DE69928236T2

DE69928236T2 - Peptid für die diagnose von schizophrenie

Info

Publication number: DE69928236T2
Application number: DE69928236T
Authority: DE
Inventors: Meir Shinitzky; Michael Deckmann
Original assignee: Yeda Research and Development Co Ltd
Current assignee: Yeda Research and Development Co Ltd
Priority date: 1998-04-02
Filing date: 1999-03-30
Publication date: 2006-08-03
Anticipated expiration: 2019-03-31
Also published as: IL138746A; EP1068303B1; WO1999051725A2; HK1030966A1; AR014811A1; WO1999051725A3; CN1171995C; BR9909308A; EP1068303A2; US7098304B1; ATE309335T1; CA2324380A1; CN1300320A; TW581812B; JP4364433B2; JP2002510712A; AU3165599A; DE69928236D1; BR9909308B1; CA2324380C

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein das Gebiet von Tests für die Diagnose von mentalen Störungen. Genauer stellt die vorliegende Erfindung einen Test für die Diagnose von Schizophrenie bereit.
Stand der Technik
Das Folgende ist eine Liste von Veröffentlichungen gemäß dem Stand der Technik, auf die in der vorliegenden Beschreibung verwiesen wird.

1. Carpenter W.T. und Buchanan R.W., Review, N. Engl. J. Med. 330 (1994), 681-690.
2. Knight J.G., Find. Exp. Clin. Pharmacol. 6 (1984), 395-408.
3. De Lisi L.E. und Crow T.J., Psychiatr. Clin. North Am. 9 (1987), 115-132.
4. Ganguli R., Rabin B.S., Kelly R.H., Lyte M. und Ragu U., Ann. N.Y. Acad. Sci. 496 (1987), 676-690.
5. Shinitzky M., Deckmann M., Kessler A., Sirota P., Rabbs A. und Elizur A., Ann. N.Y. Acad. Sci. 621 (1991), 205-217.
6. Deckmann M., Shinitzky M., Leykin I., Cheng D., Guy J., Avnon M., Salganik I., Amiri Z., Schlossberg A., Leibu E. und Rafael C., The Italian J. Psychiatr. Behav. Sci. 6 (1996), 29-34.,
7. PCT-Patentanmeldung Veröffentlichungsnummer WO 95/23970.
8. Vermuyten et al., Clinica Chimica Acta 187 (1990), 69-78.

