DE60319121T2 - Zusammensetzungen, verfahren und kits zum nachweis eines antigens auf einer zelle und in einem biologischen gemisch - Google Patents

Zusammensetzungen, verfahren und kits zum nachweis eines antigens auf einer zelle und in einem biologischen gemisch Download PDF

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Description

  • HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • Jedes Jahr werden allein in den Vereinigten Staaten hunderte Millionen von Antigen-Typisierungen von Erythrozyten (RBC) an gespendeten Bluteinheiten und den Patienten, die sie empfangen sollen, durchgeführt. Zusätzlich wird eine äquivalente Anzahl von Patienten-Antiseren auf die Anwesenheit vorexistierender anti-RBC-Antikörper durchmustert, deren Spezifitäten vor der Auswahl von kompatiblem Blut identifiziert werden müssen. Die in Blutbanken verwendete Technologie zum Ausführen dieser Tests ist im Wesentlichen die Gleiche wie die vor über 100 Jahren von Landsteiner demonstrierte – die Agglutination von RBCs durch ein geeignetes Antiserum. Assaysysteme dieser Art sind arbeitsintensiv und erfordern normalerweise Teams gut ausgebildeter Medizintechniker, die Reagenzgläschen über Vergrößerungsspiegeln schütteln und Agglutinationsmuster mit dem Auge bewerten. Dementsprechend erfordern Blutbanken wesentlich mehr Labortechniker pro Test als jede andere Art von klinischem Labor, was sich in den 10- bis 100fach höheren Kosten pro Test für das Transfusionslabor als für andere Bereiche der Labormedizin widerspiegelt. Zusätzlich stehen Blutspendeeinrichtungen, Blutbanken und Krankenhaus-Transfusionsdienste im ganzen Land auf Grund des Mangels an qualifizierten und interessierten Kandidaten einer zunehmenden Knappheit ausgebildeter Mitarbeiter zum Durchführen derartiger Tests gegenüber. Dies ist angesichts der herausragenden Wichtigkeit von genauen Tests vor einer Transfusion und der Fähigkeit, Blutkomponenten auf zeitgerechter, oft dringender, Basis an Patienten bereitzustellen, besonders besorgniserregend.
  • Im Gegensatz zu anderen Formen von Labortests, wie zum Beispiel denjenigen in klinischer Chemie, Koagulation und Hämatologie, haben sich die Blutbanktests der Entwicklung einer schnellen Automatisierung mit hohem Durchsatz widersetzt. Die Verfahren zur Blutbankautomatisierung, die derzeit zur Verfügung stehen, erfordern im Prinzip die Verwendung einer Maschine, welche die Agglutination von Erythrozyten nachweist, aber die Agglutination (oder irgendeine Variante davon) ist immer noch der Endpunkt, fast so wie vor beinahe 100 Jahren. Gründe für die Schwierigkeit bei der Entwicklung wirklich automatisierter Bluttypisierungssysteme sind vielfältig, haben aber im Großen und Ganzen mit der Notwendigkeit zu tun, mit intakten Zellen zu arbeiten, um die Anwesenheit spezifischer polymorpher Moleküle auf deren Oberflächen nachzuwei sen. Dies steht im Gegensatz zu anderen Labortests, die einfach Zellzahlen zählen oder die Konzentrationen löslicher Plasmaproteine oder Elektrolyte messen.
  • Während es zutrifft, dass Durchflusszytometrie-Tests ebenfalls einen Zelloberflächenphänotyp nachweisen, erfordern die Indikationen für derartige Tests im allgemeinen keine schnellen Echtzeitergebnisse, wie zum Beispiel diejenigen, die in der Transfusionsmedizin erforderlich sind, wo das Ziel ist, die Transfusion von nicht kompatiblem Blut zu verhindern, oft während Notfällen, wie zum Beispiel einem Trauma oder einem unvorhergesehenen chirurgischen Eingriff, wo Zeit und Genauigkeit wesentlich sind. Darüberhinaus haben wesentliche Unterschiede in der Art der Blutbanktests die Entwicklung von „Vor-Ort"-Testvorrichtungen, wie zum Beispiel derjenigen, die jetzt für Glucose- oder Elektrolytbestimmungen oder für die schnelle „Auf-der-Stelle"-Diagnose von Myokardinfarkten zur Verfügung stehen, ausgeschlossen. Die Entwicklung neuer Blutbanktestverfahren könnte zur Entwicklung kleiner, tragbarer Vorrichtungen für Tests vor einer Transfusion führen, die „Vor-Ort"-Tests (z. B. auf dem Schlachtfeld) ermöglichen könnten, die unter Verwendung herkömmlicher Ansätze nicht möglich sind.
  • Ein anderer wesentlicher Punkt bei Blutbanktests ist die zunehmende Nichtverfügbarkeit von vollständigen Sätzen immunologischer Reagenzien hoher Qualität für das Typisieren. Vorräte herkömmlicher Quellen stammen aus gespendeten menschlichen polyklonalen Antiseren, bei denen eine Qualitätskontrolle schwierig ist und bei denen die Vorräte auf Grund zunehmender ethischer Bedenken, was die absichtliche Hyperimmunisierung von Reagenz-Spendern betrifft, schwinden. Weil Immunreaktionen gegen viele Blutgruppenantigene nur bei Menschen (denen das jeweilige Antigen fehlt) und nicht bei Tieren (z. B. Mäusen, deren Immunsysteme im Allgemeinen die feinen menschlichen Polymorphismen, gegen welche das Antiserum gerichtet sein muss, nicht nachweisen können) stattfinden, haben Bemühungen, monoklonale Typisierungsreagenzien herzustellen, die Fähigkeit erfordert, menschliche B-Zellen zu transformieren, wobei es sich um ein sehr ineffizientes und teures Unterfangen handelt. Deshalb ist die Verfügbarkeit von unendlichen Vorräten gut charakterisierter monoklonaler RBC-Antikörper, analog zu denjenigen, welche die Automatisierung anderer, auf Immunologie beruhender Assays revolutionierten, wie zum Beispiel denjenigen für Endokrinologie oder Infektionskrankheiten, auf dem Gebiet der Transfusionsmedizin problematisch gewesen.
  • Mehr als 20 Millionen Bluteinheiten werden jährlich in den Vereinigten Staaten entnommen, wobei die weltweiten Blutentnahmen 40 Millionen Einheiten überschreiten. Blutentnahmezentren (z. B. American Red Cross, Spendezentren in Krankenhäusern), Krankenhäuser und andere Blutbanken und Transfusionszentren haben alle einen laufenden Bedarf, Blut schnell und exakt mit hohem Durchsatz zu typisieren. Kleine, automatisierte Bluttypisierungsgeräte würden auch „Vor-Ort"-(„Point-of-Care"-)Anwendungen in Arztpraxen finden, wie zum Beispiel denjenigen von Geburtshelfern, bei denen der Rhesusfaktor eines Patienten bestimmt werden muss, um Rh(D)-Immunglobulin korrekt zu verabreichen. Jede Bluteinheit, die entnommen wird, wird auf mindestens 3 Antigene (d. h. A, B, Rh(D)) typisiert, und das Blut wird oft zum Nachweis vieler weiterer Antigene (z. B. Rh(C), Rh(c), Rh(E), Rh(e), K, Fya, Fyb, M, N, S, s, Jka, Jkb und dergleichen) getestet.
  • Nach dem Empfang von Einheiten durch eine Blutbank erfordern die Standards, dass jede Einheit erneut auf A und B getestet wird, um das korrekte Markieren sicherzustellen. Jede entnommene Bluteinheit wird in Erythrozyten, Thrombozyten und Plasma getrennt, um 3 unterschiedliche Patienten mit unterschiedlichem Bedarf zu behandeln. Ungefähr zweimal so viele Patienten werden auf A, B und Rh(D) (und oft auf andere Antigene) typisiert wie diejenigen, die tatsächlich Blut erhalten (d. h. das Verhältnis Kreuzprobe/Transfusion beträgt ungefähr 2). Zusätzlich werden Blutproben bei Patienten im Krankenhaus alle zweiundsiebzig Stunden entnommen, um frische Proben für Kreuzprobenzwecke zur Verfügung zu haben, so dass viele Patienten während ihres Krankenhausaufenthalts viele Male typisiert und erneut typisiert werden. Deshalb liegt die Anzahl der weltweit jährlich durchgeführten Bluttypisierungen bei hunderten Millionen von Tests.
  • Wie zuvor angemerkt, verwenden im Prinzip alle Verfahren zur RBC-Typisierung, ob manuell oder automatisiert, Agglutination als den Endpunkt. Die Nachteile von manuellen Verfahren schließen Arbeitskosten, niedrigen Durchsatz und menschlichen Fehler ein. Nachteile der derzeitigen automatisierten Verfahren schließen die Unfähigkeit zum Vervielfältigen von Testreaktionen und den relativ niedrigen Durchsatz im Vergleich zu anderen Labortests ein. Zusätzlich schließen signifikante Nachteile sowohl der derzeitigen manuellen als auch der automatisierten Verfahren ihre Abhängigkeit von herkömmlichen Antiserumquellen, Quellen, deren Vorrat schwindet und die möglicherweise menschliche Krankheiten übertragen können, oder von den wenigen in menschlichen oder in Maus-Hybridomen produzierten Antikörpern, die schwierig und teuer herzustellen sind, ein. Die vorliegende Erfindung stellt unendliche Vorräte preiswerter, durch Phagen präsentierter anti-RBC-Reagenzien bereit, die nicht nur bei einer automatisierten Technologie des „Genotypisierens durch Phänotypisieren mit Reagenz", wie hierin offenbart, verwendet werden können, sondern auch mit herkömmlichen manuellen und automatisierten Agglutinationsverfahren unter Verwendung eines M13-Antikörpers als dem agglutinierenden (d. h. „Coombs"-)Mittel (z. B. US-Patent Nr. 5,985,543 an Siegel) kompatibel sind.
  • Huie, M. A. et al. (PNAS 98, 2001, 2682–2687) offenbart ein Verfahren zum Identifizieren von Antikörpern gegen Antigene aus fötalen kernhaltigen Erythrozyten unter Verwendung einer nicht immunen Phagenantikörperbank und PCR-Fingerprint-Techniken.
  • Pereira, S. et al (J. Immun. Meth. 203, 1997, 11–24) beschreibt ein Modellsystem zum Nachweis und zur Isolierung von Antikörpern gegen Tumorzelloberflächenantigene unter Verwendung einer Antikörper-Phagenpräsentation.
  • Die Nucleinsäuresequenzen der SEQ ID NO: 1–3, 5, 6 und 9 teilen sich eine Homologie mit den EMBL Hinterlegungsnummern I17331, AR037776, E39261, AX074066, AX175376 und AR063335.
  • Zusammen genommen gibt es deshalb einen lange bekannten und akuten Bedarf für verbesserte Bluttypisierungsverfahren und Reagenzien dafür, welche die Automatisierung derartiger Tests ermöglichen und dadurch die Kosten senken, die Effizienz und Genauigkeit verbessern und den Bedarf für derzeit schwierig zu erhaltende Reagenzien umgehen. Die vorliegende Erfindung erfüllt diesen Bedarf.
  • KURZE ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Die Erfindung schließt ein Verfahren zum Nachweisen der Anwesenheit einer Antigen-tragenden Einheit auf einer Zelle ein. Das Verfahren umfasst: a) In-Kontakt-Bringen einer Zelle mit einem Bakteriophagen, der einen Antikörper exprimiert, von dem bekannt ist, dass er spezifisch an die Antigen-tragende Einheit bindet, wobei der Bakteriophage eine Nucleinsäure umfasst und wobei die Sequenz der Nucleinsäure mindestens teilweise bekannt ist; b) Denaturieren aller spezifisch an die Zelle gebundener Bakteriophagen, um die Nucleinsäure freizusetzen; und c) Nachweisen der Nucleinsäure, wobei das Nachweisen der Nucleinsäure die Anwesenheit der Antigen-tragenden Einheit auf der Zelle nachweist, wodurch die Anwesenheit der Antigen-tragenden Einheit auf der Zelle nachgewiesen wird.
  • In einer Ausführungsform umfasst das Verfahren ferner das Amplifizieren der Nucleinsäure vor Schritt (c).
  • In einer anderen Ausführungsform umfasst das Verfahren ferner das Waschen der Zelle zwischen Schritt (a) und Schritt (b).
  • In noch einer anderen Ausführungsform handelt es sich bei der Zelle um einen Erythrozyten und bei der Antigen-tragenden Einheit um ein Erythrozyten-Antigen.
  • In einer weiteren Ausführungsform ist das Erythrozyten-Antigen aus der Gruppe, bestehend aus A, B, Rh(D), Rh(C), Rh(c), Rh(E), Rh(e), K, Fya, Fyb, M, N, S, s, Jka und Jkb ausgewählt.
  • In einer Ausführungsform handelt es sich bei der Zelle um einen Leukozyten und die Antigen-tragende Einheit ist aus der Gruppe, bestehend aus einem Lymphozyten-Antigen, einem Monozyten-Antigen und einem Granulozyten-Antigen ausgewählt.
  • In noch einer anderen Ausführungsform handelt es sich bei der Zelle um einen Thrombozyten und bei der Antigen-tragenden Einheit um ein Thrombozyten-Antigen.
  • In einer weiteren Ausführungsform ist das Thrombozyten-Antigen aus der Gruppe, bestehend aus HPA-1a, HPA-1b, HPA-2a, HPA-2b, HPA-3a, HPA-3b, HPA-4a, HPA-4b, HPA-5a, HPA-5b, HPA-6b, HPA-7b, HPA-8b, HPA-9b, HPA-10b, Gova und Govb ausgewählt.
  • In einer weiteren Ausführungsform umfasst die Nucleinsäure eine Sequenz, die zu einer Molecular Beacon-Sonde komplementär ist.
  • In einer weiteren Ausführungsform ist die Sequenz zu einer Sequenz komplementär, die aus der Gruppe, bestehend aus der Sequenz von SEQ ID NO: 3 und der Sequenz von SEQ ID NO: 4 ausgewählt ist.
  • In noch einer weiteren Ausführungsform ist die Sequenz der Molecular Beacon-Sonde aus der Gruppe, bestehend aus der Sequenz von SEQ ID NO: 7, der Sequenz von SEQ ID NO: 8, der Sequenz von SEQ ID NO: 9 und der Sequenz von SEQ ID NO: 10 ausgewählt.
  • In einer anderen Ausführungsform umfasst die Molecular Beacon-Sonde ein Fluorophor.
  • In einer Ausführungsform wird die Nucleinsäure unter Verwendung der Polymerasekettenreaktion (PCR) amplifiziert.
  • In einer anderen Ausführungsform umfasst die PCR die Verwendung eines Primers, der aus der Gruppe, bestehend aus der Sequenz von SEQ ID NO: 1 und der Sequenz von SEQ ID NO: 2 ausgewählt ist.
  • In noch einer anderen Ausführungsform wird die Nucleinsäure durch Transkription unter Verwendung eines durch T7 RNA amplifizierten immunologischen Nachweisverfahrens (IDAT) amplifiziert.
  • Die Erfindung schließt ein Verfahren zum Nachweisen der Anwesenheit von mindestens zwei unterschiedlichen Antigen-tragenden Einheiten auf einer Zelle ein. Das Verfahren umfasst: a) In-Kontakt-Bringen einer Zelle mit einem ersten Bakteriophagen, der einen Antikörper exprimiert, von dem bekannt ist, dass er spezifisch an eine erste Antigen-tragende Einheit bindet, wobei der erste Bakteriophage eine erste Nucleinsäure umfasst und wobei die Sequenz der ersten Nucleinsäure mindestens teilweise bekannt ist; b) In-Kontakt-Bringen der Zelle mit einem zweiten Bakteriophagen, der einen Antikörper exprimiert, von dem bekannt ist, dass er spezifisch an eine zweite Antigen-tragende Einheit bindet, wobei der zweite Bakteriophage eine zweite Nucleinsäure umfasst und wobei die Sequenz der zweiten Nucleinsäure mindestens teilweise bekannt ist und wobei sich die Sequenz der ersten Nucleinsäure nachweisbar von der Sequenz der zweiten Nucleinsäure unterscheidet; c) Nachweisen der Bindung des ersten Bakteriophagen an die Antigen-tragende Einheit durch Nachweisen der Anwesenheit der ersten Nucleinsäure, wobei das Nachweisen der ersten Nucleinsäure die Anwesenheit der ersten Antigen-tragenden Einheit auf der Zelle nachweist; d) Nachweisen der Bindung des zweiten Bakteriophagen an die Antigen-tragende Einheit durch Nachweisen der Anwesenheit der zweiten Nucleinsäure, wobei das Nachweisen der zweiten Nucleinsäure die Anwesenheit der zweiten Antigen-tragenden Einheit auf der Zelle nachweist; wodurch die Anwesenheit von mindestens zwei unterschiedlichen Antigen-tragenden Einheiten auf der Zelle nachgewiesen wird.
  • Die Erfindung schließt auch ein Verfahren zum Nachweisen der Anwesenheit eines anti-Erythrozyten-Antikörpers in menschlichem Serum ein. Das Verfahren umfasst: a) In-Kontakt-Bringen eines menschlichen Erythrozyten, der mindestens ein menschliches Erythrozyten-Antigen auf der Oberfläche der Zelle exprimiert, mit dem Serum; b) Waschen der Zelle, um alle unspezifisch an die Zelle gebundenen Antikörper zu entfernen; c) In-Kontakt-Bringen der Zelle mit einem Bakteriophagen, der ein anti-Humanglobulin-Reagenz exprimiert, wobei der Bakteriophage eine Nucleinsäure umfasst und wobei die Sequenz der Nucleinsäure mindestens teilweise bekannt ist; d) Denaturieren aller spezifisch an die Zelle gebundenen Bakteriophagen, um die Nucleinsäure freizusetzen, und e) Nachweisen der Nucleinsäure, wobei das Nachweisen der Nucleinsäure die Anwesenheit des anti-Erythrozyten-Antikörpers in dem Serum nachweist.
  • In einer Ausführungsform ist das anti-Humanglobulin-Reagenz aus der Gruppe, bestehend aus einem anti-Mensch-IgG, einem anti-Mensch-IgM, einem gegen menschliche leichte kappa/lambda Kette gerichteten Antikörper, einem Protein A aus Staphylokokken, einem Protein G aus Streptokokken und einem Protein L aus Peptostreptokokken ausgewählt.
  • In einer anderen Ausführungsform umfasst das Verfahren ferner das Amplifizieren der Nucleinsäure vor Schritt (e).
  • In noch einer anderen Ausführungsform ist der Antikörper aus der Gruppe, bestehend aus einem Autoantikörper und einem Alloantikörper ausgewählt.
  • Die Erfindung schließt ein Verfahren zum Nachweisen der Anwesenheit eines anti-Erythrozyten-Autoantikörpers bei einem Menschen ein. Das Verfahren umfasst: a) Erhalten eines Erythrozyten von dem Menschen; b) Waschen der Zelle, um alle unspezifisch an die Zelle gebundenen Antikörper zu entfernen; c) In-Kontakt-Bringen der Zelle mit einem Bakteriophagen, der ein anti-Humanglobulin-Reagenz exprimiert, wobei der Bakteriophage eine Nucleinsäure umfasst und wobei die Sequenz der Nucleinsäure mindestens teilweise bekannt ist; d) Denaturieren aller spezifisch an die Zeile gebundenen Bakteriophagen, um die Nucleinsäure freizusetzen, und e) Nachweisen der Nucleinsäure, wobei das Nachweisen der Nucleinsäure die Anwesenheit des anti-Erythrozyten-Autoantikörpers bei dem Menschen nachweist.
  • In einer Ausführungsform umfasst das Verfahren ferner das Amplifizieren der Nucleinsäure vor Schritt (e).
  • Die Erfindung schließt ein Verfahren zum Nachweisen der Anwesenheit eines Liganden in einer Probe ein. Das Verfahren umfasst: a) In-Kontakt-Bringen einer Zelle mit einem Bakteriophagen, der einen Rezeptor exprimiert, von dem bekannt ist, dass er spezifisch an den Liganden bindet, wobei der Bakteriophage eine Nucleinsäure umfasst und wobei die Sequenz der Nucleinsäure mindestens teilweise bekannt ist; b) Denaturieren aller spezifisch an die Zelle gebundener Bakteriophagen, um die Nucleinsäure freizusetzen, und c) Nachweisen der Nucleinsäure, wobei das Nachweisen der Nucleinsäure die Anwesenheit des Liganden in der Probe nachweist.
  • In einer Ausführungsform liegt der Ligand auf einer Zelle vor.
  • In einer anderen Ausführungsform handelt es sich bei der Probe um eine von einem Menschen erhaltene biologische Probe.
  • In noch einer anderen Ausführungsform handelt es sich bei der biologischen Probe um eine Zellprobe.
  • In einer weiteren Ausführungsform umfasst die Zellprobe einen Erythrozyten und bei dem Liganden handelt es sich um ein Eryhthrozyten-Antigen und ferner handelt es sich bei dem Rezeptor um einen Antikörper.
  • In einer anderen Ausführungsform umfasst das Verfahren ferner das Amplifizieren der Nucleinsäure vor dem Nachweis in Schritt (c).
  • Die Anmeldung offenbart einen Kit zum Nachweisen der Anwesenheit einer Antigen-tragenden Einheit auf einer Zelle. Der Kit umfasst einen Bakteriophagen, der einen Antikörper exprimiert, von dem bekannt ist, dass er spezifisch an die Antigen-tragende Einheit bindet, wobei der Bakteriophage eine Nucleinsäure umfasst und wobei die Sequenz der Nucleinsäure mindestens teilweise bekannt ist. Der Kit umfasst ferner einen Applikator und ein Anleitungsmaterial zur Verwendung des Kits.
  • In einer Ausführungsform handelt es sich bei der Antigen-tragenden Einheit um ein Erythrozyten-Antigen, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus A, B, Rh(D), Rh(C), Rh(c), Rh(E), Rh(e), K, Fya, Fyb, M, N, S, s, Jka und Jkb.
  • In einer anderen Ausführungsform umfasst der Kit ferner eine Molecular Beacon-Sonde, wobei die Nucleinsäuresequenz der Sonde aus einer Sequenz ausgewählt ist, die komplementär zu einer Sequenz ist, die aus der Gruppe, bestehend aus der Sequenz von SEQ ID NO: 3 und der Sequenz von SEQ ID NO: 4 ausgewählt ist.
  • In noch einer anderen Ausführungsform ist die Sequenz der Molecular Beacon-Sonde aus der Gruppe ausgewählt, bestehend aus der Sequenz von SEQ ID NO: 7, der Sequenz von SEQ ID NO: 8, der Sequenz von SEQ ID NO: 9 und der Sequenz von SEQ ID NO: 10.
  • In einer weiteren Ausführungsform umfasst der Kit ferner einen PCR-Primer.
  • In noch einer weiteren Ausführungsform ist die Sequenz des Primers aus der Gruppe ausgewählt, bestehend aus der Sequenz von SEQ ID NO: 1 und der Sequenz von SEQ ID NO: 2.
  • KURZE BESCHREIBUNG DER ABBILDUNGEN
  • Zum Zwecke der Veranschaulichung der Erfindung werden bestimmte Ausführungsformen der Erfindung in den Abbildungen abgebildet. Die Erfindung ist jedoch nicht auf die genauen Anordnungen und Mittel der in den Abbildungen abgebildeten Ausführungsformen beschränkt.
  • Bei 1 handelt es sich um eine diagrammatische Übersicht des technischen Plans, der die Verwendung (A) durch Phagen präsentierter anti-RBC-Antikörper, (B) der Amplifikation von Phagen-DNA und (C) des Nachweises von Phagen-DNA veranschaulicht.
  • Bei 2 handelt es sich um das Diagramm einer schematischen Darstellung von durch Phagen präsentierten menschlichen, monoklonalen anti-B (oben) und anti-Rh(D) (unten) RBC-Antikörpern.
  • Bei 3 handelt es sich um ein Bild, welches das Phänotypisieren von RBCs für die Blutgruppenantikörper B und Rh(D) in einem Multiplex-Phagen-Antikörper-Assay abbildet. Vier mögliche RBC-Phänotypen (positiv oder negativ für das Blutgruppenantigen B und positiv oder negativ für das Rh(D)-Antigen) wurden mit phagenpräsentiertem anti-B allein, anti-Rh(D) allein, anti-B und anti-Rh(D) zusammen oder Puffer inkubiert. Nach dem Wegwaschen von ungebundenem Phagenreagenz wurden die RBCs in anti-M13 Phagen-Antikörper resuspendiert, ein Aliquot der Zellsuspension wurde ent nommen, 200-fach in Wasser verdünnt und 2 Mikroliter der verdünnten Phagen/lysierten RBCs wurden einer PCR unterworfen. Der Rest der in anti-M13 resuspendierten RBC-Proben wurde in Vertiefungen von Mikrotiterplatten gegeben und wie hierin anderweitig beschrieben (z. B. Siegel et al., 1997, J. Immunol. Meth. 206: 73–85) auf Agglutination getestet. Man bemerke, dass eine Agglutination (obere Tafel, Vertiefungen mit großen, vernetzten Zellpellets) wie erwartet nur mit der entsprechenden Kombination von Antikörper/Zellphänotyp stattfindet. Besonders bemerkenswert ist, dass nur die passende Antikörpersequenz nachgewiesen wurde (1600 bp großes Produkt bei RBCs, welche das Blutgruppenantigen B exprimierten; 1000 bp großes Produkt bei RBCs, welche das Rh(D)-Antigen exprimierten) und es gab keinen nachweisbaren Hintergrund (d. h. kein anti-B DNA-Produkt mit RBCs des Typs 0, die keine Antigene der Gruppe A oder B exprimieren, und kein anti-Rh(D) DNA-Produkt wurde mit Rh(D)-negativen Zellen nachgewiesen). Zur PCR-Amplifikation der Inserts war der vorwärts gerichtete Primer ("5-prime LC") folgendermaßen: 5'-AAGACAGCTATCGCGATTG-3' (SEQ ID NO: 1); und der rückwärts gerichtete Primer ("GBACK") war folgendermaßen: 5'-GCCCCCTTATTAGCGTTTGCCATC-3' (SEQ ID NO: 2).
