TW581812B - Assay for the diagnosis of schizophrenia based on a new peptide - Google Patents

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581812 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明說明（1 ) 發明之範疇 一般而言，本發明係屬診斷精神異常之檢驗法之範嗔。 更特定而言，本發明提供一種診斷精神分裂症之檢驗法。 先前技術 下列爲本説明書所參考之先前技藝刊物之一覽表： 1· Carpenter，W.T·, and Buchanan，R.W·，Review，N. Engl. J· Med.， 330681-690, 1994. 2. Knight, J.G., Find. Exp. Clin. Pharmacol., 6:395-408, 1984. 3. De Lisi，L.E·，and Crow，T.J.，Psychiatr. Clin· North Am·， 9:115-132, 1987. 4. Ganguli，R·，Rabin, B.S·，Kelly, R.H·，Lyte, M. and Ragu，U·， Ann. N.Y. Acad· Sci·，496:676-690, 1987. 5. Shinitzky，M.，Deckmann，M·，Kessler，A.，Sirota，P·，Rabbs，A. and Elizur, A., An. N.Y. Acad. Sci., 621:205-217· 1991. 6. Deckmann，M·，Shinitzky，M·, Leykin，I·，Cheng，D·，Guy，J·， Avnon，M·，Salganik，I.，Amiri，Z·，Schlossberg，A·，Leibu，E·， and Rafael, C., The Italian J. Psychiatr. Behav. Sci.? 6:29-34, 1996. 7· PCT專利申請案公開號w〇 95/23970。 此處承認知道上述技藝並非表示此等技藝與本文隨附之 申請專利範圍界定之發明之可專利性有任何相關。 在下文中，上述刊物以上表中所述之號碼表示。 發明之背景 精神分裂症爲一種包含各種精神症狀，諸如聽幻覺、妄 -4- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） ---一一丨，----------------訂---------線 j (請先閱讀背面之注音？事項再填寫本頁) A7

581812 五、發明說明（2 ) 4症、錯覺、緊張症、怪誕行爲或情感退縮。約1%之總 人口罹患精神分裂症，此對社會造成龐大的經濟及社會工 作負擔。該疾病在早年開始出現，因此病人通常需要終身 的醫療及精神監護。所以精神分裂症被認爲係工業世界最 耗費之疾病之一 1。 已知各種與精神分裂症相關之危險因子，諸如遺傳傾 向、冬天出生以及懷孕及出生時有併發症。亦曾提出病毒 感染及繼發之自體免疫反應爲可能之致病因子2·4。抗血小 板之自體抗體與精神分裂症病人之相關性，可從精^分裂 及精神錯亂病人中檢測到之該抗體濃度高於從對照個體， 或者躁黉、抑f、個性異常或情感分裂病人中 = 獲得證明〜西方氏吸潰分析顯示自精神分裂症 I自體抗體鑑識之血小板抗原圖譜與從自體免疫性血小板 減少症及癡呆症患者得到之自體抗體鑑識之血小板抗原圖 譜不同7。會與得自精神分裂症病人之自體抗體特異性結 合之抗原’其特徵在於其之分子量。 發明之概要 依照本發明，數個會與在精神分裂症病人之體液内被發 現具而濃度之自體抗體結合之蛋白質已被鑑定出。此等蛋 白質所結合之典型抗體爲與血小板缔合之自體抗體 (PAA)。得自精神分裂症病人之此等自體抗體（在下文中， 稱爲「衍生自精神分裂症者之抗體_8〇八」）顯示會與上述 抗原結合，而得自對照非精神分裂症個體之自體抗體（在 下文中，稱爲「衍生自非精神分裂症者之抗體_nsda」 本紙張尺度適用中國國豕標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） — Kll·------•裝 (請先閱讀背面之注音？事項再填寫本頁) 訂---------線 « 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 581812 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 五、發明說明（」 則不會。 顯示能結合SDA之蛋白質已藉化學及酶方法鑑別出並 被進一步鐘定特徵。該被鐘別出之免疫_反應性蛋白質中 有一些爲已知蛋白質，諸如甘油醛_3_磷酸去氫酶 (G3PD)、晞醇酶 '角蛋白、肝細胞生長因子、細胞外鈣感 受器及另外數種。藉著消化兔蛋白質缔醇酶，而呈現出一 種對SAD具鬲結合活性之免疫活性胜肽。 该呈現I胜肽（爲烯醇酶蛋白質之免疫活性抗原決定部 位）包含具下列序列之28個胺基酸：

SgETEDTFIADLVVGLCTGQIKTGAPCR (序㈣別編號： 1 ) 0 根據孩呈現之胜肽，合成額外之胜肽以及鑑定出具高度 活性者（即對SDA具高結合活性，而冑NSDA之結合活性 極低或完全不與NSDA結合）。再者，被合成之活性胜肽 首次能區分得自精神分裂症病人之血聚樣品與得自對照非 精神分裂症個體之血漿樣品。 被合成之鬲度活性胜肽之一（序列鑑別編號；2 )之進一 步为析顯7F该胜肽經由二半胱胺酸構成環形以及經由剩餘 之游離半胱胺酸構成二聚物。此種形式之胜肽在與SDA 結合之能力上最具活性。 如下文所述，本發明之合成高活性胜肽之抗原決定部位 似乎爲三度空間抗原決定部位。 本發明因此提供一種會與在精神分裂症病人之體液被發 現具高濃度之抗體結合之胜肽。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂---------線

