CN1300582C - Eb病毒蛋白酶联免疫吸附诊断试剂盒及其制备方法 - Google Patents

Eb病毒蛋白酶联免疫吸附诊断试剂盒及其制备方法 Download PDF

Info

Publication number
CN1300582C
CN1300582C CNB031542875A CN03154287A CN1300582C CN 1300582 C CN1300582 C CN 1300582C CN B031542875 A CNB031542875 A CN B031542875A CN 03154287 A CN03154287 A CN 03154287A CN 1300582 C CN1300582 C CN 1300582C
Authority
CN
China
Prior art keywords
epstein
barr virus
preparation
ebna1
albumen
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
CNB031542875A
Other languages
English (en)
Other versions
CN1584593A (zh
Inventor
吴文翰
陈泓霖
陈国雄
吴子柏
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
HONGKONG SHENNONG CO Ltd
Original Assignee
HONGKONG SHENNONG CO Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by HONGKONG SHENNONG CO Ltd filed Critical HONGKONG SHENNONG CO Ltd
Priority to CN2006100799382A priority Critical patent/CN101144817B/zh
Priority to CN 200610077830 priority patent/CN1920562A/zh
Priority to CNB031542875A priority patent/CN1300582C/zh
Publication of CN1584593A publication Critical patent/CN1584593A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN1300582C publication Critical patent/CN1300582C/zh
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Images

Landscapes

  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明涉及采用特定的EB病毒蛋白作为靶抗原检测血清中抗体水平的试剂盒以及EB病毒重组多肽制备酶联免疫吸附试剂盒的方法。选择血清学诊断鼻咽癌(或传染性单核细胞增多症)最具临床诊断价值的EB病毒蛋白EBNA1(BKRF1)蛋白、Zta(BZLF1)蛋白和VCA-p18蛋白作为靶抗原，用以检测血清中的抗体水平，并通过在谷胱甘肽转移酶基因融合系统中对EB病毒蛋白进行克隆、表达和纯化，创制出诊断试剂盒，从而使重组EB病毒抗原在EB病毒的原发性感染、确立EB病毒感染的抗体谱和鉴别诊断各种EB病毒感染、鉴别传染性单核细胞增多症和传染性单核细胞综合症、协助诊断疑为鼻咽癌、早期发现和评估患鼻咽癌的风险度等诊断方面得以应用。

