JP7274680B2 - 梅毒トレポネーマ菌の表面抗原の混合物を用いる、抗梅毒トレポネーマ体液抗体の測定 - Google Patents
梅毒トレポネーマ菌の表面抗原の混合物を用いる、抗梅毒トレポネーマ体液抗体の測定 Download PDFInfo
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Description
すなわち本発明は、梅毒トレポネーマ菌(TP)の人工表面抗原である、TpN47遺伝子で形質転換がなされた遺伝子組換えカイコ(以下、47組換えカイコともいう)の繭糸又は絹糸腺に由来する遺伝子組換えTpN47抗原(以下、47抗原ともいう)、及び、同TpN15遺伝子とTpN17遺伝子の融合遺伝子で形質転換がなされた遺伝子組換えカイコ(以下、15-17組換えカイコともいう)の繭糸又は絹糸腺に由来する遺伝子組換えTpN15-TpN17融合抗原(以下、15-17抗原ともいう)、の混合物(以下、本発明のTP抗原混合物、又は、TP抗原混合物、ともいう)を、体液検体と接触させて、該体液検体中の抗梅毒トレポネーマ抗体を、上記抗原の混合物との結合シグナルとして免疫学的測定方法により測定する、体液抗体の測定方法(以下、本発明の測定方法ともいう)を提供する発明である。
TPは、スピロヘータの一種で、TP抗原タンパク質として複数のタンパク質が報告されており(The Journal of Immunology, Vol.129, p.833-838, 1982; The Journal of Immunology, Vol.129, p.1287-1291, 1982; Journal of Clinical Microbiology, Vol.21, p.82-87, 1985; Journal of Clinical Microbiology, Vol.30, p.115-122, 1992)、TP表面抗原タンパク質として、分子量が47kdのTpN47;15kdのTpN15;17kdのTpN17が、代表的なTP表面抗原タンパク質として知られており、その遺伝子の塩基配列ならびにアミノ酸配列も決定されている(Microbiological. Reviews, Vol.57,p.750-779; Infection and Immunity, Vol.61, p.1202-1210, 1993; Journal of Bacteriology, Vol.162, p.1227-1237, 1992; Infection and Immunity, Vol.57, p.3708-3714, 1989)。
<遺伝子のクローンニング>
遺伝子組換え大腸菌を用いて得られた、遺伝子組換えTpN47抗原、及び、遺伝子組換えTpN15-TpN17融合抗原は既に知られており(特許文献1等)、その生産は遺伝子工学における常法によって行うことができる。すなわち、目的とするTpN47遺伝子ないしTpN15-TpN17融合遺伝子をクローニングし、得られたTp抗原をコードするDNA配列をベクターに組み込んだ後、該ベクターを宿主である大腸菌に導入する。そして、該ベクターが導入されて形質転換がなされた大腸菌を培養して、該ベクターのTp抗原をコードするDNA配列の発現を行うことにより、所望する上記2種類のTP抗原を大量に得ることが可能である。さらに、これらの大腸菌由来の遺伝子組換えTP抗原は、市販もなされている。しかしながら、上記したように、カイコ由来の遺伝子組換えTP抗原については、本発明者の知る限り、非公知である。
47Kプライマー1:
5’末端 GATCC GGATCC GGCTCGTCTCATCATGAG(配列番号1)、
47Kプライマー2:
3’末端 TAGCC GCGGCCGC CTA AGACACACGGGATAGGAC(配列番号2)、
が例示される。これらを用いて、TpN47遺伝子のクローニングを行うことができる。
17Kプライマー1:
5’末端 GATCC GGATCC TGTGTCTCGTGCACAACC(配列番号3)、
17Kプライマー2:
3’末端 TAGCCGCGGCCGCCTATTTCTTTGTTTTTTTGAGCAC(配列番号4)、
が例示される。これらを用いて、TpN17遺伝子のクローニングを行うことができる。
15Kプライマー1:
5’末端 GATCC GGATCCTGTTCATTTAGTTCTATC(配列番号5)
15Kプライマー2:
3’末端 TAGCC GCGGCCGCCTACCTGCTAATAATGGCTT(配列番号6)
が例示される。これらを用いて、TpN15遺伝子のクローニングを行うことができる。
第1に、15Kフラグメント1用プライマーとして、配列番号5と下記配列番号7の増幅用プライマーのペア:
配列番号5の5’末端の15Kプライマー1と、