經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 581812 A7 B7 五、發明說明（4 ) 本發明尚提供一種會與在精神分裂症病人之體液内被發 現具高濃度之抗體結合之胜肽，其中該等胜肽與能和具下 列胺基酸序列之胜肽：LVVGLCTCQIKTGPAC (序列鑑別編 號：2 )特異性結合之抗體結合。該等胜肽之數個非限定 例如下： iii. IADLVVGLCTGQIKTGAPCR (序歹鑑另編號：3) iv. ADLVVGLCTGQIKTGAPCR (序歹鐘另4 編號：4) v. DLVVGLCTGQIKTGAPCR (序歹4 鐘另U 編號：5) vi. LVVGLCTGQIKTGAPCR (序歹4藍另·]編號：6) vii. LVVGLCTGQIKTGPACR (序歹ij 鑑另U 編號：7) viii· LVVGLCTPQIKTGPACR (序列錨另編號：8 )。 本發明亦提供一種會與在精神分裂症病人之體液内被發 現具高濃度之抗體結合之胜肽，其中該胜肽能與不會和選 自下列者所組成族群中之胜肽結合之抗體結合： i. SGETEDTFIADLVVGLCTGQ (序歹鑑另U 編號：9) ii. VVGLCTGQIKTGAPCR (序歹ij 鑑另J 編號：10) iii· CTGQIKTGAPCR (序列鑑別編號：11) iv. LVVGLCTGQIKTGAPC ((序歹4 鑑另編號：12) v. LVVGLCTGQIKTGAP ((序列鑑另|J 編號：13 ) vi· LVVGLCTGQIKTGPAC ((序列鑑別編號：14 ) 本發明亦提供一種會與在精神分裂症病人之體液内被發 現具高濃度之抗體結合之胜肽，其包含選自下列者所組成 族群中之胺基酸序列： i. SGETEDTFIADLVVGLCTGQIKTGAPCR (序歹U 鑑另Ο 編 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) I裝--------訂---------線 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 581812 A7 B7 五、發明說明（5 ) 號：1) ii. LVVGLCTCQIKTGPAC (序歹鑑另編號：2) iii. IADLVVGLCTGQIKTGAPCR (序列鑑別編號：3 ) iv. ADLVVGLCTGQIKTGAPCR (序列鑑別編號：4 ) v. DLVVGLCTGQIKTGAPCR (序列鑑另|J 編號：5) vi. LVVGLCTGQIKTGAPCR (序列鏗另·]編號：6) vii. LVVGLCTGQIKTGPACR (序列鑑別編號：7) viii. LVVGLCTPQIKTGPACR (序列鑑另編號：8 )。 參照較佳實施例，本發明提供一種會與在精神分裂症病 人之體液内被發現具高濃度之抗體結合之胜肽，其選自下 列者所組成之族群： i. SGETEDTFIADLVVGLCTGQIKTGAPCR (序列鑑另丨J 編 號：1) ii. LVVGLCTCQIKTGPAC (序列鑑另ij 編號：2) iii. IADLVVGLCTGQIKTGAPCR (序歹ij 鑑另》J 編號：3 ) iv. ADLVVGLCTGQIKTGAPCR (序列鑑別編號：4 ) v. DLVVGLCTGQIKTGAPCR (序歹4 鑑另U 編號：5) vi. LVVGLCTGQIKTGAPCR (序歹J 鑑另編號：6) vii. LVVGLCTGQIKTGPACR (序列鑑另編號：7) viii· LVVGLCTPQIKTGPACR (序歹鑑另J 編號：8 )。 上文（及下文）用來表示特定胺基酸之字母係根據IUPAC-IUB生化命名委員會推薦之一字母胺基酸（a.a.)代號。 雖不欲受理論所限，但根據本發明得到之結果，與SDA 結合之程度實質高於與NSDA之結合程度之胜肽，其抗原 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) ----訂---------線j 581812