Description

EB病毒蛋白酶联免疫吸附诊断试剂盒及其制备方法
[技术领域]
本发明涉及对鼻咽癌及其他EB病毒相关疾病进行血清学诊断的试剂盒及其制备方法，特别是采用特定的EB病毒蛋白作为靶抗原检测血清中抗体水平的试剂盒以及EB病毒重组多肽制备酶联免疫吸附试剂盒的方法。
[背景技术]
在我国，几乎100％四岁以上的人群均已感染了EB病毒，80％以上的健康成人是EB病毒携带者。EB病毒携带者血清中可以存在一种或2至3种(不是多种，即不是3种以上)低水平的(不是高水平的)抗EB病毒抗体。我国南方，特别是珠江三角洲及香港地区，是世界上鼻咽癌的高发区，而鼻咽癌的发生与EB病毒感染密切相关。我国南方及香港地区也是其他EB病毒相关疾病，例如鼻腔、鼻窦的NK/T细胞淋巴瘤、肺的淋巴上皮瘤样癌和传染性单核细胞增多症等的高发区。前两者患者血清EB病毒抗体谱与鼻咽癌患者的类同，而传染性单核细胞增多症患者血清EB病毒抗体的出现有一定的先后规律性。
目前常规地在临床上应用的血清EB病毒抗体的检测(免疫荧光法或免疫酶标法)在一定程度上欠客观性(凭个人在显微镜下计算阳性细胞的百分率)、指标较粗(采用几何级数的滴度，例如1∶20，1∶40，1∶80等，尚未采用目前数码时代的十分具体的数字表示)，且对EB病毒感染的特征针对性不强。例如鼻咽癌主要是潜伏感染伴少量溶解性感染，鼻咽癌患者血清中大多具有广谱的高水平的抗EB病毒抗体，特别是IgA抗体。又例如不能确切地显示传染性单核细胞增多症患者血清中具特征性的抗体水平(包括：p18VCA IgM、低亲和性p18VCAIgG、p18VCA IgG和EBNA1 IgG)。
酶联免疫吸附法可用于鉴别EB病毒的各种感染状态，在血清学诊断EB病毒相关疾病时，具有十分潜在的优势。目前虽已有采用酶联吸附试制盒血清学诊断EB病毒相关疾病的研究报告，但缺乏处理EB病毒抗体水平的一套新方法。如何区分高、低水平，尚无比较客观的标准。此外，应用酶联免疫吸附法时，如何克服各批号之间的差异和采用同一批号试剂盒每次检测之间的差异，目前尚无良方。
[发明内容]
本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种EB病毒蛋白酶联免疫吸附诊断试剂盒，其优化的酶联免疫吸附法(ELISA)具有客观性和EB病毒抗原的特异性，它提供了定量检测针对个体EB病毒抗原的不同免疫球蛋白抗体的亚型。这种优化的酶联免疫吸附法(ELISA)完全是新的，是传统的血清学检测法做不到的，因为传统的血清学检测法并不能明确抗原的特异性。而且，新的优化的酶联免疫吸附法(ELISA)采用了参考血清，可以纠正每批检测间的差异，保证了诊断的可靠性。
本发明选择血清学诊断鼻咽癌(或传染性单核细胞增多症)最具临床诊断价值的EB病毒蛋白(相关氨基酸序列95％的同源性)为EBNA1(BKRF1)蛋白的后一截，即：
PVGEADYFEYHQEGGPDGEPDVPPGAIEQGPADDPGEGPSTGP
RGQGDGGRRKKGGWFGKHRGQGGSNPKFENIAEGLRALLARSHVERTTDEGTWVAGVF
VYGGSKTSLYNLRRGTALAIPQCRLTPLSRLPFGMAPGPGPQPGPLRESIVCYFMVFL
QTHIFAEVLKDAIKDLVMTKPAPTCNIRVTVCSFDDGVDLPPWFPPMVEGAAAEGDDG
DDGDEGGDGDEGEEGQE
以及Zta(BZLF1)蛋白和VCA-p18蛋白(即18Kd的VCA或BFRF3蛋白)。采用这三种EB病毒蛋白作为靶抗原，用以检测血清中的抗体水平，并通过在谷胱甘肽转移酶基因融合系统中对EB病毒蛋白进行克隆、表达和纯化，创制出诊断试剂盒，从而使重组EB病毒抗原在以下诊断方面得以应用：
1、EB病毒的原发性感染；
2、确立EB病毒感染的抗体谱和鉴别诊断各种EB病毒感染；
3、鉴别传染性单核细胞增多症(Infectious mononucleosis)和传染性单核细胞综合症(Infectious mononucleosissyndrome)；
4、血清学协助诊断疑为鼻咽癌；
5、早期发现和评估患鼻咽癌的风险度。
这三种蛋白(六种抗体检测)的试剂盒可以相互互补。可以单独使用，也可以组合使用。例如：EBNA1-IgA和Zta-IgG的组合检测大大地提高了血清学诊断鼻咽癌的可靠性。即：绝大多数鼻咽癌患者既呈EBNA1-IgA阳性，又呈Zta-IgG阳性；少数鼻咽癌患者即使是EBNA1-IgA阴性，也会呈Zta-IgG阳性。而少数鼻咽癌患者即使是Zta-IgG阴性，也会呈EBNA1-IgA阳性，两者有互补作用。
许多临床上疑有鼻咽癌的人，经此组合检测后，如果EBNA1-IgA和Zta-IgG均为阴性，则90％以上可以有把握地排除是鼻咽癌患者。这对鼻咽癌高发区的医院和人群来说，无疑贡献良多。
如何在鼻咽癌高发区人群中早期发现患者，以便早期治疗，获得最佳的预后？本试剂盒的组合使用，提供了可能性。同时做EBNA1-IgA、EBNA1-IgG和Zta-IgG后显示：三者阳性是高风险人群；两者阳性是中风险人群；仅单阳者是低风险人群。这对鼻咽癌高发区人群早期发现鼻咽癌患者，又是一重大贡献。
组合使用本试剂盒也有助于传染性单核细胞增多症的诊断和判别各种类型的EB病毒感染。
总之，选择这三种EB病毒蛋白作为试剂盒的靶抗原，不但有单独使用的价值，更是一个整体性的、具有互补性的设计和临床实践(见下表)，可以组合使用，非其他试剂盒可以比拟，具有创新性，应获得权利保护。请见下表。
  酶联免疫吸附法   应用于
  EBNA1-IgAEBNA1-IgGZta-IgAZta-IgGP18VCA IgGP18VCA IgMP18VCA IgG+EBNA1-IgGEBNA1-IgA+Zta-IgG或EBNA1-IgA+Zta-IgAEBNA1-IgA+EBNA1-IgG+Zta-IgG   鼻咽癌的血清学诊断鼻咽癌和传染性单核细胞增多症的血清学诊断鼻咽癌的血清学诊断鼻咽癌的血清学诊断传染性单核细胞增多症的血清学诊断传染性单核细胞增多症急性期的血清学诊断EB病毒近期感染的血清学诊断鼻咽癌的血清学诊断患鼻咽癌的风险性评估
利用谷胱甘肽转移酶基因融合系统克隆、表达和纯化的这三种EB病毒蛋白。融合克隆蛋白的大小分别为：
EBNA-1＝40Kd；BFRF3＝44Kd；BZLF1＝53Kd。
但披覆在检测板上的抗原，已采用凝血酶(Thrombin)法从融合蛋白中脱离，因此是去除了谷胱甘肽转移酶(GST)的抗原。这就避开了在抗原抗体反应时由谷胱甘肽转移酶所引起的非特异性反应。
这三种EB病毒蛋白的特征可以概括如下表：
  EB病毒蛋白   分子量(氨基酸数)   EB病毒基因   核苷酸(相当坐标)
  EBNA1ZtaP18VCA   40Kd(234)53Kd(245)44Kd(176)   BKRF1BZLF1BFRF3   705(109171-109875)738(102210-103155)531(61507-62037)
[附图说明]
图1：采用ELISA检测EBNA1-IgA抗体水平时血清的稀释度。
图2：鼻咽癌患者与健康供血者的BNA1-IgA抗体水平比较。
图3：优化体外诊断鼻咽癌的EB病毒ELISA法。
图4：血清中具有高水平广谱的抗体是鼻咽癌患者的一种特异性的特征。
图5：鼻咽癌诊断和风险评估的EB病毒抗体谱。
[具体实施方式]
一、EB病毒蛋白酶联免疫吸附诊断试剂盒，包括有：阳性对照血清、对照血清、酶底物、终止反应液、稀释缓冲液、冲洗缓冲液以及EB病毒靶抗原，其中EB病毒蛋白为：EBNA1(BKRF1)蛋白的后一截、Zta(BZLF1)蛋白和VCA-p18蛋白(即18Kd的VCA或BFRF3蛋白)。
试剂盒还包括有相当于优化临界光密度值的诊断参考血清。参考血清以灵敏度曲线和特异度曲线交接点的相对光密度值(rOD)为最佳临界值。
EB病毒蛋白酶联免疫吸附诊断试剂盒的制备方法，包括重组抗原的制备、纯化标记、效价滴定、包被板制备、封闭、干燥及包装、酶标抗体浓缩液制备、稀释液制备、阳性对照制备、正常对照制备、参考血清制备、底物分装、终止液及浓缩液置备等步骤。
二、EB病毒蛋白在谷胱甘肽转移酶基因融合系统中的克隆、表达和纯化
2.1选择血清学诊断鼻咽癌(或传染性单核细胞增多症)的EB病毒蛋白
最具临床诊断价值的EB病毒蛋白为：EBNA1(BKRF1)蛋白的后一截、Zta(BZLF1)蛋白和VCA-p18蛋白(即18Kd的VCA或BFRF3蛋白)。因此我们采用这三种EB病毒蛋白作为靶抗原，用以检测血清中的抗体水平。
2.2三种EB病毒蛋白的制备
采用现代分子生物学方法在谷胱甘肽转移酶基因融合系统中克隆、表达和纯化这三种EB病毒蛋白。
2.2.1选定这三种EB病毒蛋白在基因库(V01555，B95-8细胞株的序列)中的mRNA序列，逆转录酶将之转为cDNA序列。
2.2.2设计可以扩增该cDNA序列的引物
在引物5’端加BamHI酶切序列(GGATCC)或EcoRI序列(GAATTC)，以便在Bam HI和EcoR1切割后，将之插入物连结至质粒pGEX DNA(4948bp，Amersham Biosciences)。而引物5’端再加TAG，既有利插入，又经限制性酶消化后不出现在克隆中。
2.2.3具体的引物设计、序列扩增过程
2.2.3.1关于EB病毒EBNA1蛋白(又称BKRF1蛋白)
2.2.3.1.1EBNA-1(BKRF1)引物设计
5’-TAC GGA TCC CCT GTA GGG GAA GCC GAT TA-3’
         BamHI
5’-TAC GAA TTC TCA CTC CTG CCC TTC CTC CAC-3’
         EcoRI
引物5’端的3个碱基TAC经限制性酶消化后不出现在克隆中。
GGATCC为BamHI限制性酶切序列(Bam HI restriction site)，
GAATTC则为EcoRI限制性酶切序列(Bam HI restriction site)。
2.2.3.1.2扩增的EBNA-1编码序列(cDNA)
B95-8细胞的EBNA1(BKRF1)的核苷酸编码序列应为
107950-109875。现在扩增的序列为109171-109875。即无需107950-109170甘氨酸(Gly)重复区截取的EBNA-1编码序列。所克隆的编码DNA序列与B95-8细胞的完全一致，共705碱基。以下划线表示。
107950→ a tgtctgacga ggggccaggt acaggacctg gaaatggcct aggagagaag
108061 aaccatggac gaggacgggg aagaggacga ggacgaggag gcggaagacc aggagccccg
108121 ggcggctcag gatcagggcc aagacataga gatggtgtcc ggagacccca aaaacgtcca
108001 ggagacacat ctggaccaga aggctccggc ggcagtggac ctcaaagaag agggggtgat
108061 aaccatggac gaggacgggg aagaggacga ggacgaggag gcggaagacc aggagccccg
108121 ggcggctcag gatcagggcc aagacataga gatggtgtcc ggagacccca aaaacgtcca
108181 agttgcattg gctgcaaagg gacccacggt ggaacaggag caggagcagg agcgggaggg
108241 gcaggagcag gaggggcagg agcaggagga ggggcaggag caggaggagg ggcaggaggg
108301 gcaggagggg caggaggggc aggagcagga ggaggggcag gagcaggagg aggggcagga
108361 ggggcaggag gggcaggagc aggaggaggg gcaggagcag gaggaggggc aggaggggca
108421 ggagcaggag gaggggcagg aggggcagga ggggcaggag caggaggagg ggcaggagca
108481 ggaggagggg caggaggggc aggagcagga ggaggggcag gaggggcagg aggggcagga
108541 gcaggaggag gggcaggagc aggaggggca ggaggggcag gaggggcagg agcaggaggg
108601 gcaggagcag gaggaggggc aggaggggca ggaggggcag gagcaggagg ggcaggagca
108661 ggaggggcag gagcaggagg ggcaggagca ggaggggcag gaggggcagg agcaggaggg
108721 gcaggagggg caggagcagg aggggcagga ggggcaggag caggaggagg ggcaggaggg
108781 gcaggagcag gaggaggggc aggaggggca ggagcaggag gggcaggagg ggcaggagca
108841 ggaggggcag gaggggcagg agcaggaggg gcaggagggg caggagcagg aggaggggca
108901 ggagcaggag gggcaggagc aggaggtgga ggccggggtc gaggaggcag tggaggccgg
108961 ggtcgaggag gtagtggagg ccggggtcga ggaggtagtg gaggccgccg gggtagagga
109021 cgtgaaagag ccaggggggg aagtcgtgaa agagccaggg ggagaggtcg tggacgtgga
109081 gaaaagaggc ccaggagtcc cagtagtcag tcatcatcat ccgggtctcc accgcgcagg
                                      109171
                                        ↓
109141 ccccctccag gtagaaggcc atttttccac cctgtagggg aagccgatta ttttgaatac
109201 caccaagaag gtggcccaga tggtgagcct gacgtgcccc cgggagcgat agagcagggc
109261 cccgcagatg acccaggaga aggcccaagc actggacccc ggggtcaggg tgatggaggc
109321 aggcgcaaaa aaggagggtg gtttggaaag catcgtggtc aaggaggttc caacccgaaa
109381 tttgagaaca ttgcagaagg tttaagagct ctcctggcta ggagtcacgt agaaaggact
109441 accgacgaag gaacttgggt cgccggtgtg ttcgtatatg gaggtagtaa gacctccctt
109501 tacaacctaa ggcgaggaac tgcccttgct attccacaat gtcgtcttac accattgagt
109561 cgtctcccct ttggaatggc ccctggaccc ggcccacaac ctggcccgct aagggagtcc
109621 attgtctgtt atttcatggt ctttttacaa actcatatat ttgctgaggt tttgaaggat
109681 gcgattaagg accttgttat gacaaagccc gctcctacct gcaatatcag ggtgactgtg
109741 tgcagctttg acgatggagt agatttgcct ccctggtttc cacctatggt ggaaggggct
109801 gccgcggagg gtgatgacgg agatgacgga gatgaaggag gtgatggaga tgagggtgag
109861 gaagggcagg agtga←109875
                     *＞为终止密码子
2.2.3.1.3所翻译形成的氨基酸序列(amino acid sequenc)
除109873-109875的tga为终止密码子外，实际翻译到234个氨基酸，以下划线表示。
MSDEGPGTGPGNGLGEKGDTSGPEGSGGSGPQRRGGDNHGRGRG
RGRGRGGGRPGAPGGSGSGPRHRDGVRRPQKRPSCIGCKGTHGGTGAGAGAGGAGAGG
AGAGGGAGAGGGAGGAGGAGGAGAGGGAGAGGGAGGAGGAGAGGGAGAGGGAGGAGAG
GGAGGAGGAGAGGGAGAGGGAGGAGAGGGAGGAGGAGAGGGAGAGGAGGAGGAGAGGA
GAGGGAGGAGGAGAGGAGAGGAGAGGAGAGGAGGAGAGGAGGAGAGGAGGAGAGGGAG
