JPH06341988A - 核酸検出方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 放射性標識を用いる必要がなく、簡便な操作
で感度良い核酸の検出を行える方法および該方法に用い
る核酸プローブを提供すること。 【構成】 生物種と抗原・抗体反応を行う抗体部と、プ
ローブ機能を有する核酸部とを結合して構成した核酸プ
ローブを、試料核酸と反応させ、得られたハイブリッド
体を該ハイブリッド体の有する抗体部に結合させた生物
種を培養増殖して検出する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、核酸プローブを用いた
核酸の検出方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】一本鎖のＤＮＡやＲＮＡが互いに相補性
を有している場合、相補性を有する部分が結合して二本
鎖となりハイブリッドを形成する。このハイブリダイゼ
ーション反応を利用した核酸の検出や定量のための方法
としてサザン法等の種々の方法があり、遺伝子のクロー
ニング、遺伝子組換え、所望の遺伝子のスクリーニン
グ、あるいは検体遺伝子を用いた疾病の診断等の各種遺
伝子工学的手法における基本技術の一つとなっている。

【０００３】核酸のハイブリダイゼーションを利用した
分析方法としては、ＤＮＡやＲＮＡからなるプローブに
ハイブリッドの検出のための標識を施し、これを試料核
酸とハイブリダイズさせ、形成されるハイブリッドをプ
ローブに付与した標識を利用して検出する方法が一般的
である。

【０００４】このプローブの標識化の方法では、放射性
同位元素をプローブに導入する方法、あるいは発光反
応、発色反応、蛍光反応等に必要な化合物等をプローブ
に導入あるいは結合させる方法などが用いられている。

【０００５】プローブとしては、例えば動物、植物、微
生物等から直接分離した核酸断片、所定の基準に従って
クローニングしたクローン化ＤＮＡ断片、合成機器によ
って合成したオリゴヌクレオチド等が、分析の目的など
に応じて利用されている。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】遺伝子工学の発展にと
もない、ハイブリダイゼーションを利用した核酸の分析
法の利用頻度や応用範囲も拡大しつつあり、より簡便な
操作で感度良い分析が行える方法に対する要請が高まっ
ている。

【０００７】例えば、放射性同位元素を用いた標識化
は、ハイブリッドの検出感度が良い等の利点を有する反
面、放射性物質を扱うので、そのための高価な試薬、特
別な機器、装置等が必要であり、また操作に危険性を伴
う。

【０００８】これに対して、ビオチン−アビジン−抗ア
ビジン抗体−蛍光色素複合体や発色反応を触媒する酵素
等による非放射性標識は、安全かつ簡便な操作により標
識化及び検出が行え、用いる試薬も安価であるという利
点を有するが、プローブの標識に用いた場合に検出感度
が低下し易いという欠点がある。

【０００９】すなわち、非放射性標識を用いて高感度で
の検出が可能な方法が求められている。本発明の目的
は、放射性標識を用いる必要がなく、簡便な操作で感度
良い核酸の検出を行える方法を提供することにある。

【００１０】

【課題を解決するための手段】本発明の核酸の検出方法
は、生物種と抗原・抗体反応を行う抗体部と、標的核酸
とハイブリッドを形成し得る核酸を含む核酸部とを有す
る核酸プローブを用いた核酸の検で方法であって、
（ａ）該核酸プローブと試料とを水性媒体中で反応させ
る過程と、（ｂ）該試料中に標的核酸が含まれていた場
合に形成される核酸プローブと標的核酸のハイブリッド
体を、未反応の核酸プローブと分離する過程と、（ｃ）
該ハイブリッド体にその抗体部と抗原・抗体反応を行う
生物種を反応させる過程と、（ｄ）該ハイブリッド体に
結合した生物種を増殖させる過程と、（ｅ）増殖した生
物種を検出する過程と、を有することを特徴とする。

【００１１】本発明の方法に用いる核酸プローブの基本
的構成の一例を図１及び図２に示す。図１に示す核酸プ
ローブは、プローブとしての機能を有する核酸部１と、
ハイブリッド体の形成を検出するために利用する生物種
と抗原・抗体反応を行う抗体部２とを有する。また、図
２の構成では核酸部１と抗体部２とが微粒子３を介して
結合されている。