五、發明說明（6 ) 決定部位結構顯然爲三度空間抗原決定部位。根據最低能 量計算，用電腦程式預測本發明胜肽之抗原決定部位爲一 環狀結構，其包含一疏水中心及具有約二正電荷之延伸 部。該帶正電荷之延伸部可位於許多可能的空間方位之 — 0 本發明胜肽與各種抗體之結合活性可藉本身已知之任何 方法諸如ELISA或西方氏吸潰法測定。舉例言之，受試胜 肽與抗體I結合活性藉下法分析：進行聚丙烯醯胺凝膠電 泳，將其吸潰在PVDS膜上，然後比較其與SDA之反應及 其與NSDA之反應。 本發明胜肽與PAA結合之程度可用本技藝已知之任何 檢測系統（諸如與可檢測標記鍵結之對抗人類免疫球蛋白 (抗體或其片段）測定。該標記可爲放射性族群、螢光族 群把催化反應得到可檢測產物之酶、能被抗生物素蛋白 等檢測之生物素族群。 在此方面之較佳實施例中，本發明之胜肽被結合在固體 支持物諸如PVDF膜上，然後與受試樣品反應，以及使用 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 與可檢測標兄結合之抗-人類Fc抗體測定樣品中PAA之結 合程度。 按照特定實施例，與受試胜肽結合之自體抗體之濃度藉 著使用與辣根過氧化酶結合之抗人類Fc (西格瑪公司）以 及做爲著色劑之Fast-DAB™ (西格瑪公司）或4-氣-莕酚 (西格瑪公司）而測定。 爲了認定受試之本發明胜肽與SDA之結合「實質高 581812 A7 _____ B7 五、發明說明（7 ) 於」其與NSDA之結合，本發明胜肽與SDA結合之程度當 藉本技藝已知之任何統計學方法（例如學生t-試驗）分析上 述實驗方法得到之結果而被測定時，在統計學上應顯著高 於其與NSDA之結合。 所有上述胜肽之類似物亦構成本發明之一部分。如精於 本技藝之任何人士所了解者，本發明胜肽之胺基酸序列可 被改變，例如添加、置換或刪除一種或以上胺基酸而不實 質改變該胜肽與SDA之結合能力。因此，例如位在本發 明胜肽之胺基酸序列之第一個位置之白胺酸可被屬於該胺 基酸之相同族群之甘胺酸或纈胺酸置換而不改變該胜肽之 結合活性。精於本技藝人士，根據已知之胺基酸分類（例 如在 Molecular Biology of the Cell Editors Alberts B. et al·， Garland Publishing，Inc.，New York and London, 2nd Edition，1989, pages 54-55中發現者），在決定該胜肽之任一胺基酸用何 種胺基酸置換上沒有任何困難。 落在本發明胜肽之範圍内之類似物，爲當以本技藝已知 之任何方法諸如下文實例1所述之方法測定時，與SDA 結合之程度與本發明胜肽實質相同者，即與SDA結合之 程度高於與NSDA結合之程度。 本發明之胜肽可藉較長蛋白質之酶消化（例如使用 Clostrapain)或化學（CNBr)消化而得到。在該情況，生成之 胜肽藉本技藝已知之方法（諸如RP-HPLC )分離以及分離之 胜肽隨後可被用於按上述方法定序[例如藉Euro sequence b.v.(Nijenborgh 4; 9749 Gronigen ; The Netherlands )]及分析 •10- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 x 297公釐） H-----#裝 (請先閱讀背面之注音？事項再填寫本頁) 訂---------線； 經濟部智慧財產局員Η消費合作社印製 581812 A7 B7 五、發明說明（8 ) 其與SDA之結合能力。 本發明之胜肽亦可在Abimed 522上，用Eurosequence b.v.，按照本技藝已知之方法，以1〇微莫耳之規模合成 (見下文實例中之詳細説明）。新合成胜肽之結合活性係使 用任何上述分析法測定。 本發明之胜肽能在得自精神分裂症者之樣品與得自非精 神分裂症者之樣品間做區分，所以在診斷個體之精神分裂 症上有用。所以，本發明在另一方面提供提供一種在個體 中診斷精神分裂症用之胜肽。該胜肽能與在精神分裂症病 人之體液中被發現具提高濃度之抗體結合。 受試個體之樣品一般爲包含血小板之血液樣品之含PAA 部分。不過，本發明首次可以從受試個體取得之血漿樣品 測定精神分裂症存在之機率，而無需先自樣品中單離 PAA。因此，按照本發明，受試個體之樣品可爲血漿樣品 或藉本技藝已知之任何方法從該血漿樣品得到之含PAA 部分（例如得到富含血小板之血漿（PRP)及從其單離 PAA)。 既然得自精神分裂症病人之樣品，與得自對照非精神分 裂症病人之樣品相較，其中衍生自血小板之自體抗體與本 發明胜肽之結合程度不同，本發明胜肽因而可被用於診斷 個體精神分裂症之檢驗法中。所以本發明再一方面提供一 種供診斷個體精神分裂症之檢驗法，其包含下列步驟： (a) 從該個體得到樣品’其爲血液樣品、該血液樣品之含 血小板邵分，或含有自血小板脱落之血小板-缔合抗 -11 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) ，裝----

