WO2007083793A1 - 光反応基を利用したパニング法およびそれに用いるキット - Google Patents

光反応基を利用したパニング法およびそれに用いるキット Download PDF

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WO2007083793A1
WO2007083793A1 PCT/JP2007/050890 JP2007050890W WO2007083793A1 WO 2007083793 A1 WO2007083793 A1 WO 2007083793A1 JP 2007050890 W JP2007050890 W JP 2007050890W WO 2007083793 A1 WO2007083793 A1 WO 2007083793A1
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photoreactive
ligand
protein
phage
peptide
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Yasumaru Hatanaka
Yutaka Sadakane
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National University Corporation University Of Toyama
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    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/554—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being a biological cell or cell fragment, e.g. bacteria, yeast cells

Definitions

  • the present invention relates to a vanning method for efficiently isolating a displayed phage using a photoreactive group such as phenyldiazirine.
  • this method is referred to as a photobanning method.
  • the present invention relates to a method for efficiently screening a protein or peptide that interacts with a ligand using this photobanning method.
  • the present invention relates to a kit used in this screening method.
  • the present inventors have so far developed a unique high-speed optical affinity method using a diazirine derivative as a photoreactive group.
  • the photoaffinity method is a technology that uses a photoreaction to irreversibly connect specific ligands and partner proteins.
  • Diazirine has the advantage of favoring this irreversible binding compared to other photoreactive groups.
  • Non-Patent Document 7 M. Hashimoto, J. Yang, Y. Hat anaka, Y. Sadakane, K. Nakagomi, GD Holman (2002) Improvement in the properties ies of 3 phenyl— 3— trifluoromethyldiazirine based photoreactive bis— glucose probes for GLUT4 following substitution on the phenyl ring.
  • Chem. Pharm. Bull. 50, 1004—10 06 Patent Document 8
  • Non-Patent Document 9 Hatanaka, Y., Hashimoto, H., Kanaoka, Y. A rapid and efficient method for identifying photoaffinity biotinylated sites witnin proteins. J. Am. And hem. Soc. 120, 453-454, 1998 (Non-Patent Document 10), JP 2000-319262 (Patent Document 1))
  • the present inventors conducted preliminary experiments in anticipation of technological innovation by combining the characteristics of photoreactive groups and display phage vanning.
  • a photoreactive group having a chemically selective functional group was immobilized on a solid phase, and a solid phase into which a sugar chain ligand or a peptide ligand was introduced was fabricated using this functional group.
  • the force-displaying phage can be covalently immobilized on the solid phase, and that this force on the solid phase can also recover the phage.
  • the amount since this method limits has been made on the amount of the photoreactive ligand can be fixed I spoon on a solid phase, the amount of fixed spoon ligand capable scree Jung at a time thousands of display phage per lcm 2 Stayed in.
  • Non-patent document 1 S. P. smith (1985) Filamentous fusion phage: novel expression vecto rs that display cloned antigens on the virion surface. Science, 228, 1315-1317.
  • Non-patent document 2 S. ⁇ Cwirla, ⁇ A. Peters, RW Barrett, WJ Dower (1988) Antibo dy-s electa Die filamentous rd phage vectors: affinity purification of target genes.Gen 73, 305-318
  • Non-Special Terms 3 SF Parmley, GP Smith. (1990) Peptides on phage: a vast library of peptides for identifying ligands.Proc. Natl. Acad. 3 ⁇ 4ci. USA 87, 6378-6382
  • Non-Special Terms 4 Y. Sadakane, Y. Hatanaka (2004) Multifunctional photoprobes for rapi d protein identification. In F. Darvas, A. Guttman and G. Dorman eds., Chemical Genomics, Marcel Dekker Inc., New York. Pp 199-214
  • Non-Special Terms 5 Y. Hatanaka, Y. Sadakane (2002) Photoaffinity labeling in drug disco v ery and developments: Chemical gateway for entering proteomic frontier. Curr. Top Med. Chem. 2, 271-288
  • Non-Patent Document 6 Yasumaru Hatanaka Structural Biological Organic Chemistry: Protein Affinity Label Probing Protein Functional Structure, Journal of Organic Synthesis, 56 (7), 581-590, 1998
  • Non-Patent Document 7 M. Kaneda, Y. Sadakane, Y. Hatanaka, (2003) A Novel Approach for Affinity-Based Screening of Target Specific Ligands: Application of Photoreactive D —Glyceraldehyde— 3—phosphate Dehydrogenase. Bioconjugate Chem. 14,
  • Non-patent literature 8 M. Hashimoto, J. Yang, Y. Hatanaka, Y. Sadakane, K. Nakagomi, GD Holman (2002) Improvement in the properties of 3-phenyto 3-trifluoromethyldiazi rine based photoreactive bis — Glucose probes for GLUT4 following substitution on the phenyl ring. Chem. Pharm. Bull. 50, 1004-1006
  • Patent Document 9 Hatanaka, Y., Kempin, U., Park, JJ.One-step synthesis of biotinyl ph otoprobes from unprotected carbohydrates. J. Org. Chem. 65, 5639-5643, 2000
  • Non-Patent Document 10 Hatanaka, Y., Hashimoto, H., Kanaoka, Y. A rapid and efficient met hod for identifying photoaffinity biotinylated sites within proteins.J. Am. Chem. Soc. 120, 453-454, 1998
  • Non-Patent Document 11 Y. Sadakane, H. Nakashima, J.-J. ParkJ, K. Nakagomi, Y. Hatanaka (2002) EFFICIENT CLONING OF CARBOHYDRATE BINDING PROTEINS. Photo medicine and Photobiology 23, 83-84
  • Non-Patent Document 12 Y. Sadakane, H. Nakashima, J.-J Park, Y. Hatanaka (2002) Preparati on of solid photo— crosslin thigh g matrix and application to photo-panning of displayed phages .. Photomedicine and Photobiology 24 , 85—86.
  • Patent Document 1 Japanese Patent Application Laid-Open No. 2000-319262 The entire descriptions of Non-Patent Documents 1 to 12 and Patent Document 1 are specifically incorporated herein by reference.
  • the Banning method which is a technique for isolating the target display phage, is epoch-making compared to the screening methods that have been known so far, and is considered to be applicable in various fields. However, the range of use is actually limited. There are two main causes for this. .
  • the ability to isolate the desired display phage is determined by the affinity between the ligand and the displayed protein or peptide. It is known that in an actual banning method, if the friendliness between the two is not strong, the reproducible banning operation cannot be performed and the concentration efficiency is not stable. As countermeasures against this, improvement of the display phage expression system has been promoted mainly, and contrivances such as increasing the number of expressed proteins have been made.
  • the growth of the phages after the vanning operation results in a growth difference between the phages.
  • a large molecule such as a protein
  • the difference in growth becomes remarkable, and a phage that is overwhelmingly wild-type becomes dominant.
  • the target display phage is somewhere !, and when the wild-type phage is finally isolated, there may be a problem. It has been pointed out for a long time!
  • the present invention aims at realizing the above-mentioned solution, and is a method for screening a phage displaying a protein or peptide of interest from a phage library displaying a protein or peptide on the surface of the phage. .
  • An object of the present invention is to provide a method for screening a protein or peptide more reliably than the conventional method.
  • the present inventors have completed the present invention by finding that a target display phage can be isolated efficiently and reliably by using a photoreactive ligand in a conventional vanning method. .
  • the present invention for solving the above problems is as follows.
  • a photoreactive ligand having a photoreactive group and a protein-displayed phage or a peptide-displayed phage are mixed in a liquid phase
  • a method for screening a protein or peptide that interacts with a photoreactive ligand is provided.
  • the photoreactive ligand is a photoreactive peptide, a photoreactive protein, a photoreactive nucleic acid, or a photoreactive sugar chain.
  • Immobilization of the photoreactive ligand to the solid phase is performed using a piotin avidin or streptavidin system, a His-tagged nickel system, a boron-hydroxamic acid chelate system, or an antigen-antibody system [1]-[ The method according to [3].
  • the photoreactive ligand has piotin and the solid phase is coated with avidin or streptavidin.
  • the photoreactive ligand has a His tag and the solid phase is coated with nickel.
  • the photoreactive ligand has a hydroxamic acid chelate, the solid phase is coated with boron, and (4) the photoreactive ligand has an antigen, and the solid phase contains an antibody.
  • the recovered protein-displayed phage or peptide-displayed phage is grown and mixed with the photoreactive ligand described in [1] using the grown protein-displayed phage or peptide-displayed phage, At least irradiation with actinic light, immobilization of photoreactive ligand on the solid phase, washing of the solid phase, and recovery of protein-displayed peptide or peptide-displayed phage bound to the photoreactive ligand immobilized on the solid phase
  • the method according to any one of [1] to [8], which is performed once.
  • the kit comprising a photoreactive ligand having a photoreactive group and a solid phase on which the photoreactive ligand is immobilized.
  • the photoreactive ligand is a photoreactive peptide, a photoreactive protein, a photoreactive nucleic acid, or a photoreactive sugar chain.
  • the solid phase that immobilizes the photoreactive ligand can be immobilized using piotin avidin or streptavidin system, His tag-nickel system, boron-hydroxamic acid chelate system, or antigen-antibody system.
  • the kit according to any one of [12] to [14].
  • the photoreactive ligand has piotin and the solid phase is coated with avidin or streptavidin.
  • the photoreactive ligand has a His tag and the solid phase is coated with nickel.
  • the photoreactive ligand has a hydroxamic acid chelate, the solid phase is coated with boron, and (4) the photoreactive ligand has an antigen, and the solid phase contains an antibody.
  • the kit according to [15] which is either a coated one.
  • a kit for producing a photoreactive ligand having a photoreactive group comprising a compound having a photoreactive group, a ligand labeling substance, and a photoreaction mounting solution.
  • R is a halogen atom or a sulfonate residue, and R is carbon.
  • 6 7 is an alkylthiosulfol group having 1 to 6 carbon atoms or an alkylthio group having 1 to 6 carbon atoms, R
  • n is an integer of 1 to 6.
  • a photoreactive ligand can capture a display phage having an affinity for it with a covalent bond. This irreversible binding makes it possible to remove the target display phage without losing the target display phage and remove most of the non-specifically adsorbed display phage even after a strong washing.
  • the photoreactive group is a diazirine group, the photoreaction that captures the displayed phages is very fast and has an efficient combing force with light near 360 nm. In addition, this photoreaction does not affect the phage growth ability required for the banning method, which does not damage the displayed phage.
  • the present invention is a method of screening a protein or peptide that interacts with a photoreactive ligand, the method comprising:
  • a photoreactive ligand having a photoreactive group and a protein-displayed phage or a peptide-displayed phage are mixed in a liquid phase
  • the photoreactive ligand is a ligand for a protein or peptide displayed by a protein-displaying phage or peptide-displaying phage, and has a photoreactive group.
  • the ligand is, for example, a peptide or a protein.
  • a peptide containing one cysteine residue in the original sequence there are a peptide introduced with one cysteine residue, and a peptide introduced with a photoreactive amino acid at an appropriate site.
  • the photoreactive group is a chemical reactive group that takes a highly reactive intermediate upon irradiation with light of a specific wavelength, and the intermediate has a property of forming a covalent bond with the nearest molecule and stabilizing it.
  • the photoreactive group include a diazirine group, an azide group, and a carbonyl group.
  • the photoreactive group is preferably a diazirine group.
  • a ligand equipped with a photoreactive group is called a photoreactive ligand, and examples of the photoreactive ligand include a photoreactive peptide, a photoreactive protein, a photoreactive nucleic acid, and a photoreactive sugar chain. Can do.
  • a photoreactive peptide ligand can be prepared by introducing a photoreactive group into a peptide that can be a ligand.
  • the following two methods can be used to introduce a photoreactive group into a peptide that can serve as a ligand.
  • a photoreactive group can be introduced through the sequence.
  • a photoreactive group can be bonded by introducing a cysteine residue at an arbitrary position. If a photoreactive amino acid is used, a photoreactive peptide can be synthesized using a peptide synthesizer or the like.
  • a photoreactive peptide ligand was prepared based on the calmodulin-binding peptide of sequence 1 below. This peptide has been confirmed to recognize and specifically bind calmodulin protein.
  • Two photoreactive peptides shown in Sequence 2 and Sequence 4 with different production methods were synthesized. One is a photoreactive peptide in which the third tributophane from the N-terminus is replaced with a photoreactive amino acid tm d (Phe) and the N-terminus is piotinylated. (Array 2). The chemical structure is shown under Sequence 2.
  • a photoreactive peptide was prepared with a peptide synthesizer.
  • the other is to synthesize a peptide in which the third tributophane from the N-terminus is replaced with cysteine (sequence 3), biotinate the N-terminus, and then introduce the diazirine shown in compound 3 via a thiol bond.
  • Sex peptide sequence 4
  • the two types of photoreactive calmodulin-binding peptides synthesized were purified by HPLC and used.
  • a photoreactive protein ligand can be produced by attaching a photoreactive group to calmodulin.
  • a recombinant calmodulin protein molecular weight of approximately 20,000
  • Cys residues introduced is produced in E. coli, and a photoreactive group is attached to the prepared protein. Examples of the production of three photoreactive calmodulin protein ligands with different photoreactive group introduction sites are shown below.
  • a diazirine thiosulfonate (compound 3) that specifically binds to a cysteine residue was attached to a cysteine residue introduced by genetic modification.
  • Three types of photoreactive calmodulin proteins with different photoreactive group introduction sites were produced. From the three-dimensional structure analysis result (PDB: ICDL) of MLCK fragment peptide, which is calmodulin and its binding peptide, amino acids 26, 75 and 115 are located in different positions, centering on MLCK fragment peptide. Each amino acid was converted to cysteine and compound 3 was attached. After that, each was piotin.
  • Scheme 1 shows the position of calmodulin protein and the 115th lysine.
  • Calmodulin is originally a protein that does not contain cysteine residues. By modifying the gene, calmodulin with 6 histidines at the N-terminus and mutated amino acids 26, 75, and 115 to cysteine was prepared in E. coli (scheme 2). Six histidines are necessary for purification of the expressed protein. In the examples, evaluation experiments were performed using calmodulin-binding peptide-displayed phages and S-tag-displayed phages. [0026] [Chemical 4]
  • the photoreactive nucleic acid ligand can be obtained by, for example, attaching a photoreactive group to a nucleic acid having a phosphate group of at least one nucleic acid such as DNA, RNA, or PNA having a photoreactive group.
  • the photoreactive nucleic acid ligand is a compound in which at least one nucleic acid phosphate group reacts with a thiophosphate group and a phenyl diazirine compound having a reactive group with a thiol group of a thiophosphate group. And can be produced.
  • DNA and RNA having a thiophosphate group are known and can be appropriately synthesized by known methods described in the following documents. (Zon, G .; Geise r, TG> j991)
  • Phosphorothioate oligonucleotides chemistry, purincation, analysis, s cale-up and future directions.Anticancer Drug Des. 6: 539-568.
  • the nucleic acid can be converted into a nucleic acid derivative equipped with a piotin tag by a known method.
  • S. Agrawai; Shi. Cnnstodoulou; MJ uait (198 Rino Efficient methods for attachi ng non-radioactive labels to the 5 'ends of synthetic oligodeoxyribonucleotides Nuc leic Acids Res. 14: 6227-6245. ed. LJ Kric ka See Academic Press, New York, the entire description of which is hereby specifically incorporated by reference.
  • the phenyl diazirine compound which is a photoreactive group can be, for example, a compound represented by the following general formula (C).
  • R is a halogen atom (for example, Cl, Br, 1) or a sulfonic acid ester residue.
  • the sulfonic acid ester residue can be a methanesulfol group or a toluenesulfol group.
  • R is an alkylthiosulfol having 1 to 6 carbon atoms
  • alkylthiosulfol group RSO
  • R can be, for example, methyl, ethyl, propyl or butyl.
  • the alkylthio group is represented by RS— and R can be, for example, methyl, ethyl, propyl or butyl.
  • R can be H or an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms;
  • the alkyl group can be, for example, methyl, ethyl, propyl or butyl.
  • n is an integer of 1 to 6, preferably an integer of 1 to 4, and more preferably 1.
  • the phenyl diazirine compound having a thiol-reactive group and a nucleic acid derivative are mixed, for example, in a molar ratio of about 50: 1 to 100: 1. Furthermore, this mixture is mixed with diisopropylethylamine in a molar ratio of 50 to 100 times that of the nucleic acid derivative, and the reaction can be carried out in dimethyl sulfoxide at 37 ° C. However, N-methylmorpholine, triethylamine, etc. can be used in place of diisopropylethylamine. As the reaction solvent, Methanol, dimethylformamide, or the like can be used in place of til sulfoxide.
  • the reaction temperature can include 37 ° C, for example, in the range of 4 to 70 ° C.
  • the concentration of the ferrodiazirine compound is suitably in the range of 0.1 to 0.5 mM, for example.
  • the reaction time can be from several tens of minutes to several hours depending on the type of ferrodiazirine compound. It is preferable to store in liquid nitrogen after the reaction so as not to cause an excessive reaction.
  • the product phenyldiazirine-added nucleic acid derivative can be purified by, for example, high performance liquid chromatography. In addition to high-performance liquid chromatography, it can be purified by electrophoresis, for example.
  • the photoreactive sugar chain ligand can be various monosaccharides or oligosaccharides having an aldehyde terminus.
  • monosaccharides include bilanose ring and furanoose ring, such as darcobilanose (glucose), darcofuranose, and epimers such as galactose and mannose.
  • oligosaccharides include polysaccharides such as Lewis X from disaccharides such as maltose, sucrose, and ratatose. Any sugar having an aldehyde terminal can be used to produce a photoreactive sugar chain ligand, and is not limited to the above example.
  • the photoreactive sugar chain ligand can be simultaneously attached to the aldehyde end of the sugar chain by the method shown in the following paper with a photoreactive group and piotin. (See Hatanaka, Y., Kempin, U., Park, JJ. One-step synthesis of biotinyl photoprobes from unprotected carbohydrates. J. Org. Chem. 65, 5639-5643, 2000 (Non-Patent Document 9))
  • a protein-displaying phage is a phage that displays on its surface a protein that is expected or expected to interact with a ligand.
  • the protein may be single (one type) or multiple types.
  • an arbitrary display protein may be a population of phages displayed based on a cDNA library, which is called a “library”.
  • An arbitrary protein or peptide can be displayed on the surface of the phage.
  • protein-displaying phage there are two types: the type displayed on the phage foot (M13 type) and the type displayed on the head (Fig. 1) (T7 type).
  • a “protein-displayed phage” of a deviation can also be used. Affinity to specific receptor proteins by using “protein-displaying phage” You can search for proteins with sex. Similarly, peptides having affinity for a specific ligand can be searched for by using peptide-displayed phages.
  • the protein or peptide-displaying phage can be prepared by a conventional method. Proteins and peptides to be presented can be produced based on cDNA. cDNA can be produced from mRNA that has been prepared for organs. Phage populations (libraries) that can prepare force cDNAs for specific organs and display proteins or peptides can also be purchased as commercial products. An antibody can be mentioned as a protein displayed on a phage, and a phage displaying an antibody protein is also called a phage antibody. When screening phage antibodies, a library of phage antibodies can be used!
  • the captured phages can be propagated in E. coli, used as the first phage sample, and photopanning can be repeated. (Left force 4th step).
  • the photo-banning method of the present invention mainly consists of (A) a photo-reactive calmodulin-binding peptide and a photo-banning method for isolating calmodulin-displayed phages and (B) a photo-reactive calmodulin protein.
  • FIG. 4 illustrates the method using the photoreactive calmodulin-binding peptide (A) as an example.
  • the photoreactive ligand and protein-displayed phage are mixed in a liquid phase.
  • Mixing in the liquid phase can be performed as follows. That is, a solution that satisfies the condition that the ligand and the target protein can bind physiologically is used. A photoreactive ligand and protein-displayed phage are added thereto, and the mixture is stirred and mixed.
  • it can be allowed to stand at 37 ° C. for about 10 to 60 minutes. Thereby, the selection efficiency can be improved.
  • a photoreactive ligand and a protein-displayed phage are mixed in a liquid phase, if the affinity between the photoreactive ligand and the protein of the protein-displayed phage exceeds a certain level, they interact to form a complex. Can be formed.
