CN101545014B - 一种检测传染病病原体的方法及试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种对可能存在于生物样品中的传染病病原体进行检测的方法，所述传染病病原体包括EB病毒、单纯疱疹病毒、巨细胞病毒和腺病毒，包括：扩增生物样品的核酸片段和用探针进行检测。本发明还提供用于扩增的引物以及用于检测的探针。本发明还提供包含上述引物的试剂盒。本发明所述方法灵敏度高，特异性强，操作简单，样本范围广，可同时检测多种传染病病原体，适用于呼吸道传染病的早期诊断。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学，特别是涉及检测传染病病原体的方法及试剂盒。
背景技术
在传染病流行的初期，准确、快速、便捷地对传染病的病原体进行检测，是控制传染病流行的关键。虽然国内和国际上已经建立了传染病的监测系统，但是现有的检测手段各有局限性。血清学检查利用相应的抗体与抗原结合检测到病原体，此方法诊断快速，简单、易于操作，但必须制备出针对该病原体的抗体后才能够进行检测，尤其是在还没有抗体来源的情况下不适用于传染病的早期诊断。
病原体分离法是通过直接对病原体进行分离培养，检测鉴定病原体。此方法灵敏度高、特异性强，但操作复杂、费时(至少要花费一周时间)，对实验室生物安全条件要求非常高，所以很难在疫情发生现场采用，而且不是所有的病原体都能通过病原体分离法获得。
核酸检测技术操作简便，反应快速，尤其是近年来发展的实时荧光定量PCR(Real time PCR)，灵敏度高，且能够监控整个反应进程，但一直存在DNA污染造成的假阳性率高的问题，而且由于其临界值不明显，因此检测结果灰区较宽，无法标准化，而且由于仪器要求高，投入大，对操作人员要求高，需要进行专业技能培训，还限制了多重检测的应用。同时该方法对于病原体含量极低的样本仍然无法检测。
NASBA(Nucleic acid sequence-based amplification，NASBA，依赖核酸序列的扩增技术)是一项连续、等温、基于酶反应的核酸扩增技术。该技术的反应体系包括反转录酶、核糖核酸酶H、噬菌体T7核糖核酸聚合酶和两条特别设计的寡核苷酸引物，其上游引物3′末端与模板的3′末端互补，5’末端含有噬菌体T7的依赖于DNA的RNA聚合酶的启动子序列，下游引物3′末端序列与模板的5′末端序列一致，5’末端含有与捕获探针互补的序列。在扩增起始阶段，上游引物与正义RNA模板结合后，在反转录酶的作用下合成与靶标RNA互补的反义cDNA，而原来的的RNA模板则被RnaseH降解。接着下游引物与cDNA杂交，在反转录酶的DNA聚合酶特性的作用下合成双链cDNA，即对应靶标RNA的双链cDNA拷贝。由于双链cDNA一端包含有T7 RNA polymerase的启动子序列，从而诱导了RNA聚合酶的活性，合成大量的与靶标序列互补的反义RNA链。如此循环反复，RNA拷贝数被不断放大。同时由于双链cDNA的另一末端还整合了与捕获探针互补的序列，因此所产生的互补RNA又能特异的结合捕获探针，以用于下一步的检测。
酶连接寡核苷酸捕获技术原理是NASBA扩增产物首先特异性地与捕获探针一端结合，后者的另一端能固定连接在微孔板上，然后加入病原体特异性检测探针及反应底物，检测产生的比色信号，这一检测读数与RNA的扩增产物量成正比，以此来检测NASBA扩增产物总量，判断病毒模板的感染情况。此方法操作简单，特异性强，适用于大量样品的快速检测。
EB病毒、单纯疱疹病毒、巨细胞病毒、腺病毒均为DNA病毒，引起的呼吸道传染病共同症状为发烧、头痛，常见于儿童期发病，并通常伴有皮疹发生，这些病原体致病性高并且难以区分，极易延误诊断和治疗的最佳时机。目前尚未见报道同时能检测及鉴别上述四种传染病病原体的检测方法，也没有相应的临床检测试剂盒上市。
发明内容
本发明目的是克服现有技术不能同时检测多种传染病病原体的缺陷，提供一种对可能存在于生物样品中的传染病病原体进行检测的方法，包括：
