CN1300588C - 用于精神分裂症诊断的血浆特异性蛋白获取方法及应用 - Google Patents
用于精神分裂症诊断的血浆特异性蛋白获取方法及应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN1300588C CN1300588C CNB2005100241028A CN200510024102A CN1300588C CN 1300588 C CN1300588 C CN 1300588C CN B2005100241028 A CNB2005100241028 A CN B2005100241028A CN 200510024102 A CN200510024102 A CN 200510024102A CN 1300588 C CN1300588 C CN 1300588C
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- plasma
- protein
- sample
- adhesive tape
- dimensional electrophoresis
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Landscapes
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
本发明提供一种用于精神分裂症诊断的血浆特异性蛋白获取方法及应用,利用双向凝胶电泳的方法分离待测个体血浆蛋白质,从双向凝胶电泳图谱上得到α珠蛋白、α1抗胰蛋白酶、α1巨球蛋白、血清淀粉样蛋白P组份、抗纤维蛋白酶Ⅲ和维生素D结合蛋白的表达量,并将此六个特异性蛋白的表达量作为判断被测个体是否患精神分裂症的参考依据。本发明利用分子标记客观地诊断精神分裂症,而不依赖于医生对诊断对象的主观判断。由于血浆具有取材方便,无创伤性,并可连续检测的优点,因此本发明使诊断具有极大的临床应用的可能。本发明同时可用于评价治疗精神分裂症药物的疗效,指导药物开发。
Description
技术领域
本发明涉及一种人体血浆中六种特异性蛋白的获取方法,并阐述了这些特定蛋白质的表达量在精神分裂症诊断方面的应用。本发明提供了精神分裂症诊断上分子生物学方面的指标,将会有力地推进该病的预防和治疗。本发明属于生物检测技术领域。
背景技术
精神分裂症是一类常见的严重危害人类身心健康的精神疾病,其发病率居各类精神障碍之首。流行病学调查资料显示:精神分裂症在世界各地的发病率约为0.5%-1%,全球有近5000万精神分裂症患者。患者常有感知、思维、情感、行为等多方面的障碍和精神活动的不协调。对患者的治疗将投入巨大的人力资源和社会财富,患者对其所在的家庭也造成严重的影响。精神分裂症是多因素复杂疾病,其发病是遗传因素和环境因素共同作用的结果,有多个基因在其发生过程中发挥作用,每个基因的作用都有限。过去对精神分裂症致病机制的研究主要从以下三方面进行:药物研究,尸体解剖和脑影像技术研究,遗传基因组研究。尽管作了大量的研究工作,但是迄今还没有找到一个明确的精神分裂症的致病原因,导致精神分裂症的分子机制仍然是个谜。由于人们对该疾病的发病机制所知甚少,因而还没有一个确定的生物学诊断标准。目前,临床上对精神分裂症的诊断基本上是依据各种量表,而缺少仪器分析标准和量化手段,在某种意义上依赖于医生的主观判断。如果能找到分子生物学方面确定的诊断标准,无疑会巨大地推进该病的预防和治疗。
蛋白是基因转录后的最终表现形式,是包括环境、遗传以及其它未知因素在内的多种因素相互作用的最终结果,因此从蛋白水平上探索精神分裂症致病机制是一条直接的路线。现代蛋白质组学技术具有高通量、高分辨率的特点,它直接对相关组织中的蛋白进行大规模地分析,并对这些相关蛋白的结构、功能、作用通路作进一步的研究。蛋白质组的概念,最早于1994年由澳大利亚学者Wilkins提出,指的是“一个细胞或一个组织基因组所表达的全部蛋白质。”蛋白质组学是从整体的角度,分析细胞内动态变化的蛋白质组成成份、表达水平与修饰状态,了解蛋白质之间的相互作用与联系,揭示蛋白质功能与细胞生命活动规律的研究领域。
中枢神经系统疾病的研究需要以脑组织为样本,而通常情况下获得的脑组织不是活体组织。相反,体液可以在疾病发生和发展整个过程中的任意时刻被抽取,因而通过对体液蛋白的研究可以获得许多信息。许多生理上以及疾病引起的变化可能改变体液内在代谢过程中起重要调控作用的关键蛋白的表达水平。因此,研究体液蛋白有利于对疾病进行实时监控,测定与疾病特定相关的体液蛋白的表达水平因而具有重要的临床诊断、预防及治疗意义。血液流经全身,通过血液-脑脊液屏障(BCB,blood-CSF barrier)以及血脑屏障(BBB,blood-brain barrier)分别与脑脊液和脑组织相通,血浆中部分蛋白表达水平的改变部分地反映了脑脊液或脑组织中的代谢异常。同时血浆蛋白浓度高达脑脊液的100多倍,约为60-80mg/ml。由于血浆具有取材方便,无创伤性,并可连续检测的优点,因此用血浆作为诊断神经系统疾病的生物材料,使诊断具有极大的临床应用的可能。
