JP3536635B2 - 融合ｄｎａ及び該融合ｄｎａを用いて梅毒トレポネマ抗原を発現する方法 - Google Patents
融合ｄｎａ及び該融合ｄｎａを用いて梅毒トレポネマ抗原を発現する方法Info
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、融合ＤＮＡ及び該
融合ＤＮＡを用いて梅毒トレポネマ抗原を発現する方法
に関する。
融合ＤＮＡを用いて梅毒トレポネマ抗原を発現する方法
に関する。
【０００２】本発明の融合ＤＮＡは、シグナルペプチド
の付加した梅毒トレポネマの表面抗原をコードするＤＮ
Ａ断片及びＳｅｃＡ等の分泌関連酵素をコードするＤＮ
Ａ断片が融合されたものである。また、本発明の梅毒ト
レポネマ抗原を発現する方法は、前記した本は発明の融
合ＤＮＡを用いて発現を行うものであり、これにより脂
質の結合をした梅毒トレポネマの表面抗原であって、免
疫測定において反応性が高い抗原を大量かつ用意に取得
することができる。
の付加した梅毒トレポネマの表面抗原をコードするＤＮ
Ａ断片及びＳｅｃＡ等の分泌関連酵素をコードするＤＮ
Ａ断片が融合されたものである。また、本発明の梅毒ト
レポネマ抗原を発現する方法は、前記した本は発明の融
合ＤＮＡを用いて発現を行うものであり、これにより脂
質の結合をした梅毒トレポネマの表面抗原であって、免
疫測定において反応性が高い抗原を大量かつ用意に取得
することができる。
【０００３】
【従来の技術】梅毒は、梅毒トレポネマ（トレポネマ・
パリダム Treponema pallidum 、以下Ｔｐと称する。）
により引き起こされる感染症である。Ｔｐはスピロヘー
タの一種で、Ｔｐ抗原としてその細胞表面上に数種の表
面抗原が存在することが確認されており、主なものとし
て分子量１５ｋＤａ、１７ｋＤａ、４２ｋＤａ、４７ｋ
Ｄａ等の抗原が知られている（The Journal of Immunol
ogy, Vol.129, p.833-838, 1982; The Journal of Immu
nology, Vol.129, p.1287-1291, 1982; Journalof Clin
ical Microbiology, Vol.21, p.82-87, 1985; Journal
of Clinical Microbiology, Vol.30, p.115-122, 1992)
。
パリダム Treponema pallidum 、以下Ｔｐと称する。）
により引き起こされる感染症である。Ｔｐはスピロヘー
タの一種で、Ｔｐ抗原としてその細胞表面上に数種の表
面抗原が存在することが確認されており、主なものとし
て分子量１５ｋＤａ、１７ｋＤａ、４２ｋＤａ、４７ｋ
Ｄａ等の抗原が知られている（The Journal of Immunol
ogy, Vol.129, p.833-838, 1982; The Journal of Immu
nology, Vol.129, p.1287-1291, 1982; Journalof Clin
ical Microbiology, Vol.21, p.82-87, 1985; Journal
of Clinical Microbiology, Vol.30, p.115-122, 1992)
。
【０００４】これらの抗原はノリス等によって各々Ｔｐ
Ｎ１５、ＴｐＮ１７、ＴｐＮ４４．５（ａ）、ＴｐＮ４
７と命名されている（Microbiological. Reviews, Vol.
57,p.750-779 ）（以下、ＴｐＮ４７を４７Ｋ、ＴｐＮ
１７を１７Ｋ、ＴｐＮ１５を１５Ｋと称する。）。これ
らの表面抗原をコードする遺伝子は既にクローニングさ
れており、遺伝子工学的に抗原が生産されている。ま
た、これらのアミノ酸配列も決定されている（Molecula
r Microbiology, Vol.4, p.1371-1379, 1990; Infectio
n and Immunity, Vol.61, p.1202-1210, 1993; Journal
of Bacteriology, Vol.162, p.1227-1237, 1992; Infe
ction and Immunity, Vol.57, p.3708-3714, 1989)。
Ｎ１５、ＴｐＮ１７、ＴｐＮ４４．５（ａ）、ＴｐＮ４
７と命名されている（Microbiological. Reviews, Vol.
57,p.750-779 ）（以下、ＴｐＮ４７を４７Ｋ、ＴｐＮ
１７を１７Ｋ、ＴｐＮ１５を１５Ｋと称する。）。これ
らの表面抗原をコードする遺伝子は既にクローニングさ
れており、遺伝子工学的に抗原が生産されている。ま
た、これらのアミノ酸配列も決定されている（Molecula
r Microbiology, Vol.4, p.1371-1379, 1990; Infectio
n and Immunity, Vol.61, p.1202-1210, 1993; Journal
of Bacteriology, Vol.162, p.1227-1237, 1992; Infe
ction and Immunity, Vol.57, p.3708-3714, 1989)。
【０００５】Ｔｐに感染すると、これらの抗原に対する
抗体が血液中に産生されるため、梅毒に感染しているか
否かは血液中の抗Ｔｐ抗体の有無を検査することによっ
て行われる。
抗体が血液中に産生されるため、梅毒に感染しているか
否かは血液中の抗Ｔｐ抗体の有無を検査することによっ
て行われる。
【０００６】抗Ｔｐ抗体の有無を調べるには、Ｔｐ抗原
と患者血液中の抗Ｔｐ抗体との抗原抗体反応を利用した
免疫測定方法を用いるのが一般的である。抗Ｔｐ抗体の
免疫測定を行うためには大量の抗Ｔｐ抗原が必要となる
が、近年、遺伝子工学技術の進歩により、Ｔｐ抗原をク
ローニングして人工的にＴｐ抗原を取得すること及びＴ
ｐ抗原の大量生産を行うことが可能となってきた（Scie
nce, Vol.216, p.522-523, 1982; Infection and Immun
ity, Vol.36, p.1238-1241, 1982; Infectionand Immun
ity, Vol.41, p.709-721, 1983;Infection and Immunit
y, Vol.42, p.435-445, 1983; Infection and Immunit
y, Vol.42, p.187-196, 1983; Journalof Bacteriolog
y, Vol.162, p.1227-1237, 1985; Infection and Immun
ity, Vol.54, p.500-506, 1986; Infection and Immuni
ty, Vol.56, p.71-78, 1988; Infection and Immunity,
Vol.57, p.2612-2623, 1989; Infection and Immunit
y,Vol.57, p.3708-3714, 1989;Molecular Microbiolog
y, Vol.4, p.1371-1379, 1990; Infection and Immunit
y, Vol.58, p.1697-1704, 1990; Infection and Immuni
ty, Vol.61, p.1202-1210, 1993; 特表平２−５００４
０３号）。
と患者血液中の抗Ｔｐ抗体との抗原抗体反応を利用した
免疫測定方法を用いるのが一般的である。抗Ｔｐ抗体の
免疫測定を行うためには大量の抗Ｔｐ抗原が必要となる
が、近年、遺伝子工学技術の進歩により、Ｔｐ抗原をク
ローニングして人工的にＴｐ抗原を取得すること及びＴ
ｐ抗原の大量生産を行うことが可能となってきた（Scie
nce, Vol.216, p.522-523, 1982; Infection and Immun
ity, Vol.36, p.1238-1241, 1982; Infectionand Immun
ity, Vol.41, p.709-721, 1983;Infection and Immunit
y, Vol.42, p.435-445, 1983; Infection and Immunit
y, Vol.42, p.187-196, 1983; Journalof Bacteriolog
y, Vol.162, p.1227-1237, 1985; Infection and Immun
ity, Vol.54, p.500-506, 1986; Infection and Immuni
ty, Vol.56, p.71-78, 1988; Infection and Immunity,
Vol.57, p.2612-2623, 1989; Infection and Immunit
y,Vol.57, p.3708-3714, 1989;Molecular Microbiolog
y, Vol.4, p.1371-1379, 1990; Infection and Immunit
y, Vol.58, p.1697-1704, 1990; Infection and Immuni
ty, Vol.61, p.1202-1210, 1993; 特表平２−５００４
０３号）。
【０００７】該Ｔｐ抗原を生産する方法は、遺伝子工学
における通常の方法によって行うことができる。つま
り、まず目的とするＤＮＡ配列をクローニングし、得ら
れたＴｐ抗原をコードするＤＮＡ配列をベクターに組み
込んだ後、該ベクターを宿主細胞に導入する。そして、
ベクターが導入された宿主細胞を培養し、発現を行うこ
とにより大量のＴｐ抗原を得ていた。また、固有のシグ
ナルペプチドをＮ末端に有するＴｐ抗原をコードするＤ
ＮＡ配列を使用すると、宿主細胞が持っている分泌関連
酵素の働きによって、前記Ｔｐ抗原とは異なり脂質が結
合しているＴｐ抗原も少なからず生産されていた。
における通常の方法によって行うことができる。つま
り、まず目的とするＤＮＡ配列をクローニングし、得ら
れたＴｐ抗原をコードするＤＮＡ配列をベクターに組み
込んだ後、該ベクターを宿主細胞に導入する。そして、
ベクターが導入された宿主細胞を培養し、発現を行うこ
とにより大量のＴｐ抗原を得ていた。また、固有のシグ
ナルペプチドをＮ末端に有するＴｐ抗原をコードするＤ
ＮＡ配列を使用すると、宿主細胞が持っている分泌関連
酵素の働きによって、前記Ｔｐ抗原とは異なり脂質が結
合しているＴｐ抗原も少なからず生産されていた。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、前記し
た大量に得られたＴｐ抗原は菌体から得られた天然の抗
原と比べると反応性が低く、脂質が結合しているＴｐ抗
原は反応性は高いが少量しか得られず、産業上利用する
には十分でなかった。また、現在、梅毒は抗生物質によ
り十分治療可能となっており、その感染を正確に診断
し、早期に治療を行うことが望まれている。そのため、
より高い感度と特異性をもって測定できる方法が求めら
れていた。従って、本発明の目的は、従来よりも高い感
度と特異性を示す脂質の結合したＴｐ抗原を得るために
用いることができる融合ＤＮＡ配列及び該ＤＮＡ配列を
用いることによる脂質の結合したＴｐ抗原を大量に発現
する方法を提供することである。
た大量に得られたＴｐ抗原は菌体から得られた天然の抗
原と比べると反応性が低く、脂質が結合しているＴｐ抗
原は反応性は高いが少量しか得られず、産業上利用する
には十分でなかった。また、現在、梅毒は抗生物質によ
り十分治療可能となっており、その感染を正確に診断
し、早期に治療を行うことが望まれている。そのため、
より高い感度と特異性をもって測定できる方法が求めら
れていた。従って、本発明の目的は、従来よりも高い感
度と特異性を示す脂質の結合したＴｐ抗原を得るために
用いることができる融合ＤＮＡ配列及び該ＤＮＡ配列を
用いることによる脂質の結合したＴｐ抗原を大量に発現
する方法を提供することである。
【０００９】本発明者らは鋭意検討した結果、遺伝子工