(i)扩增生物样品的核酸片段，所述核酸片段为以下的一种或一种以上的组合：
EB病毒的EBNA-1基因的如SEQ ID NO.1所示的核酸片段；
单纯疱疹病毒的UL30基因的如SEQ ID NO.2所示的核酸片段；
巨细胞病毒的UL83基因的如SEQ ID NO.3所示的核酸片段；
腺病毒的外壳蛋白六聚体基因的如SEQ ID NO.4所示的核酸片段；
(ii)用探针进行检测，所述探针与步骤(i)扩增产物中的一种特异性杂交。
本发明的一个优选实施方案是所述步骤(i)利用NASBA技术扩增样品的核酸片段。NASBA优选的运行条件为41℃～45℃温育90～150分钟。
本发明步骤(ii)中优选的是所述探针与步骤(i)所得扩增产物的杂交在固体支持物上进行。
可以固定探针和核酸片段的一种或多种，例如，固定在反应板上。术语“固体支持物”是指保持其杂交特性前提下寡核苷酸探针可以偶联的固体底物，通常，固体底物是尼龙末、纤维素膜、微珠、芯片或反应板。在固定之前，可以修饰探针，以促进固定或提高杂交效率。这样的修饰包括同聚物加尾，与NH2基团或生物素、半抗原偶联。
或者，探针和核酸片段都是不固定的，杂交可以在液体介质中进行，其检测可以用流式细胞术进行。
本发明还提供步骤(i)使用的引物，其核苷酸序列如下所示：
第1组引物用于扩增如SEQ ID NO.1所示的核酸片段，其上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，其下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；
第2组引物用于扩增如SEQ ID NO.2所示的核酸片段，其上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示，其下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示；
第3组引物用于扩增如SEQ ID NO.3所示的核酸片段，其上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示，其下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示；
第4组引物用于扩增如SEQ ID NO.4所示的核酸片段，其上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示。
上述第1组至第4组引物分别对应检测EB病毒、单纯疱疹病毒、巨细胞病毒、腺病毒。
在实际应用中，还有一种可能是使用上述引物组别中的任意一种或一种以上的组合，来扩增并检测EB病毒、单纯疱疹病毒、巨细胞病毒、腺病毒中某一种或几种，如使用第2组和第4组的序列进行单纯疱疹病毒和腺病毒的检测等。
本发明还提供所述步骤(ii)使用的捕获探针，其核苷酸序列如SEQ IDNO.17所示，其直接或间接的连接在固体支持物上，且与步骤(i)所得扩增产物杂交。
本发明还提供步骤(ii)中使用的检测探针：
序列1如SEQ ID NO.7所示，检测如SEQ ID NO.1所示的核酸片段；
序列2如SEQ ID NO.10所示，检测如SEQ ID NO.2所示的核酸片段；
序列3如SEQ ID NO.13所示，检测如SEQ ID NO.3所示的核酸片段；
序列4如SEQ ID NO.16所示，检测如SEQ ID NO.4所示的核酸片段。
上述序列1～4分别对应检测扩增后的EB病毒、单纯疱疹病毒、巨细胞病毒、腺病毒。
检测探针可用多种生物方法进行检测。优选地，所述检测探针由生物素或地高辛标记，加入底物，经过终止反应步骤后经分光光度计读取吸光度值进行结果判定。
本发明优选地实施方案是由多个反应管在同一时间进行步骤(ii)所述检测步骤，每个反应管使用的检测探针为序列1至序列4中的一种且与步骤(i)所使用的引物对应共同检测某一种病原体的存在。
