JPH06235726A

JPH06235726A - 核酸プローブ及び核酸検出方法

Info

Publication number: JPH06235726A
Application number: JP2302193A
Authority: JP
Inventors: Kinya Kato; 欽也加藤
Original assignee: Canon Inc
Current assignee: Canon Inc
Priority date: 1993-02-10
Filing date: 1993-02-10
Publication date: 1994-08-23

Abstract

(57)【要約】【目的】放射性標識を用いる必要がなく、簡便な操作
で感度良い核酸の検出を行える方法および該方法に用い
る核酸プローブを提供すること。【構成】生物種と抗原・抗体反応を行う抗体部と、プ
ローブ機能を有する核酸部とを結合して構成した核酸プ
ローブを、試料核酸と反応させ、得られたハイブリッド
体を該ハイブリッド体の有する抗体部に結合させた生物
種によって検出する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、核酸の検出及びそこで
用いられる核酸プローブに関するものである。

【０００２】

【従来の技術】一本鎖のＤＮＡやＲＮＡが互いに相補性
を有している場合、相補性を有する部分が結合して二本
鎖となりハイブリッドを形成する。このハイブリダイゼ
ーション反応を利用した核酸の検出や定量のための方法
としてサザン法等の種々の方法があり、遺伝子のクロー
ニング、遺伝子組換え、所望の遺伝子のスクリーニン
グ、あるいは検体遺伝子を用いた疾病の診断等の各種遺
伝子工学的手法における基本的技術の一つとなってい
る。

【０００３】核酸のハイブリダイゼーションを利用した
分析方法としては、ＤＮＡやＲＮＡからなるプローブに
ハイブリットの検出のための標識を施し、これを試料核
酸とハイブリザイズさせ、形成されるハイブリッドをプ
ローブに付与した標識を利用して検出する方法が一般的
である。

【０００４】このプローブの標識化の方法では、放射性
同位元素をプローブに導入する方法、あるいは発光反
応、発色反応、蛍光反応等に必要な化合物等をプローブ
に導入あるいは結合させる方法などが用いられている。

【０００５】プローブとしては、例えば動物、植物、微
生物等から直接分離した核酸断片、所定の基準に従って
クローニングしたクローン化ＤＮＡ断片、合成機器によ
って合成したオリゴヌクレオチド等が、分析の目的など
に応じて利用されている。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】遺伝子工学の発展にと
もない、ハイブリダイゼーションを利用した核酸の分析
法の利用頻度や応用範囲も拡大しつつあり、より簡便な
操作で感度良い分析が行える方法に対する要請が高まっ
ている。

【０００７】例えば、放射性同位元素を用いた標識化
は、ハイブリッドの検出感度が良い等の利点を有する反
面、放射性物質を扱うので、そのための高価な試薬、特
別な機器、装置等が必要であり、また操作に危険性を伴
う。

【０００８】これに対して、ビオチン−アビジン−抗ア
ビジン抗体−蛍光色素複合体や発色反応を触媒する酵素
等による非放射性標識は、安全かつ簡便な操作により標
識化及び検出が行え、用いる試薬も安価であるという利
点を有するが、プローブの標識に用いた場合に検出感度
が低下し易いという欠点がある。

【０００９】すなわち、非放射性標識を用いて高感度で
の検出が可能な方法が求められている。本発明の目的
は、放射性標識を用いる必要がなく、簡便な操作で感度
良い核酸の検出を行える方法および該方法に用いる核酸
プローブを提供することにある。

【００１０】

【課題を解決するための手段】上記目的は、本発明の生
物種と抗原・抗体反応を行う抗体部と、標的核酸とハイ
ブリッドを形成し得る核酸を含む核酸部とを有すること
を特徴とする核酸プローブ及び該核酸プローブを用いた
核酸の検出方法により達成することができる。本発明の
プローブの基本的構成の一例を図１及び図２に示す。図
１に示す核酸プローブは、プローブとしての機能を有す
る核酸部１と、ハイブリッド体の形成を検出するために
利用する生物種と抗原・抗体反応を行う抗体部２とを有
する。また、図２の構成では核酸部１と抗体部２とが微
粒子３を介して結合されている。