学技術を用いて、シグナルペプチドが付加した梅毒トレ
ポネマ抗原をコードするＤＮＡ断片及びＳｅｃＡ等の分
泌関連酵素をコードするＤＮＡ断片を組み合わせた融合
ＤＮＡを用いて発現を行い、それぞれの蛋白質を同時に
発現させることによって、脂質の結合した免疫的に反応
性の高いＴｐ抗原を効率良く得る方法を見出し、本発明
を完成するに至った。
学技術を用いて、シグナルペプチドが付加した梅毒トレ
ポネマ抗原をコードするＤＮＡ断片及びＳｅｃＡ等の分
泌関連酵素をコードするＤＮＡ断片を組み合わせた融合
ＤＮＡを用いて発現を行い、それぞれの蛋白質を同時に
発現させることによって、脂質の結合した免疫的に反応
性の高いＴｐ抗原を効率良く得る方法を見出し、本発明
を完成するに至った。
【００１０】以下、本発明を詳細に説明する。すなわ
ち、本発明は前記したようにシグナルペプチドが付加し
たＴｐ抗原をコードするＤＮＡ断片（以下、シグナル−
Ｔｐ抗原ＤＮＡ断片と称する。）及びＳｅｃＡ等の分泌
関連酵素をコードするＤＮＡ断片（以下、分泌酵素ＤＮ
Ａ断片と称する）。を融合した融合DNA （以下、Tp融合D
NA と称する場合もある。）である。
ち、本発明は前記したようにシグナルペプチドが付加し
たＴｐ抗原をコードするＤＮＡ断片（以下、シグナル−
Ｔｐ抗原ＤＮＡ断片と称する。）及びＳｅｃＡ等の分泌
関連酵素をコードするＤＮＡ断片（以下、分泌酵素ＤＮ
Ａ断片と称する）。を融合した融合DNA （以下、Tp融合D
NA と称する場合もある。）である。
【００１１】本発明のシグナル−Ｔｐ抗原ＤＮＡ断片及
び分泌酵素ＤＮＡ断片を融合したＴｐ融合ＤＮＡにおい
て、シグナルペプチドをコードするＤＮＡ断片はＴｐ抗
原をコードするＤＮＡ断片に結合していることが必須で
あるため、該Ｔｐ融合ＤＮＡを得るにあたっては、最初
にシグナル−Ｔｐ抗原ＤＮＡ断片を得ることが好まし
い。該シグナル−Ｔｐ抗原ＤＮＡ断片は発現する蛋白質
のＮ末端側からＣ末端側へシグナルペプチド、Ｔｐ抗原
の順に発現するように、それぞれをコードするＤＮＡ断
片が並んでいるものである。
び分泌酵素ＤＮＡ断片を融合したＴｐ融合ＤＮＡにおい
て、シグナルペプチドをコードするＤＮＡ断片はＴｐ抗
原をコードするＤＮＡ断片に結合していることが必須で
あるため、該Ｔｐ融合ＤＮＡを得るにあたっては、最初
にシグナル−Ｔｐ抗原ＤＮＡ断片を得ることが好まし
い。該シグナル−Ｔｐ抗原ＤＮＡ断片は発現する蛋白質
のＮ末端側からＣ末端側へシグナルペプチド、Ｔｐ抗原
の順に発現するように、それぞれをコードするＤＮＡ断
片が並んでいるものである。
【００１２】該融合ＤＮＡを得る方法としては、ＰＣＲ
法、リコンビナントＰＣＲ法、ライゲーション法、リン
カーライゲーション法を挙げることができる。
法、リコンビナントＰＣＲ法、ライゲーション法、リン
カーライゲーション法を挙げることができる。
【００１３】例えば、ＰＣＲ法を用いる場合は、天然の
ＴｐのＤＮＡ断片中のシグナル−Ｔｐ抗原ＤＮＡ断片
を、プライマーを用いてシグナル−Ｔｐ抗原ＤＮＡ断片
だけを増幅させることによってシグナル−Ｔｐ抗原ＤＮ
Ａ断片を得ることができる。
ＴｐのＤＮＡ断片中のシグナル−Ｔｐ抗原ＤＮＡ断片
を、プライマーを用いてシグナル−Ｔｐ抗原ＤＮＡ断片
だけを増幅させることによってシグナル−Ｔｐ抗原ＤＮ
Ａ断片を得ることができる。
【００１４】また、リコンビナントＰＣＲ法を用いる場
合は、シグナルＤＮＡ断片及びＴｐ抗原ＤＮＡ断片をそ
れぞれ別に取得し、一方のＤＮＡ断片のうち、他方を結
合させたい側にその他方のＤＮＡ断片に相補的な配列を
合成し、両者を混ぜてＰＣＲ法を行うことでシグナル−
Ｔｐ抗原ＤＮＡ断片を得ることができる。
合は、シグナルＤＮＡ断片及びＴｐ抗原ＤＮＡ断片をそ
れぞれ別に取得し、一方のＤＮＡ断片のうち、他方を結
合させたい側にその他方のＤＮＡ断片に相補的な配列を
合成し、両者を混ぜてＰＣＲ法を行うことでシグナル−
Ｔｐ抗原ＤＮＡ断片を得ることができる。
【００１５】さらに、化学的にＤＮＡ断片を合成するこ
とによりシグナル−Ｔｐ抗原ＤＮＡ断片を得ることもで
きる。
とによりシグナル−Ｔｐ抗原ＤＮＡ断片を得ることもで
きる。
【００１６】次に、得られたシグナル−Ｔｐ抗原ＤＮＡ
断片と分泌酵素ＤＮＡ断片とが融合したＴｐ融合ＤＮＡ
（この場合、分泌酵素をコードするＤＮＡ断片はシグナ
ル−Ｔｐ抗原ＤＮＡ断片の５’末端側、３’末端側のど
ちらでもよく、また分泌酵素が複数である場合は両側に
結合されていてもよいものである。）を得る方法は、前
記したリコンビナントＰＣＲ法、ライゲーション法、リ
ンカーライゲーション法等を用いて同様の操作により行
うことができる。また、Ｔｐ融合ＤＮＡは前記した化学
的にＤＮＡを合成することにより得ることもできる。
断片と分泌酵素ＤＮＡ断片とが融合したＴｐ融合ＤＮＡ
（この場合、分泌酵素をコードするＤＮＡ断片はシグナ
ル−Ｔｐ抗原ＤＮＡ断片の５’末端側、３’末端側のど
ちらでもよく、また分泌酵素が複数である場合は両側に
結合されていてもよいものである。）を得る方法は、前
記したリコンビナントＰＣＲ法、ライゲーション法、リ
ンカーライゲーション法等を用いて同様の操作により行
うことができる。また、Ｔｐ融合ＤＮＡは前記した化学
的にＤＮＡを合成することにより得ることもできる。
【００１７】さらに、シグナル−Ｔｐ抗原ＤＮＡ断片と
分泌酵素ＤＮＡ断片とが融合したＴｐ融合ＤＮＡを得る
別の方法としては、それぞれをコードするＤＮＡ断片を
制限酵素によりベクターに順次導入していき、任意の順
に並んだＴｐ融合ＤＮＡを得ることもできる。
分泌酵素ＤＮＡ断片とが融合したＴｐ融合ＤＮＡを得る
別の方法としては、それぞれをコードするＤＮＡ断片を
制限酵素によりベクターに順次導入していき、任意の順
に並んだＴｐ融合ＤＮＡを得ることもできる。
【００１８】本発明のＴｐ抗原の発現方法は、前記のよ
うに得られたＴｐ融合ＤＮＡを通常用いられる方法によ
り行うことができる。例えば、前記融合ＤＮＡをライゲ
ーション法等によりベクターに組み込み、得られたベク
ターを宿主細胞へ導入し、次に宿主細胞を培養、発現を
誘導することで蛋白質を合成することができる。
うに得られたＴｐ融合ＤＮＡを通常用いられる方法によ
り行うことができる。例えば、前記融合ＤＮＡをライゲ
ーション法等によりベクターに組み込み、得られたベク
ターを宿主細胞へ導入し、次に宿主細胞を培養、発現を
誘導することで蛋白質を合成することができる。
【００１９】この発現を行うことにより、シグナルペプ
チドが付加したＴｐ抗原（以下、シグナル−Ｔｐ抗原と
称する。）及び分泌関連酵素（以下、分泌酵素と称す
る。）がリボソーム上で合成される。合成されたシグナ
ル−Ｔｐ抗原は、同時に合成された分泌酵素の働きによ
って効率良く膜上へ運ばれ、膜を通過する。その後宿主
細胞の膜上でＴｐ抗原への脂質の付加及びシグナルペプ
チドの切断が行われ、脂質が結合したＴｐ抗原を得るこ
とができる。
チドが付加したＴｐ抗原（以下、シグナル−Ｔｐ抗原と
称する。）及び分泌関連酵素（以下、分泌酵素と称す
る。）がリボソーム上で合成される。合成されたシグナ
ル−Ｔｐ抗原は、同時に合成された分泌酵素の働きによ
って効率良く膜上へ運ばれ、膜を通過する。その後宿主
細胞の膜上でＴｐ抗原への脂質の付加及びシグナルペプ
チドの切断が行われ、脂質が結合したＴｐ抗原を得るこ
とができる。
【００２０】シグナルペプチドは前記発現方法におい
て、蛋白の細胞膜透過に必須のペプチドであって、１５
〜３０のアミノ酸残基からなる。そのＮ末端付近には塩
基性アミノ酸残基による正電荷が存在し、その正電荷数
が増加するほど膜透過の速度が上昇する（J. Biol. Che
m., Vol.265, 2873-2880, 1990; J. Biol. Chem., Vol.
267, 4882-4888, 1992; J. Biol. Chem., Vol.267, 123
75-12379, 1992）。また、シグナルペプチドの中央部に
は疎水性アミノ酸残基に富んだ広い疎水領域が存在し、
その疎水性度が増加すると、膜透過の効率が上昇する
（J. Bioenerg. Biomember., Vol.22, 233-169, 1991;
J. Biol. Chem., Vol.265, 4358-4363, 1990）。よっ
て、膜透過開始効率を上げるためには、Ｎ末端の正電荷
数及び疎水性度が重要な要因であり、正電荷数が多く疎
水性度が高いことが好ましい。
て、蛋白の細胞膜透過に必須のペプチドであって、１５
〜３０のアミノ酸残基からなる。そのＮ末端付近には塩
基性アミノ酸残基による正電荷が存在し、その正電荷数
が増加するほど膜透過の速度が上昇する（J. Biol. Che
m., Vol.265, 2873-2880, 1990; J. Biol. Chem., Vol.
267, 4882-4888, 1992; J. Biol. Chem., Vol.267, 123
75-12379, 1992）。また、シグナルペプチドの中央部に
は疎水性アミノ酸残基に富んだ広い疎水領域が存在し、
その疎水性度が増加すると、膜透過の効率が上昇する
（J. Bioenerg. Biomember., Vol.22, 233-169, 1991;
J. Biol. Chem., Vol.265, 4358-4363, 1990）。よっ
て、膜透過開始効率を上げるためには、Ｎ末端の正電荷
数及び疎水性度が重要な要因であり、正電荷数が多く疎
水性度が高いことが好ましい。
【００２１】脂質を結合させるには、シグナルペプチド
のＣ末端側の４個のアミノ酸はＬｅｕ−Ｘ−Ｙ−Ｃｙｓ
の配列であることがその効率の点で好ましい（Microbia
l Pathogenesis, Vol.7, 175-188, 1989）。該アミノ酸
配列において、Ｘ及びＹは同一のアミノ酸でもよいし、
異なっていてもよく、その種類も特に制限されない。Ｔ
ｐ抗原からのシグナルペプチド切断の際には、前記アミ
ノ酸配列のＹとＣｙｓとの結合が切断されるものであ
る。
のＣ末端側の４個のアミノ酸はＬｅｕ−Ｘ−Ｙ−Ｃｙｓ
の配列であることがその効率の点で好ましい（Microbia
l Pathogenesis, Vol.7, 175-188, 1989）。該アミノ酸
配列において、Ｘ及びＹは同一のアミノ酸でもよいし、
異なっていてもよく、その種類も特に制限されない。Ｔ
ｐ抗原からのシグナルペプチド切断の際には、前記アミ
ノ酸配列のＹとＣｙｓとの結合が切断されるものであ
る。
【００２２】本発明における分泌に関する酵素は、脂質
が結合したＴｐ抗原の前駆体であるシグナルペプチドが
付加したＴｐ抗原を宿主細胞の膜上へ移動させる機能、
膜を通過させる機能等を発揮する個々の酵素である。
が結合したＴｐ抗原の前駆体であるシグナルペプチドが
付加したＴｐ抗原を宿主細胞の膜上へ移動させる機能、
膜を通過させる機能等を発揮する個々の酵素である。
【００２３】例えば、宿主細胞が大腸菌である場合に
は、分泌の酵素はＳｅｃＡ、ＳｅｃＢ、ＳｅｃＤ、Ｓｅ
ｃＥ、ＳｅｃＦ、ＳｅｃＧ、ＳｅｃＹ等のＳｅｃ酵素で
ある。この系においてＴｐ抗原を分泌させる際には、Ｓ
ｅｃＡ、ＳｅｃＥ、ＳｅｃＹの酵素を存在させることが
好ましく、膜透過速度を上昇させ、さらに分泌を促進さ
せるためには、これらの酵素にさらにＳｅｃＧを存在さ
せることがより好ましい。
は、分泌の酵素はＳｅｃＡ、ＳｅｃＢ、ＳｅｃＤ、Ｓｅ
ｃＥ、ＳｅｃＦ、ＳｅｃＧ、ＳｅｃＹ等のＳｅｃ酵素で
ある。この系においてＴｐ抗原を分泌させる際には、Ｓ
ｅｃＡ、ＳｅｃＥ、ＳｅｃＹの酵素を存在させることが
好ましく、膜透過速度を上昇させ、さらに分泌を促進さ
せるためには、これらの酵素にさらにＳｅｃＧを存在さ
せることがより好ましい。
【００２４】本発明におけるＴｐ融合ＤＮＡに用いられ
るシグナルペプチド、Ｔｐ抗原及び分泌関連酵素をコー
ドするＤＮＡ断片は、本明細書の配列表に記載のＤＮＡ
又は公知のＤＮＡの１又は数個のＤＮＡが欠失、置換又
は付加されたものであっても、発現する蛋白の働きが実
