CN1171995C - 一种基于新肽的精神分裂症诊断方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及可与精神分裂症患者体液中水平升高而在非精神分裂症者体液中水平更低或根本不存在的抗体结合的肽。利用计算机程序预测出本发明肽的抗原表位含由带正电荷的氨基酸包围的疏水性氨基酸核心。本发明肽在个体中精神分裂症的诊断方面有应用价值。

Description

一种基于新肽的精神分裂症诊断方法
发明领域
本发明一般涉及精神紊乱诊断试验的领域。更具体地说，本发明提供了精神分裂症的一种诊断试验。
现有技术
以下是本发明说明书中引用的现有技术资料目录。
1.Carpenter，W.T.，和Buchanan，R.W.综述，新英格兰医学杂志(N.Engl.Med.)， 330：681-690，1994.
2.Knight，J.G.，实验和临床药理学研究(Find.Exp.Clin.Pharmacol.)， 6：395-408，1984.
3.De Lisi，L.E.，和Crow，T.J.，北美临床精神病学(Psychiatr.Clin.North Am.)， 9：115-132，1987.
4.Ganguli，R.，Rabin，B.S.，Kelly，R.H.，Lyte，M.和Ragu，U.，纽约科学院科学年鉴(Ann.N.Y.Acad.Sci.)， 496：676-690，1987.
5.Shinitzky，M.，Deckmann，M.，Kessler，A.，Sirota，P.，A.和Elizur，A.，纽约科学院科学年鉴， 621：205-217，1991.
6.Deckmann，M.，Shinitzky，M.，Leykin，I.，cheng，D.，Guy，J.，Avnon，M.，Salganik，I.，Amiri，Z.，Schlossberg，A.，Leibu，E.，和Rafael，C.，意大利精神病学和行为科学杂志(J.Psychiatr.Behav.Sci.)， 6：29-34，1996.
7.PCT专利申请公开WO 95/23970
在此对上述技术的参考不能理解为本发明以任何方式与其权利要求限定的专利性相关。
在下文中，以标出它们在上述目录中的序号来表示对上述出版物的参考。
发明背景
精神分裂症是一种包含多种诸如幻听，偏执狂，妄觉，紧张症，怪异行为或情感减退等精神症状的综合症。精神分裂症影响约1％总人口，其经济和社会负担巨大。精神分裂症发病早，故患者通常需要终生的医疗和精神病学的监护。因此，在工业化的社会中，精神分裂症是花费最高的疾病之一[1]。
与精神分裂症相关的已知危险因素有许多如遗传因素、冬季分娩以及妊娠和分娩并发症等。病毒感染和继发的自身免疫反应也已列为一种可能的致病因素2-4。与对照组、双极人格、抑郁症和人格紊乱者或情感分裂型(schizoeffective)患者相比较表明，精神分裂症患者、发狂患者体内抗血小板自身抗体水平升高5-6。Western Blot分析表明，精神分裂症患者来源的自身抗体所识别的血小板抗原谱与自身免疫反应性血小板减少症和痴呆症患者自身抗体所识别的血小板抗原谱不同7。与精神分裂症患者来源的自身抗体特异性结合的抗原已通过其分子量得到了鉴定。
发明概述
根据本发明，证实了数种可与精神分裂症患者体液中发现的水平升高的自身抗体结合的蛋白质。这些蛋白质结合的抗体基本上是血小板相关性自身抗体(PAA)，这些精神分裂症患者来源的自身抗体(在下文中精神分裂症来源的自身抗体简写为SDA)能够与上述抗原结合，但非精神分裂症者对照来源的自身抗体(在下文中非精神分裂症者来源的自身抗体简写为NSDA)不与上述抗原结合。
能够与SDA结合的蛋白质被确定后，进一步用化学和酶学方法来确定其特性。在已确定的有免疫反应性的蛋白质中有些是公知的蛋白质，如3-磷酸甘油醛脱氢酶(G3PD)、烯醇化酶、角蛋白、肝细胞生长因子、细胞外钙传感受体(extracellular calcium sensingreceptor)等。通过消化兔蛋白烯醇化酶，发现了一种与SDA有高结合活性的免疫活性肽。
该肽，即烯醇化酶的免疫活性表位，包含序列如下的28个氨基酸：
SGETEDTFIADLVVGLCTGQIKTGAPCR(Seq.ID No.1)