近年来精神免疫学方面对血浆及脑脊液的研究表明:精神分裂症、重型抑郁症和燥狂症等精神类疾病的发病伴随着急性期反应。急性期反应是机体在遭受急性应激、疾病、感染、创伤等各种内外刺激时出现的反应,此时,血浆中珠蛋白、α1-酸糖蛋白等正性急性期蛋白浓度增高;转铁蛋白、白蛋白等负性急性期蛋白浓度降低;同时伴有二价微量元素血浓度的改变。有不同研究小组发现精神分裂症个体血浆和脑脊液珠蛋白水平显著高于正常对照(Wong CT etal.,Acute phase proteins in male Chinese schizophrenic patients inSingapore.Schizophr.Res.1996;22,165-171);单卵双生子的研究亦表明精神分裂症患者的珠蛋白水平显著高于非患者(Vander Putten DM et al.,Plasma protein variations in monozygotic twins discordant forschizophrenia.Biol.Psychiatry 1996;40,437-442)。这些研究提示血浆及脑脊液等体液中可能蕴涵着与精神分裂症有关的重要信息。
在血浆蛋白质组水平上研究精神分裂症为诊断和治疗这一疾病提供了新的希望,蛋白质组学的技术发展也为研究者提供了有利条件,但目前国际上用血浆蛋白表达谱研究精神分裂症的文章还非常少。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的不足及临床上对精神分裂症确切诊断的需求,提供一种通过检测血浆中表达的蛋白质水平来诊断精神分裂症的方法,以期利用这一方法进行精神分裂症的分子生物学诊断,为目前量表分析的诊断方法提供更高的准确性和客观性。
为实现上述发明目的,本发明利用双向凝胶电泳的方法分离待测个体血浆蛋白质,从双向凝胶电泳图谱上得到α珠蛋白、α1抗胰蛋白酶、α1巨球蛋白、血清淀粉样蛋白P组份、抗纤维蛋白酶III和维生素D结合蛋白的表达量,并将此六个特异性蛋白的表达量作为判断被测个体是否患精神分裂症的参考依据。当被测者血浆中这些蛋白质的表达量高于参考值时,可确定该被测者患精神分裂症,从而达到利用分子标记客观地诊断精神分裂症的目的。
本发明的方法包括如下步骤:
(1)收集待测者的静脉血液样品,经离心分离得到血浆;
(2)紫外分光光度计测定血浆蛋白浓度;取含0.8mg蛋白的血浆,用样品缓冲液稀释血浆至450ul,样品缓冲液的成份是:7M尿素,2M硫尿,4%CHAPS,60mM二硫苏糖醇,0.5%IPG缓冲液;离心得到可进行第一相等电聚焦电泳的样品;
(3)经离心后的样品通过水化上样的方式上样至24cm、pH4-7非线性干胶条,进行第一相等电聚焦电泳;第一相等电聚焦电泳完成后,将胶条放入含0.02%二硫苏糖醇的胶条平衡液平衡一次;再将胶条放入含0.025%碘乙酰胺的胶条平衡液平衡一次,胶条平衡液的成份是6M尿素,1.5MTris-Cl,30%甘油和20%十二烷基硫酸钠;平衡后的胶条进行12.5%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺电泳,得到一张二维电泳凝胶;
(4)将二维电泳凝胶经固定、染色、脱色三个步骤完成考马斯亮蓝染色,得到一张染色后的二维电泳凝胶;
(5)用图像扫描仪对染色后的二维电泳凝胶进行扫描得到一张二维电泳凝胶图谱;
(6)用二维电泳凝胶图像分析软件分析二维电泳凝胶图谱上α珠蛋白、α1抗胰蛋白酶、α1巨球蛋白、血清淀粉样蛋白P组份、抗纤维蛋白酶III和维生素D结合蛋白的表达量,得到上述可用于精神分裂症诊断的六个血浆特异性蛋白的相对表达量。
将上述方法测得的六个蛋白相对表达量与精神分裂症病人的参考值进行比较,当它们的浓度高于参考值时,表示该个体患精神分裂症,当它们的浓度低于参考值时,表示该个体不患有精神分裂症,由此可根据比较结果综合判断被测个体是否患精神分裂症。
在六个血浆差异表达的蛋白质中,α珠蛋白、α1抗胰蛋白酶、α1巨球蛋白、血清淀粉样蛋白P组份这4种蛋白都属于阳性急性期反应蛋白,此4种蛋白质的表达量一致表现为在精神分裂症病人中高于正常人。这一结果与精神免疫学方面对血浆及脑脊液的研究相互支持。珠蛋白在病人的表达量是正常人的1.89倍,其变化最为明显。珠蛋白表达量是本发明方法中的最重要的一个标准。