  • 4, welche die 4A und 4B umfasst, bildet ein Diagramm ab, das unterschiedliche Phagemid-Konstrukte für Phagenpartikel, die anti-B exprimieren (4A), und Phagenpartikel, die anti-Rh(D) exprimieren (46), veranschaulicht. Das Diagramm veranschaulicht das Klonieren von Inserts mit einer Größe von etwa 140 Basenpaaren (genauer gesagt, 142 bp) in das anti-B Phagemid ("B140") oder das anti-Rh(D) Phagemid ("D140") stromabwärts von der 20 bp großen Promotorstelle für T7 RNA-Polymerase. Die 142 bp großen Inserts sind identisch bis auf eine interne 33 bp große Region, an die für B oder Rh(D) spezifische Molecular Beacons oder in einem Microarray angeordnete Oligos ("B-Beacon/Oligo" beziehungsweise "D-Beacon/Oligo") hybridisieren. B140 und D140 können durch PCR mit einem identischen Satz von Oligonucleotidprimern ("PCR-F" und "PCR-R") amplifiziert oder unter Verwendung von T7 RNA-Polymerase transkribiert werden. Die Sequenz des "B140"-Inserts ist
    5'-TGCTATGTCACTTCCCCTTGGTTCTCTCATCTGGCCTGGTGCAATAGGCCCTGC ATGCACTGGATGCACTCTATCCCATTCTGCAGCTTCCTCATTGATGGTCTCTTT TAACATTTGCATGGCTGCTTGATGTCCCCCCACT-3' (SEQ ID NO: 3)
    und die Sequenz des "D140" Inserts ist
    5'-TGCTATGTCACTTCCCCTTGGTTCTCTCATCTGGCCTGGTGCAATAGGCCCTGC ATGCACTGGATGCACTCTGTTTTACCTCATTATCCTTCTGCCAGCGCTAGCTTT TAACATTTGCATGGCTGCTTGATGTCCCCCCACT-3' (SEQ ID NO: 4).
  • Der vorwärts gerichtete PCR-Primer ("PCR-F") ist:
    5'-TGCTATGTCACTTCCCCTTGGTTCTCT-3' (SEQ ID NO: 5) und die Sequenz des rückwärts gerichteten PCR-Primers ("PCR-R") ist:
    5-AGTGGGGGGACATCAAGCAGCCATGCAAAT-3' (SEQ ID NO: 6). Die B-Beacon- und
    D-Beacon-Sequenzen sind folgendermaßen, wobei die fluoreszierenden Derivate und die Stamm-Strukturen in Kleinbuchstaben gezeigt werden. Die "B-Beacon" Sequenz ist folgendermaßen:
    6-FAM-gcgagcATCCCATTCTGCAGCTTCCTCATTGATGGTCTCgctcgc-DABCYL (SEQ ID NO: 7. Der "D-Beacon" ist:
    TAMRA-cgagcGTTTTACCTCATTATCCTTCTGCCAGCGCTAGCgctcgc-DABCYL (SEQ ID NO: 8). Die Großbuchstaben in den Beacon-Sequenzen stellen die jeweiligen Sequenzen in B140 und D140 dar, an welche die Beacons sich anlagern. Deshalb sind die Großbuchstaben die Sequenzen der Oligonucleotide, die für den Nachweis des DNA-Arrays verwendet werden. Das heißt, ein B-Oligo ist:
    5'-ATCCCATTCTGCAGCTTCCTCATTGATGGTCTC-3' (SEQ ID NO: 9) und ein "D-Oligo" ist: 5'-GTTTTACCTCATTATCCTTCTGCCAGCGCTAGC-3' (SEQ ID NO: 10).
  • AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • Definitionen
  • Wie hierin verwendet, hat jeder der folgenden Begriffe die Bedeutung, die in diesem Abschnitt mit ihm assoziiert wird.
  • Die Artikel "ein", "einer" und "eine" werden hierin verwendet, um eines oder mehr als eines (d. h. mindestens eines) des grammatikalischen Gegenstandes des Artikels zu bezeichnen. Beispielsweise bedeutet "ein Element" ein Element oder mehr als ein Element.
  • Mit dem Begriff "Antigen-tragende Einheit", wie hierin verwendet, ist ein Molekül gemeint, an das ein Antikörper bindet. Bei der Antigen-tragenden Einheit kann es sich um ein membrangebundenes Protein handeln, das aus der Gruppe, bestehend aus einem Antigen und einem Rezeptor ausgewählt ist. In einer anderen Ausführungsform handelt es sich bei dem membrangebundenen Protein um ein Antigen, wie zum Beispiel ein Erythrozyten-Antigen, wie zum Beispiel das Rh-Antigen. Wenn es sich bei der Antigen-tragenden Einheit um ein Kohlenhydrat handelt, kann es sich um ein auf einem Glykolipid exprimiertes Kohlenhydrat, zum Beispiel ein P-Blutgruppenantigen oder ein anderes Antigen, handeln.
  • Wie hierin verwendet, werden Aminosäuren durch ihren vollständigen Namen, durch den dazu entsprechenden Drei-Buchstaben-Code oder durch den dazu entsprechenden Ein-Buchstaben-Code dargestellt, wie in der folgenden Tabelle angegeben wird.
    Vollständiger Name Drei-Buchstaben-Code Ein-Buchstaben-Code
    Asparaginsäure Asp D
    Glutaminsäure Glu E
    Lysin Lys K
    Arginin Arg R
    Histidin His H
    Tyrosin Tyr Y
    Cystein Cys C
    Asparagin Asn N
    Glutamin Gln Q
    Serin Ser S
    Threonin Thr T
    Glycin Gly G
    Alanin Ala A
    Valin Val V
    Leucin Leu L
    Isoleucin Ile I
    Methionin Met M
    Prolin Pro P
    Phenylalanin Phe F
    Tryptophan Trp W
  • Wie hierin verwendet, bedeutet eine Erkrankung zu "lindern", den Schweregrad von einem oder mehreren Symptomen der Erkrankung zu verringern.
  • "Antisense" bezeichnet insbesondere die Nucleinsäuresequenz des nicht kodierenden Strangs eines doppelsträngigen DNA-Moleküls, das ein Protein kodiert, oder eine Sequenz, die im Wesentlichen zu dem nicht kodierenden Strang homolog ist. Wie hierin definiert, ist eine Antisense-Sequenz zu der Sequenz eines doppelsträngigen DNA-Moleküls, das ein Protein kodiert, komplementär. Es ist nicht notwendig, dass die Antisense-Sequenz nur zu dem kodierenden Anteil des kodierenden Strangs des DNA-Moleküls komplementär ist. Die Antisense-Sequenz kann zu regulatorischen Sequenzen komplementär sein, die auf dem kodierenden Strang eines DNA-Moleküls, das ein Protein kodiert, spezifiziert sind, wobei die regulatorischen Sequenzen die Expression der kodierenden Sequenzen kontrollieren.
  • Die Begriffe "Bakteriophage" und "Phage" werden hierin austauschbar verwendet und bezeichnen Viren, die Bakterien infizieren. Durch die Verwendung des Begriffes "Bakteriophagenbank" oder "Phagenbank", wie hierin verwendet, ist eine Population von bakteriellen Viren gemeint, die heterologe DNA umfassen, d. h. DNA, die durch das bakterielle Virus in der Natur nicht kodiert wird.
  • Mit dem Begriff "Applikator", wie der Begriff hierin verwendet wird, ist jede Vorrichtung gemeint, einschließlich, aber nicht beschränkt auf eine Spritze, eine Pipette und dergleichen, zum Verabreichen des erfindungsgemäßen Bakteriophagen, der einen Rezeptor exprimiert (z. B. ein Antiglobulin-Reagenz, einen Antikörper, einen Anti-Antikörper und dergleichen), einer erfindungsgemäßen Zelle, einer erfindungsgemäßen Probe, von erfindungsgemäßen Primern, einer erfindungsgemäßen Molecular Beacon-Sonde, von erfindungsgemäßen dNTPs, einer erfindungsgemäßen T7 RNA-Polymerase und dergleichen an eine Zelle, eine Probe und dergleichen.
  • "Biologische Probe" oder einfach "Probe", wie dieser Begriff hierin verwendet wird, bedeutet eine Probe, wie zum Beispiel eine, die von einem Tier erhalten wird, aber nicht erhalten werden muss, wobei die Probe auf die Anwesenheit eines biologischen Organismus oder eines Bestandteils davon bewertet werden soll, so dass die Probe verwendet werden kann, um die Anwesenheit, Abwesenheit und/oder den Spiegel eines Antigens oder Liganden von Interesse gemäß den erfindungsgemäßen Verfahren zu bewerten. Eine derartige Probe schließt jede biologische Flüssigkeit (z. B. Blut, Lymphe, Samen, Sputum, Speichel, Phlegma, Tränen und dergleichen), fäkales Material, eine Haarprobe, eine Nagelprobe, eine Gehirnprobe, eine Nierenprobe, eine Darmgewebeprobe, eine Zungengewebeprobe, eine Herzgewebeprobe, eine Milchdrüsengewebeprobe, eine Lungengewebeprobe, eine Fettgewebeprobe, eine Muskelgewebeprobe und jede von einem Tier erhaltene Probe, die auf die Anwesenheit oder Abwesenheit eines Antigens analysiert werden kann, ein, ist aber nicht darauf beschränkt. Ferner kann die Probe eine wässrige Probe (z. B. eine Wasserprobe), wie auch immer erhalten, umfassen, die auf die Anwesenheit eines Organismus oder eines Bestandteils davon bewertet werden soll, wie zum Beispiel eine Trinkwasserprobe vor oder nach irgendeiner Behandlung, in der die Anwesenheit eines biologischen Organismus (z. B. eines Cryptosporidium-Organismus) bewertet wird.
  • Wie hierin verwendet, kann der Begriff "Fragment", wie er auf eine Nucleinsäure angewendet wird, normalerweise mindestens etwa 20 Nucleotide lang sein, vorzugsweise mindestens etwa 30 Nucleotide, üblichererweise von etwa 40 bis etwa 50 Nucleotide, vorzugsweise mindestens etwa 50 bis etwa 80 Nucleotide, noch stärker bevorzugt mindestens etwa 80 bis etwa 90 Nucleotide, noch stärker bevorzugt mindestens etwa 90 bis etwa 100, noch stärker bevorzugt mindestens etwa 100 bis etwa 150 Nucleotide, noch stärker bevorzugt mindestens etwa 150 bis etwa 200, noch stärker bevorzugt mindestens etwa 200 Nucleotide bis etwa 250 Nucleotide, noch stärker bevorzugt mindestens etwa 250 bis etwa 300 Nucleotide, stärker bevorzugt von etwa 300 bis etwa 350 Nucleotide, vorzugsweise mindestens etwa 350 bis etwa 360 Nucleotide, und am meisten bevorzugt hat das Nucleinsäurefragment eine Länge von mehr als etwa 365 Nucleotide.
  • Wie hierin verwendet, kann der Begriff "Fragment", wie er auf ein Polypeptid angewendet wird, normalerweise mindestens etwa 20 Aminosäuren lang sein, vorzugsweise mindestens etwa 30 Aminosäuren, üblichererweise von etwa 40 bis etwa 50 Aminosäuren, vorzugsweise mindestens etwa 50 bis etwa 80 Aminosäuren, noch stärker bevorzugt mindestens etwa 80 Aminosäuren bis etwa 90 Aminosäuren, noch stärker bevorzugt mindestens etwa 90 bis etwa 100, noch stärker bevorzugt mindestens etwa 100 bis etwa 120 Aminosäuren und am meisten bevorzugt hat das Aminosäurefragment eine Länge von mehr als etwa 123 Aminosäuren.
  • Mit dem Begriff "Fab/Phage", wie hierin verwendet, ist ein Phagenpartikel gemeint, das den Fab-Anteil eines Antikörpers exprimiert.
  • Mit dem Begriff "scFv/Phage", wie hierin verwendet, ist ein Phagenpartikel gemeint, das den Fv-Anteil eines Antikörpers als Einzelkette exprimiert.
  • "Phage" oder "Phagenpartikel", wie diese Begriffe hierin verwendet werden, schließt diejenigen ein, die eine Phagen-Nucleinsäure enthalten, die unter anderem einen Antikörper kodiert. Dies liegt daran, wie dem Fachmann ersichtlich sein dürfte, dass die größeren scFv- oder Fab-DNA-Inserts im Gegensatz zur Peptid-Phagen-Präsentation (wobei das Peptid-DNA-Insert klein ist und tatsächlich in die Phagen-DNA kloniert wird) tatsächlich unter anderem in ein Plasmid kloniert werden. Somit umfasst die den Antikörper kodierende Nucleinsäure, z. B. ein Plasmid, wie zum Beispiel, aber nicht beschränkt auf, pComb3, nicht nur einen Plasmid-Replikationsursprung, sondern auch eine Replikationsursprungssequenz eines Phagen (z. B. M13) und eine M13- Verpackungssequenz, so dass, wenn die Nucleinsäure produziert wird, ein Helferphage verwendet werden kann, um die notwendigen Proteine des Phagen (z. B. M13) in trans bereitzustellen, um "phagenähnliche" Partikel herzustellen. Das heißt, diese Partikel ähneln außen Phagen, aber innen enthalten sie Plasmid-DNA (auch als "Phagemid"-DNA bezeichnet). Mit anderen Worten, die Phagemid-DNA muss keine M13-Phagen-proteine kodieren, außer einem Stück des M13-Gens III, fusioniert an die DNA für einen Antikörper oder ein Peptid. Somit sollte selbstverständlich sein, dass die Begriffe "Phage", "Phagenpartikel", "phagenähnliche Partikel" und "Phagemid" hierin austauschbar verwendet werden.
  • Eine "Erkrankung" ist ein Gesundheitszustand eines Tieres, wobei das Tier die Homöostase nicht aufrechterhalten kann und wobei, falls die Erkrankung nicht verbessert wird, sich die Gesundheit des Tieres dann fortgesetzt verschlechtert.
  • Im Gegensatz dazu ist eine "Störung" bei einem Tier ein Gesundheitszustand, bei dem das Tier fähig ist, die Homöostase aufrechtzuerhalten, bei der aber der Gesundheitszustand des Tieres weniger günstig ist, als er in Abwesenheit der Störung wäre. Wenn man eine Störung nicht behandelt, verursacht sie nicht unbedingt eine weitere Verschlechterung des Gesundheitszustands des Tieres.
  • "Homolog", wie hierin verwendet, bezeichnet die Ähnlichkeit der Untereinheitensequenz zwischen zwei polymeren Molekülen, z. B. zwischen zwei Nucleinsäuremolekülen, z. B. zwei DNA-Molekülen oder zwei RNA-Molekülen oder zwischen zwei Polypeptidmolekülen. Wenn eine Untereinheitenposition in beiden Molekülen durch die gleiche Monomer-Untereinheit besetzt wird, z. B. falls eine Position in jedem der beiden DNA-Moleküle mit Adenin besetzt ist, dann sind sie an dieser Position homolog. Die Homologie zwischen zwei Sequenzen ist eine direkte Funktion der Anzahl passender oder homologer Positionen, z. B. falls die Hälfte (z. B. fünf Positionen in einem Polymer mit einer Länge von zehn Untereinheiten) der Positionen in beiden zusammengesetzten Sequenzen homolog sind, dann sind die beiden Sequenzen zu 50% homolog, falls 90% der Positionen, z. B. 9 von 10 passend oder homolog sind, teilen die beiden Sequenzen eine Homologie von 90%. Beispielsweise teilen die DNA-Sequenzen 5'ATTGCC3' und 5'TATGGC3' eine Homologie von 50%.
  • "Anleitungsmaterial", wie dieser Begriff hierin verwendet wird, schließt eine Veröffentlichung, eine Aufzeichnung, ein Diagramm oder jedes andere Ausdrucksmedium ein, das verwendet werden kann, um den Nutzen der erfindungsgemäßen Nucleinsäure, des erfindungsgemäßen Peptids und/oder der erfindungsgemäßen Verbindung im Kit zum Nachweisen der Anwesenheit einer Antigen-tragenden Einheit auf einer Zelle von Interesse und/oder zum Nachweisen eines Autoantikörpers im Serum zu kommuni zieren. Das Anleitungsmaterial des Kits kann zum Beispiel an einem Behälter befestigt sein, welcher die erfindungsgemäße Nucleinsäure, das erfindungsgemäße Peptid und/oder die erfindungsgemäße Verbindung enthält, oder zusammen mit einem Behälter, welcher die Nucleinsäure, das Peptid und/oder die Verbindung enthält, verschickt werden. Alternativ dazu kann das Anleitungsmaterial getrennt von dem Behälter mit der Absicht verschickt werden, dass der Empfänger das Anleitungsmaterial und die Verbindung gemeinsam verwendet.
  • Eine "isolierte Nucleinsäure" bezeichnet ein Nucleinsäuresegment oder -fragment, das von Sequenzen getrennt worden ist, die es in einem in der Natur vorkommenden Zustand flankieren, z. B. ein DNA-Fragment, das von den Sequenzen entfernt worden ist, die normalerweise neben dem Fragment liegen, z. B. die neben dem Fragment liegenden Sequenzen in einem Genom, in dem es normalerweise vorkommt. Der Begriff lässt sich auch auf Nucleinsäuren anwenden, die im Wesentlichen frei von anderen Bestandteilen, welche die Nucleinsäure in der Natur begleiten, z. B. RNA oder DNA oder Proteine, die sie in der Natur in der Zelle begleiten, gereinigt worden sind. Der Begriff schließt deshalb zum Beispiel eine rekombinante DNA ein, die in einen Vektor, in ein autonom replizierendes Plasmid oder einen Virus oder in die genomische DNA eines Prokaryoten oder Eukaryoten eingefügt ist oder die als getrenntes Molekül (z. B. als cDNA oder genomisches oder cDNA-Fragment, die/das durch PCR oder Restriktionsenzymverdau hergestellt worden ist) unabhängig von anderen Sequenzen existiert. Er schließt auch eine rekombinante DNA ein, die Teil eines Hybridgens ist, das eine zusätzliche Polypeptidsequenz kodiert.
  • "Rekombinantes Polynucleotid" bezeichnet ein Polynucleotid mit Sequenzen, die in der Natur nicht miteinander verbunden sind. Ein amplifiziertes oder zusammengesetztes rekombinantes Polynucleotid kann in einem geeigneten Vektor eingeschlossen sein und der Vektor kann verwendet werden, um eine geeignete Wirtszelle zu transformieren.
  • Ein rekombinantes Polynucleotid kann auch einer nicht kodierenden Funktion (z. B. Promotor, Replikationsursprung, Ribosomenbindungsstelle, usw.) dienen.
  • Eine Wirtszelle, die ein rekombinantes Polynucleotid umfasst, wird als "rekombinante Wirtszelle" bezeichnet. Ein Gen, das in einer rekombinanten Wirtszelle exprimiert wird, wobei das Gen ein rekombinantes Polynucleotid umfasst, produziert ein "rekombinantes Polypeptid".
  • Ein "rekombinantes Polypeptid" ist eines, das nach Expression eines rekombinanten Polynucleotids produziert wird.
  • Ein "Vektor" ist eine Materialzusammensetzung, die eine isolierte Nucleinsäure umfasst und die verwendet werden kann, um die isolierte Nucleinsäure an das Innere einer Zelle abzugeben. Zahlreiche Vektoren sind auf dem Fachgebiet bekannt, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, lineare Polynucleotide, mit ionischen oder amphiphilen Verbindungen assoziierte Polynucleotide, Plasmide und Viren. Somit schließt der Begriff "Vektor" ein autonom replizierendes Plasmid oder einen Virus ein. Der Begriff sollte auch so ausgelegt werden, dass er Verbindungen einschließt, bei denen es sich nicht um ein Plasmid und nicht um einen Virus handelt, welche die Übertragung von Nucleinsäure in Zellen erleichtern, wie zum Beispiel Polylysinverbindungen, Liposomen und dergleichen. Beispiele für Virusvektoren schließen Adenovirusvektoren, Adeno-assoziierte Virusvektoren, Retrovirusvektoren und dergleichen ein, sind aber nicht darauf beschränkt.
  • "Expressionsvektor" bezeichnet einen Vektor, der ein rekombinantes Polynucleotid umfasst, das Expressionskontrollsequenzen umfasst, die mit einer zu exprimierenden Nucleotidsequenz funktionell verbunden sind. Ein Expressionsvektor umfasst ausreichend cis-wirkende Elemente zur Expression; andere Elemente zur Expression können durch die Wirtszelle oder in einem in-vitro-Expressionssystem zur Verfügung gestellt werden. Expressionsvektoren schließen alle diejenigen ein, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, wie zum Beispiel Cosmide, Plasmide (z. B. nackt oder in Liposomen enthalten) und Viren, die das rekombinante Polynucleotid einschließen.
  • Mit dem Beschreiben von zwei Polynucleotiden als "funktionell verbunden" ist gemeint, dass eine einzelsträngige oder doppelsträngige Nucleinsäureeinheit die beiden Polynucleotide umfasst, die innerhalb der Nucleinsäureeinheit auf eine solche Weise angeordnet sind, dass mindestens eines der beiden Polynucleotide fähig ist, eine physiologische Wirkung auszuüben, durch die es in Bezug auf das andere gekennzeichnet ist. Beispielsweise ist ein Promotor, der mit der kodierenden Region eines Gens funktionell verbunden ist, fähig, die Transkription der kodierenden Region zu fördern.
  • Wenn die Nucleinsäure, welche das gewünschte Protein kodiert, ferner eine Promotorsequenz/regulatorische Sequenz umfasst, ist die Promotorsequenz/regulatorische Sequenz vorzugsweise am 5'-Ende der das gewünschte Protein kodierenden Sequenz angebracht, so dass sie die Expression des gewünschten Proteins in einer Zelle antreibt. Zusammen umfassen die das gewünschte Protein kodierende Nucleinsäure und ihre Promotorsequenz/regulatorische Sequenz ein "Transgen".
  • Wie hierin verwendet, bedeutet der Begriff "Promotorsequenz/regulatorische Sequenz" eine Nucleinsäuresequenz, die zur Expression eines Genprodukts erforderlich ist, das mit der Promotorsequenz/regulatorischen Sequenz funktionell verbunden ist. In manchen Fällen kann es sich bei dieser Sequenz um die Kern-Promotorsequenz handeln und in anderen Fällen kann diese Sequenz eine Enhancersequenz und andere regulatorische Elemente enthalten, die zur Expression des Genprodukts erforderlich sind. Bei der Promotorsequenz/regulatorischen Sequenz kann es sich zum Beispiel um eine handeln, die das Genprodukt in einer gewebespezifischen Weise exprimiert.
  • Ein "konstitutiver" Promotor ist eine Nucleotidsequenz, die, wenn sie mit einer Polynucleotidsequenz funktionell verbunden ist, die ein Genprodukt kodiert oder spezifiziert, verursacht, dass das Genprodukt in einer lebenden menschlichen Zelle unter den meisten oder allen physiologischen Bedingungen der Zelle produziert wird.
  • Ein "induzierbarer" Promotor ist eine Nucleotidsequenz, die, wenn sie mit einem Polynucleotid funktionell verbunden ist, das ein Genprodukt kodiert oder spezifiziert, verursacht, dass das Genprodukt in einer lebenden menschlichen Zelle im Wesentlichen nur produziert wird, wenn ein Induktor, der dem Promotor entspricht, in der Zelle vorliegt.
  • Ein "gewebespezifischer" Promotor ist eine Nucleotidsequenz, die, wenn sie mit einem Polynucleotid funktionell verbunden ist, das ein Genprodukt kodiert oder spezifiziert, verursacht, dass das Genprodukt in einer lebenden menschlichen Zelle im Wesentlichen nur produziert wird, falls es sich bei der Zelle um eine Zelle des dem Promotor entsprechenden Gewebetyps handelt.
  • Eine "Polyadenylierungssequenz" ist eine Polynucleotidsequenz, welche die Addition eines polyA-Schwanzes an eine transkribierte Messenger-RNA-Sequenz steuert.
  • Ein "Polynucleotid" bedeutet einen Einzelstrang oder parallele und antiparallele Stränge einer Nucleinsäure. Somit kann es sich bei einem Polynucleotid entweder um eine einzelsträngige oder eine doppelsträngige Nucleinsäure handeln.