質的に同一のものであれば本発明に用いられるＤＮＡ断
片に含まれる。
るシグナルペプチド、Ｔｐ抗原及び分泌関連酵素をコー
ドするＤＮＡ断片は、本明細書の配列表に記載のＤＮＡ
又は公知のＤＮＡの１又は数個のＤＮＡが欠失、置換又
は付加されたものであっても、発現する蛋白の働きが実
質的に同一のものであれば本発明に用いられるＤＮＡ断
片に含まれる。
【００２５】
【実施例】以下、本発明を参考例及び実施例により更に
詳細に説明する。
詳細に説明する。
【００２６】（参考例１）梅毒菌（Treponema pallidu
m, Nicols strain ）を継代培養したウサギ睾丸より菌
をパーコール密度遠心により精製（Sex. Transm. Dis.,
Vol.11, p.275-286, 1984）し、再度遠心分離してその
沈殿を５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ８．５）、５ｍ
Ｍ ＥＤＴＡ、3 ％ＯＴＧ（ｎ−ｏｃｔｙｌ−β−Ｄ−
ｔｈｉｏｇｌｕｃｏｓｉｄｅ）に溶解し一晩梅毒抗原を
溶出した。遠心分離して、その上清をとり、スーパーデ
ックス２００にかけ１０ｍＭ リン酸（ｐＨ７．０）、
０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．５％ＯＴＧのバッファーを
流し分画した。４７Ｋを含む画分をハイドロキシアパタ
イトにかけ、１０ｍＭ リン酸（ｐＨ７．０）、０．３
％ＯＴＧのバッファーを流し分画した。パス画分を更に
２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＣｌでｐＨ９．７に調製しハイド
ロキシアパタイトにかけた。パス画分を回収し、濃縮後
以下の実験に使用した。また、ＤＮＡ断片の５’末には
シャイン−ダルガーノの配列及びシグナル配列をコード
する遺伝子を含まない梅毒抗原４７Ｋ（以下、４７Ｃ２
と称する。）をコードするＤＮＡ断片を作製した。この
配列は参考例５で作製する４７ＫをコードするＤＮＡ断
片とは前記の２つの配列を含まない点で異なるものであ
り、そのため脂質の付加が起こらずネイティブ型抗原ｎ
−４７Ｋは生じない。参考例３で作製する発現ベクター
ｐＷ６Ａにこの遺伝子を挿入した。このベクターをｐＷ
６Ａ−４７Ｃ２と命名する。ｐＷ６Ａ−４７Ｃ２を大腸
菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）に導入し菌体の培養を行った。
融合抗原１ｍＭ ＩＰＴＧ（Ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−１−
ｔｈｉｏ−β−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄ
ｅ）を添加して発現の誘導、菌体破砕、遠心操作後沈殿
として回収した。精製はＮｏｒｇａｒｄらの方法で（Ｉ
ＩＮＦＥＣＴＩＯＮ ＡＮＤ ＩＭＭＵＮＩＴＹ，Ａｐ
ｒ． １９９２， ｐｐ１５６８−１５７６）に準じて
調製しハイドロキシアパタイトで精製した。ネイティブ
４７ＫとＮ末に脂質を持たない組み換え抗原４７Ｃ２を
各０．２μｇづつアプライして１２．５％ポリアクリル
アミドゲルで還元ＳＤＳ電気泳動した。次に５００倍希
釈したヒトＴＰＰＡ陽性血清を一次抗体として用いてウ
ェスタンブロットを行った。結果を図１に示す。１１例
すべての血清で、ウサギ睾丸継代培養した梅毒菌から抽
出したネイティブ４７Ｋのほうが組み換え抗原４７Ｃ２
よりも反応性が良かった。
m, Nicols strain ）を継代培養したウサギ睾丸より菌
をパーコール密度遠心により精製（Sex. Transm. Dis.,
Vol.11, p.275-286, 1984）し、再度遠心分離してその
沈殿を５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ８．５）、５ｍ
Ｍ ＥＤＴＡ、3 ％ＯＴＧ（ｎ−ｏｃｔｙｌ−β−Ｄ−
ｔｈｉｏｇｌｕｃｏｓｉｄｅ）に溶解し一晩梅毒抗原を
溶出した。遠心分離して、その上清をとり、スーパーデ
ックス２００にかけ１０ｍＭ リン酸（ｐＨ７．０）、
０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．５％ＯＴＧのバッファーを
流し分画した。４７Ｋを含む画分をハイドロキシアパタ
イトにかけ、１０ｍＭ リン酸（ｐＨ７．０）、０．３
％ＯＴＧのバッファーを流し分画した。パス画分を更に
２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＣｌでｐＨ９．７に調製しハイド
ロキシアパタイトにかけた。パス画分を回収し、濃縮後
以下の実験に使用した。また、ＤＮＡ断片の５’末には
シャイン−ダルガーノの配列及びシグナル配列をコード
する遺伝子を含まない梅毒抗原４７Ｋ（以下、４７Ｃ２
と称する。）をコードするＤＮＡ断片を作製した。この
配列は参考例５で作製する４７ＫをコードするＤＮＡ断
片とは前記の２つの配列を含まない点で異なるものであ
り、そのため脂質の付加が起こらずネイティブ型抗原ｎ
−４７Ｋは生じない。参考例３で作製する発現ベクター
ｐＷ６Ａにこの遺伝子を挿入した。このベクターをｐＷ
６Ａ−４７Ｃ２と命名する。ｐＷ６Ａ−４７Ｃ２を大腸
菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）に導入し菌体の培養を行った。
融合抗原１ｍＭ ＩＰＴＧ（Ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−１−
ｔｈｉｏ−β−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄ
ｅ）を添加して発現の誘導、菌体破砕、遠心操作後沈殿
として回収した。精製はＮｏｒｇａｒｄらの方法で（Ｉ
ＩＮＦＥＣＴＩＯＮ ＡＮＤ ＩＭＭＵＮＩＴＹ，Ａｐ
ｒ． １９９２， ｐｐ１５６８−１５７６）に準じて
調製しハイドロキシアパタイトで精製した。ネイティブ
４７ＫとＮ末に脂質を持たない組み換え抗原４７Ｃ２を
各０．２μｇづつアプライして１２．５％ポリアクリル
アミドゲルで還元ＳＤＳ電気泳動した。次に５００倍希
釈したヒトＴＰＰＡ陽性血清を一次抗体として用いてウ
ェスタンブロットを行った。結果を図１に示す。１１例
すべての血清で、ウサギ睾丸継代培養した梅毒菌から抽
出したネイティブ４７Ｋのほうが組み換え抗原４７Ｃ２
よりも反応性が良かった。
【００２７】（参考例２） 抗４７Ｋモノクローナル抗
体、抗１７Ｋモノクローナル抗体の作製 Ｔｐの表面抗原として４７Ｋ及び１７ＫのＮ末端にＧＳ
Ｔを融合したＧＳＴ４７Ｋ及びＧＳＴ１７Ｋのそれぞれ
を大腸菌により発現させ精製した。得られた組換え体抗
原を免疫したマウスから採取した脾臓細胞とマウスミエ
ローマ細胞とを細胞融合させ、ハイブリドーマを作製し
た。ハイブリドーマを培養し、上記の組換え体抗原を用
いたＥＬＩＳＡ及びネイティブ抗原を用いたウェスタン
ブロットにより、組換え体抗原と反応し、かつネイティ
ブ抗原にも反応するハイブリドーマをスクリーニングし
た。スクリーニングしたハイブリドーマをクローニング
してセルラインを確立した。確立したクローンをマウス
腹腔内に注入し腹水を調製した後、その腹水を採取して
精製することにより抗４７Ｋモノクローナル抗体（以
下、４７ＫＭａｂと称する）、抗１７Ｋモノクローナル
抗体（以下、１７ＫＭａｂと称する）を得た。
体、抗１７Ｋモノクローナル抗体の作製 Ｔｐの表面抗原として４７Ｋ及び１７ＫのＮ末端にＧＳ
Ｔを融合したＧＳＴ４７Ｋ及びＧＳＴ１７Ｋのそれぞれ
を大腸菌により発現させ精製した。得られた組換え体抗
原を免疫したマウスから採取した脾臓細胞とマウスミエ
ローマ細胞とを細胞融合させ、ハイブリドーマを作製し
た。ハイブリドーマを培養し、上記の組換え体抗原を用
いたＥＬＩＳＡ及びネイティブ抗原を用いたウェスタン
ブロットにより、組換え体抗原と反応し、かつネイティ
ブ抗原にも反応するハイブリドーマをスクリーニングし
た。スクリーニングしたハイブリドーマをクローニング
してセルラインを確立した。確立したクローンをマウス
腹腔内に注入し腹水を調製した後、その腹水を採取して
精製することにより抗４７Ｋモノクローナル抗体（以
下、４７ＫＭａｂと称する）、抗１７Ｋモノクローナル
抗体（以下、１７ＫＭａｂと称する）を得た。
【００２８】（参考例３） 発現ベクターｐＷ６Ａの作
製 ファルマシア社製ベクターｐＧＥＸ２Ｔよりｔａｃプロ
モーターとＧＳＴをコードする塩基配列を除去し、プロ
メガ社製ｐＧＥＭＥＸ−１のＴ７プロモーターからｇｅ
ｎｅ１０、マルチクローニングサイト、Ｔ７トランスク
リプショナル・ターミネーターまでの塩基配列を挿入し
た。得られたベクターからｇｅｎｅ１０の塩基配列を除
去し、Ｔ７プロモーターの直後にＤＮＡ合成装置（アプ
ライドバイオシステム社製モデル３８１Ａ）にて合成し
たｌａｃオペレーターを挿入した。こうしてできた発現
ベクターをｐＷ６Ａと命名した。ｐＷ６Ａの詳細図を図
２に示す。
製 ファルマシア社製ベクターｐＧＥＸ２Ｔよりｔａｃプロ
モーターとＧＳＴをコードする塩基配列を除去し、プロ
メガ社製ｐＧＥＭＥＸ−１のＴ７プロモーターからｇｅ
ｎｅ１０、マルチクローニングサイト、Ｔ７トランスク
リプショナル・ターミネーターまでの塩基配列を挿入し
た。得られたベクターからｇｅｎｅ１０の塩基配列を除
去し、Ｔ７プロモーターの直後にＤＮＡ合成装置（アプ
ライドバイオシステム社製モデル３８１Ａ）にて合成し
たｌａｃオペレーターを挿入した。こうしてできた発現
ベクターをｐＷ６Ａと命名した。ｐＷ６Ａの詳細図を図
２に示す。
【００２９】（参考例４） 各種融合抗原発現用ベクタ
ー作製のためのプライマーの作製 以下の実施例１及び３で作製する各融合抗原を発現させ
るベクターを作製するために、下記のようなプライマー
をＤＮＡ合成装置（アプライドバイオシステム社製モデ
ル３８１Ａ）を用いて合成した。
ー作製のためのプライマーの作製 以下の実施例１及び３で作製する各融合抗原を発現させ
るベクターを作製するために、下記のようなプライマー
をＤＮＡ合成装置（アプライドバイオシステム社製モデ
ル３８１Ａ）を用いて合成した。
【００３０】
5' ------------------------------------3'
Nde I 47K-5'末端24塩基
プライマー１ GTGTA CATATG AAAGTGAAATACGCACTACTTTCT (35塩基)
【００３１】
BamHI 47K-3'末端側24塩基
プライマー２ GACACC GGATCC CTACTGGGCCACTACCTTCGCACG (36塩基)
（アンチセンス）
【００３２】
NdeI 17K-5'末端側22塩基
プライマー３ TCT CATATG AAAGGATCTGTCCGCGCGCTGT (31塩基)
【００３３】
BamHI 17K-3'末端24塩基
プライマー４ CAG GGATCC CTATTTCTTTGTTTTTTTGAGCAC (33塩基)
（アンチセンス）
【００３４】
BamHI SecA-5'末端側18塩基
プライマー５ TTT GGATCC CTCCGCAACGCGGGGCGT (27塩基)
【００３５】
XbaI SecA-3'末端22塩基
プライマー６ GT TCTAGA TTATTGCAGGCGGCCATGGCAC (30塩基)
（アンチセンス）
【００３６】
XbaI SecY-5'末端側21塩基
プライマー７ CG TCTAGA CTGGCGGTAAAATCGAGGAAT (29塩基)
【００３７】
NotI SecY-3'末端22塩基
プライマー８ GG GCGGCCGC TTATCGGCCGTAGCCTTTCAGG (32塩基)
（アンチセンス）
【００３８】
NotI SecE-5'末端側20塩基
プライマー９ GG GCGGCCGC TTTGTAGAAAACTTCTGACA (30塩基)
【００３９】
EcoT22I SecE-3'末端20塩基