上述方法的吸光度结果处理可以采取如下方案：测试K个阴性对照样品，取其吸光度值，按以下公式确定临界值：m+K×SD，m为阴性对照吸光度算术平均值，SD为阴性对照吸光度标准偏差，K依据不同实验条件而定，如检测的群体数或样本数。检测读数大于临界值则判定为检测结果“阳性”；检测读数小于临界值则判定为检测结果“阴性”。
本发明的术语“引物”指作为合成引物延伸产物的起始位点的单链寡核苷酸序列，其与待复制的核酸链互补，长度和序列必须适合于延伸产物的合成。
本发明术语“探针”指单链寡核苷酸，用于与核酸片段特异性杂交。“特异性杂交”指所述探针与核酸的整个区域或一部分在特定的实验条件下形成双链体，且在这些条件下，所述探针不与待检测样品中存在的其他核酸或核酸的其他区域形成双链体。
探针和核酸片段杂交后，可以通过任意合适的方式，进行杂交的检测，例如可以检测的标记探针和/或核酸片段，为了辅助检测，优选靶核酸片段进行NASBA扩增或PCR扩增。
本发明还提供一种对可能存在于生物样品中的传染病病原体进行检测的试剂盒，其包含用于扩增EB病毒的EBNA-1基因如SEQ ID NO.1所示核酸片段的引物、用于扩增单纯疱疹病毒的UL30基因如SEQ ID NO.2所示核酸片段的引物、用于扩增巨细胞病毒的UL83基因如SEQ ID NO.3所示核酸片段的引物、用于扩增腺病毒的外壳蛋白六聚体基因如SEQ ID NO.4所示核酸片段的引物中的一组或一组以上。
优选地，本发明所述试剂盒的引物选自以下4组引物：
第1组引物用于扩增如SEQ ID NO.1所示的核酸片段，其上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，其下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；
第2组引物用于扩增如SEQ ID NO.2所示的核酸片段，其上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示，其下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示；
第3组引物用于扩增如SEQ ID NO.3所示的核酸片段，其上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示，其下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示；
第4组引物用于扩增如SEQ ID NO.4所示的核酸片段，其上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示。
优选地，本发明所述试剂盒还包含如核苷酸序列SEQ ID NO.17所示的捕获探针。
更优选地，本发明所述试剂盒还包含以下至少一种与引物对应的检测探针：
序列1如SEQ ID NO.7所示，检测如SEQ ID NO.1所示的核酸片段；
序列2如SEQ ID NO.10所示，检测如SEQ ID NO.2所示的核酸片段；
序列3如SEQ ID NO.13所示，检测如SEQ ID NO.3所示的核酸片段；
序列4如SEQ ID NO.16所示，检测如SEQ ID NO.4所示的核酸片段。
本发明所述试剂盒还可以包含一种或多种下述组分：
杂交缓冲液或制备所述杂交缓冲液的说明书；洗涤溶液或制备所述洗涤溶液的说明书；检测形成的杂交体的组分；用于将探针附着到固体支持物上的组分。
本发明所述对可能存在于生物样品中的传染病病原体进行检测的方法，对比现有技术，其优点在于：
(1)检测速度快，效率高，可根据需要，随机两重、三重或多重组合同时检测多种致病病原体，也可检测单个病原体；
(2)灵敏度高，NASBA可检测到病毒的最小浓度为10-11pM，高于经典的病原分离法的敏感性；
(3)特异性强，由于外来双链DNA无T7启动子序列，不能被扩增，这就显著提高了NASBA反应的特异性；由于扩增过程中的引物和检测过程中的探针双重作用，再次保证了病原体检测的特异性，而且NASBA的反应条件温和，且比PCR反应需要的时间短，因此转录更加忠实于模板，进一步减少了错配率；