  • the complex is composed of weak bonds such as hydrogen bonds and hydrophobic interactions that occur between proteins and ligands.
  • the complex formed in the mixing step is covalently bound to the photoreactive ligand and the protein-displayed phage by irradiating active light against the photoreactive group of the photoreactive ligand.
  • a complex formed by a weak bond (interaction) is formed by a strong bond called a covalent bond. Irradiation with active light can be performed as follows.
  • the wavelength of the active light varies depending on the photoreactive group used, but in the case of diazirine, the light having the maximum wavelength of 360 nm is used.
  • active light was irradiated using a commercially available UV-A lamp. This lamp is a lamp having a maximum wavelength of 360 nm.
  • the wavelength of the active light to be irradiated can be appropriately selected according to the type of each photoreactive group.
  • the complex formed in the solution is exposed to active light to form a covalent bond. 360nm light is hardly absorbed by the solution, and it is thought that irradiation reaches each component without blocking the light. Light irradiation can be accelerated from both the upper and lower parts of the solution, for example, with an intensity of 30 W / m 2 , respectively. The intensity of light can be appropriately determined in consideration of the composition of the solution.
  • the irradiation time 1 minute is sufficient based on the results of the evaluation experiment (1) in Fig. 6 of Experiment 1. For example, 2 minutes is appropriate for complete covalent bond formation. However, it is not intended to be limited to 2 minutes. Under these conditions, irradiation with active light for 10 minutes did not change the viability of subsequent phages. Therefore, the irradiation time can be appropriately determined within a range of 10 minutes or less, for example.
  • the photoreactive ligand of the covalently bonded complex is immobilized on a solid phase.
  • the immobilization can be carried out using, for example, a piotin avidin system, a His tag-nickel chelate system, a boron-hydroxamic acid chelate system, an antigen-antibody reaction system, or the like.
  • a photoreactive ligand is, for example, piotinized and fixed with avidin using this tag.
  • the photoreactive ligand and the display phage can be freely contacted in the solution, and the binding due to the affinity with the specific display phage can be promoted.
  • the solid phase can be, for example, a magnetic bead, a substrate, or the like. Furthermore, the solid phase has any function that can be used for the immobilization. For example, when the photoreactive ligand has biotin, the solid phase can be avidin or streptavidin coated. For other solid phases, if the photoreactive ligand has a His tag, the solid phase is nickel-coated; if the photoreactive ligand has a hydroxamic acid chelate, the solid phase is coated with boron. In the case where the photoreactive ligand has an antigen, the solid phase can be coated with an antibody.
  • the complex can be recovered with immobilized avidin using, for example, piotin introduced into the photoreactive ligand as a tag.
  • immobilized avidin there are various types of immobilized avidin.
  • avidin immobilized on a polystyrene plate and avidin immobilized on a magnetic bead can be used. The same applies to immobilization using a system other than the piotin-avidin system.
  • the amount of ligands that can be immobilized is limited and may not be suitable for library screening.
  • Plate- immobilized avidin is a commercially available avidin-immobilized plate in the form of 96 uels, and the amount of avidin immobilized on the plate is small (60 pmol / well).
  • the amount of photoreactive ligand that can be produced tends to decrease. Since it is common to use an avidin amount that is several times higher than the amount of recovered piotine, only 30 pmol of ligand can be used.
  • the solution volume is 200 L
  • the ligand concentration is 0.15 mol / L.
  • Kd of calmodulin and calmodulin binding protein is a 10-7 to 10-8, it is possible to separate at this concentration. Kd of binding proteins, the combination of the smaller ligand than 10 7, it is preferable to use the avidin magnetic beads.
  • avidin magnetic beads magnetic beads having a low background and a large amount of fixed avidin are suitable for the photobanning method of the present invention.
  • NEB Streptavidin Magnetic Beads manufacturer code # S1420S can be used.
  • avidin magnetic beads it is possible to completely remove the display phage solution, and the nonspecific binding display phage (background) is low.
  • the background can be reduced to approximately 1,000 to 10,000.
  • the number of phages is about 100 times higher (see the evaluation experiment (7), Table 5). If the fixed amount of avidin is 1000 pmol / mg and about 1 mg of magnetic beads are used, avidin is 1000 pmol and piotin can be recovered about 500 pmol. When the solution volume is 200 L, the ligand concentration is 2.5 mol / L. Thus, it is also used in Kd 1S 10- 6 about ligand binding proteins. By realizing this concentration, quite a lot of Gand—can be used to screen for receptor proteins.
  • the avidin magnetic beads are easy to operate, the operation time is shortened, the reproducibility is improved, and mechanization is possible. Furthermore, it is preferable to reduce nonspecific adsorption with magnetic beads by adding 10% BSA.
  • the solid phase on which the photoreactive ligand is immobilized is washed.
  • This wash is to separate the! /! Protein-displaying phage from the covalently bonded complex by covalently binding to the photoreactive ligand.
  • a surfactant is preferably used for cleaning. For washing method and conditions, add a large amount of washing solution to the solid phase and stir for several minutes, then discard the solution. This operation can usually be repeated about 5 times.
  • the washing conditions for isolating the display phage covalently bound to the photoreactive ligand can be appropriately determined in consideration of the properties of the display phage and the washing efficiency of the surfactant used for washing.
  • the salt concentration it is preferable to eliminate the ionic bond by increasing the salt concentration. Therefore, for example, about 0.2 to 1 mol / L of sodium chloride salt can be used. As will be described later, precipitation may occur when coexisting with high-concentration sodium chloride and surfactant SDS, so it may be preferable to use a salt-sodium concentration of about 0.25 mol / L. .
  • the surfactant for example, SDS, Triton-X100, Tween20 and the like can be used, This can be determined appropriately in consideration of the cleaning efficiency with the surfactant. According to the experiments of the present inventors, it was found that SDS is most suitable for removing non-specific phages.
  • the concentration of SDS can be in the range of 0.1 to 1%, and it is preferably 0.5% in consideration of the effects on recovery and amplification by bringing it into the subsequent steps.
  • SDS has the advantage that the magnetic bead force container on which avidin is fixed is not adsorbed and the cleaning solution can be removed more easily.
  • a surfactant is not used, a small amount of magnetic beads are usually sucked up when a washing solution is taken by adsorption to this container.
  • a final washing solution for example, 50 mM Tris-HCl (pH 8.8), 0.25 M NaCl, 50 mM
  • the displayed phage can be reduced to about several thousand by washing with this solution three times.
  • the number of washings can be appropriately determined according to the screening system.
  • the protein-displayed phage bound to the photoreactive ligand immobilized on the solid phase is recovered.
  • proteins that interact with photoreactive ligands in particular, proteins that have a specific interaction can be screened.
  • a protein can be identified by identifying the DNA of the collected protein-displayed phage.
  • the process shown in Fig. 3 it is preferable to proliferate the collected protein-displayed phage and repeat the process shown in Fig. 3 at least once using the proliferated protein-displayed phage. More preferably, the process shown in FIG. 3 is repeated 2 to 10 times.
  • the recovered protein-displayed phage is propagated and mixed again with the photoreactive ligand in a liquid phase, irradiation with active light, immobilization of the photoreactive ligand on the solid phase, washing of the solid phase, and By recovering the protein-displayed phage bound to the photoreactive ligand immobilized on the solid phase, a protein having a specific interaction can be recovered with higher selectivity.
  • the recovered protein-displayed phage can be propagated, for example, as follows.
  • the recovered phage solution is infected with an E. coli strain serving as an appropriate host. This is propagated in a solution such as LB medium and the host is lysed to proliferate the phage.
  • T7 phage When T7 phage is used as a display phage, the protein or peptide to be displayed is expressed in the head. Therefore, even when a covalent bond is formed with the ligand, the foot necessary for infection is in an intact state.
  • the protein By identifying the finally recovered DNA of the protein-displayed phage, the protein can be identified.
  • All remaining display phages captured by the magnetic beads are put into an E. coli solution, and the infection is amplified according to a conventional method. Using the amplified phage solution, repeat photopanning from Scheme 5 again. In the method of the present invention, for example, photo-banning can be performed twice a day.
  • the present invention includes the following three kits.
  • kits for producing a photoreactive ligand having a photoreactive group of the present invention comprises a compound having a photoreactive group, a ligand labeling substance, and a photoreaction mounting solution.
  • the compound having a photoreactive group can be, for example, a phenyl diazirine compound represented by the general formula (C), and the phenyl diazirine compound represented by the general formula (C) is the above-mentioned present invention. It is a compound shown by the screening method.
  • the ligand labeling substance is, for example,
  • the photoreactive mounting solution is appropriately selected depending on the compound having a photoreactive group and the substance to be a ligand.
  • a procedure for preparing a photoreactive peptide and a protein by using a kit for preparing a photoreactive ligand having a photoreactive group is exemplified.
  • photoreactive ligands Purify photoreactive ligands by high performance liquid chromatography (HPLC) for peptides and gel filtration for proteins.
  • HPLC high performance liquid chromatography
  • photoreactive ligands can also be purified with monomeric piotin, a force suitable for use with HPLC equipment.
  • the photoreactive piotini protein is purified by gel filtration. Although purification by gel filtration is suitable, it can also be purified by monomeric piotin.
  • the vanning kit of the present invention is a kit used for screening a protein or peptide that interacts with a photoreactive ligand.
  • This kit includes a photoreactive ligand having a photoreactive group and a solid phase on which the photoreactive ligand is immobilized.
  • the photoreactive ligand contained in the kit of the present invention is the same as the photoreactive ligand described in the screening method of the present invention.
  • the photoreactive ligand can be, for example, a photoreactive peptide, a photoreactive protein, a photoreactive nucleic acid, or a photoreactive sugar chain.
  • the photoreactive group possessed by the photoreactive ligand can be, for example, a diazirine group.
  • the solid phase on which the photoreactive ligand is immobilized is the same as the solid phase on which the photoreactive ligand is immobilized as described in the screening method of the present invention.
  • a solid phase can be, for example, a magnetic bead or a substrate.
  • the solid phase that immobilizes the photoreactive ligand can be immobilized using, for example, a piotin avidin or streptavidin system, a His tag-nickel system, a boron-hydroxamic acid chelate system, or an antigen antibody system. It can be a trick.
  • the combination of the photoreactive ligand and the solid phase is (1) the photoreactive ligand has piotin, and the solid phase is coated with avidin or streptavidin, (2 ) The photoreactive ligand has a His tag and the solid phase is coated with nickel; (3) the photoreactive ligand has a hydroxamic acid chelate and the solid phase is coated with boron; and (4) The photoreactive ligand has an antigen, and the solid phase can be either coated with an antibody.
  • the kit of the present invention may further include a cleaning agent for cleaning the solid phase on which the photoreactive ligand is immobilized.
  • the detergent can be, for example, an aqueous solution containing a surfactant, and examples of the surfactant can be those described in the screening method of the present invention.
  • the cleaning agent may further contain a chelating agent such as EDTA.
  • the vanning kit of the present invention can be used in the screening method of the present invention.
  • the vanning kit is:
  • the solid phase is coated with adivine, streptavidin, nickel, boron, or an antibody
  • the solid phase carrier can be a magnetic bead or a substrate.
  • the preferred solid phase is magnetic beads coated with streptavidin.
  • a buffer solution can be appropriately used as the phage recovery solution.
  • a procedure for performing photopanning using a protein-displayed phage using the vanning kit of the present invention is exemplified.
  • the phage used here is, for example, T7 phage, and a T7 phage library and E. coli for infection are prepared separately.
  • the validation kit of the present invention includes a protein-displayed phage dilution solution and a photoreactive ligand solution.
  • the protein-displayed phage dilution solution can be a mixed solution containing 1 calmodulin-displayed phage in 100,000 wild phages.
  • the photoreactive ligand solution can be, for example, a photoreactive pyotin calmodulin-binding peptide solution.
  • the validation procedure using the validation kit of the present invention was carried out in accordance with the above-described vanning procedure, using a calmodulin-displayed T7 phage diluted solution instead of the library phage, and a photoreaction as a photoreactive pyotinylated ligand. This is performed using a sex-piotinated calmodulin-binding peptide solution.
  • Two types of photoreactive peptide ligands were prepared based on the calmodulin-binding peptide of sequence 1 that has been confirmed to recognize and specifically bind to the calmodulin protein.
  • a peptide was synthesized in which the third tryptophan from the N-terminus of sequence 1 (LKWKKLLKLLKKLLKLG) (SEQ ID NO: 1) was replaced with tmd (Phe).
  • the synthesis was performed by the Fmo c-solid phase synthesis method using a peptide synthesizer. Then, with the synthesized peptide in the solid phase, the thiotin peptide was synthesized by reacting the N-terminal amino group with piotinosuccinimide. The synthesized peptide was dissociated from the solid phase with a strong acid, and the desired piotin fluorescence reactive peptide was purified by HPLC. In addition, Fmoc-tmd (Phe) necessary for this synthesis was synthesized as follows.
  • Fmoc-tmd (Phe) was synthesized by converting the amino group into Fmoc.
  • a peptide in which the third tryptophan from the N-terminus of sequence 1 (LKWKKLLKLLKKLLKLG) (SEQ ID NO: 1) was replaced with cysteine was synthesized (sequence 3).
  • the synthesis was performed by the Fmoc-solid phase synthesis method using a peptide synthesizer. Thereafter, with the synthesized peptide in the solid phase, the piotinylated peptide was synthesized by reacting piotinosuccinimide with the N-terminal amino group.
  • the synthesized peptide was dissociated from the solid phase with a strong acid, and the desired piotinized peptide was purified by HPLC.
  • the diazirine shown in Compound 3 and the purified peptide were mixed in a solution containing 30% acetonitrile, and the cysteine residue in the peptide and Compound 3 were thiol-bonded.
  • the target pyotiny fluorescent reactive peptide was purified by HPLC (sequence 4).
  • the compound 3 required for this synthesis is M. Kaneda, Y. Sadakane, Y. Hatanaka, (2003) A Novel Approach for Affinity-Based Screening of Target Specific Ligands: Application of Photoreactive D—Glyceraldehyde— 3—phosphate Dehydrogenase Bioconjugate Chem. 14, 849-85 2.
  • the method was described in (Non-patent Document 7). Specifically, it is shown in the above synthesis method of compound 14.
  • a calmodulin protein with a single cysteine residue was produced by genetic modification. Specifically, from a human brain cDNA library, by PCR method, CaM2 primer (5'-CT TAGGAGAATGCCTAACAGATG-3) (SEQ ID NO: 2) and CaM3 primer (5'- CTGCAG GTCTTC ATTTTGC AGTC-3 ') (SEQ ID NO: 2) In 3), a partial gene of the calmodulin protein was amplified, and the calmodulin gene was amplified with the CaMl primer (5'-GGATC CCCATGGCTGATCAGCTGACCGAAG-3 ') (SEQ ID NO: 4) using this fragment as a new primer.
  • calmodulin By this megaprimer method, a gene for producing calmodulin was obtained by modifying the 115th resin of calmodulin protein to cysteine. This amplified fragment was inserted into a pQE32 vector (Qiagen) and transformed into E. coli. E. coli containing this gene was isolated and cultured in large quantities in LB medium. Then, E. coli is disrupted and HIS tag purification Calmodulin protein was purified with a column made by the manufacturer. Calmodulin in which amino acids 26 and 75 were replaced with Cys residues was also produced in the same way.
  • Photoreactive calmodulin-binding peptide (sequence 2) and calmodulin were mixed at a ratio of 1: 1, and allowed to stand at 37 ° C for 10 minutes in the presence of calcium. Thereafter, ultraviolet light (peak wavelength: 360 nm) having an intensity of 30 W / m 2 was irradiated for 1 minute to induce a photoreaction.
  • Figure 5 shows the sample analyzed by HPLC. The upper part is a sample irradiated with ultraviolet rays, and the lower part is a sample that was not irradiated with ultraviolet rays. From the results of mass spectrometry, the peak indicated by the arrow in Fig.
  • Figure 6 shows the results of quantifying the complex peak during “Figure 5 Light irradiation 60 seconds” at various irradiation times of ultraviolet rays and measuring the efficiency of complex formation. It became clear that the maximum efficiency was obtained with one minute of UV irradiation. About 3% of the initial calmodulin protein amount formed a complex.
  • a complex of calmodulin protein and its binding protein was prepared and analyzed by SDS-PAGE.
  • the upper electrophoresis in Fig. 7 shows the results of preparing samples with different UV irradiation times.
  • a simple method is shown on the right side of Fig. 7.
  • High heat treatment is performed in the presence of the reducing agent! / Since it is dissociated, other than the complex bound by the covalent bond.
  • the piotin attached to the photoreactive calmodulin peptide was detected with an avidinized HRP enzyme, it could not be detected with a low molecular weight binding peptide and calmodulin alone without piotin.
  • Calmodulin protein complex formation has been shown to require calcium, and the complex could not be detected in the presence of EGTA.
  • the lower electrophoresis in Figure 7 shows the results of an inhibition experiment with a calmodulin antagonist. Complex formation is inhibited by lOO ⁇ mol / L TFP. The concentration dependence of this inhibition is in good agreement with that of calmodulin function inhibition.
  • Evaluation experiment (2) revealed that photoreactive calmodulin protein (scheme 3) has the ability to recognize calmodulin-binding peptides and form complexes.
  • photobanning was performed to compare the selection efficiencies of the phages displaying calmodulin. According (Table 1) calmodulin presentation files over di (10 8) and S tags presentation control phage (10 8) of the photo Banning standard methods, were screened using 100 pmol of the photoreactive ligand. Capture on magnetic beads The number of phages obtained was measured. The number of calmodulin-displayed phages is evaluated. The experimental results are evaluated by how many times they are captured relative to the control phages.
  • the photoreactive calmodulin-binding peptide of sequence 2 was used to compare the selection efficiency with varying amounts of ligand. (Table 2)
  • the amount of avidin magnetic beads used is 100 L and has the ability to adsorb 250 pmol of biotin.
  • the plate used was a 96-well avidin-fixed plate (Pierce).
  • Calmodulin-displaying phage and control phage were mixed in various proportions as shown in the table below. About 10 9 phages were used in each experiment. Photo-banning was performed using photoreactive ligand (10 pmol) of sequence 2 and 100 L of magnetic beads. The number of phage captured on the magnetic beads was measured. Furthermore, plaque hybridization was performed using the calmodulin gene as a probe. Calmodulin-displayed phage plaques were regarded as positive plaques and compared with the total number of plaques, and the ratio was calculated. (Table 4)
  • the number of phage trapped in the magnetic beads decreases as the proportion of calmodulin-displayed phage decreases.
  • a calmodulin-binding peptide was prepared with the N-terminus of sequence 1 as a biotin. Use this peptide (10 / zmol / L) and follow the standard method for photopawing (but do not use light) to see how much calmodulin-displaying phage and control phage are in magnetic beads (100 L). It was measured whether it was caught. (Table 5 ) Washing is performed in 0.05% TBS (50 mM Tris / HCl (pH 7.4), 0.25 M NaCl) containing ImM CaCl.
  • the washing was performed by adding 0.5% surfactant Tween-20.
  • the same conditions ((1) and (2)) were performed twice.
  • the experiments of (1), (2), and (3) are the results of light irradiation with the ligand of sequence 2 with the ligand in which the terminus of sequence 1 is biotinylated.
  • the number of calmodulin-displayed phage captured by magnetic beads is not much different from the conventional method and photopanning method.
  • the conventional banning method captures about 1000 times more than the photobanning method.
  • the difference in knock ground is that the photo-banning method can select the target phage more efficiently than the conventional method. Comparing the experiments of (1) and (2), it can be seen that the conventional vanning method has poor reproducibility.
  • Calmodulin-displaying phage and control phage were mixed in various proportions as shown in the table below. About 10 8 phage were used in each experiment. A calmodulin-binding peptide (10 pmol) in which the terminal of sequence 1 was piotinated and a photoreactive ligand (10 pmol) of sequence 2 were used. Magnetic beads were performed at 25 ⁇ L.
  • a human brain cDNA expression library and a human liver cDNA expression library were used.
  • a human brain cDNA library contains many calmodulin genes. Both purchased from Novagen both, it began the screening from approximately 10 9 display phage.
