JP2680151B2 - 凝集による黄色ブドウ球菌の検出用試薬 - Google Patents

凝集による黄色ブドウ球菌の検出用試薬

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JP2680151B2
JP2680151B2 JP1500774A JP50077489A JP2680151B2 JP 2680151 B2 JP2680151 B2 JP 2680151B2 JP 1500774 A JP1500774 A JP 1500774A JP 50077489 A JP50077489 A JP 50077489A JP 2680151 B2 JP2680151 B2 JP 2680151B2
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Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、凝集による黄色ブドウ球菌（Staphylococc
us aureus）の検出用の試薬に関する。
黄色ブドウ球菌を検出するための試薬は、既に各種の
ものが公知である。これらの試薬は、ブドウ球菌のプロ
テインＡ、又はフィブリノーゲンについての親和性因子
の何れか、又は両方を同時に探索することを基礎とする
ものである。
プロテインＡは蛋白質性の抗原であり、ヒト由来の黄
色ブドウ球菌の菌株の大多数（85から95％）の壁の外側
の成分である。非免疫学的過程により、プロテインＡは
免疫グロブリンのFcフラグメントと結合し、Fab部分を
遊離して残す。
プロテインＡを有する黄色ブドウ球菌の菌株と、羊赤
血球、又は例えばウサギ抗羊赤血球血清で感作したラテ
ックス粒子とが一緒にされた場合には、裸眼で視認可能
な凝集が数分以内に観察される。
フィブリノーゲンについての親和性因子は、黄色ブド
ウ球菌の表面に付着するものであって、フィブリノーゲ
ンと直接に反応する。このフィブリノーゲンについての
親和性因子は、研究対象である菌株と羊赤血球（受身血
球凝集反応）又はラテックス粒子とを、何れか一方にフ
ィブリノーゲンを塗着してから接触状態に置くことによ
り、数秒以内に判定することができる。
黄色ブドウ球菌の幾らかの菌株は、これらの試薬によ
っては識別されないことが、これまで発表された各種の
研究によって示されている。その割合は、それらの研究
が行われた際に分離された黄色ブドウ球菌の全部の１か
ら５％と様々である。しかしこの識別不能である割合
は、オキサシリン（又はメチシリン）耐性な菌株のみが
対象とされた場合により大きくなり、オキサシリン耐性
な黄色ブドウ球菌の73株について行われた最近の研究に
おいては、この割合は25％にも達している（ルアン（P.
J. Ruane）等、J. Clin. Microbiol. 24,490,1986参
照）。
パリ市又はパリ市周辺の５つの病院の患者から分離し
た黄色ブドウ球菌の183株について本発明者の何れか一
方の指揮下に行われた研究において、７株（４％）は使
用した３種の試薬（Staphyslide 、Staphaurex 及びP
astorex Staph）の何れによっても凝集しないことが見
出された。オキサシリン耐性な50株のみを考慮した場合
は、市販の試薬では６株（12％）が誤って陰性となるこ
とも見出された。従ってこれらの結果は、前記文献に記
載の結果と一致するものである。
黄色ブドウ球菌の幾つかの菌株が市販の試薬によって
凝集しないという事実を説明するについては、二つの仮
説を立てることができる： １） これらの菌株が産生するプロテインＡの量が余り
に少なく、このプロテインとラテックス粒子の間に細菌
凝集をもたらすに足る反応が起こらない。
２） プロテインＡは通常の量だけ産生されるが、この
抗原並びにフィブリノーゲンに対する親和性因子が一又
は二以上の他の抗原によってマスクされ、従ってラテッ
クス粒子に接近不能となってしまう。
本発明者の何れか一方の指揮下に行われた研究におい
て、ラテックス粒子によって凝集されない菌株が、他の
菌株と同じ位の量のプロテインＡを産生することが示さ
れている。従ってこの結果から、最初の仮説を排除する
ことができる。またモノクローナル抗体を用いた酵素抗
体反応によって莢膜多糖を測定することにより、フィブ
リノーゲンで感作されてプロテインＡに抗するラテック
ス粒子によって凝集されない菌株が、全部莢膜多糖を有
していることが示された。最後に、ブドウ球菌の表面に
露出され、従ってラテックス粒子と反応することができ