(4)操作简单，结果稳定，整个检测过程只需要酶标仪这种常规的仪器；
(5)适用于早期诊断，适用于不明原因发热引起的重大传染疾病的早期快速检测、多种病原体的随机组合检测以及大量样品的检验。
(6)适用范围广，取样简单。样品中DNA、肝素、EDTA、柠檬酸盐、血红蛋白、白蛋白和脂质等的污染将不会对结果造成影响，因而适用于各种待检样品如咽喉拭子、粪便、血液等。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，本领域的技术人员可以对其进行各种改造和修改，这些等价形式同样落入本发明的保护范围。
下面实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1
设计和制备引物、探针序列。
根据NCBI搜索选取EB病毒、单纯疱疹病毒、巨细胞病毒、腺病毒的特异性基因序列，它们分别是：
EB病毒的EBNA-1基因序列，GENEBANK登录号为U21205，选取序列高度保守部分作为靶核酸序列，本发明选取的靶序列是EBNA-1基因161-308，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
单纯疱疹病毒的UL30基因序列，GENEBANK登录号为X14112，本发明选取的靶核酸序列为UL30基因的64208-64374，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
巨细胞病毒的UL83基因序列，GENEBANK登录号为X17403，本发明选取的靶核酸序列是UL83基因的120206-120397，其核苷酸序列如SEQ IDNO.3所示；
腺病毒的外壳蛋白六聚体基因序列，GENEBANK登录号为X84646，本发明选取的靶核酸序列是外壳蛋白六聚体基因的34-149，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；
分析上述病毒特异性基因的信息，经序列分析软件DNAman进行引物间/内二聚体的排除，并经BLAST验证引物的特异性和与相近病原体的同源性，设计出针对上述病原体检测的NASBA引物和探针。
捕获探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示；引物及对应的检测探针如下所示：
第1组：用于扩增EB病毒的EBNA-1基因如SEQ ID NO.1所示的核酸片段的上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示、下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示、检测探针如SEQ ID NO.7所示；
第2组：用于扩增单纯疱疹病毒的UL30基因如SEQ ID NO.2所示的核酸片段的上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示、下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示、检测探针如SEQ ID NO.10所示；
第3组：用于扩增巨细胞病毒的UL83基因基因如SEQ ID NO.3所示的核酸片段的上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示、下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示、检测探针如SEQ ID NO.13所示；
第4组：用于扩增腺病毒的外壳蛋白六聚体基因如SEQ ID NO.4所示的核酸片段的上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示、下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示、检测探针如SEQ ID NO.16所示；