  • a photoreactive calmodulin-binding peptide of sequence 2 or a peptide in which the N-terminus of sequence 1 was piotinylated was used as a ligand. The final concentration was 10 / z mol / L in all cases.
  • a membrane was prepared, plaque hybridization was performed using the calmodulin gene fragment as a probe, and the number of calmodulin presentation phages was measured (Fig. 12, Plaque Hypri). Furthermore, a small amount of SM buffer was placed on the same plate, and a phage solution was prepared from the plate. Based on this solution, PCR was performed using primers that specifically amplify calmodulin, and the presence or absence of calmodulin-displayed phages was confirmed (Fig. 12, PCR (2)). The solution was amplified. After amplification, the number of phages was measured (FIG. 12, phage number measurement (1)), and a portion was used to confirm the presence or absence of calmodulin-displayed phages (FIG. 12, PCR (l)).
  • Calmodulin-displayed phages were screened from a human brain cDNA library. The results were compared with and without light irradiation using the ligand of sequence 2.
  • the phages selected at the stage of Photo B (l) -2 (with light) were individually confirmed by PCR, which amplifies the calmodulin gene ( Figure 13).
  • the lane of M is a marker.
  • the phage solution selected with Photo B (l) -1 (with light) and Photo B (l) -3 (with light) was appropriately diluted and cultured so that about 200-300 plaques appeared.
  • a nitrocellulose membrane was placed there, and after appropriate operations, plaque hybridization was performed using the calmodulin gene as a probe (FIG. 14).
  • a black-pointed phage displaying calmodulin (referred to as a positive clone).
  • the resulting force in FIG. 14 was also measured. 0.5% in the first photobanning, 60% in the second, and 99% in the third, calmodulin-displayed phages, which is consistent with the results of the rapid increase in the number of phages described above.
  • the ligand used was a Piotinylated N-terminus of sequence 1.
  • the number of phage after vanning changes about 10 times in each cycle, but it is not reproducible. From the results of plaque hybridization in Table 10, it can be seen that calmodulin-displayed phages are not concentrated.
  • the calmodulin gene is not amplified even in experiments (Fig. 16: Conventional B (5) and (6)) conducted using the amplified phage as a template. Experiments that examined the presence of calmodulin-displayed phages in hundreds of phages at each stage ( Figure 17: Conventional) In B (5) and (6)), the calmodulin gene was increased at the fourth time in B (5), but it disappeared at the fifth time and there was no reproducibility. As long as this system is used, the calmodulin-displayed phage cannot be enriched by the conventional vanning method.
  • the photobanning method was evaluated using a library made from human liver cDNA, which is said to have low expression of calmodulin.
  • the experimental method is the same as the evaluation experiment (8).
  • 26-, 75-, 1 15 -photoreactive calmodulin indicates the position of the amino acid residue from the N-terminus, indicating that a photoreactive group has been attached to that site.
  • Bunning was carried out between calmodulin-binding peptide-displaying phage and control phage, and the amount of phage captured by the magnetic beads was compared, and the selection efficiency of the photobanning method and the conventional method were compared.
  • the photoreactive ligand piotinylated 115-photoreactive calmodulin was used, and in the conventional method, piotinylated calmodulin protein was used.
  • the conventional method was performed in the same manner as the experiment with peptide ligand (evaluation experiment (7)).
  • the photobanning method can capture 100 times the amount of calmodulin-binding peptide-displayed phage as the control phage. On the other hand, it was about 4 times with the conventional method (Table 13) [0162] [Summary]
  • the photo-banning method can select target phages more efficiently than the conventional method.
  • Calmodulin-binding peptide-displaying phage and control phage were mixed at various ratios as shown in Table 14 below. In each experiment, the total number of phages was adjusted to about 10 8 .
  • the photopaying method used a photoreactive calmodulin protein that had been piotinated, and the conventional method used a calmodulin protein that had been piotinized as a ligand.
  • the number of phage captured by magnetic beads was measured (Table 14)
  • the number of phage captured by the magnetic beads does not change even if the proportion of phages capable of binding decreases, but in the photobanning method, the number of captured phages decreases as the proportion decreases. Tsutsu.
  • the selected phage solution is appropriately diluted and cultivated so that several hundred plaques appear, and the SM buffer is prepared to prepare a phage solution, and this phage solution is used as a template for calmodulin by PCR.
  • the gene for the binding peptide was amplified ( Figure 20).
  • the numbers on each electrophoresis correspond to the samples (1) to (4) shown in Table 14. The number below shows the number of plaques that appeared on the used plate.
  • primers are prepared in the region encoding the peptide and the neighboring phage genome region, and PCR is performed. It was.
  • the photo-banning method is at least 100 times more efficient than the conventional method. It seems to be.
  • the number of calmodulin-binding peptide-displaying phages in the phage solution obtained by the photobanning method as well as the diluted sample force was determined by plaque hybridization, and is shown in FIG.
  • the numbers at the top of the high-prix photos correspond to (1) to (4) in Table 14.
  • the number of positive plaques Z, the number of total plaques, and the concentration ratio in parentheses are shown.
  • Ten of the 680 calmodulin-binding peptide-displayed phages were recovered from the phage solution diluted 1: 100,000. Therefore, the concentration efficiency is estimated to be 1470 times.
  • Screening was performed to isolate proteins that bind to calmodulin from human brain and liver cDNA libraries. Screening was carried out using 30 pmol of the photoreactive calmodulin protein as a ligand in the photopaying method and 30 pmol of the calmodulin protein in the conventional method as a biotin.
  • the library is It began screening from approximately 10 9. From the second time on, the amount was 1Z20 at the “concentration after growth” in the table corresponding to each time.
  • Avidin magnetic beads were used at 100 / zL. In the conventional method, the cleaning conditions used in the evaluation experiment (7) were used. Tables 15, 17, and 18 show human brain libraries that were screened using the photobanning method. The power of conventional screening of human brain libraries is shown in Table 16. Table 19 shows a human liver library screened by photobanning.
  • the number of phages after vanning increases with each cycle.
  • the calmodulin target database ( ⁇ almoaulin Target Database (http: // calcium .unnres.utoronto.ca / ctdb / flash.htm))) includes sequences that have been determined to be “8” or higher by calmodulin binding analysis.
  • the database is Yap KL, Kim J, Truong K, Sherman M, Yuan T, Ikura M. J Str uct Funct Genomics. 2000; 1 (1): 8-1. Reported in 14., can evaluate the ability to bind calmodulin.
  • Figure 23 shows the result of analysis of No3 AC092953 in the same database. It is considered that it binds to calmodulin.
  • Nos. 3, 7, 8, 9, 12, 13, 14, 15, 16, and 17 are considered to be non-naturally occurring peptides. That is, what is read in the opposite chain, what is undergoing frame shift, what is reported as not being a protein, etc.
  • Magnification is based on the number of control phages and how many times each phage was adsorbed.
  • Fig. 24 shows the results of PCR using the phage solution amplified after vanning as a template. Information on each sample is shown at the top of the electrophoresis. “L” is a library template.
  • the selected phage solution was appropriately diluted to make plaques appear, and the SM buffer was removed to prepare a phage solution. Using this phage solution as a template, The results of amplification by PCR are shown. The numbers under each electrophoresis indicate the approximate number of plaques that appeared on the plate used.
  • (9) and (7) are the results of the photopanning method
  • (8) are the results of the conventional method.
  • the present invention is useful in the field of drug discovery and antibody medicine related to proteins and peptides.
  • FIG. 1 A schematic diagram of a protein-displayed phage.
  • FIG. 2 is a schematic explanatory diagram of a conventional vanning method.
  • FIG. 3 is a schematic explanatory diagram of the photobanning method of the present invention.
  • FIG. 4 is an explanatory diagram of the photobanning method of the present invention.
  • FIG. 6 shows measurement results of complex formation efficiency in Example 3.
  • FIG. 9 An illustration of the degree of concentration in a single operation by the photo-banning method.
  • FIG. 10 shows the results of confirming the presence or absence of calmodulin-displayed phage in each dilution series in evaluation experiment (8).
  • FIG. 12 Schematic diagram of an experiment in Example 5, in which the cDNA-displayed phage library also isolated calmodulin-displayed phages using the photobanning method and the conventional vanning method.
  • FIG. 13 shows the results of confirming amplification of the calmodulin gene by PCR in Example 5.
  • FIG. 14 Plaque hybridizer using calmodulin gene as a probe in Example 5 Chillon results (Note: The picture does not include all plaques, but)
  • FIG. 15 Results of amplification confirmation by PCR of calmodulin gene.
  • FIG. 16 Results of amplification confirmation by PCR of calmodulin gene.
  • FIG. 17 shows the results of confirming amplification of the calmodulin gene by PCR.
  • FIG. 18 Results of confirming amplification of the calmodulin gene by PCR.
  • FIG. 20 shows the result of confirming the presence or absence of calmodulin-binding peptide-displayed phage in each dilution series.
  • FIG. 21 Results of determination of the number of calmodulin-binding peptide-displayed phages in the phage solution captured by the photobanning method using plaque hybridization.
  • FIG. 24 shows the result of PCR using a phage solution amplified after paying as a template.
  • FIG. 25 Results of PCR amplification of each gene using a phage solution as a template.
  • FIG. 26 Overview of screening for calmodulin-binding protein by the photobanning method (the present invention).
  • the screening method of the present invention can comprehensively analyze various clones with excellent reproducibility and selection efficiency.

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Abstract

【課題】リガンドに対して相互作用するタンパク質またはペプチドをより確実にスクリーニングする方法を提供する。 【解決手段】光反応性リガンドと、タンパク質提示ファージまたはペプチド提示ファージを液相中で混合し、光反応性リガンドの光反応基に対する活性光を照射し、光反応性リガンドが有する固定化機能を利用して、固相に光反応性リガンドを固定化し、光反応性リガンドを固定化した固相を洗浄し、固相に固定化された光反応性リガンドと結合したタンパク質提示ファージまたはペプチド提示ファージを回収することを含む光反応性リガンドに対して相互作用するタンパク質またはペプチドをスクリーニングする方法。

Description

明 細 書
光反応基を利用したバニング法およびそれに用いるキット
関連出願の相互参照
[0001] 本出願は、 2006年 1月 23日出願の日本特願 2006— 14314号の優先権を主張し 、その全記載は、ここに特に開示として援用される。
技術分野
[0002] 本発明は、フエニルジアジリンなどの光反応基を利用し、提示ファージを効率的に 単離するバニング法に関する。この方法を以下、フォトバニング法と呼ぶ。本発明は、 このフォトバニング法を利用した、リガンドに対して相互作用するタンパク質またはべ プチドを効率的にスクリーニングする方法に関する。さらに本発明は、このスクリー- ングする方法に用いられるキットに関する。
背景技術
[0003] タンパク質やペプチドをファージ表面に提示し、 目的のタンパク質やペプチドを提 示したファージをスクリーニングする技術は、 1985〜1990年にかけて完成された。 (G . P. bmith (1985) filamentous fusion phage: novel expression vectors that display cl oned antigens on the virion surface. Science, 228, 1315- 1317. (非特許文献 1) , S. E. Cwirla, E. A. Peters, R. W. Barrett, W. J. Dower (1988) Antibody-selectable filame ntous fd phage vectors: affinity purification of target genes. Gene 73, 305-318 (非 特許文献 2) , S. F. Parmley, G. P. Smith. (1990) Peptides on phage: a vast library of peptides for identifying ligands. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 6378—6382 (非特許 文献 3) )
[0004] 提示ファージはかなり強力な変性条件でも生存可能であり、生物を扱うというよりは タンパク質分子を扱うかのように利用でき、さらに容易にそれを発現する遺伝子を容 易に単離できることから、バイオテクノロジー分野で広く利用されている。提示ファー ジのスクリーニング法として最もよく利用されるバニング法は、砂金などを選鉱なベで 洗ってより分けると 、う意味をもつ「pan」力もきて 、るもので、 目的の提示ファージをリ ガントとのァフィユティーでより分け、その後、 目的ファージが濃縮されたファージ集 団を増殖させる。これを繰り返すことで、 目的の提示ファージが次第に濃縮され、単 離できるという方法である (図 2参照)。ファージは数時間以内に 101Q個を超えるほどの 飛躍的な増殖効率であるため、 1日で数回のバニング操作が可能である。近年、この 高速なスクリーニング能力を利用して、抗体医療のシードを探し出す基礎技術として 、抗体を提示したファージのパユング法が期待されて 、る。
本発明者らは、これまでジアジリン誘導体を光反応基として、独自の高速光ァフィ二 ティー法の開発を行ってきた。光ァフィ二ティー法は光反応を利用して特異的なリガ ンドと相手のタンパク質を非可逆的につなぎとめる技術である。ジアジリンは、他の光 反応基に比べ、この非可逆的結合を有利に起こす特徴を持つ。（Y. Sadakane, Y. H atanaka (2004) Multifunctional photoprobes for rapid protein mentincation. In F. Da rvas, A. Guttman and G. Dorman eds., Chemical Genomics, Marcel Dekker Inc., Ne w York. Ppl99- 214 (非特許文献 4)、 Y. Hatanaka, Υ. Sadakane (2002) Photoaffinity 1 abeling in drug discovery and developments: Chemical gateway for entering proteomi c frontier. Curr. Top. Med. Chem. 2, 271- 288 (非特許文献 5)、畑中保丸 構造生 物学的有機化学:光ァフィ-ティラベルによる蛋白質機能構造のプロ一ビング、有機 合成化学会誌, 56(7)、 581- 590, 1998 (非特許文献 6)、 M. Kaneda, Y. Sadakane, Y. Η atanaka, (2003) A Novel Approach for Affinity-Based screening of Target Specinc Li gands: Application of Photoreactive D—Glyceraldehyde— 3— phosphate Dehydrogenase . Bioconjugate Chem. 14, 849-852. (非特許文献 7)、 M. Hashimoto, J. Yang, Y. Hat anaka, Y. Sadakane, K. Nakagomi, G. D. Holman (2002) Improvement in the propert ies of 3— phenyl— 3— trifluoromethyldiazirine based photoreactive bis— glucose probes fo r GLUT4 following substitution on the phenyl ring. Chem. Pharm. Bull. 50, 1004—10 06 ( 特許文献 8)、 Hatanaka, Y., Kempin, U., Park, JJ. One-step synthesis of bioti nyl photoprobes from unprotected carbohydrates. J. Org. Chem. 65, 5639—5643, 20 00 (非特許文献 9)、 Hatanaka, Y., Hashimoto, H., Kanaoka, Y. A rapid and efficient method for identifying photoaffinity biotinylated sites witnin proteins. J. Am. し hem. Soc. 120, 453-454, 1998 (非特許文献 10)、特開 2000- 319262号公報（特許文献 1) ) 本発明者らは、光反応基の特徴と提示ファージバニングとの組み合わせによる技 術革新を期待し予備的な実験を行った。化学的選択性のある官能基をもつ光反応 基を固相上に固定ィ匕し、この官能基を頼りに糖鎖リガンドまたはペプチドリガンドを導 入した固相を製作した。この予備的な実験結果力 提示ファージを固相上に共有結 合で固定ィ匕できること、また、この固相上力もファージを回収できることが明らかにな つた。しかし、この方法は固相上に固定ィ匕できた光反応性リガンドの量に限界があつ たため、固定ィ匕されたリガンド量は lcm2あたり数千個の提示ファージを一度にスクリー ユングできる量に留まった。このため、固相上のリガンド量が不十分なことが影響した と考えられるファージ捕捉量の不足が問題となり、実際のバニングに使用するにはそ の数百倍の面積が必要なため、実用的技術として確立するには至らな力つた。 (Y. S adakane, H. Nakashima, J.—J. Park, K. Nakagomi, Y. Hatanaka (2002) EFFICIENT CLONING OF CARBOHYDRATE BINDING PROTEINS. Photomedicine and Photob iology 23, 83- 84 (非特許文献 11) , Y. Sadakane, Η. Nakashima, J.- J Park, Y. Hatan aka (2002) Preparation of solid photo-crosslinking matrix and application to photo- p anning of displayed phages. Photomedicine and Photobiology 24, 85-86. (非特許文 献 12) )
非特 S午文献 1： . P. smith (1985) Filamentous fusion phage: novel expression vecto rs that display cloned antigens on the virion surface. Science, 228, 1315—1317. 非特許文献 2 : S. Ε· Cwirla, Ε· A. Peters, R. W. Barrett, W. J. Dower (1988) Antibo dy-s electa Die filamentous rd phage vectors: affinity purification of target genes. Gen e 73, 305-318
非特言午文献 3 : S. F. Parmley, G. P. Smith. (1990) Peptides on phage: a vast library o f peptides for identifying ligands. Proc. Natl. Acad. ¾ci. USA 87, 6378 - 6382 非特言午文献 4 : Y. Sadakane, Y. Hatanaka (2004) Multifunctional photoprobes for rapi d protein identification. In F. Darvas, A. Guttman and G. Dorman eds.， Chemical G enomics, Marcel Dekker Inc., New York. Pp 199-214
非特言午文献 5 : Y. Hatanaka, Y. Sadakane (2002) Photoaffinity labeling in drug disco v ery and developments: Chemical gateway for entering proteomic frontier. Curr. Top . Med. Chem. 2, 271-288
非特許文献 6：畑中保丸 構造生物学的有機化学：光ァフィ二ティラベル〖こよる蛋白 質機能構造のプロ一ビング、有機合成化学会誌, 56(7)、 581-590, 1998
非特許文献 7 : M. Kaneda, Y. Sadakane, Y. Hatanaka, (2003) A Novel Approach for Affinity-Based Screening of Target Specific Ligands: Application of Photoreactive D —Glyceraldehyde— 3— phosphate Dehydrogenase. Bioconjugate Chem. 14, 849—852. 非特許文献 8 : M. Hashimoto, J. Yang, Y. Hatanaka, Y. Sadakane, K. Nakagomi, G. D. Holman (2002) Improvement in the properties of 3- phenyト 3- trifluoromethyldiazi rine based photoreactive bis— glucose probes for GLUT4 following substitution on th e phenyl ring. Chem. Pharm. Bull. 50, 1004 - 1006
特許文献 9 : Hatanaka, Y., Kempin, U., Park, JJ. One-step synthesis of biotinyl ph otoprobes from unprotected carbohydrates. J. Org. Chem. 65, 5639—5643, 2000 非特許文献 10 : Hatanaka, Y., Hashimoto, H., Kanaoka, Y. A rapid and efficient met hod for identifying photoaffinity biotinylated sites within proteins. J. Am. Chem. Soc. 120, 453-454, 1998
非特許文献 11 : Y. Sadakane, H. Nakashima, J. -J. ParkJ, K. Nakagomi, Y. Hatanaka (2002) EFFICIENT CLONING OF CARBOHYDRATE BINDING PROTEINS. Photo medicine and Photobiology 23, 83 - 84
非特許文献 12 : Y. Sadakane, H. Nakashima, J.-J Park, Y. Hatanaka (2002) Preparati on of solid photo— crosslin腿 g matrix and application to photo-panning of displayed phages.. Photomedicine and Photobiology 24, 85—86.