る抗原を蛍光抗体法によって研究した。この研究は一方
ではプロテインＡ（ヒト免疫グロブリンのFcフラグメン
トと、フルオレセインで標識化した抗ヒトFc羊免疫グロ
ブリンのペプシン化Ｆ（ab′）２フラグメントを用い
て）を対象とし、他方では莢膜多糖（莢膜多糖特異なＭ
イソタイプのマウスモノクローナル抗体と、ローダミン
で標識化した抗マウスＭ免疫グリブリンヤギ免疫グロブ
リンのＦ（ab′）２フラグメントを用いて）を対象とす
るものであった。この研究により、ラテックスにより凝
集されない細菌の表面にはプロテインＡが露出されない
か、或いはその時非常に少量であること、またこれらの
細菌の表面は他方では莢膜多糖によって完全にマスクさ
れているということが明らかに示された。対照として、
ラテックス粒子によって凝集される菌株は事実、その表
面にプロテインＡを示すということが検証された。
かくしてこの研究により、黄色ブドウ球菌の何かの菌
株によって感作された莢膜多糖がすべての細菌をマスク
し、市販の試薬によって検出可能である抗原をマスク
し、従って市販の試薬により凝集されるという事実に基
づいてそれらの菌株を黄色ブドウ球菌の種に属するもの
として識別することが妨げられるということが示され
た。
この研究で得られた結果、特にプロテインＡを表面に
示さない黄色ブドウ球菌の菌株が莢膜化された菌株であ
ってその莢膜多糖がプロテインＡをマスクするという事
実に基づいて、公知の試薬よりもずっと大きな信頼性の
ある、黄色ブドウ球菌の菌株を検出するための試薬を設
計することが可能となった。
従って本発明の一つの主題は、ブドウ球菌のプロテイ
ンＡによる親和性によって認識される抗体及びフィブリ
ノーゲンが結合している第一のタイプの懸濁粒子を含む
タイプの、凝集による黄色ブドウ球菌の検出用試薬であ
って、その試薬が黄色ブドウ球菌の莢膜多糖を特異的に
認識する少なくとも一つの抗体が結合している第二のタ
イプの懸濁粒子を含むことを特徴とする試薬である。
本発明の別の主題は、サンプル中の黄色ブドウ球菌を
凝集によって検出するための方法であって、該サンプル
を本発明による試薬と混合し、凝集が生ずるか否かを観
察することからなるものである。
現在では、本質的に免疫学的な方法によって11のタイ
プの莢膜多糖が識別されている。この点に関しては、ニ
ューヨークのシーム・ストラットン社から発行されてい
るロビンス（J.B. Robbing）、ヒル（J.C. Hill）及び
サドフ（J.C. Sadoff）編の伝染病講座第４巻、細菌ワ
クチン285−293頁所載のカラカワ（W.W. Karakawa）等
の「黄色ブドウ球菌の莢膜多糖」、カラカワ（W.W. Kar
akawa）等のJ. Clin. Microbiol.22,445−447,1985、及
びソンポリンスキー（Sompolinsky）等のJ. Clin. Micr
obiol.22,828−834,1985を参照されたい。
タイプ８の莢膜多糖の精製並びに生化学的及び免疫学
的特徴付けは1984年に行われ（フォルニエ（J.M. Fourn
ier）等Infect. Immun.45,87−93）、タイプ５について
のそれは1987年に行われた（フォルニエ（J.M. Fournie
r）等Ann. Inst. Pasteur/Microbiol.138,561−567）。
莢膜多糖５及び８の特異的モノクローナル抗体は既に
開示されている（ホッヒケッペル（H.K. Hochkeppel）
等J. Clin. Microbiol.25,526−530,1987及びネレス
（M.J. Nelles）等Infect. Immun.49,14−18,1985）。
さらにまた、患者から分離した多数の黄色ブドウ球菌
の菌株について行われた疫学的研究によれば、これらの
菌株の70から80％が莢膜多糖５及び８の一方又は他方を
有することが示されている（例えばアルバイト（R.D. A
rbeit）等Diagn. Microbiol. Infect. Dis.2,85−91,19
84）。
また本発明においては、黄色ブドウ球菌の莢膜多糖を
認識する抗体は、少なくとも莢膜多糖のタイプ５又は８
を認識する抗体によって構成するのが有利であり、タイ
プ５の莢膜多糖を認識する抗体及びタイプ８の莢膜多糖
を認識する抗体によって同時に構成するのが好ましい。
しかしながら、最も信頼性のある診断試薬は異なるタ
イプの莢膜多糖を認識する抗体の組み合わせを含むもの
であることは自明のことである。
本発明における試薬においては、異なる抗体及びフィ
ブリノーゲンが粒子の単一の懸濁液のみに対して、又は