  • Der Begriff "Nucleinsäure" bezeichnet normalerweise große Polynucleotide.
  • Der Begriff "Oligonucleotid" bezeichnet normalerweise kurze Polynucleotide, im Allgemeinen nicht länger als etwa 50 Nucleotide. Es ist selbstverständlich, dass, wenn eine Nucleotidsequenz durch eine DNA-Sequenz dargestellt wird (d. h. A, T, G, C) dies auch eine RNA-Sequenz einschließt (d. h. A, U, G, C), in der "U" "T" ersetzt.
  • Im Zusammenhang der vorliegenden Erfindung werden die folgenden Abkürzungen für die häufig vorkommenden Nucleinsäurebasen verwendet. "A" bezeichnet Adenosin, "C" bezeichnet Cytidin, "G" bezeichnet Guanosin, "T" bezeichnet Thymidin und "U" bezeichnet Uridin.
  • Eine herkömmliche Schreibweise wird hierin verwendet, um Polynucleotidsequenzen zu beschreiben: das linke Ende einer einzelsträngigen Polynucleotidsequenz ist das 5'-Ende; die linke Richtung einer doppelsträngigen Polynucleotidsequenz wird als die 5'-Richtung bezeichnet.
  • Die Richtung der Addition von Nucleotiden an naszierende RNA-Transkripte von 5' nach 3' wird als Transkriptionsrichtung bezeichnet. Der DNA-Strang mit der gleichen Sequenz wie eine mRNA wird als der "kodierende Strang" bezeichnet; Sequenzen auf dem DNA-Strang, die 5' von einem Referenzpunkt auf der DNA liegen, werden als "stromaufwärts liegende Sequenzen" bezeichnet; Sequenzen auf dem DNA-Strang, die sich 3' von einem Referenzpunkt auf der DNA befinden, werden als "stromabwärts liegende Sequenzen" bezeichnet.
  • Ein "Anteil" eines Polynucleotids bedeutet mindestens etwa zwanzig aufeinanderfolgende Nucleotidreste des Polynucleotids. Es ist selbstverständlich, dass ein Anteil eines Polynucleotids jeden Nucleotidrest des Polynucleotids einschließen kann.
  • "Primer" bezeichnet ein Polynucleotid, das fähig ist, spezifisch an eine bestimmte Polynucleotidmatrize zu hybridisieren und einen Initiationspunkt für die Synthese eines komplementären Polynucleotids bereitzustellen. Eine derartige Synthese findet statt, wenn der Polynucleotidprimer unter Bedingungen gebracht wird, bei welchen Synthese induziert wird, d. h. in Anwesenheit von Nucleotiden, einer komplementären Polynucleotidmatrize und einem Mittel zur Polymerisation, wie zum Beispiel DNA-Polymerase. Ein Primer ist normalerweise einzelsträngig, kann aber doppelsträngig sein. Bei Primern handelt es sich normalerweise um Desoxyribonucleinsäuren, aber eine große Vielfalt synthetischer und in der Natur vorkommender Primer sind für viele Anwendungen nützlich. Ein Primer ist zu der Matrize komplementär, an die er zu hybridisieren vorgesehen ist, um als Initiationsstelle der Synthese zu dienen, muss aber nicht die genaue Sequenz der Matrize widerspiegeln. In einem derartigen Fall hängt die spezifische Hybridisierung des Primers an die Matrize von der Stringenz der Hybridisierungsbedingungen ab. Primer können z. B. mit chromogenen, radioaktiven oder fluoreszierenden Einheiten markiert und als nachweisbare Einheiten verwendet werden.
  • "Sonde" bezeichnet ein Polynucleotid, das fähig ist, spezifisch an eine bestimmte Sequenz eines anderen Polynucleotids zu hybridisieren. Eine Sonde hybridisiert spezifisch an ein komplementäres Ziel-Polynucleotid, muss aber nicht die genaue komplementäre Sequenz der Matrize widerspiegeln. In einem derartigen Fall hängt die spezifische Hybridisierung der Sonde an das Ziel von der Stringenz der Hybridisierungsbedingungen ab. Sonden können z. B. mit chromogenen, radioaktiven oder fluoreszierenden Einheiten markiert und als nachweisbare Einheiten verwendet werden.
  • "Rekombinantes Polynucleotid" bezeichnet ein Polynucleotid mit Sequenzen, die in der Natur nicht miteinander verbunden sind. Ein amplifiziertes oder zusammengesetztes rekombinantes Polynucleotid kann in einem geeigneten Vektor eingeschlossen sein, und der Vektor kann verwendet werden, um eine geeignete Wirtszelle zu transformieren.
  • Ein rekombinantes Polynucleotid kann auch einer nicht kodierenden Funktion (z. B. Promotor, Replikationsursprung, Ribosomenbindungsstelle) dienen.
  • Bei einem "rekombinanten Polypeptid" handelt es sich um eines, das bei der Expression eines rekombinanten Polynucleotids produziert wird.
  • "Polypeptid" bezeichnet ein Polymer, das aus Aminosäureresten, verwandten in der Natur vorkommenden Strukturvarianten und synthetischen, in der Natur nicht vorkommenden Analoga davon besteht, die durch Peptidbindungen, verwandte in der Natur vorkommende Strukturvarianten und synthetische in der Natur nicht vorkommende Analoga davon verbunden sind. Synthetische Polypeptide können zum Beispiel unter Verwendung eines automatisierten Polypeptidsynthesegerätes synthetisiert werden.
  • Der Begriff "Protein" bezeichnet normalerweise große Polypeptide.
  • Der Begriff "Peptid" bezeichnet normalerweise kurze Polypeptide.
  • Eine herkömmliche Schreibweise wird hierin verwendet, um Polypeptidsequenzen darzustellen: das linke Ende einer Polypeptidsequenz ist der Amino-Terminus; das rechte Ende einer Polypeptidsequenz ist der Carboxyl-Terminus.
  • Wie hierin verwendet, bedeutet der Begriff "Reportergen" ein Gen, dessen Expression unter Verwendung eines bekannten Verfahrens nachgewiesen werden kann. Beispielsweise kann das lacZ-Gen von Escherichia coli als Reportergen in einem Medium verwendet werden, weil die Expression des lacZ-Gens unter Verwendung bekannter Verfahren durch Zugeben eines chromogenen Substrats, z. B. o-Nitrophenyl-β-D-galactopyranosid, zu dem Medium nachgewiesen werden kann (Gerhardt et al., Hrsg., 1994, Methods for General and Molecular Bacteriology, American Society for Microbiology, Washington, D. C., S. 574).
  • Bei einem "Rezeptor" handelt es sich um eine Verbindung, die spezifisch an einen Liganden bindet. Dieser Begriff schließt ein Protein, wie zum Beispiel einen Antikörper, ein Antiglobulin-Reagenz und dergleichen ein, das, wenn es durch einen Phagen exprimiert und mit seinem zugehörigen Liganden in Kontakt gebracht wird, spezifisch daran bindet.
  • Der Begriff "Ligand", wie er hierin verwendet wird, bezeichnet jedes Protein oder alle Proteine, die mit einer Rezeptorbindungsdomäne in Wechselwirkung treten können und somit eine "Bindungsaffinität" für eine derartige Domäne aufweisen. Liganden können löslich oder membrangebunden sein und es kann sich bei ihnen um ein in der Natur vorkommendes oder synthetisches oder rekombinant hergestelltes Protein handeln. Der "Ligand" kann auch ein Molekül sein, bei dem es sich nicht um ein Protein handelt, das als Ligand wirkt, wenn es mit der Rezeptorbindungsdomäne in Wechselwirkung tritt. Wechselwirkungen zwischen dem Liganden und der Rezeptorbindungsdomäne schlie ßen alle kovalenten oder nicht kovalenten Wechselwirkungen ein, sind aber nicht darauf beschränkt. Bei der Rezeptorbindungsdomäne handelt es sich um jeden Bereich des Rezeptormoleküls, der direkt oder indirekt mit dem Liganden in Wechselwirkung tritt.
  • Mit dem Begriff "bindet spezifisch", wie er hierin verwendet wird, ist ein Molekül gemeint, z. B. ein Protein, eine Nucleinsäure, ein Antikörper, eine Verbindung und dergleichen, das ein spezifisches Molekül erkennt und daran bindet, aber andere Moleküle in einer Probe im Wesentlichen nicht erkennt oder an sie bindet. Zum Beispiel ein Antikörper, der einen zugehörigen Liganden (d. h. eine auf einer Zelle vorliegende Antigen-tragende Einheit) erkennt und an ihn bindet, aber andere Moleküle in der Probe im Wesentlichen nicht erkennt oder an sie bindet.
  • Eine Erkrankung zu "behandeln", wie der Begriff hierin verwendet wird, bedeutet, die Häufigkeit der Erkrankung oder Störung zu verringern, wobei die Häufigkeit, mit der ein Symptom des einen oder der mehreren Symptome der Erkrankung oder Störung durch ein Tier erlebt wird, verringert wird.
  • Beschreibung
  • Die Erfindung betrifft Verfahren zum Nachweisen der Anwesenheit eines Moleküls von Interesse auf einer Zelle oder in einer biologischen Probe. Normalerweise wird ein Erythrozyten-Antigen, das auf der Oberfläche einer RBC exprimiert wird, nachgewiesen, aber die Erfindung umfasst unter vielen anderen Verwendungen das Nachweisen der Anwesenheit zahlreicher Antigene von Interesse auf einer großen Fülle von Zellen, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Erythrozyten und Leukozyten, sowie Thrombozyten und Zellen, die für eine Transplantationstherapie verwendet werden, und die Identifizierung von Antigenen auf Zellen für forensische Zwecke (z. B. Haar-, Haut-, Nagel-, Sperma-, Speichel- und andere Zellen).
  • Die Erfindung betrifft auch den Nachweis eines Antigens von Interesse in einer biologischen Probe. Eine derartige Probe schließt eine wässrige Probe ein, um die Anwesenheit irgendeines Organismus oder eines Bestandteils davon in der Probe nachzuweisen.
  • Die Erfindung betrifft die Verwendung eines Antikörpers, der für ein durch einen Phagen (z. B. einen M13-, T7-, Lambda-, eukaryotischen Phagen und dergleichen) präsentiertes bekanntes Antigen spezifisch ist, zum Nachweisen der Anwesenheit des Antigens auf einer Zelle oder in einer biologischen Probe. Genauer gesagt werden Phagen, die spezifisch an eine Zelle gebunden sind, durch Analysieren auf die Nucleinsäure hin nachgewiesen, die in dem Phagenpartikel enthalten ist. Das heißt, die Nucleinsäuresequenz der in dem Phagemid enthaltenen Nucleinsäure ist mindestens teilweise bekannt, so dass Techniken zum Nachweisen von Nucleinsäuren verwendet werden können, um die Anwesenheit der Sequenz zu bewerten, wodurch in einem neuen Verfahren, das hierin als "Phänotypisieren durch Genotypisieren mit Reagenz" bezeichnet wird, das Antigen nachgewiesen wird.
  • Im Wesentlichen wirkt die Bakteriophagen-Nucleinsäure wie ein Marker zum Nachweisen eines Antigens, welches von dem durch den Phagen kodierten Antikörper erkannt wird. Auf diese Weise können die hochsensitiven und im Durchmustern mit hohem Durchsatz bestehenden Eigenschaften von Nachweisverfahren für Nucleinsäuren auf den immunologischen Nachweis eines Antigens angewendet werden, wodurch die Vorteile beider Technologien kombiniert werden. Die entscheidenden Merkmale dieses Ansatzes sind, dass die Spezifität des durch den Bakteriophagen präsentierten Antikörpers und die Nucleinsäuresequenz, oder ein Anteil davon, der im Phagen enthaltenen DNA, beide bekannt sein müssen. Beruhend auf der hierin bereitgestellten Offenbarung dürfte es selbstverständlich sein, dass die genaue Art des Antigens, sei es ein Protein, Kohlenhydrat, Lipid oder jede andere Verbindung, das/die durch den Antikörper erkannt wird, nicht bekannt sein muss, und dass nur die Spezifität des Antikörpers für dieses Antigen bekannt sein soll. Zum Beispiel kann der Antikörper, wo von einem Antikörper bekannt ist, dass er an eine Krebszelle (oder jede mit einer Erkrankung assoziierte Zelle) bindet und diese identifiziert, aber nicht an eine ansonsten identische Zelle bindet, die nicht kanzerös (oder mit einer Erkrankung assoziiert) ist, verwendet werden, um einen Krebs (oder einen Erkrankungszustand) unter Verwendung der erfindungsgemäßen Verfahren nachzuweisen. Das heißt, die Antikörperbindung an eine Testzelle oder eine biologische Probe kann durch Nachweisen der im Phagenpartikel vorliegenden Nucleinsäure, welche den Antikörper-Anteil kodiert, nachgewiesen werden, wodurch eine Krebszelle nachgewiesen wird, ohne dass man die genaue Art des auf der Krebszelle (oder der mit einer Erkrankung assozierten Zelle) vorliegenden Antigens wissen muss.
  • Die Erfindung betrifft ferner den Nachweis mehrerer Antigene von Interesse auf einer Zelle in einem Assay in einem einzigen Reagenzgläschen. Das heißt, Bakteriophagen, die Antikörper kodieren, welche für mindestens zwei unterschiedliche Antigene spezifisch sind, können verwendet werden, um diese Antigene auf einer Zelle nachzuweisen. Genauer gesagt kodiert jeder Phage einen Antikörper, der spezifisch an ein bekanntes Antigen bindet, und jeder Phage kodiert einen Antikörper, der ein anderes Antigen oder eine andere Antigen-Einheit erkennt. Ferner enthält jeder Phage ein DNA-Molekül, welches eine Sequenz umfasst, die bekannt ist, wobei sich die Sequenz zwischen den Phagen unterscheidet. Unter Verwendung dieses Ansatzes kann die Anwesenheit einer Vielzahl von Antigenen von Interesse leicht beurteilt werden, indem man einfach einen Satz von Phagen verwendet, von denen jeder einen Antikörper präsentiert, der für eines der Antigene spezifisch ist, wobei das Nucleinsäuremolekül jedes Phagen eine bekannte Sequenz umfasst, die von der jedes anderen Phagen in dem Satz unterscheidbar ist. Auf diese Weise kann unter Verwendung eines einzelnen Reaktionsschrittes auf mehrere Antigene analysiert werden. Dieses "Vervielfältigungs"-Verfahren ist unter Verwendung herkömmlicher Verfahren, welche die Bindung antigenspezifischer Antikörper an eine Zelle identifizieren, nicht möglich, da der sekundäre anti-Antikörper-Antikörper, der verwendet wird, um die antigenspezifischen Antikörper nachzuweisen, normalerweise mit allen antigenbindenen Antikörpern kreuzreagiert, oder es kann nicht bestimmt werden, an welchen antigenspezifischen Antikörper der zweite Antikörper gebunden ist. Im Falle herkömmlicher Verfahren zum Phänotypisieren von Erythrozyten, bei denen Antikörper den entsprechenden Zelltyp direkt agglutinieren (d. h. es wird kein sekundärer Antikörper benötigt), wäre es gleichermaßen, falls sie zusammen gemischt würden, nicht möglich zu bestimmen, welcher antigenspezifische Antikörper für die Agglutination verantwortich war. Dieser Multiplex-Ansatz ermöglicht den schnellen, gleichzeitigen Nachweis einer Vielzahl von Antigenen unter Verwendung nur einer einzigen Probe.
  • Ferner betrifft die Erfindung die Identifizierung von anti-Erythrozyten-Antikörpern im Serum. Das heißt, ein Satz von RBCs, die verschiedene bekannte Antigene auf ihren Oberflächen exprimieren, kann mit einer Serumprobe in Kontakt gebracht werden. Reagenz-RBCs, die charakterisierte Antigene exprimieren, sind im Handel erhältlich (z. B. Johnson & Johnson, Raritan, NJ). Die Zellen werden dann gewaschen, um alle Antikörper zu entfernen, die unspezifisch an den Zellen haften, und die Zellen werden dann mit Bakteriophagen in Kontakt gebracht, die ein Antiglobulin-Reagenz präsentieren.
  • Zusätzlich können in einem Patienten vorliegende Autoantikörper nachgewiesen werden, indem RBCs von dem Patienten erhalten werden, sie gewaschen werden, um alle Antikörper und/oder jedes Komplement zu entfernen, die unspezifisch an die Zellen gebunden sind, und die Zellen können dann mit einem Phagen, der ein anti-Humanglobulin-Reagenz exprimiert, in Kontakt gebracht werden. Somit kann durch das Nachweisen einer durch den Phagen enthaltenen Nucleinsäuresequenz die Anwesenheit eines Autoantikörpers auf den Zellen des Patienten sowie die Anwesenheit von auf den Zellen abgelagertem Komplement auf Grund des Autoantikörpers gemäß den neuen, hierin offenbarten Verfahren des "Phänotypisierens durch Genotypisieren mit Reagenz" leicht nachgewiesen werden.
  • Das Durchmustern und Identifizieren von Serumantikörpern unter Verwendung von Reagenz-Erythrozyten, die bekannte Antigene präsentieren, wird auf dem Fachgebiet herkömmlich als "Antiglobulintest" bezeichnet, ein derartiger Test ist eine Coombs-Reaktion. Diese Assays weisen die Anwesenheit eines Antikörpers oder des durch ihn abgelagerten Komplements auf einer Zelle von Interesse nach. Weil das Komplement, obwohl es sich nicht um einen Antikörper handelt, als "Globulin" betrachtet wird, werden die Reagenzien, die verwendet werden, um Antikörper und/oder Komplement nachzuweisen, auf dem Fachgebiet als "Antiglobulin"-Reagenzien bezeichnet.
  • Diese Assays, die Antikörper und/oder Komplementfragmente (z. B. C3d) auf Patienten-Erythrozyten nachweisen, um anti-Erythrozyten-Autoantikörper oder das Komplement, das sie ablagern, nachzuweisen, und auch um Alloantikörper von Patienten oder das Komplement, das sie ablagern, nachzuweisen, können verwendet werden, um Autoantikörper, Alloantikörper oder beide zu identifizieren, die autologe Zellen oder transfundierte Zellen bei einer hämolytischen Transfusionsreaktion zerstören könnten.
  • Wie hierin verwendet, handelt es sich einem "Antiglobulin-Reagenz" um ein Reagenz, das Antikörper, Komplement oder beides nachweisen kann. Somit schließt die vorliegende Erfindung, wie einem mit den hierin bereitgestellten Lehren ausgestatteten Fachmann selbstverständlich sein dürfte, Antiglobulin-Reagenzien ein, umfassend unter anderem z. B. anti-Antikörper-Antikörper, anti-Komplement-Antikörper, Protein A, Protein G oder Protein L, d. h. die Erfindung umfasst die Expression einer großen Fülle von Reagenzien, von denen es für den Fachmann selbstverständlich sein dürfte, dass sie spezifisch an ein Globulin, wie zum Beispiel einen Antikörper, ein Komplement und dergleichen, binden würden, durch Phagen. Das heißt, die vorliegende Erfindung schließt die Verwendung eines Antiglobulin-Reagenz ein, das durch einen Phagen exprimiert wird, einschließlich, aber nicht beschränkt auf einen "anti-Antikörper-Antikörper", ein anti-Komplement und jedes Reagenz, von dem bekannt ist, dass es an ein Globulin bindet (z. B. ein Antikörper, Komplement und dergleichen). Zusätzlich sind Phagen, die Protein A oder eine immunglobulinbindende Domäne davon exprimieren, früher beschrieben worden (z. B. Djojonegoro et al., 1994, Bio/Technol. 12: 169–172). Derartige, ein Antiglobulin-Reagenz exprimierende Phagen können in den hierin offenbarten Verfahren verwendet werden, wie einem mit den hierin bereitgestellten Lehren ausgerüsteten Fachmann selbstverständlich sein dürfte.
  • Die Erfindung betrifft das Identifizieren von Autoantikörpern in einer von einem Patienten erhaltenen Serumprobe oder von Autoantikörpern oder Komplementfragmenten, die in vivo auf den Zellen eines Patienten vorher abgelagert wurden, beides Kennzeichen einer Erkrankung, wie zum Beispiel, aber nicht beschränkt auf die autoimmunhämolytische Anämie. Das heißt, von dem Patienten erhaltenes Serum wird mit einem Aliquot von Reagenz-RBCs in Kontakt gebracht, wie zum Beispiel solchen, die im Handel erhältlich sind. RBC-Autoantikörper binden an häufige Antigene, die auf im Wesentlichen allen Erythrozyten vorliegen, nicht nur denen des Patienten. Somit kann dem Patienten kein Blut von einem anderen Menschen transfundiert werden, da die im Patientenserum vorliegenden Autoantikörper auch mit den Spender-RBCs reagieren. Weil die RBCs des Patienten schon mit den Autoantikörpern überzogen sind, können diejenigen Autoantikörper, die schon von der Bindung in vivo her auf den Zellen sind, gemäß den erfindungsgemäßen Verfahren nachgewiesen werden, indem die Zellen unter Verwendung eines auf einem Phagen exprimierten anti-Humanglobulin-Reagenz direkt bewertet werden. Alternativ dazu wird das Nachweisen von Autoantikörpern auf die gleiche Weise durchgeführt wie der Nachweis von Alloantikörpern – durch In-Kontakt-Bringen des Serums des Patienten mit Reagenz-Erythrozyten. Im Falle von Autoantikörpern binden nur bestimmte Reagenz-RBCs an die Antikörper, und durch Kennen des genauen Phänotyps dieser Zellen wird die Antigenspezifität identifiziert. Im Falle von Alloantikörpern binden normalerweise alle Reagenz-Erythrozyten an die Antikörper, weil die Autoantigene auf allen Zellen vorliegen. Jeder spezifisch an die RBCs gebundene Antikörper wird dann gemäß den erfindungsgemäßen Verfahren nachgewiesen, wie zum Beispiel, wie ausführlicher an anderer Stelle hierin offenbart wird, durch In-Kontakt-Bringen der Zellen mit einem Phagen, der ein Antiglobulin-Reagenz exprimiert und Nachweisen der Bindung des Phagen an die Zellen durch Nachweisen einer durch den Phagen enthaltenen Nucleinsäure, d. h. durch Durchführen von "Phänotypisieren durch Genotypisieren mit Reagenz" gemäß den erfindungsgemäßen Verfahren. Auf diese Weise können in menschlichem Serum vorliegende Autoantikörper unter Verwendung der hierin offenbarten Verfahren analog zu dem herkömmlichen "indirekten Antiglobulintest" leicht nachgewiesen werden. Darüberhinaus kann man, durch In-Kontakt-Bringen von RBCs eines Patienten mit Antiglobulin-exprimierenden Phagenpartikeln und Nachweisen der Bindung der Phagen an die Zellen durch Nachweisen einer durch die Phagen enthaltenen Nucleinsäure, die Anwesenheit von in vivo abgelagerten autologen Antikörpern und/oder Komplementfragmenten auf den RBCs des Patienten nachweisen. Dieser Assay ist dem herkömmlichen "direkten Antiglobulintest" analog.
  • Ferner betrifft die Erfindung das Durchführen von Kompatibilitätstests zwischen Patientenserum und Erythrozyten aus potenziellen Bluteinheiten, die dem Patienten transfundiert werden sollen (d. h. einer "Kreuzprobe" von Patient und Spender). Das heißt, ein Aliquot von RBCs von einer potenziellen Spender-Bluteinheit kann mit einer Serumprobe eines potenziellen Transfusionsempfängers in Kontakt gebracht werden.
  • Die Zellen werden dann gewaschen, um alle unspezifisch an den Zellen haftenden Antikörper zu entfernen, und die Zellen werden dann mit Bakteriophagen in Kontakt gebracht, die ein Antiglobulin-Reagenz präsentieren. Somit stellt die vorliegende Erfindung Verfahren zum Nachweisen eines Alloantikörpers bei einem Patienten bereit, dem Blut übertragen werden soll, wodurch eine korrekte Kreuzprobe von Patient und Spender ermöglicht wird, um eine nicht kompatible Transfusion zu verhindern.
  • I. Verfahren
  • A. Verfahren zum Nachweisen eines Antigens
  • Die Erfindung schließt ein Verfahren zum Nachweisen der Anwesenheit einer Antigen-tragenden Einheit auf einer Zelle ein. Das Verfahren umfasst das In-Kontakt-Bringen einer Zelle mit einem Bakteriophagen, der einen Antikörper exprimiert, von dem bekannt ist, dass er spezifisch an die Antigen-tragende Einheit bindet, wenn sie auf einer Zelle vorliegt. Derartige durch Phagen präsentierte Antikörper sowie Verfahren zu ihrer Herstellung sind auf dem Fachgebiet wohlbekannt und werden unter anderem in den US-Patenten Nr. 5,876,925 , Nr. 5,985,543 und Nr. 6,255,455 , alle an Siegel, beschrieben. Diese Antikörper-präsentierenden Bakteriophagen werden hierin durch Phagen beispielhaft angegeben, die anti-Rh(D)- und anti-B-spezifische Antikörper präsentieren. Dem Fachmann dürfte jedoch auf Grund der hierin bereitgestellten Offenbarung selbstverständlich sein, dass die Erfindung nicht auf diese oder irgendwelche anderen bestimmten Antikörper, die auf den spezifischen, hierin offenbarten Bakteriophagen präsentiert werden, beschränkt ist. Stattdessen können die durch die Phagen präsentierten Antikörper für jede Zellkomponente spezifisch sein und Techniken zur Herstellung durch Phagen präsentierter Antikörper gegen Antigene von Interesse sind auf dem Fachgebiet wohlbekannt und werden durch die vorliegende Erfindung umfasst.