訂---------線I 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 581812 A7 B7 五、發明說明（9 ) 體（PAA)之部分； (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) (b) 將該樣品與能和精神分裂症病人之體液中被發現具提 高濃度之抗體結合之胜肽接觸； (c) 測定該胜肽與該樣品結合之程度，若該程度高於該胜 肽與來自非分精神分裂症者之樣品之結合度，則表示 該個體具有罹患精神分裂症之高度可能性。 在另一實施例中，上述步驟（b)中之胜肽爲能與和具有 序列鑑別編號：2之胺基酸序列之胜肽特異性結合之抗體 結合之胜肽。又，在一實施例中，上述步驟（b)中之胜肽 包含下列者所組成族群中之胺基酸序列： i. SGETEDTFIADLVVGLCTGQIKTGAPCR (序歹U 4監另|J 編 號：1) ii. LVVGLCTCQIKTGPAC (序歹鑑另U 編號：2) iii· IADLVVGLCTGQIKTGAPCR (序列鑑另丨J 編號：3) iv· ADLVVGLCTGQIKTGAPCR (序列鑑別編號：4 ) V. DLVVGLCTGQIKTGAPCR (序歹U 鑑另編號：5) vi. LVVGLCTGQIKTGAPCR (序歹U 鑑另編號：6) vii. LVVGLCTGQIKTGPACR (序歹]鑑另編號：7) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 viii. LVVGLCTPQIKTGPACR (序歹鑑另U 編號：8 )。 在一較佳實施例中，上述步驟（b)中之胜肽爲選自下列 者所組成族群中之胜肽： i. SGETEDTFIADLVVGLCTGQIKTGAPCR (序歹ij 4藍另U 編 號：1) ii. LVVGLCTCQIKTGPAC (序歹U 4藍另U 編號：2) -12- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 581812 A7 -----B7_______ 五、發明說明（10 ) iii· IADLVVGLCTGQIKTGAPCR (序列鑑另丨J 編號：3 ) iv· ADLVVGLCTGQIKTGAPCR (序列鐘另編號：4) ν· DLVVGLCTGQIKTGAPCR (序列鑑另》J 編號：5) vi. LVVGLCTGQIKTGAPCR (序列鑑另，J 編號：6) vii· LVVGLCTGQIKTGPACR (序列鑑別編號·· 7 ) 本發明亦提供一種在上述檢驗法中有用之套組，其包含 上面固定有一種或以上本發明胜肽及抗-人類免疫球蛋白 (抗-HIG)抗體或其片段之支持物。該抗-HIG抗體與可檢 測標記結合，或者該套組亦包含針對該第一抗體之第二類 型抗體，其中該第二抗體與可檢測標記結合。該套組亦包 含實施該檢驗所需之各種試劑以及使用説明書。 本發明現以下列特定實施例及附圖例示説明。 圖式之簡略説明 圖1爲具有序列鑑別編號2之胜肽14與PAA之結合活 性之代表圖’其中該PAA從精神分裂症病人（圖ία)及非 精神分裂症個體（圖1B )得到之樣品製得。具有序列鑑別 編號9之胜肽被用做陰性對照組。 圖2顯示胜肽14 (序列鑑別編號：2 )與得自精神分裂症 病人（圖2A)及非精神分裂症個體（圖2B)之血漿樣品之結 合活性之代表圖。具有序列鑑別編號9之胜肽被用做陰性 對照組。 圖3爲根據最低能量計算，用電腦程式預測之本發明胜 肽之抗原決定部位之三度空間結構之代表圖。 圖4爲從公開胜肽資料庫得到之晞醇酶之三度空間纟士構 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