【００１２】核酸部を構成する核酸は、プローブとして
の塩基配列を有するものが利用され、その長さは、その
目的、用途に応じて適宜選択されるが、本発明によれ
ば、十数塩基と短いものから用いることが可能となる。
核酸部と抗体部の比率は、核酸部の長さや検出目的に応
じて設定でき、例えば図１の構成の場合は、核酸部１分
子に対して抗体部５〜５０分子、好ましくは１０〜２０
分子が結合しているものが、また図２に示す構成では、
核酸部１分子に対して抗体部５〜５０分子、好ましくは
１０〜２０分子が結合しているものなどが利用可能であ
る。なお、図２の構成によれば、抗体部と核酸部とを結
合する媒体として微粒子を用いたので、核酸部と抗体部
を直接架橋するよりもこれらの特性に即した豊富な結合
形式を選ぶことが可能となるという利点がある。

【００１３】プローブとしての機能を有する核酸部を構
成する核酸としては、種々の生物、例えば動物、植物、
微生物等から分離したＤＮＡやＲＮＡ断片、これらの断
片塩基の配列を変更して得たもの、ＤＮＡ合成機によっ
て合成したものなどが利用できる。

【００１４】抗体部としては、ハイブリッド体の検出に
利用する生物種と特異的に反応するものであればよく、
公知の方法により調製された抗体を用い得る。即ち、各
種動物及び各クラスの免疫グロブリンを用いることがで
き、例えば、免疫法により調製した動物の抗血清を用い
てもよいし、非特異反応を抑制し感度を向上させるため
常法により調製したモノクロ−ナル抗体や更に、抗体の
半分子や可変領域を残し特異性をより高めた抗体の部分
構造Ｆａｂ又は（Ｆａｂ’）₂ 等、種々の抗体分子を用
いることができる。また、通常抗原である生物種はエピ
ト−フ゜を複数有するので複数種の抗体を用いてもよ
い。

【００１５】又、抗体部の抗原・抗体反応性、核酸部の
プローブとしての機能を損なわない限りで、変性した抗
体、核酸を用いることも可能で、例えば、微粒子との結
合若しくは架橋剤との結合を容易にするために核酸や抗
体にアミノ基等の各種官能基を導入するなどの変性を施
したものを用いることができる。

【００１６】図１の構成の場合における核酸部と抗体部
の結合はいかなる方法を用いてもよいが、例えば両末端
に核酸部及び抗体部と結合し得る基を有する架橋剤を用
いる方法等が利用できる。架橋剤は必ずしも必要ではな
く、イオン結合や物理吸着による結合も可能である。し
かし架橋剤を用いて共有結合により結合した方が結合が
強固で好ましい。

【００１７】この場合の架橋剤としては、例えば抗体の
標識化及び核酸の標識化に用いられる一般的な架橋剤が
使用可能であり、マレイミド系、サクシンイミド系、ジ
スルフィド系、カルボジイミド系、アルデヒド系などの
架橋剤がある。具体的には、カルボジイミドメト−ｐ−
トルエンスルホネート、１−エチル−３−（３−ジメチ
ルアミノプロピル）−カルボジイミド等を好適に用い得
る。

【００１８】図２に示す構成における核酸部及び抗体部
の微粒子との結合には、これらの機能を損なわない範囲
内で種々の方法が利用可能である。なかでも、化学的な
結合が好ましく、カルボジイミド法、臭化シアン法、イ
ソシアネート法等が利用できる。また、その表面を核酸
部と直接または架橋剤を介して結合し得る基で変性した
微粒子を用いることも可能である。

【００１９】この場合の架橋剤としても図１の構成の場
合と同様の架橋剤が利用でき、好適なものとして、カル
ボジイミドメト−ｐ−トルエンスルホネート、１−エチ
ル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイ
ミド等を挙げることができる。