  • Die Verfahren zum Herstellen einer Bakteriophagenbank, die heterologe DNA umfasst, sind auf dem Fachgebiet wohlbekannt und werden hierin beschrieben, sowie zum Beispiel in Sambrook et al., vorstehend. Bakteriophagen, die einen gewünschten Antikörper kodieren, können so erzeugt werden, dass das Antikörperprotein auf deren Oberfläche auf eine solche Weise präsentiert wird, dass es zur Bindung an das ihm entsprechende Bindungsprotein, z. B. das Antigen, gegen welches der Antikörper gerichtet ist, zur Verfügung steht. Somit binden die Bakteriophagen, wenn Bakteriophagen, die einen spezifischen Antikörper exprimieren, in Anwesenheit einer Zelle inkubiert werden, die das entsprechende Antigen exprimiert, an die Zelle. Bakteriophagen, die den Antikörper nicht exprimieren, binden nicht an die Zelle. Derartige Techniken zur "Anreicherung" ("Panning") sind auf dem Fachgebiet wohlbekannt und werden zum Beispiel in Wright et al. (vorstehend) beschrieben.
  • Verfahren wie zum Beispiel die vorstehend beschriebenen sind für die Herstellung menschlicher Antikörper unter Verwendung einer M13-Bakteriophagen-Präsentation entwickelt worden (Burton et al., 1994, Adv. Immunol. 57: 191–280). Verfahren, die mit der Herstellung derartiger Präsentationsbanken und deren Durchmusterung zusammenhängen, werden im US-Patent Nr. 6,255,455 an Siegel dargelegt. Im Wesentlichen wird eine cDNA-Bank aus mRNA erzeugt, die von einer Population Antikörper-produzierender Zellen gewonnen wird. Die mRNA kodiert umgelagerte Immunglobulingene und somit kodiert die cDNA die gleichen. Amplifizierte cDNA wird in M13-Expressionsvektoren (oder Phagemids mit M13-Verpackungssignalen) kloniert, was eine Bank von Phagen erzeugt, die menschliche Fab-(oder scFv-)Fragmente auf ihrer Oberfläche exprimieren. Phagen, die den Antikörper von Interesse präsentieren, werden durch Antigenbindung ausgewählt und werden in Bakterien vermehrt, um lösliches menschliches Fab-(oder scFv-)Immunglobulin zu produzieren. Somit immortailisiert dieses Verfahren im Gegensatz zur herkömmlichen Synthese monoklonaler Antikörper DNA, die menschliches Immunglobulin kodiert, anstelle von Zellen, die menschliches Immunglobulin exprimieren.
  • Obwohl die Bakteriophagen, welche die Antikörper von Interesse hierin präsentieren, durch M13-Phagen beispielhaft angegeben werden, ist die vorliegende Erfindung nicht auf diese oder irgendwelche anderen Vektoren beschränkt, die einen Antikörper präsentieren. Stattdessen dürfte einem Fachmann, der mit den hierin bereitgestellen Lehren ausgestattet wäre, ersichtlich sein, dass jeder Vektor, der einen Antikörper präsentieren kann, wobei der Vektor eine Nucleinsäuresequenz umfasst, deren Sequenz mindestens teilweise bekannt ist, bei den hierin offenbarten Verfahren verwendet werden kann. Deshalb können, während die hierin offenbarten Antikörper-präsentierenden Bakteriophagen durch M13 beispielhaft angegeben werden, andere Bakteriophagen, wie zum Beispiel Lambda-Phagen oder T7-Phagen, in dem erfindungsgemäßen Verfahren auch nützlich sein. Es sind Präsentationsbanken mit Lambda-Phagen, die Peptide auf ihrer Oberfläche präsentieren, die durch heterologe DNA kodiert werden (Sternberg et al., 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 1609–1613), sowie Präsentationsbanken mit T7-Phagen (Hansen et al., 2001, Int. J. Oncol. 19: 1303-1309) erzeugt worden.
  • Darüberhinaus wird in Betracht gezogen, dass das erfindungsgemäße Verfahren ausgeweitet werden kann, um andere Viren als Bakteriophagen einzuschließen, wie zum Beispiel eukaryotische Viren. Tatsächlich können eukaryotische Viren erzeugt werden, die Gene kodieren, die zur Abgabe an einen Säuger geeignet sind und die einen Antikör per kodieren und präsentieren, der fähig ist, auf einen spezifischen Zelltyp oder ein spezifisches Gewebe zu zielen, in welchen/welches das Gen abgegeben werden soll. Zum Beispiel sind retrovirale Vektoren erzeugt worden, die funktionelle Antikörperfragmente präsentieren (Russell et al., 1993, Nucl. Acids Res. 21: 1081–1085). Diese und alle anderen Vektoren, die einen Antikörper exprimieren, können bei den erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden und werden dadurch umfasst.
  • Während das erfindungsgemäße Verfahren, wie hierin beispielhaft angegeben, die Verwendung von Phagen beschreibt, welche den Fab-Anteil oder einen scFv-Anteil eines Antikörpermoleküls kodieren, sollte das Verfahren darüberhinaus nicht so ausgelegt werden, als sei es allein auf die Verwendung von Phagen beschränkt, die Fab- oder scFv-Antikörper kodieren. Fab-Moleküle umfassen die gesamte leichte Ig-Kette, das heißt, sie umfassen sowohl die variable als auch die konstante Region der leichten Kette, schließen aber nur die variable Region und die erste Domäne der konstanten Region (CH1) der schweren Kette ein. Einkettige Antikörpermoleküle umfassen eine einzelne Proteinkette, die das Ig Fv-Fragment umfasst. Ein Ig Fv-Fragment schließt nur die variablen Regionen der schweren und leichten Ketten des Antikörpers ein, die keine konstante Region darin aufweisen. Phagenbanken, die scFv-DNA umfassen, können gemäß den in Marks et al., 1991, J. Mol. Biol. 222: 581–597, beschriebenen Verfahren erzeugt werden. Das Anreichern von so erzeugten Phagen zur Isolierung eines gewünschten Antikörpers wird wie hierin für Fab-DNA umfassende Phagenbanken beschrieben ausgeführt.
  • Die Erfindung sollte auch so ausgelegt werden, dass sie synthetische Phagenpräsentationsbanken einschließt, bei denen die variablen Regionen der schweren und leichten Kette so synthetisiert werden können, dass sie nahezu alle möglichen Spezifitäten einschließen. Deshalb können Antikörper-präsentierende Banken "natürlich" oder "synthetisch" sein (Barbas, 1995, Nature Medicine 1: 837-839; de Kruif et al., 1995, J. Mol. Biol. 248: 97–105). Antikörper-präsentierende Banken, die "natürliche" Antikörper umfassen, werden wie im US-Patent Nr. 5,876,925 an Siegel beschrieben erzeugt. Antikörper-präsentierende Banken, die "synthetische" Antikörper umfassen, werden gemäß dem in Barbas (1995, vorstehend) und den darin aufgeführten Referenzen beschriebenen Verfahren erzeugt.
  • Dem Fachmann dürfte auf Grund der hierin bereitgestellten Offenbarung ersichtlich sein, dass die Erythrozyten-Antikörper, gegen die unter Verwendung auf dem Fachgebiet bekannter Verfahren Antikörper erzeugt werden können und die dann bei dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden können, Rh-Antigene, einschließlich Rh(D), Rh(C), Rh(c), Rh(E), Rh(e), und andere Antigene, bei denen es sich nicht um Rh-Antigene handelt, einschließlich Erythrozyten-Antigenen in den Kell-, Duffy-, Lutheran- und Kidd-Blutgruppen, einschließen, aber nicht darauf beschränkt sind.
  • Somit kann das erfindungsgemäße Verfahren zum Nachweis jedes RBC-Antigens oder anderen Zellantigens, wie zum Beispiel, aber nicht beschränkt auf, eines tumorspezifischen Antigens, bakteriellen Antigens und dergleichen verwendet werden. Das erfindungsgemäße Verfahren ist auch zum Typisieren von Thrombozyten durch Erzeugen von Phagenantikörpern, die für etliche klinisch wichtige Thrombozyten-Antigene, besonders HPA-1a/1b, HPA-2a/2b, HPA-3a/3b und dergleichen, spezifisch sind, nützlich.
  • Die Erfindung ist ferner zum Typisieren von Spender-Leukozyten auf HLA-Antigene zum Zwecke der Abstimmung von Spendern und Empfängern für eine potenzielle Transplantat-Abstimmung im Falle der Transplantation von sowohl festen (zum Beispiel Niere, Herz, Leber, Lunge) und nicht festen (zum Beispiel Knochenmark) Organen oder Geweben von Nutzen.
  • Zusätzlich können die Verfahren der vorliegenden Erfindung für forensische Zwecke verwendet werden, um jedes Antigen von Interesse in einer Probe nachzuweisen, wobei es sich bei der Probe um Knochen, Haar, Haut, Samen, Speichel oder jede andere Probe, die von einem Organismus oder einer biologischen Probe erhalten werden kann, handeln kann, sie aber nicht darauf beschränkt ist. Das einzige erforderliche Merkmal ist, dass die Probe ein Antigen enthalten muss, das spezifisch durch einen Antikörper erkannt wird, der durch einen Bakteriophagen oder einen anderen Antikörperpräsentierenden Vektor exprimiert wird. Somit ist die vorliegende Erfindung in keiner Weise auf den Nachweis eines bestimmten Antigens beschränkt; stattdessen umfasst die Erfindung das Nachweisen einer großen Fülle von Antigenen von Interesse unter Verwendung der neuen, hierin offenbarten Nachweisverfahren des "Phänotypisieren durch Genotypisieren mit Reagenz".
  • Somit umfasst die Erfindung das Nachweisen eines Antigens von Interesse auf einem Erythrozyten, hierin als "Phänotypisieren" bezeichnet, durch Nachweisen der Bindung eines Phagen, der einen anti-Erythrozyten-Antikörper exprimiert, wobei der Phage durch Nachweisen einer bekannten Sequenz nachgewiesen wird, die in der durch das Phagenpartikel enthaltenen Nucleinsäure vorliegt, was hierin als "Phänotypisieren durch Genotypisieren mit Reagenz" bezeichnet wird. Ferner schließt die Erfindung das Durchmustern von Patientenseren auf anti-Erythrozyten-Antikörper unter Verwendung von Phagenpartikeln ein, die ein anti-Human-IgG (oder einen anti-IgM oder gegen leichte kappa- oder lambda-Kette gerichteten Antikörper, der jeden Ig-Isotyp aufgreifen würde) präsentieren. Wieder werden die an die RBCs gebundenen Phagen durch Nachweisen einer in der Nucleinsäure, die durch die Phagen enthalten wird, vorliegenden Nucleinsäuresequenz nachgewiesen.
  • Zusätzlich umfasst die Erfindung die Verwendung des Phänotypisieren durch Genotypisieren mit Reagenz-Verfahrens in einem Immunassay, ob sich das Antigen, das nachgewiesen wird, auf einer Zelle befindet oder nicht (z. B. Antigene, wie zum Beispiel, aber nicht beschränkt auf solche, die für Forschungs- oder klinische Zwecke vorgesehen sind, von einem Cytokin bis zu HCG für einen Schwangerschaftstest). Das heißt, die vorliegende Erfindung kombiniert die durch Immunglobuline für eine bestimmte Substanz verliehene Spezifität, wobei die Spezifität jede posttranslationale Modifikation (z. B. Phosphorylierung, Glycosylierung und dergleichen) mit einbezieht, mit der durch Nucleinsäure-Nachweisverfahren verliehenen Sensitivität – sowie der Fähigkeit, Multiplex-Assays durchzuführen. Das heißt, eine Probe, die analysiert wird, würde so aufgetragen, dass ihre Bestandteile an einer festen Unterlage befestigt sind, wie zum Beispiel Überziehen der Vertiefung einer Platte für einen ELISA, einen Nitrocellulose-Filter, einer Kugel oder jede andere feste Unterlage, und man kann die Phagen, die ein Protein exprimieren, das spezifisch an einen zugehörigen Liganden bindet, an die Bestandteile binden lassen, die an der festen Unterlage befestigt sind. Alle spezifisch an einen zugehörigen Liganden gebundenen Phagen können durch Nachweisen einer bekannten Nucleinsäuresequenz nachgewiesen werden, die durch die innerhalb der Phagen enthaltene Nucleinsäure spezifiziert wird. Somit kann die Anwesenheit eines Liganden von Interesse unter Verwendung des hierin offenbarten Verfahrens des "Phänotypisieren durch Genotypisieren mit Reagenz" nachgewiesen werden, wobei die Probe, die analysiert wird, keine Zelle umfasst.
  • Darüberhinaus dürfte dem Fachmann beruhend auf der hierin bereitgestellten Offenbarung ersichtlich sein, dass die Erfindung das Phänotypisieren von anderen Blutzellen (z. B. Thrombozyten, Leukozyten und dergleichen) und den Nachweis von Antikörpern gegen diese Zellen im Blut (z. B. anti-Thrombozyten Auto- oder Alloantikörper, anti-HLA-Antikörper usw.) umfasst, so dass die vorliegende Erfindung nicht auf Erythrozyten beschränkt ist. Tatsächlich ist die Erfindung überhaupt nicht auf Blutzellen beschränkt, sondern kann verwendet werden, um jedes Molekül von Interesse, das auf irgendeiner Art von Zelle vorliegt, nachzuweisen. Somit dürfte einem Fachmann beruhend auf der hierin bereitgestellten Offenbarung ersichtlich sein, dass die vorliegende Erfindung das Nachweisen eines Moleküls von Interesse auf einer Zelle einschließt, aber nicht darauf beschränkt ist, wobei sonst Durchflusszytometrie verwendet würde, so dass die große Fülle von nun erhältlichen Antikörpern (z. B. hunderte von anti-CD-Antikörpern, wie zum Beispiel anti-CD4 oder -CD8 für Helfer/Suppressor-T-Zellen, anti-CD20 für B-Zellen und dergleichen) auf einem Phagen exprimiert werden und verwendet werden können, um gemäß den hierin an anderer Stelle offenbarten neuen Verfahren nachzuweisen, ob das Antigen in einer Zelle vorliegt. Die vorliegende Erfindung schließt die Verwendung von Antikörpern, die in der Zukunft gegen Antigene von Interesse entwickelt werden, ein, so diese gemäß den hierin offenbarten Verfahren entwickelt und verwendet werden.
  • Dem Fachmann dürfte beruhend auf den hierin bereitgestellten Lehren ersichtlich sein, dass zum Beispiel der Nachweis eines Moleküls von Interesse, mit Bezug auf eine forensische Anwendung der hierin offenbarten Verfahren, einen wichtigen Vorteil über vorliegende Verfahren insofern bereitstellt, als viele zum Identifizieren des Ursprungs von Flüssigkeiten (Blut oder lösliche Substanzen in Speichel und dergleichen) wichtige Antigene Kohlenhydrate sind (wie die A- und B-Antigene). Die Verwendung von genetischen Tests an dem winzigen Fleck für DNA kann die DNA, welche Kohlenhydrate kodiert, nicht amplifizieren, weil DNA keine Kohlenhydrate kodiert, bei denen es sich um Produkte einer posttranslationalen Modifikation von Proteinen handelt. Verfahren des Stands der Technik in Bezug auf den Nachweis von Kohlenhydraten sind auf das Nachweisen der DNA für die Enzyme (z. B. die Glycosyltransferasen) beschränkt, die zum Zusammensetzen der Zuckereinheiten auf dem Protein oder Lipid verantwortlich sind. Das Problem mit herkömmlichen Nachweisassays ist, dass die letztendliche Expression eines bestimmten Zuckers das Ergebnis der Vererbung etlicher Enzyme ist, die in genauer Reihenfolge wirken, um die Ketten zusammenzusetzen, so dass die Gene für alle Enzyme nachgewiesen werden müssten, um die Identität der Person zu identifizieren, von der die Probe abgeleitet wurde. Zum Beispiel ist, damit ein Individuum die Blutgruppe A hat, das Enzym erforderlich, das N-Acetylgalactosamin auf seinen Vorläufer-Zucker addiert, sowie das Enzym (eine Fucosyltransferase), um den Vorläufer-Zucker zusammenzusetzen. Andere Kohlenhydrate (wie P) sind in ihren Strukturen und ihrer Zusammensetzung noch komplizierter. Falls die Probe ein Gemisch aus Sekreten von unterschiedlichen Individuen in einem Fleck umfasst, würde ein DNA-Test alle Enzyme aufgreifen und der Test könnte nicht unterscheiden, ob eine Person alle Enzyme hätte und ein bestimmtes Zucker-Antigen herstellen könnte oder ob die Probe DNA von verschiedenen Personen umfasste, von denen jede nur die verschiedenen Zuckerbestandteile herstellen könnte. Im Unterschied zu herkömmlichen, auf Nucleinsäure beruhenden Tests stellt die vorliegende Erfindung den Vorteil bereit, die exquisite Spezifität eines Antikörpers, der eine komplexe Struktur, wie zum Beispiel ein Glycan, erkennen kann, und die Fähigkeit, winzige Mengen einer Nucleinsäure nachzuweisen, zu kombinieren; somit stellt der Nachweis der durch den Phagen enthaltenen Nucleinsäure, kombiniert mit der Spezifität eines Antikörpers einen neuen Assay mit der außergewöhnlichen Empfindlichkeit und Spezifität bereit, die bei forensischen Anwendungen erforderlich ist.
  • Beruhend auf der hierin bereitgestellten Offenbarung dürfte einem Fachmann selbstverständlich sein, dass sich der Begriff "Phänotypisieren", wie er hierin in Bezug auf das "Phänotypisieren durch Genotypisieren mit Reagenz" verwendet wird, auf die Identifizierung jedes Antigens von Interesse, ob das Antigen mit einer Zelle assoziiert ist oder nicht, durch Nachweisen einer Nucleinsäuresequenz bezieht, während der Begriff auf dem Fachgebiet im Allgemeinen für das Nachweisen eines durch eine Zelle oder einen Organismus demonstriertes Kennzeichen verwendet wird. Somit wäre zum Beispiel die Identifizierung einer Droge in einem getrockneten Fleck auf einer Autotür unter Verwendung eines durch einen Phagen präsentierten anti-Drogen-Antikörpers gemäß den erfindungsgemäßen Verfahren "Phänotypisieren", wie der Begriff hierin verwendet wird. Deshalb handelt es sich bei den erfindungsgemäßen Verfahren, wobei ein durch einen Phagen exprimierter Antikörper an ein zugehöriges Antigen bindet und das Antigen durch Analysieren auf eine in der Phagen-DNA vorliegende Nucleinsäuresequenz nachgewiesen wird, um "Phänotypisieren", wie es hierin verwendet wird.
  • Tatsächlich würde der Fachmann, ausgestattet mit den hierin bereitgestellten Lehren, erkennen, dass die vorliegende Erfindung nicht auf den Nachweis eines "Antigens" unter Verwendung eines durch einen Phagen präsentierten Antikörpers (wobei der Antikörper dann durch Nachweisen einer durch die Phagen-DNA kodierten Nucleinsäuresequenz nachgewiesen wird) beschränkt ist. Stattdessen umfasst die vorliegende Erfindung die Verwendung eines durch einen Phagen exprimierten Proteins, bei dem es sich nicht um einen Antikörper handelt, wobei das Protein spezifisch an einen zugehörigen, auf einer Zelle, in einer Probe oder beidem vorliegenden Liganden bindet. Viele derartige Bindungspaare sind auf dem Fachgebiet wohlbekannt und sind unter Verwendung einer großen Vielfalt von Assays, einschließlich Hefe Zwei- und Drei-Hybridbindungsassays, unter einer großen Fülle von anderen Assays identifiziert worden. Somit kann, wo ein Bindungspaar auf dem Fachgebiet bekannt ist, eines der beiden Moleküle durch den Phagen exprimiert werden (das durch den Phagen exprimierte Protein des Bindungspaares wird hierin als der "Rezeptor" bezeichnet) und die Anwesenheit des anderen Mitglieds des Bindungspaares (als "Ligand" oder "Ziel" bezeichnet) kann durch Nachweisen einer Nucleinsäuresequenz nachgewiesen werden, die durch den Phagen, der das Rezeptorprotein exprimiert, enthalten wird. Der Ligand, der durch seinen zugehörigen, durch den Phagen exprimierten Rezeptor/Bindungspartner nachgewiesen werden soll, kann ein Hormon oder ein Anteil eines Hormons, wobei der Anteil an den durch den Phagen präsentierten Rezeptor binden kann, einschließen, ist aber nicht darauf beschränkt. Ferner können die erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden, um unter anderem die Expression eines Hormonrezeptors auf einer Zelle durch Bewerten der Menge eines Phagen zu messen, der das Hormon oder den Anteil davon präsentiert, das an die Zelle, die analysiert wird, bindet. Die auf Grund der Wechselwirkung von Rezeptor/Ligand (beziehungsweise von durch die Phagen exprimiertem Hormonrezeptor/Hormon) spezifisch an die Zelle gebundenen Phagen können durch Nachweisen einer Nucleinsäuresequenz nachgewiesen werden, die in der durch die Phagen enthaltenen Nucleinsäure enthalten ist, wie an anderer Stelle hierin ausführlicher offenbart wird.
  • Einem Fachmann dürfte beruhend auf der hierin bereitgestellten Offenbarung selbstverständlich sein, dass die vorliegende Erfindung den Nachweis eines Moleküls von Interesse umfasst, das nicht mit einer Zelle assoziiert ist. Das heißt, die vorliegende Erfindung schließt das Analysieren der Anwesenheit eines Moleküls von Interesse in jeder Probe ein, wobei die Probe auf einen festen Träger aufgetragen werden kann, so dass das Molekül von Interesse immobilisiert werden kann. Ein Phage, der einen Rezeptor exprimiert, von dem bekannt ist, dass er spezifisch an das Molekül bindet (hierin als "Liganden-" oder "Ziel" Molekül bezeichnet), kann dann mit der immobilisierten Probe in Kontakt gebracht werden und die Bindung von Phagen kann durch Analysieren auf die Anwesenheit einer Nucleinsäuresequenz, die durch die Phagen enthalten ist, nachgewiesen werden, wie an anderer Stelle hierin ausführlicher beschrieben wird. Auf diese Weise kann die vorliegende Erfindung unter Verwendung der hierin offenbarten Verfahren des "Phänotypisieren durch Genotypisieren mit Reagenz" verwendet werden, um ein Molekül von Interesse (einen Liganden) nachzuweisen, das in irgendeiner Probe vorliegt.
  • Dem Fachmann dürfte beruhend auf der hierin bereitgestellten Offenbarung auch ersichtlich sein, dass ein Phage leicht ein Peptid exprimieren kann, von dem bekannt ist, dass es Krebszellen nachweist, wobei aber nicht bekannt ist, an welchen Bestandteil auf der Krebszelle das Peptid bindet. Somit kann das Protein, von dem bekannt ist, dass es Krebszellen bindet, verwendet werden, um eine Krebszelle nachzuweisen, obwohl die Identität des Liganden/Bindungspartners, der an das Protein bindet, nicht bekannt ist, indem gebundene Phagen durch Nachweisen einer durch den Phagen enthaltenen Nucleinsäuresequenz nachgewiesen werden, all das wie an anderer Stelle hierin ausführlicher offenbart wird.
  • Zusätzlich kann der Phage, wo der Phage verwendet wird, um die Bindung von Serumantikörpern an einen Reagenz-Erythrozyten nachzuweisen, Staph Protein A oder einen Anteil davon anstelle von anti-IgG exprimieren, um an die RBCs gebundene Immunglobuline nachzuweisen. Deshalb dürfte dem Fachmann beruhend auf der hierin bereitgestellten Offenbarung ersichtlich sein, dass eine große Fülle an Molekülen durch den Phagen exprimiert werden kann, um einen zugehörigen Bindungspartner nachzuweisen, der auf einer Zelle, in einem Gewebe oder einer wässrigen Probe und dergleichen vorliegt, und die vorliegende Erfindung ist in keiner Weise auf Phagen, die einen Antikörper exprimieren, oder auf den Nachweis eines Antigens auf einer Zelle beschränkt, wie an anderer Steile hierin beispielhaft angegeben wird. Das heißt, sobald ein Bindungspaar bekannt ist, könnte der Fachmann, ausgestattet mit der hierin bereitgestellten Offenbarung, leicht ein Mitglied des Bindungspaares unter Verwendung der erfindungsgemäßen Verfahren nachweisen, d. h. durch Exprimieren eines Mitglieds des Bindungspaares auf einem Phagen und In-Kontakt-Bringen des Phagen mit einer Probe, dann Nachweisen von spezifisch an die Probe gebundenen Phagen durch Nachweisen einer durch die Phagen-Nucleinsäure kodierten Nucleinsäuresequenz. Dies ermöglicht den schnellen und empfindlichen Nachweis eines Moleküls von Interesse oder verschiedener Moleküle von Interesse durch Nachweisen einer Nucleinsäure, wenn eine Vervielfältigung verwendet wird, wobei es sich bei dem Molekül nicht um eine Nucleinsäure handelt.