以此肽为依据，合成其它肽，并鉴定出了一些高活性肽(即，同与NSDA的结合活性低或根本不与NSDA结合的肽比较起来，此肽与SDA有高结合活性)。而且，合成的活性肽第一次能够将精神分裂症患者和非精神分裂症个体来源的血浆区分开来。
进一步分析合成的高反应活性肽中的一个肽(Seq.ID No.2)表明该肽借助两个半胱氨酸形成了一个环，并借助其余游离半胱氨酸形成二聚体，这种结构的肽与SDA结合能力最强。
如下所述，本发明合成的高活性肽的抗原表位似乎是一种三维空间表位。
因此，本发明提供了可与精神分裂症患者体液中发现的水平升高的抗体结合的肽。
本发明进一步提供了能够与精神分裂症患者体液中发现的水平升高的抗体结合的肽，其中此肽结合的抗体能够特异性地与具有如下氨基酸序列的肽结合：LVVGLCTCQIKTGPAC(I.D No.2)。此类肽的几个非限制性例子如下：
iii.IADLVVGLCTGQIKTGAPCR(Seq.I.D.No.3)
iv.ADLVVGLCTGQIKTGAPCR(Seq.I.D.No.4)
v.DLVVGLCTGQIKTGAPCR(Seq.I.D.No.5)
vi.LVVGLCTGQIKTGAPCR(Seq.I.D.No.6)
vii.LVVGLCTGQIKTGPACR(Seq.I.D.No.7)
viii.LVVGLCTPQIKTGPACR(Seq.I.D.No.8)
本发明也提供了一种能够与精神分裂症患者体液中发现的水平升高的抗体结合的肽，此类肽能够结合的抗体不与选自如下的肽结合：
i.SGETEDTFIADLVVGLCTGQ(Seq.I.D.No.9)
ii.VVGLCTGQIKTGAPCR(Seq.I.D.No.10)
iii.CTGQIKTGAPCR(Seq.I.D.No.11)
iv.LVVGLCTGQIKTGAPC(Seq.ID.No.12)
v.LVVGLCTGQIKTGAP(Seq.ID No.13)
vi.LVVGLCTGQIKTGPAC(Seq.ID No.14)
本发明也提供了一种能够与精神分裂症患者体液中发现的水平升高的抗体结合的肽，这种肽包含选自如下的氨基酸序列：
i.SGETEDTFIADLVVGLCTGQIKTGAPCR(Seq.I.D.No.1)
ii.LVVGLCTCQIKTGPAC(Seq.I.D.No.2)
iii.IADLVVGLCTGQIKTGAPCR(Seq.I.D.No.3)
iv.ADLVVGLCTGQIKTGAPCR(Seq.I.D.No.4)
v.DLVVGLCTGQIKTGAPCR(Seq.I.D.No.5)
vi.LVVGLCTGQIKTGAPCR(Seq.I.D.No.6)
vii.LVVGLCTGQIKTGPACR(Seq.I.D.No.7)
viii.LVVGLCTPQIKTGPACR(Seq.I.D.No.8)
根据优选实施方案，本发明提供了一种能够与精神分裂症患者体液中发现的水平升高的抗体结合的肽，其选自如下的肽：
i.SGETEDTFIADLVVGLCTGQIKTGAPCR(Seq.I.D.No.1)
ii.LVVGLCTCQIKTGPAC(Seq.I.D.No.2)
iii.IADLVVGLCTGQIKTGAPCR(Seq.I.D.No.3)
iv.ADLVVGLCTGQIKTGAPCR(Seq.I.D.No.4)
v.DLVVGLCTGQIKTGAPCR(Seq.I.D.No.5)
vi.LVVGLCTGQIKTGAPCR(Seq.I.D.No.6)
vii.LVVGLCTGQIKTGPACR(Seq.I.D.No.7)
viii.LVVGLCTPQIKTGPACR(Seq.I.D.No.8)
上面(和此后)用来表示特定氨基酸的字母与IUPAC-IUB生化命名委员会推荐的单字母氨基酸符号一致。
不囿于理论，以本发明获得的结果为依据，可清楚看出，同与NSDA的结合比较起来，与SDA以相当高水平结合的肽的抗原表位结构是一三维表位。通过以最小能量计算法为基础的计算机程序预测本发明肽的抗原表位为一环状结构，其中包含一疏水核心和一带约两个正电荷的延伸区。带正电荷的延伸区可以以其可能的多种空间方位之一存在。