【００１１】核酸部を構成する核酸は、プローブとして
の塩基配列を有するものが利用され、その長さは、その
目的、用途に応じて適宜選択されるが、本発明によれ
ば、十数塩基と短いものから用いることが可能となる。
核酸部と抗体部の比率は、核酸部の長さや検出目的に応
じて設定でき、例えば図１の構成の場合は、核酸部１分
子に対して抗体部５〜５０分子、好ましくは１０〜２０
分子が結合しているものが、また図２に示す構成では、
核酸部１分子に対して抗体部５〜５０分子、好ましくは
１０〜２０分子が結合しているものなどが利用可能であ
る。なお、図２の構成によれば、抗体部と核酸部とを結
合する媒体として微粒子を用いたので、核酸部と抗体部
を直接架橋するよりもこれらの特性に即した豊富な結合
形式を選ぶことが可能となるという利点がある。

【００１２】プローブとしての機能を有する核酸部を構
成する核酸としては、種々の生物、例えば動物、植物、
微生物等から分離したＤＮＡやＲＮＡ断片、これらの断
片塩基の配列を変更して得たもの、ＤＮＡ合成機によっ
て合成したものなどが利用できる。

【００１３】抗体部としては、ハイブリッド体の検出に
利用する生物種と特異的に反応するものであればよく公
知の方法により調製された抗体を用い得る。即ち、各種
動物及び各クラスの免疫グロブリンを用いることがで
き、例えば、免疫法により調製した動物の抗血清を用い
てもよいし、非特異反応を抑制し感度を向上させるため
常法により調製したモノクロ−ナル抗体や更に、抗体の
半分子や可変領域を残し特異性をより高めた抗体の部分
構造Ｆａｂ又は（Ｆａｂ’）₂ 等、種々の抗体分子を用
いることができる。また、通常抗原である生物種はエピ
ト−フ゜を複数有するので複数種の抗体を用いてもよ
い。

【００１４】又、抗体部の抗原・抗体反応性、核酸部の
プローブとしての機能を損なわない限りで、変性した抗
体、核酸を用いることも可能で、例えば、微粒子との結
合若しくは架橋剤との結合を容易にするために核酸や抗
体にアミノ基等の各種官能基を導入するなどの変性を施
したものを用いることができる。

【００１５】図１の構成の場合における核酸部と抗体部
の結合はいかなる方法を用いてもよいが、例えば両末端
に核酸部及び抗体部と結合し得る基を有する架橋剤を用
いる方法等が利用できる。架橋剤は必ずしも必要ではな
く、イオン結合や物理吸着による結合も可能である。し
かし架橋剤を用いて共有結合により結合した方が結合が
強固で好ましい。

【００１６】この場合の架橋剤としては、例えば抗体の
標識化及び核酸の標識化に用いられる一般的な架橋剤が
使用可能であり、マレイミド系、サクシンイミド系、ジ
スルフィド系、カルボジイミド系、アルデヒド系などの
架橋剤がある。具体的には、カルボジイミドメト−ｐ−
トルエンスルホネート、１−エチル−３−（３−ジメチ
ルアミノプロピル）−カルボジイミド等を好適に用い得
る。

【００１７】図２に示す構成における核酸部及び抗体部
の微粒子との結合には、これらの機能を損なわない範囲
内で種々の方法が利用可能である。なかでも、化学的な
結合が好ましく、カルボジイミド法、臭化シアン法、イ
ソシアネート法等が利用できる。また、その表面を核酸
部と直接または架橋剤を介して結合し得る基で変性した
微粒子を用いることも可能である。

【００１８】この場合の架橋剤としても図１の構成の場
合と同様の架橋剤が利用でき、好適なものとして、カル
ボジイミドメト−ｐ−トルエンスルホネート、１−エチ
ル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイ
ミド等を挙げることができる。