プライマー１０ CA ATGCAT TCAGAACCTCAGGCCAGTGA (28塩基)
（アンチセンス）
【００４０】
BamHI SecG-5'末端側20塩基
プライマー１１ ATTGG GGATCC GCAACTCCGCAAGGAACAGG (31塩基)
【００４１】
SecG-3'末端21塩基
プライマー１２ TTAGTTCGGGATATCGCTGGT (21塩基)
（アンチセンス）
【００４２】
SecG-3'末端側15塩基 SecA-5' 末端側18塩基
プライマー１３ GATATCCCGAACTAA CTCCGCAACGCGGGGCGT (33塩基)
【００４３】
prlA4(SecY mutation)用塩基
プライマー１４ TGCTTATCATTGTTGTCGTGAT (22塩基)
【００４４】
prlA4(SecY mutation)用塩基
プライマー１５ CAATGATAAGCAGTGAGGTCCCACC (25塩基)
（アンチセンス）
【００４５】（参考例５） Ｔｐ４７Ｋ、１７Ｋ遺伝子
及び大腸菌分泌関連酵素ＳｅｃＧ、ＳｅｃＡ、ｐｒｌＡ
４（ＳｅｃＹ ｍｕｔａｎｔ）、ＳｅｃＥ遺伝子及びＳ
ｅｃＧ−ＳｅｃＡカセット遺伝子の調製 ａ）梅毒菌（Treponema pallidum, Nicols strain ）を
継代培養したウサギ睾丸より菌をパーコール密度遠心に
より精製（Sex. Transm. Dis., Vol.11, p.275-286, 19
84）し、ＳＤＳ−プロテナーゼＫ／フェノール・クロロ
ホルム法によりジェノミックＤＮＡを抽出した。
及び大腸菌分泌関連酵素ＳｅｃＧ、ＳｅｃＡ、ｐｒｌＡ
４（ＳｅｃＹ ｍｕｔａｎｔ）、ＳｅｃＥ遺伝子及びＳ
ｅｃＧ−ＳｅｃＡカセット遺伝子の調製 ａ）梅毒菌（Treponema pallidum, Nicols strain ）を
継代培養したウサギ睾丸より菌をパーコール密度遠心に
より精製（Sex. Transm. Dis., Vol.11, p.275-286, 19
84）し、ＳＤＳ−プロテナーゼＫ／フェノール・クロロ
ホルム法によりジェノミックＤＮＡを抽出した。
【００４６】ｂ）ポリメラーゼチェインリアクション
（ＰＣＲ）法により、センスプライマーとして参考例４
で作製したプライマー３を、またアンチセンスプライマ
ーとして参考例４で作製したプライマー４を選択し梅毒
菌ジェノミックＤＮＡを鋳型として、梅毒抗原１７Ｋ(I
nfection and Immunity,Vol.61, p.1202-1210, 1993 ）
をコードするＤＮＡ断片を作製した。このＤＮＡ断片の
５’末にはシャイン−ダルガーノの配列を含まない。塩
基配列を配列表１に示す。
（ＰＣＲ）法により、センスプライマーとして参考例４
で作製したプライマー３を、またアンチセンスプライマ
ーとして参考例４で作製したプライマー４を選択し梅毒
菌ジェノミックＤＮＡを鋳型として、梅毒抗原１７Ｋ(I
nfection and Immunity,Vol.61, p.1202-1210, 1993 ）
をコードするＤＮＡ断片を作製した。このＤＮＡ断片の
５’末にはシャイン−ダルガーノの配列を含まない。塩
基配列を配列表１に示す。
【００４７】ｃ）次にセンスプライマーとして参考例４
で作製したプライマー１を、アンチセンスプライマーと
して参考例４で作製したプライマー２を選択し梅毒菌ジ
ェノミックＤＮＡを鋳型として、梅毒抗原４７Ｋ(Infec
tion and Immunity, Vol.60,p.1568-1576, 1992) をコ
ードするＤＮＡ断片を作製した。このＤＮＡ断片の５’
末にはシャイン−ダルガーノの配列を含まない。塩基配
列を配列表２に示す。
で作製したプライマー１を、アンチセンスプライマーと
して参考例４で作製したプライマー２を選択し梅毒菌ジ
ェノミックＤＮＡを鋳型として、梅毒抗原４７Ｋ(Infec
tion and Immunity, Vol.60,p.1568-1576, 1992) をコ
ードするＤＮＡ断片を作製した。このＤＮＡ断片の５’
末にはシャイン−ダルガーノの配列を含まない。塩基配
列を配列表２に示す。
【００４８】ｄ）また大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）からミ
ニプレップ法（ｃｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ
ｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ ｕｎｉｔ
２．４ ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｂｙ Ｊｏｈｎ Ｗｉｌ
ｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ）により、ジェノミックＤＮＡを抽
出した。
ニプレップ法（ｃｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ
ｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ ｕｎｉｔ
２．４ ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｂｙ Ｊｏｈｎ Ｗｉｌ
ｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ）により、ジェノミックＤＮＡを抽
出した。
【００４９】ｅ）ポリメラーゼチェインリアクション
（ＰＣＲ）法により、センスプライマーとして参考例４
で作製したプライマー１１を、アンチセンスプライマー
として参考例４で作製したプライマー１２を選択し大腸
菌ジェノミックＤＮＡを鋳型として、分泌関連酵素Ｓｅ
ｃＧ(EMVO J., Vol.13, pp.3272-3277, 1994) をコード
するＤＮＡ断片を作製した。このＤＮＡ断片の５’末に
はシャイン−ダルガーノの配列を含む。塩基配列を配列
表３に示す。
（ＰＣＲ）法により、センスプライマーとして参考例４
で作製したプライマー１１を、アンチセンスプライマー
として参考例４で作製したプライマー１２を選択し大腸
菌ジェノミックＤＮＡを鋳型として、分泌関連酵素Ｓｅ
ｃＧ(EMVO J., Vol.13, pp.3272-3277, 1994) をコード
するＤＮＡ断片を作製した。このＤＮＡ断片の５’末に
はシャイン−ダルガーノの配列を含む。塩基配列を配列
表３に示す。
【００５０】ｆ）次にセンスプライマーとして参考例４
で作製したプライマー５を、アンチセンスプライマーと
して参考例４で作製したプライマー６を選択し大腸菌ジ
ェノミックＤＮＡを鋳型として、分泌関連酵素ＳｅｃＡ
(JOURNAL OF BACTERIOLOGY,Vol.170, pp.3404-3414, 19
88) をコードするＤＮＡ断片を作製した。このＤＮＡ
断片の５’末にはシャイン−ダルガーノの配列を含む。
塩基配列を配列表４に示す。
で作製したプライマー５を、アンチセンスプライマーと
して参考例４で作製したプライマー６を選択し大腸菌ジ
ェノミックＤＮＡを鋳型として、分泌関連酵素ＳｅｃＡ
(JOURNAL OF BACTERIOLOGY,Vol.170, pp.3404-3414, 19
88) をコードするＤＮＡ断片を作製した。このＤＮＡ
断片の５’末にはシャイン−ダルガーノの配列を含む。
塩基配列を配列表４に示す。
【００５１】ｇ）次にセンスプライマーとして参考例４
で作製したプライマー７を、アンチセンスプライマーと
して参考例４で作製したプライマー８を選択し大腸菌ジ
ェノミックＤＮＡを鋳型として、分泌関連酵素ＳｅｃＹ
(Biomembr., Vol.22, pp.353-367, 1990) をコードする
ＤＮＡ断片を作製した。このＤＮＡ断片の５’末にはシ
ャイン−ダルガーノの配列を含む。塩基配列は配列表５
に示す。
で作製したプライマー７を、アンチセンスプライマーと
して参考例４で作製したプライマー８を選択し大腸菌ジ
ェノミックＤＮＡを鋳型として、分泌関連酵素ＳｅｃＹ
(Biomembr., Vol.22, pp.353-367, 1990) をコードする
ＤＮＡ断片を作製した。このＤＮＡ断片の５’末にはシ
ャイン−ダルガーノの配列を含む。塩基配列は配列表５
に示す。
【００５２】次にポリメラーゼチェインリアクション
（ＰＣＲ）法により、センスプライマーとして参考例４
で作製したプライマー７を、またアンチセンスプライマ
ーとして参考例４で作製したプライマー１５を選択し、
参考例５で作製したＳｅｃＹをコードする遺伝子を鋳型
として、ｐｒｌＡ４（ＳｅｃＹ ｍｕｔａｎｔ）(BIO/T
ECHNOLOGY, VOL.12, pp.178-140, 1994)作製用の材料と
なる遺伝子を増幅した。これをＳｅｃＹ−２遺伝子と命
名する。
（ＰＣＲ）法により、センスプライマーとして参考例４
で作製したプライマー７を、またアンチセンスプライマ
ーとして参考例４で作製したプライマー１５を選択し、
参考例５で作製したＳｅｃＹをコードする遺伝子を鋳型
として、ｐｒｌＡ４（ＳｅｃＹ ｍｕｔａｎｔ）(BIO/T
ECHNOLOGY, VOL.12, pp.178-140, 1994)作製用の材料と
なる遺伝子を増幅した。これをＳｅｃＹ−２遺伝子と命
名する。
【００５３】同様にＰＣＲ法により、センスプライマー
として参考例４で作製したプライマー１４を、またアン
チセンスプライマーとして参考例４で作製したプライマ
ー８を選択し、参考例５で作製したＳｅｃＹをコードす
る遺伝子を鋳型として、ｐｒｌＡ４（ＳｅｃＹ ｍｕｔ
ａｎｔ）作製用の材料となる遺伝子を増幅した。これを
ＳｅｃＹ−３遺伝子と命名する。
として参考例４で作製したプライマー１４を、またアン
チセンスプライマーとして参考例４で作製したプライマ
ー８を選択し、参考例５で作製したＳｅｃＹをコードす
る遺伝子を鋳型として、ｐｒｌＡ４（ＳｅｃＹ ｍｕｔ
ａｎｔ）作製用の材料となる遺伝子を増幅した。これを
ＳｅｃＹ−３遺伝子と命名する。
【００５４】リコンビナントＰＣＲ法により、センスプ
ライマーとして参考例４で作製したプライマー７を、ま
たアンチセンスプライマーとして参考例４で作製したプ
ライマー８を選択し、参考例５で作製したＳｅｃＹ−
２、ＳｅｃＹ−３をコードする遺伝子の両者を鋳型とし
て反応液中に添加し、リコンビナントＰＣＲを行いこれ
らの遺伝子を結合した。これをｐｒｌＡ４（ＳｅｃＹ
ｍｕｔａｎｔ）と命名する。このＤＮＡ断片の５’末に
はシャイン−ダルガーノの配列を含む。この塩基配列で
は１２５１番目のＧがＡに置換している。
ライマーとして参考例４で作製したプライマー７を、ま
たアンチセンスプライマーとして参考例４で作製したプ
ライマー８を選択し、参考例５で作製したＳｅｃＹ−
２、ＳｅｃＹ−３をコードする遺伝子の両者を鋳型とし
て反応液中に添加し、リコンビナントＰＣＲを行いこれ
らの遺伝子を結合した。これをｐｒｌＡ４（ＳｅｃＹ
ｍｕｔａｎｔ）と命名する。このＤＮＡ断片の５’末に
はシャイン−ダルガーノの配列を含む。この塩基配列で
は１２５１番目のＧがＡに置換している。
【００５５】ｈ）更にセンスプライマーとして参考例４
で作製したプライマー９を、アンチセンスプライマーと
して参考例４で作製したプライマー１０を選択し大腸菌
ジェノミックＤＮＡを鋳型として、分泌関連酵素Ｓｅｃ
Ｅ(Genes Dev., Vol.3, p.1035-1044, 1989) をコード
するＤＮＡ断片を作製した。このＤＮＡ断片の５’末に
はシャイン−ダルガーノの配列を含む。塩基配列を配列
表６に示す。
で作製したプライマー９を、アンチセンスプライマーと
して参考例４で作製したプライマー１０を選択し大腸菌
ジェノミックＤＮＡを鋳型として、分泌関連酵素Ｓｅｃ
Ｅ(Genes Dev., Vol.3, p.1035-1044, 1989) をコード
するＤＮＡ断片を作製した。このＤＮＡ断片の５’末に
はシャイン−ダルガーノの配列を含む。塩基配列を配列
