zeigen scharte, ungefähr 2 mm Durchmesser Blutkörper-Zellspots, wohingegen Wells mit positiven Reaktionen, d.h. Agglutination, die roten Blutkörperchen in agglutinierten Wells, einen dünnen teppichartigen Überzug über den gesamten Boden des Wells ausbilden.
  • Für die Hemagglutinations-Assays an der Verwendung von Mikrosäulen-Gelkarten (ID-Micro-Typing System, Ortho Diagnostics, Raritan, NJ) wurden 25 μl an Fab/Phagen-Klonen mit 50 μl Aliquots von roten Blutkörperchen (0,8% Suspension in Micro Typing System Paffer, Ortho Diagnostics) vermischt. Die Mischungen wurden in Reservoirs oberhalb der Minisäulen platziert, welche Dextran-Acrylamid-Beads enthalten, die zuvor in 100 μl/ml Anti-M13-Antikörpern suspendiert wurden. Nach Inkubation bei 37°C wurden die Gelkarten bei 70 × g für 10 Minuten zentrifugiert und ausgelesen.
  • Vermischte Verfahren
  • Herstellung von Fluoreszenz-gelabelten roten Blutkörperchen für die Durchfluss-Zytrometrie wurden durchgeführt, wie hier beschrieben und Beispiele wurden analysiert unter Verwendung eines FACScan Mikrofluorimeters, ausgestattet mit Lysis II (Ver 1.1)-Software (Becton-Dickinson, Mountain View, CA). Plasmid-DNA wurde hergestellt durch bakterielles Klonen (Qiawell Plus, Qiagen, Chatsworth, CA). Doppel-strängige DNA wurde sequenziert unter Verwendung von Leichtketten- oder Schwerketten-Ig konstanten Region-reversen Primern oder einzigartigen pComb3 Vektor-Primern, welche 5-Prime zur entsprechenden Ig-Kette annealen (Barbas et al., 1991, supra; Roben et al., 1995, J. Immunol. 154:6437–6445) sowie automatisiertem Fluoreszenz-Sequenzieren (Applied Biosystems, Foster City, CA). Sequenzen wurden analysiert unter Verwendung von Mac Vector Version 5.0 Sequenzierungssoftware (Oxford Molecular Group, Oxford, UK) und der Tomlinson Datenbank von Ig Keimbahn-Genen (Tomlinson et al., 1996, V Base Sequence Directory. MRC Center for Protein Engineering, Cambridge, UK).
  • Experimentelles Design für die Zellinkubation und die Abtrennungsprotokolle
  • Die experimentellen Bedingungen, wie oben beschrieben, zum Panning von Fab/Phagen-Bibliotheken für anti-rote Blutkörperchen reaktive Phagen wurden bestimmt nach Durchführen einer Serie von anfänglichen Untersuchungen mit dem Ziel der Optimierung des Zellseparationsprozesses sowie einer ultimativen Ausbeute von Antigen-spezifischen Fab/Phagen. Die hauptsächlichen Parameter, welche untersucht wurden, schlossen ein:
  • Biotinylierung
  • Die Bedingungen wurden so konzipiert, dass sie die rote Blutkörperchen-Oberfläche in einer Art und Weise biotinylierten, so dass eine hinreichende Anzahl von Streptavidin-überzogenen magnetischen Beads an die Zellen binden würden, wobei verursacht würde, dass die roten Blutkörperchen von einer magnetischen Säule zurückgehalten werden. In diesem Fall wird die Über-Biotinylierung, welche die Antigenizität des Rh(D)-Antigens zerstören könnte oder die Zellen zur nicht-spezifischen Absorption von Antikörpern führen würde, zu vermeiden. Um dieses Problem zu adressieren, wurden Rh(D)-positive/Kell-negative rote Blutkörperchen (wobei Kell ein rotes Blutzell-Antigen ist; (Walker, ed. 1993, Technical Manual. 11th Edition, Bethesda: American Association of Blood Banks) mit einem Bereich von Sulfo-NHS-LC-Biotin Konzentrationen inkubiert und der Grad der Biotinylierung wurde ausgewertet mit Hilfe von Durchfluss-Cytrometrie unter Einsatz von Fluoreszein-konjugiertem Streptavidin.
  • Um den Grad der Zell-Oberflächenbiotinylierung auszuwerten, wurden 5 μl Aliquots von 3% Suspension von Rh(D)-positiven/Kell-negativen roten Blutkörperchen bei verschiedenen Biotin-Reagenzkonzentrationen biotinyliert und wurden mit 200 μl einer 1/100-Verdünnung von FITC-Streptavidin (Jackson ImmunoResearch, Bar Harbor, Maine) für 30 Minuten bei 4°C (2) inkubiert. Die Mischung wurde mit Phosphat-gepufferter Salzlösung (PDS) gewaschen, und mit Durchfluss-Mikrofluorimetrie (-☐-) analysiert. Aliquots von Zellen wurden auch analysiert hinsichtlich des Erhalts der Rh(D)-Antigenizität (-Δ-), (d.h. spezifisches Anfärben) oder für das nicht Vorliegen von nicht-spezifischem Anfärben (-O-) durch Inkubation der Zellen mit 100 μl entweder von Anti-Rh(D) bzw. Anti-Kell-typisierten Seren, Waschen der Zellen und ihr anschließendes Färben mit einer 1/100 Verdünnung von FITC-Ziege-Anti-menschlichem IgG (Jackson ImmunoResearch).