【００１９】微粒子として種々のものが利用可能である
が、例えばポリスチレン、ポリメチルメタクリレート等
を主成分とした有機高分子等を用いることができ、これ
らの有機高分子微粒子の表面を必要に応じて変性して例
えばカルボキシル基、ヒドロキシル基、アミノ基、アル
デヒド基、オキシシラン基等の抗体や核酸との結合を容
易とする官能基を導入したものが好ましい。また、微粒
子の粒径は、例えば０．０５〜１０μｍ、好ましくは
０．１〜２μｍの直径を有するものが利用できる。

【００２０】本発明の核酸プローブを用いた核酸の検出
方法は、上記の構成の核酸プローブと試料とを水性媒体
中で反応させる過程と、該試料中に標的核酸が含まれて
いた場合に形成される核酸プローブと標的核酸のハイブ
リット体を、未反応の核酸プローブと分離する過程と、
該ハイブリッド体にその抗体部と抗原・抗体反応を行う
生物種を反応させる過程と、該ハイブリッド体に結合し
た生物種を検出する過程とを有することを特徴とする。

【００２１】ハイブリッド体を形成している核酸プロー
ブと未反応の核酸プローブとの分離は、例えば、試料を
適当な担体に固定しておき、これに核酸プローブを反応
させてハイブリッド体を形成させた後の適当な段階で、
担体を洗浄することで行うことができる。生物種と核酸
プローブの反応過程は、試料と核酸プローブとの反応過
程の後に行っても良いし、ハイブリッド体を形成してい
る核酸プローブと未反応の核酸プローブとの分離操作の
後に、ハイブリッド体を構成している核酸プローブと生
物種を反応させるようにしても良い。

【００２２】本発明の核酸の検出方法の一例における各
過程を模式的に図３に示す。この方法では、まず、
（Ａ）に示すように試料核酸４、５、６を適当な担体７
に固定する。担体や担体の固定方法としては、核酸プロ
ーブを用いた核酸検出法において一般的に用いられてい
るものを利用することができる。次に、（Ｂ）に示すよ
うに、本発明の核酸プローブ８を固定された試料核酸に
反応させ、検出対象としての標的核酸６とのハイブリッ
ドを形成させる。この反応には、一般に用いられている
ハイブリダイゼーションのための操作が利用できる。次
に（Ｃ）に示すように、ハイブリッド体の検出のための
生物種９を反応系に加え、これを核酸プローブの有する
抗体部に結合させ他の後、（Ｄ）において反応系から担
体を分離し、（Ｅ）においてハイブリッド体を構成して
いる核酸プローブに結合した生物種を適当な方法で検出
する。

【００２３】ハイブリッド体検出用の生物種としては、
大腸菌等の細菌などの微生物や微生物断片等が利用でき
る。

【００２４】また、ハイブリッド体を構成している核酸
プローブに結合した生物種を検出する方法としては、生
物種の染色法等が利用できる。特に、フローサイトメト
リーを用いれば生物種の１個体（細胞あるいは菌体）か
らの検出が可能であるので、高感度な分析が可能とな
る。例えば、生物種１つにＤＮＡ一つが対応する系を設
定すれば、ＤＮＡの１フラグメントからの検出が可能と
なる。従来のＤＮＡハイブリダイゼーション法による検
出感度の限界は、１ｋｂのＤＮＡ断片では数万個程度
（数百ファエムトグラムオーダー）程度で、それ以下の
場合には検出できず、またＰＣＲ法による増幅を用いる
従来法でも１０００個程度が限界である点を考えれば、
本発明によれば、飛躍的な検出感度の向上が期待でき
る。