特許文献 1 :特開 2000-319262号公報上記非特許文献 1〜12および特許文献 1の全 記載は、ここに特に開示として援用される。
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
目的の提示ファージを単離する技術であるバニング法は、それまで知られて ヽたス クリーニング法に比べれば画期的であり、様々な分野で応用できると考えられた。し かし、実際には使用範囲は限られている。これには、主に二つの原因があるとされる 。 1つ目は、 目的の提示ファージを単離できるかは、リガンドと提示したタンパク質や ペプチドとの親和性で決まってしまうことである。実際のバニング法では、両者間の親 和性が力なり強くないと、再現性の良いバニング操作ができず、濃縮効率も安定しな いことが知られている。これに対する改善策として、主に提示ファージ発現系の改良 が進められており、発現するタンパク質数を増やすなどの工夫がなされている。しか し、一般的な手法とはなっていない。 2つ目は、バニング操作後に行うファージの増 幅で、ファージ間で生長差が生じることである。特に、タンパク質など大きな分子をフ ァージに提示させると生長差が顕著となり、圧倒的に野生型に近いファージがマジョ リティーとなることが知られている。これらの理由で数回のバニング操作を繰り返すう ちに目的の提示ファージはどこかに 、つてしま!、、野生型のファージが最終的に単 離されてしまうと!、つた問題があることが長い間指摘されて!、る。
[0008] 上記の問題点を解決するためには、リガンドと提示ファージ間の親和性に頼らない 選別法を開発し、非特異的な結合で残ってしまう野生株に近いファージを徹底的に 排除する必要がある。この解決法を実現する手段として、光反応基を利用したパニン グ法を着想した。本発明者らは予備的な実験として、提示ファージが固相上に配列し た光反応性リガンドにより固定ィ匕できることを既に明らかにしている。しかし、この方法 は固相上に固定ィ匕できた光反応性リガンドの量に限界があつたため、標準的なファ ージライブラリーを対象としたバニングに使用する目的には、その数百 cm2の固相面 積が必要なため、実用的技術として確立するには至らず、方法論的可能性を示唆す るに留まった。
[0009] 本発明は、上記の解決法を実現することを目的とし、タンパク質やペプチドなどをフ ァージ表面に提示したファージライブラリーから、 目的のタンパク質やペプチドを提示 したファージをスクリーニングする方法である。充分量の光反応性リガンドを介し、ファ ージライブラリーから目的の提示ファージを効率よくマトリックス上に特異的に釣り上 げ、かつ確実に単離できる実用的方法を提供し、リガンドに対して相互作用するタン ノ ク質またはペプチドを、従来法に比べてより確実にスクリーニングする方法を提供 することを目的とする。
課題を解決するための手段 [0010] 本発明者らは、従来のバニング法において、光反応性のリガンドを利用することで、 目的の提示ファージを効率よぐかつ確実に単離できることを見いだして本発明を完 成させた。
[0011] 上記課題を解決するための本発明は以下のとおりである。
[1]光反応基を有する光反応性リガンドと、タンパク質提示ファージまたはペプチド提 示ファージを液相中で混合し、
光反応性リガンドの光反応基に対する活性光を照射し、
光反応性リガンドを固相に固定ィ匕し、
光反応性リガンドを固定ィ匕した固相を洗浄し、
固相に固定化された光反応性リガンドと結合したタンパク質提示ファージまたはぺプ チド提示ファージを回収することを含む
光反応性リガンドに対して相互作用するタンパク質またはペプチドをスクリーニングす る方法。
[2]光反応性リガンドが光反応性ペプチド、光反応性タンパク質、光反応性核酸また は光反応性糖鎖である [1]に記載の方法。
[3]光反応基がジアジリン基である [1]または [2]に記載の方法。
[4]光反応性リガンドの固相への固定ィ匕をピオチン アビジンまたはストレプトァビジ ン系、 Hisタグ一ニッケル系、ホウ素ーヒドロキサム酸キレート系、または抗原 抗体系 を用いて行う [1]〜[3]の 、ずれかに記載の方法。
[5] (1)光反応性リガンドがピオチンを有し、固相はアビジンまたはストレプトアビジン を被覆したものであり、（2)光反応性リガンドが Hisタグを有し、固相はニッケルを被覆 したものであり、（3)光反応性リガンドがヒドロキサム酸キレートを有し、固相はホウ素 を被覆したものであり、及び (4)光反応性リガンドが抗原を有し、固相は抗体を被覆し たものであるのいずれかである [4]に記載の方法。
[6]固相が磁気ビーズ、または基板である [1]〜[5]のいずれかに記載の方法。
[7]固相に固定化された光反応性リガンドと結合したタンパク質提示ファージまたはべ プチド提示ファージの回収を、磁気ビーズを回収することで行う [6]に記載の方法。
[8]洗浄は、界面活性剤を用い行う [1]〜[7]のいずれかに記載の方法。 [9]回収したタンパク質提示ファージまたはペプチド提示ファージの DNAを同定する ことで、タンパク質またはペプチドを同定する [1]〜[8]の 、ずれかに記載の方法。
[10]回収したタンパク質提示ファージまたはペプチド提示ファージを増殖させ、増殖 させたタンパク質提示ファージまたはペプチド提示ファージを用いて、 [1]に記載され た光反応性リガンドとの液相中での混合、活性光の照射、固相への光反応性リガンド の固定化、固相の洗浄、および固相に固定化された光反応性リガンドと結合したタン パク質提示ファージまたはペプチド提示ファージの回収を少なくとも 1回行う、 [1]〜[8] のいずれかに記載の方法。
[11]回収したタンパク質提示ファージまたはペプチド提示ファージの DNAを同定す ることで、タンパク質またはペプチドを同定する [10]に記載の方法。
[12]光反応性リガンドに対して相互作用するタンパク質またはペプチドをスクリーニン グするために用いるキットであって、
光反応基を有する光反応性リガンドと前記光反応性リガンドを固定化する固相を含 む前記キット。
[13]光反応性リガンドが光反応性ペプチド、光反応性タンパク質、光反応性核酸また は光反応性糖鎖である [12]に記載のキット。
[14]光反応基がジアジリン基である [12ほたは [13]に記載のキット。
[15]光反応性リガンドを固定ィ匕する固相は、ピオチン アビジン若しくはストレブトァ ビジン系、 Hisタグ一ニッケル系、ホウ素一ヒドロキサム酸キレート系、または抗原一抗 体系を用いて光反応性リガンドを固定ィ匕するものである [12]〜[14]のいずれかに記載 のキット。
[16] (1)光反応性リガンドがピオチンを有し、固相はアビジンまたはストレプトアビジン を被覆したものであり、（2)光反応性リガンドが Hisタグを有し、固相はニッケルを被覆 したものであり、（3)光反応性リガンドがヒドロキサム酸キレートを有し、固相はホウ素 を被覆したものであり、及び (4)光反応性リガンドが抗原を有し、固相は抗体を被覆し たものであるのいずれかである [15]に記載のキット。
[17]固相が磁気ビーズ、または基板である [12]〜[16]のいずれかに記載のキット。
[18]光反応性リガンドを固定ィ匕した固相を洗浄するための洗浄剤をさらに含む [12]〜 [17]のいずれかに記載のキット。
[19][1]〜[11]の ヽずれかの方法にぉ ヽて使用される、 [12]〜[18]の ヽずれかに記載 のキット。
[20]光反応基を有する化合物、リガンド標識物質および光反応装着溶液を含む、光 反応基を有する光反応性リガンドを作製するためのキット。
[21]光反応基を有する化合物は、以下の一般式 (C)で示されるフ -ルジアジリンィ匕 合物である [20]に記載のキット。
[化 1]
Figure imgf000010_0001
(上記式中、 Rは、ハロゲン原子、またはスルホン酸エステル残基であり、 Rは、炭素
6 7 数 1〜6のアルキルチオスルホ -ル基または炭素数 1〜6のアルキルチオ基であり、 R
8 は、 Hまたは炭素数 1〜6のアルキル基であり、 nは 1〜6の整数である。 )
[22]リガンド標識物質は、ピオチン、ヒスチジンタグ（Hisタグ）、ヒドロキサム酸キレート または抗原である [20]または [21]に記載のキット。
[23]タンパク質提示ファージ希釈溶液および光反応性リガンド溶液を含む、バリデー シヨンするためのキット。
発明の効果
[0012] 本発明により、従来のバニング法と比較して約 1000倍もの濃縮効果をもつバニング 法を提供できる。光反応性のリガンドは、それと親和性のある提示ファージを共有結 合で捉えることが可能である。この不可逆的な結合により、強力な洗浄を行っても、 目 的の提示ファージを逃すことがなぐかつ、非特異的に吸着した提示ファージのほと んどを取り除くことが可能となる。提示ファージを捉える光反応は、光反応基がジアジ リン基である場合、 360nm付近の光で効率良ぐし力も極めて速くおこる。また、この光 反応は、提示ファージにダメージを与えることはなぐバニング法に必要なファージの 増殖能には影響を与えない。
[0013] さらに、強力な洗浄操作が可能となることで、従来のバニング法の洗浄のように経験 的な感が必要となくなる。その結果、リガンドに対して相互作用するタンパク質または ペプチドをより効率的に、かつ確実にスクリーニングすることができる。さらに、提示フ ァージの単離操作を機械化することが可能である。特に、近年、開発が進められてい る抗体提示ファージの単離法として、バニング操作の機械化は経済的にも意味があ るといえる。
発明を実施するための最良の形態
[0014] [スクリーニング方法]
本発明は、光反応性リガンドに対して相互作用するタンパク質またはペプチドをスク リーニングする方法であり、この方法は、
(1)光反応基を有する光反応性リガンドと、タンパク質提示ファージまたはペプチド提 示ファージを液相中で混合し、
(2)光反応性リガンドの光反応基に対する活性光を照射し、
(3)光反応性リガンドを固相に固定ィ匕し、
(4)光反応性リガンドを固定ィ匕した固相を洗浄し、
(5)固相に固定化された光反応性リガンドと結合したタンパク質提示ファージまたはべ プチド提示ファージを回収することを含む。
[0015] [光反応性リガンド] 本発明において、光反応性リガンドは、タンパク質提示ファージまたはペプチド提 示ファージが提示するタンパク質またはペプチドに対するリガンドであって、光反応 基を有するものである。ここで、リガンドとは、例えば、ペプチドまたはタンパク質であり
、より具体的には、元の配列にシスティン残基を 1つ含むペプチドまたは、システィン 残基を 1つ導入したペプチド、および、適切部位に光反応性アミノ酸を導入したぺプ チドがある。さらに、 s-s結合に関与していないシスティン残基を含むタンパク質、また は、遺伝子改変法などで、新たにシスティン残基を導入したタンパク質がある。これら の性質を満たして 、れば、任意の配列のペプチドやタンパク質をリガンドとすることが できる。
[0016] また、光反応基は、特定波長の光照射で反応性の高い中間体をとる化学反応基で あり、その中間体は最寄りの分子と共有結合を結び、安定化する性質をもつ。光反応 基の例としては、例えば、ジアジリン基、アジド基、カルボニル基などを挙げることがで きる。本発明では、光反応基は、ジアジリン基であることが好ましい。
[0017] 光反応基を装着したリガンドを光反応性リガントと呼び、光反応性リガントとしては、 例えば、光反応性ペプチド、光反応性タンパク質、光反応性核酸および光反応性糖 鎖を挙げることができる。
[0018] [光反応性ペプチドリガンドの作製方法]
光反応性ペプチドリガンドは、リガンドとなり得るペプチドに光反応基を導入すること で調製することができる。リガンドとなり得るペプチドへの光反応基の導入は、以下の 2つの方法を挙げることができる。
[0019] 1つは、システィン残基を介して、光反応基を導入する方法であり、もう 1つは、光反 応性アミノ酸を利用して製作する方法である。ペプチドリガンドにシスティン残基を含 む配列では、それを介して光反応基を導入することができる。また、システィン残基を 含まない配列のリガンドでは、任意の位置にシスティン残基を導入して、光反応基を 結合させることができる。光反応性アミノ酸を利用すれば、ペプチド合成機などを使 用し光反応性ペプチドを合成することができる。
[0020] 以下に光反応性カルモジュリン結合ペプチドリガンドを例に、光反応性ペプチドリガ ンドの調製方法をさらに説明する。 [0021] カルモジュリン結合ペプチド（17残基)をテンプレートに、 2種類の光反応性カルモ ジュリン結合ペプチドリガンドを製作した例である。
光反応性ペプチドリガンドは、以下の配列 1のカルモジュリン結合ペプチドをもとに 製作した。このペプチドはカルモジュリンタンパク質を認識し特異的に結合することが 確かめられている。配列 2および配列 4で示した、製作方法の異なる 2つの光反応性 ペプチドを合成した。 1つは、 N末端から 3つ目のトリブトファンを、光反応性アミノ酸 tm d(Phe)で置き換えたペプチドを合成し、 N末端をピオチンィ匕した光反応性ペプチドで ある。（配列 2)。配列 2の下にその化学構造を示した。 tmd(Phe) (ィ匕合物 1)のァミノ基 に Fmoc保護基を付けた Fmoc-tmd(Phe) (化合物 2)を用い、ペプチド合成機で光反 応性ペプチドを製作した。もう 1つは、 N末端から 3つ目のトリブトファンを、システィン に置き換えたペプチドを合成し (配列 3)、 N末端をビォチン化した後、化合物 3に示さ れるジアジリンをチオール結合で導入した光反応性ペプチドである（配列 4)。合成し た 2種類の光反応性カルモジュリン結合ペプチドは、 HPLCで精製し使用した。
[0022] [化 2]
NH2-LKW KLLKLLKKLLKLG-OH
Hef. O'NeU ϋΐ. (1387) ScieiLce 1454-145G.
Figure imgf000013_0001
Biotin-LKCj¾KKLLKLLKKLLKLG-OH (配列 3)
Biotin-LKCvsKKLLKLLKKLLKLG-OH (配列 4)
Figure imgf000013_0002
[0023] [化 3]
Figure imgf000014_0001
(化合物 2) (化合物 3)
(化合物 υ Fmcc-tmd(Phe)
tmd(Phe)
L-4'-(3-(trifluoromethyl)-3H- 9-Fluorenylmet oxycartoonyl- S-[4-(3-triHuoromethyl- diazirine-3-yl)phenyl alanine L-4'-(3-(trifluoromethyl)-3H- 3W-diazirin-3-yl)-benzyl]- diazirine-3-yl)phenylalanine methane thiosulfonate
[0024] 〔光反応性タンパク質リガンドの製作方法〕
光反応性タンパク質リガンドは、カルモジュリンに光反応基を装着することで製作で きる。タンパク質リガンドは、 Cys残基を導入した組換えカルモジュリンタンパク質 (分 子量約 2万)を大腸菌で製作し、作製したタンパク質に光反応基を装着する。光反応 基を導入する部位を変えた 3種類の光反応性カルモジュリンタンパク質リガンドの作 製例を以下に示す。
[0025] システィン残基に特異的に結合するジアジリンチォスルフォネート（diazirine thiosulf onate) (ィ匕合物 3)を、遺伝子改変で導入したシスティン残基へ装着することで作製し た。光反応基の導入部位の異なる 3種類の光反応性カルモジュリンタンパク質を製作 した。カルモジュリンとその結合ペプチドである MLCK断片ペプチドの立体構造解析 結果（PDB: ICDL)から、 26、 75、 115番目のアミノ酸が MLCK断片ペプチドを中心に それぞれ別の位置にあることがわかる。それぞれのアミノ酸をシスティンに変換して、 化合物 3を装着した。その後、それぞれをピオチンィ匕した。下記の (模式図 1)はカル モジュリンタンパク質と 115番目のリジンの位置を示している。カルモジュリンはもともと システィン残基を含まないタンパク質である。遺伝子を改変で、 N末端に 6個のヒスチ ジンをもち、 26、 75、 115番目のアミノ酸をシスティンに変異させたカルモジユリンを大 腸菌で作製した (模式図 2)。 6個のヒスチジンは発現タンパク質の精製に必要なタグ である。カルモジュリン結合ペプチド提示ファージと Sタグ提示ファージを用いて、実 施例において、評価実験を行った。 [0026] [化 4]
Figure imgf000015_0001
(模式図 3) (模式図 4)
[0027] 具体的には、精製した発現タンパク質（2mg/ml) 0.5mLと化合物 3(lmol/L)0.015mL とァセトニトリル 0.5mLを混ぜ、 4°Cで一晩おき、模式図 3に示したタンパク質を製作し た。余分な試薬はゲルろ過で除いた。精製した光反応性カルモジュリンとピオチン OS uを pH9.0の条件下で 4°Cー晚静置し、ピオチンィ匕光反応性カルモジュリンを製作した 。余分な試薬はゲルろ過で取り除いて、ピオチンィ匕光反応性カルモジュリンを得た。 ( 模式図 4)カルモジュリン 1分子にピオチンが何個ついているかは、ピオチン量を 2-hy droxyazobenzene— 4'— carboxylic acid (HABA)を使用した定量法で決定し、カノレモジ ュリン量と比較することによって測定することができる。
[0028] [光反応性核酸]
光反応性核酸リガンドは、例えば、光反応基を有する DNA、 RNA、 PNAなど少なく とも 1つの核酸のリン酸基がチォリン酸基を有する核酸に光反応基を装着したもので あることができる。
[0029] 光反応性核酸リガンドは、少なくとも 1つの核酸のリン酸基がチォリン酸基とチォリン 酸基のチオール基と反応性の基を有するフ ニルジアジリン化合物とを反応させるこ とで製作することができる。 DNAおよび RNAにおいて、チォリン酸基を有するものは 、公知であり、下記文献に記載の公知の方法により適宜合成できる。 (Zon, G.; Geise r, T.G. >j991) Phosphorothioate oligonucleotides: chemistry, purincation, analysis, s cale- up and future directions. Anticancer Drug Des. 6:539-568.および Caruthers, M.H.; Beaton, G.; Wu, J.V.; Wiesler, W. (1992) Chemical synthesis of deoxyoligon ucleotides and deoxyoligonucleotide analogs. Methods Enzymol. 211:3-20.参照、そ れらの全記載は、ここに特に開示として援用される。）
[0030] 核酸はあら力じめ公知の方法で、ピオチンタグを装着した核酸誘導体とすることが でさる。 (S. Agrawai;し. Cnnstodoulou; MJ uait (198りノ Efficient methods for attachi ng non-radioactive labels to the 5' ends of synthetic oligodeoxyribonucleotides Nuc leic Acids Res. 14: 6227 - 6245.「Nonisotopic DNA probe techniques」(ed. L.J Kric ka) Academic Press, New York 参照、その全記載は、ここに特に開示として援用さ れる。 )
[0031] 光反応基であるフエニルジアジリンィ匕合物は、例えば、以下の一般式 (C)で示され るィ匕合物であることがでさる。
[0032] [化 5]
Figure imgf000017_0001
Figure imgf000017_0002
[0033] 上記式中、 Rは、ハロゲン原子 (例えば、 Cl、 Br、 1)、またはスルホン酸エステル残
6
基である。スルホン酸エステル残基は、具体的には、メタンスルホ -ル基あるいはトル エンスルホ-ル基であることができる。 Rは、炭素数 1〜6のアルキルチオスルホ-ル
7
基または炭素数 1〜6のアルキルチオ基である。アルキルチオスルホ -ル基は、 RSO
2
—で示され、 Rは例えば、メチル、ェチル、プロピルまたはブチルであることができる。 アルキルチオ基は、 RS—で示され、 Rは例えば、メチル、ェチル、プロピルまたはブ チルであることができる。 Rは、 Hまたは炭素数 1〜6のアルキル基であることができ、
8
アルキル基は、例えば、メチル、ェチル、プロピルまたはブチルであることができる。 n は 1〜6の整数であり、好ましくは 1〜4の整数であり、より好ましくは 1である。
[0034] 上記のチオール反応性基を有するフエニルジアジリン化合物と核酸誘導体とを、例 えば、 50 : 1〜100 : 1程度のモル比で混合する。さらに、この混合物に、核酸誘導体 に対して 50〜100倍のモル比のジイソプロピルェチルァミンをカ卩え、反応はジメチルス ルォキシド中、 37°Cで行うことができる。但し、ジイソプロピルェチルァミンの代りに、 N -メチルモルホリン、トリェチルアミン等を用いることもできる。反応溶媒としては、ジメ チルスルホキシドの代りに、メタノール、ジメチルホルムアミド等を用いることもできる。 反応温度は、 37°Cを含む、例えば、 4〜70°Cの範囲とすることができる。