本发明首次提出利用上述六个血浆特异性蛋白可进行精神分裂症的临床诊断,而此六个血浆特异性蛋白的含量测定并不限于凝胶电泳方法,还可以采用其它方法,如酶免疫测定方法。酶免疫测定方法的过程是:先将上述蛋白的单克隆或多克隆抗体固定于微量滴定板或膜上;然后加入人血浆进行免疫反应;之后再加入酶标抗体进行底物显色反应;最后用酶标仪测定吸光度,根据吸光度计算上述蛋白的浓度。
本发明提供的精神分裂症的分子水平的诊断方法与目前正在使用的依据各种量表评价的诊断方法相比,它是一种客观的方法,不依赖于医生对诊断对象的主观判断。由于血浆具有取材方便,无创伤性,并可连续检测的优点,因此本发明使诊断具有极大的临床应用的可能。
本发明涉及的6种血浆蛋白质不仅是疾病诊断的分子标记,也是该疾病的药物候选靶点。本发明的诊断精神分裂症的方法,不仅适用于人类,也可诊断实验动物,用于精神分裂症治疗药物的开发和药效的评价,促进开发治疗精神分裂症药物的进程。
附图说明
图1为血浆蛋白双向电泳图谱。
图1中,点1是抗纤维蛋白酶III,点2,3,4是维生素D结合蛋白;点5,6,7,8是α1抗胰蛋白酶;点13是α1巨球蛋白;点14是血清淀粉样蛋白P组份;点16,17,18是α珠蛋白。
具体实施方式
本发明将结合基于双向电泳方法寻找精神分裂症的诊断标记这一具体实施例作进一步说明,这一实施例仅用于支持本发明的技术方案,而不用于限制本
发明范围。
精神分裂症患者来自于上海市精神卫生中心,以CCMD-2-R(中国精神病分类方案与诊断标准第二版修订版)为诊断标准。匹配的对照个体由上海地区医院门诊部提供,未经诊断是否患精神分裂症。在经过本人或患者家属同意的前提下采集血液,并签署了经上海市人类遗传资源委员会批准的知情同意书。
采集到的静脉血经2000rpm×4℃×10min离心分离血浆,Beckman DUSeries 600紫外分光光度计测定蛋白浓度,蛋白浓度为60-80mg/ml,分装后于-80℃保存。取0.8mg的血浆蛋白(约13ul的血浆),用第一相电泳的样品缓冲液稀释血浆至450ul。第一相电泳的样品缓冲液的成分为:7M尿素,2M硫尿,4%CHAPS,60mM二硫苏糖醇,0.5%IPG缓冲液(Amersham Biosciences),少量溴酚兰。经49,000rpm×4℃×15分钟离心,得到可进行第一相等电聚焦电泳的样品。
经离心后的样品通过水化上样的方式上样至24cm、pH4-7非线性干胶条(Amersham Biosciences)上,上样量为0.8mg/胶条。胶条水化和第一相等电聚焦电泳均是在Amersham IPGphor上进行的。水化和等电聚焦电泳程序为:100V,1400Vhr;500V,500Vhr;1000V,1000Vhr;4000V,4000Vhr;8000V,72000Vhrs。
第一相等电聚焦电泳完成后,从Amersham IPGphor上取下干胶条,进行两次胶条平衡。第一次是将IPG胶条浸泡在10ml含二硫苏糖醇的平衡溶液中,二硫苏糖醇浓度为0.02g/ml。第二次用碘乙酰胺代替二硫苏糖醇,碘乙酰胺浓度为0.025g/ml。每步平衡时间约为15分钟。胶条平衡液的组成是:6M尿素,1.5MTris-Cl(PH 8.8),30%甘油,20%十二烷基硫酸钠。
平衡后的胶条应立即进行12.5%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺电泳,电泳缓冲液是Tris-甘氨酸。电泳是在Amersham EttanDALTsix中进行的,电泳的方式采取恒定功率,分两步进行(第一步:2.5瓦/胶,30分钟;第二步:15瓦/胶,4小时)。二相电泳结束后,得到一张二维电泳凝胶。
用50%甲醇、5%正磷酸固定凝胶2小时;8%硫酸铵,5%正磷酸,0.1%w/v考马斯亮蓝染料G-250,20%甲醇,12小时染色;染色后的脱色分三步进行,每一步使用20%硫酸铵脱色溶液,最后一次在脱色液中加入几滴叠氮钠以防止细菌污染。由此得到一张染色后的二维电泳凝胶。
质谱分析前的蛋白点处理是在Ettan蛋白点自动处理工作台(AmershamBiosciences)中完成的。二维凝胶上的蛋白点经过蛋白点的切割、脱色、干燥、酶解、肽段混合物提取的步骤,最后点样至特定的质谱点样板上。蛋白的质谱分析是在MALDI-ToF-MS/Pro(Amersham Biosciences)中通过单个质谱获取肽质量谱完成的。肽质量谱在蛋白数据库中的自动搜索是借助于仪器自带的软件包完成的。