【００２０】微粒子として種々のものが利用可能である
が、例えばポリスチレン、ポリメチルメタクリレート等
を主成分とした有機高分子等を用いることができ、これ
らの有機高分子微粒子の表面を必要に応じて変性して例
えばカルボキシル基、ヒドロキシル基、アミノ基、アル
デヒド基、オキシシラン基等の抗体や核酸との結合を容
易とする官能基を導入したものが好ましい。また、微粒
子の粒径は、例えば０．０５〜１０μｍ、好ましくは
０．１〜２μｍの直径を有するものが利用できる。

【００２１】本発明の核酸プローブを用いた核酸の検出
方法では、まず上記の構成の核酸プローブと試料との水
性媒体中での反応が行われる。この反応により該試料中
に標的核酸が含まれていた場合には核酸プローブと標的
核酸のハイブリット体が形成される。この反応工程に
は、一般に用いられている公知の核酸プローブと試料と
の反応方法が利用できる。未反応の核酸プローブは、形
成されたハイブリッド体と分離され、この分離工程に
は、例えば、試料を適当な担体に固定しておき、これに
核酸プローブを反応させてハイブリッド体を形成させた
後の適当な段階で、担体を洗浄する方法など公知の方法
が利用できる。

【００２２】次に、得られたハイブリッド体の有する核
酸プローブの抗体部に生物種を反応させる。この反応
は、生物種を懸濁した適当な緩衝液等をハイブリッド体
に接触させることにより行うことができる。この生物種
との反応過程は、試料と核酸プローブの反応過程の後に
行っても良いし、ハイブリッド体を形成している核酸プ
ローブと未反応の核酸プローブとの分離操作の後に、ハ
イブリッド体を構成している核酸プローブと生物種を反
応させるようにしても良い。

【００２３】このようにしてハイブリッド体に固定され
た生物種を培養して増殖させ、それを検出する。ハイブ
リッド体と生物種の結合体の培養条件は用いた生物種の
種類によって選択すればよい。生物種としては、操作効
率を考慮すれば増殖速度が高く検出し易いものがよく、
例えば大腸菌等を好適に利用できる。増殖した生物種の
検出は、染色法等によって行うことができるが、十分な
増殖量が得られれば菌体を懸濁させてその濁度を光学的
手法で測定する方法等によりおこなうことができる。本
発明の方法では、生物種を増殖させて、検出情報を増幅
することができるので、生物種１つがハイブリッド体１
つに対応する状況では、標的核酸の１フラグメントから
の検出が可能となる。従って、本発明の方法によれば、
従来の方法での検出感度（通常の方法では１ｋｂのＤＮ
Ａなら数万個程度、すなわち数百ファエムトグラムオー
ダー程度、ＰＣＲによる増幅を用いる方法では１０００
個程度）と比べると飛躍的な感度の向上が達成できる。

【００２４】本発明の核酸の検出方法の一例における各
過程を模式的に図２に示す。この方法では、まず、
（Ａ）に示すように試料核酸４、５、６を適当な担体７
に固定する。担体や担体の固定方法としては、核酸プロ
ーブを用いた核酸検出法において一般的に用いられてい
るものを利用することができる。次に、（Ｂ）に示すよ
うに、本発明の核酸プローブ８を固定された試料核酸に
反応させ、検出対象としての標的核酸６とのハイブリッ
ドを形成させる。この反応には、一般に用いられている
ハイブリダイゼーションのための操作が利用できる。次
に（Ｃ）に示すように、ハイブリッド体の検出のための
生物種９を反応系に加え、これを核酸プローブの有する
抗体部に結合させ他の後、（Ｄ）において反応系から担
体を分離し、（Ｅ）においてハイブリッド体を構成して
いる核酸プローブに結合した生物種を適当な方法で培養
増殖させた後、これを検出する。図に示した例では、培
養液中に担体を浸漬して、担体上のハイブリッド体に結
合した生物種を増殖させて、培養液中に拡散させる方法
が取られているが、生物種の種類によっては、例えば担
体として多孔性のものを用い、これに培養液を含浸させ
て担体表面で生物種の培養を行うことも可能である。