实施例2
制备本发明所述试剂盒。组成为：
1、扩增体系
引物(4组) 每组10uM
Tris/HCl 10-100mM
氯化钾 1-10mM
BSA 1-5g/ml
二硫苏糖醇 1-5mM
三磷酸核苷与脱氧三磷酸核苷等浓度混合物 200-1000uM
反转录酶 5-300U
核糖核酸酶H RNase H 5-300U
噬菌体T7核糖核酸聚合酶 5-300U
阴性对照为无RNA酶水
阳性对照是5pM人工合成的EB病毒的EBNA-1基因序列、单纯疱疹病毒的UL30基因序列、巨细胞病毒的UL83基因序列、腺病毒的外壳蛋白六聚体基因序列。
2、检测体系
检测探针(4组，均由地高辛标记) 26μM
捕获探针(生物素标记) 26μM
清洗缓冲液 1xTBS
杂交缓冲液 10mg/ml BSA，50mM Tris-HCl(pH 7.5)
检测缓冲液 1xTBS：1.4M NaCl，30mM KCl，260mM
检测浓缩液 碱性磷酸酶标记的抗地高辛的抗体
终止液 3M NaOH
底物 10mM对硝基苯磷酸盐溶液
阴性对照为无RNA酶水；
阳性对照是5pM人工合成的EB病毒的EBNA-1基因序列、单纯疱疹病毒的UL30基因序列、巨细胞病毒的UL83基因序列、腺病毒的外壳蛋白六聚体基因序列。
实施例3：
对可能存在于生物样品中的传染病病原体进行检测的方法，同时也是本发明所述试剂盒的使用方法。
1、核酸提取
取待测痰液样品，离心取上清，加入1ml异硫氰酸胍，混匀后再加入1ml TRIZOL，振荡混匀，冰浴中放置5分钟.加入350ul氯仿，充分振荡混匀，静止分层后，立即于4℃，12000r/min离心20分钟.将上清转移至另一离心管，加等体积的异丙醇(4℃预冷)混匀.-20℃放置1h，4℃，12000r/分钟离心20分钟，沉淀即总RNA.加入0.5ml 75％乙醇洗涤，4℃，12000r/分钟离心10分钟，小心倒掉乙醇，室温放置10分钟，加适量DEPC处理过的水溶解沉淀，即得到待测核酸样品，-80℃保存备用。
2、NASBA扩增反应
在0.5ml无RNA酶的灭菌离心管中配制如下所示的20μl NASBA扩增反应体系，在41℃温育90分钟，核酸扩增产物用于后续检测。
NASBA扩增反应体系(20μl)的终浓度具体为：
待测核酸样品 200μM
引物 1μM
AMV 10U
RNase H 10U
T7 RNA聚合酶 10U
Tris/HCl 10mM
氯化钾 1mM
BSA 100mg/ml
二硫苏糖醇 1mM
三磷酸核苷与脱氧三磷酸核苷等浓度混合物 200uM
3、NASBA扩增产物检测
取步骤2所得5μl NASBA产物，加1μl检测探针溶液(每孔各加一种)和1μl捕获探针溶液，和43μl杂交缓冲液混匀后加入包被了抗生物素蛋白链菌素的微孔板(购自Thermo fisher scientific)每个独立的孔中，在45℃温育1小时，以250μl 1xTBS，pH 7.4清洗小孔三次。每次倾去溶液后要拍干微孔板，每孔加100μl检测缓冲液与检测浓缩液的混合物(按检测浓缩液∶检测缓冲液＝1∶500稀释)，检测浓缩液购自Sigma，P/N N7653，在室温下温育30分钟，以250μl 1xTBS，pH 7.4清洗小孔三次，每次倾去溶液后要拍干微孔板，微孔加100μl底物，避光室温温育5分钟，100μl终止液并轻轻摇动来终止显色反应，将微孔板和微孔板板框放入标准96孔微孔板分光光度计并读取405nm吸光度。100μl底物加100μl终止液作为背景参照。
4、检测结果分析
上述吸光度结果处理采取如下方案：测试8个阴性对照样品测定其吸光度值，按以下公式确定临界值：m+8×SD，m为阴性对照吸光度算术平均值，SD为阴性对照吸光度标准偏差。临界值为0.15+0.035×8＝0.43。检测读数大于临界值则判定为“阳性”；检测读数小于临界值则判定为“阴性”。
实施例4：