  • Die spezifischen Bedingungen, unter denen man den Antikörper oder Rezeptor, der durch den Bakteriophagen präsentiert wird, spezifisch an ein Antigen oder einen Liganden von Interesse binden lässt, hängen von dem spezifischen Komplex aus Antigen-Antikörper und/oder Rezeptor-Ligand ab, der an der Reaktion beteiligt ist. Dem Fachmann dürfte beruhend auf der hierin bereitgestellten Offenbarung selbstverständlich sein, dass derartige Bedingungen für jedes Antigen/Bindungspaar, das nachgewiesen wird, und den Antikörper/Rezeptor, der dafür verwendet wird, leicht bestimmt werden können, wie hierin für den Nachweis von Rh(D)- und B-Antigenen auf intakten Erythrozyten unter Verwendung von Phagen, die für diese Antigene spezifische Antikörper exprimieren, beispielhaft angegeben wird. Diese Techniken zum Bestimmen von Bindungsbedingungen werden auf dem Fachgebiet routinemäßig ausgeführt und werden deshalb hierin nicht weiter beschrieben.
  • Sobald die den Antikörper (oder Rezeptor) exprimierenden Bakteriophagen mittels der Wechselwirkung zwischen der Antigen-tragenden Einheit auf einem Molekül von Interesse, das auf der Zelle vorliegt, (dem Liganden) und dem durch die Phagen exprimierten Antikörper (Rezeptor), spezifisch an die Zelle oder den Liganden in einer Probe gebunden sind, wird die Anwesenheit von gebundenen Phagen durch Nachweisen der in dem Bakteriophagenpartikel enthaltenen Nucleinsäure nachgewiesen. Für den hierin beispielhaft angegebenen Phagen M13 handelt es sich bei der Nucleinsäure um ein einzelsträngiges DNA-Molekül, aber die vorliegende Erfindung ist nicht auf eine bestimmte Nucleinsäure beschränkt; stattdessen kann jede Nucleinsäure unter Verwendung auf dem Fachgebiet wohlbekannter Techniken nachgewiesen werden (z. B. wie in Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Laborstory Manual, Cold Spring Harbor Laborstory, New York; und Ausubel et al., 1997, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, beschrieben wird), von denen manche hierin offenbart werden, sowie Techniken, die in der Zukunft entwickelt werden sollen, und diese verschiedenen Techniken sind alle in der Erfindung eingeschlossen.
  • Die vorliegende Erfindung schließt auch die Amplifikation der Nucleinsäure ein, um bei ihrem Nachweis zu helfen. Die vorliegende Erfindung ist jedoch nicht auf Verfahren beschränkt, welche die Amplifikation der Nucleinsäure erfordern. Stattdessen dürfte dem Fachmann beruhend auf der hierin bereitgestellten Offenbarung ersichtlich sein, dass Nachweisverfahren, die keine Amplifikation der Nucleinsäure erfordern, in der Erfindung eingeschlossen sind. Derartige Nachweisverfahren schließen den Nachweis einer Nucleinsäure, die direkt auf einen Chip übertragen wird, wobei ein mit Fluoreszenz (oder einem Enzym) markiertes, zu der Sequenz des Phagen (Phagemid) komplementäres Oligonucleotid die nicht amplifizierte Nucleinsäure nachweisen kann, ein, sind aber nicht darauf beschränkt. Somit ist die Erfindung, während 1 die verschiedenen Techniken veranschaulicht, die verwendet werden können, um die Nucleinsäuresequenz von Interesse nachzuweisen, nicht auf Verfahren beschränkt, die vor dem Nachweis der Sequenz eine Amplifikation erfordern. Deshalb werden PCR, IDAT oder andere Amplifikationsreaktionen bevorzugt, sind aber nicht erforderlich, um die Erfindung auszuüben.
  • Dem Fachmann dürfte, sobald er mit den hierin bereitgestellten Lehren ausgestattet ist, selbstverständlich sein, dass die Nucleinsäure, wie hierin beispielhaft angegeben wird, unter Verwendung von herkömmlichen Polymerasekettenreaktions-Assays amplifiziert werden kann. Das heißt, ein Satz von Primersequenzen kann beruhend auf der bekannten Sequenz der durch den Bakteriophagen enthaltenen Nucleinsäure entwickelt werden. Wie an anderer Stelle hierin diskutiert wird, können die Primer für jeden Anteil der Nucleinsäure spezifisch sein, entweder für die einzigartige Sequenz, die in dem Anteil der Nucleinsäure enthalten ist, das den CDR3-Anteil des Antikörpers kodiert, oder jede andere in der Nucleinsäure vorliegende Sequenz. Somit kann ein Primer zu einer allgemeinen Sequenz komplementär sein, die in der Phagen-DNA enthalten ist (unabhängig von der Spezifität des Antikörpers), und der andere Primer kann z. B. zu einer für diesen Phagen spezifischen Sequenz, wie zum Beispiel, aber nicht beschränkt auf die hypervariable CDR3-Region der schweren Kette des Antikörpers (d. h. der Sequenz, die für einen bestimmten Antikörper einzigartig ist), komplementär sein.
  • Der Nachweis der amplifizierten Nucleinsäure zeigt die Anwesenheit des Antigens an, das durch den spezifischen, durch den Bakteriophagen kodierten Antikörper erkannt wird. Die Herstellung von PCR-Primern und Sonden, die mit der durch die PCR amplifizierten Sequenz hybridisieren, sind auf dem Fachgebiet wohlbekannt und diese Verfahren werden unter anderem in Sambrook et al. (1989, Molecular Cloning: A Laborstory Manual, Cold Spring Harbor Laborstory, New York) und Ausubel et al. (1997, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York) beschrieben.
  • Zusätzlich dürfte dem Fachmann beruhend auf der hierin bereitgestellten Offenbarung ersichtlich sein, dass Sequenzen in die Nucleinsäure, die den durch den Bakteriophagen exprimierten Antikörper kodiert, eingefügt werden können, wobei die eingefügte Sequenz dann unter Verwendung verschiedener auf dem Fachgebiet bekannter Assays nachgewiesen werden kann. Zum Beispiel handelt es sich, wie an anderer Stelle hierin diskutiert wird, bei "Molecular Beacons" oder wie hierin verwendet "Beacons" oder "Beacon-Sequenzen" um Oligonucleotide mit Stamm- und Schleifen-Struktur mit einer fluoreszierenden Markierung am 5'-Ende und einem allgemeinen Quencher am 3'-Ende (siehe z. B. Tyagi und Kramer, 1996, Nature Biotech. 14: 303–308; Broude, 2002, Trends in Biotechnology 20: 249–256). Wenn der Stamm geschlossen ist (in Abwesenheit einer komplementären Nucleinsäure) befinden sich Fluorophor und Quencher in unmittelbarer Nachbarschaft und die Fluoreszenzenergie wird durch den Quencher absorbiert und die Fluoreszenz wird gequencht und ist nicht nachweisbar. In Anwesenheit einer komplementären Nucleinsäure hybridisiert die Schleife des Beacons und das Fluorophor und der Quencher trennen sich, so dass kein Quenching stattfindet. Photonen werden dann ungequencht aus dem Fluorophor bei der für das Fluorophor spezifischen Wellenlänge emittiert und dann ist eine Fluoreszenz nachweisbar. Durch Kombinieren von etlichen Beacons in einem Röhrchen, jedes mit einem unterschiedlichen Fluorophor am 5'-Ende, können mehrere DNA-(Tyagi et al, 1998, Nature Biotech. 16: 49–53) oder RNA-(de Baar et al., 2001, J. Clin. Microbiol. 39: 1895–1902) Ziele gleichzeitig nachgewiesen werden, indem man das aus dem Reaktionsgefäß emittierte Farbspektrum misst.
  • Molecular Beacons mit zwei oder mehr unterschiedlichen Farben können in eine PCR- und/oder eine Transkriptionsreaktion (z. B. IDAT) einbezogen werden, um die Anwesenheit von Antikörper-spezifischer DNA nachzuweisen. Wie hierin an anderer Stelle beschrieben wird, kann die Nucleinsäure von jedem Bakteriophagen, die einen für ein Antigen von Interesse spezifischen Antikörper kodiert, modifiziert werden, um eine einzigartige Beacon-Sequenz einzufügen und jede Molecular Beacon-Sonde kann an ein einzigartiges Quencher/Fluorophor-Paar konjugiert werden, so dass jeder Beacon, wenn er an seine komplementäre Sequenz gebunden ist, bei einer einzigartigen Frequenz fluoresziert. Auf diese Weise kann jeder Beacon verwendet werden, um einen an ein Antigen bindenden Antikörper nachzuweisen, so dass die "Mulitplex"-Reaktion Ergebnisse erzielen kann, die demonstrieren, welche Antigene auf einer Zelle, die untersucht wird, vorliegen, indem bewertet wird, welche Fluorophore in der Probe vorliegen. Die Planung und Herstellung derartiger "Beacon"-Sequenzen und Nucleinsäuresequenzen, die dazu komplementäre Sequenzen umfassen, sind auf dem Fachgebiet wohlbekannt.
  • Ausgestattet mit der hierin bereitgestellten Offenbarung dürfte dem Fachmann selbstverständlich sein, dass die vorliegende Erfindung nicht in der Anzahl der Moleküle von Interesse beschränkt ist, die in einer einzigen Multiplex-Reaktion nachgewiesen werden können. Das heißt, die Planung von einzigartigen Sequenzen, die in einer einzelnen Reaktion nachgewiesen und voneinander unterschieden werden können, ist auf dem Fachgebiet wohlbekannt. Ferner dürfte einem Fachmann beruhend auf der hierin bereitgestellten Offenbarung ersichtlich sein, dass verschiedene Technologien, wie zum Beispiel, aber nicht beschränkt auf Mikrochip-Arrays, Slot Blots, Verwendung von Beacon-Sonden und andere Assays mit hohem Durchsatz, die das Verarbeiten von vielen Proben ermöglichen und die Fähigkeit für Multiplex-Assays bereitstellen, bei den Verfahren der vorliegenden Erfindung, wie hierin beispielhaft angegeben, verwendet werden können, wie auf dem Fachgebiet bekannt ist, oder unter Verwendung von Techniken, die in der Zukunft entwickelt werden sollen, deren Verwendung beruhend auf der hierin bereitgestellten Offenbarung leicht in Betracht gezogen werden kann. Das heißt, die derzeitige Chip-Technologie sorgt schon dafür, dass die Anzahl von Antigenen, die auf einem einzelnen Chip analysiert werden kann, die Anzahl bekannter Erythrozyten-Antigene übersteigt. Ferner kann ein einzelnes Röhrchen, das zahlreiche Primerpaare enthält, verwendet werden, um die PCR-Reaktionen zu vervielfältigen, wenn die Parameter für das Durchlaufen der Zyklen bei verschiedenen PCR-Reaktionen kompatibel sind. Somit würde es scheinen, dass das Vervielfältigen der Reaktionen, welche die erfindungsgemäßen Verfahren betreffen, nur in Bezug auf die Anzahl von Flecken auf den Chips beschränkt ist, da das Binden von Phagen an Zellen, die Anzahl der Primer, die verwendet werden können, um eine PCR in einem einzelnen Röhrchen durchzuführen, und dergleichen die Anzahl der Moleküle nicht beschränken, die unter Verwendung der erfindungsgemäßen Verfahren analysiert werden können.
  • Dem Fachmann dürfte beruhend auf der hierin bereitgestellten Offenbarung selbstverständlich sein, dass die Erfindung eine Amplifikation der Nucleinsäure von Interesse (d. h. der Nucleinsäure, die durch den Bakteriophagen enthalten wird, welcher den Antikörper gegen die Antigen-tragende Einheit von Interesse bindet, der durch die spezifische Bindung des Antikörpers an sein zugehöriges Antigen an die Zelle bindet) unter Verwendung eines auf dem Fachgebiet bekannten Verfahrens, sowie von in der Zukunft zu entwickelnden Verfahren umfasst. Die PCR-Amplifikation wurde hierin zuvor diskutiert und wird hierin an anderer Stelle beispielhaft angegeben, wie auch IDAT, bei der es sich um eine Amplifikation der Nucleinsäure unter Verwendung eines auf Transkription beruhenden Verfahrens handelt. Dies sind jedoch nur beispielhafte Amplifikationsverfahren, und die vorliegende Erfindung ist in keiner Weise auf diese oder irgendein anderes Verfahren zum Amplifizieren der durch den Phagen von Interesse enthaltenen Nucleinsäure beschränkt.
  • Die Erfindung umfasst auch das Nachweisen der Nucleinsäure, sobald sie amplifiziert worden ist. Einem Fachmann dürfte, sobald er mit den hierin bereitgestellten Lehren ausgestattet wäre, ersichtlich sein, dass jedes auf dem Fachgebiet bekannte oder in der Zukunft zu entwickelnde Verfahren zum Nachweis einer Nucleinsäure verwendet werden kann, um die Nucleinsäure bei dem erfindungsgemäßen Verfahren nachzuweisen. Derartige Nachweisverfahren schließen Echtzeit-PCR unter Verwendung fluoreszierender Sonden, das Nachweisen von Amplikons der vorhergesagten Größe unter Verwendung von Größentrennungstechniken (z. B. Agarosegelelektrophorese), Southern- und Northern-Blotting-Techniken, Hybridisierung an Oligonucleotid-Microarrays und die Verwendung von "Molecular Beacon" Sonden, wie hierin ausführlicher an anderer Stelle diskutiert wird, ein, sind aber nicht darauf beschränkt. Ferner werden Techniken zum Automatisieren, Beschleunigen oder Verbessern des Nachweises der Nucleinsäuresequenz von Interesse auf andere Weise in Betracht gezogen, wie hierin ausführlicher an anderer Stelle offenbart wird. Derartige Techniken schließen die "durch ein elektrisches Feld beschleunigte Hybridisierung an Oligonucleotid-Microarrays" (Su et al., 2002, Electrophoresis 23: 1551–1557), die schnelle Ergebnisse bereitstellt, z. B. beträgt die Zeit vom Auftragen von DNA (oder RNA) bis zum Ablesen weniger als etwa 10 Minuten, ein, sind aber nicht darauf beschränkt. Somit werden Techniken zum Verbessern der Effizienz des Nachweisschrittes in der Erfindung eingeschlossen, wie dem Fachmann selbstverständlich sein dürfte.
  • B. Nachweis mehrerer Antigene
  • Die vorliegende Erfindung schliesst ein Verfahren zum Nachweisen der Anwesenheit von mindestens zwei unterschiedlichen Antigen-tragenden Einheiten auf einer Zelle ein. Das Verfahren umfasst das In-Kontakt-Bringen von mindestens zwei unterschiedlichen Bakteriophagen, wobei jeder einen Antikörper kodiert und exprimiert, der spezifisch ein Antigen bindet, wobei die beiden Antikörper nicht das gleiche Antigen binden. Alle Phagen, die unspezifisch an die Zelle gebunden sind, werden entfernt (z. B. durch Waschen der Zelle), und die Anwesenheit von gebundenen Bakteriophagen wird durch Nachweisen der in dem Phagen vorliegenden Nucleinsäure nachgewiesen. Das heißt, wie ausführlicher an anderer Stelle hierin beschrieben wird, die Sequenz oder ein Anteil davon der in dem Phagenpartikel vorliegenden Nucleinsäure wird freigelegt und die Anwesenheit der Nucleinsäure (d. h. die Anwesenheit ihrer bekannten Nucleinsäuresequenz) wird unter Verwendung von auf dem Fachgebiet wohlbekannten Verfahren nachgewiesen. Weil jeder Bakteriophage eine Nucleinsäuresequenz umfasst, die von denjenigen unterscheidbar ist, die in anderen in der gleichen Probe vorliegenden Bakteriophagen vorliegen, kann die Anwesenheit von verschiedenen Antigenen in einem einzelnen Probengemisch nachgewiesen werden. Derartige "Multiplex"-Assays sind unter Verwendung von auf Antikörpern beruhenden Nachweisverfahren nicht möglich, da die Reagenzien, die verwendet werden, um die Anwesenheit von an die Zelle gebundenen Antikörpern nachzuweisen, nicht leicht zwischen jedem Antikörper unterscheiden können. Ferner verwendet die herkömmliche Bluttypisierung keine Reagenzien, welche die Anwesenheit von an die Zelle gebundenen Antikörpern nachweisen, da viele Bluttypisierungsreagenzien, normalerweise die dekavalenten IgMs, die Zellen direkt agglutinieren. In diesen Assays kann man die Reaktion nicht vervielfältigen, es wäre nicht möglich zu bestimmen, welches Reagenz die Agglutination verursacht hätte. Verfahren, die auf dem Nachweisen von mehreren, einzigartigen Nucleinsäuresequenzen beruhen, machen das Analysieren verschiedener Antigene wie hierin beschrieben durch Nachweisen der innerhalb von Phagenpartikeln, die an diese Antigene mittels eines durch den Phagen exprimierten Antikörpermoleküls gebunden/gekoppelt sind, vorliegenden Nucleinsäuresequenzen jedoch möglich, wie hierin demonstriert wird.
  • Einem Fachmann dürfte beruhend auf der hierin bereitgestellten Offenbarung ersichtlich sein, dass die verschiedenen Bakteriophagen, die jeder einen anderen Antikörper präsentieren, der ein Antigen erkennt, dass sich von den durch die anderen durch Phagen präsentierten, in der Probe vorliegenden Antikörper erkannten Antigenen unterscheidet, gleichzeitig im gleichen Reaktionsgemisch mit der Zelle, die analysiert wird, in Kontakt gebracht werden können. Die Bakteriophagen können jedoch mit der Zelle in aufeinanderfolgender Weise in Kontakt gebracht werden, so dass jeder Bakteriophage mit der Zelle in Kontakt gebracht wird, ungebundene Bakteriophagen entfernt werden, und der nächste Bakteriophage mit der Zelle in Kontakt gebracht werden kann, ungebundene Bakteriophagen entfernt werden, und so weiter und so fort, bis allen Bakteriophagen ermöglicht wurde, an die Zelle zu binden, so dass alle Antigene von Interesse auf der Zelle analysiert worden sind. Alle gebundenen Phagen können dann behandelt werden, um die darin vorliegenden Nucleinsäuren freizusetzen, und die verschiedenen in der Probe vorliegenden Nucleinsäuresequenzen können, wie an anderer Stelle hierin ausführlicher diskutiert wird, nachgewiesen werden. Weil jeder Bakteriophage, der einen einzigartigen Antikörper exprimiert, eine Nucleinsäure enthält, die eine bekannte Sequenz umfasst, welche anders ist als die Sequenzen aller anderen Bakteriophagen-Nucleinsäuren, die in dem Assay verwendet werden, kann die Bindung jedes Bakteriophagen getrennt von allen anderen bestimmt werden. Somit kann die Anwesenheit jedes Antigens, das analysiert wird, durch Nachweisen der einzigartigen Nucleinsäuresequenz nachgewiesen werden, die mit dem Bakteriophagen assoziiert ist, der den Antikörper präsentiert, der an das Antigen gebunden ist, weil das Nachweisen verschiedener Nucleinsäuresequenzen in einer Probe den Nachweis anderer, nicht verwandter Sequenzen in der gleichen Probe nicht stört.
  • Dem Fachmann dürfte beruhend auf der hierin bereitgestellten Offenbarung ersichtlich sein, dass, wenn es auf Geschwindigkeit ankommt, unterschiedliche Antigene in einem einzelnen Reaktionsgemisch analysiert werden können. Wenn eine größere Empfindlichkeit des Assays gewünscht wird, z. B. wenn der forensische Nachweis einer kleinen Probe beteiligt ist oder wenn die jeweilige Kombination von Phagen, die für den Assay erforderlich ist, mit dem gleichen Amplifikationsschema oder den gleichen Bedingungen irgendwie nicht kompatibel ist, können dann die verschiedenen Reaktionen darüberhinaus der Reihe nach durchgeführt werden. Somit umfasst die Erfindung, während bevorzugt wird, dass PCR durch Zugeben aller relevanter Primer in ein Röhrchen und Amplifizieren aller Fragmente auf einmal durchgeführt wird, auch Verfahren, bei denen jedes Antigen/jeder Ligand in aufeinanderfolgender Weise unter Verwendung der gleichen Probe identifiziert wird. Beim Planen der Primer und der Strecken von Phagen- bzw. Phagemid-DNA zum Amplifizieren ist deshalb vorzuziehen, spezifische Sequenzen (Marker) zum Amplifizieren in der Phagen-DNA zu planen, statt den Unterschied in der Antikörper- oder Peptidsequenz auszunutzen, da man sie in Bezug auf die Bedingungen zur Vervielfältigung und zum Durchlaufen von Zyklen kompatibel machen kann. Wie hierin für den Nachweis von B- und Rh(D)-Antigenen auf einer RBC unter Verwendung von durch Phagen präsentiertem anti-B und anti-Rh(D) beispielhaft angegeben wird, können die Primer so geplant werden, dass sie in einer einzelnen Reaktion verwendet werden, und die Phagen wurden zusammen zu den RBCs gegeben und die PCR wurde in einem einzelnen Röhrchen durchgeführt, um Amplikons von sowohl 1100 bp als auch 1600 bp zu produzieren. Während dies das bevorzugte Verfahren ist, ist die Erfindung nicht auf dieses bestimmte Schema beschränkt.
  • Deshalb können etliche unterschiedliche durch Phagen präsentierte Antikörper (z. B. für verschiedene Blutgruppenantigene spezifische Antikörper) gleichzeitig mit einer Probe von RBCs in Kontakt gebracht werden. Die nicht gebundenen Phagen werden entfernt und die Nucleinsäuren der an die Zellen gebundenen Phagen werden analysiert, um zu bestimmen, welcher Phage an die Zellen gebunden war. Da jeder Bakteriophage einen einzigartigen Sequenz-"Marker" enthält, können Nucleinsäureverfahren verwendet werden, um zu bestimmen, welcher Phage und deshalb welche Antigene auf den Zellen vorliegen. Dieses "Multiplex"-Verfahren ist eine riesige Verbesserung im Vergleich zu Verfahren des Stands der Technik, die erfordern, dass jedes Antigen getrennt analysiert wird, wodurch zusätzliche Reagenzien benötigt werden, was die technische Schwierigkeit und Länge des Assays erhöht und mehr Gelegenheiten für Fehler einführt, weil zusätzliche Schritte und Manipulationen erforderlich sind.
  • Demensprechend können etliche unterschiedliche durch Phagen präsentierte Blutgruppenantikörper gleichzeitig mit der gleichen Probe von Erythrozyten in Kontakt gebracht werden und die Unterschiede der Antikörper-Nucleotidsequenz können ausgenutzt werden, um zu bestimmen, welche gebunden haben und welche nicht, wie hierin unter Verwendung von anti-B- und anti-Rh(D)-Antikörpern demonstriert wird, die auf unterschiedlichen Phagen präsentiert werden. Ein derartiges "Vervielfältigen" ist durch Agglutinationsverfahren nicht möglich, weil man niemals sagen könnte, welcher Antikörper (welche Antikörper) die Agglutination verursachte(n).
  • Dass eine derartige Methodik möglich ist, d. h. dass die gleichzeitige Bindung mehrerer anti-RBC-Antikörper durch die Amplifikation und den Nachweis von Antikörper-DNA nachgewiesen werden kann, wird durch die hierin offenbarten Daten demonstriert, wo ein Modellsystem eingesetzt wurde, das durch Phagen präsentierte menschliche monoklonale anti-Blutgruppe B- und anti-Rh(D)-Antikörper umfasst. Dem Fachmann dürfte jedoch, beruhend auf der hierin bereitgestellten Offenbarung, leicht ersichtlich sein, dass eine derartige "Vervielfältigungs-" Strategie nicht auf irgendwelche bestimmten Antikörper beschränkt ist, sondern verwendet werden kann, um mehrere Erythrozyten-Antigene unter Verwendung einer großen Fülle Antikörper-präsentierender Phagen nachzuweisen, wobei jeder Phage eine DNA-Sequenz umfasst, die nachweisbar von der Nucleinsäure anderer Phagen, die Antikörper mit unterschiedlichen Spezifitäten kodieren, oder sogar Phagen, die Antikörper mit den gleichen Spezifitäten kodieren, unterschieden werden kann, sofern die Nucleinsäuren der Phagen voneinander unterschieden werden können. Tatsächlich sind diese Verfahren nicht auf Erythrozyten oder ihre Antigene beschränkt, sondern können leicht auf jedes System übertragen werden, wo es wünschenswert ist, die Anwesenheit mehrerer Antigene auf einer Zelle oder in einer Probe nachzuweisen.
  • Dem Fachmann dürfte ersichtlich sein, wie an anderer Stelle hierin ausführlicher diskutiert wird, dass die Primer, wo einige Antikörper-präsentierende Phagen, wobei jeder mit einem unterschiedlichen Antigen von Interesse reagieren kann, in einer "Multiplex"-Reaktion verwendet werden können, wobei die Antigene in einer einzelnen Reaktion und/oder innerhalb der gleichen Probe nachgewiesen werden, so ausgewählt werden, dass die durch jedes Primerpaar (d. h. vorwärts und rückwärts gerichtete Primer und, falls gewünscht, eine Sonde für das davon hergestellte Amplikon) amplifizierten Regionen jeweils voneinander unterscheidbar sind.