粒子の別々の懸濁液（粒子の懸濁液あたり成分一又は二
タイプ以上の割合の）に対して結合されることができ、
別々の懸濁液は混合されて試薬となる。
本発明による試薬において用いられる懸濁液における
粒子は、特にポリスチレンビーズの如きラテックス粒子
又は同類の粒子であり、好ましくは２マイクロメートル
より小さい大きさを有するものである。一例としては、
ローヌ・プラン（Rhne−Poulenc）社により市販され
ているESTAPORという商品名の粒子、例えば、 ・直径0.8マイクロメートルのポリスチレン粒子 K 10
9、 ・直径0.8マイクロメートルカルボキシル基を有するポ
リスチレン粒子 PSI 480 の如きを挙げることができる。
フランス特許FR−Ａ−2 334 106に記載された如き、
磁気粒子を含んでいるポリアクリルアミド及び／又はア
ガロースのゲルのような、磁気ゲルを使用することもま
た可能である。アイビーエフ社から市販されているUltr
ogel 及びMagnogel のようなゲルもまた使用できる。
本発明において用いられる抗体は、動物又はヒトの、
ポリクローナル又はモノクローナルな抗体でありうる。
ブドウ球菌のプロテインＡによる親和性によって認識
される抗体は、特にIgGクラスの抗体である。これらは
これらの免疫グロブリンのFcフラグメントによって置き
換えることができる。
ポリクローナルな抗体の場合には、これらの抗体又は
標準的な方法によって精製された抗体を含む、自然の又
は免疫されたヒト又は動物の血漿を用いて試薬を調製す
ることができる。
モノクローナル抗体の場合には、ハイブリドーマ培地
の上清又はマウスで調製した腹水、或いは精製状態の抗
体を使用することができる。
フィブリノーゲンを結合するためには、自然の又は高
度免疫されたヒト又は動物の血漿、或いは標準的な方法
によって精製したフィブリノーゲンを用いることができ
る。
これらの分子を懸濁液中の粒子、通常はラテックス粒
子に対して結合することは、種々の方法によって達成す
ることができる： ・結合は、これらの分子を含む溶液中においてラテック
ス粒子を培養する過程において自発的に行われる。例え
ば56℃において30分の培養で大抵は十分である。
・この結合はまた、抗体と、ある種のラテックス粒子
（ESTAPOR PSI 480）上に存在しているカルボキシル基
との間で共有結合を行わせることによって実行すること
ができる。例えば共有結合を確立するために、カルボジ
イミドを使用することが可能である。
ラテックス粒子に対して結合される分子の濃度は、公
知の方法によって各々の分子について決定しなければな
らないが、通常はラテックス1mg当たり200マイクログラ
ムより少ない。血漿成分の如き分子を使用する場合に
は、この血漿の1/1000への希釈が行われる。
本発明は以下の実施例によって例示される。
実施例１ ａ） フィブリノーゲンと、IgGを含むヒトの血漿中に
含まれる抗体で感作したラテックス粒子の調製 ラテックス（ESTAPOR,K 109）の懸濁液を、CGAと呼ば
れるpH8のグリシン（0.27M）−塩化ナトリウム（0.15
M）−アジ化ナトリウム（0.04g/）緩衝液中で２％の
濃度とした。この懸濁液の一定容積を、同じ緩衝液で1/
1000に希釈したヒト血漿の等容積と混合し、次いで振盪
しながら56℃で30分間培養した。洗浄の後、感作された
ラテックス粒子を0.05％のヒト血漿を含むCGA緩衝液中
に再度懸濁した。
ｂ） タイプ８の莢膜多糖を認識する精製したモノクロ
ーナル抗体で感作したラテックス粒子の調製 ラテックス（ESTAPOR,K 109）の懸濁液を、CGAと呼ば
れるpH9.2のグリシン（0.17M）−塩化ナトリウム（0.15
M）−アジ化ナトリウム（0.04g/）緩衝液中で２％の
濃度とした。この懸濁液の一定容積を、同じ緩衝液中に
溶解した精製抗体の等容積と混合した。抗体の最終的な
濃度は、ラテックス1mg当たり抗体100マイクログラムで
あった。37℃で30分間培養した後、感作したラテックス
粒子を洗浄し、次いで0.1％のウシ血清アルブミンを含
むCGA緩衝液中に再度懸濁した。
ｃ） 試薬の調製 ａ）で得た懸濁液とｂ）で得た懸濁液とを同じ割合で
混合し、試薬を調製した。
実施例２ 実施例１と同様に作業を行ったが、段階ｂ）において
タイプ８及び５の多糖を特異的に認識するモノクローナ
ル抗体の混合物を使用した。
この目的のために、0.15M/のグリシン及び0.15M/
の塩化ナトリウムからなるpH8.2の緩衝液（CN）中で４
％の濃度とした前述のESTAPORラテックス（K 109）の懸