对可能存在于生物样品中的传染病病原体进行检测的方法，同时也是本发明所述试剂盒的使用方法。
1、核酸提取
取待测血液样品，取新鲜全血2ml加1ml 3％柠檬酸钠，混匀后4℃，3000r/分钟离心，10分钟，取上清，加入1ml异硫氰酸胍，混匀后再加入1ml TRIZOL，振荡混匀，冰浴中放置5分钟.加入350ul氯仿，充分振荡混匀，静止分层后，立即于4℃，12000r/分钟离心20分钟.将上清转移至另一离心管，加等体积的异丙醇(4℃预冷)混匀.-20℃放置1h，4℃，12000r/min离心20分钟，沉淀即总RNA.加入0.5ml 75％乙醇洗涤，4℃，12000r/min离心10分钟，小心倒掉乙醇，室温放置10分钟，加适量DEPC处理过的水溶解沉淀，即得到待测核酸样品，-80℃保存备用。
2、NASBA扩增
在0.5ml无RNA酶的灭菌离心管中配制如下所示的20μl NASBA扩增反应体系，在41℃温育90分钟，核酸扩增产物用于后续检测。
NASBA扩增反应体系(20μl)的终浓度具体为：
待测核酸样品 600uM
引物 2uM
AMV 150U
RNase H 150U
T7 RNA聚合酶 150U
Tris/HCl 10mM
氯化钾 1mM
BSA 200mg/ml
二硫苏糖醇 3mM
三磷酸核苷与脱氧三磷酸核苷等浓度混合物 600uM
3、NASBA扩增产物检测
取步骤2所得5μl NASBA产物，加1μl检测探针溶液(每孔各加一种)和1μl捕获探针溶液，和43μl杂交缓冲液混匀并加入包被了抗生物素蛋白链菌素的微孔板(购自Thermo fisher scientific公司)每个独立的孔中，在45℃温育1小时，以250μl 1xTBS，pH7.4清洗小孔三次。每次倾去溶液后要拍干微孔板，每孔加100μl检测缓冲液和检测缓冲液的混合物(按检测浓缩液∶检测缓冲液＝1∶500配置)，在室温下温育30分钟，以250μl 1xTBS，pH7.4清洗小孔三次，每次倾去溶液后要拍干微孔板，微孔加100μl 10mM Tris/HCl，避光室温温育5分钟，加100μl终止液并轻轻摇动来终止显色反应，将微孔板和微孔板板框放入标准96孔微孔板分光光度计并读取405nm吸光度，使用100μl 10mM Tris/HCl加100μl终止液作为背景参照。
当检测待测样品中是否含有某3种病原体时，只需在配制扩增体系时，分别在3个反应管加入该3种病原体对应的引物，检测时加入该3种病原体对应的探针溶液，其他步骤同。
4、检测结果分析
测定10个已知的阴性样品的吸光度，临界值是m(阴性对照吸光度算术平均值)+10×SD(阴性对照吸光度标准偏差)，临界值通常为0.15+0.03×10＝0.45。检测读数大于临界值则判定为检测结果“阳性”；检测读数小于临界值则判定为检测结果“阴性”。
实施例5：检测EB病毒的灵敏度实验
1、核酸扩增
取1ml EB病毒标准品加入1ml异硫氰酸胍，混匀后再加入1mlTRIZOL，振荡混匀，冰浴中放置5分钟.加入350ul氯仿，充分振荡混匀，静止分层后，立即于4℃，12000r/min离心20分钟.将上清转移至另一离心管，加等体积的异丙醇(4℃预冷)混匀.-20℃放置1h，4℃，12000r/min离心20分钟，沉淀即总RNA.加入0.5ml 75％乙醇洗涤，4℃，12000r/min离心10分钟，小心倒掉乙醇，室温放置10分钟，加适量DEPC处理过的水溶解沉淀，即得到待测核酸样品，测定其浓度。
在0.5ml无RNA酶的灭菌离心管中分别标记，配制如下所示的20μlNASBA扩增反应体系，并同时设置两个阴性对照，EB病毒RNA配制为10-9pm、10-10pm、10-11pm、10-12pm的终浓度，每种浓度设置复管，以无RNA酶水作为阴性对照，41℃水浴95分钟。核酸扩增产物用于后续检测。
NASBA扩增反应体系(20μl)的终浓度具体为：
EB病毒RNA
引物(第1组) 1μM
AMV 10U
RNase H 10U
T7 RNA聚合酶 10U
Tris/HCl 10mM