表６に示す。
【００５６】ｉ）ポリメラーゼチェインリアクション
（ＰＣＲ）法により、センスプライマーとして参考例４
で作製したプライマー１１を、又アンチセンスプライマ
ーとして参考例４で作製したプライマー１２を選択し、
参考例５で作製したＳｅｃＧをコードする遺伝子を鋳型
として、ＳｅｃＧ−ＳｅｃＡ遺伝子カセット作製用の材
料となる遺伝子を増幅した。これをＳｅｃＧ−２遺伝子
と命名する。同様にＰＣＲ法により、センスプライマー
として参考例４で作製したプライマー１３を、又アンチ
センスプライマーとして参考例４で作製したプライマー
６を選択し、参考例５で作製したＳｅｃＡをコードする
遺伝子を鋳型として、ＳｅｃＧ−ＳｅｃＡ遺伝子カセッ
ト作製用の材料となる遺伝子を増幅した。これをＳｅｃ
Ａ−２遺伝子と命名する。リコンビナントＰＣＲ法によ
り、センスプライマーとして参考例４で作製したプライ
マー１１を、又アンチセンスプライマーとして参考例４
で作製したプライマー６を選択し、参考例５で作製した
ＳｅｃＧ−２、ＳｅｃＡ−２をコードする遺伝子の両者
を鋳型として反応液中に添加し、ＳｅｃＧ−ＳｅｃＡ遺
伝子カセット作製用の材料となる遺伝子を増幅した。次
に参考例４でのリコンビナントＰＣＲを行いこれらの遺
伝子を結合した。これをＳｅｃＧ−ＳｅｃＡ遺伝子カセ
ットと命名する。
（ＰＣＲ）法により、センスプライマーとして参考例４
で作製したプライマー１１を、又アンチセンスプライマ
ーとして参考例４で作製したプライマー１２を選択し、
参考例５で作製したＳｅｃＧをコードする遺伝子を鋳型
として、ＳｅｃＧ−ＳｅｃＡ遺伝子カセット作製用の材
料となる遺伝子を増幅した。これをＳｅｃＧ−２遺伝子
と命名する。同様にＰＣＲ法により、センスプライマー
として参考例４で作製したプライマー１３を、又アンチ
センスプライマーとして参考例４で作製したプライマー
６を選択し、参考例５で作製したＳｅｃＡをコードする
遺伝子を鋳型として、ＳｅｃＧ−ＳｅｃＡ遺伝子カセッ
ト作製用の材料となる遺伝子を増幅した。これをＳｅｃ
Ａ−２遺伝子と命名する。リコンビナントＰＣＲ法によ
り、センスプライマーとして参考例４で作製したプライ
マー１１を、又アンチセンスプライマーとして参考例４
で作製したプライマー６を選択し、参考例５で作製した
ＳｅｃＧ−２、ＳｅｃＡ−２をコードする遺伝子の両者
を鋳型として反応液中に添加し、ＳｅｃＧ−ＳｅｃＡ遺
伝子カセット作製用の材料となる遺伝子を増幅した。次
に参考例４でのリコンビナントＰＣＲを行いこれらの遺
伝子を結合した。これをＳｅｃＧ−ＳｅｃＡ遺伝子カセ
ットと命名する。
【００５７】（実施例１）参考例５で作製した１７Ｋ、
ＳｅｃＡ、ＳｅｃＧ、ｐｒｌＡ４（ＳｅｃＹ ｍｕｔａ
ｎｔ）、ＳｅｃＥをコードする遺伝子を、この順に遺伝
子をベクターに挿入した。これら５つの抗原と酵素を同
時に発現する系を以下１７Ｋ：ＳｅｃＧ：ＳｅｃＡ：ｐ
ｒｌＡ４（ＳｅｃＹ ｍｕｔａｎｔ）：ＳｅｃＥ発現系
と命名する。１７Ｋ：ＳｅｃＧ：ＳｅｃＡ：ｐｒｌＡ４
（ＳｅｃＹ ｍｕｔａｎｔ）：ＳｅｃＥ発現系のための
べクターを作製するため、発現ベクターｐＷ６Ａと１７
Ｋをコードする遺伝子を制限酵素ＮｄｅＩとＢａｍＨＩ
で消化した後、ライゲートして１７Ｋをコードする遺伝
子を発現ベクターｐＷ６Ａに挿入した。このベクターを
ｐＷ６Ａ−１７Ｋと命名する。続いてｐＷ６Ａ−１７Ｋ
とＳｅｃＡをコードする遺伝子をＢａｍＨＩとＸｂａＩ
で消化した後、ライゲートしてＳｅｃＡをコードする遺
伝子をベクターｐＷ６Ａ−１７Ｋに挿入した。このベク
ターをｐＷ６Ａ−１７Ｋ−ＳｅｃＡと命名する。続いて
ｐＷ６Ａ−１７Ｋ−ＳｅｃＡとｐｒｌＡ４（ＳｅｃＹ
ｍｕｔａｎｔ）をコードする遺伝子を制限酵素ＸｂａＩ
とＮｏｔＩで消化した後、ライゲートしてｐｒｌＡ４
（ＳｅｃＹ ｍｕｔａｎｔ）をコードする遺伝子をベク
ターｐＷ６Ａ−１７Ｋ−ＳｅｃＡに挿入した。このベク
ターをｐＷ６Ａ−１７Ｋ−ＳｅｃＡ−ｐｒｌＡ４（Ｓｅ
ｃＹ ｍｕｔａｎｔ）と命名する。続いてｐＷ６Ａ−１
７Ｋ−ＳｅｃＡ−ｐｒｌＡ４（ＳｅｃＹ ｍｕｔａｎ
ｔ）とＳｅｃＥをコードする遺伝子を制限酵素ＮｏｔＩ
とＥｃｏＴ２２で消化した後、ライゲートしてＳｅｃＥ
をコードする遺伝子をベクターｐＷ６Ａ−１７Ｋ−Ｓｅ
ｃＡ−ｐｒｌＡ４（ＳｅｃＹ ｍｕｔａｎｔ）に挿入し
た。このベクターをｐＷ６Ａ−１７Ｋ−ＳｅｃＡ−ｐｒ
ｌＡ４（ＳｅｃＹ ｍｕｔａｎｔ）−ＳｅｃＥと命名す
る。
ＳｅｃＡ、ＳｅｃＧ、ｐｒｌＡ４（ＳｅｃＹ ｍｕｔａ
ｎｔ）、ＳｅｃＥをコードする遺伝子を、この順に遺伝
子をベクターに挿入した。これら５つの抗原と酵素を同
時に発現する系を以下１７Ｋ：ＳｅｃＧ：ＳｅｃＡ：ｐ
ｒｌＡ４（ＳｅｃＹ ｍｕｔａｎｔ）：ＳｅｃＥ発現系
と命名する。１７Ｋ：ＳｅｃＧ：ＳｅｃＡ：ｐｒｌＡ４
（ＳｅｃＹ ｍｕｔａｎｔ）：ＳｅｃＥ発現系のための
べクターを作製するため、発現ベクターｐＷ６Ａと１７
Ｋをコードする遺伝子を制限酵素ＮｄｅＩとＢａｍＨＩ
で消化した後、ライゲートして１７Ｋをコードする遺伝
子を発現ベクターｐＷ６Ａに挿入した。このベクターを
ｐＷ６Ａ−１７Ｋと命名する。続いてｐＷ６Ａ−１７Ｋ
とＳｅｃＡをコードする遺伝子をＢａｍＨＩとＸｂａＩ
で消化した後、ライゲートしてＳｅｃＡをコードする遺
伝子をベクターｐＷ６Ａ−１７Ｋに挿入した。このベク
ターをｐＷ６Ａ−１７Ｋ−ＳｅｃＡと命名する。続いて
ｐＷ６Ａ−１７Ｋ−ＳｅｃＡとｐｒｌＡ４（ＳｅｃＹ
ｍｕｔａｎｔ）をコードする遺伝子を制限酵素ＸｂａＩ
とＮｏｔＩで消化した後、ライゲートしてｐｒｌＡ４
（ＳｅｃＹ ｍｕｔａｎｔ）をコードする遺伝子をベク
ターｐＷ６Ａ−１７Ｋ−ＳｅｃＡに挿入した。このベク
ターをｐＷ６Ａ−１７Ｋ−ＳｅｃＡ−ｐｒｌＡ４（Ｓｅ
ｃＹ ｍｕｔａｎｔ）と命名する。続いてｐＷ６Ａ−１
７Ｋ−ＳｅｃＡ−ｐｒｌＡ４（ＳｅｃＹ ｍｕｔａｎ
ｔ）とＳｅｃＥをコードする遺伝子を制限酵素ＮｏｔＩ
とＥｃｏＴ２２で消化した後、ライゲートしてＳｅｃＥ
をコードする遺伝子をベクターｐＷ６Ａ−１７Ｋ−Ｓｅ
ｃＡ−ｐｒｌＡ４（ＳｅｃＹ ｍｕｔａｎｔ）に挿入し
た。このベクターをｐＷ６Ａ−１７Ｋ−ＳｅｃＡ−ｐｒ
ｌＡ４（ＳｅｃＹ ｍｕｔａｎｔ）−ＳｅｃＥと命名す
る。
【００５８】ベクターｐＷ６Ａ−１７Ｋ−ＳｅｃＡ−ｐ
ｒｌＡ４（ＳｅｃＹ ｍｕｔａｎｔ）−ＳｅｃＥを制限
酵素ＢａｍＨＩとＸｂａＩで消化後、エチジウムブロマ
イドを含むゲルを用いてアガロース電気泳動し、現れた
ｐＷ６Ａ−１７Ｋ−ｐｒｌＡ４（ＳｅｃＹ ｍｕｔａｎ
ｔ）−ＳｅｃＥ（ＳｅｃＡが除去されている）のバンド
とＳｅｃＡのバンドの内、ｐＷ６Ａ−１７Ｋ−ｐｒｌＡ
４（ＳｅｃＹ ｍｕｔａｎｔ）−ＳｅｃＥ（ＳｅｃＡが
除去されている）のバンドのみを切り出しジーンクリー
ンＩＩ（フナコシ）にて精製した。次にＳｅｃＧ−Ｓｅ
ｃＡ遺伝子カセットを制限酵素ＢａｍＨＩとＸｂａＩで
消化した後、ライゲートしてＳｅｃＧ−ＳｅｃＡ遺伝子
カセットをベクターｐＷ６Ａ−１７Ｋ−ｐｒｌＡ４（Ｓ
ｅｃＹｍｕｔａｎｔ）−ＳｅｃＥ（ＳｅｃＡが除去され
ている）に挿入した。このベクターをｐＷ６Ａ−１７Ｋ
−ＳｅｃＧ−ＳｅｃＡ−ｐｒｌＡ４（ＳｅｃＹ ｍｕｔ
ａｎｔ）−ＳｅｃＥと命名する。できたベクターの概略
図を図３（ｃ）に示す。なお、遺伝子を挿入した各々の
ベクターは塩化カルシウム法により大腸菌ＤＨ５αに導
入され、アンピシリンを含むＬＢ培地を用いた菌体の培
養後、アルカリＳＤＳ法により所望のベクターを取得し
た。
ｒｌＡ４（ＳｅｃＹ ｍｕｔａｎｔ）−ＳｅｃＥを制限
酵素ＢａｍＨＩとＸｂａＩで消化後、エチジウムブロマ
イドを含むゲルを用いてアガロース電気泳動し、現れた
ｐＷ６Ａ−１７Ｋ−ｐｒｌＡ４（ＳｅｃＹ ｍｕｔａｎ
ｔ）−ＳｅｃＥ（ＳｅｃＡが除去されている）のバンド
とＳｅｃＡのバンドの内、ｐＷ６Ａ−１７Ｋ−ｐｒｌＡ
４（ＳｅｃＹ ｍｕｔａｎｔ）−ＳｅｃＥ（ＳｅｃＡが
除去されている）のバンドのみを切り出しジーンクリー
ンＩＩ（フナコシ）にて精製した。次にＳｅｃＧ−Ｓｅ
ｃＡ遺伝子カセットを制限酵素ＢａｍＨＩとＸｂａＩで
消化した後、ライゲートしてＳｅｃＧ−ＳｅｃＡ遺伝子
カセットをベクターｐＷ６Ａ−１７Ｋ−ｐｒｌＡ４（Ｓ
ｅｃＹｍｕｔａｎｔ）−ＳｅｃＥ（ＳｅｃＡが除去され
ている）に挿入した。このベクターをｐＷ６Ａ−１７Ｋ
−ＳｅｃＧ−ＳｅｃＡ−ｐｒｌＡ４（ＳｅｃＹ ｍｕｔ
ａｎｔ）−ＳｅｃＥと命名する。できたベクターの概略
図を図３（ｃ）に示す。なお、遺伝子を挿入した各々の
ベクターは塩化カルシウム法により大腸菌ＤＨ５αに導
入され、アンピシリンを含むＬＢ培地を用いた菌体の培
養後、アルカリＳＤＳ法により所望のベクターを取得し
た。
【００５９】（実施例２）実施例１で得られたｐＷ６Ａ
−１７Ｋ−ＳｅｃＧ−ＳｅｃＡ−ｐｒｌＡ４（ＳｅｃＹ
ｍｕｔａｎｔ）−ＳｅｃＥとｐＷ６Ａ−１７Ｋをそれ
ぞれ別々に異なる大腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）に導入し
アンピシリンを含むＬＢ培地を用いて菌体の培養を行っ
た。融合抗原は１ｍＭ ＩＰＴＧを添加して発現の誘導
を行い、菌体破砕、遠心操作後沈殿として回収した。１
７Ｋとウサギ睾丸で継代培養しパーコール密度遠心によ
り精製した梅毒菌を、１５％ポリアクリルアミドゲルで
還元ＳＤＳ電気泳動した。その後、参考例５で睾丸で梅
毒菌を培養したウサギの血清を一次抗体として用いてウ
ェスタンブロットを行ったところ、血清と反応する抗原
の発現が認められた。ここで１７Ｋ発現系では二本のバ
ンドが認められるが、これらは上からそれぞれプレマチ
ュアー型と呼ばれるシグナル配列を持ち脂質が付加され
ていない１７Ｋの抗原（以下、ｐ−１７Ｋと称する）と
ネイティブ型と呼ばれるシグナル配列が除去され脂質が
付加されている抗原（以下、ｎ−１７Ｋと称する）であ
る。ｎ−１７Ｋ抗原の泳動位置はウサギ睾丸抽出梅毒菌
ネイティブ１７Ｋと一致した。次に１７Ｋ発現系と１７
Ｋ：ＳｅｃＧ：ＳｅｃＡ：ｐｒｌＡ４（ＳｅｃＹ ｍｕ
ｔａｎｔ）：ＳｅｃＥ発現系の発現産物を１５％ポリア
クリルアミドゲルで還元ＳＤＳ電気泳動した。その後、
実施例１で睾丸で梅毒菌を培養したウサギの血清を一次
抗体として用いてウェスタンブロットを行った。結果を
図４に示す。１７Ｋ：ＳｅｃＧ：ＳｅｃＡ：ｐｒｌＡ４
（ＳｅｃＹ ｍｕｔａｎｔ）：ＳｅｃＥ発現系では１７
Ｋ発現系と比べてネイティブ型のｎ−１７Ｋの発現量の
割合が大幅に増加した。また、同様なウェスタンブロッ
トにより、ｐ−１７Ｋ及びｎ−１７Ｋが参考例２で作製
した抗１７Ｋモノクローン抗体と反応することを確認し
た。
−１７Ｋ−ＳｅｃＧ−ＳｅｃＡ−ｐｒｌＡ４（ＳｅｃＹ
ｍｕｔａｎｔ）−ＳｅｃＥとｐＷ６Ａ−１７Ｋをそれ
ぞれ別々に異なる大腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）に導入し
アンピシリンを含むＬＢ培地を用いて菌体の培養を行っ
た。融合抗原は１ｍＭ ＩＰＴＧを添加して発現の誘導
を行い、菌体破砕、遠心操作後沈殿として回収した。１
７Ｋとウサギ睾丸で継代培養しパーコール密度遠心によ
り精製した梅毒菌を、１５％ポリアクリルアミドゲルで
還元ＳＤＳ電気泳動した。その後、参考例５で睾丸で梅
毒菌を培養したウサギの血清を一次抗体として用いてウ
ェスタンブロットを行ったところ、血清と反応する抗原
の発現が認められた。ここで１７Ｋ発現系では二本のバ
ンドが認められるが、これらは上からそれぞれプレマチ
ュアー型と呼ばれるシグナル配列を持ち脂質が付加され
ていない１７Ｋの抗原（以下、ｐ−１７Ｋと称する）と
ネイティブ型と呼ばれるシグナル配列が除去され脂質が
付加されている抗原（以下、ｎ−１７Ｋと称する）であ
る。ｎ−１７Ｋ抗原の泳動位置はウサギ睾丸抽出梅毒菌
ネイティブ１７Ｋと一致した。次に１７Ｋ発現系と１７
Ｋ：ＳｅｃＧ：ＳｅｃＡ：ｐｒｌＡ４（ＳｅｃＹ ｍｕ
ｔａｎｔ）：ＳｅｃＥ発現系の発現産物を１５％ポリア
クリルアミドゲルで還元ＳＤＳ電気泳動した。その後、
実施例１で睾丸で梅毒菌を培養したウサギの血清を一次