【００２５】

【実施例】以下実施例を用いて本発明を更に詳細に説明
するが、本発明はこれらになんら限定されない。

【００２６】実施例１架橋剤を用いた核酸プローブの作成法常法により、ｐＵＣ１９のＳｓｐＩ、Ｃｆｒ１０Ｉ断片
（約０．７Ｋｂ）をｐＵＣ１９のＸｂａＩ部位に挿入し
ｐＵＣ５５を構築した。このものはＤＮＡ長及びＡｍｐ
耐性を指標として、常法に従い大腸菌により増殖後スク
リーニングをかけ、回収した。得られたｐＵＣ５５から
ＰｖｕII、ＶｓｐＩ断片（約０．９Ｋｂ）を切り出して
抽出し常法に従ってＤＮＡ断片を調製し、これを熱変性
によって一本鎖としバイオ情報変換素子の作成に供し
た。

【００２７】このＤＮＡ断片（０．１ｍｇ）と、抗Ｅ．
ｃｏｌｉＩｇＧ抗体（マウス、フナコシ社）をｐＨ
７．２の０．１Ｍリン酸塩緩衝液で１ｍｇ／ｍｌに希釈
した抗体０．５ｍｌ、及びカルボジイミドメト−ｐ−ト
ルエンスルホネートの１％水溶液０．５ｍｌを加え室温
で６０分間反応を行い、一本鎖ＤＮＡ−カルボジイミド
−抗体の複合体、すなわち本発明の核酸プローブを得
た。

【００２８】実施例２微粒子を用いた核酸プローブの作成法実施例１で得たｐＵＣ５５のＰｖｕII、ＶｓｐＩ断片を
解離させて得た一本鎖ＤＮＡ断片の溶液（核酸濃度１０
μｇ／ｍｌ、溶媒として０．１ＭＭｇＣｌ₂を含むリ
ン酸緩衝液−生理食塩水（以下ＰＢＳという）を使用）
の２５００μｌと、１−エチル−３−（３−ジメチルア
ミノプロピル）−カルボジイミドの０．０６ｇと、１重
量％の高分子微粒子水分散液（粒子直径０．８μｍ、ス
チレン−アクリルアミド−アクリル酸共重合体微粒子）
の５００μｌを混合し、室温で１０分間放置した。遠心
分離による洗浄後、微粒子を１／１５Ｎリン酸塩緩衝液
（ｐＨ８．０）に分散して、固形分１％の微粒子分散液
を得た。この微粒子分散液の５ｍｌに、１−エチル−３
−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミドの
０．１２ｇを加え、室温で３時間振とうした。次に、こ
の微粒子分散液から遠心分離により微粒子を回収し、さ
らに１／１５Ｎリン酸塩緩衝液（ｐＨ８．０）で洗浄し
た。洗浄後の微粒子に、大腸菌のＩｇＧに対するマウス
抗体（フナコシ社）溶液（ＰＢＳで１ｍｇ／ｍｌの濃度
に調整）の１．０ｍｌを加えた後、３時間振とうし、遠
心分離により一本鎖ＤＮＡ／微粒子／抗体・複合体、す
なわち本発明の核酸プローブを得た。

【００２９】実施例３検出例試料核酸として以下のものを用意した。試料Ａ：ｐＵＣ１９と大腸菌ＪＭ１０９株から常法に
より調製した染色体ＤＮＡの混合物（混合重量比、１：
１）試料Ｂ：ｐＢＲ３２２と大腸菌ＨＢ１０１から常法に
より調製した染色体ＤＮＡの混合物（重量混合比、１：
１）試料Ｃ：大腸菌ＨＢ１０１から常法により調製した染
色体ＤＮＡ以上の試料Ａ〜Ｃを個々に用いて以下の操作を行った。

【００３０】試料１μｇを含む溶液２μｌに、１０×Ｔ
Ａ緩衝液２．０μｌ及び水１６．０μｌを混合し、得ら
れた混合液に１０単位のＨｉｎｄＩＩＩ（ＴＯＹＯＢＯ
製）を加え、３７℃で２時間放置して、反応させた。反
応終了後、フェノール抽出、エタノール沈澱を行って精
製し、これを３μｌのｄｄＨ₂ Ｏに溶解し、ニトロセル
ロースフィルター（シュライヒャーシャネル）にスポ
ットし、自然風乾後、８０℃２時間の焼付けを行って試
料をフィルターに固定した。