本发明肽与多种抗体的结合活性可以以任一公知的方法如酶联免疫吸附试验或Western Blotting等方法来确定。例如，可通过下列方法检测肽与抗体的结合活性：将肽进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，转移到PVDS膜上，与SDA反应并比较它们与NSDA的反应性。
本发明肽与PAA的结合程度能够以任何本领域公知的检测系统如可检测标记物标记的抗人免疫球蛋白或其片段的抗体来确定。标记物可能是一种放射性基团、荧光基团，能够催化生成一种可检测产物的酶或能够被亲合素检测的生物素基团等。
这方面的优选实施方案中，将本发明的肽结合到一种固相支持物如PVDF膜上，与被检测样品反应，利用可检测标记物标记的抗人Fc抗体确定样品中PAA的结合水平。
根据具体的实施例，以辣根过氧化酶标记的抗人Fc抗体(SIGMA)并以Fast-DABTM(SIGMA)或4-氯萘酚(SIGMA)为显色试剂确定与检测肽结合的自身抗体水平。
本发明检测肽与SDA的结合“实质性高于”其与NSDA的结合，意味着以任何本领域公知的统计学方法(如Student’s t检验)分析上述实验结果的相关性，该肽与SDA的结合水平都应该在统计学上显著地高于其与NSDA的结合。
上述肽的类似物也构成了本发明的一个方面。本领域的熟练技术人员能够理解本发明肽的氨基酸序列可以改变，例如插入，替代，或缺失一个或更多的氨基酸而基本上不改变肽与SDA的结合能力。例如，可以用属于同一家族的甘氨酸或缬氨酸替代本发明肽氨基酸序列中第一位亮氨酸而并不改变其结合活性。根据可查找的公知的氨基酸家族分类，例如在Alberts B等编著的《细胞的分子生物学》书(Garland出版，纽约和伦敦，第二版，1989，54-55页)中可查找，本领域的熟练技术人员不难确定肽中的每一个氨基酸能够被哪一个氨基酸所代替。
本发明范围内肽的类似物是一类和SDA的结合活性与所述肽基本相同的肽，即以本领域公知的任一方法如实施例1所描述的方法确定出此类肽与SDA的结合水平比与NSDA的结合水平更高。
本发明肽能够以酶(例如：梭菌蛋白酶)消化或化学方法(例如：溴化氰)消化一种更长的蛋白质获得。在此条件下，以本领域公知的方法如RP-HPLC分离生成的肽，测定分离肽的序列(如Eurosequenceb.v.(Nijenborgh 4；9749 Gronigen；The Netherlands))，并以上述方法分析它们与SDA的结合能力。
本发明肽也可以通过本领域公知的方法如由Eurosequence b.v.在Abimed 522按10微摩尔的量合成(详细说明见下面的例子)，以上述任何一种方法确定新合成肽的结合活性。
本发明的肽能够将精神分裂症患者和非精神分裂症者来源的样品区分开来，因此，在个体精神分裂症的诊断方面有用。另外一方面，本发明提供了一种可应用于个体精神分裂症诊断的肽，此肽能够与精神分裂症患者体液中发现的水平升高的抗体结合。
被检测者的样品通常上是含血小板血液样品的含PAA组分。但根据本发明，直接检测被检者血浆而无需先从样品中分离PAA以确定患精神分裂症的可能性第一次成为可能。因此根据本发明，待检测者的样品可以是血浆或以本领域任何公知的方法从其中分离的含PAA的成份(例如获得富含血小板的血浆(PRA)并从中分离PAA)。
与得自非精神分裂症者对照的样品比较，本发明的肽能够不同程度的与精神分裂症患者来源的样品中血小板衍生自身抗体结合，因此，该肽可应用于个体精神分裂症的诊断。因此，本发明的另外一方面是提供一种个体精神分裂症的诊断试验，包含以下步骤：
(a)采集待检测者的样品，样品为：全血、包含血小板的成份，或含从血小板上脱落的血小板相关抗体(PAA)的成份；
(b)将所述样品与能够与精神分裂症患者体液中发现的水平升高的抗体结合的肽接触；
(c)确定所述肽与样品的结合水平，如果结合水平高于该肽与非精神分裂症者样品的结合水平则表明该检测者患精神分裂症的可能性高。
在更进一步的实施方案中，上述步骤(b)中肽是可以和能够与具Seq.I.D.No.2氨基酸序列的肽特异性地结合的抗体结合的肽，另一实施方案中，上述步骤(b)中的肽包含选自如下的氨基酸序列：
i.SGETEDTFIADLVVGLCTGQIKTGAPCR(Seq.I.D.No.1)
i.LVVGLCTCQIKTGPAC(Seq.I.D.No.2)
iii.IADLVVGLCTGQIKTGAPCR(Seq.I.D.No.3)