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五、發明說明（11 ) 之X-光照片，並與本發明胜肽之水模型比較。 在抗原決定部位中發現之胺基酸如下標示： L =白胺酸 A =丙胺酸 P =脯胺酸 R =精胺酸 K =組胺酸 實例 材料及方法 1·命小板及血小板自體抗體 從病人及對照個體抽出靜脈血液（2〇毫升）並用肝素做 爲抗凝血劑。富含血小板之血漿（PRP)藉於室溫離心（100 公克’ 20分鐘）而得到。不含血漿之血小板藉用補充有做 爲抗凝血劑之10 mM EDTA之磷酸鹽緩衝食鹽水（pBS)清洗 二次（4000公克；15分鐘；4 °C )。爲了單離抗-血小板抗 體，將血小板與〇·1Μ甘胺酸/ 10 mM EDTA (pH 2.8)於室溫 一起培育10分鐘，然後離心（4000公克；15分鐘；4 °C )。將含有抗血小板抗體之上清液用飽和Na2P04溶液中 和及貯存於-20 C直至使用。 2.製備用等電聚焦 〇型血之血小板濃縮物購自地方血庫以及用PBS/ίο mM EDTA清洗3至5次（4000公克；15分鐘；4。(：）直至上清 液不含血漿。血小板（約20倍濃縮物）首先用20毫升含 0.5%Triton X-100/0.5% NP40之水於室溫及溫和振搖下溶解 -14- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注音？事項再填寫本頁) 裝---- 訂---------" 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 581812 Α7 Β7 五、發明說明（I2 ) 15分鐘。將懸浮液離心（ 10000公克，15分鐘，4 °C)，移 除上清液，以及將小丸用含〇· l%Triton X-100之水萃取二 次或以上。將三個上清液合併以及加入Ampholyte™ 3/10 (BioRad)以使終濃度爲1%。將該溶液饋入ROTOFOR™室 (容量·· 60毫升）中，然後按照製造廄（BioRad)之説明手册 進行製備用等電聚焦。聚焦通常於4.5小時後完成（10 °C ; 10瓦特恆定功率）。收取20份以及測定各份之pH値 (pH梯度爲1.5-12)。將此等部份貯存於-20 °C直至使用爲 止。 3. 免疫-反應性部分之鑑定 藉下法分析此等部分之免疫-反應性：進行聚丙烯醯胺 (10%)凝膠電泳，將蛋白質吸潰在PVDF膜上以及用在50 毫升培育緩衝液中之1毫升自體抗體搜尋膜。與來自 SIGMA之辣根-過氧化酶（山羊）（稀釋度1 : 5〇0)及Fast- DAB™ (SIGMA)或4-氯莕酚（SIGMA)結合之抗-人類Fc被用 做著色試劑，以檢測被結合之人類抗-血小板抗體。在pH 範園爲6.0至10.0之部份中觀察到免疫-反應性。 4. 製備用聚丙烯醯胺（8%)凝膠電泳 將免疫-反應性部分（pH 6-10)合併，以及在購自BioRad 之PrepCell中，按照製造廠之説明手册，於還原條件下藉 製備用SDS聚丙烯醯胺凝膠（8%及8厘米高）依照分子量 而分離。收集1.5毫升之部分（η = 400):每第10份藉SDS 凝膠電泳分析繼而予以銀染色，以測定在該400份中之分 子量分布。 -15- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) --------訂---------· 581812 A7 -------gL _ ___ 五、發明說明（13 ) 5·急疫-反應性部分之鐘定 用購自BioRad之DotBlot裝置（96凹穴）將每第15份（〇1 毫升）點_吸潰在PVDF膜上。免疫·反應性部份然後如上 述（1.3)檢測。 6· 疫-反應性蛋白質之鏗定 如前述，鑑定各種免疫反應性-蛋白質。反應性與蛋白 質量之比高之蛋白質被優先定序。樣品之製備通常以下述 方式進行：大約爲陽性之部分（+/- 10)用上文1 5所述之方 法再分析。將陽性部分合併，冷滚乾燥，在分析用（〇 mm) SDS聚丙烯醯胺（1〇%)凝膠上再分離，以及用庫瑪斯 藍（Coomassie Blue)染色。將該帶切下並送往Eurosequenee b.v.(進行酶消化，胜肽之rp_hPLC分離，繼而進行胺基 酸定序）。 7·免疫-反應性抗原決定部位之鑑定 在被鑑定之蛋白質中，下列二者被發現在市面上可以獲 得： (a) 甘油醛_6·磷酸去氫酶（G0PD) (b) 烯·醇酶。 約1〇毫克之蛋白質用酶（Clostrapain)或化學法（CNBr)消 化，以及生成之胜肽藉RP-HPLC分離。所有部分之取樣 (20%)被Eurosequence b.v送往主要發明者，以供用上文1.5 所述之方法分析免疫-反應性。只有烯醇酶之酶消化物產 生活性片段，該活性片段繼而藉Eurosequence b.v定序。 -16 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) ^一^ I I I ! I I 訂11!!· 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 581812 A7 B7 五、發明說明（I4 ) 8. 胜肽合成. 在Abimed 522上用Eurosequence b.v以10微莫耳之規模 合成各種胜肽。將胜肽例行溶於1毫升水/DMF/DMSO (1 : 1 : 1 ; v/v/v)中。然後將胜肽線·吸潰於P VDF膜上以及如 上述測試其免疫-活性。 9. 抗原決定部位掃描 用Macintosh電腦系統計算本發明胜肽之水模型。烯醇 酶之X-光三度空間結構從公開胜肽資料庫得到，以及掃 描烯醇酶之表面以尋找與水模型計算得之胜肽之抗原決定 部位符合之抗原決定部位。 實例1 :免疫-反應性蛋白質之繼定 下列蛋白質爲以上文1.3所述之檢驗法測定時，能與精 神分裂症病人中以高濃度存在之自體抗體高度結合之蛋白 質·· 蛋白質： 甘油醛-6-磷酸去氫酶 晞醇酶 角蛋白 肝細胞生長因子 細胞外之鈣感受器 測試以上鑑定之蛋白質與得自精神分裂症病人之血漿樣 品及得自對照非精神分裂症個體之血漿樣品之結合能力。 該結果顯示無法使用上述蛋白質區分得自精神分裂症病人 之血漿樣品及得自非精神分裂症個體之血漿樣品，亦即結 -17- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) --------訂·--------· 581812 A7 五、發明說明（15 ) 合結果不具決定性。 上述二酶I結合活性然後藉其與SDA (從得自精神分裂 症病人之樣品製備）及與NSDA (從對照非精神分裂症個體 製備）之反應而測試。如下文表i所見，在本例中，該等 蛋白質與SDA之結合度實質高於其與NSDA之結合度，該 結合度以與各酶呈陽性反應之樣品數目表示。 表 酶 ―" I II 病人（η=8) -------- 對照組（η=8、 陽性 陽性 G-3-P-去氫酶 來自人類 7/8 來自豬 8/8 ----------- 1/8 來自難 7/8 2/8 來自酵母菌 6/8 1/8 來自枯草桿菌 1/8 2/8 缔醇酶 來自兔子 7/8 1/8 上述結果顯示按照本發明得到之蛋白質在診斷受試個體 之精神分裂症上有用，但從個體得到及受試之樣品必須包 含由血小板衍生之自體抗體。該酶不適於在血漿樣品中直 接檢測精神分裂症。 -18 - W長尺度適财關家標準（CNS)A4規格（21G χ挪公髮了 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝--------訂---------- 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本 581812 A7 -----—---一 —五、發明說明（I6 ) 實例2 ·· ^定在能與SDAs特異性結会爻麵、; 之抗原決定部位 人類G-3-P-去氫酶及兔烯醇酶之化學（CNBr)及酶消化 (Clostrapain)被用於鑑別抗原決定部位。只有烯醇酶之酶消 化物顯示一具免疫活性之胜肽（胺基酸372_399 ;具有下表 2中之序列鑑別編號：1之胜肽），即與SDAs之結合程度 南於與NSDAs之結合程度者。 根據經消化蛋白質中鑑定出之抗原決定部位之序列，藉 上文1.8所述之方法合成許多胜肽。然後如上述評估被合 成之胜肽與SDAs之結合活性並和其與NSDAs之結合活性 比較。 如下文表2所見，數個被合成之胜肽顯示與SDAs之結 合活性實質上高於其與NSDAs之結合活性（在表中以 「是」表示），而其他則顯示與得自精神分裂症病人之樣 品及與得自非精神分裂症個體之樣品之結合度沒有明顯差 異（在表中以「否」表示）。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 t 公 97 2 X 110 一 2 /1\ 格 規 A4 5) N (C 準 標 家 國 國 中 用 適 度 尺 張 紙 本 581812 A7 B7 五、發明說明（π 表2

Peptide

Seq. LD.No.