Die vorstehenden Veröffentlichungen werden nachfolgend durch Angabe ihrer Nummer aus der obigen Liste anerkannt.
Hintergrund der Erfindung
Schizophrenie ist ein Syndrom, das eine Vielzahl von mentalen Symptomen wie akustische Halluzinationen, Paranoia, Wahnvorstellungen, Katatonie, bizarres Verhalten oder Gefühlsverarmung umfaßt. Schizophrenie befällt etwa 1 % der Ge samtbevölkerung, und die dadurch verursachten ökonomischen sowie sozialen Belastungen der Gesellschaft sind beträchtlich. Der Ausbruch der Krankheit erfolgt in einem frühen Alter, und folglich bedürfen die Patienten typischerweise einer lebenslangen medizinischen und psychiatrischen Überwachung. Schizophrenie wird deshalb als eine der kostenintensivsten Krankheiten in der industriellen Welt eingestuft¹.
Es gibt verschiedene bekannte Risikofaktoren, welche mit Schizophrenie assoziiert sind, wie genetische Veranlagung, die Geburt während des Winters und Komplikationen während der Schwangerschaft und Entbindung. Virusinfektionen und nachfolgende Autoimmunreaktionen sind ebenfalls als mögliche auslösende Faktoren angenommen worden^2-4. Die Beteiligung von Autoantikörpern gegen Thrombocyten in Schizophreniepatienten wurde ebenfalls nachgewiesen, da erhöhte Spiegel von Autoantikörpern in Schizophrenie- und Demenzpatienten im Vergleich zu Kontrollindividuen, bipolaren, gemütskranken, persönlichkeitsgestörten oder schizoaffektiven Patienten nachgewiesen wurden^5-6. Eine Western-Blot-Analyse zeigte ein Muster von Thrombocyten-Antigenen auf, die von Autoantikörpern erkannt werden, welche von Schizophreniepatienten erhalten wurden, wobei sich diese Antigene von denjenigen unterschieden, die von Autoantikörpern erkannt werden, welche von Patienten erhalten wurden, die an Autoimmunthrombocytopenie und Demenz litten⁷. Das Antigen, an das die von Schizophreniepatienten erhaltenen Autoantikörper spezifisch banden, ist durch sein Molekulargewicht charakterisiert worden. Außerdem konnten unter Verwendung eines ELISAs erhöhte Spiegel einer neuronenspezifischen Enolase in der Cerebrospinalflüssigkeit von Patienten mit neurologischen Störungen, z.B. Schizophrenie, nachgewiesen werden⁸.
Zusammenfassung der Erfindung
Im Einklang mit der Erfindung sind mehrere Proteine identifiziert worden, die Autoantikörper binden, die in erhöhten Spiegeln in Körperflüssigkeiten von Schizophreniepatienten nachgewiesen werden. Die Antikörper, welche an diese Proteine binden, sind typischerweise mit Thrombocyten assoziierte Autoantikörper (PAAs). Es wurde gezeigt, daß solche Autoantikörper, die von schizophrenen Patienten erhalten wurden (nachstehend "von Schizophrenen stammende Antikörper – SDAs") an die vorstehenden Antigene binden, während Autoantikörper, die von nicht schizophrenen Kontrollindividuen erhalten wurden (nachstehend "von Nichtschizophrenen stammende Antikörper – NSDAs") nicht daran banden.
Die Proteine, für welche gezeigt wurde, daß sie zur Bindung von SDAs befähigt sind, wurden identifiziert und durch chemische und enzymatische Methoden weiter charakterisiert. Einige der identifizierten immunreaktiven Proteine sind bekannte Proteine wie Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase (G3PD), Enolase, Keratin, Hepatocyten-Wachstumsfaktor, auf extrazelluläres Calcium ansprechender Rezeptor und mehrere andere. Die Spaltung des Kaninchenproteins Enolase ergab ein immunologisch aktives Peptid, das eine hohe Bindungsaktivität gegenüber SDAs aufwies.
Das erhaltene Peptid, welches dem immunologisch aktiven Epitop des Enolaseproteins entspricht, besteht aus 28 Aminosäuren in der folgenden Reihenfolge:
SGETEDTFIADLVVGLCTGQIKTGAPCR (SEQ ID NO:1)
Basierend auf dem erhaltenen Peptid wurden weitere Peptide synthetisiert, und hochaktive Peptide (d.h. solche, die eine hohe Bindungsaktivität gegenüber SDAs im Vergleich zu einer sehr geringen Bindungsaktivität gegenüber NSDAs zeigten oder die überhaupt nicht an NSDAs binden) wurden identifiziert. Außerdem waren die synthetisierten aktiven Peptide zum ersten Mal in der Lage, zwischen von Schizophreniepatienten erhaltenen Plasmaproben und von nicht schizophrenen Kontrollindividuen erhaltenen Plasmaproben zu unterscheiden.
Die weitere Analyse eines der synthetisierten hochaktiven Peptide (SEQ ID NO:2) zeigte, daß dieses Peptid mit Hilfe von zwei Cysteinresten einen Ring und über den verbleibenden freien Cysteinrest ein Dimer bildet. Diese Form des Peptids ist im Hinblick auf seine Fähigkeit zur Bindung von SDAs am aktivsten.
Wie nachstehend beschrieben, scheint das Antigenepitop der synthetischen hochaktiven Peptide der Erfindung ein räumliches dreidimensionales Epitop zu sein. Die Erfindung stellt ein Peptid bereit, das befähigt ist, an Antikörper zu binden, die in erhöhten Spiegeln in Körperflüssigkeiten von Schizophreniepatienten nachgewiesen werden, umfassend eine Aminosäuresequenz gewählt aus der Gruppe bestehend aus:

(i) LVVGLCTCQIKTGPAC (SEQ ID NO:2);
(ii) LVVGLCTGQIKTGPACR (SEQ ID NO:7); oder
(iii) LVVGLCTPQIKTGPACR (SEQ ID NO:8).

Durch eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung wird ein Peptid bereitgestellt, das befähigt ist, Antikörper zu binden, die in erhöhten Spiegeln in Körperflüssigkeiten von Schizophreniepatienten nachgewiesen werden, wobei das Peptid gewählt ist aus der Gruppe bestehend aus:

(i) SGETEDTFIADLVVGLCTGQIKTGAPCR (SEQ ID NO:1);
(ii) LVVGLCTCQIKTGPAC (SEQ ID NO:2);
(iii) IADLVVGLCTGQIKTGAPCR (SEQ ID NO:3);
(iv) ADLVVGLCTGQIKTGAPCR (SEQ ID NO:4);
(v) DLVVGLCTGQIKTGAPCR (SEQ ID NO:5);
(vi) LVVGLCTGQIKTGAPCR (SEQ ID NO:6);
(vii) LVVGLCTGQIKTGPACR (SEQ ID NO:7); oder
(viii) LVVGLCTPQIKTGPACR (SEQ ID NO:8).