  • Eine lineare nicht-sättigende Antwort wurde beobachtet (2). Der Erhalt der Rh(D)-Antigenizität wurde ausgewertet unter Verwendung von Anti-Rh(D) typisierendem Serum und wurde als nicht beeinträchtigt durch die Derivatisierung von Zell-Oberflächen-Proteinen mit Biotin bei allen getesteten Biotin-Konzentrationen gefunden (2). Desweiteren absorbierten Kell-negative rote Blutkörperchen nicht nicht-spezifische anti-Kell-Antikörper.
  • Jede biotinylierte rote Blutkörperchen-Probe wurde dann mit einem Überschuss an Streptavidin-gecoateten magnetischen Mikrobeads inkubiert und einer magnetischen Abtrennungssäule unterzogen. Es wurde bestimmt, dass bis zu 108 rote Blutkörperchen von der Säule zurückgehalten werden könnten, bei roten Blutkörperchen-Proben, die mit mehr als oder genau 500 μg/ml Biotinreagenz biotinyliert wurden. Da die tatsächlichen rote Blutkörperchen/Phagen Panning-Experimente zur Anwendung von nur ungefähr 107 (Rh(D)-positiven Zellen (siehe unten) konzipiert wurden, wurde die rote Blutkörperchen-Zellbiotinylierung bei 500 μg/ml als hinreichend bestimmt.
  • Konzentration von Rh(D)-positiven und Rh(D)-negativen RBSs in der Inkubationsmischung
  • Vor dem Durchführen des Fab/Phagen-Panning-Experimentes wurde die Fähigkeit der magnetisch aktivierten Zellseparationstechnik, Rh(D)-positive und Rh(D)-negative Zellen zu trennen, ausgewertet unter Verwendung von Anti-Rh(D)-typisierendem Serum und Durchflusszytrometrien (3). Streptavidin-Mikrobead-überzogene biotinylierte Rh(D)-positive rote Blutkörperchen (8 × 106-Zellen) wurden mit einem 10fachen Überschuss an Rh(D)-negativen nicht überzogenen roten Blutkörperchen (8 × 107-Zellen) in einem 40 μl Volumen an PBS enthaltend 2% nicht fetter trockener Milch (MPBS) vermischt und die Mischung wurde auf eine MiniMACS-Säule aufgebracht. Die Säule wurde gewaschen und die gebundenen Zellen wurden, wie hier beschrieben, eluiert. Aliquots von roten Blutkörperchen enthalten in der Originalmischung (Panel a), der Säulenwaschlösung (Panel b) des Säuleneluats (Panel c) wurden mit Anti-Rh(D)-typisierendem Serum und FITC-Ziege-anti-menschliches IgG angefärbt, wie in 2 beschrieben. Die Durchflusszytogramme zeigten, dass obwohl ungefähr 90% der Zellen in der Säulenbeladung Rh(D)-negativ (Panel a) waren, beinahe alle von ihnen aus der Säule (Panel b) ausgewaschen wurden, was zu einem Säuleneluat führte, das beinahe vollständig Rh(D)-positive Zellen (Panel c) lieferte. Da ungefähr nur 6% des letztendlichen Eluats Rh(D)-negative Zellen (Panel c) umfassen und Rh(D)-negative Zellen anfänglich in einen 10fachen Überschuss im Vergleich zu Rh(D)-positiven Zellen vorlagen, waren nur 0,6% der ursprünglichen Antigen-negativen immunosorbenten Zellen kontaminierend für die letztendliche Antigen-positive Herstellung. Diese Effizienz der Zellabtrennung wurde als adäquat für folgende Paning-Experimente mit Fab/Phagen erachtet. In den oben beschriebenen Experimenten war es nötig, um das Verklumpen der magnetischen Abtrennungssäule zu vermeiden, die Säule in der Abwesenheit eines magnetischen Feldes zu beladen. Dies machte ein Reaktionsvolumen notwendig von weniger als, oder gleich 40 μl, so dass kein Material aus der Säule laufen konnte. Aus theoretischen Gründen (Kretzschmar et al., 1995, Anal. Biochem. 224:413–419) kann man geeignete Konzentrationen der Zellen, benötigt für ein 40 μl Volumen berechnen, um mehr als 50% an Fab/Phagen, spezifisch für ein gegebenes Zelloberflächen-Antigen einzufangen. Solch eine Berechnung ist eine Funktion der Anzahl der Antigenstellen pro Zelle und der Dissoziationskonstante (KD) des gebundenen Fab/Phagen. Unter Verwendung eines Wertes von ungefähr 100,000 Rh(D)-Antigenstellen pro roten Blutkörperchen (Phenotyp „-D-/D-„) (Mollison et al., 1993, Blood Transfusion in Clinical Medicine, Oxford, Blackwell Scientific Publications) und der gewünschten Fab/Phagen-Affinität im Bereich von KD = 10–8 bis 10–9 M würden dann 8 × 106 Rh(D)-positive rote Blutkörperchen in einem 40 μl Reaktionsvolumen benötigt werden. Geht man von dieser Anzahl von Rh(D)-positiven Zellen aus, wurde ein 10facher Überschuss von Rh(D)-negativen Zellen als maximale Menge von Antigen-negativen Zellen gefunden, welche effektiv von Antigen-positiven roten Blutkörperchen durch magnetische Säule (3) abgetrennt werden könnten.