Activity SGETEDTFIADLWGLCTGQIKTGAPCR (28aa) LWGLCTCQUKTGPAC (17aa) IADLWGLCTGQIKTGAPCR (20aa) ADLVYGLCTGQIKTGAPCR (19aa) DLWGLCTGQIKTGAPCR (18aa) LWGLCTGQIKTGAPCR (17aa) LWGLCTGQUKTGPACR (17aa) LWGLCTPQUKTGPACR (17aa) SGETEDTFIADLWGLCTGQ (20aa) WGLCTGQIKTGAPCR (16aa) CTGQIKTGAPCR (12aa) LWGLCTGQIKTGAPC (16aa) LWGLCTGQIKTGAP (15aa) LWGLCTGQIKTGPAC (16aa) 2 6 7 8 9 10 11 12 13 14 是 是 是 是 是 是 是 是 否 否 否 否 否 否 請 先 閱 讀 背 之 注 意 事 項

頁 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 在被合成之胜肽中，序列鑑別編號：2之胜肽最能與在 精神分裂症病人中被發現具高濃度之抗體結合。 實例3 :鑑定序列鑑別編號：2之胜肽之特徵 序列鑑別編號：2之胜肽（包含三個半胱胺酸）於合成後 立即得到之雷射脱附質譜顯示存在一單體，其未由半胱胺 酸形成一環。不過，將胜肽（約4毫克）溶於1毫升水 -20- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 581812 A7 五、發明說明（l8 ) /DMF/DMS0(1 : 1 : 1 ; v : v : v)及讓該溶液靜置於室溫 整夜後，該胜肽經由二半胱胺酸形成一環以及經由其餘之 游離半胱胺酸形成二聚物。未檢測到聚合度更高之聚合 物。當測试该一形式之胜肤之結合活性時，該胜肽之二聚 物形式與SDAs之結合活性遠高於非二聚物形式者。 胜肽例如藉鲩基乙醇或硼氫化鈉還原而進行之化學分析 會完全破壞免疫活性，而氧化（例如用空氣或氧）則會恢復 免疫活性。 實例4 :— 序列鑑別編號：2之胜肽與得自精神分裂淪乃非 積神分裂症個體之樣品之結合活性 胜肽14 (序列鑑別編號2 )與被單離之PAAs之結合活性 用上述方法測试。如圖1A所見，上述胜肤會與得自不同 精神分裂症病人之8種PAAs中之7種結合。圖1B顯示上 述胜肽不會與得自8個不同非精神分裂症個體之PAAs結 合。序列鑑別編號：9之胜肽被用做陰性對照組。 然後測試胜肽14 (序列鑑別編號2 )與得自精神分裂症 病人之血漿樣品中之SDA結合之能力。如圖2A所見，該 胜肽會與得自不同精神分裂症病人之5種SDA中之4種結 合。圖2B顯示在得自15個不同非精神分裂症個體之 NSDA之中，上述胜肽不會與其中14人之NSDA結合。序 列鑑別編號：9之胜肽被用做陰性對照組。 實例5 :三度空間結構 根據最低能量計算，用電腦程式預測本發明胜肽之抗原 決定部位之三度空間結構。 -21- ‘紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 x 297公爱） (請先閱讀背面之注咅？事項再填寫本頁) 裝--------訂----------- 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 581812 五、發明說明（

請 先 閱 讀 背 面 之 注 意 事 項 再_ 填· I裝 頁I 圖3所見，被預測（抗原決定部位之結構爲一環狀結 構，、包口疏水中心及具有約二正電荷之延伸部。該帶 正電荷之延伸部可位於許多可能的空間方位之一。 實例6 : 甚得之胜肽之抗原 合之抗原決定鄯仿 計算本發明胜肽之水模型三度空間結構。然後掃描從公 開胜肽資料庫得到之烯醇酶之X-光三度空間結構，以及 將本發明胜肽之胺基酸之位置與烯醇酶表面之胺基酸之位 置比較’以檢查是否與本發明胜肽之一個或以上計算得之 抗原決定邵位符合之抗原決定部位可在烯醇酶之表面被發 訂 如圖4 (烯醇酶表面掃描之電腦模擬圖）所見，抗原決 足部位在歸醇g母表面被發現，其由一群疏水胺基酸（白胺 酸、丙胺酸及脯胺酸）外繞帶正電之胺基酸（精胺酸及組胺 酸）而組成，其符合從本發明胜肽模擬之抗原決定部位。 因此，本發明胜肽之抗原決定部位之預測結構確可在烯醇 酶之表面上被發現。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -22- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 581812 A7 B7 五、發明說明（2〇 ) 序列表 (1) 一般資訊 (i) 申請人·· (A) 名字：亞達研發股份有限公司 (B) 街道：魏茲曼科學研究院 (C) 城市：里活佛特 (E) 國家：以色列 (F) 郵遞區號：郵政信箱95 (G) 電話：+08 9470617 (H) 傳眞：+08 9470739 (ii) 發明之名稱：以新穎胜肽於精神分裂症之診斷分析 (iii) 序列之數目：14 (iv) 電腦可讀形式 (A) 媒體類型：軟碟 (B) 電腦·· IBM PC相容型