Die Buchstaben, welche vorstehend (und nachstehend) verwendet werden, um eine spezifische As zu bezeichnen, entsprechen den von der IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commission empfohlenen Ein-Buchstaben-Aminosäure (As)-Symbolen.
Ohne an eine Theorie gebunden zu sein, ist auf der Grundlage der im Einklang mit der Erfindung erhaltenen Ergebnisse deutlich geworden, daß die Struktur des Antigenepitops der Peptide, an das SDAs in einem wesentlich höheren Ausmaß im Vergleich zu NSDAs binden können, ein dreidimensionales Epitop darstellt. Unter Verwendung eines Computerprogramms auf der Grundlage von Berechnungen der Minimalenergie wird für das Antigenepitop eines erfindungsgemäßen Peptids eine cyclische Struktur vorhergesagt, die einen hydrophoben Kern und eine Extension mit etwa zwei positiven Ladungen umfaßt. Die positiv geladenen Extensionen können in einer von vielen möglichen räumlichen Orientierungen angeordnet sein.
Die Bindungsaktivität des erfindungsgemäßen Peptids gegenüber verschiedenen Antikörpern kann durch irgendeine der per se bekannten Methoden wie einen ELISA oder ein Western-Blot-Verfahren bestimmt werden. Zum Beispiel kann ein getestetes Peptid auf seine Bindungsaktivität gegenüber Antikörpern untersucht werden, indem es einer Polyacrylamid-Gelelektrophorese unterzogen und durch ein Blot-Verfahren auf PVDS-Membranen aufgebracht wird, die dann mit SDAs umgesetzt werden, wobei deren Reaktion mit NSDAs verglichen wird.
Das Ausmaß der Bindung der erfindungsgemäßen Peptide an PAAs kann unter Verwendung irgendeines auf dem Fachgebiet bekannten Nachweissystems wie Antikörper gegen menschliches Immunglobulin oder Fragmente davon, gebunden an einen nachweisbaren Marker, bestimmt werden. Der Marker kann eine radioaktive Gruppe; eine fluoreszierende Gruppe; ein Enzym, das befähigt ist, eine Reaktion zu katalysieren, die ein nachweisbares Produkt ergibt; eine Biotingruppe, die durch Avidin nachgewiesen werden kann; etc. sein.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform dieses Aspekts werden die erfindungsgemäßen Peptide an einen festen Träger wie z.B. eine PVDF-Membran gebunden und mit der getesteten Probe umgesetzt, und das Ausmaß der Bindung der PAAs in der Probe wird unter Verwendung eines anti-Mensch-Fc-Antikörpers, der an einen nachweisbaren Marker konjugiert ist, bestimmt.
Im Einklang mit einer besonderen Ausführungsform erfolgt die Bestimmung des an ein getestetes Peptid gebundenen Anteils der Autoantikörper unter Verwendung eines anti-Mensch-Fc's, das an Meerrettichperoxidas (SIGMA) konjugiert ist, sowie von Fast-DAB^TM (SIGMA) oder 4-Chlornaphthol (SIGMA) als das Farbreagens.
Damit die Bindung des getesteten erfindungsgemäßen Peptids an einen SDA als "wesentlich höher" als dessen Bindung an einen NSDA angesehen werden kann, sollte das Ausmaß der Bindung an einen SDA statistisch signifikant höher sein als dessen Bindung an einen NSDA, wie durch irgendeine der auf dem Fachgebiet bekannten statistischen Methoden (z.B. den Student-t-Test) bestimmt wird, die in Verbindung mit den durch die vorstehend erwähnten experimentellen Methoden erhaltenen Ergebnissen angewendet werden.
Das erfindungsgemäße Peptid kann durch enzymatische Spaltung (z.B. unter Verwendung von Clostrapain) oder chemische (CNBr) Spaltung eines längeren Proteins erhalten werden. In einem solchen Fall werden die erhaltenen Peptide durch auf dem Fachgebiet bekannte Methoden wie durch RP-HPLC aufgetrennt, und die aufgetrennten Peptide können dann zur Sequenzierung (z.B. durch Eurosequence BV (Nijenborgh 4, 9749 Gronigen, Niederlande)) verwendet und auf ihre Bindeeigenschaft gegenüber SDAs, wie vorstehend beschrieben, untersucht werden.
Die erfindungsgemäßen Peptide können auch durch auf dem Fachgebiet bekannte Methoden wie mit einem Abimed 522-Gerät in einem 10 μMol-Maßstab durch Eurosequence BV synthetisiert werden (vgl. die ausführliche Erläuterung in den nachstehenden Beispielen). Die Bindungsaktivität der neu synthetisierten Peptide wird unter Verwendung irgendeines der vorstehend erwähnten Tests bestimmt.
Die erfindungsgemäßen Peptide können zwischen einer Probe, die von einem Individuum erhalten wurde, das an Schizophrenie leidet, und einer Probe, die von einem nicht schizophrenen Individuum erhalten wurde, unterscheiden und sind daher für die Diagnose von Schizophrenie bei einem Individuum nützlich. So stellt die vorliegende Erfindung gemäß einem anderen Aspekt davon ein Peptid zur Verwendung für die Diagnose von Schizophrenie bei einem Individuum bereit, wobei das Peptid befähigt ist, Antikörper zu binden, die in erhöhten Spiegeln in Körperflüssigkeiten von Schizophreniepatienten nachgewiesen werden.
Die zu testende Probe des Individuums ist typischerweise eine PAAs enthaltende Fraktion einer Thrombocyten umfassenden Blutprobe. Jedoch ist es im Einklang mit der vorliegenden Erfindung zum ersten Mal möglich geworden, die Wahrscheinlichkeit für das Vorliegen von Schizophrenie in einer von getesteten Individuen erhaltenen Plasmaprobe zu bestimmen, ohne das zuerst die PAAs aus der Probe isoliert werden müssen. So kann im Einklang mit der vorliegenden Erfindung die zu testende Probe eines Individuums entweder eine Plasmaprobe oder eine PAAs enthaltende Fraktion, die durch irgendeine der auf dem Fachgebiet bekannten Methoden daraus erhalten wird (z.B. durch das Erhalten eines an Thrombocyten reichen Plasmas (PRP) und das Isolieren der PAAs daraus), sein.
Da die erfindungsgemäßen Peptide befähigt sind, in einem unterschiedlichen Ausmaß an von Thrombocyten stammende Autoantikörper in einer Probe, die von einem Schizophreniepatienten erhalten wurde, im Vergleich zu einer Probe, die von einem nicht schizophrenen Kontrollindividuum erhalten wurde, zu binden, können die Peptide für die Herstellung einer diagnostischen Zusammensetzung zur Diagnose von Schizophrenie bei einem Individuum verwendet werden. Eine solche Diagnose von Schizophrenie bei einem Individuum könnte die folgenden Schritte umfassen:

(a) das Erhalten einer Probe von dem Individuum, wobei die Probe eine Blutprobe, eine Thrombocyten enthaltende Fraktion davon oder eine Fraktion, enthaltend mit Thrombocyten assoziierte Antikörper (PAAs), die von den Thrombocyten abfallen, ist;
(b) das Inkontaktbringen der Probe mit einem Peptid, das befähig ist, an Antikörper zu binden, die in erhöhten Spiegeln in Körperflüssigkeiten von Schizophreniepatienten nachgewiesen werden; und
(c) das Bestimmen des Ausmaßes der Bindung des Peptids an die Probe, wobei ein Ausmaß, das höher als das Ausmaß der Bindung des Peptids an eine Probe von nicht schizophrenen Individuen ist, anzeigt, daß für das Individuum eine hohe Wahrscheinlichkeit besteht, an Schizophrenie zu leiden.

Folglich betrifft die vorliegende Erfindung auch die Verwendung eines Peptids, umfassend eine oder bestehend aus einer As-Sequenz, gewählt aus der Gruppe bestehend aus

Die vorliegende Erfindung stellt auch einen Kit bereit, welcher bei der vorstehenden Diagnose nützlich ist. Der erfindungsgemäße Kit umfaßt einen Träger, umfassend ein oder mehrere darauf immobilisierte erfindungsgemäße Peptide, und einen anti-Mensch-Immunglobulin-Antikörper oder ein Fragment davon. Der anti-HIG-Antikörper kann an einen nachweisbaren Marker konjugiert sein, oder der Kit kann alternativ auch einen zweiten Typ von Antikörpern, welcher gegen die ersten Antikörper gerichtet sind, umfassen, wobei die zweiten Antikörper an einen nach weisbaren Marker konjugiert sind. Der Kit umfaßt auch verschiedene Reagenzien, welche für die Durchführung des Tests erforderlich sind, sowie Gebrauchsanweisungen.
Die Erfindung wird nun in der folgenden, nicht begrenzenden Beschreibung der spezifischen Ausführungsformen und der beigefügten Zeichnungen veranschaulicht.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 ist eine graphische Darstellung, welche die Bindungsaktivität des Peptids 14 mit SEQ ID NO:2 gegenüber PAAs zeigt, die aus Proben, erhalten von Schizophreniepatienten (1A) und nicht schizophrenen Individuen (1B), präpariert wurden. Das Peptid mit SEQ ID NO:9 wurde als Negativkontrolle verwendet.
2 ist eine graphische Darstellung, welche die Bindungsaktivität von Peptid 14 (SEQ ID NO:2) gegenüber Plasmaproben zeigt, die von Schizophreniepatienten (2A) und nicht schizophrenen Individuen (2B) erhalten wurden. Das Peptid mit SEQ ID NO:9 wurde als Negativkontrolle verwendet.
3 ist eine graphische Darstellung, welche eine schematisch vorhergesagte, dreidimensionale Struktur des Antigenepitops der erfindungsgemäßen Peptide, bestimmt mittels einem Computerprogramm auf der Grundlage von Berechnungen der Minimalenergie, zeigt.
4 ist eine Röntgenaufnahme einer dreidimensionalen Struktur von Enolase, welche aus einer öffentlich zugänglichen Peptiddatenbank abgeleitet und mit dem Wassermodell der erfindungsgemäßen Peptide verglichen wurde.
Die in dem Epitop vorkommenden Aminosäuren sind wie folgt gekennzeichnet:

L: = Leucin
A: = Alanin
P: = Prolin
R: = Arginin
K: = Histidin

Beispiele
Materialien und Methoden
1. Thrombocyten und anti-Thrombocyten-Autoantikörper
Venöses Blut (20 ml) wurde mit Heparin als Antikoagulans von Patienten und Kontrollindividuen erhalten. Das an Thrombocyten reiche Plasma (PRP) wurde durch Zentrifugation (100 × g für 20 min) bei Raumtemperatur erhalten. Die plasmafreien Thrombocyten wurden durch dreimaliges Waschen mit phosphatgepufferter Salzlösung (PBS), supplementiert mit 10 ml mM EDTA als Antikoagulans, erhalten (4000 × g; 15 min; 4°C). Für die Isolierung der anti-Thrombocyten-Antikörper wurden die Thrombocyten mit 0,1 M Glycin/10 mM EDTA, pH 2,8, für 10 min bei Raumtemperatur inkubiert und dann zentrifugiert (4000 × g; 15 min; 4°C). Der Überstand, enthaltend die anti-Thrombocyten-Antikörper, wurde mit einer gesättigten Na₂PO₄-Lösung neutralisiert und bis zum Gebrauch bei –20°C gelagert.
2. Präparative isoelektrische Fokussierung
Thrombocytenkonzentrate der Blutgruppe 0 wurden von einer örtlichen Blutbank bezogen und drei- bis fünfmal mit PBS/10 mM EDTA gewaschen (4000 × g; 15 min; 4°C), bis der Überstand frei von Plasma war. Die Thrombocyten (etwa 20 Konzentrate) wurden zuerst unter vorsichtigem Schütteln mit 20 ml 0,5% Triton X-100/0,5% NP40 in Wasser für 15 min bei Raumtemperatur solubilisiert. Die Suspension wurde zentrifugiert (10.000 × g; 15 min; 4°C), der Überstand wurde entfernt, und das Pellet wurde noch zweimal mit 0,1% Triton X-100 in Wasser extrahiert. Die drei Überstände wurden vereinigt, und Ampholyte^TM 3/10 (BioRad) wurde bis zu einer Endkonzentration von 1 % zugesetzt. Diese Lösung wurde in die ROTOFOR^TM-Kammer (Fassungsvermögen 60 ml) eingebracht, und die präparative isoelektrische Fokussierung wurde dann gemäß der Betriebsanleitung des Herstellers (BioRad) durchgeführt. Typischerweise war die Fokussierung nach 4,5 h abgeschlossen (10°C; 10 Watt Dauerleistung). 20 Fraktionen wurden gesammelt, und der pH-Wert der Fraktionen wurde bestimmt (pH-Gradient von 1,5-12). Die Fraktionen wurden bis zur weiteren Verwendung bei –20°C gelagert.
3. Identifizierung von immunreaktiven Fraktionen
Die Fraktionen wurden durch eine Polyacrylamid (10%)-Gelelektrophorese, das Übertragen der Proteine durch ein Blot-Verfahren auf PVDF-Membranen und das Untersuchen der Membran mit 1 ml Autoantikörper in 50 ml Inkubationspuffer als Sonde auf Immunreaktivität analysiert. Ein anti-Mensch-Fc, konjugiert an Meerrettichperoxidase (Ziege), von SIGMA (1:500-Verdünnung) und Fast-DAB^TM (SIGMA) oder 4-Chlornaphthol (SIGMA) wurden als Farbreagens verwendet, um gebundene Mensch-anti-Thrombocyten-Antikörper nachzuweisen. Eine Immunreaktivität wurde in den Fraktionen mit einem pH im Bereich von 6,0 bis 10,0 beobachtet.
4. Präparative Polyacrylamid (8%)-Gelelektrophorese
Die immunreaktiven Fraktionen (pH 6-10) wurden vereinigt und in einem präparativen SDS-Polyacrylamidgel (8% und 8 cm hoch) in einer PrepCell von BioRad gemäß der Betriebsanleitung des Herstellers unter reduzierenden Bedingungen nach dem Molekulargewicht aufgetrennt. Fraktionen (n = 400) von 1,5 ml wurden gesammelt; jede zehnte Fraktion wurde durch eine SDS-Gelelektrophorese, gefolgt durch eine Silberfärbung zur Bestimmung der Gewichtsverteilung in den 400 Fraktionen, analysiert.
5. Identifizierung von immunreaktiven Fraktionen
Jede fünfte Fraktion (0,1 ml) wurde durch das Dot-Blot-Verfahren unter Verwendung der Dot-Blot-Vorrichtung (96 Vertiefungen) von BioRad auf PVDF-Membranen aufgetragen. Die immunreaktiven Fraktionen wurden dann, wie vorstehend beschrieben (1.3), nachgewiesen.
6. Identifizierung von immunreaktiven Proteinen
Wie bereits beschrieben, wurde eine Vielzahl von immunreaktiven Proteinen identifiziert. Priorität bei der Sequenzierung wurde Proteinen mit einem hohen Verhältnis von Reaktivität zu Proteinmenge gegeben. Die Herstellung der Probe erfolgte typischerweise in der folgenden Weise: Die Fraktionen (± 10) in der Umgebung einer positiven Fraktion wurden noch einmal analysiert, wie vorstehend unter 1.5 beschrieben wurde. Die positiven Fraktionen wurden vereinigt, gefriergetrocknet, noch einmal auf einem analytischen (0,75 mm) SDS-Polyacrylamid (10%)-Gel aufgetrennt und mit Coomassieblau gefärbt. Die Bande wurde ausgeschnitten und an Eurosequence BV geschickt (Enzymverdau, RP-HPLC-Trennung von Peptiden, gefolgt durch eine Aminosäuresequenzierung).
7. Identifizierung eines immunreaktiven Epitops
Zwei der identifizierten Proteine waren im Handel erhältlich:

a) Glycerinaldehyd-6-phosphat-Dehydrogenase (G6PD)
b) Enolase

Etwa 10 mg Protein wurden entweder enzymatisch (Clostrapain) oder chemisch (CNBr) gespalten, und die erhaltenen Peptide wurden mittels RP-HPLC aufgetrennt. Aliquots (20%) aller Fraktionen wurden von Eurosequence BV für eine Analyse auf eine Immunreaktivität, wie unter 1.5 beschrieben, an den Haupterfinder geschickt. Einzig das enzymatische Spaltprodukt der Enolase ergab ein aktives Fragment, das anschließend durch Eurosequence BV sequenziert wurde.
8. Peptidsynthese
Verschiedene Peptide wurden mit einem Abimed 522-Gerät in einem 10 μMol-Maßstab durch Eurosequence BV synthetisiert. Die Peptide wurden üblicherweise in 1 ml Wasser/DMF/DMSO (1:1:1; Vol./Vol./Vol.) gelöst. Die Peptide wurden in Linien punktförmig auf PVDF-Membranen aufgetragen und auf eine Immunreaktivität getestet, wie vorstehend beschrieben wurde.
9. Epitop-Durchmusterung
Wassermodelle der erfindungsgemäßen Peptide wurden auf einem Macintosh-Computersystem berechnet. Die dreidimensionale Röntgenstruktur von Enolase wurde aus einer öffentlich zugänglichen Peptiddatenbank abgeleitet, und die Oberfläche der Enolase wurde abgesucht, um Epitope zu finden, die mit den Epitopen der durch das Wassermodell berechneten Peptide übereinstimmen.
Beispiel 1: Identifizierung von immunreaktiven Proteinen
Die folgenden Proteine sind als befähigt zur Bindung von Autoantikörpern, die in hohen Spiegeln in Schizophreniepatienten vorhanden sind, in einem hohen Ausmaß, wie durch den vorstehend in 1.3 beschriebenen Test bestimmt wurde, identifiziert worden:
Protein:

Glycerinaldehyd-6-phosphat-Dehydrogenase
Enolase
Keratin
Hepatocyten-Wachstumsfaktor
Extrazelluläres Calcium erkennender Rezeptor

