JPH02502942A - 凝集による黄色ブドウ球菌の検出用試薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 凝集による黄色ブドウ球菌の検出用試薬本発明は、凝集による黄色ブドウ球１１ ｉ　（Ｓｔａｐｂｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ）の検出用の試薬に関する 。

黄色ブドウ球菌を検出するための試薬は、既に各種のものが公知である。これら の試薬は、ブドウ球菌のプロティンＡ、又はフィブリノーゲンについての親和性 因子の何れか、又は両方を同時に探索することを基礎とするものである。

プロティンＡは蛋白質性の抗原であり、ヒト由来の黄色ブドウ球菌の菌株の大多 数（８５から９５％）の壁の外側の成分である。非免疫学的過程により、プロテ ィンＡは免疫グロブリンのＦｃフラグメントと結合し、Ｐａｂ部分を遊離して残 す。

プロティンＡを有する黄色ブドウ球菌の菌株と、羊赤血球、又は例えばウサギ抗 羊赤血球血清で感作したラテックス粒子とが一緒にされた場合には、裸眼で視認 可能な凝集が数分以内に観察される。

フィブリノーゲンについての親和性因子は、黄色ブドウ球菌の表面に付着するも のであって、フィブリノーゲンと直接に反応する。

このフィブリノーゲンについての親和性因子は、研究対象である菌株と羊赤血球 （受身血球凝集反応）又はラテックス粒子とを、何れか一方にフィブリノーゲン を塗着してから接触状態に置くことにより、数秒以内に判定することができる。

黄色ブドウ球菌の幾らかの菌株は、これらの試薬によっては識別されないことが 、これまで発表された各種の研究によって示されている。その割合は、それらの 研究が行われた際に分離された黄色ブドウ球菌の全部の１から５％と様々である 。しかしこの識別不能である割合は、オキサシリン（又はメチシリン）耐性な菌 株のみが対象とされた場合にはより大きくなり、オキサシリン耐性な黄色ブドウ 球菌の７３株について行われた最近の研究においては、この割合は２５％にも達 している（ルアン（Ｐ、Ｊ、　Ｒｕａｎｅ）等、Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｍｉｃｒｏ ｂｉｏｌ。

２４、４９０．１９８６参照）。

パリ市又はパリ市周辺の５つの病院の愚者から分離した黄色ブドウ球菌の１８３ 株について本発明者の何れか一方の指揮下に行われた研究において、７株（４％ ）は使用した３種の試薬（Ｓｔａｐｈｙｓｌｉｄｅ＠、５ｔａｐｈａｕｒｅｘ＠ 及びＰａｓ　ｔｏｒｅｘ　＠　５ｔａｐｈ）の何れによっても凝集しないことが 見出された。オキサシリン耐性な５０株のみを考慮した場合は、市販の試薬では ６株（１２％）が誤うて陰性となることも見出された。

従ってこれらの結果は、前記文献に記載の結果と一致するものである。

黄色ブドウ球菌の幾つかの菌株が市販の試薬によって凝集しないという事実を説 明するについては、二つの仮説を立てることができる： １）　これらの菌株が産生ずるプロティンＡの量が余りに少なく、このプロティ ンとラテックス粒子の間に細菌凝集をもたらすに足る反応が起こらない。

２）　プロティンＡは通常の量だけ産生されるが、同時にフィブリノーゲンにつ いての親和性因子でもあるこの抗原が−又は二以上の他の抗原によってマスクさ れ、従ってラテックス粒子に接近不能となってしまう。

本発明者の何れか一方の指揮下に行われた研究において、ラテックス粒子によっ て凝集されない菌株が、他の菌株と同じ位の量のプロティンＡを産生ずることが 示されている。従ってこの結果から、最初の仮説を排除することができる。また モノクローナル抗体を用いた酵素抗体反応によって莢膜多糖を測定することによ り、フィブリノーゲンで感作されてプロティンＡに抗するラテックス粒子により て凝集されない菌株が、全部莢膜多糖を有していることが示された。最後に、ブ ドウ球菌の表面に露出され、従ってラテックス粒子と反応することができる抗原 を蛍光抗体法によって研究した。このトと、フルオレセインで標識化した抗ヒト Ｆｃ羊免疫グロブリンのペプシン化Ｆ（ａｂ’）＊フラグメントを用いて）を対 象とし、他方では莢膜多ＩＩ（莢膜多糖特異なＭイソタイプのマウスモノクロー ナル抗体と、ローダミンでｔｌｌｋ化した抗マウスＭ免疫グロブリンヤギ免疫グ ロブリンのＦ（ａｂ’）ｔフラグメントを用いて）を対象とするものであった。