iv.ADLVVGLCTGQIKTGAPCR(Seq.I.D.No.4)
v.DLVVGLCTGQIKTGAPCR(Seq.I.D.No.5)
vi.LVVGLCTGQIKTGAPCR(Seq.I.D.No.6)
vii.LVVGLCTGQIKTGPACR(Seq.I.D.No.7)
viii.LVVGLCTPQIKTGPACR(Seq.I.D.No.8)
在一优选的实施方案中，步骤(b)中的肽选自如下的肽：
i.SGETEDTFIADLVVGLCTGQIKTGAPCR(Seq.I.D.No.1)
ii.LVVGLCTCQIKTGPAC(Seq.I.D.No.2)
iii.IADLVVGLCTGQIKTGAPCR(Seq.I.D.No.3)
iv.ADLVVGLCTGQIKTGAPCR(Seq.I.D.No.4)
v.DLVVGLCTGQIKTGAPCR(Seq.I.D.No.5)
vi.LVVGLCTGQIKTGAPCR(Seq.I.D.No.6)
vii.LVVGLCTGQIKTGPACR(Seq.I.D.No.7)
本发明也提供了上述试验中有用的试剂盒。该试剂盒包含：其上固定了一种或更多种本发明肽的支持物，抗人免疫球蛋白抗体或其片段。抗人免疫球蛋白抗体可以偶联了可检测标记物，或者，该试剂盒可同时也包含一种抗所述一抗的二抗，其中二抗偶联了可检测的标记物。该试剂盒也包含试验实施所需的各种试剂和使用说明书。
参考以下非限制性的具体实施方案和附图说明本发明。
附图简述
图1是具Seq.I.D.No.2序列的肽14与从精神分裂症患者样品中制备的PAA的结合活性(图1A)和该肽与从非精神分裂症者样品中制备的PAA的结合活性(图1B)图解说明。以序列为Seq.I.D.No.9的肽作为阴性对照。
图2是肽14(Seq.I.D.No.2)与精神分裂症患者的血浆样品的结合活性(图2A)和该肽与非精神分裂症者的血浆样品结合活性(图2B)图解说明。以序列为Seq.I.D.No.9的肽作为阴性对照。
图3是基于最小能量计算法的计算机程序预测的本发明肽抗原表位三维空间结构示意图。
图4为从公开肽数据库中得到的烯醇化酶三维结构X-射线并与本发明肽水模型比较。
以下列字母表示该表位中的氨基酸：
L＝亮氨酸
A＝丙氨酸
P＝脯氨酸
R＝精氨酸
K＝赖氨酸
实施例
材料和方法
1.血小板和抗血小板自身抗体
以肝素为抗凝剂，采集患者和对照的静脉血(20ml)。室温下离心(100g，20分钟)获得富含血小板的血浆(PRA)。以添加10mM EDTA为抗凝剂的磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤三次(4000g；15分钟；4℃)制备无血浆的血小板。为分离抗血小板抗体，在室温下将血小板和0.1M甘氨酸/10mM EDTA，pH2.8共同孵育10分钟后离心(4000g；15分钟；4℃)，以饱和Na2PO4溶液中和含抗血小板抗体的上清液，-20℃下保存待用。
2.制备型等电聚焦
O型血的血小板浓缩物购自当地血站，以PBS/10mM EDTA(4000g；15分钟；4℃)洗涤3-5次直到上清液中无血浆为止。以20ml 0.5％Triton X-100/0.5％NP40水溶液室温下轻轻摇动溶解血小板(大约20份浓缩物)15分钟。离心悬浮液(10000g；15分钟；4℃)，移取上清并以0.1％Triton X-100水溶液再抽提沉淀2次，合并三次的上清液并加入AmpholyteTM3/10(Bio-Rad)使终浓度为1％。将该溶液装入ROTOFORTM槽中(容量60ml)，按厂家(Bio-Rad)仪器操作说明书进行制备型等电聚焦。通常4.5小时完成聚焦(10℃；10瓦恒定功率)。收集20个组分并确定各组分的pH值(pH梯度1.5-12)，-20℃下保存待用。
3.免疫反应性组分的鉴定
按以下的方法确定组分的免疫反应性：以聚丙烯酰胺(10％)凝胶电泳分析各个组分，转移至PVDF膜上，以1ml自身抗体在50ml孵育缓冲液中与膜杂交，以SIGMA的辣根过氧化酶偶联的抗人Fc抗体(山羊)(1∶500稀释)并以Fast-DABTM(SIGMA)或4-氯萘酚(SIGMA)为显色试剂，检测结合的人抗血小板抗体。在pH6.0-10.0间的组分中检测到免疫反应性。