【００２５】

【実施例】以下実施例を用いて本発明を更に詳細に説明
するが、本発明はこれらになんら限定されない。

【００２６】実施例１（架橋剤を用いた核酸プローブの
作成） 常法により、ｐＵＣ１９のＳｓｐＩ、Ｃｆｒ１０Ｉ断片
（約０．７Ｋｂ）をｐＵＣ１９のＸｂａＩ部位に挿入し
ｐＵＣ５５を構築した。このものはＤＮＡ長及びＡｍｐ
耐性を指標として、常法に従い大腸菌により増殖後スク
リーニングをかけ、回収した。得られたｐＵＣ５５から
ＰｖｕII、ＶｓｐＩ断片（約０．９Ｋｂ）を切り出して
抽出し常法に従ってＤＮＡ断片を調製し、これを熱変性
によって一本鎖としバイオ情報変換素子の作成に供し
た。

【００２７】まず、このＤＮＡ断片を、リン酸塩緩衝液
−生理食塩水（ＰＢＳ）に０．１ｍＭ ＭｇＣｌ₂を加
えた溶液に１０μｇ／ｍｌの濃度となるように溶解した
溶液の２５００μｌに、抗Ｅ．ｃｏｌｉ ＩｇＧ抗体
（マウス、フナコシ社）をｐＨ７．２の０．１Ｍリン酸
塩緩衝液で１ｍｇ／ｍｌに希釈した抗体溶液０．５ｍｌ
及びカルボジイミドメト−ｐ−トルエンスルホネートの
１％水溶液０．５ｍｌを加え室温で６０分間反応を行
い、反応混合物から一本鎖ＤＮＡ−カルボジイミド−抗
体の複合体、すなわち本発明の核酸プローブをカラムク
ロマトグラフィーにより分離した。

【００２８】実施例２（微粒子を用いた核酸プローブの
作成） 実施例１で得たｐＵＣ５５のＰｖｕII、ＶｓｐＩ断片を
解離させて得た一本鎖ＤＮＡ断片の溶液（核酸濃度１０
μｇ／ｍｌ、溶媒として０．１Ｍ ＭｇＣｌ₂を含むＰ
ＢＳを使用）の２５００μｌと、１−エチル−３−（３
−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミドの０．０
６ｇと、１重量％の高分子微粒子水分散液（粒子直径
０．８μｍ、スチレン−アクリルアミド−アクリル酸共
重合体微粒子）の５００μｌを混合し、室温で１０分間
放置した。遠心分離による洗浄後、微粒子を１／１５Ｎ
リン酸塩緩衝液（ｐＨ８．０）に分散して、固形分１％
の微粒子分散液を得た。この微粒子分散液の５ｍｌに、
１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カ
ルボジイミドの０．１２ｇを加え、室温で３時間振とう
した。次に、この微粒子分散液から遠心分離により微粒
子を回収し、さらに１／１５Ｎリン酸塩緩衝液（ｐＨ
８．０）で洗浄した。洗浄後の微粒子に、大腸菌のＩｇ
Ｇに対するマウス抗体（フナコシ社）溶液（ＰＢＳで１
ｍｇ／ｍｌの濃度に調整）の１．０ｍｌを加えた後、３
時間振とうし、遠心分離により一本鎖ＤＮＡ／微粒子／
抗体・複合体、すなわち本発明の核酸プローブを得た。

【００２９】実施例３（検出例） 試料核酸として以下のものを用意した。 試料Ａ： ｐＵＣ１９と大腸菌ＪＭ１０９株から常法に
より調製した染色体ＤＮＡの混合物（混合重量比、１：
１） 試料Ｂ： ｐＢＲ３２２と大腸菌ＨＢ１０１から常法に
より調製した染色体ＤＮＡの混合物（重量混合比、１：
１） 試料Ｃ： 大腸菌ＨＢ１０１から常法により調製した染
色体ＤＮＡ 以上の試料Ａ〜Ｃを個々に用いて以下の操作を行った。