この研究により、ラテックスにより凝集されない細菌の表面にはプロティンＡが 露出されないか、或いはその時非常に少量であること、またこれらの細菌の表面 は他方では莢膜多糖によって完全にマスクされているということが明らかに示さ れた。対照として、インＡを示すということが検証された。

か（してこの研究により、黄色ブドウ球菌の何かの菌株によってで検出可能であ る抗原をマスクし、従って市販の試薬により凝集されるという事実に基づいてそ れらの菌株を黄色ブドウ球菌の種に属するものとして識別することが妨げられる ということが示された。

この研究で得られた結果、特にプロティンＡを表面に示さない黄色ブドウ球菌の 菌株が莢膜化された菌株であってその莢膜多糖がプロティンＡをマスクするとい う事実に基づいて、公知の試薬よりもずっと大きな信頼性のある、黄色ブドウ球 菌の菌株を検出するための試薬を設計することが可能となった。

従うて本発明の課題は、懸濁液中の粒子からなり、該粒子に対してフィブリノー ゲン及びブドウ球菌のプロティンＡによる親和性によって認識された抗体が結合 しているタイプの、凝集による黄色ブドウ球菌の検出用試薬であって、懸濁液中 に粒子を含み、該粒子に対して黄色ブドウ球菌の莢膜多糖を特異的に認識する少 なくとも一つの抗体が結合していることを特徴とするものである。

本発明の別の課題は、サンプル中の黄色ブドウ球菌を凝集によって検出するため の方法であって、該サンプルを本発明による試薬と混合し、凝集が生ずるか否か を観察することからなるものである。

現在では、本質的に免疫学的な方法によって１１のタイプの莢膜多糖が識別され ている。この点に関しては、ニューヨークのシーム・ストラットン社から発行さ れているロビンス（Ｊ、Ｂ、　Ｒｏｂｂｉｎｇ）、ヒル（Ｊ、Ｃ，Ｂ１１１）及 びサドフ（Ｊ、Ｃ，５ａｄｏｆｆ）　ｋＸの伝染病講座第４巻、細菌ワクチン２ ８５−２９３頁所載のカラカワ（ＷＪ、　Ｋａｒａｋａｗａ）等の「黄色ブドウ 球菌の莢膜多糖」、カラカワ（ＷＪ、　Ｋａｒａｋａｗａ）等のＪ、　Ｃｌ１ｎ 。

Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　２２．４４５−４４７．１９８５、及びソンボリンスキ ー（Ｓｏｍｐｏｌ　１ｎｓｋｙ）等のＪ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、 　２２．８２８−８３４．１９８５を参照されたい。

タイプ８の莢膜多糖の精製並びに生化学的及び免疫学的特徴付けは１９８４年に 行われ（フォルニエ（Ｊ、Ｍ、　Ｆｏｕｒｎｉｅｒ）等Ｉｎｆｅｃｔ、　Ｉ＋＋ ｎｕｎ。

４５、８７−９３）、タイプ５についてのそれは１９８７年に行われた（フォル ニエ（Ｊ、Ｍ、　Ｆｏｕｒｎｉｅｒ）等Ａｎｎ、　Ｉｎ５ｔ、　Ｐａ５ｔｅｕｒ ／Ｍｉｃｒｏｂｉｏ１．１３Ｌ　５６１莢膜多Ｉ！５及び８の特異的モノクロー ナル抗体は既に開示されている（ホフヒケッベル（Ｈ，に、　Ｂｏｃｈｋｅｐｐ ｅｌ）等Ｊ、　ＣＩｉｐｏＭｉｃｒＣｌｌｐｏ。

１４−１８．１９８５）。

さらにまた、患者から分離した多数の黄色ブドウ球菌の菌株について行われた疫 学的研究によれば、これらの菌株の７０から８０％が莢膜多糖５及び８の一方又 は他方を有することが示されている（例えばアルバイト（Ｒ，Ｄ、　Ａｒｂｅｉ ｔ）等Ｄｉａｇｎ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　Ｉｎｆｅｃｔ、　Ｄｉｓ、　２＋ ８５−９１．１９８４）。

また本発明においては、黄色ブドウ球菌の莢膜多糖を認識する抗体は、少なくと も莢膜多糖のタイプ５又は８を認識する抗体によって構成するのが有利であり、 タイプ５の莢膜多糖を認識する抗体及びタイプ８の莢膜多糖を認識する抗体によ って同時に構成するのが好ましい。

しかしながら、最も信軌性のある診断試薬は異なるタイプの莢膜多糖を認識する 抗体の組み合わせを含むものであることは自明のことである。

本発明による試薬においては、異なる抗体及びフィブリノーゲンが粒子の単一の 懸濁液のみに対して、又は粒子の別々の懸濁液（粒子の懸濁液あたり成分−又は 二タイプ以上の割合の）に対して結合されることができ、別々の懸濁液は混合さ れて試薬となる。