[0035] フエ-ルジアジリン化合物の濃度は、例えば、 0.1〜0.5mMの範囲とすることが適当 である。反応時間はフエ-ルジアジリンィ匕合物の種類による力 例えば、数 10分から 数時間程度であることができる。反応後は液体窒素中で保存し、過剰な反応を起こさ ないようにすることが好ましい。産物であるフエニルジアジリン付加核酸誘導体は、例 えば、高速液体クロマトグラフィーで精製することができる。高速液体クロマトグラフィ 一以外も、例えば、電気泳動等で精製することもできる。
[0036] [光反応性糖鎖]
光反応性糖鎖リガンドは、アルデヒド末端をもつ様々な単糖またはオリゴ糖であるこ とができる。単糖では、ビラノース環、フラノ一ス環をもつ、例えば、ダルコビラノース（ グルコース）、ダルコフラノースや、ェピマーであるガラクトース、マンノースなどが例と してあげられる。オリゴ糖では、マルトース、スクロース、ラタトースなどの二糖類から、 ルイス Xなどの多糖類が例としてあげられる。アルデヒド末端を有する糖であれば、光 反応性糖鎖リガンドを製作できるので、上記の例に限定される意味ではない。
[0037] 光反応性糖鎖リガンドは、糖鎖のアルデヒド末端に、以下の論文に示された方法で 、光反応基とピオチンを同時に装着することができる。 (Hatanaka, Y., Kempin, U., P ark, JJ. One-step synthesis of biotinyl photoprobes from unprotected carbohydrates . J. Org. Chem. 65, 5639-5643, 2000 (非特許文献 9)参照）
[0038] [タンパク質提示ファージ]
タンパク質提示ファージは、リガンドと相互作用をすると予想されるまたは期待され るタンパク質を表面に提示するファージである。タンパク質は、単独（一種類)であつ ても、多種類であってもよい。例えば、任意の提示タンパク質が cDNAライブラリーをも とに提示されたファージの集団であってもよぐこれを、「ライブラリー」と呼ぶ。
[0039] ファージの表面に任意のタンパク質やペプチドを提示できる。例えば、「タンパク質 提示ファージ」には、ファージの足に提示するタイプ (M13型）と、頭部（図 1)に提示す るタイプ (T7型）がある。本発明では 、ずれの「タンパク質提示ファージ」を用いること もできる。「タンパク質提示ファージ」を用いることで、特定の受容体タンパク質に親和 性をもつタンパク質を探し出すことができる。同様に、ペプチド提示ファージを用いる ことで、特定のリガンドに親和性をもつペプチドを探し出すことができる。
[0040] タンパク質またはペプチド提示ファージの調製方法は、常法により行うことができる 。提示したいタンパク質及びペプチドは、 cDNAを元に製作することができる。 cDNA は、臓器など力も調製した mRNAから製作することができる。特定の臓器など力 cDN Aを調製し、タンパク質またはペプチドを提示できるファージ集団（ライブラリー）は、 市販品として購入することも可能である。また、ファージに提示されるタンパク質として 抗体を挙げることができ、抗体タンパク質を提示したファージは、ファージ抗体とも呼 ばれる。ファージ抗体をスクリーニングする場合には、ファージ抗体のライブラリーを 用!/、ることができる。
[0041] 以下に本発明のフォトバニング法について説明する。
まず、本発明のフォトバニング法について図 3を参照して概略説明する。
1.フォトバニング法では光反応性リガンドを使用する (一番左のステップ)。
2.リガンドに親和性のある提示ファージを親和性によりリガンドに結合させ、その瞬間 に光照射を行うと、リガンドと提示ファージが共有結合で結ばれる (左から 2つめのステ ップ)。
3.如何なる洗浄条件でも、この非可逆的結合 (共有結合)で結ばれたファージは取り 除かれることはない。強烈な洗浄により、共有結合で捉えられていない非特異的結合 ファージ（リガンドに結合していないファージなど）は取り除かれる (左から 3つめのステ ップ)。
4.捉えられた提示ファージを大腸菌で増殖させ、最初のファージ試料とし、フォトパ- ングを繰り返すことができる。（左力 4つめのステップ)。
[0042] さらに、本発明のフォトバニング法を、図 4を参照しながら詳細に説明する。尚、本発 明のフォトバニング法には、主に、（A)光反応性カルモジュリン結合ペプチドで、カル モジュリン提示ファージを単離するフォトバニング法と (B)光反応性カルモジュリンタ ンパク質で、カルモジュリン結合ペプチドを提示したファージを単離するフォトパニン グ法があるが、図 4では、（A)の光反応性カルモジュリン結合ペプチドを用いる方法 を例に、説明する。 [0043] [混合] (図 4、模式図 5)
本発明の方法では、上記光反応性リガンドと、タンパク質提示ファージを液相中で 混合する。液相での混合は、以下のように行うことができる。即ち、リガンドと目的とす るタンパク質が、生理的に結合できるような条件を満たす溶液を使用する。そこに、光 反応性リガンドとタンパク質提示ファージを加え、攪拌させ、混合する。結合を促進さ せるために、混合後、例えば、 37°Cで 10〜60分程度静置することもできる。これにより 、選択効率の向上が可能になる。
[0044] 光反応性リガンドと、タンパク質提示ファージとを液相中で混合すると、光反応性リ ガンドとタンパク質提示ファージのタンパク質との親和性が一定以上であれば、相互 作用をして複合体を形成することができる。複合体は、タンパク質とリガンド間で生じ る、水素結合、疎水性相互作用などの弱い結合湘互作用)で成り立つている。
[0045] [活性光照射] (図 4、模式図 6)
上記混合工程で形成した複合体は、光反応性リガンドの光反応基に対する活性光 を照射することで、光反応性リガンドとタンパク質提示ファージとは、共有結合される。 これにより、弱い結合湘互作用)で成り立つていた複合体が、共有結合という強い結 合で成り立つものとなる。活性光の照射は、以下のように行うことができる。
[0046] [光の照射条件]
活性光の波長は、使用する光反応基で異なるがジアジリンの場合は、 360nmが最 大波長の光を使用する。実験では、市販の UV-Aランプを用いて活性光を照射した。 このランプは、最大波長 360nmをもつランプである。光反応基がジアジリン以外の場 合、各光反応基の種類に応じて照射する活性光の波長は適宜選択できる。
[0047] 溶液中で形成された複合体に、活性光をあて共有結合を形成する。 360nmの光は 溶液には、ほとんど吸収されず、光をさえぎることなく各成分へ照射が行き届くと考え られる。光照射は溶液の上部と下部の両方から、それぞれ例えば、 30W/m2の強度で 照射し光反応を促進することができる。光の強度は、溶液の組成等を考慮して適宜 決定できる。
[0048] ジアジリンの光化学的性質により、比較的短い照射時間で共有結合を形成できる。
照射時間は、評価実験（1)実験 1の図 6で検討した結果から、 1分で充分であるが、よ り共有結合形成を完全なものにするために例えば、 2分間とすることが適当である。伹 し、 2分間に限定される意図ではない。この条件で、活性光を 10分間、ファージに照 射しても、その後のファージの生存率には変化がなかった。したがって、照射時間は 、例えば、 10分間以下の範囲で適宜決定することができる。
[0049] 次いで、共有結合した複合体が有する光反応性リガンドを固相に固定化する。固 定化は、例えば、ピオチン アビジン系、 Hisタグ一ニッケルキレート系、ホウ素ーヒド ロキサム酸キレート系、抗原 抗体反応系などを用いて行うことができる。
[0050] あら力じめ光反応性リガンドを固定ィ匕しておいたものでは、結合する提示ファージと の自由な接触が阻害され、バニング効率が減少すると考えられる。そこで、本発明で は、例えば、光反応性リガンドを例えば、ピオチンィ匕し、このタグを用いてアビジンで 固定ィ匕する方法を用いることができる。これにより、光反応性リガンドと提示ファージ が溶液中で自由に接触できるようになり、特異的な提示ファージとの親和性による結 合を促進できると考えられる。
[0051] 固相は、例えば、磁気ビーズ、基板等であることができる。さらに固相は、上記固定 化に利用できるいずれかの機能を有するものである。例えば、光反応性リガンドがビ ォチンを有する場合、固相はアビジンまたはストレプトアビジンを被覆したものである ことができる。それ以外の固相としては、光反応性リガンドが Hisタグを有する場合、固 相はニッケルを被覆したものであり、光反応性リガンドがヒドロキサム酸キレートを有す る場合、固相はホウ素を被覆したものであり、光反応性リガンドが抗原を有する場合、 固相は抗体を被覆したものであることができる。
[0052] [固定ィ匕アビジンの性状] (図 4、模式図 7)
複合体は、例えば、光反応性リガンドに導入されているピオチンをタグとして、固定 化アビジンで回収できる。固定化アビジンには様々な種類があるが、例えば、ポリス チレンプレートに固定ィ匕されているアビジン、及び磁気ビーズに固定ィ匕されているァ ビジンを用いることができる。ピオチン一アビジン系以外の系による固定ィ匕でも同様 である。
[0053] 〔プレート固定化アビジン〕
プレート固定ィ匕アビジンはプレート上で洗浄するため、バックグランドは非常に少な ぐ安定した回収効率を示す。磁気ビーズと比較しても 1/10倍程度のバックグランド が得られる。（結果は評価実験 (5)表 3を参照）
[0054] 但し、固定ィ匕できるリガンド量に限りがあり、ライブラリーのスクリーニングには向かな いことがある。プレート固定化アビジンは市販されているアビジン固定化プレートは 96 ゥエルなどの形態をとつており、プレート上に固定ィ匕されているアビジン量は、少なく（ 60 pmol/well)、そのため、固定ィ匕できる光反応性リガンド量も少なくなつてしまう傾向 がある。回収するピオチン量に比べて、数倍は多いアビジン量を使用することが一般 的であるので、せいぜい 30 pmolのリガンドしか使用できない。溶液量を 200 Lで行う とき、リガンドの濃度は 0.15 mol/Lとなる。カルモジュリンとカルモジュリン結合タンパ ク質の Kdは 10— 7〜10— 8であるので、この濃度で分離が可能である。結合タンパク質の Kdが、 10— 7よりも小さなリガンドとの組み合わせには、アビジン磁気ビーズを使用する ことが好ましい。
[0055] プレート固定ィ匕アビジンでは、光反応性リガンドを十分量使用できな 、ため、提示 ファージのライブラリーなど、大量のファージからスクリーニングするとき、または、親 和性が低いリガンドを使用するときには、アビジン磁気ビーズの使用が好ましい。
[0056] 〔アビジン磁気ビーズ〕
アビジン磁気ビーズは、低 、バックグランドと大量のアビジン固定ィ匕量を併せ持つ 磁気ビーズが本発明のフォトバニング法には最適である。例えば、 NEB社の Streptavi din Magnetic Beads (ストレプトアビジン磁気ビーズ)メーカコード #S1420Sを使用する ことができる。アビジン磁気ビーズでは、提示ファージ溶液を完全に取り除くことが可 能で、非特異的結合の提示ファージ (バックグランド）が低い。おおよそ 1000〜10000 個までバックグランドを減らせる。
[0057] 徹底的な洗浄ができない従来のバニング法では、同じ磁気ビーズを使用しても 100 0倍程度多 、ファージ数カバックグランドになる (結果は評価実験（7)表 5を参照)。ァ ビジンの固定ィ匕量を 1000 pmol/mgとし、磁気ビーズを lmg程度使用することにすると 、アビジンは 1000 pmolであり、ピオチンは 500 pmol程度回収ができる。溶液量を 200 Lで行うとき、リガンドの濃度は 2.5 mol/Lとなる。これにより、結合タンパク質の Kd 1S 10— 6程度のリガンドでも使用できる。この濃度を実現したことにより、かなり多くのリ ガンド—受容体タンパク質のスクリーニングに利用できる。
[0058] アビジン磁気ビーズは、操作が容易なため、操作時間が短縮および再現性が向上 され、機械化が可能となる。さらに 10%BSAを加えて磁気ビーズとの非特異的吸着を 軽減することが好ましい。
[0059] (図 4、模式図 7)固定ィ匕アビジンに磁気ビーズを使用することで、低いバックグラン ドと安定した回収を実現した。固定ィ匕量が多いことで、低い親和性 (Kd=10— 6)の提示 ファージでも回収できる。
[0060] 次 、で、光反応性リガンドを固定ィ匕した固相を洗浄する。この洗浄は、光反応性リ ガンドと共有結合して!/ヽな ヽタンパク質提示ファージを共有結合した複合体から分離 するためのものである。洗浄には、界面活性剤を用いることが好ましい。洗浄の方法 および条件は、固相に、大量の洗浄溶液を加えて、数分間、攪拌させた後に溶液を 捨てる。この操作を通常、 5回程度、繰り返すことができる。
[0061] [提示ファージの洗浄条件と回収] (図 4、模式図 8〜10)
[洗浄条件の決定] (図 4、模式図 8)
光反応性リガンドと共有結合した提示ファージを単離するための洗浄条件は、提示 ファージの性状及び洗浄に使用する界面活性剤の洗浄効率等を考慮して適宜決定 できる。
[0062] 提示ファージの中には、アルカリや酸に対して弱 ヽものがあるので、緩衝液を使用 し、 pHは例えば、 8.8とすることが適当である。この pHはトリス緩衝液力もっとも緩衝能 力が発揮できる pHである。但し、他の緩衝液も使用することはできる。
[0063] さらに、塩濃度を高めにして、イオン的な結合を排除することが好ましい。そのため 、例えば、 0.2〜lmol/L程度の塩ィ匕ナトリウムを用いることができる。後述するが、高濃 度の塩ィ匕ナトリウムと界面活性剤 SDSと共存させると沈殿を生じる場合があるので、 0. 25mol/L程度の塩ィ匕ナトリウム濃度を用いることが好ま 、場合がある。
[0064] また、カルモジュリンとその結合ペプチドとの結合には、カルシウムイオンが必須で あるので、これを排除するために、そのキレート剤、例えば、 EDTAを併用することが 適当である。
[0065] 界面活性剤としては、例えば、 SDS、 Triton-X100、 Tween20等を用いることができ、 界面活性剤による洗浄効率を考慮して、適宜決定できる。尚、本発明者らの実験に よれば、非特異的なファージの除去には SDSが一番適しているとの結果が得られた。 SDSの濃度は、 0.1〜1%の範囲とすることができ、以後のステップへの持込みによる 回収と増幅への影響を考慮すると、 0.5%であることが好ま 、。
[0066] SDSの使用により、アビジンを固定ィ匕している磁気ビーズ力 容器に吸着することが なくなり、より簡単に洗浄溶液を除去できるという利点がある。界面活性剤を使用しな い場合、この容器への吸着により洗浄溶液をとる際に、少量の磁気ビーズを吸い上 げてしまうことが常である。
[0067] 最終的に洗浄溶液として、例えば、 50 mM Tris-HCl (pH8.8), 0.25 M NaCl, 50 mM
EDTA, 0.5 % SDSを用いることが好ましい。但し、この洗浄溶液に限定する意図では ない。
[0068] 共有結合して ヽな 、提示ファージは、この溶液を用いて 3回洗浄すれば数千個程 度にすることができる。より確実に洗浄するために、実験では SDS溶液を含む洗浄液 で 4〜7、好ましくは 5〜6回洗浄する。また、次のステップへの SDSの影響を抑えるた めに、最後に SDSを含まない洗浄液で 1回洗浄することが好ましい。但し、洗浄の回 数は、スクリーニングの系に応じて適宜決定することができる。
[0069] 洗浄後、固相に固定化された光反応性リガンドと結合したタンパク質提示ファージ を回収する。これにより、光反応性リガンドに対して相互作用するタンパク質、特に、 特異的な相互作用を有するタンパク質をスクリーニングすることができる。回収したタ ンパク質提示ファージの DNAを同定することで、タンパク質を同定することができる。
[0070] ただし、本発明では、上記回収したタンパク質提示ファージを増殖させ、増殖させ たタンパク質提示ファージを用いて、再度図 3で示した工程を少なくとも 1回繰り返す ことが好ましい。より好ましくは上記図 3で示した工程を 2〜10回の範囲で繰り返す。
[0071] 回収したタンパク質提示ファージを増殖させ、再度、光反応性リガンドとの液相中で の混合、活性光の照射、固相への光反応性リガンドの固定化、固相の洗浄、および 固相に固定化された光反応性リガンドと結合したタンパク質提示ファージの回収を行 うことで、特異的な相互作用を有するタンパク質をより高い選択性で回収することがで きる。 [0072] 回収したタンパク質提示ファージを増殖は、例えば、以下のように行うことができる。 回収したファージ溶液を、適切な宿主となる大腸菌株に感染させる。これを、 LB培地 などの溶液中で増殖させ、宿主を溶菌させることにより、ファージを増殖する。
[0073] [ファージの回収と増幅] (図 4、模式図 9)
T7ファージを提示ファージとした場合は、提示するタンパク質やペプチドは頭部に 発現されるため、リガンドと共有結合が生じた場合にも、感染に必要な足部はインタク トな状態である。
[0074] そこで、共有結合で捉えた提示ファージの回収と増幅は、磁気ビーズに固定化され た状態で行うことが適当である。徹底的な洗浄後、磁気ビーズに捕らえられた提示フ ァージ (模式図 8)を、 10倍ごとに希釈し、 0.5〜lmLの大腸菌溶液に入れ、 5〜10分間 混合しながら感染させ、トップァガーと混合し、プレートにまく。感染時間は 15分間を 超えないようにすることが、正確なファージ数を測定するという観点力も適当である。
[0075] 足部にタンパク質やペプチドを発現する T13ファージを使用する場合には、模式図 8の状態で、トリプシンなどのプロテアーゼで処理し、ファージとリガンドを切り離す必 要があるが、この方法は一般的な方法であり実施可能である。
[0076] 最終的に回収したタンパク質提示ファージの DNAを同定することで、タンパク質を 同定することができる。
[0077] [ファージ溶液の調製] (図 4、模式図 10)
磁気ビーズに捉えられた提示ファージの残りをすベて大腸菌溶液に入れ、感染 '増 幅を、常法に従い行う。増幅したファージ溶液を使用し、再度、模式図 5からフォトパ ニングを繰り返す。本発明の方法は、 1日に例えば、 2回のフォトバニングが可能であ る。
[0078] [キット]
本発明は、以下の 3つのキットを包含する。
(a)光反応基を有する光反応性リガンド作製用キット
(b)パニング用キット
(c)バリデーシヨン用キット
[0079] (a)光反応基を有する光反応性リガンド作製用キット 本発明の光反応基を有する光反応性リガンドを作製するためのキットは、光反応基 を有する化合物、リガンド標識物質および光反応装着溶液を含む。
[0080] 光反応基を有する化合物は、例えば、一般式 (C)で示されるフ ニルジアジリンィ匕 合物であることができ、一般式 (C)で示されるフエニルジアジリン化合物は、上記本 発明のスクリーニング方法で示した化合物である。また、リガンド標識物質は、例えば
、ピオチン、ヒスチジンタグ (Hisタグ）、ヒドロキサム酸キレートまたは抗原であることも できる。光反応装着溶液は、光反応基を有する化合物とリガンドとなる物質によって 適宜選択される。
[0081] 光反応基を有する光反応性リガンド作製用キットにより光反応性ペプチドとタンパク 質の作製する手順を例示する。
(1)システィン残基を含むピオチンィ匕ペプチドまたは、 SS結合して 、な 、フリーなシス ティン残基を含むタンパク質を用意する。
(2)キットのジアジリンチォスルフォネートを、キット付属の光反応装着溶液に溶かし、 ペプチドまたはタンパク質と混合する。
(3)ペプチドの場合は数時間、タンパク質の場合は 10時間程度室温もしくは 37°Cで静 置する。
(4)ペプチドの場合は高速液体クロマトグラフ一 (HPLC)により、タンパク質の場合はゲ ルろ過により光反応性リガンドを精製する。ペプチドリガンドの場合は、 HPLC装置の 使用が適している力 モノメリックピオチンにより、光反応性リガンドを精製することもで きる。
(5)光反応性タンパク質を、キットのタンパク質ピオチンィ匕試薬でピオチンを装着する
(6)光反応性ピオチンィ匕タンパク質は、ゲルろ過により精製する。なお、ゲルろ過によ る精製が適しているが、モノメリックピオチンにより精製することもできる。
[0082] (b)バニング用キット
本発明のバニング用キットは、光反応性リガンドに対して相互作用するタンパク質ま たはペプチドをスクリーニングするために用いるキットである。このキットは、光反応基 を有する光反応性リガンドと前記光反応性リガンドを固定ィヒする固相を含む。 [0083] 本発明のキットに含まれる光反応性リガンドは、本発明のスクリーニング方法におい て説明した光反応性リガンドと同一である。光反応性リガンドは、例えば、光反応性 ペプチド、光反応性タンパク質、光反応性核酸または光反応性糖鎖であることができ る。また、光反応性リガンドが有する光反応基は、例えば、ジアジリン基であることが できる。
[0084] 光反応性リガンドを固定ィ匕する固相についても、本発明のスクリーニング方法にお いて説明した光反応性リガンドを固定ィ匕する固相と同一である。そのような固相は、 例えば、磁気ビーズ、または基板であることができる。さらに、光反応性リガンドを固 定化する固相は、例えば、ピオチン アビジン若しくはストレプトアビジン系、 Hisタグ —ニッケル系、ホウ素ーヒドロキサム酸キレート系、または抗原 抗体系を用いて光 反応性リガンドを固定ィ匕するものであることができる。