【００３１】ハイブリダイゼーション溶液としては、１
００％ホルムアルデヒド９ｍｌ、２０×ＳＳＣ５ｍｌ、
５０×Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液０．４ｍｌ、１Ｍリン酸ナ
トリウム（ｐＨ６．５）０．４ｍｌ、５０．０ｍｇ／ｍ
ｌ濃度の変性サケ精子ＤＮＡ（Ｓｉｇｍａ社製）０．１
ｍｌの混合溶液を調製した。

【００３２】先の試料を固定したフィルターを、最終濃
度が３×ＳＳＣ及び１×Ｄｅｎｈａｒｄｔ液である溶液
２００ｍｌに３７℃で３０分間浸漬してプレハイブリダ
イゼーションを行った後、ハイブリダイゼーション溶液
を入れたポリエチレン製の袋内にフェルターが溶液に浸
漬されるように実施例１で得た核酸プローブの２μｇと
ともに入れて密封し、３７℃で６時間反応させた。反応
終了後、ポリエチレン製袋からフィルターを取出し、こ
れを２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳの５００ｍｌに浸し、
室温で２５分間洗浄し、０．２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤ
Ｓの５００ｍｌで同様に室温で３５分間洗浄した後、さ
らに、０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢ
Ｓ（ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ）で洗浄した。洗浄終了後、フ
ィルターを２５ｍｌのＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎに浸し、これ
に大腸菌の分散液（ＯＤ＝０．７）の１ｍｌを添加し、
室温で免疫反応を行った。

【００３３】反応後、フィルターを溶液から取出し、再
度ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ洗浄することで未反応の大腸菌を
フィルターから除去した後、ＤＡＰＩ法に従って染色を
行い、落射蛍光顕微鏡によってフィルターを観察したと
ころ、試料Ａのスポットに大腸菌が密集して結合してい
るのが観察されたが、試料Ｂのスポット及び試料Ｃのス
ポットでは大腸菌の結合は観察できなかった。

【００３４】実施例４核酸プローブとして実施例２で得られたものを用いる以
外は実施例３と同様の検出試験を行ったところ実施例２
と同様の結果が得られた。

【００３５】

【発明の効果】本発明により、放射性同位元素を用いる
ことなく極めて微量な核酸の検出が簡便な方法で行える
ようになった。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の核酸プローブの構成の一例を示す模式
図である。

【図２】本発明の核酸プローブの構成の一例を示す模式
図である。

【図３】本発明の核酸プローブを用いて試料核酸を検出
する方法を説明する模式図であり、図中（Ａ）→（Ｂ）
→（Ｃ）→（Ｄ）→（Ｅ）の手順で操作を行うことを示
す。

【符号の説明】

１核酸部２抗体部３微粒子４、５非標的核酸６標的核酸７担体８核酸プローブ９生物種

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】生物種と抗原・抗体反応を行う抗体部
と、標的核酸とハイブリッドを形成し得る核酸を含む核
酸部とを有することを特徴とする核酸プローブ。
【請求項２】核酸プローブを用いた核酸の検出方法で
あって、請求項１に記載の核酸プローブと試料とを水性
媒体中で反応させる過程と、該試料中に標的核酸が含ま
れていた場合に形成される核酸プローブと標的核酸のハ
イブリット体を、未反応の核酸プローブと分離する過程
と、該ハイブリッド体にその抗体部と抗原・抗体反応を
行う生物種を反応させる過程と、該ハイブリッド体に結
合した生物種を検出する過程とを有することを特徴とす
る核酸検出方法。
【請求項３】前記生物種が細菌である請求項２に記載
の核酸検出方法。
【請求項４】前記細菌が大腸菌である請求項３に記載
の核酸検出方法。