本発明による試薬において用いられる懸濁液における粒子は、特にポリスチレン ビーズの如きラテックス粒子又は同類の粒子であり、好ましくは２マイクロメー トルより小さい大きさを有するものである。−例としては、ロース・プラン（Ｒ ｈ６ｎｅ−Ｐｏｕｌｅｎｃ）社により市販されているＥＳＴＡＦＯＲという商品 名の粒子、例えば、・直径０．８マイクロメートルのポリスチレン粒子に１０９ 、・直径０．８マイクロメートルカルボキシル基を有するポリスチレン粒子Ｐｓ ｉ　４８０ の如きを挙げることができる。

フランス特許ＦＲ−＾−２３３４１０６に記載された如き、磁気粒子を含んでい るポリアクリルアミド及び／又はアガロースのゲルのような、磁気ゲルを使用す ることもまた可能である。アイピーエフ社から市販されているＵｌｔｒｏｇｅｌ ■及びＭａｇｎｏｇｅｌ　＠のようなゲルもまた使用できる。

本発明において用いられる抗体は、動物又はヒトの、ポリクローナル又はモノク ローナルな抗体でありうる。

ブドウ球菌のプロティンＡによる親和性によって認識される抗体は、特にＩｇＧ クラスの抗体である。これらはこれらの免疫グロブリンのＦｃフラグメントによ って置き換えることができる。

ポリクローナルな抗体の場合には、これらの抗体又は標準的な方法によって精製 された抗体を含む、自然の又は免疫されたヒト又は動物の血漿を用いて試薬を調 製することができる。

モノクローナル抗体の場合には、ハイブリドーマ培地の上清又はマウスで調製し た腹水、或いは精製状態の抗体を使用することができる。

フィブリノーゲンを結合するためには、自然の又は高度免疫されたヒト又は動物 の血漿、或いは標準的な方法によって精製したフィブリノーゲンを用いることが できる。

これらの分子を懸濁液中の粒子、通常はラテックス粒子に対して結合することは 、種々の方法によって達成することができる：・結合は、これらの分子を含む溶 液中においてラテックス粒子を培養する過程において自発的に行われる０例えば ５６°Ｃにおいて３０分の培養で大抵は十分である。

・この結合はまた、抗体と、ある種のラテックス粒子（ＥＳＴＡＰＯＲＰｓｉ４ ８０）上に存在しているカルボキシル基との間で共有結合を行わせることによっ て実行することができる０例えば共有結合を確立するために、カルボジイミドを 使用することが可能である。

ラテックス粒子に対して結合される分子の濃度は、公知の方法によって各々の分 子について決定しなければならないが、通常はラテックス１■当たり２００マイ クログラムより少ない、血漿成分の如き分子を使用する場合には、この血漿の１ ／１０００への希釈が行われる。

本発明は以下の実施例によって例示される。

１隻貫上 ａ）　フィブリノーゲンと、■ｇＧを含むヒトの血漿中に含まれる抗体で感作し たラテックス粒子の調製 うｆ　マウス（ＥＳＴＡＰＯＲ，Ｋ　１０９）　（Ｄ懸濁液を、ＣＧＡと呼ばれ るｐｌ＋８のグリシン（０，２７Ｍ）−塩化ナトリウム（０，１５？Ｉ）−アジ 化ナトリウム（０，０４ｇ／　ｉ！　）　ＩＩ衝液液中２％の濃度とした。この 懸濁液の一定容積を、同じ緩衝液で１／１０００に希釈したヒト血漿の等容積と 混合し、次いで振盪しなから５６°Ｃで３０分間培養した。洗浄の後、感作され たラテックス粒子を０．０５％のヒト血漿を含むＣＧＡ緩衝液中に再度懸濁した 。

ｂ）　タイプ８の莢膜多糖を認識する精製したモノクローナル抗体で感作したラ テックス粒子の調製 ラテックス（ＥＳＴＡＰＯＲ，Ｋ　１０９）の懸濁液を、ＣＧＡと呼ばれるｐＨ ９，２のグリシン（０，１７Ｍ）−塩化ナトリウム（０，１５？Ｉ）−アジ化ナ トリウム（０，０４ｇ／　ｊ！　）　Ｍｋ衝液液中２％の濃度とした。この懸濁 液の一定容積を、同じ緩衝液中に溶解した精製抗体の等容積と混合した。

抗体の最終的な濃度は、ラテックス１■当たり抗体１００マイクログラムであっ た。３７°Ｃで３０分間培養した後、感作したラテックス粒子を洗浄し、次いで ０．１χのウシ血清アルブミンを含むＣＧＡｌＩ衝液中に再度懸濁した。