GAGAGGGAGGAGAGGAGGAGAGGAGGAGAGGAGGAGAGGGAGAGGAGAGGGGRGRGGS
GGRGRGGSGGRGRGGSGGRRGRGRERARGGSRERARGRGRGRGEKRPRSPSSQSSSSG
SPPRRPPPGRRPFFH PVGEADYFEYHQEGGPDGEPDVPPGAIEQGPADDPGEGPSTGP
RGQGDGGRRKKGGWFGKHRGQGGSNPKFENIAEGLRALLARSHVERTTDEGTWVAGVF
VYGGSKTSLYNLRRGTALAIPQCRLTPLSRLPFGMAPGPGPQPGPLRESIVCYFMVFL
QTHIFAEVLKDAIKDLVMTKPAPTCNIRVTVCSFDDGVDLPPWFPPMVEGAAAEGDDG
DDGDEGGDGDEGEEGQE
2.2.3.2关于EB病毒Zta(Bam H1  Z  trans activator)或ZEBRA(BamHI  Z Epstein- Barr  Replication  Activator)蛋白或BZLF1蛋白
2.2.3.2.1Zta(BZLF1)引物设计
5’-TAC GGA TCC ATG ATG GAC CCA AAC TCG AC-3’
         BamHI
5’-TAC GAA TTC TTA GAA ATT TAA GAG ATC CTC-3’
         EcoRI
引物5’端的3个碱基TAC经限制性酶消化后不出现在克隆中。GGATCC为BamHI限制性酶切序列(Bam HI restriction site)，GAATTC则为EcoRI限制性酶切序列(Bam HI restrictionsite)。
2.2.3.2.2扩增的Zta编码序列(cDNA)
B95-8细胞的Zta(BZLF1)的核苷酸编码序列应为102210-102338，102423-102530，102655-103155三段拼接而成。以下划线表示。所克隆的编码DNA序列与B95-8细胞的三段拼接而成的序列完全一致，共738碱基。以下划线表示。
                                     102210
                                       ↓
102181 tgaagcaggc gtggtttcaa taacgggag t tagaaattta agagatcctc gtgtaaaaca
102241 tctggtgtcc gggggataat ggagtcaaca tccaggcttg ggcacatctg cttcaacagg
102301 aggcgcagcc tgtcattttc agatgatttg gcagcagcca cctgcggaca aaaatcaggc
                                                ↑
                                              102338
102361 gtttagatgg ggcatttatg tttgggacgc tagccgcctg ggcattcgtg ttagtatata
        102423
          ↓
102421 ct gacctcac ggtagtgctg cagcagttgc ttaaacttgg cccggcattt tctggaagcc
102481 acccgattct tgtatcgctt tatttctagt tcagaatcgc attcctccag ctgcgagcaa
                                                            ↑
                                                          102530
102541 gggaatgcgt tactacaagt ggtgcctagt cagttgaaac aagccccacc atccgctgcc
                                                                 102655
                                                                   ↓
102601 gcccctccat gagccccacc gtccgctgcc gcccctcctt gagcccctcc ttac cgattc
102661 tggctgttgt ggtttccgtg tgcgtcgtgc cggggcagcc actggtgcag gctgtggaac
102721 accaatgtct gctagctgtt gtccttggtt agccccgggg caagcaaaca ccactgctgc
102781 tgctgtttga acagtagaat tgtctccagg ttgaggtgct tctcccccgg cttggttagt
102841 ctgttgattc tgggttatgt cggagactgg gaacagctga ggtgctgcat aagcttgata
102901 agcattctca ggagcaggct gaggggcaga aaaccacgac ccagtcggag cggttgaaac
102961 atgataggca gttagctggc cttgtggcag aggctctggc agcaccggcc acagcacaca
103021 aggcaaagga gcttgcgatg gccctcccag gtcctgatag actctggtag cttggtcaaa
103081 agcttgtaca aaaggcacct ggtatgggtc aggtgtaaat tttacatctt cagaagtcga
103141 gtttgggtcc atcatcttca gcaaagatag caaaggtggc cggcaaggtg caatgtttag
                      ↑
                     103155
三段拼接而成的序列如下：
*＞为终止密码子
t tagaaattta agagatcctc gtgtaaaaca
tctggtgtcc gggggataat ggagtcaaca tccaggcttg ggcacatctg cttcaacagg
aggcgcagcc tgtcattttc agatgatttg gcagcagc
gacctcac ggtagtgctg cagcagttgc ttaaacttgg cccggcattt tctggaagcc
acccgattct tgtatcgctt tatttctagt tcagaatcgc attcctccag
cgattc
tggctgttgt ggtttccgtg tgcgtcgtgc cggggcagcc actggtgcag gctgtggaac
accaatgtct gctagctgtt gtccttggtt agccccgggg caagcaaaca ccactgctgc
tgctgtttga acagtagaat tgtctccagg ttgaggtgct tctcccccgg cttggttagt
ctgttgattc tgggttatgt cggagactgg gaacagctga ggtgctgcat aagcttgata
agcattctca ggagcaggct gaggggcaga aaaccacgac ccagtcggag cggttgaaac
atgataggca gttagctggc cttgtggcag aggctctggc agcaccggcc acagcacaca
aggcaaagga gcttgcgatg gccctcccag gtcctgatag actctggtag cttggtcaaa
agcttgtaca aaaggcacct ggtatgggtc aggtgtaaat tttacatctt cagaagtcga
gtttgggtcc atcat
2.2.3.2.3所翻译形成的氨基酸序列(amino ac id sequenc)
除102212-102210的taa)为终止密码子外，实际翻译到245个氨基酸，以下划线表示。
MMDPNSTSEDVKFTPDPYQVPFVQAFDQATRVYQDLGGPSQAPL
PCVLWPVLPEPLPQGQLTAYHVSTAPTGSWFSAPQPAPENAYQAYAAPQLFPVSDITQ
NQQTNQAGGEAPQPGDNSTVQTAAAVVFACPGANQGQQLADIGVPQPAPVAAPARRTR
KPQQPFSLEECDSELEIKRYKNRVASRKCRAKFKQLLQHYREVAAAKSSENDRLRLLL
KQMCPSLDVDSIIPRTPDVLHEDLLNF
2.2.3.3关于EB病毒VCA-p18蛋白(又称BFRF3蛋白)，即18kd的VCA蛋白
2.2.3.3.1VCA-p18(BFRF3)引物设计
5’-TAC GGA TCC ATG GCA CGC CGG CTG CCC AAG-3’
         BamHI
5’-TAC GAA TTC CTA CTG TTT CTT ACG TG-3’
         EcoRI
引物5’端的3个碱基TAC经限制性酶消化后不出现在克隆中。GGATCC为BamHI限制性酶切序列(Bam HI restriction site)，GAATTC则为EcoRI限制性酶切序列(Bam HI restrictionsite)。
2.2.3.3.2扩增的BFRF3编码序列(cDNA)
B95-8细胞的BFRF3的核苷酸编码序列应为61507-62037。
所克隆的编码DNA序列与B95-8细胞的完全一致，共531碱基。以下划线表示。
            61507
            ↓
61501 cgcgtt atgg cacgccggct gcccaagccc accctccagg ggaggctgga ggcggatttt
61561 ccagacagtc ccctgcttcc taaatttcaa gagctgaacc agaataatct ccccaatgat
61621 gtttttcggg aggctcaaag aagttacctg gtatttctga catcccagtt ctgctacgaa
61681 gagtacgtgc agaggacttt tggggtgcct cggcgccaac gcgccataga caagaggcag
61741 agagccagtg tggctggggc tggtgctcat gcacaccttg gcgggtcatc cgccaccccc
61801 gtccagcagg ctcaggccgc cgcatccgct gggaccgggg ccttggcatc atcagcgccg
61861 tccacggccg tagcccagtc cgcgaccccc tctgtttctt catctattag cagcctccgg
61921 gccgcgactt cgggggcgac tgccgccgcc tccgccgccg cagccgtcga taccgggtca
61981 ggtggcgggg gacaacccca cgacaccgcc ccacgcgggg cacgtaagaa acagtagagg
                                                                   ↑
                                                                  62037
61507→ atgg cacgccggct gcccaagccc accctccagg ggaggctgga ggcggatttt
        ccagacagtc ccctgcttcc taaatttcaa gagctgaacc agaataatct ccccaatgat
        gtttttcggg aggctcaaag aagttacctg gtatttctga catcccagtt ctgctacgaa
        gagtacgtgc agaggacttt tggggtgcct cggcgccaac gcgccataga caagaggcag
        agagccagtg tggctggggc tggtgctcat gcacaccttg gcgggtcatc cgccaccccc
        gtccagcagg ctcaggccgc cgcatccgct gggaccgggg ccttggcatc atcagcgccg
        tccacggccg tagcccagtc cgcgaccccc tctgtttctt catctattag cagcctccgg
        gccgcgactt cgggggcgac tgccgccgcc tccgccgccg cagccgtcga taccgggtca
  ggtggcgggg gacaacccca cgacaccgcc ccacgcgggg cacgtaagaa acagtag←62037
                                                   *＞为终止密码子
2.2.3.3.3所翻译形成的氨基酸序列(amino acid sequenc)
除62035-620370的tag为终止密码子外，实际翻译到176个氨基酸，以下划线表示。
MARRLPKPTLQGRLEADFPDSPLLPKFQELNQNNLPNDVFREAQ
RSYLVFLTSQFCYEEYVQRTFGVPRRQRAIDKRQRASVAGAGAHAHLGGSSATPVQQA
QAAASAGTGALASSAPSTAVAQSATPSVSSSISSLRAATSGATAAASAAAAVDTGSGG
GGQPHDTAPRGARKKQ
总结关于EB病毒EBNA1蛋白、Zta蛋白、和VCA-p18蛋白的基因片段、基因库序列大小、扩增克隆序列大小和表达多肽的氨基酸数如下。
表1
  EB病毒蛋白   EBNA1   Zta   VCA-p18
  基因片段基同库序列大小扩增克隆序列大小表达多肽的氨基酸数   BKRF11926bp705bp234aa   BZLF738bp738bp245aa   BFRF3531bp531bp176aa
2.3将PCR扩增子与谷胱甘肽转移酶(GST)基因克隆到Eco R1/Bam HI消化的原核细胞表达pGEX2T质粒载体(Pharmacia，Uppsala，Sweden)上系在一起。采用氯化钙技术将重组的质粒转至大肠杆菌。加乳糖类似物异丙基硫代半乳糖苷诱导已经转到了重组质粒的大肠杆菌数小时，然后收获细菌并以去垢triton(一系列有机的非离子型表面活化剂的商品名)X-100和超声波裂解细菌。细菌裂解产物经离心后除去碎片而澄清，含融合蛋白的上清液采用谷胱甘肽琼脂糖4B经谷胱甘肽转移酶-谷胱甘肽亲和色谱仪纯化。纯度达94.0％以上。融合克隆蛋白的大小为：EBNA-1＝40Kd；BFRF3＝44Kd；BZLF1＝53Kd。具体步骤如下。
2.3.1.cDNA的扩增
2.3.1.1RNA的制备。
2.3.1.1.1根据Rnaid Plus试剂盒(BIO 101)说明书的要求从培养细胞中分离RNA。
采用RNaid Plus试剂盒从悬浮的细胞中抽提RNA。培养的细胞用PBS洗一次，然后每106细胞加1ml quanidine thiocyanate溶解液，并与vortex混合。再加等容积酸性酚(acid phenol)，并混合。加1mlchloroform isoamyl alcohol(BDH)至溶液中，再次混合。溶解产物在冰块上孵15min后，在4℃下旋转10,000xg 20min。将上层转移至一新管，再用1/2容积的chloroform isoamyl alcohol(BDH)旋转2min。将上层再转移至一新管。加入15ul RNAMATRIX，并在室温下孵育5min，孵育中偶加混合，使RNA吸附。RNA/RNAMATRIX复合物在10,000xg下1min形成小球，在500μl RNA洗液中洗两次。小球再次悬浮在30-100μl Diethpyrocarbonate(DEPC，Sigma)处理过的水中。RNA在55℃下洗提5min，并适合于光谱分析。
2.3.1.1.2.采用RT PCR扩增RNA转录物。
2.3.1.2在Bam HI和EcoR1切割后，将插入物连结至质粒pGEX DNA(4948bp，Amersham Biosciences)。
2.3.2将连结产物转至XL1反应潜能细胞。
2.3.3采用摘取个别克隆法使质粒小孔化。
2.3.4小孔化DNA的限制性酶切。
2.3.5从pGEX重组物中筛选融合蛋白表达。
2.3.6SDS PAGE分析。
2.3.7采用抗谷胱甘肽转移酶抗体做Western blot。
2.3.8大量纯化融合蛋白。
2.3.9如果需要的话用凝血酶将谷胱甘肽转移酶融合蛋白中的谷胱甘肽转移酶除去。
3.所选三类EB病毒抗原的特点