  • Konstruktion und Panning von Fab/Phagen-Bibliotheken
  • γ1κ und γ1λ Phagen-Bibliotheken wurden hergestellt, wie hier beschrieben, und man fand, dass sie 7 × 107 und 3 × 108 unabhängige Transformanten enthielten. Tabelle 1 führt die Panning-Ergebnisse für die Bibliotheken auf.
  • Ein roter Blutzell-Agglutinations-Assay, welcher Anti-M13 sekundäre Antikörper einsetzte als überbrückende Antikörper, wurde verwendet, um Anti-Rh(D)-Fab/Phagen-Aktivität in den gepannten polyklonalen Bibliotheken und den individuellen zufällig aufgelesenen Fab/Phagen-Klonen (4) nachzuweisen. Die dargestellten Ergebnisse sind ein repräsentatives Beispiel des Assays und stellen negative Reaktivitäten mit Rh(D)-negativen Blutzellen und stark positive Reaktivität mit Rh(D)-positiven roten Blutzellen für die γ1κ-Bibliotheken (Panning #2) bis zu einer Verdünnung von 1/2048 dar.
  • Im Falle der γ1κ-Bibliothek scheint eine signifikante Anreicherung des Bindens an den Phagen nach nur einer Runde des Pannings aufzutreten, wohingegen signifikante Anreicherung für die γ1λ-Bibliothek während der zweiten Runde auftritt. Dies wird sowohl durch das scharfe prozentuale Ansteigen des gebundenen Phagen während einer gegebenen Runde von Pannings reflektiert, wie auch durch die Fähigkeit der polyklonalen γ1κ und γ1λ Fab/Phagen-Bibliotheken, Rh(D)-positive rote Blutkörperchen nach einer bzw. zwei Runden des Pannings (Tabelle 1, 4) zu agglutinieren.
  • Monoklonale Fab/Phagen wurden hergestellt aus zufällig aufgelesenen individuellen bakteriellen Kolonien, erhalten während einer jeden Runde des Pannings. Es war offensichtlich, dass durch die dritte Runde des Pannings alle Klone Anti-Rh(D)-Spezifität (Tabelle 1) aufwiesen. Um zu bestätigen, dass diese Fab/Phagen Anti-Rh(D)-Spezifität aufweisen und nicht an andere nicht verwandte Antigene binden, welche zufällig auf den speziellen Rh(D)-positiven roten Blutkörperchen vorlagen und auf speziellen Rh(D)-negativen roten Blutkörperchen, die in dem Agglutinationsassay verwendet wurden, nicht vorlagen, wurden die Klone gegen ein Pannel von 11 Rh(D)-negativen und -positiven roten Blutkörperchen von variierenden Blutgruppen Spezifitäten gescreent, um ihre Anti-Rh(D)-Spezifität zu verifizieren ((Walker, 1993, supra).
  • Klonale Analyse des genetischen Grades
  • Um die genetische Diversität unter den zufällig aufgelesenen Anti-Rh(D)-Klonen zu untersuchen, wurde Plasmid-DNA hergestellt aus jedem der Klone und die korrespondierenden Schwer- und Leicht-Ketten-Ig-Nukleotidsequenzen wurden identifiziert. In Tabelle 2 wird eine Vielzahl von Attributen für jeden Klon aufgelistet, einschließend den Namen der am stärksten verwandten Keimbahn-schweren oder leichten Ketten Ig-Genen. Eine detailliertere Analyse der Nukleotidspiegel führte zutage, dass unter allen der anti-Rh(D)-bindenden Klone eine große Vielzahl von einzigartigen schweren und leichtkettigen DNA-Sequenzen (Tabelle 3) vorlag. Aufgrund des zufälligen Auswählens von schweren und leichten Ketten- und Gensegmenten, welche während der Erzeugung einer Fab/Phagen-Display-Bibliothek vorlagen (Barbas et al., 1991, supra), ist es evident, dass diese schweren Ketten und leichten Ketten sich aus beinahe 50 unterschiedlichen anti-Rh(D)-Antikörpern kombinierten.
  • Eine detaillierte multiple Abgleichsanalyse der vorhergesagten Aminosäuresequenzen führte insgesamt 25 einzigartige schwere Ketten, 18 einzigartige kappa-leichte Ketten und 23 einzigartige lambda-leichte Kettenproteine zutage. Aufgrund des kombinatorischen Effektes während der Bibliothekkonstruktion paarten sich diese schweren und leichten Ketten-Gensegmente so, dass 50 einzigartige Fab-Antikörper (20γ1κ und 30γ1λ) erzeugt wurden. Interessanterweise wurden alle 25 einzigartigen schweren Ketten und beinahe alle der 18 einzigartigen kappa-leichten Ketten abgeleitet von nur 5 VHIII bzw. vier VκI Keimbahn-Genen, wohingegen lambda-leichte Ketten abgeleitet wurden von einem diverseren Satz an Keimbahn-Genen. Die Analyse der schweren und leichten Ketten-Nukleotidsequenze von über 60 negativen Klonen von dem ungepannten Bibliotheken wurden durchgeführt, um die Heterogenität in variablen Regionfamilien-Repräsentationen vor der Auswahl zu verifizieren. Klone, welche VH-Familien I (13%), III (36%), IV (31%)m V (15%), und VI (5%) repräsentierten; Vκ-Familien I (43%), II (14%), III (29%) und IV (14%); und Vγ-Familien I (48%), II (4%), III (9%), IV (4%), V (9%), VI (17%) und VII (9%) lagen vor.