  • C. Nachweis von Antikörpern im Serum
  • Die vorliegende Erfindung schließt ein Verfahren zum Nachweisen der Anwesenheit von Autoantikörpern oder Alloantikörpern im Serum ein, genauer gesagt, zum Nachweisen von in menschlichem Serum vorliegenden anti-Erythrozyten-Antikörpern (indirekter Antiglobulintest). Das Verfahren umfasst das In-Kontakt-Bringen eines menschlichen Erythrozyten, der mindestens ein Erythrozyten-Antigen exprimiert, mit einer zu analysierenden Serumprobe. Die Zelle wird gewaschen, um unspezifisch gebundene Antikörper zu entfernen und die Zelle wird dann mit einem Bakteriophagen in Kontakt gebracht, der ein Antiglobulinreagenz auf seiner Oberfläche präsentiert. Wenn es sich um einen menschlichen Antikörper (IgG, IgM und dergleichen) handelt, der an die Zelle gebunden ist, bindet der Bakteriophage mittels des durch den Phagen präsentierten Antiglobulinreagenz. Die Anwesenheit von spezifisch an die Zelle gebundenen Phagen (mittels einer Bindung an den menschlichen Antikörper auf der Zelle) kann dann, wie hierin offenbart, beruhend auf dem Nachweis einer in dem Bakteriophagen vorliegenden bekannten Nucleinsäuresequenz nachgewiesen werden. Auf diese Weise kann, wenn die Antigenzusammensetzung eines Satzes von Zellen bekannt ist, dieser Zellen-Referenzsatz verwendet werden, um die Anwesenheit von Antikörpern gegen diese Antigene in jeder Probe durch einfaches und schnelles Nachweisen der Nucleinsäure eines ein Antiglobulin auf seiner Oberfläche präsentierenden Bakteriophagen zu analysieren, so dass das "Phänotypisieren-durch-Genotypisieren" verwendet werden kann, um die Effizienz und Empfindlichkeit zu erhöhen, sowie um Assays zu automatisieren, die vorher unter Verwendung von auf Antikörpern beruhenden Nachweisverfahren durchgeführt wurden.
  • D. Nachweis von Antikörpern oder Komplementfragmenten auf Erythrozyten
  • Die vorliegende Erfindung schließt ein Verfahren zum Nachweisen der Anwesenheit von Autoantikörpern, Alloantikörpern oder Komplementfragmenten, die an die Oberfläche von Erythrozyten gebunden sind, ein, genauer gesagt, zur Diagnose einer autoimmunhämolytischen Anämie oder zur Bestimmung der Alloimmunzerstörung transfundierter Erythrozyten (direkter Antiglobulintest). Das Verfahren umfasst Waschen einer Probe von Erythrozyten, um unspezifisch gebundene Antikörper zu entfernen, und dann In-Kontakt-Bringen der Zellen mit Bakteriophagen, die ein Antiglobulinreagenz auf ihrer Oberfläche präsentieren. Wenn es sich um einen menschlichen Antikörper oder Komplement handelt, das an die Zelle gebunden ist, bindet der Bakteriophage mittels des durch den Phagen präsentierten Antiglobulinreagenz. Die Anwesenheit von spezifisch an die Zelle gebundenen Phagen (mittels einer Brandung an den menschlichen Antikörper oder das Komplement auf der Zelle) kann dann wie hierin offenbart, beruhend auf dem Nachweis einer in dem Bakteriophagen vorliegenden bekannten Nucleinsäuresequenz nachgewiesen werden. Auf diese Weise kann das "Phänotypisieren-durch-Genotypisieren" verwendet werden, um die Effizienz und Empfindlichkeit zu erhöhen, sowie um Assays zu automatisieren, die vorher unter Verwendung von auf Antikörpern beruhenden Nachweisverfahren durchgeführt wurden.
  • E. Durchführen von Spender/Empfänger-Kompatibilitäts-Tests
  • Die vorliegenden Erfindung schließt ein Verfahren zum Sicherstellen der Kompatibilität, das heißt nicht vorhandenen Reaktionsfähigkeit, zwischen Antikörpern im Patientenserum und einem aus einer zur Transfusion vorgesehenen Bluteinheit gezogenen Erythrozyten-Aliquot (Kreuzprobe) ein. Das Verfahren umfasst das In-Kontakt-Bringen einer Probe charakterisierter Spender-Erythrozyten mit einer Probe des zu testenden Patientenserums. Die Zellen werden gewaschen, um unspezifisch gebundene Antikörper zu entfernen, und die Zelle wird dann mit einem Bakteriophagen in Kontakt gebracht, der ein Antiglobulinreagenz auf seiner Oberfläche präsentiert. Wenn es an die Zelle gebundenen menschlichen Antikörper gibt, wie es bei einer nicht kompatiblen Kreuzprobe der Fall wäre, bindet der Bakteriophage mittels des durch den Phagen präsentierten Antiglobulinreagenz. Die Anwesenheit von spezifisch an die Zelle gebundenen Phagen (mittels einer Bindung an den menschlichen Antikörper auf der Zelle) kann dann, wie hierin offenbart, beruhend auf dem Nachweis einer in dem Bakteriophagen vorliegenden bekannten Nucleinsäuresequenz nachgewiesen werden. Auf diese Weise kann das "Phänotypisieren-durch-Genotypisieren" verwendet werden, um die Effizienz und Empfindlichkeit zu erhöhen, sowie um Assays zu automatisieren, die vorher unter Verwendung von auf Antikörpern beruhenden Nachweisverfahren durchgeführt wurden.
  • II. Kits
  • Die Anmeldung offenbart verschiedene Kits, die eine Verbindung umfassen, wie zum Beispiel einen Bakteriophagen, der einen Antikörper mit bekannter Spezifität für ein Antigen von Interesse präsentiert, ein Primerpaar zum Amplifizieren einer in dem Phagen vorliegenden bekannten Nucleinsäuresequenz, einen Molecular Beacon zum Nachweisen einer in der im Bakteriophagen enthaltenen Nucleinsäuresequenz vorliegenden bekannten Sequenz, ein Reagenz zur Verwendung bei einer IDAT-Reaktion (z. B. T7 RNA-Polymerase, DNA-Polymerase I, dNTPs und dergleichen) und/oder Zusammensetzungen der Erfindung, einen Applikator und Anleitungsmaterialien, welche die Verwendung der Verbindung zum Durchführen der erfindungsgemäßen Verfahren beschreiben, und jede Kombination der vorhergehenden Bestandteile. Obwohl beispielhafte Kits nachstehend beschrieben werden, ist dem Fachmann der Gehalt anderer nützlicher Kits angesichts der vorliegenden Offenbarung offensichtlich.
  • In einer Ausführungsform veranschaulicht die Anmeldung einen Kit zum Nachweisen der Anwesenheit einer Antigen-tragenden Einheit auf einer Zelle. Der Kit wird gemäß den in der Erfindung offenbarten Verfahren verwendet. Kurz gesagt, der Kit kann verwendet werden, um einen Bakteriophagen, der einen Antikörper präsentiert, der spezifisch bindet, mit der Antigen-tragenden Einheit in Kontakt zu bringen, wenn sie auf einer Zelle vorliegt. Dies liegt daran, wie an anderer Stelle hierin ausführlicher offenbart wird, dass die Bindung des Bakteriophagen an die Zelle und der anschließende Nachweis einer Nucleinsäuresequenz, von der bekannt ist, dass sie in dem Phagen vorliegt, anzeigt, dass der Phage an die Zelle gebunden ist, wodurch angezeigt wird, dass der durch den Phagen präsentierte Antikörper an sein zugehöriges Antigen gebunden hat, womit wiederum angezeigt wird, dass das Antigen auf der Zelle vorliegt, wodurch das Antigen durch dieses neue erfindungsgemäße Verfahren des "Phänotypisieren-durch-Genotypisieren" nachgewiesen wird.
  • Der Kit umfasst ferner einen Applikator, der zum Verabreichen des Bakteriophagen, der PCR-Primer, Molecular Beacons und dergleichen an eine Probe nützlich ist. Der jeweilige in dem Kit eingeschlossene Applikator wird z. B. von dem Verfahren abhängen, das verwendet wird, um das Antigen unter Verwendung des "Phänotypisieren-durch-Genotypisieren", wie hierin offenbart, nachzuweisen, und derartige Applikatoren sind auf dem Fachgebiet wohlbekannt und können unter anderen Dingen eine Pipette, eine Spritze, einen Tropfer und dergleichen einschließen. Darüberhinaus umfasst der Kit ein Anleitungsmaterial zur Verwendung des Kits. Diese Anleitungen verkörpern einfach die hierin bereitgestellte Offenbarung.
  • In einer Ausführungsform umfasst der Kit ferner einen Bakteriophagen, der einen Antikörper exprimiert, der spezifisch an ein Erythrozyten-Antigen, wie zum Beispiel, aber nicht beschränkt auf, die RBC-Antigene A, B, Rh(D), Rh(C), Rh(c), Rh(E), Rh(e), K, Fya, Fyb, M, N, S, s, Jka, Jkb bindet.
  • Ferner, in einer anderen Ausführungsform, umfasst der Kit ferner eine Molecular Beacon-Sonde, wobei die Nucleinsäuresequenz der Sonde zu einer Sequenz komplementär ist, wie zum Beispiel der Sequenz der SEQ ID NO: 3 und der Sequenz der SEQ ID NO: 4, wie hierin beispielhaft angegeben wird. Diese Sequenzen sind in der durch den Phagen enthaltenen Nucleinsäure enthalten, so dass Sequenzen, die damit hybridisieren, die Anwesenheit der Nucleinsäure des Phagen (Phagemid) nachweisen können. Genauer gesagt umfasst der Kit eine Molecular Beacon-Sonde mit einer Sequenz, wie zum Beispiel, aber nicht beschränkt auf, die Sequenz von SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 und SEQ ID NO: 10.
  • In noch einer anderen Ausführungsform umfasst der Kit einen PCR-Primer, der die in dem Phagen vorliegende Nucleinsäuresequenz amplifizieren kann. Ein derartiger PCR-Primer schließt einen Primer ein, der die Sequenz der SEQ ID NO: 1 und die Sequenz der SEQ ID NO: 2 umfasst, ist aber nicht darauf beschränkt.
  • Der Kit schließt einen pharmazeutisch verträglichen Träger ein. Die Zusammensetzung wird in einer geeigneten Menge bereitgestellt, wie an anderer Stelle hierin dargelegt wird.
  • Zusätzliche Kits, wie zum Beispiel solche zum Nachweisen von Komplement und Auto- und Alloantikörpern in einer Probe, sowie Kits zum Nachweisen irgendeines Liganden von Interesse, wo ein bekanntes Liganden/Rezeptor-Bindungspaar bekannt ist, sind auch eingeschlossen, wie einem Fachmann beruhend auf der hierin bereitgestellten Offenbarung leicht ersichtlich sein dürfte.
  • Die Erfindung wird nun mit Bezug auf die folgenden Beispiel beschrieben. Diese Beispiele werden nur zum Zwecke der Veranschaulichung bereitgestellt und die Erfindung sollte auf keinen Fall so ausgelegt werden, als sei sie durch diese Beispiele beschränkt, sondern sie sollte stattdessen so ausgelegt werden, dass sie jede Variation und alle Variationen, die als Ergebnis der hierin bereitgestellten Lehren zutage treten, umfasst.
  • BEISPIELE
  • Die derzeitigen in Blutentnahmeeinrichtungen, Blutbanken und Transfusionsservicelaboratorien verwendeten Technologien sind außerordentlich arbeitsintensiv, anfällig für menschliche Fehler und pro Test um eine Größenordnung teurer als diejenigen in anderen klinischen Laboratorien. Gekoppelt mit einem zunehmenden Mangel an geübten Medizintechnikern, schwindenden Vorräten von aus menschlichem Plasma abgeleiteten Phänotypisierungreagenzien und einer immanenten Schwierigkeit, Agglutinationsverfahren, die auf den 1950er Jahren beruhen, vollständig zu automatisieren, ist die Fähigkeit, die hunderte von Millionenen von Tests vor einer Transfusion pro Jahr auf schnelle, exakte und kostenwirksame Weise durchzuführen, eine deutliche Herausforderung.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft die Entwicklung neuer molekularer Technologien und dazugehöriger Reagenzien, um eine neue Klasse erneuerbarer, preiswerter Testreagenzien für Blutbanken mit hoher Qualität zu entwickeln, die in einem schnellen, automatisierbaren Assaysystem mit hohem Durchsatz funktionieren.
  • Ein zentrales Merkmal der hierin offenbarten neuen Technologien sind für Erythrozyten-Antigene spezifische monoklonale Antikörper, die auf der Oberfläche von Bakteriophagenpartikeln präsentiert werden. Die in der Natur vorkommende Anwesenheit einzigartiger DNA-Sequenzen innerhalb der Phagenpartikel ist ausgenutzt worden, um ein Assaysystem zu entwickeln, bei dem der Phänotyp eines Erythrozyten durch Analysieren des Genotyps des Nachweisreagenzes bestimmt wird, d. h. des Phagen, der einen Antikörper trägt, der spezifisch an ein auf einem Erythrozyten vorliegendes Antigen bindet.
  • Eine derartige Strategie bietet eine herausragende Empfindlichkeit und Spezifität, erfordert winzige Mengen an Testmaterialien und Reagenzien, kann leicht an eine Automatisierung angepasst werden und ist Vervielfältigungs-Strategien zugänglich, wodurch sie die Möglichkeit bietet, ein gleichzeitiges Antigen-Profiling einer Erythrozyten-Probe in einem einzigen Reaktionsgefäß durchzuführen, wobei all dies eine wesentliche Verbesserung gegenüber Verfahren des Stands der Technik bietet.
  • Ein Satz von durch Phagen präsentierten Antikörperreagenzien, die für klinisch signifikante Erythrozyten-Antigene spezifisch sind, wird unter Verwendung von Technologien für Phagenpräsentations-Antikörperbanken entwickelt. Beispiele für diese Reagenzien und Methodiken für ihre Herstellung sind zuvor beschrieben worden (siehe z. B. die US-Patente Nr. 5,876,925 und 6,255,455 ), und werden durch die hierin verwendeten Reagenzien beispielhaft angegeben. Es ist gezeigt worden, dass diese Phagenpräsentations-Antikörperreagenzien herkömmlichen Blutbankreagenzien überlegen sind und mit allen derzeit zur Verfügung stehenden auf Agglutination beruhenden Bluttypisierungsverfahren verwendet werden können. Darüberhinaus wird, beruhend auf dieser neuen Generation von anti-Erythrozyten-Antikörpern, eine neue Bluttypisierungsplattform offenbart, wobei die neue Plattform die gekoppelten phänotypischen/genotypischen Eigenschaften dieser neuen Reagenzien voll ausnutzt.
  • Somit demonstrieren die hierin offenbarten Daten, dass die vorliegende Erfindung einige lang existierende technische Hürden auf dem Gebiet der Blut-Typisierung überwindet. Die hierin offenbarten Daten demonstrieren die Entwicklung einer neuen Klasse erneuerbarer, preiswerter Blutbank-Testreagenzien mit hoher Qualität und Methodiken, die damit zusammenhängen, die in einem schnellen, automatisierbaren Assaysystem mit hohem Durchsatz funktionieren.
  • Ein Merkmal der hierin offenbarten neuen Technologie sind antigenspezifische monoklonale RBC-Antikörper, die auf der Oberfläche filamentöser Phagenpartikel präsentiert werden, die unter Verwendung etlicher auf dem Fachgebiet wohlbekannter Technologien und solcher Technologien, wie sie in der Zukunft entwickelt werden, isoliert werden. Die Phagenpartikel verknüpfen den Phänotyp eines auf dem Phagen präsentierten Antikörpers (der Antigen-bindenden Einheit) physikalisch mit seinem Genotyp (der einzigartigen DNA-Sequenz innerhalb des Partikels, welche die Aminosäuresequenz der jeweiligen Antigen-bindenden Einheit kodiert). Zusätzlich kann das Phagenpartikel den Phänotyp des auf seiner Oberfläche präsentierten Antikörpers und die in dem Phagenpartikel vorliegende DNA insofern verknüpfen, als ein anderer Anteil der DNA, welcher den Antigen-bindenden Anteil des Moleküls nicht kodiert, aber damit assoziiert ist (z. B. eine Beacon-Sequenz) nachgewiesen werden kann, so dass das Nachweisen der Identität des durch den auf dem Phagen präsentierten Antikörper gebundenen Antigens leicht durch Nachweisen der Anwesenheit des Beacons bestimmt werden kann.
  • Somit ist die in der Natur vorkommende Anwesenheit von einzigartigen DNA-Sequenzen innerhalb der Partikel hierin durch Entwickeln eines neuen Assaysystems ausgenutzt worden, bei dem der Phänotyp einer RBC, die analysiert wird, durch Analysieren des Genotyps des Nachweisreagenzes, d. h. des Antikörper-präsentierenden Phagen und des DNA-Moleküls, das einen derartigen Antikörper kodiert, oder eine andere einzigartige DNA-Sequenz (d. h. eine Beacon-Sequenz) innerhalb der durch den Phagen enthaltenen DNA bestimmt wird. Die Logik hinter der Entwicklung dieses neuen Ansatzes des "Phänotypisieren durch Genotypisieren mit Reagenz" ist die Erkenntnis, dass Methodiken, die Nucleinsäurenachweisschemata verwenden, die höchste Empfindlichkeit und Spezifität bieten, winzige Mengen von Testmaterialien und Reagenzien erfordern und leicht an eine Automatisierung angepasst werden können.
  • Darüberhinaus sind auf Nucleinsäure beruhende Assays Vervielfältigungsstrategien zugänglich, die im Falle der Blut-Typisierung die Möglichkeit bieten würden, das Antigen-Profil einer bestimmten RBC-Probe in einem einzigen Reaktionsgefäß gleichzeitig zu bestimmen. Die Möglichkeit, Typisierungsreaktionen unter Verwendung der in dieser Forschungsanmeldung vorgeschlagenen Technologie zu vervielfältigen, würde einen wesentlichen Vorteil sowohl für Blutentnahmeeinrichtungen als auch Transfusionsdienste darstellen, die in der Vergangenheit auf die herkömmliche "ein Röhrchen/ein Ergebnis"-Agglutinationsmethodik beschränkt sind. Deshalb ermöglichen die hierin beschriebenen neuen Assays den Nachweis mehrerer auf einer RBC vorliegender Antigen-tragender Einheiten, um leicht und schnell nachgewiesen zu werden.
  • Phagenpräsentations-Technologie
  • Im Kern der vorgeschlagenen Technologie befinden sich Antigen-spezifische monoklonale RBC-Antikörper, die auf der Oberfläche filamentöser Bakteriophagenpartikel präsentiert werden (siehe Übersicht in Siegel, 2001, Transfusion Med. Rev. 15: 35–52). Im Gegensatz zu teuren und zeitraubenden herkömmlichen zellulären Verfahren zum Erzeugen von monoklonalen Antikörpern aus B-Lymphozyten funktioniert die Phagen-Antikörperpräsentation durch Immortalisieren der Immunglobulingene statt der Zellen, aus denen sie abgeleitet wurden. Unter Verwendung von molekularen Verfahren anstelle einer Zelltransformation werden "Banken" von Phagenpartikeln aus Populationen von B-Zellen hergestellt, wobei jeder Phage außen eine bestimmte Antikörperspezifität präsentiert und innen die einzigartige DNA-Sequenz des Antikörpers enthält.
  • Verfahren zum Selektieren von für bestimmte Zelloberflächenantigene spezifischen Phagenpartikeln aus derartigen Banken sind zuvor beschrieben worden (z. B. Siegel et al., 1997, J. Immunol. Meth. 206: 73–85; U.S-Pat. Nr. 5,876,925 an Siegel) und hunderte von einzigartigen, durch einen Phagen präsentierte menschliche monoklonale anti-Rh(D)-Antikörpern sind bis heute hergestellt worden (z. B. Siegel et al., 1997, J. Immunol. Meth. 206: 73–85; Chang und Siegel, 1998, Blood 91: 3066–3078; U.S. Pat. Nr. 6,255,455 an Siegel). Obwohl auf diese Weise hergestellte monoklonale Antikörper als lösliche (nicht an Phagen gebundene) Antikörpermoleküle exprimiert werden können, die RBCs unter Verwendung der herkömmlichen indirekten (d. h. Coombs) Antiglobulinreaktion agglutinieren können (siehe Siegel und Silberstein, 1994, Blood 83: 2334–2344), ist etabliert worden, dass die tatsächlichen Phagenpartikel, welche die rekombinanten monoklonalen Antikörper präsentieren, durch Substituieren von anti-M13-Phagenantikörpern für das Coombs-Reagenz bei Agglutinationsreaktionen verwendet werden können (Siegel et al., 1997, J. Immunol. Meth. 206: 73–85; U.S. Pat. Nr. 5,985,543 an Siegel). Ein Vorteil dieses Verfahrens bei Agglutinationsassays unter Verwendung intakter, den Antikörper-präsentierender Phagen ist eine erhöhte Empfindlichkeit, das so wenig wie ungefähr 10 anti-Rh(D)-exprimierende Phagenpartikel (im Vergleich zu etwa 150–1000 herkömmlichen IgGs) auf Grund des höheren Ausmaßes an Vernetzung durch anti-M13, das durch die relativ große Größe der Partikel (ungefähr 0,5 Mikrometer) geschaffen wird, nötig sind, um eine Agglutination zu induzieren.
  • Für eine kommerzielle Anwendung wichtiger ist die Fähigkeit derartiger durch Phagen präsentierter Antikörper, ihre eigene Replikation innerhalb von E. coli zu steuern, was es ermöglicht, genügend Reagenz zur Verwendung bei einer herkömmlichen Erythrozyten-Typisierung von nahezu 500.000 Bluteinheiten bei Reagenzkosten von wenigen Dollar herzustellen (siehe Siegel et al., 1997, J. Immunol. Meth. 206: 73–85).
  • Die Substitution herkömmlicher Blutbank-Typisierungsreagenzien durch Phagenpräsentierte rekombinante Antikörper bei Agglutinationsassays ist an und für sich wegen der vorstehend festgestellten Gründe – der Fähigkeit, menschliche Antikörper ohne den Bedarf einer B-Zell-Transformation zu klonieren, der höheren Empfindlichkeit des Assays, der preiswerten Herstellung in einer bakteriellen Kultur und anderer – eine enorme Verbesserung gegenüber auf Coombs beruhenden Agglutinationsmethodiken des Stands der Technik (Siegel, 2001, Transfusion Med. Rev. 15: 35–52). Die hierin offenbarten Daten demonstrieren jedoch die weitere dramatische Verbesserung gegenüber der auf Phagen beruhenden Technologie durch Ausnutzen der in der Natur vorkommenden Anwesenheit einzigartiger DNA-Sequenzen, die innerhalb der Antikörper-exprimierenden Phagenpartikel enthalten sind, zum Erleichtern einer Automatisierung mit hohem Durchsatz und zum Typisieren mehrerer Antigene in einem einzelnen Reaktionsgefäß (Vervielfältigung). Das erfindungsgemäße Verfahren kann die verschiedenen in 1 veranschaulichten Schritte umfassen und wird an anderer Stelle hierin ausführlicher offenbart.
  • Unter Verwendung von Phagenpräsentation und anderen auf dem Fachgebiet erhältlichen Technologien kann ein Satz neuer monoklonaler Reagenzien, die für klinisch signifikante RBC-Antigene spezifisch sind, gemäß den hierin bereitgestellten Lehren sowie von auf dem Fachgebiet bekannten und in der Zukunft zu entwickelnden Verfahren kloniert, hergestellt und die für sie kennzeichnende Leistung bestätigt werden. Zum Beispiel demonstrierten frühere Untersuchungen die Herstellung und Isolierung derartiger Reagenzien mit Spezifitäten für die RBC-Antigene B, anti-Rh(D), M und N (siehe z. B. Chang und Siegel, 2001, Transfusion. 41:6–12; Siegel et al., 1997, J. Immunol. Meth. 206: 73–85; Chang und Siegel, 1998, Blood 91: 3066–3078; Czerwinski et al., 1995, Transfusion. 35: 137–144; Czerwinski et al., 1999, Transfusion. 39: 364–371). Derartige Verfahren können angewendet werden, um unter anderem anti-A, anti-Rh (C, c, E, e), sowie Antikörper in den Blutgruppen Kell, Duffy, Kidd und Ss zu entwickeln. Diese Reagenzien können bei herkömmlichen manuellen und automatisier ten Agglutinationsassays sowie bei den neuen, hierin offenbarten Verfahren, verwendet werden.
  • Ein Index-Satz von anti-Blutgruppe B- und anti-Rh(D)-Phagen wurde hergestellt und einzigartige DNA-Sequenzmarker (d. h. Beacon-Sequenzen), Oligonucleotidprimer und Hybridisierungsstellen und Polymerasepromotoren werden in die DNA eingefügt, die jeden Antikörper kodiert. Die Leistungskennzeichen etlicher Nucleinsäure-Amplifikations/Nachweis-Schemata werden bewertet, um die RBC-Bindung von jedem Reagenz, wie hierin beispielhaft angegeben, unter Verwendung von Gruppe B- und anti-Rh(D)-Phagenreagenzien zu identifizieren und zu quantifizieren.