所选三类EB病毒抗原的ELISA法对测定EB病毒抗体既敏感、特异、又客观。
表2EB病毒抗原的ELISA法对测定EB病毒抗体既敏感、特异、又客观
  血清号   EB病毒感染状态  VCA IgG   VCA IgA   Zta IgG   Zta IgA   EBNA1IgG   EBNA1IgA
  N11N31MINPG495PA196   未感染婴儿传染性单核细胞增多症患者健康EB病毒携带者取自鼻咽癌患者血清库取自鼻咽癌患者血清库   ＜200＞3k＞3k＞3k＞3k   未测定＜100＜1001.6k＞1.6k   未测定＜200＜200＞3k＞3k   未测定＜20＜20100400   ＜1k＜1k3k＞6k＞6k   未测定＜100阴性800＞800
临界值＝所测血清的平均光密度值/血清空白的平均光密度值＝S/N＝3
为了检测Zta IgA，开始的血清稀释度是1∶20；为了检测p18VCAIgA和EBNA1 IgA，开始的血清稀释度是1∶100；为了检测p18VCAIgG和Zta IgG，开始的血清稀释度是1∶200；为了检测EBNA1 IgG，开始的血清稀释度是1∶1000。滴度＝高于临界值的最大血清稀释度。
从表2可知：
(1)取自1例从未感染过EB病毒的婴儿血清(N11)，没有检测到VGA IgG；而在一例传染性单核细胞增多症患者急性感染期所取的血清样本中(N31)，VCA IgG抗体很早就产生了。可以为了客观地作抗体的定量。
(2)在急性时期的传染性单核细胞增多症患者血清样本中(N31)无EBNA1 IgG抗体。在产生VCA IgG抗体8个月或更长时期后才产生EBNA1 IgG(Chan KH等)。
(3)因此，同时出现VCAIgG和EBNA1 IgG是过去感染EB病毒的指标。
(4)与健康携带者相对比，鼻咽癌患者血清中具有广谱的抗EB病毒抗体。
(5)EBNA1 IgG的抗体水平高于其他的抗体水平。这说明，EBNA1是EB病毒感染，特别是鼻咽癌患者的一种重要抗原。这也是与EBNA1是寄生在肿瘤细胞中的EB病毒所表达的主要抗原相一致的。
(6)总之，上述结果显示，酶联免疫吸附法可用于鉴别EB病毒的各种感染状态。
(7)所以，针对EB病毒特异性抗原而创建的酶联免疫吸附法，在血清学诊断EB病毒相关疾病时，确实具有十分潜在优势的可用性。
4.优化血清学诊断鼻咽癌的ELISA法
(1)创建了以灵敏度和特异度曲线的交界点为临界光密度值由于鼻咽癌患者血清中抗EB病毒抗体水平与健康携带者血清中抗EB病毒抗体水平有相互重叠，不会具有能回答“阳”或“阴”的绝对标准(见附图2)，我们所创建的以灵敏度和特异度曲线的交界点为临界光密度值(见附图3)的方法，区分“高”和“低”，就能客观地反映鼻咽癌患者血清中抗EB病毒抗体的特征。
(2)创建了根据鼻咽癌患者组和健康成人组的滴度曲线确定检测血清的稀释度(见图1)。
表3优化血清学诊断鼻咽癌的ELISA法
 VCA IgG   VCA IgA   Zta-IgG   Zta IgA   EBNA1IgG   EBNA1IgA
抗免疫球蛋白，稀释度血清稀释*[n＝81C，74NPC]临界光密度值灵敏度特异度  zG，50k   zA，2k1001.2565％65％   zG，50k2000.8386％86％   zA，2k20183％83％   zG，50k2000172％72％   zA，2k1000.6283％83％
*根据74例鼻咽癌患者和81例对照组的数据而得
z：抗免疫球蛋白购自Zymed，zG表示Zymed IgG，zA表示Zymed IgA
(3)为了诊断标准的判定，在试剂盒中提供一支相当于优化临界光密度值的诊断参考血清。这就使使用同一批号的试剂盒分批检测样本时，可以纠正每一批检测所应用的区分高、低水平的相对光密度值，得出更精确可靠的数据。
(4)由于鼻咽癌患者血清中大多具有广谱的高水平的抗EB病毒抗体，特别是IgA抗体的特征(见图4)，我们创建了两步检测法，即首先使用EBNA IgA，如属“高”水平则再进行第二步，使用Zta IgG以诊断，或同时使同Zta-IgG和EBNA IgG以筛选(见附图5)。
总之，新的优化的酶联免疫吸附法(ELISA)具有客观性和EB病毒抗原的特异性，它提供了定量捡测针对个体EB病毒抗原的不同免疫球蛋白抗体的亚型。这种优化的酶联免疫吸附法(ELISA)完全是新的，是传统的血清学检测法做不到的，因为传统的血清学检测法并不能明确抗原的特异性。而且，新的优化的酶联免疫吸附法(ELISA)采用了参考血清，可以纠正每批检测间的差异，保证了诊断的可靠性。
5.重组EB病毒抗原在诊断方面的应用
5.1EB病毒的原发性感染
5.1.1免疫荧光显示存在VCA抗体；由于延迟的EBNA抗体转阳，所以采用抗补体免疫荧光显示无EBNA抗体。
5.1.2EBV IgM阳性。
5.1.3低亲和性VCA IgG抗体
这里要强调的是：采用荧光免疫(IF)检测低亲和性VCA IgG不敏感，而采用ELISA则较敏感；采用荧光免疫(IF)检测VCA IgM不敏感，而采用ELISA较敏感。
为了测定低亲和性VCA IgG抗体，将一系列血清样本在平行的徽板上起作用。一个板孔以4M尿素处理30min，而另一个板孔则不经处理。当尿素处理引起抗体水平下降4倍或4倍以上时，则显示低亲和性VCA IgG抗体存在。
5.2确立EB病毒感染的抗体谱和鉴别诊断各种EB病毒感染
表4EB病毒各种感染状态的抗体谱
感染状态   1VCA IgG   2EBNA IgG   3VCA IgM   4低亲和性VCA IgG   5DNA 例数
  原发性感染小计 阳性阳性阳性 阴性阴性阴性 阳性阳性阴性 阳性阴性阳性 37 3011546
  近期感染小计 阳性 阴性 阴性 阴性 00 1212
  过去感染小计 阳性阳性 阳性阳性 阴性阳性 阴性阴性 1 14115
  未感染   阴性   阴性   阴性   阴性   0   8
  合计   38   69
表5各种EB病毒感染状态的鉴别诊断
 EB病毒感染状态 免疫荧光法VCA IgG阳性和EBNA IgG阴性   酶联免疫吸附法 PCR法EB病毒DNA
低亲和性p18VCA IgG  VCA IgM
 急性原发性感染(n＝46)近期感染(n＝12)过去感染(n＝15)未感染(n＝8) 100％100％0*0**    97.8％000   67.4％00.7％0   80.4％00.7％0
*所有过去感染过EB病毒的人，经酶联免疫吸附法检测VCA IgG和EBNA1 IgG，均呈阳性。
**所有过去未感染过EB病毒的人，经酶联免疫吸附法检测VCA IgG和EBNA1 IgG，均呈阴性。
由此可见，由于EBNA IgG要在感染后一段时间血清抗体才转阳，采用传统的免疫荧光法不能鉴别急性原发性感染和近期感染；而采用酶联免疫吸附法检测血清低亲和性p18VCA IgG和VCAIgM，则大多数急性原发性感染患者(低亲和性p18VCA IgG为97.8％，VCA IgM为67.4％)可呈阳性。即，采用酶联免疫吸附法可鉴别急性原发性感染和近期感染。
5.3鉴别传染性单核细胞增多症(Infectious mononucleosis)和传染性单核细胞综合症(Infectious mononucleosis syndrome)
5.3.1除症状、白细胞升高(12000-18000)、外周血涂片见不典型CD4T淋巴细胞、异嗜抗羊红细胞抗体(heteophil anti-sheepred blood cell antibodies)、涂片EBERs原位杂交等外。
5.3.2首先出现传染性单核细胞增多症的急性表指，即p18VCA IgM和低亲和性VCA IgG，然后是VCA IgG，8个月后才出现EBNA1 IgG。因此：
未感染EB病毒：VCA阴性、EBNA1为阴性。
传染性单核细胞增多症：VCA阳性、EBNA1阴性。
健康携带者：VCA阳性、EBNA1阳性。
VCA阴性、EBNA1为阴性，为未感染EB病毒。
因此，采用ELISA法检测EBNA1 IgG阳性和p18VCA IgM阳性则为传染性单核细胞增多症；而传染性单核细胞综合症则否。
5.4血清学协助诊断疑为鼻咽癌
5.4.1鼻咽癌患者血清EB病毒抗体水平特征及血清学检测的应用范围
表6鼻咽癌患者血清EB病毒抗体水平特征及血清学检测的应用范围
 鼻咽癌患者血清EB病毒抗体水平特征   血清学检测的应用范围
 广谱的血清EB病毒抗休，特别是IgA的升高高拷贝量的血清/血浆中EB病毒DNA   1.血清学诊断鼻咽癌2.人群普查以早期发现鼻咽癌1.预测治疗的疗效
5.4.2免疫荧光法和酶联免疫吸附法的单独使用
在香港玛丽医院218例连续检测的血清样本中(51例鼻咽癌、4例鼻咽以外的淋巴上皮瘤样癌、23例其他癌和140例其他疾病)作了如下分析。
表7免疫荧光法和酶联免疫吸附法单独使用的比较
  检测方法   鼻咽癌真阳性/假阴性   对照组假阳性/真阴性   旧性预测   阴性预测   实用性
  免疫荧光：VCA IgAEA IgA酶联免疫吸附：EBNA1 IgAZta IgGEBV DNA 51/440/1546/941/1431/24 65/985/15822/14128/1353/160 44％89％68％59％91％ 96％91％94％91％87％ 排除和(预测)预测(排除)和预测预测
阳性预测＝真阳性/真阳性+假阳性×100％＝A/(A+C)×100％
阴性预测＝真阴性/假阴性+真阴性×100％＝D/(B+D)×100％
5.4.3免疫荧光法和酶联免疫吸附法的联合使用的比较
在香港玛丽医院218例连续检测的血清样本中(51例鼻咽癌、4例鼻咽以外的淋巴上皮瘤样癌、23例其他癌和140例其他疾病)同样作了如下分析。
表8免疫荧光法联合使用在血清学诊断鼻咽癌方面的比较
     鼻咽癌组   健康成人对照组   旧性预测   阴性预测
  真阳性   假阴性   假阳性   真阴性
VCA IgA阳性+EA IgA阳性VCA IgA阳性+EA IgA阴性VCA IgA阴性+EA IgA阳性VCA IgA阴性+EA IgA阴性   4011051   1544554   564089   1589916394   88.9％14.7％ 95.9％
阳性预测＝真阳性/(真阳性+假阳性)×100％＝TP/(TP+FP)
40/(40+5)＝88.9％
11/(11+64)＝14.7％
阴性预测＝真阴性/(假阴性+真阴性)×100％＝TN/(TN+FN)
94/(94+4)＝95.9％
值得指出的是，无论是鼻咽癌患者或健康成人，EA IgA阳性者中没有一例呈VCA IgA阴性，这是因为所采用的B95-8细胞所产生的“VCA”中既有溶解晚期的抗原，又包含了溶解早期的抗原。所以，在免疫荧光法中所采用的VCA IgA的抗原特异性与EA IgA的抗原特异性相互重叠了。也就是说，虽然联合使用了两种免疫荧光法，却不能达到“1+1＝2”的作用，即互补作用不强。而且，VCA IgA和EAIgA双阴性98中，4例为假阴性，假阴性率达4.1％(4/4+94)，并不能在临床上起到有效的排除诊断鼻咽癌的作用。以下所述酶联免疫吸附法的联合使用却可以克服这一缺点。
5.4.4先做酶联免疫吸附法的EBNA1 IgA，再做免疫荧光VCA IgA
表9
  酶联免疫吸附法的EBNA1 IgA   免疫荧光VCA IgA   酶联免疫吸附法的EBNA1 IgA和免疫荧光VCA IgA联合
  灵敏度特异度   89％78％   86％91％   88％95％
表10酶联免疫吸附法联合使用的比较
  鼻咽癌组   健康成人对照组   旧性预测   阴性预测
  真阳性   假阴性   假阳性   真阴性
 EBNA1 IgA阳性+Zta IgG阳性EBNA1 IgA阳性+Zta IgG阴性EBNA1 IgA阴性+Zta IgG阳性EBNA1 IgA阴性+Zta IgG阴性   3313854   2242471   5172547   158146138116   86.8％43.3％24.2％ 99.1％
阳性预测＝真阳性/(真阳性+假阳性)×100％＝TP/(TP+FP)
33/(33+5)＝88.8％
13/(13+17)＝43.3％
8/(8+25)＝
阴性预测＝真阴性/(假阴性+真阴性)×100％＝TN/(TN+FN)
116/(1+116)＝
比较后可知，酶联免疫吸附法联合使用(EBNA1 IgA+Zta IgG)的阴性预测值(99.1％)大大高于免疫荧光法联合使用(VCA IgA+EAIgA)，即临床上联合使用EBNA IgA和Zta IgG时，如果是双阴性，则排除鼻咽癌诊断的可靠性达99.1％。两种酶联免疫吸附法联合检测在血清学诊断鼻咽癌时具有很强的互补作用。
5.4.5采用免疫荧光和采用酶联免疫吸附血清学诊断鼻咽癌之间的关联
表11采用免疫荧光和采用酶联免疫吸附血清学诊断鼻咽癌之间的关联
  免疫荧光血清学诊断   酶联免疫吸附血清学诊断   百分率
  相互吻合旗鼓相当相互不吻合总计   100例51例4例155例   64.5％32.9％2.6％
5.4.6酶联免疫吸附联合应用的血清学诊断鼻咽癌的预测和排除
表12
  例数   EBNA1IgA   Zta IgG   预测   评论
  333033117   高高低低   高低高低   阳性，87％阳性，43％阳性，24％阴性，99％   恒定地符合鼻咽癌中度地符合鼻咽癌临界地符合鼻咽癌恒定地不符合鼻咽癌
5.5早期发现和评估患鼻咽癌的风险度
联合应用EBNA1 IgA、EBNA1 IgG和Zta IgG显示优势比大大增高。
表13联合应用EBNA1 IgA、EBNA1 IgG和Zta IgG显示优势比大大增高
          EB病毒抗体谱            观察到的％(期待的％)   优势比
 EBNA1 IgA   EBNA1 IgG  Zta IgG   鼻咽癌(n＝121)   健康成人(n＝332)
 低低低高低高高高总数   低低高低高低高高  低高低低高高低高   0.83(0.54)5.79(2.01)1.65(2.61)3.31(3.03)6.61(9.84)6.61(11.42)15.7(14.82)59.5(55.73)100r＝0.990   59.3(59.17)14.8(14.79)8.73(9.63)10.2(9.63)3.01(2.41)1.51(2.41)1.51(1.57)0.9(0.39)100r＝0.999   0.0090.130.280.313.984.509.54137.91.0
两个层次的筛查：
第一层次：EBNA IgA
第二层次：Zta IgG+EBNA IgG
表14早期发现和评估患鼻咽癌的风险度的两个层次的筛查
  /1000   EBNA1 IgA   EBNA1 IgG   Zta IgG   风险度水平   相对风险度   随访
  4162496860   高高高高低   高高低低未做   高低高低未做   高中中低低   138940.30.2   疑为鼻咽癌宜监护的风险度宜监护的风险度微风险度不必在意
在1000人中140人(14.0％，140/1000)认为具有患鼻咽癌的风险度。在这140人中：4人(2.86％，4/140)认为具有高风险度；40人(28.57％，40/140)认为具有中等风险度；96人(68.57％，96/140)认为具有微风险度。860人EBNA1 IgA低，未进一步做Zta-IgG和EBNA1 IgG，认为无风险度。
另香港某私人机构筛查了香港居民2000人，发现6例具有高风险度的人，其中1人证实为鼻咽癌忠患者，经治疗后5年无复发；所有其他人均未患鼻咽癌。
5.6协助诊断Burkitt淋巴瘤
应用Zta IgG1.
                                       EBV-1.ST25
                EB病毒蛋白酶联免疫吸附诊断试剂盒及其制备方法
                            序列表(SEQUENCE LISTING)
<110>香港神农有限公司(Sinoclone Limited)
<120>EB病毒蛋白酶联免疫吸附诊断试剂盒及其制备方法
<130>EBV Serological Diagnositic Kits
<160>6
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>705
<212>DNA
<213>Epstein-Barr Virus
<400>1
cctgtagggg aagccgatta ttttgaatac caccaagaag gtggcccaga tggtgagcct     60
gacgtgcccc cgggagcgat agagcagggc cccgcagatg acccaggaga aggcccaagc    120
actggacccc ggggtcaggg tgatggaggc aggcgcaaaa aaggagggtg gtttggaaag    180
catcgtggtc aaggaggttc caacccgaaa tttgagaaca ttgcagaagg tttaagagct    240
ctcctggcta ggagtcacgt agaaaggact accgacgaag gaacttgggt cgccggtgtg    300