  • Klonale Analyse auf Proteinebene
  • Um die Diversität der Feinspezifität (Rh(D)-Antigen-Epitop-Spezifität) unter den Anti-Rh(D)-Klonen zu untersuchen, wurden Agglutinationsexperimente durchgeführt mit ausgewählten Klonen und mit Sätzen von seltenen Rh(D)-positiven roten Blutzellen, welche von Individuen erhalten wurden, deren rote Blutzellen Rh(D)-Antigen erzeugten, welches bestimmte Epitope nicht aufwies. Die Untersuchung des Musters der Agglutination eines speziellen Anti-Rh(D)-Antikörpers mit solchen Sätzen von Mutanten von roten Blutkörperchen ermöglicht die Identifikation des spezifischen Epitops auf Rh(D), auf welches der Antikörper gerichtet ist (Mollison et al., 1993, supra). Ein repräsentatives Beispiel eines solchen Experimentes ist in 5 gezeigt und Rh(D)-Epitope für ausgewählte Anti-Rh(D) Fab/Phagen-Klone sind in Tabelle 2 aufgelistet.
  • Agglutinationsexperimente wurden durchgeführt mit anti-Rh(D)-negativen Blutkörperchen (rr), Rh(D)-positive rote Blutkörperchen (R2R2) und „partiell" Rh(D)-positiven roten Blutkörperchen (Mosaics IIIa, IVa, Va, VI, VII). Die Ergebnisse, wie sie dargestellt sind, sind ein repräsentatives Beispiels des Assays für 5 zufällig ausgewählte Anti-Rh(D) Fab/Phagen-Klone (5).
  • Figure 00370001
  • Figure 00380001
  • Figure 00390001
  • Figure 00400001
  • Figure 00410001
  • Figure 00420001
  • Figure 00430001
  • Figure 00440001
  • Figure 00450001
  • Verwendung der Fab/Phagen-Antikörper als Blutbank-typisierende Reagenzien
  • Die Fähigkeit der Anti-Rh(D) Fab/Phagen-Herstellungen, um akkurat Rh(D)-negative und Rh(D)-positive roten Blutkörperchen in Mikroplatten-Hämagglutinations-Assays (4 und 5) zu unterscheiden, liefert der Nachweis, dass ein Geltest (Lapierre et al., 1990, Transfusion 30:109–1130), verwendet durch Blutbanken, um rote Blutkörperchen unter Verwendung von konventionellen Antiserien zu phenotypisieren, adaptiert werden konnte zur Anwendung von Fab/Phagen.
  • Der Geltest umfasst eine Plastikkarte von ungefähr 5 × 7 cm, enthaltend 6 Minisäulen jeweils gefüllt mit ungefähr 20 μl an Dextran-Acrylamid-Beads suspendiert in Anti-menschlichem Globulin (Coombs Reagenz). Rote Blutzellen, die typisiert werden sollen, werden inkubiert mit dem gewünschten menschlichen Antiserum und zentrifugiert durch das Gel. Rote Blutkörperchen, welche positiv für Antigene sind, gegen welche die Antiseren gerichtet sind, agglutinieren, da sie auf das Anti-humane Globulin ansprechen und in oder oberhalb der Gel-Matrix eingefangen werden. Unreaktive rote Blutzellen sedimentieren durch die Gelpartikel und formen einen Niederschlag am Boden der Mikrotube. Da der Geltest eine Vielzahl von Vorteilen anbietet, gegenüber traditionellen Blutbank-Verfahren zur Phenotypisierung von roten Blutzellen, einschließend vermindertes Reagenzvolumen, die Elimination von Zell-Wasch-Schritten und eine objektivere Interpretation der Ergebnisse, haben viele Blutbank-Ausstattungen diese neue Technologie adaptiert. Wie in 6 dargestellt, können Anti-Rh(D)-Fab/Phagen verwendet werden mit Gelkarten, welche modifiziert sind, so dass sie anti-M13-Antikörper enthalten.
  • Um den Assay durchzuführen, wurden Rh(D)-negative oder positive rote Blutzellen inkubiert mit Verdünnungen von Anti-Rh(D)-Fab/Phagen (λ1κ-Bibliothek, Panning #2) und wurden zentrifugiert in Mikrosäulen enthaltend Beads, suspendiert in anti-M13-Antikörper. Unverdünnte Fab/Phagen Stammlösungen hatten einen Titer von 5 × 1012 cfu/ml ähnlich zu denjenigen bei auf Mikroplatten absetzenden Assays (4). Da das Volumen der Fab/Phagen verwendet in diesem Assay ein Viertel desjenigen des Mikroplattenassays ist, ist die Menge von Fab/Phagen vorliegend in 1:625 Verdünnung ungefähr gleich zu derjenigen vorliegend in der 1:2048 Verdünnung in 4. Folglich ist die Anzahl von Fab/Phagen, nötig, um ein positives Ergebnis zu erzielen, essentiell äquvalent in beiden Assays.