【００３０】試料１μｇを含む溶液２μｌに、１０×Ｔ
Ａ緩衝液２．０μｌ及び水１６．０μｌを混合し、得ら
れた混合液に１０単位のＨｉｎｄＩＩＩ（ＴＯＹＯＢＯ
製）を加え、３７℃で２時間放置して、反応させた。反
応終了後、フェノール抽出、エタノール沈澱を行って精
製し、これを３μｌのｄｄＨ₂ Ｏに溶解し、ニトロセル
ロースフィルター（シュライヒャー シャネル）にスポ
ットし、自然風乾後、８０℃２時間の焼付けを行って試
料をフィルターに固定した。

【００３１】ハイブリダイゼーション溶液としては、１
００％ホルムアルデヒド９ｍｌ、２０×ＳＳＣ５ｍｌ、
５０×Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液０．４ｍｌ、１Ｍリン酸ナ
トリウム（ｐＨ６．５）０．４ｍｌ、５０．０ｍｇ／ｍ
ｌ濃度の変性サケ精子ＤＮＡ（Ｓｉｇｍａ社製）０．１
ｍｌの混合溶液を調製した。

【００３２】先の試料を固定したフィルターを、最終濃
度が３×ＳＳＣ及び１×Ｄｅｎｈａｒｄｔ液である溶液
２００ｍｌに３７℃で３０分間浸漬してプレハイブリダ
イゼーションを行った後、ハイブリダイゼーション溶液
を入れたポリエチレン製の袋内にフェルターが溶液に浸
漬されるように実施例１で得た核酸プローブの２μｇと
ともに入れて密封し、３７℃で６時間反応させた。反応
終了後、ポリエチレン製袋からフィルターを取出し、こ
れを２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳの５００ｍｌに浸し、
室温で２５分間洗浄し、０．２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤ
Ｓの５００ｍｌで同様に室温で３５分間洗浄した後、さ
らに、０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢ
Ｓ（ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ）で洗浄した。洗浄終了後、フ
ィルターを２５ｍｌのＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎに浸し、これ
に大腸菌の分散液（ＯＤ＝０．７）の１ｍｌを添加し、
室温で免疫反応を行った。

【００３３】反応後、フィルターを溶液から取出し、再
度ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ洗浄することで未反応の大腸菌を
フィルターから除去した後、フィルターを培養容器内に
置き、これにＬＢ培地を加え、３７℃で３時間培養し
た。培養後、培養液のＯ．Ｄ．（６６０ｎｍ）を測定し
た。その結果、試料Ａでは大腸菌の増殖がみられたが、
試料Ｂ、Ｃでは大腸菌の増殖は認められなかった。

【００３４】

【発明の効果】本発明により、放射性同位元素を用いる
ことなく極めて微量な核酸の検出が簡便な方法で行える
ようになった。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の核酸プローブの構成の一例を示す模式
図である。

【図２】本発明の核酸プローブの構成の一例を示す模式
図である。

【図３】本発明の核酸プローブを用いて試料核酸を検出
する方法を説明する模式図であり、図中（Ａ）→（Ｂ）
→（Ｃ）→（Ｄ）→（Ｅ）の手順で操作を行うことを示
す。

【符号の説明】

１ 核酸部 ２ 抗体部 ３ 微粒子 ４、５ 非標的核酸 ６ 標的核酸 ７ 担体 ８ 核酸プローブ ９ 生物種

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 生物種と抗原・抗体反応を行う抗体部
   と、標的核酸とハイブリッドを形成し得る核酸を含む核
   酸部とを有する核酸プローブを用いた核酸の検で方法で
   あって、（ａ）該核酸プローブと試料とを水性媒体中で
   反応させる過程と、（ｂ）該試料中に標的核酸が含まれ
   ていた場合に形成される核酸プローブと標的核酸のハイ
   ブリッド体を、未反応の核酸プローブと分離する過程
   と、（ｃ）該ハイブリッド体にその抗体部と抗原・抗体
   反応を行う生物種を反応させる過程と、（ｄ）該ハイブ
   リッド体に結合した生物種を増殖させる過程と、（ｅ）
   増殖した生物種を検出する過程と、を有することを特徴
   とする核酸検出方法。
2. 【請求項２】 生物種が細菌である請求項１に記載の核
   酸検出方法。
3. 【請求項３】 生物種が大腸菌である請求項２に記載の
   核酸検出方法。