[0085] 光反応性リガンドおよび固相の組み合わせは、より具体的には、（1)光反応性リガ ンドがピオチンを有し、固相はアビジンまたはストレプトアビジンを被覆したものであり 、（2)光反応性リガンドが Hisタグを有し、固相はニッケルを被覆したものであり、 (3) 光反応性リガンドがヒドロキサム酸キレートを有し、固相はホウ素を被覆したものであり 、及び (4)光反応性リガンドが抗原を有し、固相は抗体を被覆したものであるのいず れかであることができる。
[0086] 本発明のキットは、光反応性リガンドを固定ィ匕した固相を洗浄するための洗浄剤を さらに含むことができる。洗浄剤は、例えば、界面活性剤を含む水溶液であることが でき、界面活性剤の例は、本発明のスクリーニング方法において説明した物であるこ とができる。上記洗浄剤は、キレート剤、例えば、 EDTAをさらに含むものであることも できる。
[0087] 本発明のバニング用キットは、前記本発明のスクリーニング方法に使用することがで きるものである。
[0088] 上記バニング用キットは、より具体的には、
(bl)固相
(b2)血清含有アルブミン水溶液
(b3)洗浄溶液 (b4)ファージ回収溶液
を含むことができる。
[0089] 固相は、前記の通り、アジビン、ストレプトアビジン、ニッケル、ホウ素または抗体が 被覆されたものであり、固相の担体は、磁気ビーズまたは基板であることができる。好 ましい固相は、ストレプトアビジンで被覆された磁気ビーズである。ファージ回収溶液 としては、緩衝液を適宜使用できる。
[0090] 本発明のバニング用キットを使用し、タンパク質提示ファージを用いてフォトパニン グを行う手順を例示する。
ここで使用されるファージは、例えば、 T7ファージであり、 T7ファージライブラリーお よび感染用大腸菌は、別途準備する。
(1)光反応性ピオチン化リガンドと T7ファージライブラリーが相互作用する条件を満た す溶液中で混合、静置する。
(2)紫外線ランプ (強度 30W/m2)を用い、活性光を 1〜10分照射する。
(3)キットの 10%血清含有アルブミン水溶液を最終濃度 1%になるように加え、キットの ストレプトアビジン磁気ビーズを使用したリガンド量の 2倍以上のモル比のストレプトァ ビジンをもつ量を混合する。
(4)室温で 10〜30分、振とうする。
(5)キットの洗浄溶液 lmL程度を加え、 5分間振とうする。
(6)磁気ビーズを、磁気スタンドで回収する。
(7)回収した磁気ビーズに、洗浄溶液 lmL程度を加え 5分間振とう後、磁気スタンドで 回収する。
(8)上記の操作を 4〜6回繰り返す。
(9)回収した磁気ビーズに、キットのファージ回収溶液 lmL程度を加え 5分間振とう後、 磁気スタンドで回収する。
(10)回収した適当量の磁気ビーズを感染用大腸菌と混合し、感染用大腸菌が溶菌す るまで 3〜5時間、 37°Cで振とうする。
(11)増幅した適当量のファージ溶液と光反応性ピオチン化リガンドとを混合し、本操 作 (手順 2番目から)を 2〜5回、繰り返す。 [0091] (c)バリデーシヨン用キット
本発明のバリデーシヨン用キットは、タンパク質提示ファージ希釈溶液および光反応 性リガンド溶液を含む。タンパク質提示ファージ希釈溶液は、例えば、タンパク質力 例えば、カルモジュリンの場合、野生ファージ 10万個中に 1つのカルモジュリン提示 ファージを含む割合で混合した溶液であることができる。そして、光反応性リガンド溶 液は、例えば、光反応性ピオチンィ匕カルモジュリン結合ペプチド溶液であることがで きる。本発明のバリデーシヨン用キットを用いてのバリデーシヨンの手順は、上記した バニングの手順に従い、ライブラリーファージの代わりにカルモジュリン提示 T7ファー ジ希釈溶液を使用し、光反応性ピオチン化リガンドとして光反応性ピオチン化カルモ ジュリン結合ペプチド溶液を用いて行なう。
実施例
[0092] 以下本発明を実施例によりさらに詳細に説明する。
例 1
光反応性ペプチドリガンドの作製
カルモジュリンタンパク質を認識し特異的に結合することが確かめられている、前記 配列 1のカルモジュリン結合ペプチドをもとに 2種類の光反応性ペプチドリガンドを製 作した。
[0093] 〔光反応性アミノ酸を使用した製作法 (配列 2)〕
配列 1 (LKWKKLLKLLKKLLKLG) (配列番号 1)の N末端から 3つ目のトリプトファン を、 tmd(Phe)で置き換えたペプチドを合成した。合成はペプチド合成機を用いた Fmo c—固相合成法で行った。その後、合成したペプチドが固相にある状態で、 N末端の ァミノ基にピオチンサクシイミドを反応させることにで、ピオチンィ匕ペプチドを合成した 。固相から合成ペプチドを強酸で解離し、 HPLCで目的のピオチンィ匕光反応性ぺプ チドを精製した。また、本合成に必要な Fmoc— tmd(Phe)は、以下のように合成した。
[0094] Hatanaka, Y., Kempin, U., Park, JJ. One-step synthesis of biotinyl photoprobes fr om unprotected carbohydrates. J. Org. Chem. 65, 5639—5643, 2000 (非特許文献 9) に記載の方法により、 4- [3- (Trifluoromethyl)- 3H- diazirin- 3- yl]benzaldehyde(12)を 合成した。 その後、以下に示す方法 L- 4 - [3- (Trifluoromethyl)- 3H- diazirin- 3- yl]phe nylalani ne(15)を合成した。
さらに、アミノ基を Fmoc化することで、 Fmoc— tmd(Phe)を合成した。
[0095] [化 6]
Figure imgf000030_0001
[0096] 4- [3- (Trifluoromethyl)- 3H- diazirin- 3- yl]benzyl alcohol (13)
化合物 (12) (3.3 g, 15.4 mmol)を EtOH 7 mLに溶かし 0°Cで撹拌しながら NaBH (0.
4
626 g, 16.5 mmol)を EtOH 7 mL中に懸濁したものをカ卩えた。加え終わったのち室温 に戻し 4時間撹拌した。これに氷上で 1M HC1をゆっくり加えて過剰の試薬を分解した 後、 Etherで抽出し、 Ether層を硫酸マグネシウムで乾燥させた。濾過で乾燥剤を除い た後に溶媒を減圧溜去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（Hexane:Ether = 1:1)により精製して、淡黄色の油状物質（13)を得た。
[0097] 収量 3.21g (96%)
1H-NMR (CDC1 )
3
σ： 7.39 (d, 2H, J = 8.5 Hz), 7.19 (d, 2H, J = 8.5 Hz), 4.71 (s, 2H), 1.87(bs, 1H) [0098] 3— [4— (Bromomethyl)phenyl]— 3— (trifluoromethyl)— 3H—diazirine (14)
化合物 (13) (344.0 mg, 1.59 mmol)を CH CI 2 mLに溶力し、 CBr (658.2 mg, 1.985
2 2 4
mmol)をカ卩えた。 0°Cに冷やし Ph P (474 mg, 1.807 mmol)をゆっくりと加えた。室温ま
3
で戻し 1時間撹拌した後で、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（Hexane)で精製して 、無色の油状物質 (14)を得た。
[0099] 収量 401.8mg (90%)
JH-NMR (CDC1 )
3
σ： 7.42 (d, 2H, J = 8.5 Hz), 7.17 (d, 2H, J = 8.5 Hz), 4.46 (s, 2H).
[0100] L— 4し [3— (Trifluoromethyl)— 3H— diazirin— 3— yl]phenylalanine (15) tert-Butylglycinate benzophenone imine (1.136 g, 3.839 mmol)と、不斉触媒の 0(9)
[9]
— Allyト N— 9— anthracenylmethylcinchonidium bromide (0.2127 g， 0.351 mmol, 0.1 eq )を CH CI 9 mUこ溶力した。化合物 (14) (1.419 g， 5.085 mmol, 1.5 eq.)を加えァルゴ
2 2
ンガス雰囲気下、室温で撹拌した。反応混合液を- 78°Cに冷却しながら 2-tert-Butyli mino— 2— diethylamino—丄, 3— dimethylperhirdo— 1,«3,2— mazaphosphorine (1.41 g, 5.139 mmol, Aldrich)を数秒間で滴下し、 - 78°Cで 7時間反応させた。室温に戻し減圧蒸留 した後、残查を Etherで希釈し蒸留水で 2回、飽和食塩水で 1回洗った。油層を硫酸 マグネシウムで乾燥した。濾過で乾燥剤を除いた後に溶媒を減圧溜去し、シリカゲル カラムクロマトグラフィー (HeXane:EtOAc = 7:1)で精製し、黄色の油状物質を得た。
[0101] 収量 1.89g (95%)
JH-NMR (CDC1 )
3
σ： 7.57 (d, 2H, J = 6.9 Hz ), 7.39-7.27 (m, 6H), 7.06 (q, 4H, J = 8.4 Hz )
6.59 (d, 2H, J = 6.9 Hz), 4.09 (q, 1H, J = 8.6, 4.6 Hz), 3.26-3.11 (m, 2H)
1.44 (s, 9H).
[0102] 得られた黄色の油状物質（75 mg, 0.152 mmol)を 0°Cで TFA lmLに溶力し、室温で 2時間撹拌した。 (TLC, Hexane:AcOEt = 7:1)で反応終了を確認後、 TFAを減圧溜去 し、残渣を CH C1で希釈し水で 3回抽出した。水層を凍結乾燥して白色の固体（15)
2 2
を得た。
[0103] 収量（TFA塩として） 53.4 mg (91%)
1H-NMR (CD OD)
3
σ： 7.46 (d, 2H, J = 7.9 Hz ), 7.27 (d, 2H, J = 7.9 Hz), 3.84 (dd, 1H, J = 8.2, 4.5 H z), 3.38 (m,lH), 3.10 (d, 1H, J = 4.5, 8.2 Hz).
光学純度（e.e.)
[0104] その後、 L- 4し [3- (Trifluoromethyl)- 3H- diazirin- 3- yl]phenylalanine(15)を Fmoc体に 誘導した。そして、 HPLCによりその光学純度を確認した。適量を MeOHに溶力した後 、キラルカラム (Sumichiral OA- 3300 2.5 μ m 4.6 mm X 25 cm)を用いて 0.01 M Amm onium Acetate/MeOH、流速 1 mL/minで溶出させ、 360 nmのジアジリン由来の UV吸 収により検出した。 e.e. = 98%
[a] +22.4° (c = 0.52, EtOH)
D
[0105] 〔ジアジリンチォフォスフェートを利用した製作法 (配列 4)〕
配列 1 (LKWKKLLKLLKKLLKLG) (配列番号 1)の N末端から 3つ目のトリプトファン を、システィンに置き換えたペプチドを合成した (配列 3)。合成はペプチド合成機を 用いた Fmoc—固相合成法で行った。その後、合成したペプチドが固相にある状態で 、 N末端のァミノ基にピオチンサクシイミドを反応させることにで、ピオチン化ペプチド を合成した。固相から合成ペプチドを強酸で解離し、 HPLCで目的のピオチン化ぺプ チドを精製した。化合物 3に示されるジアジリンと、精製したペプチドを 30%ァセトニト リルを含む溶液中で混合し、ペプチド内のシスティン残基と化合物 3をチオール結合 させた。 HPLCで目的のピオチンィ匕光反応性ペプチドを精製した (配列 4)。本合成に 必要な化合物 3は、 M. Kaneda, Y. Sadakane, Y. Hatanaka, (2003) A Novel Approac h for Affinity-Based Screening of Target Specific Ligands: Application of Photoreacti ve D—Glyceraldehyde— 3— phosphate Dehydrogenase. Bioconjugate Chem. 14, 849—85 2. (非特許文献 7)に記載の方法で行った。具体的には、上記の化合物 14の合成法 に示してある。
[0106] 例 2
ピオチンィ匕光反応性カルモジユリンの作製
遺伝子改変によりシスティン残基を 1つ加えたカルモジュリンタンパク質を製作した 。具体的には、ヒト脳 cDNAライブラリーから、 PCR法により、 CaM2プライマー（5'- CT TAGGAGAATGCCTAACAGATG-3) (配列番号 2)と CaM3プライマー（5'- CTGCAG GTCTTC ATTTTGC AGTC-3 ' ) (配列番号 3)とで、カルモジュリンタンパク質の一部 遺伝子を増幅し、この断片を新たにプライマーとして、 CaMlプライマー（5'-GGATC CCCATGGCTGATCAGCTGACCGAAG-3') (配列番号 4)とで、カルモジュリン遺伝 子を増幅した。このメガプライマー法により、カルモジュリンタンパク質の 115番目のリ ジンをシスティンに改変したカルモジュリンを製作する遺伝子を得た。本増幅断片を 、 pQE32ベクター（キアゲン社）に挿入し、大腸菌に形質転換した。この遺伝子が入つ た大腸菌を単離し、 LB培地で大量に培養した。その後、大腸菌を破砕し、 HISタグ精 製カラムで、カルモジュリンタンパク質を精製した。 26番、 75番のアミノ酸を Cys残基に 替えたカルモジュリンも、同様の方法で製作した。
[0107] 精製した発現タンパク質（2mg/ml) 0.5mLと化合物 3(lmol/L)0.015mLとァセトニトリ ル 0.5mLを混ぜ、 4°Cで一晩おき、模式図 3に示したタンパク質を製作した。本方法で 必要となる化合物 3は、上記の〔ジアジリンチォフォスフェートを利用した製作法 (配列
4)〕に記載した方法で合成した。
[0108] 余分な試薬はゲルろ過で除いた。精製した光反応性カルモジュリンとピオチン OSu を PH9.0の条件下で 4°Cー晚静置し、ピオチンィ匕光反応性カルモジュリンを製作した
。余分な試薬はゲルろ過で取り除いて、ピオチンィ匕光反応性カルモジュリンを得た。 ( 模式図 4)
[0109] ピオチンィ匕光反応性カルモジュリンであることかは以下の方法により特定した。
電気泳動により精製したサンプルを分離し、メンブレンに転写した後、アビジン一 H
RP試薬を用いたウェスタンブロット法により確認した。
[0110] 例 3
[製作した光反応性リガンドを評価する実験]
[評価実験 (1) ]
評価実験 1として、光反応性カルモジュリン結合ペプチド (配列 2)力 カルモジユリ ンタンパク質を認識し、光照射により共有結合で結ばれた複合体を形成する能力が あるか、検討した。
[Oil 1] 光反応性カルモジュリン結合ペプチド (配列 2)とカルモジュリンを 1： 1の比率で混 ぜ、カルシウム存在下 37°Cで 10分間静置した。その後、 30W/m2の強度の紫外線 (ピ ーク波長 360nm)を 1分間照射し、光反応を誘導した。その試料を、 HPLCで解析した のが図 5である。上段は紫外線照射した試料で、下段は紫外線照射しなカゝつた試料 である。図 5中の矢印で示されたピークは質量分析の結果から、インタタト (intact)Ca M：もともとのカルモジュリンタンパク質、架橋 (crosslinked)CaM：カルモジュリンと光反 応性カルモジュリン結合ペプチドとの複合体、 DA-CBP:光反応性カルモジュリン結 合ペプチドである。 MALDI-TOF MASSでの 2410の質量増加はちょうど、カルモジュ リン結合ペプチドのそれと一致する。 [0112] HPLCの分析条件では、親和性のみで結合した複合体は解離してしまうことが、「図 5光照射なし」の結果力もわかる。また、「図 5光照射 60秒」の結果から、カルモジユリ ンタンパク質とその結合ペプチドが共有結合で複合体を形成していることがわかる。 紫外線の様々な照射時間での「図 5光照射 60秒」中の複合体のピークを定量し、複 合体形成の効率を測定した結果を図 6で示す。 1分間の紫外線照射で最大の効率が 得られることが明らかになった。最初のカルモジュリンタンパク質量の 3%程度が複合 体を形成した。
[0113] 評価実験 1と同様にカルモジュリンタンパク質とその結合タンパク質の複合体を製 作し、 SDS-PAGEで解析した結果を図 7に示す。図 7上段の電気泳動では、紫外線 の照射時間を変え、試料を調製した結果を示す。図 7右に簡単に方法が記した。還 元剤存在下高熱処理を行って!/ヽるので、共有結合で結ばれた複合体以外は解離し てしまう。また、光反応性カルモジュリンペプチドに装着されたピオチンをアビジン化 HRP酵素で検出したため、分子量の小さな結合ペプチド、およびピオチンを持たない カルモジュリン単独では検出できな 、。カルモジュリンタンパク質の複合体形成には 、カルシウムが必要であることがわ力つており、 EGTA存在下では、複合体を検出でき なかった。図 7下段の電気泳動では、カルモジュリンアンタゴニストによる阻害実験を 行った結果を示す。 lOO ^ mol/L TFPで複合体形成は阻害される。この阻害の濃度 依存性は、カルモジュリン機能阻害のそれと良く一致している。
[0114] 〔まとめ〕
評価実験（1)より、製作した光反応性カルモジュリン結合ペプチドは、カルモジユリ ンを特異的に認識し、共有結合で結ばれた複合体を形成することが明らかとなった。
[0115] [評価実験 (2) ]
評価実験 2として、光反応性カルモジュリンタンパク質 (模式図 3)が、カルモジュリン 結合ペプチドを認識し、光照射により共有結合で結ばれた複合体を形成する能力が あるか、検討した。
[0116] 光反応性カルモジュリンタンパク質 (模式図 3)とピオチンィ匕カルモジュリン結合ぺプ チドを 1 : 1の比率で混ぜ、 37°Cで 10分間静置した。その後、 30W/m2の強度の紫外線 (ピーク波長 360應)を 1分間照射し、光反応を誘導した。その試料を SDS-PAGEで解 祈したのが図 8である。紫外線の有無、カルシウムの有無を図 8の下に示している。高 熱処理を行っているので、共有結合で結ばれた複合体以外は解離してしまう。また、 カルモジュリンペプチドに装着されたピオチンをアビジン化 HRP酵素で検出したため 、分子量の小さな結合ペプチド自身は検出できない。 CBB染色によりすベての条件 でも、ほぼ同じ量のカルモジュリンがあることがわかる力 化学発光で検出されている のは、紫外線とカルシウムがともにある条件のときだけである。
[0117] 〔まとめ〕
評価実験（2)より、光反応性カルモジュリンタンパク質 (模式図 3)は、カルモジュリン 結合ペプチドを認識し、複合体を形成する能力があることが明らかになった。
[0118] 例 4
[フォトバニング法の標準的方法]
光反応性カルモジュリン結合ペプチドを使用して構築したフォトバニング法の手順 を以下に示す。
(1)提示ファージ溶液 (108〜109個)、 50mM Tris/HCl (pH7.4), ImM CaClで構成さ
2 れる溶液 200 μ Lを調製する。
(2)光反応性カルモジュリン結合ペプチド (具体的には配列 2、または配列 4)を最終 濃度 10 Μになるようにカ卩え、良く混ぜる。
(3) 37°Cで 10分間静置する。（提示ファージとリガンドペプチドとの親和性による結 合を促進するため）
(4)ポリスチレン製の底が平らな 96穴プレートに移しかえる。このとき、 1穴あたり 100 μ Lを越えな!/ヽように分注する。
(5) 30W/m2の強度の UV-Aランプを上下に配置した照射装置で、 2分間光を照射す る。
(6) 96穴プレートからマイクロチューブへ溶液を移しかえる。
(7) 10%ゥシ血清アルブミン (BSA)を 200 Lカ卩え、 1分間振とうする。（磁気ビーズと の非特異的吸着を軽減するため）
(8)アビジン固定ィ匕磁気ビーズ (NEB社)を 100〜250 しカ卩え、 2分間振とうする。（こ の量の磁気ビーズで、約 250〜1000 pmolのピオチンを吸着することが可能である。 ) (9) 15000rpm (約 20000g)で 5秒間遠心し、専用のマグネティックスタンド（NEB社）に 立て、上清を静かに取り除く。
(10)洗浄溶液（50mM Tris/HCl (pH8.8)、 0.25M NaCl、 50mM EDTA、 0.5% SDS)を lmL加え、 5分間激しぐ振とうする。
(11) 15000rpm (約 20000g)で 5秒間遠心し、専用のマグネティックスタンド（NEB社）に 立て、上清を静かに取り除く。
(12X10)、（11)の操作を合計 5回繰り返す。
(13) 50mM Tris/HCl (pH8.8)、 0.25M NaCl, 50mM EDTAを含む溶液 lmLを加え、 5分間激しぐ振とうする。
(14) 15000rpm (約 20000g)で 5秒間遠心し、専用のマグネティックスタンド（NEB社）に 立て、上清を静かに取り除く。
(15) 200〜500 Lの SMバッファー（0.1M NaCl, 8mM MgCl , 50mM Tris/HCl (pH7.