  • In den anderen Assays, welche, wie eben beschrieben, durchgeführt wurden, trat, wenn anti-M13-Antikörper aus dem Assay eliminiert wurde, keine Agglutination von roten Blutkörperchen beobachtbar auf. Darüber hinaus reagiert der anti-IgG-Antikörper nicht mit rekombinanten Fabs, welche auf der Oberfläche des Bakteriophagen exprimiert werden. Nur Rh-positive Zellen, welche mit anti-Rh-Phagen zur Reaktion gebracht wurden, wurden agglutiniert, wenn Anti-M13-Antikörper in dem Assay vorlag. Es sollte festgehalten werden, dass wenn hohe Konzentrationen von Anti-M13-Antikörper verwendet wurden, sogar Rh-negative Zellen agglutiniert erschienen. Dies ist ein Artefakt, welcher vom Quervernetzen von ungebundenen (d.h. unreagierten) Phagen herrührt, welche quervernetzt werden in der Gegenwart von hohen Mengen an anti-M13-Antikörper und eine semi-undurchdringbare Matrix ausbilden, durch welche nicht alle Rh-negativen Zellen wandern können. In den hier beschriebenen Experimenten wurden auch anti-M13-Konzentrationen von ungefähr 100 μg/ml als optimal für die Agglutination und für das Verhindern von falsch positiven Ergebnissen betrachtet. Abhängend von präzisen Konzentrationen von Reagenzien und Zellen verwendet in dem Assay kann die Konzentration von anti-M13 von dieser Anzahl abweichen.
  • Um die relative Sensitivität des anti-M13-modifizierten mikrotypisierten Systems auszuwerten, wiesen die Säulen der Micro-Typing-Systemkarten, daran angebracht, 100 μg/ml an Anti-M13-Antikörper auf. Rh-negative oder Rh-positive Blutkörperchen wurden mit unverdünnten oder mit 5fach seriell verdünnten (1/5, 1/25, 1/625 und 1/3125) Anti-Rh-Phagen-Antikörpern inkubiert. Die Karten wurden zentrifugiert und die Proben wurden ausgewertet hinsichtlich Agglutination. Der modifizierte Micro-Typing-Systemkarten-Assay war in der Lage, Anti-Rh-Agglutination bei einer Verdünnung von zwischen 1/625 und 1/3125 nachzuweisen.
  • Prozeduren zur Isolation von tumorspezifischen Antikörpern
  • Fab/Phagen spezifisch für Tumorzellen sind bedeutsam in der in vitro Diagnostik (Laborassays von Biopsie, Flüssigkeiten oder Blutproben), beim in vivo Labeling von Tumoren/Metastasen (Koppeln von Antikörpern an bildgebende Sonden) oder zur Behandlung von bösartigen Tumoren (Koppeln von Antikörpern an chemische oder radioaktive Toxine). Tumorspezifische Antikörper sind auch bedeutsam für die Identifikation von neuen Antigenen oder Markern auf Tumorzellen, welche die Basis für Anti-Tumorvakzine bilden können. Des weiteren können Tumor-spezifische Antikörper bedeutsam für die Erzeugung von Anti-idiotypische Antikörpern sein und können auch eine Basis für Anti-Tumorvakzine bilden.
  • Anti-Tumor-Antikörper werden essentiell, wie hier beschrieben, für die Erzeugung von Anti-Rh-Antikörpern erzeugt. Tumorzellen, beispielsweise, jedoch nicht limitiert auf, bösartige Melanomzellen, sind Zelloberflächen-biotinyliert, gelabelt mit Streptavidin-magnetischen Mikrobeads und werden dann mit einem Überschuss von normalen Melanozyten vermischt. Fab/Phagen-Bibliotheken werden erzeugt aus peripheralen Blutlymphozyten von Melanom-Patienten, welche therapeutisch bedeutsame Anti-Tumor-Antikörper besitzen. Eine Vielzahl von Melanom-Patienten, welche sich offensichtlich „geheilt haben", haben diese realisiert bei Erzeugen einer humoralen (d.h. Antikörper) Immunantwort. Diese Fab/Phagen-Bibliotheken werden inkubiert mit der Mischung von Zellen. Fab/Phagen, welche gerichtet gegen Epitope, spezifisch für bösartige Zellen, sind, werden an die bösartigen Zellen binden und können dann isoliert werden unter Verwendung des magnetischen Säulen-Panning-Ansatzes.
  • Isolation von Fab/Phagen, welche bakterielle Viruleszenz-Faktoren identifizieren
  • Der Ansatz, wie hier beschrieben, kann verwendet werden, um Fab/Phagen zu isolieren, welche in der Lage sind, Unterschiede zwischen den Viruleszenz-Bakterien und ihren nicht-pathogenen Gegenspielern zu unterscheiden. In diesem Fall wird der virulente Stamm an Bakterien magnetisch gelabelt, verdünnt mit den nicht-pathogenen Gegenspielern und eine Fab/Phagen-Bibliothek, erzeugt aus Lymphozyten, erhalten von Individuen, infiziert mit dem virulenten Strang. wird hinzugegeben. Fab/Phagen, welche isoliert werden in dieser Art und Weise, können bedeutsam für die Identifikation neuer bakterieller Antigene sein, gegen welche antibakterielle Verbindungen und/oder Vakzine entwickelt werden können.