  • Die hierin offenbarten Daten demonstrieren, dass Polymerasekettenreaktion (PCR) und Agarosegelelektrophorese verwendet werden können, um die Bindung von zwei unterschiedlichen anti-RBC-Antikörperspezifitäten gleichzeitig nachzuweisen und zu unterscheiden. Diese Daten demonstrieren, dass eine Durchmusterung unter Verwendung dieser Verfahren schnell durchgeführt werden kann und für eine kommerzielle Anwendung dimensioniert und automatisiert werden kann.
  • Amplifikation von Phagen-DNA unter Verwendung der Polymerasekettenreaktion:
  • In einer Ausführungsform wurde die Bindung eines RBC-spezifischen, durch einen Phagen präsentierten Antikörpers, z. B. eines anti-Rh(D) exprimierenden Phagenpartikels, durch die Zugabe von Oligonucleotidprimern nachgewiesen, die für die Nucleinsäuresequenz des anti-Rh(D) spezifisch waren, die freigesetzt wurde, wenn die gebundenen Phagenpartikel zum Beispiel erhitzt wurden, um die Phagenhülle zu denaturieren. Ein Primer kann zu einer allgemeinen Sequenz komplementär sein, die in der Phagen-DNA (unabhängig von der Antikörperspezifität) enthalten ist, und der andere Primer kann z. B. zu einer Sequenz komplementär sein, die für den Phagen spezifisch ist, wie zum Beispiel, aber nicht beschränkt auf, die hypervariable CDR3-Region der schweren Kette des Antikörpers (d. h. der Sequenz, die für einen bestimmten Antikörper einzigartig ist). Die Messung der so erhaltenen amplifizierten Antikörper-DNA kann die Anwesenheit des diesem Antikörper zugehörigen Antigens auf der Oberfläche einer Zelle, die untersucht wird, anzeigen. Ohne einer bestimmten Theorie verpflichtet sein zu wollen, können etliche unterschiedliche, durch Phagen präsentierte Blutgruppen-Antikörper gleichzeitig mit der gleichen Probe von Erythrozyten in Kontakt gebracht werden und die Unterschiede der Antikörper-Nucleotidsequenz können ausgenutzt werden, um zu bestimmen, welche gebunden haben und welche nicht, wie hierin unter Verwendung von anti-B- und anti-Rh(D)-Antikörpern, die auf unterschiedlichen Phagen präsentiert werden, demonstriert wird. Ein derartiges "Vervielfältigen" ist durch Agglutinationsverfahren nicht möglich, da man niemals sagen könnte, welcher Antikörper (welche Antikörper) die Agglutination verursachte(n).
  • Dass eine derartige Methodik möglich ist, d. h. dass die gleichzeitige Bindung mehrerer anti-RBC-Antikörper durch die Amplifikation und den Nachweis von Antikörper-DNA nachgewiesen werden kann, wird durch die hierin offenbarten Daten demonstriert, wo ein Modellsystem eingesetzt wurde, das durch Phagen präsentierte menschliche monoklonale anti-Blutgruppe B- und anti-Rh(D)-Antikörper umfasste. Dem Fachmann dürfte jedoch beruhend auf der hierin bereitgestellten Offenbarung leicht ersichtlich sein, dass eine derartige "Vervielfältigungs"-Strategie nicht auf irgendwelche bestimmten Antikörper beschränkt ist, sondern verwendet werden kann, um mehrere Erythrozyten-Antigene unter Verwendung einer großen Fülle Antikörper-präsentierender Phagen nachzuweisen, wobei jeder Phage eine DNA-Sequenz umfasst, die nachweisbar von der Nucleinsäure anderer Phagen, die Antikörper mit unterschiedlichen Spezifitäten kodieren, oder sogar von Phagen, die Antikörper mit der gleichen Spezifität kodieren, unterschieden werden kann, sofern die Nucleinsäuren der Phagen voneinander unterschieden werden können. Unter Verwendung von PCR und Agarosegelelektrophorese, um einzigartige kodierende Sequenzen in jedem Typ von Phagenpartikel zu amplifizieren und, beruhend z. B. auf der Größe der Amplikons, nachzuweisen, demonstrieren die hierin offenbarten Daten, dass eine Probe von RBCs für B und Rh(D) mit außerordentlicher Empfindlichkeit gleichzeitig phänotypisiert wurde. Das heißt, der einzelne Assay wies das Äquivalent von 20 Attogramm herkömmlichem IgG nach und erforderte 10.000fach weniger RBCs (135 picol oder insgesamt etwa 1500 RBCs) als eine herkömmliche Agglutinationsreaktion.
  • In der Praxis kann jedoch eine schnelle, dimensionierbare und automatisierbare Anzeige der DNA anstelle von Agarosegelelektrophorese verwendet werden. Viele Verfahren sind auf dem Fachgebiet wohlbekannt, und mehrere derartige Verfahren werden ausführlicher an anderer Stelle hierin diskutiert. Nichtsdestotrotz dürfte dem Fachmann, sobald er mit den Lehren der Erfindung ausgestattet wäre, selbstverständlich sein, dass eine große Fülle von Verfahren zum Nachweisen von Nucleinsäuren bei den erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden kann, und die Erfindung ist in keiner Weise auf die hierin beispielhaft angegebenen und diskutierten Verfahren beschränkt.
  • Amplifikation von Phagen-DNA unter Verwendung von Transkriptions-vermittelter Amplifikation
  • Zusätzlich zur Verwendung von PCR für einen Phagen-DNA-Amplifikationsschritt (Schritt B in 1) können bei den erfindungsgemäßen Verfahren Verfahren verwendet werden, die auf dem Nachweis der Transkription von Phagen-Antikörper-DNA anstelle von ihrer Amplifikation beruhen. Genauer gesagt ist ein Immunnachweis durch dieses Verfahren verwendet worden, um die Bindung von Antikörpern nachzuweisen, an die Oligonucleotide, welche die Promotorstelle für T7 RNA-Polymerase enthalten, wie in Zhan et al. beschrieben (2001, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98: 5497–5502) mit Glutaraldehyd chemisch konjugiert worden sind. Diese Technik zur Transkription von DNA, die auf Grund ihrer physikalischen Assoziation in Phagenpartikein in vivo an einem Antikörper befestigt ist, kann als Alternative zu PCR und anderen Amplifikationstechniken verwendet werden. Diese Technologie ist IDAT benannt worden, was für durch T7 RNA amplifizierten Immunnachweis steht (Zhang et al., 2001, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98: 5497–5502). Indem man die Promotorstelle für T7 RNA-Polymerase oberhalb eines beliebigen Sequenzmarkers in der Phagemid-DNA anbringt, produziert die Zugabe von T7 RNA-Polymerase und NTPs durch das aufeinanderfolgende und fortschreitende Binden von T7-Enzymen an ihren Promoter schnell (100 Basen pro Sekunde) Marker-Transkripte.
  • Da eine Bindung von T7 RNA-Polymerase an RNA-Produkte nicht vorkommt, ist die Amplifikation linear und nicht exponentiell wie bei PCR. Zum RBC-Phänotypisieren stellt eine derartige Amplifikation einen Vorteil gegenüber PCR (und sicherlich gegenüber herkömmlichen Agglutinationsverfahren) dadurch bereit, dass eine quantitative Information (d. h. die relative Kopienzahl von Antigen pro Zelle) über mehrere Antigene gleichzeitig aus einer einzigen Probe von Zellen bestimmt werden kann. Ein Beispiel unter anderen dafür, wo eine derartige Quantifizierung bei Blutbankverfahren nützlich sein kann, ist der Nachweis von "schwachen Rh(D)"-Phänotypen, wie im Übersichtsartikel von Mollison et al. (1997, In: Blond Transfusion in Clinical Medicine, 10. Aufl., Blackwell Scientific Publications, Oxford, England) beschrieben.
  • Ein zusätzlicher Vorteil von auf Transkription beruhenden Nachweisverfahren, wie zum Beispiel, aber nicht beschränkt auf IDAT, gegenüber PCR, ist die Eliminierung des Durchlaufens von Temperaturzyklen, sobald die Antikörper-Phagen-DNA aus den Partikeln freigesetzt ist. Die Elimierung von Reaktionen, die Temperaturzyklen durchlaufen, vereinfacht die Gerätegestaltung und senkt die Kosten des Assays. Nichtsdestotrotz haben PCR und Transkriptionsverfahren jeweils Vorteile und Nachteile, die auf dem Fachgebiet wohlbekannt sind, so dass der Fachmann leicht bestimmen kann, welches Verfahren oder ob irgendein anderes Verfahren für den jeweiligen Assay verwendet werden kann und die dafür gewünschten Bedingungen. Dies liegt daran, dass PCR, Transkription und viele andere Verfahren zum Nachweisen einer Nucleinsäure bei den Verfahren der vorliegenden Erfindung erfolgreich verwendet werden können und dem Fachmann dürfte ersichtlich sein, welches Verfahren beruhend auf Faktoren, die auf dem Fachgebiet anerkannt sind, eingesetzt werden soll.
  • Nachweis von Phagen-DNA unter Verwendung von Molecular Beacons:
  • Bei Molecular Beacons handelt es sich um Oligonucleotide mit Stamm- und Schleifen-Struktur mit einer fluoreszierenden Markierung am 5'-Ende und einem allgemeinen Quencher am 3'-Ende (siehe z. B. Tyagi und Kramer, 1996, Nature Biotech. 14: 303–308; Broude, 2002, Trends in Biotechnology 20: 249–256). Wenn der Stamm geschlossen ist (in Abwesenheit einer komplementären Nucleinsäure) befinden sich Fluorophor und Quencher in unmittelbarer Nachbarschaft und die Fluoreszenzenergie wird durch den Quencher absorbiert und die Fluoreszenz ist gequencht und nicht nachweisbar. In Anwesenheit einer komplementären Nucleinsäure hybridisiert die Schleife des Beacons und der Fluorophor und der Quencher trennen sich, so dass kein Quenching stattfindet. Photonen werden dann aus dem Fluorophor ungequencht emittiert, bei der für den Fluorophor spezifischen Wellenlänge, und dann ist Fluoreszenz nachweisbar. Durch Kombinieren von etlichen Beacons in einem Röhrchen, jedes mit einem anderen Fluorophor am 5'-Ende, können multiple DNA-(Tyagi et al, 1998, Nature Biotech. 16: 49–53) oder RNA-(de Baar et al., 2001, J. Clin. Microbiol. 39: 1895–1902) Ziele gleichzeitig nachgewiesen werden, indem man das aus dem Reaktionsgefäß emittierte Farbspektrum misst.
  • Molecular Beacons mit zwei unterschiedlichen Farben können in die PCR- und/oder Transkriptionsreaktion einbezogen werden, um die Anwesenheit von Antikörper-spezifischer DNA nachzuweisen. Wie hierin an anderer Stelle beschrieben wird, werden anti-Rh(D) und anti-B-Phagen-DNA modifiziert, um kurze DNA-Sequenzen zu enthalten, die amplifiziert (oder transkribiert) werden und anschließend unter Verwendung von Molecular Beacons wie an anderer Stelle hierin beschrieben nachgewiesen werden können. Die Planung und Herstellung derartiger "Beacon"-Sequenzen und Nucleinsäuresequenzen, umfassend dazu "komplementäre" Sequenzen, sind auf dem Fachgebiet wohlbekannt. Tatsächlich sind Softwareprogramme im Handel erhältlich, um bei der Planung derartiger Sequenzen zu helfen, einschließlich der Sequenzen von Molecular-Beacon-Sonden, die zu einer Sequenz von Interesse komplementär sind.
  • Ferner umfassen derartige Beacons und Sequenzen, die daran binden, wie zum Beispiel die in 4 beispielhaft angegebenen, die folgenden Sequenzen: die Sequenz des inserts "B140" ist
    5'-TGCTATGTCACTTCCCCTTGGTTCTCTCATCTGGCCTGGTGCAATAGGCCCTGC ATGCACTGGATGCACTCTATCCCATTCTGCAGCTTCCTCATTGATGGTCTCTTT TAACATTTGCATGGCTGCTTGATGTCCCCCCACT-3' (SEQ ID NO: 3)
    und die Sequenz des Inserts "D140" ist
    5'-TGCTATGTCACTTCCCCTTGGTTCTCTCATCTGGCCTGGTGCAATAGGCCCTGC ATGCACTGGATGCACTCTGTTTTACCTCATTATCCTTCTGCCAGCGCTAGCTTT TAACATTTGCATGGCTGCTTGATGTCCCCCCACT-3' (SEQ ID NO: 4).
  • Der vorwärts gerichtete PCR-Primer ("PCR-F") ist:
    5'-TGCTATGTCACTTCCCCTTGGTTCTCT-3' (SEQ ID NO: 5)
    und der rückwärts gerichtete PCR-Primer ("PCR-R") ist:
    5-AGTGGGGGGACATCAAGCAGCCATGCAAAT-3' (SEQ ID NO: 6).
  • Die B-Beacon und D-Beacon Sequenzen sind folgendermaßen, wobei die fluoreszierenden Derivate an den Enden und die Stamm-Strukturen in Kleinbuchstaben gezeigt werden. Die "B-Beacon"-Sequenz ist folgendermaßen:
    6-FAM-gcgagcATCCCATTCTGCAGCTTCCTCATTGATGGTCTCgctcgc-DABCYL (SEQ ID NO: 7). Der "D-Beacon" ist:
    TAMRA-cgagcGTTTTACCTCATTATCCTTCTGCCAGCGCTAGCgctcgc-DABCYL (SEQ ID NO: 8). Die Großbuchstaben in den Beacon-Sequenzen stellen die jeweiligen Sequenzen in B140 und D140 dar, an welche die Beacons sich anlagern. Deshalb handelt es sich bei den Großbuchstaben um die Sequenzen der Oligonucleotide, die für den Nachweis des DNA-Arrays verwendet werden. Das heißt, ein "B-Oligo" ist:
    5'-ATCCCATTCTGCAGCTTCCTCATTGATGGTCTC-3' (SEQ ID NO: 9) und ein "D-Oligo" ist: 5'-GTTTTACCTCATTATCCTTCTGCCAGCGCTAGC-3' (SEQ ID NO: 10).
  • Die vorliegende Erfindung ist nicht auf diese beispielhaft angegebenen Sequenzen beschränkt; stattdessen schließt die Erfindung solche zusätzlichen Sequenzen ein, die durch den Fachmann, sobald er mit der hierin bereitgestellten Offenbarung ausgestattet ist, leicht geplant werden können. Das heißt, die Planung und Verwendung von Beacon-Sequenzen sind auf dem Fachgebiet wohlbekannt und werden hierin nicht weiter diskutiert und die hierin offenbarten Sequenzen sind lediglich ein Beispiel für die Sequenzen, die verwendet werden können, um die Erfindung auszuüben. Zum Beispiel sind viele Fluoreszierer-Quencher-Paare auf dem Fachgebiet wohlbekannt, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, diejenigen, die hierin beispielhaft angegeben sind, die 6-Carboxyfluorescein (6-FAM), 6-Carboxytetramethylrhodamin (TAMRA) und DABCYL (ein nicht fluoreszierendes Chromophor, das als universeller Quencher für jedes Fluorophor in einem Molecular Beacon dient: 4-(4-Dimethylaminophenylazo)-benzoesäure) einschließen. Derartige Moleküle sind auf dem Fachgebiet wohlbekannt und werden z. B. in den US-Patenten Nr. 6,395,517 und 6,615,063 beschrieben und werden hierin nicht weiter diskutiert.
  • Nachweis von Phagen-DNA unter Verwendung von Oligonucleotid-Microarrays:
  • Zusätzlich zu Molecular Beacons kann die Hybridisierung fluoreszierender RBC-Phagen-Antikörper-Amplikons (aus PCR) oder -Transkripte (unter Verwendung von IDAT hergestellt) an Arrays komplementärer Oligonucleotidsonden verwendet werden, um die Menge gebundenen Antikörpers (falls vorhanden) in einer Probe indirekt zu quantifizieren. Ferner, obwohl die Verwendung herkömmlicher Verfahren zur Hybridisierung an derartige Microarrays diffusionsbeschränkt ist und einige Stunden erfordern kann, um adäquate Fluoreszenzsignale zu erhalten, kann dieser Vorgang durch die Anwendung eines elektrischen Feldes über die Oberfläche eines preiswerten Indium-Zinnoxidbeschichteten Glas-Objektträgers, wie in Su et al. (2002, Electrophoresis 23: 1551–1557) beschrieben, um 2–3 Größenordnungen beschleunigt werden. Dieses, auf dem Fachgebiet als "durch ein elektrisches Feld beschleunigte Hybridisierung an Oligonucleotid-Microarrays" bekannter Vorgang stellt schnelle Ergebnisse bereit, z. B. beträgt die Zeit vom Auftragen von DNA (oder RNA) bis zum Ablesen weniger als 10 Minuten. Deshalb kann die durch ein elektrisches Feld beschleunigte Hybridisierung verwendet werden, um den schnellen Nachweis von Antigenen von Interesse, die auf einer Zelle (z. B. einem Erythrozyten, einem Thrombozyten und dergleichen) vorliegen, weiter zu verstärken.
  • Die vorliegende Erfindung ist nicht auf das Typisieren von Blut beschränkt, sondern sie hat weitreichende potenzielle Verwendungen auf vielen Gebieten der Transfusionsmedizin, wie zum Beispiel, aber nicht beschränkt auf, Thrombozyten-Antigen-Tests, und findet eine breite Anwendung in der Transplantationsimmunologie (dem HLA-Antigen-Typisieren) und insbesondere der forensischen Medizin, wo das Vervielfältigen von Reaktionen die größte Menge an Information aus winzigen Mengen von Testproben bereitstellen kann. Zusätzlich kann die Konstruktion von Antiglobulin-Reagenzien (z. B. anti-IgG, -IgM, anti-Komplementkomponente C3), die auf Phagenpartikeln exprimiert werden, verwendet werden, um ein Durchmustern von Serum auf vorgebildete anti-RBC-Antikörper, reverse Gruppen-Typisierung durchzuführen, oder um direkte/indirekte Coombs-Tests unter Verwendung einer Methodik durchzuführen, welche die mit den Antiglobulin-Reagenzien assoziierte DNA nachweist. Die Antiglobulin-Phagen-Reagenzien können aus Maus-Immun-Phagenpräsentationsbanken oder durch das Klonieren vorexistierender Hybridom-Immunglobulin-mRNA unter Verwendung auf dem Fachgebiet wohlbekannter Techniken isoliert werden.
  • Anti-Blutgruppe B und anti-Rh(D)-Typisierung unter Verwendung von Phagen-DNA-Analyse
  • Die hierin offenbarten Daten demonstrieren den Nachweis von anti-Blutgruppe B und anti-Rh(D)-Antigenen auf RBCs unter Verwendung der neuen erfindungsgemäßen Verfahren. Das heißt, zwei durch Phagen präsentierte menschliche monoklonale Antikörper – ein anti-Blutgruppe B- und ein anti-Rh(D)-Antikörper-, die beide früher aus dem Anreichern von Phagenpräsentationsbanken isoliert wurden, die aus immunisierten Individuen konstruiert wurden (Chang und Siegel, 2001, Transfusion. 41: 6–12; Siegel et al., 1997, J. Immunol. Meth. 206: 73–85) wurden verwendet, was den Vervielfältigungs-Nachweis dieser beiden Antigene demonstriert.
  • Für die Zwecke dieser Untersuchung wurde ein Antikörper (der als FB5.7 bezeichnete anti-B-Antikörper) als ein durch Phagen präsentiertes Fab-Fragment und der andere (der als E1 M2 bezeichnete anti-Rh(D)-Antikörper) als einkettiges Fv-Fragment (scFv) exprimiert (2). Diese Antikörper wurden zuvor in Chang und Siegel, 2001, Transfusion. 41: 6–12; Siegel et al., 1997, J. Immunol. Meth. 206: 73–85; Chang und Siegel, 1998, Blood 91: 3066–3078; und den US-Patenten Nr. 5,876,925 , Nr. 5,985,543 und Nr. 6,255,455 , alle an Siegel, beschrieben. Diese Daten demonstrieren, dass verschiedene Antikörperformen (z. B. Fab, scFv und dergleichen) bei den erfindungsgemäßen Verfahren leicht verwendet werden können.
  • Es wurde vorhergesagt, dass eine PCR-Amplifikation der einen Antikörper kodierenden Regionen der entsprechenden Phagemid-DNA Produkte unterschiedlicher Länge produziert (d. h. 1600 bp und 1000 bp) und dann wurde anstelle von herkömmlichen, auf Antikörpern beruhenden Nachweisverfahren, Agarosegelelektrophorese verwendet, um die Anwesenheit von anti-B und/oder anti-Rh(D)-Antikörpern genetisch zu bestimmen, beruhend auf den unterschiedlichen Größen der vorhergesagten Amplikons.
  • Vor dem Durchführen von Bindungsassays der durch einen Phagen präsentierten Reagenzien mit RBCs wurde eine Reihe von PCR-Reaktionen mit seriellen Verdünnungen der anti-B- oder anti-Rh(D)-Phagenpräparationen durchgeführt, um das neue genetische Nachweisverfahren zu validieren und um dessen Empfindlichkeit zu bestimmen. Eine PCR der Antikörper kodierenden Phagemid-Regionen produzierte die vorhergesagten Produktgrößen von 1600 bp für die anti-B-kodierende Fab-DNA und 1000 bp für die anti-Rh(D)-kodierende scFv-DNA. Bemerkenswerterweise betrug die Nachweisempfindlichkeit etwa 100 Phagen-Antikörper-Partikel, wenn man nur 10% der gesamten PCR-Reaktionsprodukte sichtbar macht. Dieser Wert stellt das Äquivalent von nur 1,7 × 10–22 Mol oder ungefähr 2 × 10–17 g IgG (etwa 20 Attogramm) dar, ein überraschendes Empfindlichkeitsniveau, das durch frühere Bluttypisierungsverfahren nicht erreicht worden ist.
  • Zur PCR-Amplifikation der Inserts war der vorwärts gerichtete Primer ("5-prime LC") folgendermaßen: 5'-AAGACAGCTATCGCGATTG-3' (SEQ ID NO: 1); und der rückwärts gerichtete Primer ("GBACK") war folgendermaßen:
    5'-GCCCCCTTATTAGCGTTTGCCATC-3' (SEQ ID NO: 2).
  • Um zu bestimmen, ob dieser genetische Assay der Verwendung von durch Phagen präsentierten anti-B- und anti-Rh(D)-Antikörpern verwendet werden könnte, um RBCs korrekt zu phänotypisieren, wurde ein Experiment durchgeführt, das eine perfekte Übereinstimmung zwischen den bekannten Phänotypen der Reagenz-RBCs, den Ergebnissen von herkömmlichen, auf Agglutination beruhenden Tests, die unter Verwendung der Phagen-Antikörper durchgeführt wurden, und den Ergebnissen der neuen genetischen Testverfahren (3) demonstrierte. Deshalb demonstrieren die hierin offenbarten Daten die Wirksamkeit des neuen "Phäntypisieren durch Genotypisieren mit Reagenz" sowie die Fähigkeit, Phänotypbestimmungen zu vervielfältigen.
  • Darüberhinaus ist der Assay unter Verwendung des hierin offenbarten PCR-Protokolls bemerkenswert empfindlich, wenn man bedenkt, dass die in den Spuren des in 3 abgebildeten Agarosegels nur 10% des gesamten Reaktionsprodukts darstellen, und die Anzahl der zu jeder PCR-Reaktion gegebenen RBCs nur etwa 1500, oder das Äquivalent von 135 picol RBCs betrug. Im Gegensatz dazu benutzen herkömmliche Verfahren ungefähr 10.000-mal mehr RBCs pro Agglutinationsassay.
  • Entwicklung durch Phagen präsentierter anti-RBC-Typisierungsreagenzien
  • Die zum Klonieren, Herstellen und Validieren der Leistungskennzeichen durch Phagen präsentierter monoklonaler anti-RBC-Antikörper benutzten Verfahren sind Schwerpunkt zahlreicher Publikationen (z. B. Siegel, 2002, In: Methods in Molecular Biology: Antibody Phage Display: Methods and Protocols, Bd. 178, S. 219–226, Aitkem & O'Brien, Hrsg., Humana Press, Totowa, N. J.; Siegel, 2000, In: Phage Display of Proteins and Peptides: A Laborstory Manual, Bd. 23, S. 23.21–23.32, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N. Y.; Siegel und Chang, 1997, In: Antibody Engineering: New Technologies, Applications, & Commercialization, IBC, Boston, Mass.), sowie einiger erteilter US-Patente (siehe vorstehend). Proben (peripheres Restblut, Milzgewebe, Knochenmark und dergleichen), aus welchen andere RBC-Antigenspezifitäten als B, Rh(D), M und N isoliert wurden, sind unter Verwendung von diagnostischem Restmaterial von Patienten bereits archiviert worden.