ttcgtatatg gaggtagtaa gacctccctt tacaacctaa ggcgaggaac tgcccttgct    360
attccacaat gtcgtcttac accattgagt cgtctcccct ttggaatggc ccctggaccc    420
ggcccacaac ctggcccgct aagggagtcc attgtctgtt atttcatggt ctttttacaa    480
actcatatat ttgctgaggt tttgaaggat gcgattaagg accttgttat gacaaagccc    540
gctcctacct gcaatatcag ggtgactgtg tgcagctttg acgatggagt agatttgcct    600
ccctggtttc cacctatggt ggaaggggct gccgcggagg gtgatgacgg agatgacgga    660
gatgaaggag gtgatggaga tgagggtgag gaagggcagg agtga                    705
<210>2
<211>234
<212>PRT
<213>Epstein-Barr Virus
<400>2
Pro Val Gly Glu Ala Asp Tyr Phe Glu Tyr His Gln Glu Gly Gly Pro
1               5                   10                  15
Asp Gly Glu Pro Asp Val Pro Pro Gly Ala Ile Glu Gln Gly Pro Ala
            20                  25                  30
Asp Asp Pro Gly Glu Gly Pro Ser Thr Gly Pro Arg Gly Gln Gly Asp
        35                  40                  45
Gly Gly Arg Arg Lys Lys Gly Gly Trp Phe Gly Lys His Arg Gly Gln
    50                  55                  60
Gly Gly Ser Asn Pro Lys Phe Glu Asn Ile Ala Glu Gly Leu Arg Ala
65                  70                  75                  80
Leu Leu Ala Arg Ser His Val Glu Arg Thr Thr Asp Glu Gly Thr Trp
                85                  90                  95
                                                EBV-1.ST25
Val Ala Gly Val Phe Val Tyr Gly GIy Ser Lys Thr Ser Leu Tyr Asn
            100                 105                 110
Leu Arg Arg Gly Thr Ala Leu Ala Ile Pro Gln Cys Arg Leu Thr Pro
        115                 120                 125
Leu Ser Arg Leu Pro Phe Gly Met Ala Pro Gly Pro Gly Pro Gln Pro
    130                 135                 140
Gly Pro Leu Arg Glu Ser Ile Val Cys Tyr Phe Met Val Phe Leu Gln
145                 150                 155                 160
Thr His Ile Phe Ala Glu Val Leu Lys Asp Ala Ile Lys Asp Leu Val
                165                 170                 175
Met Thr Lys Pro Ala Pro Thr Cys Asn Ile Arg Val Thr Val Cys Ser
            180                 185                 190
Phe Asp Asp Gly Val Asp Leu Pro Pro Trp Phe Pro Pro Met Val Glu
        195                 200                 205
Gly Ala Ala Ala Glu Gly Asp Asp Gly Asp Asp Gly Asp Glu Gly Gly
    210                 215                 220
Asp Gly Asp Glu Gly Glu Glu Gly Gln Glu
225                 230
<210>3
<211>531
<212>DNA
<213>Epstein-Barr Virus
<400>3
atggcacgcc ggctgcccaa gcccaccctc caggggaggc tggaggcgga ttttccagac     60
agtcccctgc ttcctaaatt tcaagagctg aaccagaata atctccccaa tgatgttttt    120
cgggaggctc aaagaagtta cctggtattt ctgacatccc agttctgcta cgaagagtac    180
gtgcagagga cttttggggt gcctcggcgc caacgcgcca tagacaagag gcagagagcc    240
agtgtggctg gggctggtgc tcatgcacac cttggcgggt catccgccac ccccgtccag    300
caggctcagg ccgccgcatc cgctgggacc ggggccttgg catcatcagc gccgtccacg    360
gccgtagccc agtccgcgac cccctctgtt tcttcatcta ttagcagcct ccgggccgcg    420
acttcggggg cgactgccgc cgcctccgcc gccgcagccg tcgataccgg gtcaggtggc    480
gggggacaac cccacgacac cgccccacgc ggggcacgta agaaacagta g             531
<210>4
<211>176
<212>PRT
<213>Epstein-Barr Virus
<400>4
Met Ala Arg Arg Leu Pro Lys Pro Thr Leu Gln Gly Arg Leu Glu Ala
1               5                   10                  15
Asp Phe Pro Asp Ser Pro Leu Leu Pro Lys Phe Gln Glu Leu Asn Gln
            20                  25                  30
                                                EBV-1.ST25
Asn Asn Leu Pro Asn Asp Val Phe Arg Glu Ala Gln Arg Ser Tyr Leu
        35                  40                  45
Val Phe Leu Thr Ser Gln Phe Cys Tyr Glu Glu Tyr Val Gln Arg Thr
    50                  55                  60
Phe Gly Val Pro Arg Arg Gln Arg Ala Ile Asp Lys Arg Gln Arg Ala
65                  70                  75                  80
Ser Val Ala Gly Ala Gly Ala His Ala His Leu Gly Gly Ser Ser Ala
                85                  90                  95
Thr Pro Val Gln Gln Ala Gln Ala Ala Ala Ser Ala Gly Thr Gly Ala
            100                 105                 110
Leu Ala Ser Ser Ala Pro Ser Thr Ala Val Ala Gln Ser Ala Thr Pro
        115                 120                 125
Ser Val Ser Ser Ser Ile Ser Ser Leu Arg Ala Ala Thr Ser Gly Ala
    130                 135                 140
Thr Ala Ala Ala Ser Ala Ala Ala Ala Val Asp Thr Gly Ser Gly Gly
145                 150                 155                 160
Gly Gly Gln Pro His Asp Thr Ala Pro Arg Gly Ala Arg Lys Lys Gln
                165                 170                 175
<210>5
<211>738
<212>DNA
<213>Epstein-Barr Virus
<400>5
atgatggacc caaactcgac ttctgaagat gtaaaattta cacctgaccc ataccaggtg     60
ccttttgtac aagcttttga ccaagctacc agagtctatc aggacctggg agggccatcg    120
caagctcctt tgccttgtgt gctgtggccg gtgctgccag agcctctgcc acaaggccag    180
ctaactgcct atcatgtttc aaccgctccg actgggtcgt ggttttctgc ccctcagcct    240
gctcctgaga atgcttatca agcttatgca gcacctcagc tgttcccagt ctccgacata    300
acccagaatc aacagactaa ccaagccggg ggagaagcac ctcaacctgg agacaattct    360
actgttcaaa cagcagcagc agtggtgttt gcttgccccg gggctaacca aggacaacag    420
ctagcagaca ttggtgttcc acagcctgca ccagtggctg ccccggcacg acgcacacgg    480
aaaccacaac agccagaatc gttggaggaa tgcgattctg aactagaaat aaagcgatac    540
aagaatcggg tggcttccag aaaatgccgg gccaagttta agcaactgct gcagcactac    600
cgtgaggtgg ctgctgccaa atcatctgaa aatgacaggc tgcgcctcct gttgaagcag    660
atgtgcccaa gcctggatgt tgactccatt atcccccgga caccagatgt tttacacgag    720
gatctcttaa atttctaa                                                  738
<210>6
<211>245
<212>PRT
<213>Epstein-Barr Virus
                                                EBV-1.ST25
<400>6
Met Met Asp Pro Asn Ser Thr Ser Glu Asp Val Lys Phe Thr Pro Asp
1               5                   10                  15
Pro Tyr Gln Val Pro Phe Val Gln Ala Phe Asp Gln Ala Thr Arg Val
            20                  25                  30
Tyr Gln Asp Leu Gly Gly Pro Ser Gln Ala Pro Leu Pro Cys Val Leu
        35                  40                  45
Trp Pro Val Leu Pro Glu Pro Leu Pro Gln Gly Gln Leu Thr Ala Tyr
    50                  55                  60
His Val Ser Thr Ala Pro Thr Gly Ser Trp Phe Ser Ala Pro Gln Pro
65                  70                  75                  80
Ala Pro Glu Asn Ala Tyr Gln Ala Tyr Ala Ala Pro Gln Leu Phe Pro
                85                  90                  95
Val Ser Asp Ile Thr Gln Asn Gln Gln Thr Asn Gln Ala Gly Gly Glu
            100                 105                 110
Ala Pro Gln Pro Gly Asp Asn Ser Thr Val Gln Thr Ala Ala Ala Val
        115                 120                 125
Val Phe Ala Cys Pro Gly Ala Asn Gln Gly Gln Gln Leu Ala Asp Ile
    130                 135                 140
Gly Val Pro Gln Pro Ala Pro Val Ala Ala Pro Ala Arg Arg Thr Arg
145                 150                 155                 160
Lys Pro Gln Gln Pro Glu Ser Leu Glu Glu Cys Asp Ser Glu Leu Glu
                165                 170                 175
Ile Lys Arg Tyr Lys Asn Arg Val Ala Ser Arg Lys Cys Arg Ala Lys
            180                 185                 190
Phe Lys Gln Leu Leu Gln His Tyr Arg Glu Val Ala Ala Ala Lys Ser
        195                 200                 205
Ser Glu Asn Asp Arg Leu Arg Leu Leu Leu Lys Gln Met Cys Pro Ser
    210                 215                 220
Leu Asp Val Asp Ser Ile Ile Pro Arg Thr Pro Asp Val Leu His Glu
225                 230                 235                 240
Asp Leu Leu Asn Phe
                245