抗体として用いてウェスタンブロットを行った。結果を
図４に示す。１７Ｋ：ＳｅｃＧ：ＳｅｃＡ：ｐｒｌＡ４
（ＳｅｃＹ ｍｕｔａｎｔ）：ＳｅｃＥ発現系では１７
Ｋ発現系と比べてネイティブ型のｎ−１７Ｋの発現量の
割合が大幅に増加した。また、同様なウェスタンブロッ
トにより、ｐ−１７Ｋ及びｎ−１７Ｋが参考例２で作製
した抗１７Ｋモノクローン抗体と反応することを確認し
た。
【００６０】（実施例３）参考例５で作製した４７Ｋ、
ＳｅｃＡ、ＳｅｃＧ、ｐｒｌＡ４（ＳｅｃＹ ｍｕｔａ
ｎｔ）、ＳｅｃＥをコードする遺伝子を、この順にベク
ターに挿入した。これら５つの抗原と酵素を同時に発現
する系を以下４７Ｋ：ＳｅｃＧ：ＳｅｃＡ：ｐｒｌＡ４
（ＳｅｃＹ ｍｕｔａｎｔ）：ＳｅｃＥ発現系と命名す
る。４７Ｋ：ＳｅｃＧ：ＳｅｃＡ：ｐｒｌＡ４（Ｓｅｃ
Ｙ ｍｕｔａｎｔ）：ＳｅｃＥ発現系のためのべクター
を作製するため、ベクターｐＷ６Ａ−１７Ｋ−ＳｅｃＧ
−ＳｅｃＡ−ｐｒｌＡ４（ＳｅｃＹ ｍｕｔａｎｔ）−
ＳｅｃＥを制限酵素ＮｄｅＩとＢａｍＨＩで消化後、エ
チジウムブロマイドを含むゲルを用いてアガロース電気
泳動し、現れたｐＷ６Ａ−ＳｅｃＧ−ＳｅｃＡ−ｐｒｌ
Ａ４（ＳｅｃＹ ｍｕｔａｎｔ）−ＳｅｃＥ（１７Ｋを
コードする遺伝子が除去されている）のバンドと１７Ｋ
をコードする遺伝子のバンドの内、ｐＷ６Ａ−ＳｅｃＧ
−ＳｅｃＡ−ｐｒｌＡ４（ＳｅｃＹ ｍｕｔａｎｔ）−
ＳｅｃＥ（１７Ｋをコードする遺伝子が除去されてい
る）のバンドのみを切り出しジーンクリーンＩＩ（フナ
コシ）にて精製した。４７Ｋをコードする遺伝子を制限
酵素ＮｄｅＩとＢａｍＨＩで消化した後、ライゲートし
て４７Ｋの遺伝子をベクターｐＷ６Ａ−ＳｅｃＧ−Ｓｅ
ｃＡ−ｐｒｌＡ４（ＳｅｃＹ ｍｕｔａｎｔ）−Ｓｅｃ
Ｅ（１７Ｋが除去されている）に挿入した。このベクタ
ーをｐＷ６Ａ−４７Ｋ−ＳｅｃＧ−ＳｅｃＡ−ｐｒｌＡ
４（ＳｅｃＹ ｍｕｔａｎｔ）−ＳｅｃＥと命名する。
できたベクターの概略図を図３（ｄ）に示す。比較のた
めに４７Ｋのみの発現系を作製した。発現ベクターｐＷ
６Ａと４７Ｋをコードする遺伝子を制限酵素ＮｄｅＩと
ＢａｍＨＩで消化した後、ライゲートして４７Ｋをコー
ドする遺伝子を発現ベクターｐＷ６Ａに挿入した。この
ベクターをｐＷ６Ａ−４７Ｋと命名する。できたベクタ
ーの概略図を図３（ｂ）に示す。なお、遺伝子を挿入し
た各々のベクターは塩化カルシウム法により大腸菌ＤＨ
５αに導入され、アンピシリンを含むＬＢ培地を用いた
菌体の培養後、アルカリＳＤＳ法により所望のベクター
を取得した。
ＳｅｃＡ、ＳｅｃＧ、ｐｒｌＡ４（ＳｅｃＹ ｍｕｔａ
ｎｔ）、ＳｅｃＥをコードする遺伝子を、この順にベク
ターに挿入した。これら５つの抗原と酵素を同時に発現
する系を以下４７Ｋ：ＳｅｃＧ：ＳｅｃＡ：ｐｒｌＡ４
（ＳｅｃＹ ｍｕｔａｎｔ）：ＳｅｃＥ発現系と命名す
る。４７Ｋ：ＳｅｃＧ：ＳｅｃＡ：ｐｒｌＡ４（Ｓｅｃ
Ｙ ｍｕｔａｎｔ）：ＳｅｃＥ発現系のためのべクター
を作製するため、ベクターｐＷ６Ａ−１７Ｋ−ＳｅｃＧ
−ＳｅｃＡ−ｐｒｌＡ４（ＳｅｃＹ ｍｕｔａｎｔ）−
ＳｅｃＥを制限酵素ＮｄｅＩとＢａｍＨＩで消化後、エ
チジウムブロマイドを含むゲルを用いてアガロース電気
泳動し、現れたｐＷ６Ａ−ＳｅｃＧ−ＳｅｃＡ−ｐｒｌ
Ａ４（ＳｅｃＹ ｍｕｔａｎｔ）−ＳｅｃＥ（１７Ｋを
コードする遺伝子が除去されている）のバンドと１７Ｋ
をコードする遺伝子のバンドの内、ｐＷ６Ａ−ＳｅｃＧ
−ＳｅｃＡ−ｐｒｌＡ４（ＳｅｃＹ ｍｕｔａｎｔ）−
ＳｅｃＥ（１７Ｋをコードする遺伝子が除去されてい
る）のバンドのみを切り出しジーンクリーンＩＩ（フナ
コシ）にて精製した。４７Ｋをコードする遺伝子を制限
酵素ＮｄｅＩとＢａｍＨＩで消化した後、ライゲートし
て４７Ｋの遺伝子をベクターｐＷ６Ａ−ＳｅｃＧ−Ｓｅ
ｃＡ−ｐｒｌＡ４（ＳｅｃＹ ｍｕｔａｎｔ）−Ｓｅｃ
Ｅ（１７Ｋが除去されている）に挿入した。このベクタ
ーをｐＷ６Ａ−４７Ｋ−ＳｅｃＧ−ＳｅｃＡ−ｐｒｌＡ
４（ＳｅｃＹ ｍｕｔａｎｔ）−ＳｅｃＥと命名する。
できたベクターの概略図を図３（ｄ）に示す。比較のた
めに４７Ｋのみの発現系を作製した。発現ベクターｐＷ
６Ａと４７Ｋをコードする遺伝子を制限酵素ＮｄｅＩと
ＢａｍＨＩで消化した後、ライゲートして４７Ｋをコー
ドする遺伝子を発現ベクターｐＷ６Ａに挿入した。この
ベクターをｐＷ６Ａ−４７Ｋと命名する。できたベクタ
ーの概略図を図３（ｂ）に示す。なお、遺伝子を挿入し
た各々のベクターは塩化カルシウム法により大腸菌ＤＨ
５αに導入され、アンピシリンを含むＬＢ培地を用いた
菌体の培養後、アルカリＳＤＳ法により所望のベクター
を取得した。
【００６１】（実施例４）実施例３で得られたｐＷ６Ａ
−４７Ｋ−ＳｅｃＧ−ＳｅｃＡ−ｐｒｌＡ４（ＳｅｃＹ
ｍｕｔａｎｔ）−ＳｅｃＥとｐＷ６Ａ−４７Ｋをそれ
ぞれ別々に異なる大腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）に導入し
アンピシリンを含むＬＢ培地を用いて菌体の培養を行っ
た。融合抗原は発現の誘導、菌体破砕、遠心操作後沈殿
として回収した。４７Ｋとウサギ睾丸で継代培養しパー
コール密度遠心により精製した梅毒菌を、７．５％ポリ
アクリルアミドゲルで還元ＳＤＳ電気泳動した。その後
参考例５で睾丸で梅毒菌を培養したウサギの血清を一次
抗体として用いてウェスタンブロットを行ったところ、
血清と反応する抗原の発現が認められた。ここで４７Ｋ
発現系では二本のバンドが認められるが、これらは上か
らそれぞれプレマチュアー型と呼ばれるシグナル配列を
持ち脂質が付加されていない４７Ｋの抗原（以下、ｐ−
４７Ｋと称する）とネイティブ型と呼ばれるシグナル配
列が除去され脂質が付加されている抗原（以下、ｎ−４
７Ｋと称する）である。ｎ−４７Ｋ抗原の泳動位置はウ
サギ睾丸抽出梅毒菌のものと一致した。次に４７Ｋ発現
系と４７Ｋ：ＳｅｃＧ：ＳｅｃＡ：ｐｒｌＡ４（Ｓｅｃ
Ｙ ｍｕｔａｎｔ）：ＳｅｃＥ発現系の発現産物を７．
５％ポリアクリルアミドゲルで還元ＳＤＳ電気泳動し
た。その後実施例１で睾丸で梅毒菌を培養したウサギの
血清を一次抗体として用いてウェスタンブロットを行っ
た。結果を同じ図５に示す。４７Ｋ：ＳｅｃＧ：Ｓｅｃ
Ａ：ｐｒｌＡ４（ＳｅｃＹ ｍｕｔａｎｔ）：ＳｅｃＥ
発現系では４７Ｋ発現系と比べてネイティブ型のｎ−４
７Ｋの発現量の割合が増加した。また、同様のウェスタ
ンブロットによりｐ−４７Ｋ及びｎ−４７Ｋが参考例２
で作製した抗４７Ｋモノクローン抗体と反応することを
確認した。
−４７Ｋ−ＳｅｃＧ−ＳｅｃＡ−ｐｒｌＡ４（ＳｅｃＹ
ｍｕｔａｎｔ）−ＳｅｃＥとｐＷ６Ａ−４７Ｋをそれ
ぞれ別々に異なる大腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）に導入し
アンピシリンを含むＬＢ培地を用いて菌体の培養を行っ
た。融合抗原は発現の誘導、菌体破砕、遠心操作後沈殿
として回収した。４７Ｋとウサギ睾丸で継代培養しパー
コール密度遠心により精製した梅毒菌を、７．５％ポリ
アクリルアミドゲルで還元ＳＤＳ電気泳動した。その後
参考例５で睾丸で梅毒菌を培養したウサギの血清を一次
抗体として用いてウェスタンブロットを行ったところ、
血清と反応する抗原の発現が認められた。ここで４７Ｋ
発現系では二本のバンドが認められるが、これらは上か
らそれぞれプレマチュアー型と呼ばれるシグナル配列を
持ち脂質が付加されていない４７Ｋの抗原（以下、ｐ−
４７Ｋと称する）とネイティブ型と呼ばれるシグナル配
列が除去され脂質が付加されている抗原（以下、ｎ−４
７Ｋと称する）である。ｎ−４７Ｋ抗原の泳動位置はウ
サギ睾丸抽出梅毒菌のものと一致した。次に４７Ｋ発現
系と４７Ｋ：ＳｅｃＧ：ＳｅｃＡ：ｐｒｌＡ４（Ｓｅｃ
Ｙ ｍｕｔａｎｔ）：ＳｅｃＥ発現系の発現産物を７．
５％ポリアクリルアミドゲルで還元ＳＤＳ電気泳動し
た。その後実施例１で睾丸で梅毒菌を培養したウサギの
血清を一次抗体として用いてウェスタンブロットを行っ
た。結果を同じ図５に示す。４７Ｋ：ＳｅｃＧ：Ｓｅｃ
Ａ：ｐｒｌＡ４（ＳｅｃＹ ｍｕｔａｎｔ）：ＳｅｃＥ
発現系では４７Ｋ発現系と比べてネイティブ型のｎ−４
７Ｋの発現量の割合が増加した。また、同様のウェスタ
ンブロットによりｐ−４７Ｋ及びｎ−４７Ｋが参考例２
で作製した抗４７Ｋモノクローン抗体と反応することを
確認した。
【００６２】
【発明の効果】本発明により、脂質が結合した反応性の
高いＴｐ抗原を大量に得ることができ、該抗原を免疫測
定試薬として用いた場合には、従来に較べ、より特異的
で感度の高い測定を行うことができる。また、遺伝子工
学技術を用いていることにより抗原の安定供給が確保さ
れる。
高いＴｐ抗原を大量に得ることができ、該抗原を免疫測
定試薬として用いた場合には、従来に較べ、より特異的
で感度の高い測定を行うことができる。また、遺伝子工
学技術を用いていることにより抗原の安定供給が確保さ
れる。
【００６３】
配列番号：１
配列の長さ：４８６
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸
配列
TCTCATATGA AAGGATCTGT CCGCGCGCTG TGCGCGTTCC TTGGTGTTGG AGCGCTCGGT
30 60
AGCGCTTTGT GTGTCTCGTG CACAACCGTG TGTCCGCACG CCGGGAAGGC CAAAGCGGAA
90 120
AAGGTAGAGT GCGCGTTGAA GGGAGGTATC TTTCGGGGTA CGCTACCTGC GGCCGATTGC
150 180
CCGGGAATCG ATACGACTGT GACGTTCAAC GCGGATGGCA CTGCGCAAAA GGTAGAGCTT
210 240
GCCCTTGAGA AGAAGTCGGC ACCTTCTCCT CTTACGTATC GCGGTACGTG GATGGTACGT
270 300
GAAGACGGAA TTGTCGAACT CTCGCTTGTG TCCTCGGAGC AATCGAAGGC ACCGCACGAG
330 360
AAAGAGCTGT ACGAGCTGAT AGACAGTAAC TCCGTTCGCT ACATGGGCGC TCCCGGCGCA
390 420
GGAAAGCCTT CAAAGGAGAT GGCGCCGTTT TACGTGCTCA AAAAAACAAA GAAATAGGGA
450 480
TCCCTG
【００６４】
配列番号：２
配列の長さ：１３２５
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸
配列
GTGTACATAT GAAAGTGAAA TACGCACTAT TTTCTGCCGG AGCGCTGCAG TTGTTGGTTG
30 60
TAGGCTGTGG CTCGTCTCAT CATGAGACGC ACTATGGCTA TGCGACGCTA AGCTATGCGG
90 120
ACTACTGGGC CGGGGAGTTG GGGCAGAGTA GGGACGTGCT TTTGGCGGGT AATGCCGAGG
150 180
CGGACCGCGC GGGGGATCTC GACGCAGGCA TGTTCGATGC AGTTTCTCGC GCAACCCACG
210 240
GGCATGGCGC GTTCCGTCAG CAATTTCAGT ACGCGGTTGA GGTATTGGGC GAAAAGGTTC
270 300
TCTCGAAGCA GGAGACCGAA GACAGCAGGG GAAGAAAAAA GTGGGAGTAC GAGACTGACC
330 360
CAAGCGTTAC TAAGATGGTG CGTGCCTCTG CGTCATTTCA GGATTTGGGA GAGGACGGGG
390 420
AGATTAAGTT TGAAGCAGTC GAGGGTGCAG TAGCGTTGGC GGATCGCGCG AGTTCCTTCA
450 480