濁液を、抗タイプ５及び抗タイプ８のモノクローナル抗
体の混合物を最終的な濃度が1mg/mlとなるよう同じ比率
で含んでいる一定容積のGN緩衝液と混合した。この混合
物を振盪しながら37℃で1/2時間培養した。
この感作したラテックスの一定容積を、3mg/mlのウシ
血清アルブミン及び0.04g/のアジ化ナトリウムを含む
GN緩衝液と混合した。この混合物は37℃で1/2時間培養
した。この抗タイプ５及び８のラテックスの１容積を、
ヒト血漿の抗体及びフィブリノーゲンで感作したラテッ
クス粒子１容積と混合した。
実施例３ 実施例１と同様に作業を行ったが、段階ｂ）において
黄色ブドウ球菌の11の公知の莢膜多糖を特異的に認識す
る11の抗体の混合物を使用した。
実施例４ 本発明者の一方の指揮下に行われた研究において、実
施例２に記載の手順に従って調製された試薬の凝集力を
市販の試薬（Pastorex Staph）の凝集力と比較した。
この比較は、患者から分離した黄色ブドウ球菌の183株
について行われた。市販の試薬では183株のうち176株が
凝集しただけであるのに対し、実施例２に従って調製さ
れた試薬は183株全部を凝集した。さらにまた、市販の
試薬によって既に凝集している菌株の凝集の迅速さ及び
強さも、実施例２に従って調製された試薬を用いること
によって非常に目覚ましく改善された。
本発明による試薬は： ・生物学的な液体（分泌液、膿、その他）や培地（血液
培地、その他）中で、細菌を分離する前に、 ・細菌の分離の後に、 凝集による黄色ブドウ球菌の種の迅速な識別のために使
用されることができる。
本発明による試薬は、現在市販されている既存の凝集
試薬によっては認識されないすべての黄色ブドウ球菌の
菌株、中でもオキサシリン耐性な菌株が主であるものを
認識することを可能ならしめる。かくして本発明による
試薬は、殆どの場合に多耐性であるこれらの菌株がもた
らす問題点に鑑みるとき、大きな重要性を有するもので
ある。

Claims (10)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】ブドウ球菌のプロテインＡによる親和性に
    よって認識される抗体及びフィブリノーゲンが結合して
    いる第一のタイプの懸濁粒子を含むタイプの、凝集によ
    る黄色ブドウ球菌の検出用試薬であって、その試薬が黄
    色ブドウ球菌の莢膜多糖を特異的に認識する少なくとも
    一つの抗体が結合している第二のタイプの懸濁粒子を含
    むことを特徴とする試薬。
  2. 【請求項２】黄色ブドウ球菌の莢膜多糖を認識する抗体
    は、タイプ５又は８の莢膜多糖を認識する抗体であるこ
    とを特徴とする、請求項１記載の試薬。
  3. 【請求項３】黄色ブドウ球菌の莢膜多糖を認識する抗体
    は、タイプ５の莢膜多糖を認識する抗体であることを特
    徴とする、請求項２記載の試薬。
  4. 【請求項４】黄色ブドウ球菌の莢膜多糖を認識する抗体
    は、タイプ５の莢膜多糖を認識する抗体と、タイプ８の
    莢膜多糖を認識する抗体の混合物であることを特徴とす
    る、請求項２記載の試薬。
  5. 【請求項５】黄色ブドウ球菌の莢膜多糖を認識する抗体
    は、異なる種類の莢膜多糖を認識する抗体の組み合わせ
    からなることを特徴とする、請求項３記載の試薬。
  6. 【請求項６】懸濁粒子はラテックス粒子であることを特
    徴とする、請求項１から５の何れか一つに記載の試薬。
  7. 【請求項７】粒子は２マイクロメートルより小さな寸法
    を有することを特徴とする、請求項１から６の何れか一
    つに記載の試薬。
  8. 【請求項８】懸濁粒子は磁気ゲルであることを特徴とす
    る、請求項１から５の何れか一つに記載の試薬。
  9. 【請求項９】サンプル中の黄色ブドウ球菌を凝集によっ
    て検出するための方法であって、試験するサンプルを請
    求項１から８の何れか一つに記載の試薬と混合し、凝集
    が生ずるか否かを観察することからなることを特徴とす
    る方法。
  10. 【請求項１０】サンプルは血液培地のサンプルである、
    請求項９記載の方法。
JP1500774A 1987-12-24 1988-12-22 凝集による黄色ブドウ球菌の検出用試薬 Expired - Lifetime JP2680151B2 (ja)

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