凝胶图像扫描在Amersham ImageScanner图像扫描仪中进行,扫描后得到一张二维电泳凝胶图谱,如图1所示。
血浆样品二维凝胶的图像分析以及蛋白点的定量用Amersham ImageMasterPlatium软件完成。精神分裂症患者和正常人之间血浆蛋白表达差异的显著性是通过Student’s two-tailed t-test计算得到的。42个精神分裂症患者和46个正常人之间血浆蛋白表达差异的显著性是通过SPSS 10.0软件计算得到的。在病人组和正常对照组间血浆蛋白表达有差别的蛋白有6种,表达量见下表:
表1.精神分裂症患者和正常人血浆蛋白的表达相对量
蛋白质 | 精神分裂症组/参考值 | 正常对照组 | P值 |
α珠蛋白α1抗胰蛋白酶α1巨球蛋白血清淀粉样蛋白P组份抗纤维蛋白酶III维生素D结合蛋白 | 1.25±0.412.54±0.610.04±0.010.12±0.040.17±0.040.25±0.08 | 0.66±0.32.08±0.490.03±0.010.10±0.050.14±0.050.19±0.06 | <0.01<0.01<0.010.034<0.01<0.01 |
注:表中各栏是某一蛋白质的表达量在总血浆蛋白中的百分数,数据用均值±标准差表示。
6个差异表达的蛋白质中有α珠蛋白、α1抗胰蛋白酶、α1巨球蛋白、血清淀粉样蛋白P组份这4种蛋白属于阳性急性期反应蛋白,此4种蛋白质的表达量在精神分裂症病人中高于正常人。这反映了精神分裂症发病期间伴随着急性期反应。在6个血浆差异表达的蛋白质中,珠蛋白在病人的表达量是正常人的1.89倍,其变化最为明显,被测者血浆中珠蛋白的表达量是本发明中一项诊断精神分裂症的最重要的数据。
Claims (1)
1、一种血浆特异性蛋白获取方法,其特征在于包括以下步骤:
1)收集待测者的静脉血液样品,经离心分离得到血浆;
2)紫外分光光度计测定血浆蛋白浓度;取含0.8mg蛋白的血浆,用样品缓冲液稀释血浆至450ul,样品缓冲液的成份是:7M尿素,2M硫尿,4%CHAPS,60mM二硫苏糖醇,0.5%IPG缓冲液;最后离心得到可进行第一相等电聚焦电泳的样品;
3)经离心后的样品通过水化上样的方式上样至24cm、pH4-7非线性干胶条,进行第一相等电聚焦电泳;第一相等电聚焦电泳完成后,将胶条放入含0.02%二硫苏糖醇的胶条平衡液平衡一次;再将胶条放入含0.025%碘乙酰胺的胶条平衡液平衡一次,胶条平衡液的成份是6M尿素,1.5M Tris-Cl,30%甘油和20%十二烷基硫酸钠;平衡后的胶条进行12.5%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺电泳,得到一张二维电泳凝胶;
4)将二维电泳凝胶经固定、染色、脱色三个步骤完成考马斯亮蓝染色,得到一张染色后的二维电泳凝胶;
5)用图像扫描仪对染色后的二维电泳凝胶进行扫描,得到一张二维电泳凝胶图谱;
6)用二维电泳凝胶图像分析软件分析二维电泳凝胶图谱上α珠蛋白、α1抗胰蛋白酶、α1巨球蛋白、血清淀粉样蛋白P组份、抗纤维蛋白酶III和维生素D结合蛋白的表达量,得到上述六个血浆特异性蛋白的相对表达量。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CNB2005100241028A CN1300588C (zh) | 2005-02-28 | 2005-02-28 | 用于精神分裂症诊断的血浆特异性蛋白获取方法及应用 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CNB2005100241028A CN1300588C (zh) | 2005-02-28 | 2005-02-28 | 用于精神分裂症诊断的血浆特异性蛋白获取方法及应用 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN1654957A CN1654957A (zh) | 2005-08-17 |
CN1300588C true CN1300588C (zh) | 2007-02-14 |
Family
ID=34894325
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CNB2005100241028A Expired - Fee Related CN1300588C (zh) | 2005-02-28 | 2005-02-28 | 用于精神分裂症诊断的血浆特异性蛋白获取方法及应用 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN1300588C (zh) |