Die vorstehend identifizierten Proteine wurden auf ihre Bindeeigenschaft gegenüber Plasmaproben, die von Schizophreniepatienten erhalten wurden, und gegenüber Plasmaproben, die von nicht schizophrenen Kontrollpatienten erhalten wurden, getestet. Die Ergebnisse zeigten, daß es nicht möglich war, die vorstehenden Proteine für die Unterscheidung zwischen einer Plasmaprobe, die von einem Schizophreniepatienten erhalten wurde, und derjenigen, die von einem nicht schizophrenen Individuum erhaltene wurde, zu verwenden, d.h. die Bindungsergebnisse waren nicht schlüssig.
Die Bindungsaktivität der vorstehenden zwei Enzyme wurde dann durch das Umsetzen davon mit SDAs (präpariert aus Proben, die von Schizophreniepatienten erhalten wurden) und mit NSDAs (präpariert aus nicht schizophrenen Kontrollindividuen) getestet. Wie nachstehend in Tabelle 1 erkennbar ist, war in diesem Fall die Bindung der Proteine an SDAs wesentlich höher als ihre Bindung an NSDAs, wie durch die Anzahl der Proben, die mit jedem der Enzyme positiv reagierten, gezeigt wird. Tabelle 1 Reaktivität von Proteinen gegenüber SDAs und NSDAs
Die obigen Ergebnisse zeigten, daß die im Einklang mit der Erfindung erhaltenen Proteine bei der Diagnose von Schizophrenie in einem getesteten Individuum nützlich sein können, aber erfordern, daß die von dem Individuum erhaltene und getestete Probe präparierte Autoantikörper, die von Thrombocyten stammen, umfaßt. Die Enzyme sind nicht für den direkten Nachweis von Schizophrenie in einer Plasmaprobe geeignet.
Beispiel 2: Identifizierung des Epitops in den gespaltenen Proteinen welche zur spezifischen Bindung an SDAs befähigt sind
Zur Identifizierung des Epitops wurden eine chemische (CNBr) und eine enzymatische (Clostrapain) Spaltung von menschlicher G-3-P-Dehydrogenase und Kaninchen-Enolase verwendet. Einzig die enzymatische Spaltung der Enolase ergab ein Peptid, welches immunologisch aktiv war (Aminosäuren 372-399; das Peptid mit SEQ ID NO:2 in der folgenden Tabelle 2), d.h. befähigt war, in einem höheren Ausmaß an SDAs, verglichen mit seiner Fähigkeit zur Bindung an NSDAs, zu binden.
Basierend auf der Sequenz des in den gespaltenen Proteinen identifizierten Epitops wurde eine Reihe von Peptide durch das vorstehend in 1.8 beschriebene Verfahren synthetisiert. Die synthetisierten Peptide wurden dann auf ihre Bindungsaktivität gegenüber SDAs im Vergleich zu NSDAs, wie vorstehend beschrieben, untersucht.
Wie nachstehend in Tabelle 2 erkennbar ist, zeigten mehrere der synthetisierten Peptide eine wesentlich höhere Bindungsaktivität gegenüber SDAs im Vergleich zu ihrer Bindung an NSDAs (bezeichnet in der Tabelle als Ja), während andere keinen signifikanten Unterschied hinsichtlich ihrer Bindung an Proben von schizophrenen und nicht schizophrenen Individuen zeigten (bezeichnet in der Tabelle als Nein). Tabelle 2

* Nur für Vergleichszwecke.