4.制备型聚丙烯酰胺(8％)凝胶电泳
合并免疫反应性组分(pH6-10)，按制造商仪器说明书方法用Bio-Rad的PrepCell在还原条件下进行制备型SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(8％，8cm高)，按照分子量大小分离组分。收集1.5ml级分(n＝400)：每10个级分取一样品经SDS凝胶电泳并银染确定分子大小在400个级分中的分布情况。
5.免疫反应性级分的鉴定
每5个级分(0.1ml)取一样品，用Bio-Rad的DotBlot装置(96孔)将其点印迹到PVDF膜上。按上述方法确定免疫反应性组分(1.3)。
6.免疫反应性蛋白质的鉴定
如前所述，鉴定了多个免疫反应性的蛋白质。优先测定免疫反应性与蛋白质量比值高的蛋白质序列。基本上按如下方法制备样品：阳性级分附近的级分(+/-10)以1.5所述的方法再次分析其免疫反应性。合并阳性级分、冻干后在分析级(0.75mm)SDS聚丙烯酰胺(10％)凝胶电泳上再分离，以考马斯亮蓝染色，切下条带，送到Eurosequenceb.v测序(酶消化，RP-HPLC分离肽后测定氨基酸序列)。
7.免疫反应性表位的鉴定
在被鉴定的蛋白质中，发现有两个蛋白质已有商品出售：
a)甘油醛-6-磷酸脱氢酶(G6PD)
b)烯醇化酶
以酶法(梭菌蛋白酶)或化学法(溴化氰)消化大约10mg蛋白质，以RP-HPLC法分离生成的肽。取部分(20％)级分由Eurosequence b.v送往Main Inventor按1.5所述方法分析其免疫反应性。仅以酶法消化的烯醇化酶产物中得到了一有活性的片段，继后由Eurosequenceb.v测定其序列。
8.肽的合成
由Eurosequence b.v在Abimed 522按10微摩尔的量合成多种肽，将肽常规溶解于1ml水/DMF/DMSO(1∶1∶1；v/v/v)中。将肽线印迹到PVDF膜上按上述方法检测其免疫反应性。
9.表位扫描
在MacIntosh计算机系统上计算本发明肽的水模型，从公开肽数据库中得到烯醇化酶的X-射线三维结构，并扫描其表面以寻找与水模型计算的肽表位相匹配的表位。
实施例1：免疫反应性蛋白质的鉴定
以1.3所述方法已确定出以下蛋白质能够与精神分裂症患者体液中发现的水平较高的自身抗体以高水平结合：
蛋白质：
甘油醛-6-磷酸脱氢酶
烯醇化酶
角蛋白
肝细胞生长因子
胞外钙传感受体。
检测上述蛋白质与精神分裂症患者和非精神分裂症患者对照的血浆的结合能力。结果表明：用上述蛋白质无法将精神分裂症患者和非精神分裂症者的血浆区分开，也就是说，结合结果不是结论性的。
通过与SDA(从精神分裂症患者样品中制备的)和NSDA(从非精神分裂症者样品中制备的)的反应，确定上述两种酶的结合活性。如下表1所示，蛋白质与SDA的结合显著高于与NSDA的结合，由能够与每种酶呈阳性反应的样品的数目来表示。
                    表1
         蛋白质与SDA与NSDA的反应性
  酶     病人(n＝8)     对照(n＝8)
    阳性     阳性
  G-3-P脱氢酶
  人来源     7/8     1/8
  猪来源     8/8     1/8
  鸡来源     7/8     2/8
  酵母来源     6/8     1/8
  枯草芽孢杆菌来源     1/8     2/8
  烯醇化酶
  兔来源     7/8     1/8
以上结果表明本发明获得的蛋白质可能在个体精神分裂症的诊断方面有用，但要求得自该个体的检测样品包含制备的血小板来源的自身抗体。这两种酶不适合直接检测血浆以诊断精神分裂症。
实施例2：鉴定被消化蛋白质中能够特异性地与SDAs结合的表位
利用化学(溴化氰)和酶法(梭菌蛋白酶)消化人G-3-P脱氢酶和兔烯醇化酶的产物鉴定其表位，只在酶消化的烯醇化酶中发现一个具免疫活性的肽(氨基酸372-399，该肽具有如下表2中的Seq.I.D.No.1序列)，即该肽与SDA的结合程度和能力高于与NSDA的结合。
以从消化的蛋白质中发现的表位序列为依据，按1.8所述的方法合成多种肽，按上述方法评估合成肽与SDA和NSDA的结合活性。