Families Citing this family (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP2656081B1 (en) | 2010-12-20 | 2017-09-06 | Cambridge Enterprise Ltd. | Method and biomarkers for differentially diagnosing psychotic disorders |
CN110702917B (zh) * | 2019-09-05 | 2023-08-15 | 首都医科大学附属北京安定医院 | 血清淀粉样蛋白p在制备抑郁症诊断治疗相关产品的用途 |
CN113004422B (zh) * | 2021-03-04 | 2023-01-20 | 辽宁成大生物股份有限公司 | 一种融合蛋白、含其的疫苗及其应用 |
Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5429947A (en) * | 1992-06-17 | 1995-07-04 | Merril; Carl R. | Diagnosing Alzheimer's disease and schizophrenia |
WO1998040748A1 (en) * | 1997-03-14 | 1998-09-17 | Neuromark | Diagnosing neurologic disorders |
CN1300320A (zh) * | 1998-04-02 | 2001-06-20 | 耶达研究与开发有限公司 | 一种基于新肽的精神分裂症诊断方法 |
WO2001063293A2 (en) * | 2000-02-24 | 2001-08-30 | Oxford Glycosciences (Uk) Ltd. | Diagnosis and treatment of schizophrenia |
EP1420068A1 (en) * | 2001-07-27 | 2004-05-19 | Japan as represented by President of Niigata University | Method of analyzing nucleic acid specifying gene showing change in expression dose in schizophrenia |
-
2005
- 2005-02-28 CN CNB2005100241028A patent/CN1300588C/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5429947A (en) * | 1992-06-17 | 1995-07-04 | Merril; Carl R. | Diagnosing Alzheimer's disease and schizophrenia |
WO1998040748A1 (en) * | 1997-03-14 | 1998-09-17 | Neuromark | Diagnosing neurologic disorders |
CN1300320A (zh) * | 1998-04-02 | 2001-06-20 | 耶达研究与开发有限公司 | 一种基于新肽的精神分裂症诊断方法 |
WO2001063293A2 (en) * | 2000-02-24 | 2001-08-30 | Oxford Glycosciences (Uk) Ltd. | Diagnosis and treatment of schizophrenia |
EP1420068A1 (en) * | 2001-07-27 | 2004-05-19 | Japan as represented by President of Niigata University | Method of analyzing nucleic acid specifying gene showing change in expression dose in schizophrenia |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN1654957A (zh) | 2005-08-17 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Khachaturian | Diagnosis of Alzheimer's disease | |