Ｃ）試薬の調製 ａ）で得た懸濁液とｂ）で得た＠濁液とを同じ割合で混合し、試薬を調製した。

１旌ｆｌ 実施例１と同様に作業を行ったが、段ｌ５ｂ）においてタイプ８及び５の多糖を 特異的に認識するモノクローナル抗体の混合物を使用した。

この目的のために、０．１５Ｍ／　Ｉ！のグリシン及び０．１５Ｍ／　Ｉ！の塩 化ナトリウムからなるｐＨ８，２の緩衝液（ＧＮ）中で４％の濃度とした前述の ＥＳＴＡＦＯＲラテックス（Ｋ　１０９）の懸濁液を、抗タイプ５及び抗タイプ ８のモノクローナル抗体の混合物を最終的な濃度が１１ｇ／ＩＩ！！、となるよ う同じ比率で含んでいる一定容積のＧＮ緩衝液と混合した。この混合物を振盪し ながら３７℃で２時間培養した。

この感作したラテックスの一定容積を、３■／ｄのウシ血清アルブミン及び０． ０４　ｇ　／　ｌのアジ化ナトリウムを含むＧＮ緩衝液と混合した。この混合物 は３７℃で３時間培養した。この抗タイプ５及び８のラテックスの１容積を、ヒ ト血漿の抗体及びフィブリノーゲンで感作したラテックス粒子１容積と混合した 。

１旌■主 実施例１と同様に作業を行ったが、段階ｂ）において黄色ブドウ球菌の１１の公 知の莢膜多糖を特異的に認識する１１の抗体の混合物を使用した。

１旌■互 本発明者の一方の指揮下に行われた研究において、実施例２に記載の手順に従っ て調製された試薬の凝集力を市販の試薬（Ｐａｓ　ｔｏｒｅｘ　＠５ｔａｐｈ） の凝集力と比較した。この比較は、患者から分離した黄色ブドウ球菌の１８３株 について行われた。市販の試薬では１８３株のうち１７６株が凝集しただけであ るのに対し、実施例２に従って調製された試薬は１８３株全部を凝集した。さら にまた、市販の試薬によって既に凝集している菌株の凝集の迅速さ及び強さも、 実施例２に従って調製された試薬を用いることによって非常に目覚ましく改善さ れた。

本発明による試薬は； ・生物学的な液体（分泌液、膿、その他）や培地（血液培地、その他）中で、細 菌を分離する前に、 ・細菌の分離の後に、 凝集による黄色ブドウ球菌の種の迅速な識別のために使用されることができる。

本発明による試薬は、現在市販されている既存の凝集試薬によっては認識されな いすべての黄色ブドウ球菌の菌株、中でもオキサシリン耐性な菌株が主であるも のを認識することを可能ならしめる。

か（して本発明による試薬は、殆どの場合に多謝性であるこれらの菌株がもたら す問題点に鑑みるとき、大きな重要性を有するものである。

一一一−−＾−”−”’　ＰＣＴ／Ｆｌｉｔ　８８１００６３７１際調査報告 ＦＲ８８００６３７

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. １．懸濁液中の粒子からなり、該粒子に対してフィブリノーゲン及びブドウ球菌 のプロテインＡによる親和性によって認識された抗体が結合しているタイプの、 凝集による黄色ブドゥ球菌の検出用試薬であって、懸濁液中に粒子を含み、該粒 子に対して黄色ブドウ球菌の莢膜多糖を特異的に認識する少なくとも一つの抗体 が結合していることを特徴とする試薬。
2. ２．黄色ブドウ球菌の莢膜多糖を認識する抗体は、タイプ５又は８の莢膜多糖を 認識する抗体であることを特徴とする、請求項１記載の試薬。
3. ３．黄色ブドウ球菌の莢膜多糖を認識する抗体は、タイプ５の莢膜多糖を認識す る抗体であると同時にタイプ８の莢膜多糖を認識する抗体であることを特徴とす る、請求項２記載の試薬。
4. ４．黄色ブドウ球菌の莢膜多糖を認識する抗体は、異なる種類の莢膜多糖を認識 する抗体の組み合わせからなることを特徴とする、請求項３記載の試薬。
5. ５．懸濁液中の粒子はラテックス粒子であることを特徴とする、請求項１から４ の何れか一つに記載の試薬。
6. ６．粒子は２マイクロメートルより小さな寸法を有することを特徴とする、請求 項１から５の何れか一つに記載の試薬。
7. ７．懸濁液中の粒子は磁気ゲルであることを特徴とする、請求項１から４の何れ か一つに記載の試薬。
8. ８．サンプル中の黄色ブドウ球菌を凝集によって検出するための方法であって、 試験するサンプルを請求項１から７の何れか一つに記載の試薬と混合し、凝集が 生ずるか否かを観察することからなることを特徴とする方法。
9. ９．サンプルは血液培地のサンプルである、請求項８記載の方法。