TGGTTGACAG CGAGGAATAC AAGATTACGA ACGTAAAGGT TCACGGTATG AAGTTTGTCC
510 540
CAGTTGCGGT TCCTCATGAA TTAAAAGGGA TTGCAAAGGA GAAGTTTCAC TTCGTGGAAG
570 600
ACTCCCGCGT TACGGAGAAT ACCAACGGCC TTAAGACAAT GCTCACTGAG GATAGTTTTT
630 660
CTGCACGTAA GGTAAGCAGC ATGGAGAGCC CGCACGACCT TGTGGTAGAC ACGGTGGGTA
690 720
CCGGTTACCA CAGCCGTTTT GGTTCGGACG CAGAGGCTTC TGTGATGCTG AAAAGGGCTG
750 780
ATGGCTCTGA GCTGTCGCAC CGTGAGTTCA TCGACTATGT GATGAACTTC AACACGGTCC
810 840
GCTACGACTA CTACGGTGAT GACGCGAGCT ACACCAATCT GATGGCGAGT TATGGCACCA
870 900
AGCACTCTGC TGACTCCTGG TGGAAGACAG GAAGAGTGCC CCGCATTTCG TGTGGTATCA
930 960
ACTATGGGTT CGATCGGTTT AAAGGTTCAG GGCCGGGATA CTACAGGCTG ACTTTGATTG
990 1020
CGAACGGGTA TAGGGACGTA GTTGCTGATG TGCGCTTCCT TCCCAAGTAC GAGGGGAACA
1050 1080
TCGATATTGG GTTGAAGGGG AAGGTGCTGA CCATAGGGGG CGCGGACGCG GAGACTCTGA
1110 1140
TGGATGCTGC AGTTGACGTG TTTGCCGATG GACAGCCTAA GCTTGTCAGC GATCAAGCGG
1170 1200
TGAGCTTGGG GCAGAATGTC CTCTCTGCGG ATTTCACTCC CGGCACTGAG TACACGGTTG
1230 1260
AGGTTAGGTT CAAGGAATTC GGTTCTGTGC GTGCGAAGGT AGTGGCCCAG TAGGGATCCG
1290 1320
GTGTC
【００６５】
配列番号：３
配列の長さ：３６９
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸
配列
ATTGGGGATC CGCAACTCCG CAAGGAACAG GTTGATTATG TATGAAGCTC TTTTAGTAGT
30 60
TTTCCTTATT GTGGCAATTG GCCTTGTTGG TCTGATCATG CTGCAGCAAG GTAAAGGCGC
90 120
TGATATGGGA GCCTCCTTCG GAGCAGGCGC TTCCGCTACG CTGTTTGGTT CAAGTGGTTC
150 180
TGGTAACTTC ATGACCCGCA TGACGGCGCT GCTGGCAACG TTATTCTTCA TCATCAGTCT
210 240
GGTGCTGGGT AACATCAATA GCAACAAAAC CAATAAAGGT AGCGAATGGG AAAATCTGAG
270 300
TGCACCGGTG AAACCGAACA AACTCAGCCA GCTGCTCCGG CTAAGCCGAC CAGCGATATC
330 360
CCGAACTAA
【００６６】
配列番号：４
配列の長さ：２７５４
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸
配列
TTTGGATCCC TCCGCAACGC GGGGCGTTTG AGATTTTATT ATGCTAATCA AATTGTTAAC
30 60
TAAAGTTTTC GGTAGTCGTA ACGATCGCAC CCTGCGCCGG ATGCGCAAAG TGGTCAACAT
90 120
CATCAATGCC ATGGAACCGG AGATGGAAAA ACTCTCCGAC GAAGAACTGA AAGGGAAAAC
150 180
CGCAGAGTTT CGTGCACGTC TGGAAAAAGG CGAAGTGCTG GAAAATCTGA TCCCGGAAGC
210 240
TTTCGCCGTG GTACGTGAGG CAAGTAAGCG CGTCTTTGGT ATGCGTCACT TCGACGTTCA
270 300
GTTACTCGGC GGTATGGTTC TTAACGAACG CTGCATCGCC GAAATGCGTA CCGGTGAAGG
330 360
AAAAACCCTG ACCGCAACGC TGCCTGCTTA CCTGAACGCA CTAACCGGTA AAGGCGTGCA
390 420
CGTAGTTACC GTCAACGACT ACCTGGCGCA ACGTGACGCC GAAAACAACC GTCCGCTGTT
450 480
TGAATTCCTT GGCCTGACTG TCGGTATCAA CCTGCCGGGC ATGCCAGCAC CGGCAAAGCG
510 540
CGAAGCTTAC GCAGCTGACA TCACTTACGG TACGAACAAC GAATACGGCT TTGACTACCT
570 600
GCGCGACAAC ATGGCGTTCA GCCCTGAAGA ACGTGTACAG CGTAAACTGC ACTATGCGCT
630 660
GGTGGACGAA GTGGACTCCA TCCTGATCGA TGAAGCGCGT ACACCGCTGA TCATTTCCGG
690 720
CCCGGCAGAA GACAGCTCGG AAATGTATAA ACGCGTGAAT AAAATTATTC CGCACCTGAT
750 780
CCGTCAGGAA AAAGAAGACT CCGAAACCTT CCAGGGCGAA GGCCACTTCT CGGTGGACGA
810 840
AAAATCTCGC CAGGTGAACC TGACCGAACG TGGTCTGGTG CTGATTGAAG AACTGCTGGT
870 900
GAAAGAGGGC ATCATGGATG AAGGGGAGTC TCTGTACTCT CCGGCCAACA TCATGCTGAT
930 960
GCACCACGTA ACGGCGGCGC TGCGCGCTCA TGCGCTGTTT ACCCGTGACG TCGACTACAT
990 1020
CGTTAAAGAT GGTGAAGTTA TCATCGTTGA CGAACACACC GGTCGTACCA TGCAGGGCCG
1050 1080
TCGCTGGTCC GATGGTCTGC ACCAGGCTGT GGAAGCGAAA GAAGGTGTGC AGATCCAGAA
1110 1140
CGAAAACCAA ACGCTGGCTT CGATCACCTT CCAGAACTAC TTCCGTCTGT ATGAAAAACT
1170 1200
GGCGGGGATG ACCGGTACTG CTGATACCGA AGCTTTCGAA TTTAGCTCAA TCTACAAGCT
1230 1260
GGATACCGTC GTTGTTCCGA CCAACCGTCC AATGATTCGT AAAGATCTGC CGGACCTGGT
1290 1320
CTACATGACT GAAGCGGAAA AAATTCAGGC GATCATTGAA GATATCAAAG AACGTACTGC
1350 1380
GAAAGGCCAG CCGGTGCTGG TGGGTACTAT CTCCATCGAA AAATCGGAGC TGGTGTCAAA
1410 1440
CGAACTGACC AAAGCCGGTA TTAAGCACAA CGTCCTGAAC GCCAAATTCC ACGCCAACGA
1470 1500
AGCGGCGATT GTTGCTCAGG CAGGTTATCC GGCTGCGGTG ACTATCGCGA CCAATATGGC
1530 1560
GGGTCGTGGT ACAGATATTG TGCTCGGTGG TAGCTGGCAG GCAGAAGTTG CCGCGCTGGA
1590 1620
AAATCCGACC GCAGAGCAAA TTGAAAAAAT TAAAGCCGAC TGGCAGGTAC GTCACGATGC
1650 1680
GGTACTGGAA GCAGGTGGCC TGCATATCAT CGGTACCGAG CGTCACGAAT CCCGTCGTAT
1710 1740
CGATAACCAG TTGCGCGGTC GTTCTGGTCG TCAGGGGGAT GCTGGTTCTT CCCGTTTCTA
1770 1800
CCTGTCGATG GAAGATGCGC TGATGCGTAT TTTTGCTTCC GACCGAGTAT CCGGCATGAT
1830 1860
GCGTAAACTG GGTATGAAGC CAGGCGAAGC CATTGAACAC CCGTGGGTGA CTAAAGCGAT
1890 1920
TGCCAACGCC CAGCGTAAAG TTGAAAGCCG TAACTTCGAC ATTCGTAAGC AACTGCTGGA
1950 1980
ATATGATGAC GTGGCTAACG ATCAGCGTCG CGCCATTTAC TCCCAGCGTA ACGAACTGTT
2010 2040
GGATGTCAGC GATGTGAGCG AAACCATTAA CAGCATTCGT GAAGATGTGT TCAAAGCGAC
2070 2100
CATTGATGCC TACATTCCAC CACAGTCGCT GGAAGAAATG TGGGATATTC CGGGGCTGCA
2130 2160
GGAACGTCTG AAGAACGATT TCGACCTCGA TTTGCCAATT GCCGAGTGGC TGGATAAAGA
2190 2220
ACCAGAACTG CATGAAGAGA CGCTGCGTGA GCGCATTCTG GCGCAGTCCA TCGAAGTGTA
2250 2280
TCAGCGTAAA GAAGAAGTGG TTGGTGCTGA GATGATGCGT CACTTCGAGA AAGGCGTCAT
2310 2340
GCTGCAAACG CTTGACTCCC TGTGGAAAGA GCACCTGGCA GCGATGGACT ATCTGCGTCA
2370 2400
GGGTATCCAC CTGCGTGGCT ACGCACAGAA AGATCCGAAG CAGGAATACA AACGTGAATC
2430 2460
GTTCTCCATG TTTGCAGCGA TGCTGGAGTC GTTGAAATAT GAAGTTATCA GTACGCTGAG
2490 2520
CAAAGTTCAG GTACGTATGC CTGAAGAGGT TGAGGAGCTG GAACAACAGC GTCGTATGGA
2550 2580
AGCCGAGCGT TTAGCGCAAA TGCAGCAGCT TAGCCATCAG GATGACGACT CTGCAGCCGC
2610 2640
AGCTGCACTG GCGGCGCAAA CCGGAGAGCG CAAAGTAGGA CGTAACGATC CTTGCCCGTG
2670 2700
CGGTTCTGGT AAAAAATACA AGCAGTGCCA TGGCCGCCTG CAATAATCTA GAAC
2730
【００６７】
配列番号：５
配列の長さ：１３６８
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸
配列
CGTCTAGACT GGCGGTAAAA TCGAGGAATA AGTAGCAGAT GGCTAAACAA CCGGGATTAG
30 60