2
5), 0.01%ゼラチン)で磁気ビーズ (沈殿)を懸濁する。
(16) 10倍希釈系列希釈の懸濁液を調製し、その 50 Lをとり 500 Lの大腸菌溶液（ 株名： BLT5403, OD600 = 1程度の増殖）と混ぜ、 5分間静置する。
(17) 50°Cに保温しておいた 3mLのトツプアガー（LB培地（トリプトン 10g、イーストエタ ストラクト 5g、 NaCl 5gを 1Lの水で溶解したもの）に 0.7%ァガーを含むもの）と混ぜ、 L Bプレート（LB培地に 1.5%ァガーを入れて、プレート内で固めておいたもの）にまく。
(18) 37°Cで 2時間程度静置し、プラーク数を測定する。
(19X15)の残りの懸濁液を、 10mLの大腸菌溶液と混ぜ、 37°Cで振とうしながら 3時間 程度培養する。液が透けてきたら、大腸菌を遠心で取り除き、上清を回収する。
このファージ溶液を用いて、（1)からの操作を繰り返す。
[フォトバニング法の評価実験]
評価実験 (3) [光反応性ペプチドリガンドの種類とバニング効率]
配列 2と配列 4の光反応性カルモジュリン結合ペプチドを用いてフォトバニングを行 ヽ 、カルモジュリン提示ファージの選別効率を比較した。 （表 1)カルモジュリン提示ファ ージ（108個）および Sタグ提示コントロールファージ（108個）を上記のフォトバニング標 準的方法に従い、 100 pmolの光反応性リガンドを使用して選別した。磁気ビーズに捕 らえられたファージの数を測定した。カルモジュリン提示ファージ数力 コントロール のファージ数に対して何倍捕らえられるかで、実験結果を評価する。
[0120] [表 1]
Figure imgf000037_0001
(光なし） は、 UV— A照射のみをおこなわず、 同様の実験をしたもの。
[0121] 〔まとめ〕
磁気ビーズに捉えられたカルモジュリン提示ファージとコントロールファージの数を 比較すると、配列 2を使用したフォトバニングで 1000倍、配列 4を使用した場合は 2000 倍の選択効率があることがわかる。両者ともに十分な選択効率を持つ。
[0122] 評価実験 (4) [光反応性ペプチドリガンド量と効率]
配列 2の光反応性カルモジュリン結合ペプチドを使用し、リガンドの量を変えて選別 効率を比較した。 （表 2)使用したアビジン磁気ビーズの量は 100 Lで、 250 pmolのビ ォチンを吸着する能力をもつ。
[0123] [表 2]
Figure imgf000037_0002
100 pmo l (光なし） は、 光照射のみをおこなわず、 同様の実験をしたもの。
[0124] 〔まとめ〕
磁気ビーズが吸着できる以上の量のリガンドを使用した 1000 pmolの実験では選別 効率が悪い。それ以下のリガンド量を使用するときには、効率にはあまり影響しない。
[0125] 評価実験（5) [アビジン磁気ビーズとアビジンプレートの比較]
提示ファージを回収する固定ィ匕アビジンとして、磁気ビーズとプレートとを比較した 。 (表 3)
使用したプレートは 96穴のアビジン固定ィ匕プレート（ピアス社製)を使用した。
[0126] [表 3]
Figure imgf000038_0001
[0127] 〔まとめ〕
カルモジュリン提示ファージ数とコントロールファージ数を比較するとき、磁気ビーズ では 1000倍、アビジンプレートでは 1800倍の差があった。
[0128] 評価実験（6) [フォトバニング法の効率決定]
カルモジュリン提示ファージとコントロールファージを、以下の表にあるような様々な 割合で混合した。各実験で 109個程度のファージを使用した。配列 2の光反応性リガ ンド（10 pmol)、磁気ビーズ 100 Lを用いてフォトバニングを行った。磁気ビーズに捕 らえられたファージ数を測定した。さらに、カルモジュリン遺伝子をプローブにしてプ ラークハイブリダィゼーシヨンを行った。カルモジュリン提示ファージのプラークを陽性 のプラークとし全部のプラーク数と比較して、その割合を計算した。（表 4)
[0129] [表 4] 磁気ビーズに捕らえられた 陽性プラークノ全体数
CaM ： control
ファージ数 (陽性の割合％)
1 :0 10000x 103 ND
1 :15 10000X103 ND
1 :150 2000 x103 157/160 (98%)
1： 1 , 500 300 χΐθ3 580/600 (97%)
1 :15,000 60 103 333/400 (84%)
1 :150,000 40x103 11/119 (9%)
1 :1, 500, 000 50x103 1/100 (1%)
0:1 10x103 ND
ND:測定せず
[0130] 〔まとめ〕
磁気ビーズに捕らえられたファージの数は、カルモジュリン提示ファージの割合が 少なくなるにしたがって減少していく。
1,500個中に 1個の割合でカルモジュリンファージが存在する条件でも、磁気ビーズ に捉えられたファージはほとんどがカルモジュリン提示ファージであった。
1:15,000 (0.0066%)の実験を例にとると、 15,000個中に 1個の割合で存在していた カルモジュリン提示ファージ力 フォトバニングによって 400個中 333個（84%)の割合 に増カロした。 0.0066%が 84%へ増えたので、 84+0.0066 = 12727となり、約 12700倍 濃縮できたことになる。同様に、 1:150,000では 13500倍、 1:1,500,000では 15000倍に 濃縮できたことになる。
このフォトバニング法により、 1回の操作で約 13000倍程度濃縮することができた。 ( 図 9で概略を説明）
[0131] 評価実験（7) [フォトバニング法と従来のバニング法との比較 (1)]
従来のバニング法と効率を比較するため、配列 1の N末をピオチンィ匕したカルモジ ュリン結合ペプチドを製作した。このペプチド（10/zmol/L)を使用し、フォトパユング の標準的方法に従 ヽ (ただし、光照射は行わな 、)カルモジュリン提示ファージとコン トロールファージがどれだけ磁気ビーズ（100 L)に捕らえられたかを測定した。（表 5 )洗浄は、 ImM CaClを含む TBS (50mM Tris/HCl (pH7.4), 0.25M NaCl)に 0.05%も
2
しくは、 0.5%の界面活性剤 Tween-20を加え調製した洗浄液で行った。再現性をみる ために、同一条件の実験 ((1)と (2))を 2回行った。
[表 5]
Figure imgf000040_0001
(1 )、 （2)、 （3)の実験は、 配列 1の Ν末端をビォチン化したリガンドで、 実験は配列 2のリガンドで光照射を行った結果である。
[0133] 〔まとめ〕
磁気ビーズで捕らえられたカルモジュリン提示ファージ数は、従来法、フォトパニン グ法の区別なぐあまり変化がない。しかしながら、コントロールファージの数をみると き、従来のバニング法では、フォトバニング法にくらべ 1000倍程度多く捕らえられてい る。フォトバニング法が従来法に比べ、効率的に目的のファージを選別できるのは、 このノックグランドの差による。（1)と (2)の実験を比較してみると、従来のバニング法は 再現性が悪いことがわかる。
[0134] 評価実験（8) [フォトバニング法と従来のバニング法との比較 (2)]
カルモジュリン提示ファージとコントロールファージを、以下の表にあるような様々な 割合で混合した。各実験で 108個程度のファージを使用した。配列 1の Ν末をピオチン 化したカルモジュリン結合ペプチド（10 pmol)、および配列 2の光反応性リガンド（10 p mol)を使用した。磁気ビーズは 25 μ Lで行った。
[0135] 磁気ビーズに捕らえられたファージ数をそれぞれのリガンドにつ 、て測定した。
各ファージを適宜希釈し、プレート 1枚に 100〜400個のファージプラークを出現させ 、その上に 5 mLの SMバッファーをカ卩え、 2時間振とうした。この溶液 2 Lに対して、力 ルモジュリン遺伝子を増幅するように設計したプライマーを用いて PCRを行い、カル モジュリン提示ファージの有無を各希釈系列で確認した。（表 6および図 10)
[0136] [表 6]
Figure imgf000041_0001
[0137] 〔まとめ〕
磁気ビーズに捕らえられたファージの数は、従来法では大きな変化は見られな 、が 、フォトバニング法ではカルモジュリン提示ファージの割合が少なくなるに従って、減 少していった。フォトバニング法では、バックグランドのファージ数が少なくなるので、 このような結果となる。カルモジュリン遺伝子の PCRの結果より、従来法は (3)1 :1,000 の混合ファージからの選別において、少なくとも 300個中に 1個のカルモジュリン提示 ファージが存在することがわかる。一方、フォトバニング法では (6)1 :1,000,000の混合 ファージからの選別においても、少なくとも 400個中に 1個のカルモジュリン提示ファー ジが存在することがわかる。以上の PCRの結果より、フォトバニング法は従来法に比 ベ、少なくとも 1000倍の選別効率をもつことが明らかになった。（図 11で概略を説明） [0138] 例 5
[ライブラリースクリーニング実験] [実験の方法]
cDNA提示ファージライブラリーからカルモジュリン提示ファージを、フォトパユング 法と従来のバニング法で単離する実験を行った。（図 12参照)ヒト脳 cDNA発現ライブ ラリーおよびヒト肝臓 cDNA発現ライブラリーを使用した。ヒト脳 cDNAライブラリ一中に はカルモジュリン遺伝子が多く含まれて 、るとされて 、る。両者ともノバジェン社より購 入、概ね 109個の提示ファージからスクリーニングをはじめた。配列 2の光反応性カル モジュリン結合ペプチド、もしくは配列 1の N末をピオチンィ匕したペプチドをリガンドと して使用した。最終濃度はいずれも 10 /z mol/Lとした。フォトバニング法では、光照射 を 2分間行った。アビジン磁気ビーズは 50 L使用した。上記のピオチン化リガンドの 12.5倍量のピオチン結合能力をもつ。従来法では、評価実験（7)で使用した TBS-0. 05%Tw-Ca2+を洗浄溶液として、 5回洗浄した。バニング後のファージ溶液の一部を 適宜希釈し、磁気ビーズ上に捕らえられたファージ数を測定した（図 12、ファージ数 測定 (2))。
[0139] その際に出来るプレートを使用し、メンブレンを製作し、カルモジュリン遺伝子断片 をプローブとしたプラークハイブリダィゼーシヨンを行って、カルモジュリン提示ファー ジ数を測定した（図 12、プラークハイプリ）。さらに、同じプレート上に SMバッファーを 少量入れ、プレートからファージ溶液を製作した。この溶液をもとにして、カルモジユリ ンを特異的に増幅するプライマーを用いて PCRを行 、カルモジュリン提示ファージの 有無を確認した（図 12、 PCR(2))上記操作で残ったバニング後のファージ溶液を増 幅した。増幅後、ファージ数を測定し (図 12、ファージ数測定 (1))、一部を使用し PCR によりカルモジュリン提示ファージの有無を確認した（図 12、 PCR(l))。
[0140] [実験の結果]
〔評価実験（9)フォトバニング法 (ヒト脳ライブラリー)光照射の有無〕
ヒト脳 cDNAライブラリーから、カルモジュリン提示ファージをスクリーニングした。配 列 2のリガンドを使用し、光照射の有無で結果を比べた。
[0141] [表 7]
Figure imgf000043_0001
[0142] フォト B(l)-2 (光あり）の段階で選別したファージを個別に、カルモジュリン遺伝子を 増幅する PCR法で確認した（図 13)。 Mのレーンはマーカーである。フォト B(l)-1(光 あり）力もフォト B(l)- 3 (光あり）で選別したファージ溶液を適度に希釈し、 200〜300個 程度のプラークが出現するように培養した。そこに、ニトロセルロースメンブレンを置き 、適切な操作ののち、カルモジュリン遺伝子をプローブとしたプラークハイブリダィゼ ーシヨンを行った（図 14)。黒く見える点力 カルモジュリンを提示しているファージで ある（陽性クローンと呼ぶ)。
[0143] 再現性を確かめるために、同一の実験をおこなった (表 8)。選別したファージ溶液 を希釈し、プラークを形成させ、 1つのプラークから得たファージをテンプレートとして 、カルモジュリン遺伝子を PCRで増幅した（図 15)。各サイクルで 10個ずつ確認した。
[0144] [表 8] バニング後の数 増殖後の濃度 （M) サイクル数
(ファージ数測定（2)) (ファージ数測定（1)) フォ ト B(3)-1 70x103 30x109 フォ ト B(3)-2 700 x 103 2x109 フォ ト B(3)-3 10,000x103 —— [0145] 増殖後のファージ溶液をテンプレートに PCRでカルモジュリン遺伝子を増幅した結 果を示す（図 16)。選別したファージ溶液を適度に希釈し、数百個程度のプラークが 出現するように培養し、 SMバッファーをカ卩えてファージ溶液を製作した。このファージ 溶液をテンプレートに、 PCRでカルモジュリン遺伝子を増幅した結果を示す（図 17)。 各電気泳動下の数値は、使用したプレート上に出現したプラーク数のおおよその数 を示す。
[0146] 〔まとめ〕
フォト B(l)- 1,2 (光あり）に比べて、フォト B(l)- 3 (光あり）のバニングの数 (表 7)力 10 0倍に増えている。これは、ファージ溶液がカルモジュリン提示ファージに均一化され たこと、すなわち割合が 100%近くなつたことを示す。
表 7のプラークハイブリダィゼーシヨンの結果は、図 14の結果力も測定された。 1回目 のフォトバニングで 0.5%、 2回目で 60%、 3回目で 99%がカルモジュリン提示ファージ となっており、上記のファージ数の急激な増加結果と一致する。
[0147] カルモジュリン遺伝子を個別のファージをテンプレートに増幅した PCR (図 13)によ り、フォト B(l)-2で選別されたファージは、 43個が陽性であり、 43Z60個つまり約 70% がカルモジュリン提示ファージであることがわかる。この割合は、ほぼプラークハイブリ ダイゼーシヨンで求めた結果と一致する。増幅したファージをテンプレートに行った実 験（図 16：フォト B(l)と (2))でも、 2回目のフォトバニング (光あり）でカルモジュリン遺伝 子の増幅が観察できる。しかし、（光なし)では増幅しな力つた。各バニング段階で、 数百個のファージ中にカルモジュリン提示ファージが存在す力調べた実験（図 17：フ オト B(l)と (2))から、（光あり）で 2回目から目的の提示ファージが得られることがわかる 。 （光なし)では 3回バニングを行っても、カルモジュリン提示ファージは見られなかつ た。
[0148] 以上の結果より、カルモジュリン提示ファージの濃縮には、光照射が必要であること がわかる。光反応により形成された共有結合が、バニングの効率を上昇させることが 明らかになる。
また、表 8および図 15の実験から、フォトバニング法でカルモジュリン提示ファージ を単離するとき、 1回目で OZlO (0%)、 2回目で 7ZlO(70%)、 3回目で 9ZlO(90 %)となり、前回の表 7での結果とほぼ同じとなった。
再現性が優れて!/、ると言える。
[0149] 〔評価実験（10)従来法 (ヒト脳ライブラリー)〕
従来法で、カルモジュリン提示ファージの単離を試みた。再現性を確認するために 、同様の実験を 2回行った。
使用したリガンドは、配列 1の N末をピオチンィ匕したものである。
[0150] [表 9]
Figure imgf000045_0001
[0151] [表 10]
Figure imgf000045_0002
[0152] 〔まとめ〕
バニング後のファージ数は各サイクルで 10倍程度変化して 、るが、再現性がな 、。 表 10のプラークハイブリダィゼーシヨンの結果より、カルモジュリン提示ファージが濃 縮されていないことがわかる。増幅したファージをテンプレートに行った実験（図 16 : 従来 B(5)と (6))でも、カルモジュリン遺伝子は増幅されない。各バニング段階で、数百 個のファージ中にカルモジュリン提示ファージが存在する力調べた実験（図 17：従来 B(5)と (6))では、従来 B(5)において 4回目にカルモジュリン遺伝子が増加されたものの 、 5回目には消えており再現性がない。このシステムを使用する限り、従来のバニング 法ではカルモジュリン提示ファージを濃縮することは出来ない。
[0153] 〔評価実験（11)フォトバニング法 (ヒト肝臓ライブラリー)〕
カルモジュリンの発現量が低いとされる、ヒト肝臓 cDNAから作られたライブラリーを 使用し、フォトバニング法を評価した。実験方法は、評価実験 (8)と同じである。
[0154] [表 11]
Figure imgf000046_0001
[0155] 〔まとめ〕
表 11のプラークハイブリダィゼーシヨンの結果から、肝臓 cDNAより 3回目のフォトパ ユングで 21%、 4回目で 92%の割合までカルモジュリン提示ファージを濃縮できること がわかる。これは、図 18の PCRで行った結果、 2回目で 10%、 3回目で 20%、 4回目で 90%と良く一致している。表 11のファージ数の急激な増カロが、 4回目で起こることと、 カルモジュリン提示ファージの占有割合とが、良く一致している。増幅したファージを テンプレートとして行った実験（図 16 :フォト L(4))で、 3回目のフォトバニングから、力 ルモジュリン遺伝子が見えてきている。各バニング段階で、数百個のファージ中に力 ルモジュリン提示ファージが存在するかを調べた実験（図 17 :フォト L(4))でも、 3回目 のフォトパユングから、カルモジュリン遺伝子が見えてきている。フォトパユング法は、 発現量の少な!/、ライブラリ一力もでもカルモジュリン提示ファージを濃縮し、ほぼ 100 %にすることができた。以上の結果をまとめて図 19に示す。
[0156] [光反応性カルモジュリンタンパク質をリガントとしたフォトバニング法]
[評価実験 (12)光反応基をつける部位による影響]
光反応基の導入部位の異なる 3種類の光反応性カルモジュリンタンパク質でフォト バニング法の効率を比較した (表 12)。カルモジュリンとその結合ペプチドである MLC K断片ペプチドの立体構造解析結果（PDB: ICDL)から、 26, 75, 115番目のアミノ酸 力 SMLCK断片ペプチドを中心にそれぞれ別の位置にあることがわかる。それぞれの アミノ酸をシスティンに変換して、化合物 3を装着した。その後、それぞれをピオチン 化した。カルモジュリン結合ペプチド提示ファージと Sタグ提示ファージを用いて、評 価実験を行った。方法に関しては、前述の標準的な方法に従った。使用した光反応 性カルモジュリンリガンド量は 30pmol、使用した磁気ビーズ量は 100 μ Lである。
[0157] [表 12]
Figure imgf000047_0001
26- , 75 - , 1 1 5—光反応性カルモジュリンは、 それぞれ N末からのアミノ酸残 基の位置を示し、 その部位に光反応基を装着したことを示す。
[0158] 〔まとめ〕
光反応基を結合させる部位を変えても、選別効率にあまり影響を与えな力つた。
[0159] [評価実験（13)フォトバニング法と従来法との比較 (1)]
カルモジュリン結合ペプチド提示ファージとコントロールファージとで、バニングを行 い、磁気ビーズにどれだけのファージが捉えられるか比較し、フォトバニング法と従来 法の選別効率を比較した。光反応性リガンドとしてはピオチンィ匕した 115—光反応性 カルモジュリンを使用し、従来法ではピオチンィ匕したカルモジュリンタンパク質を使用 した。従来法は、ペプチドリガンドでの実験 (評価実験（7) )と同様におこなった。
[0160] [表 13] 磁気ビーズに捕らえられたファージ数
カルモジユリン結合べ コントロ一ル
バニング 倍率
プチド提示ファ一ジ ファ一ジ
フォトバニング （光あり） 600 x 103 6 x 103 100倍 従来法 （光なし） 20, 000 χ ΐ θ3 5, 000 103 4倍 倍率は、 カルモジュリン結合ペプチド提示ファージ数を、 コントロールファー ジ数で割ったものである。
[0161] フォトバニング法では、コントロールファージの 100倍量のカルモジュリン結合べプチ ド提示ファージを捉えることができる。一方、従来法では 4倍程度であった (表 13) [0162] 〔まとめ〕
タンパク質をリガントとした場合にも、ペプチドリガンドを使用したときと同様に、フォト バニング法は従来法に比べ、 目的ファージを効率よく選別できる。
[0163] [評価実験（14)フォトバニング法と従来法との比較 (2)]
カルモジュリン結合ペプチド提示ファージとコントロールファージを以下の表 14のよ うに様々な割合で混合した。各実験では合計ファージ数が、 108個程度になるように そろえた。フォトパユング法では、ピオチン化した光反応性カルモジュリンタンパク質 を、また、従来法ではピオチンィ匕したカルモジュリンタンパク質をリガンドとして使用し た。磁気ビーズに捕らえられたファージ数を測定した (表 14)