Claims (6)

1、一种EB病毒蛋白酶联免疫吸附诊断试剂盒，包括有：阳性对照血清、阴性对照血清、酶底物、终止反应液、稀释缓冲液、冲洗缓冲液以及EB病毒靶抗原，其特征在于EB病毒靶抗原为：EBNA1蛋白、Zta蛋白和VCA-p18蛋白，其中所述EBNA1蛋白的氨基酸序列包括：
PVGEADYFEYHQEGGPDGEPDVPPGAIEQGPADDPGEGPSTGP
RGQGDGGRRKKGGWFGKHRGQGGSNPKFENIAEGLRALLARSHVERTTDEGTWVAGVF
VYGGSKTSLYNLRRGTALAIPQCRLTPLSRLPFGMAPGPGPQPGPLRESIVCYFMVFL
QTHIFAEVLKDAIKDLVMTKPAPTCNIRVTVCSFDDGVDLPPWFPPMVEGAAAEGDDG
DDGDEGGDGDEGEEGQE。
2、根据权利要求1所述试剂盒，其特征在于所述EBNA1蛋白的氨基酸序列为：
MSDEGPGTGPGNGLGEKGDTSGPEGSGGSGPQRRGGDNHGRGRG
RGRGRGGGRPGAPGGSGSGPRHRDGVRRPQKRPSCIGCKGTHGGTGAGAGAGGAGAGG
AGAGGGAGAGGGAGGAGGAGGAGAGGGAGAGGGAGGAGGAGAGGGAGAGGGAGGAGAG
GGAGGAGGAGAGGGAGAGGGAGGAGAGGGAGGAGGAGAGGGAGAGGAGGAGGAGAGGA
GAGGGAGGAGGAGAGGAGAGGAGAGGAGAGGAGGAGAGGAGGAGAGGAGGAGAGGGAG
GAGAGGGAGGAGAGGAGGAGAGGAGGAGAGGAGGAGAGGGAGAGGAGAGGGGRGRGGS
GGRGRGGSGGRGRGGSGGRRGRGRERARGGSRERARGRGRGRGEKRPRSPSSQSSSSG
SPPRRPPPGRRPFFH PVGEADYFEYHQEGGPDGEPDVPPGAIEQGPADDPGEGPSTGP
RGQGDGGRRKKGGWFGKHRGQGGSNPKFENIAEGLRALLARSHVERTTDEGTWVAGVF
VYGGSKTSLYNLRRGTALAIPQCRLTPLSRLPFGMAPGPGPQPGPLRESIVCYFMVFL
QTHIFAEVLKDAIKDLVMTKPAPTCNIRVTVCSFDDGVDLPPWFPPMVEGAAAEGDDG
DDGDEGGDGDEGEEGQE。
3、一种EB病毒蛋白酶联免疫吸附诊断试剂盒的制备方法，包括EB病毒重组抗原的制备、纯化标记、效价滴定、包被板制备、封闭、干燥及包装、酶标抗体浓缩液制备、稀释液制备、阳性对照制备、正常对照制备、底物分装、终止液及浓缩液制备，其特征在于它还包括参考血清的制备，其中EB病毒蛋白重组抗原的制备为：
A、选定EBNA1蛋白的后一截，即：
PVGEADYFEYHQEGGPDGEPDVPPGAIEQGPADDPGEGPSTGP
RGQGDGGRRKKGGWFGKHRGQGGSNPKFENIAEGLRALLARSHVERTTDEGTWVAGVF
VYGGSKTSLYNLRRGTALAIPQCRLTPLSRLPFGMAPGPGPQPGPLRESIVCYFMVFL
QTHIFAEVLKDAIKDLVMTKPAPTCNIRVTVCSFDDGVDLPPWFPPMVEGAAAEGDDG
DDGDEGGDGDEGEEGQE
和Zta蛋白序列，即：
MMDPNSTSEDVKFTPDPYQVPFVQAFDQATRVYQDLGGPSQAPL
PCVLWPVLPEPLPQGQLTAYHVSTAPTGSWFSAPQPAPENAYQAYAAPQLFPVSDITQ
NQQTNQAGGEAPQPGDNSTVQTAAAVVFACPGANQGQQLADIGVPQPAPVAAPARRTR
KPQQPESLEECDSELEIKRYKNRVASRKCRAKFKQLLQHYREVAAAKSSENDRLRLLL
KQMCPSLDVDSIIPRTPDVLHEDLLNF
以及VCA-p18蛋白序列，即：
MARRLPKPTLQGRLEADFPDSPLLPKFQELNQNNLPNDVFREAQ
RSYLVFLTSQFCYEEYVQRTFGVPRRQRAIDKRQRASVAGAGAHAHLGGSSATPVQQA
QAAASAGTGALASSAPSTAVAQSATPSVSSSISSLRAATSGATAAASAAAAVDTGSGG
GGQPHDTAPRGARKKQ
这三种EB病毒蛋白在基因库中的mRNA序列，用逆转录酶将之转为cDNA序列；
B、设计可以扩增该cDNA序列的引物、进行序列扩增；
C、将PCR扩增子与谷胱甘肽转移酶基因克隆到Eco R1/Bam HI消化的原核细胞表达pGEX2T质粒载体上，将重组的质粒转至大肠杆菌，诱导已经转到了重组质粒的大肠杆菌，然后收获并裂解细菌，细菌裂解产物经离心后除去碎片而澄清，含融合蛋白的上清液采用谷胱甘肽琼脂糖4B经谷胱甘肽转移酶-谷胱甘肽亲和色谱仪纯化。
4、根据权利要求3所述试剂盒的制备方法，其特征在于EBNA 1引物设计为：
5′-TAC  GGA TCC CCT GTA GGG GAA GCC GAT TA-3′
         BamHI
5′-TAC  GAA TTC TCA CTC CTG CCC TTC CTC CAC-3′
         EcoRI。
5、根据权利要求3所述试剂盒的制备方法，其特征在于Zta引物设计为：
5′-TAC  GGA TCC ATG ATG GAC CCA AAC TCG AC-3′
         BamHI
5′-TAC  GAA TTC TTA GAA ATT TAA GAG ATC CTC-3′
         EcoRI。
6、根据权利要求3所述试剂盒的制备方法，其特征在于VCA-p18引物设计为：
5′-TAC  GGA TCC ATG GCA CGC CGG CTG CCC AAG-3′
         BamHI
5′-TAC  GAA TTC CTA CTG TTT CTT ACG TG-3′
         EcoRI。
CNB031542875A 2003-08-20 2003-08-20 Eb病毒蛋白酶联免疫吸附诊断试剂盒及其制备方法 Expired - Lifetime CN1300582C (zh)