Claims (20)

  1. Ein Verfahren zum Agglutinieren von Zellen umfassend Bereitstellen einer Mischung umfassend eine Population von Zellen und eine Population von einem Bakteriophagen, wobei ein erster Antikörper auf der Oberfläche von besagtem Bakteriophagen exprimiert wird und besagter erster Antikörper spezifisch für eine Antigen-tragende Gruppe ist, welche von zumindest einem Teil der Zellen in besagter Zellpopulation exprimiert wird, wobei besagter erster Antikörper an besagten Teil von besagten Zellen bindet und verursacht, dass besagter Bakteriophage auch an besagten Teil von besagten Zellen bindet, Hinzugeben eines zweiten Antikörpers spezifisch für besagten Bakteriophagen zu besagter Mischung, wobei das Binden von besagtem zweiten Antikörper an den Bakteriophagen gebunden an besagten Teil von besagten Zellen verursacht, dass besagter Teil von besagten Zellen agglutiniert.
  2. Das Verfahren von Anspruch 1, wobei besagte Zellen ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus roten Blutkörperchen und weißen Blutkörperchen.
  3. Das Verfahren von Anspruch 2, wobei besagte Zellen rote Blutkörperchen sind.
  4. Das Verfahren von Anspruch 1, wobei besagter Bakteriophage M13 ist.
  5. Das Verfahren von Anspruch 4, wobei besagter Antikörper ein Anti-M13-Antikörper ist.
  6. Das Verfahren von Anspruch 3, wobei besagter erster Antikörper ein Antikörper gegen rote Blutkörperchen ist.
  7. Das Verfahren von Anspruch 6, wobei besagter erster Antikörper ein Anti-Rh-Körper ist.
  8. Das Verfahren von Anspruch 1, wobei besagte Antigen-tragende Gruppe ein Antigen eines roten Blutkörperchens ist.
  9. Das Verfahren von Anspruch 1, wobei besagte Antigen-tragende Gruppe ein HLA-Antigen ist.
  10. Das Verfahren von irgendeinem der Ansprüche 1 bis 9, wobei besagte Mischung zu einer Mikrotube hinzugefügt wird, welche inerte Partikel enthält und einen zweiten Antikörper spezifisch für besagten Bakteriophagen, und es ermöglicht wird, dass besagte Mischung unter Einwirkung von Schwerkraft sedimentiert und die Lokalisierung besagten Teils von besagten Zellen beobachtet wird, wobei starke Agglutinierung von besagtem Teil von besagten Zellen dadurch angezeigt wird, dass die Zellen auf oder innerhalb der obersten Schicht von besagten inerten Partikeln lokalisiert sind, und schwache Agglutinierung von besagten Zellen dadurch angezeigt wird, dass die Zellen innerhalb einer unteren Schicht von besagten inerten Partikeln lokalisiert sind und keine Agglutinierung dadurch angezeigt wird, dass die Zellen am Boden besagter Mikrotube lokalisiert sind.
  11. Das Verfahren von Anspruch 10, wobei der Schritt des Sedimentierens durch Zentrifugation erreicht wird.
  12. Ein Verfahren zum Einfangen von Zellen umfassend Bereitstellen einer Mischung umfassend eine Population von Zellen und eine Population von einem Bakteriophagen, wobei ein erster Antikörper auf der Oberfläche von besagtem Bakteriophagen exprimiert wird und besagter erster Antikörper spezifisch für ein Antigen ist, welches durch zumindest einen Teil der Zellen in besagter Zellpopulation exprimiert wird, wobei besagter erster Antikörper an besagten Teil von besagten Zellen bindet und verursacht, dass besagter Bakteriophage auch an besagten Teil von besagten Zellen bindet, Hinzugeben besagter Mischung zu einer Mikrotube enthaltend inerte Partikel, welche gebunden daran einen zweiten Antikörper aufweisen, welcher spezifisch für besagten Bakteriophagen ist, Ermöglichen des Sedimentierens der Mischung unter Einfluss von Schwerkraft, wobei eingefangene Zellen oben oder innerhalb einer obersten Schicht von besagten inerten Partikeln lokalisiert sind.
  13. Das Verfahren von Anspruch 12, wobei besagter Sedimentationsschritt durch Zentrifugation durchgeführt wird.