如下表2所示，合成肽中有几种肽与SDA的结合活性实质性高于与NSDA的结合活性。(表中以‘是’表示，)而其他的肽与精神分裂症患者及非精神分裂症者来源的样品的结合活性无差别(表中以‘否’表示)。
                            表2
                   肽    Seq.I.D.No. 活性
SGETEDTFIADLVVGLCTGQIKTGAPCR    (28aa)LVVGLCTCQUKTGPAC                (17aa)IADLVVGLCTGQIKTGAPCR            (20aa)ADLVVGLCTGQIKTGAPCR             (19aa)DLVVGLCTGQIKTGAPCR              (18aa)LVVGLCTGQIKTGAPCR               (17aa)LVVGLCTGQUKTGPACR               (17aa)LVVGLCTPQUKTGPACR               (17aa)SGETEDTFIADLVVGLCTGQ            (20aa)VVGLCTGQIKTGAPCR                (16aa)CTGQIKTGAPCR                    (12aa)LVVGLCTGQIKTGAPC                (16aa)LVVGLCTGQIKTGAP                 (15aa)LVVGLCTGQIKTGPAC                (16aa) 1234567891011121314 是是是是是是是是否否否否否否
在合成肽中，肽Seq.I.D.NO.2与精神分裂症患者体液中发现的水平较高的抗体的结合活性最强。
实施例3：肽Seq.I.D.NO.2的鉴定
肽Seq.I.D.NO.2(含3个半胱氨酸)合成后以激光解吸质谱分析表明，它以单体存在，并没有借助半胱氨酸形成一个环状结构。但将肽(约4mg)溶解于1ml水/DMF/DMSO(1∶1∶1；v∶v∶v)中室温下放置过夜后，肽借助两个半胱氨酸形成一个环，并借助其余的游离半胱氨酸形成二聚体，没有检测到更大的多聚体。当检测两种形式的肽与SDA的结合活性时，清楚地表明二聚体形式下的肽与SDA结合活性远高于非二聚体形式。
以化学还原法分析肽，举例来说巯基乙醇、硼氢化钠，可完全破坏其免疫活性，而氧化如空气或氧气则可恢复其免疫活性。
实施例4：肽Seq.I.D.NO.2与精神分裂症患者和非精神分裂症者的样品的结合活性
以上述方法检测肽14(Seq.I.D.NO.2)与分离的PAA的结合活性。如图1A所示，上述肽与8例精神分裂症患者中7例来源的PAA结合为阳性。图1B表明该肽不与8例非精神分裂症者来源的PAA结合，肽Seq.I.D.NO.9为阴性对照。
检测肽14(Seq.I.D.NO.2)与精神分裂症患者来源的血浆样品中SDA结合活性。如图2A所示，它能够与8例精神分裂症患者中4例的SDA结合。图2B表示上述肽不与15例非精神分裂症者中14例的NSDA结合。肽14(Seq.I.D.NO.9)为阴性对照。
实施例5：三维结构
以基于最小能量计算法的计算机程序预测本发明肽抗原表位的三维结构。
如图3所示，预测的抗原表位是一包含一疏水核心和一带约两个正电荷的延伸区的环状结构。带正电荷的延伸区可以其多种可能的空间方位之一存在。
实施例6：扫描烯醇化酶分子表面寻找与肽计算表位相匹配的表位
计算本发明肽的水模型三维结构。扫描从公开肽数据库中得到的烯醇化酶X-射线三维结构，将本发明肽的氨基酸位置与烯醇化酶分子表面的氨基酸位置相比较，确定是否能够在烯醇化酶分子表面寻找到一种与本分明肽的计算表位中的一个或多个相匹配的表位。
如图4即计算机模拟的烯醇化酶分子表面的扫描图所示，在烯醇化酶表面发现一表位，此表位包含由带正电荷的氨基酸(精氨酸、赖氨酸)包围的疏水氨基酸簇(亮氨酸、丙氨酸和脯氨酸)，它与本发明肽的模拟表位相匹配。因此，在烯醇化酶的分子表面的确能够找到本发明肽的抗原表位的预测结构。
                        序列表
(1)一般信息
(i)申请人
    (A)名称：YEDA RESEARCH AND DEVELOPMENT COMPANY LTD.