Suomalainen | Biomarkers for mitochondrial respiratory chain disorders | |
EP3422010A1 (en) | Novel biomarkers for cognitive impairment and methods for detecting cognitive impairment using such biomarkers | |
CN111351945B (zh) | 维生素d结合蛋白作为标志物在精神疾病抑郁症诊断中的应用 | |
CA2460001A1 (en) | Diagnostic assay | |
Kirch et al. | Abnormal cerebrospinal fluid protein indices in schizophrenia | |
EP0591290A1 (en) | Fluorophore assisted carbohydrate electrophoresis diagnosis | |
CN101356439A (zh) | 纤维化标记 | |
CN1300588C (zh) | 用于精神分裂症诊断的血浆特异性蛋白获取方法及应用 | |
CN111413492A (zh) | 一种用于检测新型冠状病毒covid-2019肺炎的方法及系统 | |
Scheytt et al. | Increased gene expression of growth associated protein-43 in skin of patients with early-stage peripheral neuropathies | |
CN1916632A (zh) | Cd146分子的检测方法及其应用 | |
US20110195434A1 (en) | Method for the analysis of solid objects | |
CN117612729A (zh) | 基于临床化验指标预判胡蜂蛰伤病人轻症或重症的方法 | |
VOLK et al. | Protein profile in multiple sclerosis | |
Almkvist et al. | Neuropsychological assessment of dementia: state of the art | |
CN1871519A (zh) | 用于诊断阿尔茨海默氏病的快速检测方法 | |
US20050079099A1 (en) | Generation of biochemical images and methods of use | |
DE69432561T2 (de) | Diagnose mentaler störungen | |
Nalbandian et al. | Automated mass screening for hemoglobin S: a rational method. | |
Papadopoulos | Abrnomal lipoprotein patterns in human serum as determined by agarose gel electrophoresis. | |
CN115480063A (zh) | 用于预测帕金森病患者认知下降的标记物及其用途 | |
CN109406795A (zh) | 一种轻型脑外伤的血清分子诊断标记物及应用 | |
US7125724B2 (en) | Method for identification and/or diagnosis of REM sleep loss from blood samples | |
Ambekar et al. | Quantitative Characterization of Nonsclerotic Glomeruli Is Prognostic of Clinical Outcomes in Proteinuric Diseases: FR-OR56 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C14 | Grant of patent or utility model | ||
GR01 | Patent grant | ||
C17 | Cessation of patent right | ||
CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20070214 Termination date: 20140228 |