  • Schnelle und skalierbare Methodik des Phagen-Antikörper-Nachweises
  • Die Phagemid-DNA von anti-RBC-Blutgruppenantikörpern, z. B. anti-B und anti-Rh(D), werden modifiziert, so dass die Phagenantikörper jeweils einen einzigartigen Marker enthalten, der durch PCR amplifiziert oder durch T7 RNA-Polymerase transkribiert und anschließend durch ein entsprechendes Paar einzigartiger Molecular Beacons oder von in einem Microarray angeordneten Oligonucleotiden nachgewiesen werden kann. Die Marker werden außerhalb der anti-B oder anti-Rh(D) kodierenden Region in die Phagemid-DNA eingefügt, um die Antikörperexpression und Präsentation auf der Phagenhülle nicht zu unterbrechen (siehe z. B. 4). Eine ausgewählte Anzahl von Schemata zur/zum Nucleinsäureamplifikation/-nachweis wird unter Verwendung des modifizierten Satzes durch Phagen präsentierter anti-RBC-Antikörper durchgeführt, um die Leistungskennzeichen zu bewerten, um die Wirksamkeit des schnellen, vervielfältigten RBC-Phänotypisierens zu maximieren.
  • Zur Modifikation der Phagemid-DNA wurden B140 und D140 sequenziert. PCR-F und PCR-R sind gemeinsam mit B-Beacon/Oligo in kinetischen PCR-Assays (Molecular Beacon) zum Messen des Spiegels von HIV-gag cDNA (O'Doherty et al., 2000, J. Virol. 74: 10074–10080) durchgeführt worden. B140 und D140 werden in anti-B- oder anti-Rh(D)-Phagemids unter Verwendung von Standard-Klonierungstechniken ligiert. Antikörper exprimierende Phagenpartikel werden aus ihren modifizierten DNAs hergestellt und ihre Bindungseigenschaften wie zuvor beschrieben validiert (Chang und Siegel, 1998, Blood 91: 3066–3078; Siegel, 2002, In: Methods in Molecular Biology: Antibody Phage Display: Methods and Protocols, Bd. 178, S. 219–226, Aitkem & O'Brien, Hrsg., Humana Press, Totowa, NJ; Siegel, 2000, In: Phage Display of Proteins and Peptides: A Laborstory Manual, Bd. 23, S. 23.21–23.32, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY; Siegel und Chang, 1997, In: Antibody Engineering: New Technologies, Applications, & Commercialization, IBC, Boston, MA).
  • Experimente zur Amplifikation von Phagen-DNA durch PCR werden an RBC/Phagen-inkubierten Proben wie an anderer Stelle hierin bereits beschrieben durchgeführt, mit Ausnahme der Verwendung eines ABI 7700 spektrofluorimetrischen Gerätes für thermische Zyklen, der Zugabe von einem von B-BEACON oder D-BEACON oder beiden, oder der Verwendung eines PCR-Fluorescein-Markierungsgemisches (mit Fluorescein-dUTP versetzte dNTPs) je nach dem Nachweisverfahren. Zur Amplifikation von Phagen-DNA durch Transkription wird eine Reihe von Experimenten analog zu denjenigen, die unter Verwendung von PCR durchgeführt wurden, unter Verwendung des folgenden RNA-Amplifikationsverfahrens durchgeführt: Phagenpartikel werden 2 Minuten lang auf 94°C erhitzt, um die Phagenhülle zu denaturieren und die einzelsträngige Phagemid-DNA freizusetzen. Da T7 RNA-Polymerase doppelsträngige DNA als Matrize erfordert, werden DNA-Polymerase I, dNTPs und der zum Klonieren von D140/B140 verwendete, Not I enthaltende, rückwärts gerichtete Primer verwendet, um während der RNA-Synthese den zweiten Strang der DNA zu synthetisieren. Um die RNA-Amplifikation zu initiieren, wird Amplifikationspuffer, der T7 RNA-Polymerase enthält (Zhang et al., 2001, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98: 5497–5502), in Anwesenheit von einem oder beiden Molecular Beacons oder von Fluorescein-12-UTP je nach dem Nachweisverfahren, wie nachstehend beschrieben, zugegeben.
  • Zum Nachweis von amplifizierter Phagen-DNA unter Verwendung von Molecular Beacons sind die Stamm- und Schleife-Strukturen des B-Beacon (FAM-markiert) und des D-Beacon (TAMRA-markiert) sowohl einzeln als auch in Kombination während der PCR-Amplikonbildung und während der RNA-Transkription anwesend. Die kürzeste Zeit bis zum positiven Ergebnis ("time-to-positivity" (die wenigsten PCR-Zyklen/kürzeste Zeit für die RNA-Transkription), wobei ein positives Ergebnis eine Fluoreszenz von mindestens 2 Logarithmen über dem Hintergrund ist, wird bestimmt. Anfänglich werden Empfindlichkeitsassays unter Verwendung serieller Verdünnungen von Phagen durchgeführt und es folgen Bindungsexperimente unter Verwendung Antigen-negativer und- positiver RBCs. Die Fähigkeit, Reaktionen mit anti-B und anti-Rh(D) zu vervielfältigen, wird bewertet und durch Titrieren werden zahlreiche Variablen untersucht, einschließlich der relativen Konzentrationen jedes Beacons, der Menge an eingesetzten Phagenantikörpern, Anzahl der RBCs, Zeit der RBC/Phagen-Inkubation und Anzahl der Waschungen. Zusätzlich wird die Wirkung auf das Fluoreszenzsignal als Funktion der Antigen-Kopienzahl pro RBC bewertet (vergleiche z. B. die Rh(D)-Phänotypen R2R2, R1R1, R1r, Dw, partieller Rh(D) und dergleichen (Mollison et al., 1997, In: Blond Transfusion in Clinical Medicine, 10. Aufl., Blackwell Scientific Publications, Oxford, England) und die Quantifizierung der Antigendichte mit exponentieller (PCR) und linearer (Transkription) Amplifikation wird verglichen.
  • Zum Nachweis amplifizierter Phagen-DNA auf durch ein elektrisches Feld verstärkten Oligonucleotid-Microarrays, werden Oligonucleotide, die den hybridisierenden Nucleotiden von B-Beacon und D-Beacon entsprechen, synthetisiert und unter Verwendung eines Gerätes zur Herstellung von Arrays auf Indium-Zinnoxid-beschichtete Objektträger aus Glas aufgetragen. Die Objektträger werden verarbeitet, mit fluoreszenzmarkierten PCR-Amplikons oder RNA-Transkripten inkubiert und wie beschrieben gewaschen (Su et al., 2002, Electrophoresis 23: 1551–1557) und unter Verwendung eines ScanArray 5000 Microarray-Scanners analysiert.
  • Ähnlich zu dem in den vorstehend beschriebenen Molecular Beacon-Experimenten beschriebenen Ansatz wird der Nachweis von anti-B- und anti-Rh(D)-assoziierter Phagen-DNA in der kürzesten Zeit durch Variieren ähnlicher Parameter optimiert. Weil RBCs mit und ohne jedes Antigen eingeschlossen werden, liegen Testproben mit einem oder beiden (oder keinem) Phagenantikörper und ein Microarray mit mehreren Flecken, etliche interne positive und negative Kontrollen vor, die eine genaue Bewertung des Signal/Hintergrund-Verhältnisses gestatten. Beruhend auf früherer Erfahrung wird geschätzt, dass von der Zeit des Probenauftrags bis zur Hybridisierung und zum Ablesen weniger als 10 Minuten erforderlich sind.
  • Routineverfahren des molekularen Klonierens werden verwendet und die Fehlersuche ist unkompliziert. Darüberhinaus ist es unwahrscheinlich, dass es irgendeine nachteilige Wirkung gibt, die sich aus dem Einführen von B140/D140 auf die Antikörperexpression oder -präsentation ergibt. Andere Nucleotidsequenzen sind ohne irgendwelche ungünstige Wirkungen erfolgreich in die Not I Stelle von pComb3X kloniert worden. Darüberhinaus gibt es andere günstige einzigartige Restriktionsstellen, in die B140/D140 (oder ein alternativer Satz von Markern), falls notwendig oder gewünscht, kloniert werden können. Das wichtige Merkmal der Assays ist die relative Zeit bis zu einem positiven Ergebnis für die verwendete Amplifikations/Nachweisstrategie und er eignet sich für eine Vervielfältigung des RBC-Phänotypisierens. Hierin offenbarte PCR-Untersuchungen demonstrieren Empfindlichkeit und Spezifität. Das Transkriptionsverfahren bietet, obwohl es linear ist, die Einfachheit isothermaler Amplifikationsreaktionen und bei einem Einsatz von 107–109 Matrizen-DNAs pro Probe ist es wahrscheinlich, dass die Empfindlichkeit kein limitierender Faktor ist. Tatsächlich demonstrierten frühere Untersuchungen, die Transkriptionsverfahren mit Glutaraldehyd-konjugierten Oligonucleotid/monoklonalen Antikörpern benutzten, eine 109 bis 1011-fach höhere Empfindlichkeit als ELISA-Assays beziehungsweise Western-Blot-Assays mit verstärkter Chemilumineszenz, wobei über die Fähigkeit berichtet wurde, so wenig wie einige Antigenkopien in einem Zell-Lysat nachzuweisen (Zhang et al., 2001, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98: 5497–5502).
  • Ferner stellen die hierin offenbarten Verfahren eine enorme Verbesserung gegenüber von Geräten, wie zum Beispiel, aber nicht beschränkt auf, das automatisierte Analysegerät Olympus PK7200, dar, die für eine Vorrichtung, welche die Hämagglutinationstechnologie verwendet, als auf dem Stand der Technik betrachtet werden. Dies liegt daran, dass die hierin offenbarten Verfahren, bei denen von einem Durchsatz von einigen hundert Proben pro Stunde berichtet wird, sich als machbar und letztendlich überlegen darstellen, insofern als die Zeit bis zu einem positiven Ergebnis (einschließlich der RBC/Phagen-Inkubationszeiten) im Bereich von 30 Minuten liegt, die Reaktionen in einem Format mit 96 Vertiefungen stattfinden und mehrere Antigenbestimmungen (eine Vervielfältigung) in einer einzelnen Vertiefung stattfinden kann.
  • Nachweis von Auto- und Alloantikörpern im Serum
  • Dieser Assay wird auf eine zu dem indirekten Standard-Antiglobulintest (siehe z. B. Mollison, 1997, In: Blond Transfusion in Clinical Medicine, 10. Aufl., Blackwell Scientific Publications, Oxford, England) ähnliche Weise durchgeführt, mit der Substitution von Antiglobulin-exprimierenden Phagenpartikeln für das herkömmliche Antiglobulinreagenz und dem Nachweis von gebundenem Phagenreagenz wie hierin offenbart, beruhend auf dem Nachweis einer bekannten, in dem Bakteriophagen vorliegenden Nucleinsäuresequenz. Kurz gesagt werden Mitglieder eines Satzes von Reagenz-Erythrozyten mit bekannter Antigenzusammensetzung jeweils mit einem Aliquot von Patientenseren inkubiert. Die Zellen werden gewaschen, um unspezifisch gebundene Antikörper zu entfernen und die Zellen werden dann mit Bakteriophagen in Kontakt gebracht, die ein Antiglobulinreagenz präsentieren. Das Antiglobulinreagenz kann, falls gewünscht, für alle menschlichen Immunglobulin-Isotypen spezifisch oder für nur eine Klasse, wie zum Beispiel IgM oder IgG, spezifisch sein. Unter Verwendung von Algorithmen, die auf dem Gebiet der Immunhämatologie wohlbekannt sind, wird die Spezifität oder werden die Spezifitäten von in den Patientenseren vorliegenden anti-Erythrozyten-Antikörpern beruhend auf dem Muster der Reaktivität der Seren mit Erythrozyten des Satzes bestimmt.
  • Nachweis von Antikörpern oder Komplementfragmenten auf Erythrozyten
  • Dieser Assay wird auf eine zu dem direkten Standard-Antiglobulintest (siehe z. B. Mollison, 1997, In: Blond Transfusion in Clinical Medicine, 10. Aufl., Blackwell Scientific Publications, Oxford, England) ähnliche Weise durchgeführt, mit der Substitution von Antiglobulin-exprimierenden Phagenpartikeln für das herkömmliche Antiglobulinreagenz und dem Nachweis von gebundenem Phagenreagenz wie hierin offenbart, beruhend auf dem Nachweis einer bekannten, in dem Bakteriophagen vorliegenden Nucleinsäuresequenz. Kurz gesagt wird eine Probe von Erythrozyten gewaschen, um unspezifisch gebundene Antikörper zu entfernen und dann mit einem Bakteriophagen in Kontakt gebracht, der ein Antiglobulinreagenz auf seiner Oberfläche präsentiert. Die Herstellung von Antiglobulinreagenz kann für IgG, für Komplement C3d oder beide spezifische Moleküle (z. B. einen anti-IgG-Antikörper, einen anti-C3d-Antikörper, beide und dergleichen) umfassen. Wo menschlicher Antikörper oder Komplement an die Zelle gebunden ist, bindet der Bakteriophage mittels des durch den Phagen präsentierten Antiglobulin-Reagenz. Die Anwesenheit von spezifisch an die Zelle gebundenem Phagen (mittels der Bindung an den menschlichen Antikörper oder das Komplement auf der Zelle) wird dann wie hierin offenbart beruhend auf dem Nachweis einer in dem Bakteriophagen vorliegenden bekannten Nucleinsäuresequenz nachgewiesen.
  • Durchführen von Spender/Empfänger-Kompatibilitätstests
  • Dieser Assay wird auf eine dem Standard-Coombs-Kreuzprobentest (siehe z. B. Mollison, 1997, In: Blond Transfusion in Clinical Medicine, 10. Aufl., Blackwell Scientific Publications, Oxford, England) ähnliche Weise durchgeführt, mit der Substitution von Antiglobulin-exprimierenden Phagenpartikeln für das herkömmliche Antiglobulinreagenz und dem Nachweis von gebundenem Phagenreagenz wie hierin offenbart, beruhend auf dem Nachweis einer bekannten, in dem Bakteriophagen vorliegenden Nucleinsäuresequenz. Kurz gesagt umfasst das Verfahren das In-Kontakt-Bringen einer Probe von Spender-Erythrozyten mit einer Serumprobe eines Patienten. Die Zellen werden gewaschen, um unspezifisch gebundene Antikörper zu entfernen und die Zelle wird dann mit einem Bakteriophagen in Kontakt gebracht, der ein Antiglobulinreagenz (z. B. anti-IgM oder anti-IgG) auf seiner Oberfläche präsentiert. Wenn ein menschlicher Antikörper an die Zelle gebunden ist, wie es bei einer nicht kompatiblen Kreuzprobe der Fall wäre, bindet der Bakteriophage mittels des durch den Phagen präsentierten Antiglobulinreagenz. Die Anwesenheit von spezifisch an die Zelle gebundenem Phagen (mittels einer Bindung an den menschlichen Antikörper auf der Zelle) wird, wie hierin offenbart, beruhend auf dem Nachweis einer bekannten, in dem Bakteriophagen vorliegenden Nucleinsäuresequenz nachgewiesen.
  • SEQUENZPROTOKOLL
    Figure 00620001
  • Figure 00630001
  • Figure 00640001

Claims (28)

  1. In-vitro-Verfahren zum Nachweisen der Anwesenheit einer Antigen-tragenden Einheit auf einer Zelle, wobei das Verfahren umfasst: (a) In-Kontakt-Bringen einer Zelle mit einem Bakteriophagen, der einen Antikörper exprimiert, von dem bekannt ist, dass er spezifisch an die Antigen-tragende Einheit bindet, wobei der Bakteriophage eine Nucleinsäure umfasst und wobei die Sequenz der Nucleinsäure mindestens teilweise bekannt ist; (b) Denaturieren aller spezifisch an die Zelle gebundener Bakteriophagen, um die Nucleinsäure freizusetzen, und (c) Nachweisen der Nucleinsäure, wobei das Nachweisen der Nucleinsäure die Anwesenheit der Antigen-tragenden Einheit auf der Zelle nachweist, wodurch die Anwesenheit der Antigen-tragenden Einheit auf der Zelle nachgewiesen wird.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, ferner umfassend das Amplifizieren der Nucleinsäure vor Schritt (c).
  3. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Verfahren ferner das Waschen der Zelle zwischen Schritt (a) und Schritt (b) umfasst.
  4. Verfahren nach Anspruch 1, wobei es sich bei der Zelle um einen Erythrozyten handelt und es sich bei der Antigen-tragenden Einheit um ein Erythrozyten-Antigen handelt.
  5. Verfahren nach Anspruch 4, wobei das Erythrozyten-Antigen aus der Gruppe, bestehend aus A, B, Rh(D), Rh(C), Rh(c), Rh(E), Rh(e), K, Fya, Fyb, M, N, S, s, Jka und Jkb ausgewählt ist.
  6. Verfahren nach Anspruch 1, wobei es sich bei der Zelle um einen Leukozyten handelt und wobei die Antigen-tragende Einheit aus der Gruppe, bestehend aus einem Lymphozyten-Antigen, einem Monozyten-Antigen und einem Granulozyten-Antigen ausgewählt ist.
  7. Verfahren nach Anspruch 1, wobei es sich bei der Zelle um einen Thrombozyten handelt und wobei es sich ferner bei der Antigen-tragenden Einheit um ein Thrombozyten-Antigen handelt.
  8. Verfahren nach Anspruch 7, wobei das Thrombozyten-Antigen aus der Gruppe, bestehend aus HPA-1a, HPA-1b, HPA-2a, HPA-2b, HPA-3a, HPA-3b, HPA-4a, HPA-4b, HPA-5a, HPA-5b, HPA-6b, HPA-7b, HPA-8b, HPA-9b, HPA-10b, Gova und Govb ausgewählt ist.
  9. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Nucleinsäure eine Sequenz umfasst, die zu einer Molecular Beacon-Sonde komplementär ist.
  10. Verfahren nach Anspruch 9, wobei die Sequenz zu einer Sequenz komplementär ist, die aus der Gruppe, bestehend aus der Sequenz von SEQ ID NO: 3 und der Sequenz von SEQ ID NO: 4 ausgewählt ist.
  11. Verfahren nach Anspruch 10, wobei die Sequenz der Molecular Beacon-Sonde aus der Gruppe, bestehend aus der Sequenz von SEQ ID NO: 7, der Sequenz von SEQ ID NO: 8, der Sequenz von SEQ ID NO: 9 und der Sequenz von SEQ ID NO: 10 ausgewählt ist.
  12. Verfahren nach Anspruch 9, wobei die molekulare Beacon-Sonde ein Fluorophor umfasst.
  13. Verfahren nach Anspruch 2, wobei die Nucleinsäure unter Verwendung der Polymerasekettenreaktion (PCR) amplifiziert wird.
  14. Verfahren nach Anspruch 13, wobei die PCR die Verwendung eines Primers umfasst, der aus der Gruppe, bestehend aus der Sequenz von SEQ ID NO: 1 und der Sequenz von SEQ ID NO: 2 ausgewählt ist.
  15. Verfahren nach Anspruch 2, wobei die Nucleinsäure durch Transkription unter Verwendung eines durch T7 RNA amplifizierten immunologischen Nachweisverfahrens (IDAT) amplifiziert wird.
  16. In-vitro-Verfahren zum Nachweisen der Anwesenheit von mindestens zwei unterschiedlichen Antigen-tragenden Einheiten auf einer Zelle, wobei das Verfahren umfasst: (a) In-Kontakt-Bringen einer Zelle mit einem ersten Bakteriophagen, der einen Antikörper exprimiert, von dem bekannt ist, dass er spezifisch an eine erste Antigen-tragende Einheit bindet, wobei der erste Bakteriophage eine erste Nucleinsäure umfasst und wobei die Sequenz der ersten Nucleinsäure mindestens teilweise bekannt ist; (b) In-Kontakt-Bringen der Zelle mit einem zweiten Bakteriophagen, der einen Antikörper exprimiert, von dem bekannt ist, dass er spezifisch an eine zweite Antigen-tragende Einheit bindet, wobei der zweite Bakteriophage eine zweite Nucleinsäure umfasst und wobei die Sequenz der zweiten Nucleinsäure mindestens teilweise bekannt ist und wobei sich die Sequenz der ersten Nucleinsäure nachweisbar von der Sequenz der zweiten Nucleinsäure unterscheidet; (c) Nachweisen der Bindung des ersten Bakteriophagen an die Antigen-tragende Einheit durch Nachweisen der Anwesenheit der ersten Nucleinsäure, wobei das Nachweisen der ersten Nucleinsäure die Anwesenheit der ersten Antigen-tragenden Einheit auf der Zelle nachweist; (d) Nachweisen der Bindung des zweiten Bakteriophagen an die Antigen-tragende Einheit durch Nachweisen der Anwesenheit der zweiten Nucleinsäure, wobei das Nachweisen der zweiten Nucleinsäure die Anwesenheit der zweiten Antigen-tragenden Einheit auf der Zelle nachweist; wodurch die Anwesenheit von mindestens zwei unterschiedlichen Antigen-tragenden Einheiten auf der Zelle nachgewiesen wird.
  17. In-vitro-Verfahren zum Nachweisen der Anwesenheit eines anti-Erythrozyten-Antikörpers in menschlichem Serum, wobei das Verfahren umfasst: (a) In-Kontakt-Bringen eines menschlichen Erythrozyten, der mindestens ein menschliches Erythrozyten-Antigen auf der Oberfläche der Zelle exprimiert, mit dem Serum; (b) Waschen der Zelle, um alle unspezifisch an die Zelle gebundenen Antikörper zu entfernen; (c) In-Kontakt-Bringen der Zelle mit einem Bakteriophagen, der ein anti-Humanglobulin-Reagenz exprimiert, wobei der Bakteriophage eine Nucleinsäure umfasst und wobei die Sequenz der Nucleinsäure mindestens teilweise bekannt ist; (d) Denaturieren aller spezifisch an die Zelle gebundenen Bakteriophagen, um die Nucleinsäure freizusetzen, und (e) Nachweisen der Nucleinsäure, wobei das Nachweisen der Nucleinsäure die Anwesenheit des anti-Erythrozyten-Antikörpers in dem Serum nachweist.
  18. Verfahren nach Anspruch 17, wobei das anti-Humanglobulin-Reagenz aus der Gruppe, bestehend aus einem anti-Mensch-IgG, einem anti-Mensch-IgM, einem gegen menschliche leichte kappa/lambda Kette gerichteten Antikörper, einem Protein A aus Staphylokokken, einem Protein G aus Streptokokken und einem Protein L aus Peptostreptokokken ausgewählt ist.
  19. Verfahren nach Anspruch 17, wobei das Verfahren ferner das Amplifizieren der Nucleinsäure vor Schritt (e) umfasst.
  20. Verfahren nach Anspruch 17, wobei der Antikörper aus der Gruppe, bestehend aus einem Autoantikörper und einem Alloantikörper ausgewählt ist.
  21. In-vitro-Verfahren zum Nachweisen der Anwesenheit eines anti-Erythrozyten-Autoantikörpers bei einem Menschen, wobei das Verfahren umfasst: (a) Waschen eines Erythrozyten, der aus dem Menschen erhalten wurde, um alle unspezifisch an die Zelle gebundenen Antikörper zu entfernen; (b) In-Kontakt-Bringen der Zelle mit einem Bakteriophagen, der ein anti-Humanglobulin-Reagenz exprimiert, wobei der Bakteriophage eine Nucleinsäure umfasst und wobei die Sequenz der Nucleinsäure mindestens teilweise bekannt ist; (c) Denaturieren aller spezifisch an die Zelle gebundenen Bakteriophagen, um die Nucleinsäure freizusetzen, und (d) Nachweisen der Nucleinsäure, wobei das Nachweisen der Nucleinsäure die Anwesenheit des anti-Erythrozyten-Autoantikörpers bei dem Menschen nachweist.
  22. Verfahren nach Anspruch 21, wobei das Verfahren ferner das Amplifizieren der Nucleinsäure vor Schritt (d) umfasst.
  23. In-vitro-Verfahren zum Nachweisen der Anwesenheit eines Liganden in einer Probe, wobei das Verfahren umfasst: (a) In-Kontakt-Bringen einer Zelle mit einem Bakteriophagen, der einen Rezeptor exprimiert, von dem bekannt ist, dass er spezifisch an den Liganden bindet, wobei der Bakteriophage eine Nucleinsäure umfasst und wobei die Sequenz der Nucleinsäure mindestens teilweise bekannt ist; (b) Denaturieren aller spezifisch an die Zelle gebundener Bakteriophagen, um die Nucleinsäure freizusetzen, und (c) Nachweisen der Nucleinsäure, wobei das Nachweisen der Nucleinsäure die Anwesenheit des Liganden in der Probe nachweist.
  24. Verfahren nach Anspruch 23, wobei der Ligand auf einer Zelle vorliegt.
  25. Verfahren nach Anspruch 23, wobei es sich bei der Probe um eine von einem Menschen erhaltene biologische Probe handelt.
  26. Verfahren nach Anspruch 25, wobei es sich bei der biologischen Probe um eine Zellprobe handelt.
  27. Verfahren nach Anspruch 26, wobei die Zellprobe einen Erythrozyten umfasst und wobei es sich bei dem Liganden um ein Erythrozyten-Antigen handelt und wobei es sich ferner bei dem Rezeptor um einen Antikörper handelt.
  28. Verfahren nach Anspruch 23, wobei das Verfahren ferner das Amplifizieren der Nucleinsäure vor dem Nachweis in Schritt (c) umfasst.
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