    (B)街道：THE WEIZMANN INSTITUTE OF SCIENCE
    (C)城市：REHOVOT
    (E)国家：以色列
    (F)邮编(ZIP)：P.O.BOX 95
    (G)电话：+08 9470617
    (H)传真：+08 9470739
(ii)发明题目：一种基于新肽的精神分裂症诊断方法
(iii)序列数目：14
(iv)计算机可读形式：
    (A)介质类型：软盘
    (B)计算机：IBM PC兼容机
    (C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS
    (D)软件：Patentin Release#1.0，Version#1.30(EPO)
(2)SEQ ID NO：1的资料：
(i)序列特征：
    (A)长度：28个氨基酸
    (B)类型：氨基酸
    (C)链型：未知
    (D)拓扑结构：未知
(ii)分子类型：肽
(iii)假设：无
(iv)反义：无
(v)片段类型：内部的
(xi)序列描述：SEQ ID NO：1
Ser Gly Glu Thr Glu Asp Thr Phe Ile Ala Asp Leu Val Val Gly Leu
1               5                   10                  15
Cys Thr Gly Gln Ile Lys Thr Gly Ala Pro Cys Arg
            20                  25
(2)SEQ ID NO：2资料
(i)序列特征
    (A)长度：16个氨基酸
    (B)类型：氨基酸
    (C)链型：未知
    (D)拓扑结构：未知
(ii)分子类型：肽
(ii)假设：无
(iv)反义：无
(v)片段类型：内部的
(xi)序列描述：SEQ ID NO：2
Leu Val Val Gly Leu Cys Thr Cys Gln Ile Lys Thr Gly Pro Ala Cys
1               5                   10                  15
(2)SEQ ID NO：3资料
(i)序列特征
    (A)长度：20个氨基酸
    (B)类型：氨基酸
    (C)链型：未知
    (D)拓扑结构：未知
(ii)分子类型：肽
(iii)假设：无
(iv)反义：无
(v)片段类型：内部的
(xi)序列描述：SEQ ID NO：3
Ile Ala Asp Leu Val Val Gly Leu Cys Thr Gly Gln Ile Lys Thy Gly
1               5                   10                  15
Ala Pro Cys Arg
            20
(2)SEQ ID NO：4资料
(i)序列特征
    (A)长度：19个氨基酸
    (B)类型：氨基酸
    (C)链型：未知
    (D)拓扑结构：未知
(ii)分子类型：肽
(iii)假设：无
(iv)反义：无
(v)片段类型：内部的
(xi)序列描述：SEQ ID NO：4
Ala Asp Leu Val Val Cly Lau Cys Thr Gly Gln Ile Lys Thr Gly Ala
1               5                   10                  15
Pro Cys Arg
(2)SEQ ID NO：5资料
(i)序列特征
    (A)长度：18个氨基酸
    (B)类型：氨基酸
    (C)链型：未知
    (D)拓扑结构：未知
(ii)分子类型：肽
(iii)假设：无
(iv)反义：无
(v)片段类型：内部的
(xi)序列描述：SEQ ID NO：5
Asp Leu Val Val Gly Leu Cys Thr Gly Gln Ile Lys Thr Gly Ala Pro
1               5                   10                  15
Cys Arg
(2)SEQ ID NO：6资料
(i)序列特征
    (A)长度：17个氨基酸
    (B)类型：氨基酸
    (C)链型：未知
    (D)拓扑结构：未知
(ii)分子类型：肽
(iii)假设：无
(iv)反义：无
(v)片段类型：内部的
(xi)序列描述：SEQ ID NO：6
Leu Val Val Gly Leu Cys Thr Gly Gln Ile Lys Thr Gly Ala Pro Cys Arg
1               5                   10                  15
(2)SEQ ID NO：7资料
(i)序列特征
    (A)长度：17个氨基酸
    (B)类型：氨基酸
    (C)链型：未知
    (D)拓扑结构：未知
(ii)分子类型：肽
(iii)假设：无
(iv)反义：无
(v)片段类型：内部的
(xi)序列描述：SEQ ID NO：7
Leu Val Val Gly Leu Cys Thr Gly Gln Ile Lys Thr Gly Pro Ala Cys
1               5                   10                  15
Arg
(2)SEQ ID NO：8资料
(i)序列特征
    (A)长度：17个氨基酸
    (B)类型：氨基酸
    (C)链型：未知
    (D)拓扑结构：未知
(ii)分子类型：肽
(iii)假设：无
(iv)反义：无
(v)片段类型：内部的
(xi)序列描述：SEQ ID NO：8
Leu Val Val Gly Leu Cys Thr Pro Gln Ile Lys The Gly Pro Ala Cys