(C) 操作系統·· PC-DOS/MS-DOS (D) 軟體·· Patentln Release #1.0，版本 #1·30(ΕΡΟ) (2)序列鑑別編號：1之資料： ⑴序列特徵 (Α)長度：28胺基酸 (Β)類型：胺基酸 (C) 股數··未知 (D) 構形：未知 (ii)分子類型：胜月太 -23- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 請 先 閱 讀 背 之 注 意 事

經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 581812 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7_ 五、發明說明（21 ) (iii) 假設：無 (iv) 反義：無 (v) 片段類型：内部 (xi)序列説明：序列鑑別編號：1 Ser Gly Glu Thr Glu Asp Thr Phe lie Ala Asp Leu Val Val Gly Leu 1 5 10 15

Cys Thr Gly Gin lie Lys Thr Gly Ala Pro Cys Arg 20 25 (2)序列鑑別編號：2之資料： (i) 序列特徵 (A) 長度：16胺基酸 (B) 類型：胺基酸 (C) 股數：未知 (D) 構形：未知 (ii) 分子類型：胜肽 (iii) 假設：無 (iv) 反義：無 0)片段類型：内部 ㈤)序列説明：序列鑑別編號：2

Leu Val Val Gly Leu Cys Thr Cys Gin lie Lys THr Gly Pro Ala Cys 1 5 10 15 (2)序列鑑別編號·· 3之資料： (i)序列特徵 (A)長度：20胺基酸 -24- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)a4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 581812 A7 B7 五、發明說明（22 ) (B) 類型：胺基酸 (C) 股數：未知 (D) 構形：未知 (ii) 分子類型··胜肽 (iii) 假設：無 (iv) 反義：無 (v) 片段類型：内部 (xi)序列説明：序列鑑別編號：3 lie Ala Asp Leu Val Val Gly Leu Cys Thr Gly Gin lie Lys Thr Gly 15 10 15

Ala Pro Cys Arg 20 (2)序列鑑別編號：4之資料： (i) 序列特徵 (A) 長度：19胺基酸 (B) 類型：胺基酸 (C) 股數：未知 (D) 構形：未知 (ii) 分子類型：胜肽 (iii) 假設：無 (iv) 反義：無 (v) 片段類型：内部 (xi)序列説明：序列鑑別編號：4 -25- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) ϋ i^i 11 一-口，R ·ϋ I _ 581812 A7 五、發明說明（23 )

Ala Asp Leu Val Val Gly Leu Cys Thr Gly Gin He Lys Thr Gly Ala 1 5 10 15

Pro Cys Arg (2)序列鑑別編號：5之資料： ⑴序列特徵 (A) 長度：18胺基酸 (B) 類型：胺基酸 (C) 股數：未知 (D) 構形：未知 (ϋ)分子類型：胜肽 (iii) 假設：無 (iv) 反義：無 (v) 片段類型：内部 (xi)序列説明：序列鑑別編號：5 15

Asp Leu Val Val Gly Leu Cys Thr Gly Gin lie Lys Thr Gly Ala Pro 1 5 10

Cys Arg (2)序列鑑別編號：6之資料： 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 (i) 序列特徵 (A) 長度：17胺基酸 (B) 類型：胺基酸 (C) 股數：未知 (D) 構形：未知 (ii) 分子類型：胜肽 -26- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 581812 A7 一 B7 五、發明說明（24 ) (iii) 假設：無 (iv) 反義：無 (v) 片段類型：内部 〇i)序列説明：序列鑑別編號：6

Leu Val Val Gly Leu Cys Thr Gly Gin lie Lys Thr Gly Ala Pro Cys 15 10 15

Arg (2)序列鑑別編號：7之資料： (i )序列特徵 (A) 長度：17胺基酸 (B) 類型：胺基酸 (C) 股數：未知 (D) 構形··未知 (ii) 分子類型：胜肽 (iii) 假設：無 (iv) 反義：無 (v) 片段類型：内部 (xi)序列説明：序列鑑別編號：7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製

Leu Val Val Gly Leu Cys Thr Gly Gin lie Lys Thr Gly Pro Ala Cys 1 5 10 15

Arg (2)序列鑑別編號：8之資料·· ⑴序列特徵 (A)長度：17胺基酸 -27- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 2 1X 8 1X 8 5 五 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 一_____B7_ 發明說明（25 ) (B) 類型：胺基酸 (C) 股數：未知 (D) 構形：未知 (ii) 分子類型：胜肽 (iii) 假設：無 (iv) 反義：無 (V)片段類型：内部 (xi)序列説明：序列鑑別編號：8

Leu Val Val Gly Leu Cys Thr Pro Gin lie Lys Thr Gly Pro Ala Cys 15 10 15

Arg (2)序列鑑別編號：9之資料： (i) 序列特徵 (A) 長度：20胺基酸 (B) 類型：胺基酸 (C) 股數：未知 (D) 構形：未知 (ii) 分子類型：胜肽 (iii) 假設：無 (iv) 反義··無 (v) 片段類型：内部 (xi)序列説明：序列鑑別編號：9

Ser Gly Glu Thr Glu Asp Thr Phe lie Ala Asp Leu Val Val Gly Leu 15 10 15 -28- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 x 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

581812 A7 B7 五、發明說明（26 )

Cys Thr Gly Gin 20 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) (2)序列鑑別編號：10之資料： (i) 序列特徵 (A) 長度：16胺基酸 (B) 類型：胺基酸 (C) 股數：未知 (D) 構形：未知 (ii) 分子類型：胜肽 (iii) 假設：無 (iv) 反義：無 (V)片段類型：内部 (xi)序列説明··序列鑑別編號：10