  14. Das Verfahren von Anspruch 12 oder 13, wobei nach Sedimentation die Lokalisation von besagtem Teil von besagten Zellen beobachtet wird und das Einfangen von besagtem Teil von besagten Zellen angezeigt wird dadurch, dass die Zellen oben oder innerhalb einer obersten Schicht von besagten inerten Partikeln lokalisiert sind und die Abwesenheit des Einfangens von besagten Zellen angezeigt wird, dadurch, dass die Zellen am Boden von besagter Mikrotube lokalisiert sind.
  15. Ein Verfahren zum Nachweis des Vorliegens einer Antigen-tragenden Gruppe auf einer Zelle umfassend Bereitstellen einer Mischung umfassend eine Population von Zellen und eine Population eines Bakteriophagens, wobei ein erster bekannter Antikörper auf der Oberfläche von besagtem Bakteriophagen exprimiert wird, wobei das Vorliegen von besagter Antigen-tragender Gruppe auf besagten Zellen angezeigt wird durch Binden des ersten Antikörpers an zumindest zwei von besagten Zellen, was verursacht, dass besagter Bakteriophage auch an besagte zwei von besagten Zellen bindet, wobei, wenn ein zweiter Antikörper zu besagter Mischung hinzugefügt wird, welcher spezifisch für besagten Bakteriophagen ist, besagter zweiter Antikörper an den Bakteriophagen bindet, welcher an besagte zumindest zwei von besagten Zellen bindet, was verursacht, dass die Zellen agglutinieren, wobei besagte Agglutination ein Zeichen des Vorliegens von besagter Antigen-tragender Gruppe auf besagten Zellen ist, wobei die Antigen-tragende Gruppe spezifisch für besagten ersten Antikörper ist.
  16. Das Verfahren von Anspruch 15, wobei besagte Agglutinierung besagte Antigen-tragende Gruppe als eine Antigen-tragende Gruppe spezifisch für besagten ersten Antikörper identifiziert.
  17. Das Verfahren von Anspruch 15, wobei besagte Mischung zu einer Mikrotube hinzugegeben wird, welche inerte Partikel enthält und einen zweiten Antikörper spezifisch für besagten Bakteriophagen, wobei man besagte Mischung unter dem Einfluss von Schwerkraft sedimentieren lässt, und die Lokalisierung der Zellen in besagter Mikrotube beobachtet wird, wobei starke Agglutinierung der Zellen angezeigt wird, dadurch, dass die Zellen oben oder innerhalb einer obersten Schicht von besagten inerten Partikeln lokalisiert sind, und die starke Agglutinierung ein Anzeigen der Gegenwart von besagter Antigen-tragender Gruppe auf besagten Zellen ist, und besagte Antigen-tragende Gruppe spezifisch für besagten ersten Antikörper ist.
  18. Das Verfahren von Anspruch 17, wobei besagte starke Agglutination besagte Antigen-tragende Gruppe als eine Antigen-tragende Gruppe spezifisch für besagten ersten Antikörper identifiziert.
  19. Das Verfahren von Anspruch 15, wobei besagte Mischung zu einer Mikrotube hinzugefügt wird, welche inerte Partikel enthält, welche daran gebunden einen zweiten Antikörper aufweisen, welcher spezifisch für besagten Bakteriophagen ist, wobei das Sedimentieren besagter Mischung ermöglich wird unter dem Einfluss von Schwerkraft, wobei die eingefangenen Zellen auf oder innerhalb der obersten Schicht von besagten inerten Partikeln positioniert sind, und die Gegenwart von besagten eingefangenen Zellen ein Hinweis auf die Gegenwart einer Antigen-tragenden Gruppe auf besagter Zelle ist, wobei die Antigen-tragende Gruppe spezifisch für besagten ersten Antikörper ist.
  20. Das Verfahren von Anspruch 19, wobei das Vorliegen von besagten eingefangenen Zellen besagte Antigen-tragende Gruppe auf besagten Zellen als spezifisch für besagten ersten Antikörper identifiziert.
DE69733828T 1996-10-11 1997-10-10 Zusammensetzungen und verfahren zum nachweis der bindung von antikörpern in zellen Expired - Lifetime DE69733828T2 (de)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US2855096P 1996-10-11 1996-10-11
US28550P 1996-10-11
US08/884,046 US5985543A (en) 1996-10-11 1997-06-27 Compositions and methods for detection of antibody binding to cells
PCT/US1997/017995 WO1998016827A1 (en) 1996-10-11 1997-10-10 Compositions and methods for detection of antibody binding to cells
US884046 2004-07-02