Von den synthetisierten Peptiden zeigte das Peptid mit SEQ ID NO:2 die größte Fähigkeit zur Bindung an Antikörper, die in hohen Spiegeln in Schizophreniepatienten nachgewiesen werden.
Beispiel 3: Charakterisierung des Peptids mit SEQ ID NO:2
Eine Laser-Desorptionsmassenspektroskopie des Peptids von SEQ ID NO: 2 (umfassend drei Cysteinreste) direkt nach der Synthese zeigt das Vorhandensein eines Monomers ohne eine Ringbildung über die Cysteinreste. Jedoch bildet das Peptid nach dem Lösen des Peptids (etwa 4 mg) in 1 ml Wasser/DMF/DMSO (1:1:1; Vol./Vol./Vol.) und dem Stehenlassen der Lösung über Nacht bei Raumtemperatur einen Ring über zwei Cysteinreste und ein Dimer über den verbleibenden freien Cysteinrest. Es konnten keine höheren Polymere nachgewiesen werden. Beim Testen der Bindungsaktivität der zwei Formen des Peptids gegenüber SDAs wurde deutlich, daß die Dimerform des Peptids hinsichtlich der Bindung an SDAs viel aktiver als die Nicht-Dimerform war.
Durch eine chemische Analyse des Peptids durch Reduktion, z.B. durch Mercaptoethanol oder Natriumborhydrid, wurde die immunologische Aktivität vollständig aufgehoben, während eine Oxidation, z.B. durch Luft oder Sauerstoff, die immunologische Aktivität wiederherstellte.
Beispiel 4: Bindungsaktivität des Peptids von SEQ ID NO:2 gegenüber Proben von schizophrenen und nicht schizophrenen Individuen
Die Bindungsaktivität von Peptid 14 (SEQ ID NO:2) gegenüber isolierten PAAs wurde unter Anwendung des vorstehend beschriebenen Verfahrens getestet. Wie in 1A erkennbar ist, zeigte das vorstehende Peptid eine positive Bindung an sieben von acht PAAs, die von verschiedenen Schizophreniepatienten erhalten wurden. 1B zeigt, daß das vorstehende Peptid nicht an PAAs band, die von acht verschiedenen nicht schizophrenen Individuen erhalten wurden. Das Peptid mit SEQ ID NO:9 wurde als Negativkontrolle verwendet.
Anschließend wurde die Fähigkeit von Peptid 14 (SEQ ID NO:2) zur Bindung an SDAs in Plasmaproben, die von Schizophreniepatienten erhalten wurden, getestet. Wie in 2A erkennbar ist, zeigte dieses Peptid eine positive Bindung an vier von fünf SDAs aus verschiedenen Schizophreniepatienten. 2B zeigt, daß das vorstehende Peptid nicht an NSDAs aus 14 von 15 verschiedenen nicht schizophrenen Individuen band. Das Peptid mit SEQ ID NO:9 wurde als Negativkontrolle verwendet.
Beispiel 5: Dreidimensionale Struktur
Die dreidimensionale Struktur des Antigenepitops der erfindungsgemäßen Peptide wurde unter Verwendung eines Computerprogramms auf der Grundlage von Berechnungen der Minimalenergie vorhergesagt.
Wie in 3 erkennbar ist, ist die vorhergesagte Struktur des Antigenepitops eine cyclische Struktur, welche einen hydrophoben Kern und eine Extension, umfassend etwa zwei positive Ladungen, umfaßt. Die positiv geladenen Extensionen können in einer von vielen möglichen räumlichen Orientierungen angeordnet sein.
Beispiel 6: Abtasten der Oberfläche der Enolase zum Auffinden von Epitopen, die mit den berechneten Epitopen der Peptide übereinstimmen
Die dreidimensionale Struktur des Wassermodells der erfindungsgemäßen Peptide wurde berechnet. Eine dreidimensionale Röntgenstruktur von Enolase, abgeleitet aus einer öffentlich zugänglichen Peptiddatenbank, wurde dann abgetastet, und die Position der Aminosäuren der erfindungsgemäßen Peptide wurde mit der Position der Aminosäuren der Enolase-Oberfläche verglichen, um festzustellen, ob ein Epitop, das mit einem oder mehreren der berechneten Epitope der erfindungsgemäßen Peptide übereinstimmt, auf der Oberfläche der Enolase gefunden werden kann.
Wie in 4, die eine Computersimulation der Abtastung der Oberfläche der Enolase zeigt, erkennbar ist, wurde ein Epitop, bestehend aus einer Gruppe von hydrophoben Aminosäuren (Leucin, Alanin und Prolin), umgeben von positiv geladenen Aminosäuren (Arginin und Histidin), welches mit dem Epitop übereinstimmt, das für die erfindungsgemäßen Peptide simuliert wurde, auf der Oberfläche der Enolase gefunden. Somit konnte die vorhergesagte Struktur des Antigenepitops der erfindungsgemäßen Peptide tatsächlich auf der Zelloberfläche von Enolase nachgewiesen werden. SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Peptid, umfassend die Aminosäuresequenz: (i) LVVGLCTCQIKTGPAC (SEQ ID NO:2); (ii) LVVGLCTGQIKTGPACR (SEQ ID NO:7); oder (iii) LVVGLCTPQIKTGPACR (SEQ ID NO:8).
Peptid, bestehend aus: (i) SGETEDTFIADLVVGLCTGQIKTGAPCR (SEQ ID NO:1); (ii) LVVGLCTCQIKTGPAC (SEQ ID NO:2); (iii) IADLVVGLCTGQIKTGAPCR (SEQ ID NO:3); (iv) ADLVVGLCTGQIKTGAPCR (SEQ ID NO:4); (V) DLVVGLCTGQIKTGAPCR (SEQ ID NO:5); (vi) LVVGLCTGQIKTGAPCR (SEQ ID NO:6); (vii) LVVGLCTGQIKTGPACR (SEQ ID NO:7); oder (viii) LVVGLCTPQIKTGPACR (SEQ ID NO:8).
Verwendung eines Peptids, umfassend eine oder bestehend aus einer Aminosäuresequenz wie in Anspruch 2(i) bis (viii) definiert, für die Herstellung einer Zusammensetzung zum Diagnostizieren von Schizophrenie in einer Probe.
Verwendung gemäß Anspruch 3, wobei die von dem Individuum erhaltene Probe eine Gesamtblut-Probe ist.
Kit zur Verwendung in der Diagnose von Schizophrenie, umfassend: (i) einen Träger, umfassend ein oder mehrere darauf immobilisierte Peptide gemäß Anspruch 1 oder 2; und (ii) einen Anti-Mensch-Immunoglobulin-Antikörper oder ein Fragment davon, das die Bindeeigenschaften des gesamten Antikörpers behält, wobei der Antikörper oder das Fragment davon an einen nachweisbaren Marker konjugiert ist.
Peptid gemäß Anspruch 1 oder 2 oder Kit gemäß Anspruch 5, wobei das Peptid die Aminosäuresequenz LVVGLCTCQIKTGPAC (SEQ ID NO:2) hat.