Val Val Gly Leu Cys Thr Gly Gin lie Lys Thr Gly Ala Pro Cys Arg 15 10 15 (2)序列鑑別編號：11之資料： (i) 序列特徵 (A) 長度：12胺基酸 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 (B) 類型··胺基酸 (C) 股數：未知 (D) 構形：未知 (ii) 分子類型：胜肽 (iii) 假設：無 (iv) 反義：無 -29- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 581812 A7 __-__ B7 五、發明說明（27 ) (請先閱讀背面之注音3事項再填寫本頁) (v)片段類型：内部 (xi)序列説明：序列鑑別編號：11 Cys Thr Gly Gin He Lys Thr Gly Ala Pro Cys Arg 1 5 10 (2)序列鑑別編號：12之資料： ⑴序列特徵 (A) 長度·· 16胺基酸 (B) 類型：胺基酸 (C) 股數：未知 (D) 構形：未知 (ii) 分子類型：胜肽 (iii) 假設：無 (iv) 反義··無 (v) 片段類型：内部 (xi)序列説明：序列鑑別編號：12

Leu Val Val Gly Leu Cys Thr Gly Gin lie Lys Thr Gly Ala Pro Cys 1 5 10 15 (2)序列鑑別編號：13之資料： 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 ⑴序列特徵 (A) 長度·· 15胺基酸 (B) 類型：胺基酸 (C) 股數：未知 (D) 構形：未知 (ii)分子類型：胜肽 -30- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 581812 A7 B7 五、發明說明（28 ) (iii) 假設：無 (iv) 反義：無 (請先閱讀背面之注咅3事項再填寫本頁) (v) 片段類型：内部 (xi)序列説明：序列鑑別編號：13

Leu Val Val Gly Leu Cys Thr Gly Gin lie Lys Thr Gly Ala Pro 1 5 10 15 (2)序列鑑別編號：14之資料： ⑴序列特徵 (A) 長度：16胺基酸 (B) 類型：胺基酸 (C) 股數：未知 (D) 構形：未知 (ii) 分子類型··胜肽 (iii) 假設：無 (iv) 反義：無 0)片段類型··内部 (xi)序列説明：序列鑑別編號：14 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製

Leu Val Val Gly Leu Cys Thr Gly Gin lie Lys Thr Gly Pro Ala Cys 1 5 10 15 -31- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐）

Claims (1)

1. 581812 A B c D 第088105128號專利申請案 中文申請專利範圍替換本(93年2月)

   申請專利範圍 1. 一種胜肽，其係與在精神分裂症病人體液内被發現具 提高濃度之抗體結合並選自由下列胜肽所組成之群： a. SGETEDTFIADLVVGLCTGQIKTGAPCR (序列鑑及J 編號：1) b. LVVGLCTCQIKTGPAC (序歹4 鑑另:J 編號·· 2 ) c. IADLVVGLCTGQIKTGAPCR (序列鑑別編號：3 ) d. ADLVVGLCTGQIKTGAPCR (序歹J 鑑另U 編號：4 ) e. DLVVGLCTGQIKTGAPCR (序歹U J監另4 編號：5 ) f. LVVGLCTGQIKTGAPCR (序歹4 鑑另U 編號：6 ) g. LVVGLCTGQIKTGPACR (序歹J 鑑另U 編號：7 )及 h. LVVGLCTPQIKTGPACR (序歹U 鑑另4 編號：8 )。 2. 根據申請專利範圍第1項之胜肽，其係為序列鑑別編 號：2之胺基酸序列。 3. 根據申請專利範圍第1項之胜肽，其係與能和選自下 列者所組成族群中之胜肽結合之抗體結合： a. SGETEDTFIADLVVGLCTGQIKTGAPCR (序歹U 鑑另 編號：1) b. LVVGLCTCQIKTGPAC (序歹鑑另]編號：2 ) c. IADLVVGLCTGQIKTGAPCR (序歹鑑另U 編號：3 ) d. ADLVVGLCTGQIKTGAPCR (序歹]鑑另U 編號：4 ) e. DLVVGLCTGQIKTGAPCR (序歹J 鑑另4 編號：5 ) f. LVVGLCTGQIKTGAPCR (序歹U 鑑另J 編號：6 ) 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 2 1A 8 1A 8 5 8 8 8 8 A BCD 々、申請專利範圍 g. LVVGLCTGQIKTGPACR (序歹|J 鑑別編號：7 )及 h. LVVGLCTPQIKTGPACR (序列鑑別編號：8 )。 4. 根據申請專利範圍第1項之胜肽，其包含至少一個具 有一由疏水中心及帶正電之延伸部組成之環形三度空 間結構的抗原決定部位。 5. —種供診斷精神分裂症用之套組，其包含： i. 一支持物，其上固定有根據申請專利範圍第1 項之一或多種胜肽； ϋ. 與可檢測標記結合之抗-人類免疫球蛋白抗體或 其片段； iii. 進行該所需之試劑。 6. 根據申請專利範圍第5項之套組，其中（i)之胜肽係為 序列鑑別編號：2之胜肽。 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 x 297公釐)

   581812 ♦ θ日修正 93. 2, 13 一I I

   對照組 胜肽14

   對照組 胜肽14 圖1B 581812 修正 命片日/ m 2· 13補充

   對照組 mk i4 圖2A

   對照組 胜肽14 圖2B