17K-5’末端+15K-3’末端プライマーとして、
TGTGCACGAGACACACCTGCTAATAATGGCTTCCT(配列番号7)
を準備し、上記で得たTpN15遺伝子を鋳型にしたPCR反応を行って、15K接続フラグメントのクローニングを行い;
第2に、17Kフラグメント2用プライマーとして、下記配列番号8と配列番号4の増幅用プライマーのペア:
5’末端 TGTGTCTCGTGCACAACCGT(配列番号8)と、
配列番号4の3’末端の17Kプライマー2
を準備し、上記で得たTpN17遺伝子を鋳型にしたPCR反応を行って、17K接続フラグメントのクローニングを行い;
第3に、15K-17K増幅用プライマーとして、上記配列番号4と配列番号5の増幅用プライマーのペアを準備して、上記第1、第2で得た15K接続フラグメントと17K接続フラグメントを鋳型としたPCR反応を行う;
ことにより、所望のTpN15-TpN17融合遺伝子のクローニングを行うことができる。
遺伝子組換えカイコは、カイコをTP抗原遺伝子で形質転換することにより得ることができる。カイコ(Bombyx mori)は、約5千年ともいわれる養蚕の歴史の中で、野生種のクワコ(Bombys mandarina)から飼い慣らされた種であり、品種改良が続けられた家畜昆虫である。カイコでは、形質転換法が既に提供されており、さらに全ゲノム情報も明らかにされている(Goldsmith,M.R. et al.,Annu.Rev.Entomol.,50:71-100,2005)。
上記の通り、本発明のTP抗原混合物は、47-抗原と15-17抗原の混合物である。47-抗原と15-17抗原の混合比は、47-抗原:15-17抗原(質量比)が、4:6-6:4であることが好適である。本発明のTP混合物は、水性溶媒中に溶解した状態の水性組成物の形態であってもよいし、凍結乾燥品等であってもよいし、固相に固定化された状態であってもよい。水性組成物における、本発明のTP抗原混合物の濃度は、該混合物の使用目的に応じて自由に設定可能である。
本発明の測定方法に供される体液検体は、梅毒罹患により、抗TP抗体が含まれ得る体液の検体であれば限定されない。例えば、血液検体、唾液検体、尿検体等が例示される。これらの中でも、特に血液検体が好適である。血液検体としては、全血検体、血清検体、血漿検体等が挙げられ、血清検体又は血漿検体がさらに好適である。必要に応じて抗凝固剤等の添加や、TP Reiter株の培養液加熱上清で非特異抗体の吸収処理を行って得られる血清も許容される。また、適宜生理食塩水や緩衝液による希釈も行われる。
本発明の測定方法において行われる免疫学的測定方法は、体液検体中の抗TP抗体と、本発明のTP抗原混合物の間の抗原抗体反応によって、該体液検体中の抗TP抗体を測定できる手段であれば限定されない。その限りにおいて、酵素免疫測定法、免疫比濁法、放射性免疫測定法、ラテックス凝集法若しくは比濁法(以下、ラテックス凝集法・比濁法と記載する)、血球若しくは粒子凝集法(以下、血球・粒子凝集法と記載する)、イムノクロマトグラフィー法等を用いることができる。
該固相化領域と体液検体との接触により形成され、水相により媒介される毛細管現象により連続相中を移動する、上記抗原の混合物と体液検体中の抗TP抗体の複合体を検出する領域が、上記固相化領域の下流に設けられている、
梅毒トレポネーマ測定用イムノクロマトデバイス(以下、本発明のデバイスともいう)を提供する。
本発明の測定方法は、例えば、本発明のTP抗原混合物、と体液検体を接触させ、該体液検体中の抗TP抗体を、上記TP抗原混合物との結合をシグナルとして測定し、該シグナルを検体提供者の梅毒罹患のデータとして取得するデータの取得方法、とも表現され得るものである。
リムコ株式会社(沖縄県うるま市)からオンデマンド注文を行って購入した、47組換えカイコと、15-17組換えカイコが、それぞれ産生した100個ほどの繭を用いて、カイコ遺伝子組換えTP抗原の抽出と精製を行った。これらの繭は、ハサミで5mmほどの大きさに切断し、PBS-1%Tritonx-100に浸潤し、一昼夜4℃下でスターラー攪拌した。次に、ろ紙(ワットマン社)で不溶物を濾別し、抽出液を得た。抽出液は遠心濃縮器(サルトリウス社 ビバスピン20)にて濃縮し、Sephacryl S-200HR XK50/60(GE社)カラム、トリス塩酸緩衝液にてゲルろ過した。抗原分画は遠心濃縮器で濃縮し、精製組換え抗原とした。表1に精製結果を示した。
96ウェルELISAプレート(BECTON DICKINSON社)の各ウェルに、ネイティブ抗原、及び、組換えカイコ抗原(TpN47,TpN15-17)それぞれを、10mMリン酸緩衝液で希釈し、5μg/mLの濃度で100μL/ウェルで分注し、一晩4℃に放置することにより各ウェル壁を感作した。感作後、1%ウシ血清アルブミンを含む10mMリン酸緩衝液で37℃2時間ブロッキング後、洗浄、乾燥し、各抗原の感作ELISAプレートとした。