Priority Applications (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN2006100799382A CN101144817B (zh) 2003-08-20 2003-08-20 一种eb病毒蛋白酶联免疫吸附诊断试剂盒及其制备方法
CN 200610077830 CN1920562A (zh) 2003-08-20 2003-08-20 Eb病毒蛋白酶联免疫吸附诊断试剂盒及其制备方法
CNB031542875A CN1300582C (zh) 2003-08-20 2003-08-20 Eb病毒蛋白酶联免疫吸附诊断试剂盒及其制备方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CNB031542875A CN1300582C (zh) 2003-08-20 2003-08-20 Eb病毒蛋白酶联免疫吸附诊断试剂盒及其制备方法

Related Child Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN 200610077830 Division CN1920562A (zh) 2003-08-20 2003-08-20 Eb病毒蛋白酶联免疫吸附诊断试剂盒及其制备方法
CN2006100799382A Division CN101144817B (zh) 2003-08-20 2003-08-20 一种eb病毒蛋白酶联免疫吸附诊断试剂盒及其制备方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN1584593A CN1584593A (zh) 2005-02-23
CN1300582C true CN1300582C (zh) 2007-02-14

Family

ID=34597961

Family Applications (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN 200610077830 Pending CN1920562A (zh) 2003-08-20 2003-08-20 Eb病毒蛋白酶联免疫吸附诊断试剂盒及其制备方法
CN2006100799382A Expired - Lifetime CN101144817B (zh) 2003-08-20 2003-08-20 一种eb病毒蛋白酶联免疫吸附诊断试剂盒及其制备方法
CNB031542875A Expired - Lifetime CN1300582C (zh) 2003-08-20 2003-08-20 Eb病毒蛋白酶联免疫吸附诊断试剂盒及其制备方法