Publications (2)

Publication Number Publication Date
DE69733828D1 DE69733828D1 (de) 2005-09-01
DE69733828T2 true DE69733828T2 (de) 2006-01-05

Family

ID=26703824

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DE69733828T Expired - Lifetime DE69733828T2 (de) 1996-10-11 1997-10-10 Zusammensetzungen und verfahren zum nachweis der bindung von antikörpern in zellen

Country Status (9)

Country Link
US (2) US5985543A (de)
EP (1) EP0935754B1 (de)
JP (1) JP3901222B2 (de)
AT (1) ATE300738T1 (de)
AU (1) AU732758B2 (de)
CA (1) CA2268339C (de)
DE (1) DE69733828T2 (de)
ES (1) ES2246510T3 (de)
WO (1) WO1998016827A1 (de)

Families Citing this family (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6255455B1 (en) * 1996-10-11 2001-07-03 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Rh(D)-binding proteins and magnetically activated cell sorting method for production thereof
CA2361877A1 (en) 1999-03-01 2000-09-08 Genentech, Inc. Antibodies for cancer therapy and diagnosis
US7811768B2 (en) * 2001-01-26 2010-10-12 Aviva Biosciences Corporation Microdevice containing photorecognizable coding patterns and methods of using and producing the same
US7015047B2 (en) * 2001-01-26 2006-03-21 Aviva Biosciences Corporation Microdevices having a preferential axis of magnetization and uses thereof
DE10122806A1 (de) * 2001-05-10 2002-11-14 Holger Kiesewetter Verfahren zum Nachweis von Blutzell-Antigenen und gegen diese gerichtete Antikörper
AU2002367935A1 (en) * 2001-10-23 2003-12-22 Sloan Kettering Institute For Cancer Research Protein micro-arrays and multi-layered affinity interaction detection
ATE386111T1 (de) * 2002-09-18 2008-03-15 Univ Pennsylvania Zusammensetzungen, verfahren und kits zum nachweis eines antigens auf einer zelle und in einem biologischen gemisch
DE102004033811A1 (de) * 2004-07-12 2006-02-02 Salama, Abdulgabar, Prof. Dr. Verfahren zum einfachen und schnellen Nachweis von Zellen und Biomolekülen mit Hilfe paramagnetischer Partikel
WO2006038021A1 (en) * 2004-10-08 2006-04-13 Affitech As Methods for antibody library screening
EP1963494B1 (de) 2005-11-29 2014-10-08 The Trustees of The University of Pennsylvania Diagnostische phagenpartikelreagentien
WO2007083793A1 (ja) * 2006-01-23 2007-07-26 National University Corporation University Of Toyama 光反応基を利用したパニング法およびそれに用いるキット
US7998696B2 (en) * 2007-12-05 2011-08-16 Zyomyx, Inc. Cell assay kit and method
US7850917B2 (en) * 2008-03-11 2010-12-14 Ortho-Clinical Diagnostics, Inc. Particle agglutination in a tip
US20100015690A1 (en) 2008-07-16 2010-01-21 Ortho-Clinical Diagnostics, Inc. Use of fluid aspiration/dispensing tip as a microcentrifuge tube
CA2819260A1 (en) 2010-12-15 2012-06-21 Cytosed, Inc. Antibody-linked immuno-sedimentation agent and method of isolating a target from a sample using same
KR101698040B1 (ko) * 2013-06-27 2017-01-24 주식회사 중겸 M13 박테리오파지에 대한 단일 도메인 항체 및 이를 포함하는 면역센서 융합 단백질

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU623589B2 (en) * 1987-03-02 1992-05-21 Bristol-Myers Squibb Company Platelet related growth regulator
US5338689A (en) * 1987-08-24 1994-08-16 Stiftung Fur Diagnostische Forschung Method and card for detecting antigens and/or antibodies
US5663143A (en) * 1988-09-02 1997-09-02 Dyax Corp. Engineered human-derived kunitz domains that inhibit human neutrophil elastase
US5498538A (en) * 1990-02-15 1996-03-12 The University Of North Carolina At Chapel Hill Totally synthetic affinity reagents
ES2315612T3 (es) * 1991-04-10 2009-04-01 The Scripps Research Institute Genotecas de receptores heterodimericos usando fagemidos.
US5491067A (en) * 1993-07-15 1996-02-13 Ortho Diagnostic Systems Inc. Agglutination reaction and separation vessel
US5665558A (en) * 1994-05-17 1997-09-09 Gamma Biologicals, Inc. Method and apparatus useful for detecting bloodgroup antigens and antibodies

Also Published As

Publication number Publication date
EP0935754B1 (de) 2005-07-27
WO1998016827A1 (en) 1998-04-23
JP2001508865A (ja) 2001-07-03
ES2246510T3 (es) 2006-02-16
CA2268339C (en) 2010-02-23
ATE300738T1 (de) 2005-08-15
CA2268339A1 (en) 1998-04-23
JP3901222B2 (ja) 2007-04-04
EP0935754A1 (de) 1999-08-18
DE69733828D1 (de) 2005-09-01
EP0935754A4 (de) 2003-04-23
AU4746197A (en) 1998-05-11
US6979534B1 (en) 2005-12-27
US5985543A (en) 1999-11-16
AU732758B2 (en) 2001-04-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE69733828T2 (de) Zusammensetzungen und verfahren zum nachweis der bindung von antikörpern in zellen
DE69718341T2 (de) Verfahren und mittel zur auswahl von peptiden und proteinen mit spezifischer affinität zu einem zielmolekül
US6255455B1 (en) Rh(D)-binding proteins and magnetically activated cell sorting method for production thereof
DE69835893T2 (de) Diagnostische tests und kits für clostridium difficile
DE69736239T2 (de) Magnetisch aktivierte zellsortierung zur herstellung von proteinen
DE60319121T2 (de) Zusammensetzungen, verfahren und kits zum nachweis eines antigens auf einer zelle und in einem biologischen gemisch
WO1998016541A9 (en) Magnetically activated cell sorting for production of proteins
EP3262422B1 (de) Verfahren und system für antikörpernachweis
DE102005031755B4 (de) Salmonella spp. bindende Peptide, dafür kodierende Nukleinsäuren deren Verwenduen und Verfahren und Kits zur Anreicherung, Immobilisierungen und zum Nachweis von Salmonella spp.
EP4399355A1 (de) Verfahren zur selektion oder screenen von antikörpern und antigenen aus einer antikörperbibliothek
DE4314998A1 (de) Monoklonale Antikörper gegen filamentöse Phagen, ihre Herstellung und Verwendung zum Nachweis und zur Isolierung der Phagen
Dennis Selection and screening strategies
EP1371985A2 (de) Mittel und Verfahren zum Anreichern und Nachweisen von Mikroorganismen
Bickel et al. Use and applications of subtractive antibody screening

Legal Events

Date Code Title Description
8364 No opposition during term of opposition