ATTTTCAAAG TGCCAAAGGT GGCTTAGGCG AGCTGAAACG CAGACTGCTG TTTGTTATCG
90 120
GTGCGCTGAT TGTGTTCCGT ATTGGCTCTT TTATTCCGAT CCCTGGTATT GATGCCGCTG
150 180
TACTTGCCAA ACTGCTTGAG CAACAGCGAG GCACCATCAT TGAGATGTTT AACATGTTCT
210 240
CTGGTGGTGC TCTCAGCCGT GCTTCTATCT TTGCTCTGGG GATCATGCCG TCGGCGTCGA
270 300
TCATTATCCA GCTGCTGACG GTGGTTCACC CAACGTTGGC AGAAATTAAG AAAGAAGGGG
330 360
AGTCTGGTCG TCGTAAGATC AGCCAGTACA CCCGCTACGG TACCCTGGTG CTGGCAATAT
390 420
TCCAGTCGAT CGGTATTGCT ACCGGTCTGC CGAATATGCC TGGTATGCAA GGCCTGGTGA
450 480
TTAACCCGGG CTTTGCATTC TACTTCACCG CTGTTGTAAG TCTGGTCACA GGAACCATGT
510 540
TCCTGATGTG GTTGGGCGAA CAGATTACTG AACGAGGTAT CGGCAACGGT ATTTCAATCA
570 600
TTATCTTCGC CGGTATTGTC GCGGGACTCC CGCCAGCCAT TGCCCATACT ATCGAGCAAG
630 660
CGCGTCAAGG CGACCTGCAC TTCCTCGTGT TGCTGTTGGT TGCAGTATTA GTATTTGCAG
690 720
TGACGTTCTT TGTTGTATTT GTTGAGCGTG GTCAACGCCG CATTGTGGTA AACTACGCGA
750 780
AACGTCAGCA AGGTCGTCGT GTCTATGCTG CACAGAGCAC ACATTTACCG CTGAAAGTGA
810 840
ATATGGCGGG GGTAATCCCG GCAATCTTCG CTTCCAGTAT TATTCTGTTC CCGGCGACCA
870 900
TCGCGTCATG GTTCGGGGGC GGTACTGGTT GGAACTGGCT GACAACAATT TCGCTGTATT
930 960
TGCAGCCTGG GCAACCGCTT TATGTGTATG CGTCTGCAAT CATCTTCTTC TGTTTCTTCT
990 1020
ACACGGCGTT GGTTTTCAAC CCGCGTGAAA CAGCAGATAA CCTGAAGAAG TCCGGTGCAT
1050 1080
TTGTACCAGG AATTCGTCCG GGAGAGCAAA CGGCGAAGTA TATCGATAAA GTAATGACCC
1110 1140
GCCTGACCCT GGTTGGTGCG CTGTACATTA CCTTTATCTG CCTGATCCCG GAGTTCATGC
1170 1200
GTGATGCAAT GAAAGTACCG TTCTACTTCG GTGGGACCTC ACTGCTTATC GTTGTTGTCG
1230 1260
TGATTATGGA CTTTATGGCT CAAGTGCAAA CTCTGATGAT GTCCAGTCAG TATGAGTCTG
1290 1320
CATTGAAGAA GGCGAACCTG AAAGGCTACG GCCGATAAGC GGCCGCCC
1350
【００６８】
配列番号：６
配列の長さ：４３１
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸
配列
GGGCGGCCGC TTTGTAGAAA ACTTCTGACA GGTTGGTTTA TGAGTGCGAA TACCGAAGCT
30 60
CAAGGAAGCG GGCGCGGCCT GGAAGCGATG AAGTGGGTCG TTGTGGTGGC ATTGCTCCTG
90 120
GTGGCGATTG TCGGCAACTA CCTTTATCGC GACATTATGC TGCCGCTGCG TGCGCTGGCC
150 180
GTAGTAATTC TGATTGCTGC AGCGGGTGGT GTCGCGCTGT TAACGACAAA AGGTAAAGCT
210 240
ACCGTTGCTT TTGCCCGTGA AGCGCGTACC GAAGTCCGTA AGGTCATTTG GCCGACTCGC
270 300
CAGGAAACAT TGCACACCAC GCTGATTGTG GCTGCGGTTA CCGCAGTAAT GTCACTGATC
330 360
CTGTGGGGAC TGGATGGTAT TCTGGTTCGC CTGGTATCCT TTATCACTGG CCTGAGGTTC
390 420
TGAATGCATT G
【図１】 ４７Ｋ及び４７Ｃ２の反応性を示す図であ
る。
る。
【図２】 発現ベクターｐＷ６Ａの詳細図である。
【図３】（ａ）発現ベクターｐＷ６Ａ−１７Ｋの詳細図
である。 （ｂ）発現ベクターｐＷ６Ａ−４７Ｋの詳細図である。 （ｃ）発現ベクターｐＷ６Ａ−１７Ｋ−ＳｅｃＧ−Ｓｅ
ｃＡ−ｐｒｌＡ４−ＳｅｃＥの詳細図である。 （ｄ）発現ベクターｐＷ６Ａ−４７Ｋ−ＳｅｃＧ−Ｓｅ
ｃＡ−ｐｒｌＡ４−ＳｅｃＥの詳細図である。
である。 （ｂ）発現ベクターｐＷ６Ａ−４７Ｋの詳細図である。 （ｃ）発現ベクターｐＷ６Ａ−１７Ｋ−ＳｅｃＧ−Ｓｅ
ｃＡ−ｐｒｌＡ４−ＳｅｃＥの詳細図である。 （ｄ）発現ベクターｐＷ６Ａ−４７Ｋ−ＳｅｃＧ−Ｓｅ
ｃＡ−ｐｒｌＡ４−ＳｅｃＥの詳細図である。
【図４】 １７Ｋにおける組み換え抗原と分泌関連酵素
を同時に発現した場合の効果を示す図である。
を同時に発現した場合の効果を示す図である。
【図５】 ４７Ｋにおける組み換え抗原と分泌関連酵素
を同時に発現した場合の効果を示す図である。
を同時に発現した場合の効果を示す図である。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ
(Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19
Ｃ１２Ｒ 1:19） Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ
(56)参考文献 特開 平９−235298（ＪＰ，Ａ)
特開 平９−234071（ＪＰ，Ａ)
Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，Ｖｏ
ｌ．61，Ｎｏ．４（1993）ｐ．1202−
1210
Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，Ｖｏ
ｌ．60，Ｎｏ．４（1992）ｐ．1568−
1576
Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏ
ｌ．12，Ｎｏ．２（1994）ｐ．178−180
(58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名)
ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
ＰｕｂＭｅｄ
ＪＳＴＰｌｕｓ（ＪＯＩＳ)
Claims (8)
- 【請求項１】 梅毒トレポネマの表面抗原のＮ末端に脂
質を付加する機能を有するシグナルペプチドが付加した
前記梅毒トレポネマの表面抗原をコードするＤＮＡ断片
とＳｅｃＡをコードするＤＮＡ断片とが融合された融合
ＤＮＡ。 - 【請求項２】 ＳｅｃＡをコードするＤＮＡ断片の５’
末端側にＳｅｃＧをコードするＤＮＡ断片を融合した請
求項１に記載の融合ＤＮＡ 。 - 【請求項３】 ＳｅｃＹ及びＳｅｃＥをコードするＤＮ
Ａ断片がＳｅｃＡをコードするＤＮＡ断片の３’末端側
に融合した請求項１又は２に記載の融合ＤＮＡ。 - 【請求項４】 シグナルペプチドが付加した梅毒トレポ
ネマの表面抗原、ＳｅｃＧ，ＳｅｃＡ、ＳｅｃＹ及びＳ
ｅｃＥのそれぞれをコードするＤＮＡが、前記順番に融
合された融合ＤＮＡ。 - 【請求項５】 梅毒トレポネマの表面抗原が分子量１５
ｋＤａ、１７ｋＤａ及び４７ｋＤａから選ばれた抗原で
ある請求項１又は４に記載の融合ＤＮＡ。 - 【請求項６】 梅毒トレポネマの表面抗原が分子量１７
ｋＤａの抗原である請求項１又は４に記載の融合ＤＮ
Ａ。 - 【請求項７】 梅毒トレポネマの表面抗原が分子量４７
ｋＤａの抗原である請求項１又は４に記載の融合ＤＮ
Ａ。 - 【請求項８】 請求項１乃至７のいずれかに記載の融合
ＤＮＡを用いて梅毒トレポネマ抗原を発現する方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP36763897A JP3536635B2 (ja) | 1997-12-29 | 1997-12-29 | 融合ｄｎａ及び該融合ｄｎａを用いて梅毒トレポネマ抗原を発現する方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP36763897A JP3536635B2 (ja) | 1997-12-29 | 1997-12-29 | 融合ｄｎａ及び該融合ｄｎａを用いて梅毒トレポネマ抗原を発現する方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH11192089A JPH11192089A (ja) | 1999-07-21 |
| JP3536635B2 true JP3536635B2 (ja) | 2004-06-14 |
Family
ID=18489821
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP36763897A Expired - Fee Related JP3536635B2 (ja) | 1997-12-29 | 1997-12-29 | 融合ｄｎａ及び該融合ｄｎａを用いて梅毒トレポネマ抗原を発現する方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3536635B2 (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP5348361B2 (ja) * | 2001-08-24 | 2013-11-20 | 株式会社シノテスト | タンパク質の担体への固定化方法、タンパク質を固定化した担体及びタンパク質を固定化した担体を用いた被検物質の測定試薬 |
| JP7274680B2 (ja) | 2021-06-07 | 2023-05-17 | 株式会社セテカ | 梅毒トレポネーマ菌の表面抗原の混合物を用いる、抗梅毒トレポネーマ体液抗体の測定 |
-
1997
- 1997-12-29 JP JP36763897A patent/JP3536635B2/ja not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１２，Ｎｏ．２（１９９４）ｐ．１７８−１８０ |
| Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，Ｖｏｌ．６０，Ｎｏ．４（１９９２）ｐ．１５６８−１５７６ |
| Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，Ｖｏｌ．６１，Ｎｏ．４（１９９３）ｐ．１２０２−１２１０ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH11192089A (ja) | 1999-07-21 |
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