[0164] [表 14]
Figure imgf000048_0001
従来法においては、結合能力のあるファージ割合が減少しても、磁気ビーズに捉え られるファージ数には変化がないが、フォトバニング法では割合が減少するに従い、 捕らえられたファージ数が減少して 、つた。 [0166] 選別したファージ溶液を適度に希釈し、数百個程度のプラークが出現するように培 養し、 SMバッファーをカ卩えてファージ溶液を製作し、このファージ溶液をテンプレート に、 PCRでカルモジュリン結合ペプチドの遺伝子を増幅した（図 20)。各電気泳動上 の数字は、表 14で示されている (1)から (4)の試料に対応している。また、下の数値は、 使用したプレート上に出現したプラーク数の数を示す。カルモジュリン結合ペプチド のコード領域だけでは、増幅される遺伝子が短くなり、電気泳動での検出が困難にな るため、ペプチドをコードする領域と近隣のファージゲノム領域とにプライマーを製作 し、 PCRを行った。
[0167] フォトバニング法では、 1:100〜1:100,000までの希釈のすべてでカルモジュリン結 合ペプチド提示ファージが検出されているのに対して、従来法では 1:10,000の希釈 では検出ができなかった。
フォトバニング法で PCRによる検出限界が不明なことと、プレート上のファージ数に ばらつきがあるので、正確には決められないが、フォトバニング法は従来法に比べ、 選別効率は、少なくとも 100倍以上であると思われる。
[0168] 希釈試料力もフォトバニング法で捕らえたファージ溶液中のカルモジュリン結合べ プチド提示ファージの数を、プラークハイブリダィゼーシヨンで決定し、図 21に示す。 ハイプリ写真上部の数字は、表 14の (1)〜(4)に対応する。また、下段には陽性ブラー ク数 Z全体プラーク数と（ ）内に濃縮倍率を示した。 1:100,000に希釈したファージ溶 液から、 680個中 10個のカルモジュリン結合ペプチド提示ファージが回収された。よつ て濃縮効率は 1470倍と見積もられる。
[0169] 〔まとめ〕
フォトバニング法は従来法に比べ 100倍以上の濃縮効率をもつことが明らかになり、 1回のフォトバニングで 1470倍の濃縮に成功した。
[0170] [評価実験（15)ライブラリーのスクリーニング実験]
ヒト脳および肝臓の cDNAライブラリーから、カルモジュリンに結合するタンパク質を 単離する目的で、スクリーニングを行った。フォトパユング法では、ピオチン化した光 反応性カルモジュリンタンパク質を、従来法ではピオチンィ匕したカルモジュリンタンパ ク質を、それぞれリガンドとして 30pmol使用し、スクリーニングを行った。ライブラリ一は 概ね 109個からスクリーニングを始めた。 2回目以降は、各回に対応する表中の「増殖 後の濃度」の 1Z20量で行った。
アビジン磁気ビーズは、 100 /z L使用した。従来法では、評価実験（7)で使用した洗 浄条件で行った。フォトバニング法でヒト脳ライブラリーをスクリーニングしたものが、 表 15、表 17、表 18で示されている。従来法でヒト脳ライブラリーをスクリーニングしたも の力 表 16で示されている。フォトバニング法でヒト肝臓ライブラリーをスクリーニングし たものが、表 19で示されている。
[0171] [表 15]
Figure imgf000050_0001
[0173] [表 17] バニング後の数 増殖後の濃度 （/mL) サイクル数
(ファージ数測定 (2)) (ファージ数測定（υ) フォト B(9)-1 400 x103 20x109 フォト B(9)- 2 400 x 103 20 109 フォト B(9)-3 8,000x 103 10x109
フォト B(9)-4 18,000x103 10x109 表 18] バニング後の数 増殖後の濃度 （/mL) サイクル数
(ファージ数測定 (2)) (ファージ数測定（1)) フォ卜 B(10)-1 360 x103 20x109 フォト B(10)- 2 2, 200 x10s 6x109 フォト B(10)-3 2,000x103 20x10°
フォト B(10)- 4 30,000x103 —— 表 19] バニング後の数 増殖後の濃度 （/mL) サイクル数
(ファージ数測定 (2)) (ファージ数測定（1)) フォ卜 L(11)- 1 200 x 103 50x109 フォ卜 L(11)-2 400 x10s 30x109 フォ卜 L(11)- 3 200 x103 50x109
フォ卜 1_(11)- 4 2,000x103 60x109
フォ卜 L(11)_5 1,000 103 100x109
[0176] 〔まとめ〕
フォトバニング法では、サイクルが増えるごとにバニング後のファージの数が増加す る。
[0177] [評価実験（16)単離したファージ遺伝子のシーケンス]
各表にゴジックで示されたサイクル、フォト B(7)-4,フォト B(7)- 5,従来法（一） B(8)-5 ,フォト B(9)- 4,フォト B(10)- 4,フォト L(ll)- 4,フォト L(ll)- 5でのファージをプレート上 で単離した。単離したファージ数は，全部で 230個であった。これらをテンプレート〖こ してインサート部分を PCRで増幅した（例：図 22)このうち、 400bp以上の DNAを選び P CR断片を回収した。全部で 228断片回収した。回収した 228断片について、 5'末端よ り DNAシーケンスを読んだ。
複数個回収されたファージもしくはカルモジュリン結合タンパク質として報告のある遺 伝子をもつファージについて、表 20にまとめた。
[0178] [表 20]
Figure imgf000052_0001
[0179] 上表の Nol, 2, 10, 11, 18は，すでにカルモジュリン結合タンパク質として報告のあ るものである。シーケンスの結果、ファージは各タンパク質において、カルモジュリン 結合部位を含む領域を、フレームどおり発現して 、ることがわ力つた。
[0180] 上表の No3, 7, 8, 9, 12, 13, 14, 15, 16, 17については、カルモジュリンターゲットデ ~~タべ' ~"ス (し almoaulin Target Database (http://calcium.unnres.utoronto.ca/ctdb/fl ash.htm))のカルモジュリン結合解析により「8」以上の判定を受けた配列を含んで!/、る 。同データベースは、 Yap KL, Kim J, Truong K, Sherman M, Yuan T, Ikura M. J Str uct Funct Genomics. 2000;1(1):8- 14.で報告されたもので、カルモジュリンへの結合 能力を評価できる。
図 23は、 No3の AC092953について同データベースで解析した結果である。配列の 下の数字力 以上の部分力 カルモジュリンと結合すると考えられる。
No3, 7, 8, 9, 12, 13, 14, 15, 16, 17においては、自然には存在しないペプチドと考え られる。すなわち、反対鎖で読まれているもの、フレームシフトをおこしているもの、タ ンパク質にはならな 、と報告されて 、るものなどである。
[0181] No.4および 6に関しては、カルモジュリン結合能力は同データベースでは確認され ていない。しかしながら、この 2つのファージについては、簡易的なフォトパユング法 にお 、て、カルモジュリン結合活性が示されて 、る（表 21)。
[0182] [表 21]
Figure imgf000053_0001
倍率はコントロールファージ数を 1として、 各ファージが何倍量の吸着したか をみたもの。
[0183] 〔まとめ〕
複数個単離されたファージは、すべてがカルモジュリンと結合することが予想された 。シーケンスを読んだ 228個のファージから、 124個のカルモジュリン結合活性のある ファージが回収できたことになる。フォトバニング法により、約 55%の陽性ファージを 得る選別効率が得られたことがわかる。
[0184] [評価実験（17)ライブラリースクリーニングの評価]
単離されたカルモジュリン結合タンパク質につ 、て、各フォトバニングサイクルで回 収できているかどうか、各遺伝子に特異的な PCRで確認した。図 24は、バニング後増 幅したファージ溶液をテンプレートに PCRを行ったものである。電気泳動の上部には 各サンプル情報が示されている。「L」はライブラリーをテンプレートにしたものである。 図 25は、選別したファージ溶液を適度に希釈し、プラークを出現させ、 SMバッファー をカロえてファージ溶液を製作した。このファージ溶液をテンプレートに、各遺伝子つ いて PCRで増幅した結果を示す。各電気泳動下の数値は、使用したプレート上に出 現したプラーク数のおおよその数を示す。両図において、（9)および (7)はフォトパニン グ法での結果であり、（8)は従来法での結果である。
[0185] 〔まとめ〕
おおむね、フォトバニング法 ((7)と (9))では各遺伝子でサイクル数が増加するに従 い、検出頻度が上昇している。従来法 ((8))では、ほとんどの遺伝子が検出されない。 2回のフォトバニング法 ((7)と (9))を比べるとき、再現性が良い。ライブラリースクリー- ングの結果を図 26にまとめて示す。
産業上の利用可能性
[0186] 本発明は、タンパク質やペプチドが関連する創薬分野および抗体医療分野に有用 である。
図面の簡単な説明
[0187] [図 1]タンパク質提示ファージの模式図。
[図 2]従来のバニング法の概略説明図。
[図 3]本発明のフォトバニング法の概略説明図。
[図 4]本発明のフォトバニング法の説明図。
[図 5]例 3における HPLCの解析結果。
[図 6]例 3における複合体形成効率の測定結果。
[図 7]例 3の評価実験（1)における SDS-PAGEでの解析結果。
[図 8]例 3の評価実験（2)における SDS-PAGEでの解析結果。
[図 9]フォトバニング法による 1回の操作での濃縮程度の説明図。
[図 10]評価実験（8)においてカルモジュリン提示ファージの有無を各希釈系列で確 認した結果。
[図 11]評価実験 (6)フォトバニング法と従来法との選別効率対比結果。
[図 12]例 5における、 cDNA提示ファージライブラリ一力もカルモジュリン提示ファージ をフォトバニング法と従来のバニング法で単離する実験の模式図。
[図 13]例 5における、カルモジュリン遺伝子の PCR法での増幅確認結果。
[図 14]例 5における、カルモジュリン遺伝子をプローブとしたプラークハイブリダィゼー シヨン結果（注：写真はすべてのプラークを載せて 、るわけではな 、)。
[図 15]カルモジュリン遺伝子の PCR法での増幅確認結果。
[図 16]カルモジュリン遺伝子の PCR法での増幅確認結果。
[図 17]カルモジュリン遺伝子の PCR法での増幅確認結果。
[図 18]カルモジュリン遺伝子の PCR法での増幅確認結果。
[図 19]例 5のまとめ。
[図 20]カルモジュリン結合ペプチド提示ファージの有無を各希釈系列で確認した結 果。
[図 21]フォトバニング法で捕らえたファージ溶液中のカルモジュリン結合ペプチド提 示ファージの数のプラークハイブリダィゼーシヨンでの決定結果。
[図 22]インサート部分の PCRでの増幅結果。
[図 23]No3の AC092953について、カルモジュリンターゲットデータベースで解析した 結果。
[図 24]パユング後増幅したファージ溶液をテンプレートに PCRした結果。
[図 25]ファージ溶液をテンプレートにして各遺伝子ついて PCRで増幅した結果。
[図 26]フォトバニング法 (本発明)によるカルモジュリン結合タンパク質のスクリーニング の概要。本発明のスクリーニング方法は、優れた再現性と選択効率で様々なクローン を網羅的に解析できる。

Claims

請求の範囲
[1] 光反応基を有する光反応性リガンドと、タンパク質提示ファージまたはペプチド提示 ファージを液相中で混合し、
光反応性リガンドの光反応基に対する活性光を照射し、
光反応性リガンドを固相に固定ィ匕し、
光反応性リガンドを固定ィ匕した固相を洗浄し、
固相に固定化された光反応性リガンドと結合したタンパク質提示ファージまたはぺプ チド提示ファージを回収することを含む
光反応性リガンドに対して相互作用するタンパク質またはペプチドをスクリーニングす る方法。
[2] 光反応性リガンドが光反応性ペプチド、光反応性タンパク質、光反応性核酸または 光反応性糖鎖である請求項 1に記載の方法。
[3] 光反応基がジアジリン基である請求項 1または 2に記載の方法。
[4] 光反応性リガンドの固相への固定ィ匕をピオチン アビジン若しくはストレプトアビジン 系、 Hisタグ—ニッケル系、ホウ素ーヒドロキサム酸キレート系、または抗原 抗体系を 用いて行う請求項 1〜3のいずれか 1項に記載の方法。
[5] (1)光反応性リガンドがピオチンを有し、固相はアビジンまたはストレプトアビジンを被 覆したものであり、（2)光反応性リガンドが Hisタグを有し、固相はニッケルを被覆した ものであり、（3)光反応性リガンドがヒドロキサム酸キレートを有し、固相はホウ素を被 覆したものであり、及び (4)光反応性リガンドが抗原を有し、固相は抗体を被覆したも のであるのいずれかである請求項 4に記載の方法。
[6] 固相が磁気ビーズ、または基板である請求項 1〜5のいずれか 1項に記載の方法。
[7] 固相に固定化された光反応性リガンドと結合したタンパク質提示ファージまたはぺプ チド提示ファージの回収を、磁気ビーズを回収することで行う請求項 6に記載の方法
[8] 洗浄は、界面活性剤を用い行う請求項 1〜7のいずれ力 1項に記載の方法。
[9] 回収したタンパク質提示ファージまたはペプチド提示ファージの DNAを同定すること で、タンパク質またはペプチドを同定する請求項 1〜8のいずれか 1項に記載の方法。
[10] 回収したタンパク質提示ファージまたはペプチド提示ファージを増殖させ、増殖させ たタンパク質提示ファージまたはペプチド提示ファージを用いて、
請求項 1に記載された光反応性リガンドとの液相中での混合、活性光の照射、固相 への光反応性リガンドの固定化、固相の洗浄、および固相に固定化された光反応性 リガンドと結合したタンパク質提示ファージまたはペプチド提示ファージの回収を少な くとも 1回行う、
請求項 1〜8のいずれか 1項に記載の方法。
[11] 回収したタンパク質提示ファージまたはペプチド提示ファージの DNAを同定すること で、タンパク質またはペプチドを同定する請求項 10に記載の方法。
[12] 光反応性リガンドに対して相互作用するタンパク質またはペプチドをスクリーニングす るために用いるキットであって、
光反応基を有する光反応性リガンドと前記光反応性リガンドを固定化する固相を含 む目 I〗記キット。
[13] 光反応性リガンドが光反応性ペプチド、光反応性タンパク質、光反応性核酸または 光反応性糖鎖である請求項 12に記載のキット。
[14] 光反応基がジアジリン基である請求項 12または 13に記載のキット。
[15] 光反応性リガンドを固定ィ匕する固相は、ピオチン アビジン若しくはストレブトァビジ ン系、 Hisタグ一ニッケル系、ホウ素ーヒドロキサム酸キレート系、または抗原 抗体系 を用いて光反応性リガンドを固定ィ匕するものである請求項 12〜14のいずれか 1項に 記載のキット。
[16] (1)光反応性リガンドがピオチンを有し、固相はアビジンまたはストレプトアビジンを被 覆したものであり、（2)光反応性リガンドが Hisタグを有し、固相はニッケルを被覆した ものであり、（3)光反応性リガンドがヒドロキサム酸キレートを有し、固相はホウ素を被 覆したものであり、及び (4)光反応性リガンドが抗原を有し、固相は抗体を被覆したも のであるのいずれかである請求項 15に記載のキット。
[17] 固相が磁気ビーズ、または基板である請求項 12〜16のいずれか 1項に記載のキット
[18] 光反応性リガンドを固定ィ匕した固相を洗浄するための洗浄剤をさらに含む請求項 12 〜 17のいずれ力 1項に記載のキット。
[19] 請求項 1〜： L 1のいずれかの方法において使用される、請求項 12〜18のいずれか 1 項に記載のキット。
[20] 光反応基を有する化合物、リガンド標識物質および光反応装着溶液を含む、光反応 基を有する光反応性リガンドを作製するためのキット。
[21] 光反応基を有する化合物は、以下の一般式 (C)で示されるフ ニルジアジリンィ匕合 物である請求項 20に記載のキット。
[化 1]
Figure imgf000058_0001
(上記式中、 Rは、ハロゲン原子、またはスルホン酸エステル残基であり、 Rは、炭素
6 7 数 1〜6のアルキルチオスルホ -ル基または炭素数 1〜6のアルキルチオ基であり、 R
8 は、 Hまたは炭素数 1〜6のアルキル基であり、 nは 1〜6の整数である。 )
[22] リガンド標識物質は、ピオチン、ヒスチジンタグ (Hisタグ）、ヒドロキサム酸キレートまた は抗原である請求項 20または 21に記載のキット。
[23] タンパク質提示ファージ希釈溶液および光反応性リガンド溶液を含む、バリデーショ ンするためのキット,
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1911768A1 (en) * 2006-10-13 2008-04-16 Canon Kabushiki Kaisha Protein, method for immobilizing protein, structure, biosensor, nucleic acid, vector and kit for detecting target substance

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2001508865A (ja) * 1996-10-11 2001-07-03 ザ・トラステイーズ・オブ・ザ・ユニバーシテイ・オブ・ペンシルベニア 細胞への抗体結合の検出のための組成物および方法

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2005221394A (ja) * 2004-02-06 2005-08-18 Marubeni Corp フォトアフィニティービーズ、アフィニティー吸着体及び標的物質の分離・精製方法

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2001508865A (ja) * 1996-10-11 2001-07-03 ザ・トラステイーズ・オブ・ザ・ユニバーシテイ・オブ・ペンシルベニア 細胞への抗体結合の検出のための組成物および方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HATANAKA Y. ET AL.: "Photoaffinity Labeling in Drug Discovery and Developments: Chemical Gateway for Entering Proteomic Frontier", CURRENT TOPICS IN MEDICINAL CHEMISTRY, vol. 2, 2002, pages 271 - 288, XP003015483 *
SADAKANE Y. ET AL.: "EFFICIENT CLONING OF CARBOHYDRATE BINDING PROTEINS BY PHOTOAFFINITY LABELING", PHOTOMEDICINE AND PHOTOBIOLOGY, vol. 23, 2001, pages 83 - 84, XP003015484 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1911768A1 (en) * 2006-10-13 2008-04-16 Canon Kabushiki Kaisha Protein, method for immobilizing protein, structure, biosensor, nucleic acid, vector and kit for detecting target substance
US7868142B2 (en) 2006-10-13 2011-01-11 Canon Kabushiki Kaisha Protein, method for immobilizing protein, structure, biosensor, nucleic acid, vector and kit for detecting target substance

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