1               5                   10                  15
Arg
(2)SEQ ID NO：9资料
(i)序列特征
    (A)长度：20个氨基酸
    (B)类型：氨基酸
    (C)链型：未知
    (D)拓扑结构：未知
(ii)分子类型：肽
(iii)假设：无
(iv)反义：无
(v)片段类型：内部的
(xi)序列描述：SEQ ID NO：9
Ser Gly Glu Thr Glu Asp Thr Phe Ile Ala Asp Lau Val Val GLy Leu
1               5                   10                  15
Cys Thr Gly Gln
20
(2)SEQ ID NO：10资料
(i)序列特征
    (A)长度：16个氨基酸
    (B)类型：氨基酸
    (C)链型：未知
    (D)拓扑结构：未知
(ii)分子类型：肽
(iii)假设：无
(iv)反义：无
(v)片段类型：内部的
(xi)序列描述：SEQ ID NO：10
Val Val Gly Leu Cys Thr Gly Gln Ile Lys Thr Gly Ala Pro Cys Arg
1               5                   10                  15
(2)SEQ ID NO：11资料
(i)序列特征
    (A)长度：12个氨基酸
    (B)类型：氨基酸
    (C)链型：未知
    (D)拓扑结构：未知
(ii)分子类型：肽
(iii)假设：无
(iv)反义：无
(v)片段类型：内部的
(xi)序列描述：SEQ ID NO：11
Cys Thr Gly Gln Ile Lys Thr Gly Ala Pro Cys Arg
1               5                   10
(2)SEQ ID NO：12资料
(i)序列特征
    (A)长度：16个氨基酸
    (B)类型：氨基酸
    (C)链型：未知
    (D)拓扑结构：未知
(ii)分子类型：肽
(iii)假设：无
(iv)反义：无
(v)片段类型：内部的
(xi)序列描述：SEQ ID NO：12
Leu Val Val Gly Leu Cys Thr Gly Gln Ile Lys Thr Gly Ala Pro Cys
1               5                   10                  15
(2)SEQ ID NO：13资料
(i)序列特征
    (A)长度：15个氨基酸
    (B)类型：氨基酸
    (C)链型：未知
    (D)拓扑结构：未知
(ii)分子类型：肽
(iii)假设：无
(iv)反义：无
(v)片段类型：内部的
(xi)序列描述：SEQ ID NO：13
Leu Val Val Gly Leu Cys Thr Gly Gln Ile Lys Thr Gly Ala Pro
1               5                   10              15
(2)SEQ ID NO：14资料
(i)序列特征
    (A)长度：16个氨基酸
    (B)类型：氨基酸
    (C)链型：未知
    (D)拓扑结构：未知
(ii)分子类型：肽
(iii)假设：无
(iv)反义：无
(v)片段类型：内部的
(xi)序列描述：SEQ ID NO：14
Leu Val Val Gly Leu Cys Thr Gly Gln Ile Lys Thr Gly Pro Ala Cys
1               5                   10                  15

Claims (7)

1.一种肽，该肽能够与精神分裂症患者体液中发现的水平升高的抗体结合，并且包含一种选自如下的氨基酸序列：
i.SGETEDTFIADLVVGLCTGQIKTGAPCR
ii.LVVGLCTCQIKTGPAC
iii.IADLVVGLCTGQIKTGAPCR
iv.ADLVVGLCTGQIKTGAPCR
v.DLVVGLCTGQIKTGAPCR
vi.LVVGLCTGQIKTGAPCR
vii.LVVGLCTGQIKTGPACR
viii.LVVGLCTPQIKTGPACR。
2.根据权利要求1的肽，其选自如下的肽：
i.SGETEDTFIADLVVGLCTGQIKTGAPCR
ii.LVVGLCTCQIKTGPAC
iii.IADLVVGLCTGQIKTGAPCR
iv.ADLVVGLCTGQIKTGAPCR
v.DLVVGLCTGQIKTGAPCR
vi.LVVGLCTGQIKTGAPCR
vii.LVVGLCTGQIKTGPACR
viii.LVVGLCTPQIKTGPACR。
3.根据权利要求1的肽，其中包含至少一个抗原性表位，该表位具有含一个疏水核心和一个带正电荷的延伸区的环状三维结构。
4.权利要求1或2所述肽在制备一种诊断精神分裂症的组合物中的用途。
5.一种用于精神分裂症诊断的试剂盒，其中包含：
i.其上固定有一种或多种权利要求1或2所述肽的支持物；
ii.抗人免疫球蛋白抗体或其保留了完整抗体结合特征的片段，该抗体或其片段偶联了可检测的标记物；
iii.实施检测试验所需的试剂；和
iv.使用说明书。
6.一种在体外对个体中精神分裂症进行诊断的方法，包含以下步骤：
(a)将采集自被检测者的样品和权利要求1或2所述肽相接触，该样品是血样、其包含血小板的成分、或含从血小板上脱落的血小板相关抗体的成分；和
(b)确定该肽与样品的结合水平，结合水平高于该肽与非精神分裂症者血样的结合水平则提示被检测者患精神分裂症的可能性高。
7.根据权利要求6的方法，其中采集自被检测者的样品是全血。
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