Family Applications Before (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN 200610077830 Pending CN1920562A (zh) 2003-08-20 2003-08-20 Eb病毒蛋白酶联免疫吸附诊断试剂盒及其制备方法
CN2006100799382A Expired - Lifetime CN101144817B (zh) 2003-08-20 2003-08-20 一种eb病毒蛋白酶联免疫吸附诊断试剂盒及其制备方法

Country Status (1)

Country Link
CN (3) CN1920562A (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101144817B (zh) * 2003-08-20 2011-10-05 香港神农有限公司 一种eb病毒蛋白酶联免疫吸附诊断试剂盒及其制备方法

Families Citing this family (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101153059B (zh) * 2006-09-27 2010-05-12 同昕生物技术（北京）有限公司 用于鼻咽癌筛查、诊断和治疗效果预测的elisa试剂盒
CN101113979B (zh) * 2007-07-25 2012-01-11 中山大学肿瘤防治中心 检测EB病毒gp78抗体的CBA试剂盒及其制备方法
CN101545014B (zh) * 2009-05-11 2014-07-16 海康生命科技有限公司 一种检测传染病病原体的方法及试剂盒
CN103185795B (zh) * 2011-12-30 2015-01-07 深圳市亚辉龙生物科技有限公司 一种检测eb病毒抗体的试剂装置及其方法
WO2015184262A1 (en) * 2014-05-30 2015-12-03 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Compositions and methods of delivering treatments for latent viral infections
CN106645715B (zh) * 2016-11-18 2018-11-23 安徽医科大学 一种用于eb病毒衣壳抗原和核抗原1蛋白抗体联合检测的蛋白质芯片及其制备和应用
CN106771192A (zh) * 2017-01-04 2017-05-31 广州华弘生物科技有限公司 一种单核细胞增多症的快速诊断试剂盒
CN106755590A (zh) * 2017-01-22 2017-05-31 中南大学湘雅医院 一种用于检测传单患者eb病毒fish检测探针
DE102017121046B4 (de) * 2017-09-12 2023-07-06 Liv Bode Verfahren zum Nachweis akuter Borna Disease Virus (BDV) Infektionen und eines diagnostischen Kits hierfür, insbesondere in Kombination mit Verfahren zur Unterscheidung akuter von chronischen und ruhenden BDV-Infektionen und diagnostische Kits hierfür
CN108931655B (zh) * 2018-07-24 2021-09-07 中山大学肿瘤防治中心（中山大学附属肿瘤医院、中山大学肿瘤研究所） 抗eb病毒衣壳抗原和早期抗原抗体的校准品和质控品及其制备方法
CN109929040B (zh) * 2019-04-17 2021-03-23 北京贝思泰生物科技有限公司 一种eb病毒bfrf3-bzlf1融合蛋白、基因、包含其的载体、宿主细胞、试纸条及其生产方法和应用
CN113493495B (zh) * 2020-03-20 2022-08-16 上海交通大学医学院附属瑞金医院 Eb病毒balf4蛋白的抗原表位
CN112176110A (zh) * 2020-11-04 2021-01-05 上海思路迪生物医学科技有限公司 基于捕获测序的eb病毒检测技术
CN112903997B (zh) * 2021-01-19 2022-07-26 中山生物工程有限公司 EB病毒衣壳抗原IgA抗体酶联免疫检测试剂盒及其检测方法
CN112903998B (zh) * 2021-01-19 2022-07-22 中山生物工程有限公司 EB病毒NA1-IgA抗体酶联免疫检测试剂盒及其检测方法

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1038699A (zh) * 1988-05-11 1990-01-10 澳大利亚慈善机关修女财产托管人 新的酶免疫测定系统
US5374520A (en) * 1985-12-13 1994-12-20 The Johns Hopkins University Assay method for Epstein-Barr virus antibodies
US5672471A (en) * 1990-06-29 1997-09-30 E. I. Du Pont De Nemours And Company Assay for detection and/or quantifying a mammalian IgA antibody response to Epstein-Barr virus membrane antigen using EBV-MA gp 350/220 lacking the transmembrane anchor domain
EP0834742A1 (de) * 1996-10-01 1998-04-08 Gull Laboratories GmbH Spezifischer Anti-EBNA-1-Test mittels antikomplementärer Immunfluoreszenz
CN1053042C (zh) * 1985-08-22 2000-05-31 翰斯·Ｊ·沃尔夫 Eb病毒有关疾病的体外鉴别诊断方法
CN1331414A (zh) * 2000-06-28 2002-01-16 中国科学院大连化学物理研究所 一种液氨催化制低级脂肪胺反应过程产物的分析方法
JP2003043044A (ja) * 2001-07-30 2003-02-13 Denka Seiken Co Ltd 抗体捕捉法による抗体の免疫学的測定方法

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1920562A (zh) * 2003-08-20 2007-02-28 香港神农有限公司 Eb病毒蛋白酶联免疫吸附诊断试剂盒及其制备方法

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1053042C (zh) * 1985-08-22 2000-05-31 翰斯·Ｊ·沃尔夫 Eb病毒有关疾病的体外鉴别诊断方法
US5374520A (en) * 1985-12-13 1994-12-20 The Johns Hopkins University Assay method for Epstein-Barr virus antibodies
CN1038699A (zh) * 1988-05-11 1990-01-10 澳大利亚慈善机关修女财产托管人 新的酶免疫测定系统
US5672471A (en) * 1990-06-29 1997-09-30 E. I. Du Pont De Nemours And Company Assay for detection and/or quantifying a mammalian IgA antibody response to Epstein-Barr virus membrane antigen using EBV-MA gp 350/220 lacking the transmembrane anchor domain
EP0834742A1 (de) * 1996-10-01 1998-04-08 Gull Laboratories GmbH Spezifischer Anti-EBNA-1-Test mittels antikomplementärer Immunfluoreszenz
CN1331414A (zh) * 2000-06-28 2002-01-16 中国科学院大连化学物理研究所 一种液氨催化制低级脂肪胺反应过程产物的分析方法
JP2003043044A (ja) * 2001-07-30 2003-02-13 Denka Seiken Co Ltd 抗体捕捉法による抗体の免疫学的測定方法

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101144817B (zh) * 2003-08-20 2011-10-05 香港神农有限公司 一种eb病毒蛋白酶联免疫吸附诊断试剂盒及其制备方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN1584593A (zh) 2005-02-23
CN101144817B (zh) 2011-10-05
CN1920562A (zh) 2007-02-28
CN101144817A (zh) 2008-03-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN1300582C (zh) Eb病毒蛋白酶联免疫吸附诊断试剂盒及其制备方法
CN1324147C (zh) 细小病毒b19的诊断测试
CN1467500A (zh) 免疫学测定方法、免疫测定用试剂及其制造方法
CN101063683A (zh) 检测多种抗eb病毒抗原抗体的液相芯片试剂盒及其制备方法
CN1733937A (zh) 耳聋相关基因突变及其检测方法
CN1687454A (zh) 基于环介导的等温扩增技术的血液病毒核酸筛查方法
CN1636058A (zh) 新型丙氨酸转氨酶及其应用方法
CN1156587C (zh) 中国石斛属植物及其药材的dna分子鉴定方法
CN101037671A (zh) 杂交瘤细胞株及其产生的抗人红细胞表面h抗原的单克隆抗体
CN1590409A (zh) 针对sars冠状病毒n蛋白抗原的抗体及其在sars冠状病毒或者其抗原检测中的用途
CN1646704A (zh) 确定致病性病毒对蛋白酶抑制剂敏感性的组合物和方法
CN1255540C (zh) 一株疫苗诱导的乙型肝炎病毒株及其应用
CN1133594A (zh) 单纯性疱疹病毒-2ul26基因，衣壳蛋白，免疫测定和蛋白酶抑制剂
CN1798842A (zh) 核酸检测
CN1813064A (zh) 检测sars冠状病毒的方法
CN1087915A (zh) 用于丙型肝炎病毒分类的抗原肽,含有所述肽的药盒及用所述肽进行分类的方法
CN1216902C (zh) 非典型性肺炎病毒特异蛋白质和临床检测的方法及试剂盒
CN1763203A (zh) 一种基因重组人巨细胞病毒融合蛋白pp150/MDBP及其制备方法与应用
CN1495262A (zh) gp350/220的非剪接变异体
CN1531548A (zh) 编码可诱导抗病毒效应的蛋白质的嵌合链
CN1171995C (zh) 一种基于新肽的精神分裂症诊断方法
CN1156491C (zh) 经修饰的梅毒螺旋体外膜蛋白质,其免疫检测应用和含有它的试剂盒
CN1455814A (zh) 日本人戊型肝炎病毒多核苷酸探针和引物,检测芯片、试剂盒,以及检测方法
CN1746306A (zh) 一种重组人干扰素α4编码cDNA序列及其制备方法和应用
CN1661372A (zh) 一种用于检测sars抗体的免疫微球及其制备方法和用途

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
EE01 Entry into force of recordation of patent licensing contract

Assignee: ZHONGSHAN BIO-TECH Co.,Ltd.

Assignor: SINOCLONE Ltd.

Contract record no.: 2011990000813

Denomination of invention: Reagent kit for diagnosing EB virus ELISA and preparation thereof

Granted publication date: 20070214

License type: Exclusive License

Open date: 20050223

Record date: 20110824

CX01 Expiry of patent term

Granted publication date: 20070214

CX01 Expiry of patent term