(1)テストデバイスの作製
図1に示すイムノクロマトデバイスを作製した。
本試験は、ヒト血清を体液検体として用いた。また、上記複合体のメンブレン移動用の展開液は用いていない。抗TP抗体の濃度が18.75mIU/mLの血清を、抗TP抗体陰性の健常人血清で2倍希釈系列を作製した。この希釈血清をセロディアTPPA(富士レビオ)と、上記のように赤色ラテックスビーズに感作させた組換えカイコ抗原を用いた、上記のテストデバイス(本品)で測定した。セロディアTPPAは添付文書の処方に従い、また、本品は血清100μLを、コンジュゲートパッドに滴下し、メンブレンに展開し、15分後に赤色ラインの出現の有無で陰陽を判定した。結果を表3に示す。表3において、「+」は陽性、「-」は陰性、「±」は判定保留を示している。
上述したように、梅毒は潜伏性を伴うので、検査試薬の性能を実用レベルで確かめるためには経時的な効果の検討が必要であり、セロコンバージョンパネルによる試験が適合する。TP感染後、体液抗体の産生は一度に起こるのではなく、少量から徐々に増加する。従って、感度の高い試薬は、より少量の体液抗体から測定できるので、TP感染後、より早い段階から、TP感染の診断に寄与することが可能となる。かかる観点からの試薬の性能を、セロコンバージョンパネルを用いることにより検討することが可能である。これは言い換えれば、実用レベルの試薬性能の検討と位置付けられる。
96ウェルELISAプレート(BECTON DICKINSON社)の各ウェルに、ネイティブ抗原(常盤化学)、及び、上記実施例1(1)にて調製したカイコ由来の組換抗原(TpN47,TpN15-17)の混合物(TP抗原混合物)原液、それぞれを10mMリン酸緩衝液で希釈し、5μg/mLの濃度で、100μL/ウェルで分注し一晩4℃に放置することにより感作した。感作後1%ウシ血清アルブミンを含む10mMリン酸緩衝液で、37℃2時間ブロッキング後、洗浄、乾燥し、各抗原の感作ELISAプレートとした。
2:移動相
21:発色エリア
3:検体滴下・反応相
10:イムノクロマトデバイス
41:感作粒子
42:複合体担持粒子
43,502:サンドイッチ複合体
50:TP抗原混合物
501:固相定着TP混合物-抗TP抗体の複合体
51:抗TP抗体
52:15-17抗原
53:47抗原
54:第2抗体
55:標識顕在化試薬
56:シグナル
61:粒子
62:固相
Claims (5)
- 梅毒トレポネーマ菌の人工表面抗原である、TpN47遺伝子で形質転換がなされた遺伝子組換えカイコの繭糸又は絹糸腺に由来する遺伝子組換えTpN47抗原、及び、同TpN15遺伝子とTpN17遺伝子の融合遺伝子で形質転換がなされた遺伝子組換えカイコの繭糸又は絹糸腺に由来する遺伝子組換えTpN15-TpN17融合抗原、の混合物を、血清検体と接触させて、該血清検体中の抗梅毒トレポネーマ抗体を、上記抗原の混合物との結合シグナルとして免疫学的測定方法により測定する、血清抗体の測定方法。
- 免疫学的測定方法は、酵素免疫測定法、免疫比濁法、放射性免疫測定法、ラテックス凝集若しくは比濁法、血球若しくは粒子凝集法、又は、イムノクロマトグラフィー法である、請求項1に記載の測定方法。
- 前記遺伝子組換えTpN47抗原、及び、遺伝子組換えTPN15-TPN17融合抗原の混合物の、固相における定着物が用いられる、請求項1又は2に記載の測定方法。
- 梅毒トレポネーマ菌の人工表面抗原である、TpN47遺伝子で形質転換がなされた遺伝子組換えカイコの繭糸又は絹糸腺に由来する遺伝子組換えTpN47抗原、及び、同TpN15遺伝子とTpN17遺伝子の融合遺伝子で形質転換がなされた遺伝子組換えカイコの繭糸又は絹糸腺に由来する遺伝子組換えTpN15-TpN17融合抗原、の混合物が固相において定着している、血清検体中の抗梅毒トレポネーマ抗体の測定に用いる、抗原が定着した固相。
- 梅毒トレポネーマ菌の人工表面抗原である、TpN47遺伝子で形質転換がなされた遺伝子組換えカイコの繭糸又は絹糸腺に由来する遺伝子組換えTpN47抗原、及び、同TpN15遺伝子とTpN17遺伝子の融合遺伝子で形質転換がなされた遺伝子組換えカイコの繭糸又は絹糸腺に由来する遺伝子組換えTpN15-TpN17融合抗原、の混合物、の固相化領域が設けられており、
該固相化領域と血清検体との接触により形成され、水相により媒介される毛細管現象により連続相中を移動する、上記抗原の混合物と血清検体中の抗梅毒トレポネーマ抗体の複合体を検出する領域が、上記固相化領域の下流に設けられている、
梅毒トレポネーマ測定用イムノクロマトデバイス。
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