氯化钾 1mM
BSA 100mg/ml
二硫苏糖醇 1mM
三磷酸核苷与脱氧三磷酸核苷等浓度混合物 200uM
取扩增产物委托上海生工生物工程技术服务有限公司进行序列分析，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，与EB病毒EBNA-1基因序列161-308一致。
2、核酸检测
1)在支持板框上安放一个微孔板板条，该微孔板包被了抗生物素蛋白链菌素(购自Thermo fisher scientific公司)。
2)每个微孔中依次加入43μl杂交缓冲液、加1μl检测探针溶液(第1组)和1μl捕获探针溶液，5μl扩增产物，轻敲支持板以混合溶液(注意避免产生气泡)。
3)牢牢盖上封口膜避免蒸发，45℃水浴60分钟。
4)倾去溶液后，以250μl 1xTBS，pH 7.4清洗小孔五次，且每次清洗30s，倾去溶液后拍干微孔板。
5)每孔加100μl检测缓冲液和检测浓缩液的混合物(按检测浓缩液∶缓冲液＝1∶500配置)，牢牢盖上封口膜避免蒸发。
6)在室温下温育30分钟。
7)倾去溶液后，以250μl 1xTBS，pH 7.4清洗小孔五次，且每次清洗30s，每次倾去溶液后拍干微孔板。
8)微孔加100μl连接液(小心避免在孔中引入泡沫)。
9)避光室温温育5分钟。
10)微孔加100μl终止液并轻轻摇动来终止显色反应。
11)将微孔板和微孔板板框放入标准96孔微孔板分光光度计并读取405nm吸光度。
3、结果如表1所示。
表1.本发明所述方法检测不同浓度EB病毒的吸光度值
| 样品 | EB病毒 | EB病毒 | EB病毒 | EB病毒 | EB病毒 | EB病毒 | EB病毒 | EB病毒 | 无RNA酶水 | 无RNA酶水 |
| 浓度(pM) | 10-9 | 10-9 | 10-10 | 10-10 | 10-11 | 10-11 | 10-12 | 10-12 | ||
| OD值405nm | 2.512 | 2.433 | 1.344 | 1.352 | 0.628 | 0.521 | 0.332 | 0.343 | 0.124 | 0.242 |
4、结果分析
经分光光度计读取吸光度值进行结果判定，测定7个已知的阴性样品(水)的吸光度，临界值是m(阴性对照吸光度算术平均值)+7×SD(阴性对照吸光度标准偏差)，临界值为0.17+0.04×7＝0.45。检测读数大于临界值则判定为检测结果“阳性”；检测读数小于临界值则判定为检测结果“阴性”。即第1组的引物与第1组的检测探针可以检测到EB病毒的最低浓度是10-11pM。
实施例6：检测其他病原体的灵敏度实验
参照实施例5，配制不同浓度的单纯疱疹病毒、巨细胞病毒、腺病毒，用其对应的引物进行NASBA扩增后测定扩增产物序列，其核苷酸与靶基因一致。用相应的捕获探针和检测探针进行检测，检测到的最低浓度均能达到10-11pM。
实施例7：EB病毒的引物特异性试验
将EB病毒EBNA-1基因161-308如SEQ ID NO.1所示的基因片段随机进行突变，突变后的核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示，为了叙述方便，将其称为EB病毒EBNA-1基因片段的干扰序列。
配制等浓度的实施例5EB病毒标准品扩增所得EBNA-1基因、上述干扰序列以及人DNA，取其中之一或两两混合或三种混合共配制成7种不同的待测样品，每种待测样品设置复管，在0.5ml无RNA酶的灭菌离心管中分别标记，配制如下所示的20μl NASBA扩增反应体系，并同时设置两个无RNA酶水的阴性对照，41℃水浴95分钟。核酸扩增产物用于后续检测。
NASBA扩增反应体系(20μl)的终浓度具体为：
待测样品 800μM
引物(第1组) 1μM
AMV 10U
RNase H 10U
T7 RNA聚合酶 10U
Tris/HCl 10mM
氯化钾 1mM
BSA 100mg/ml
二硫苏糖醇 1mM
三磷酸核苷与脱氧三磷酸核苷等浓度混合物 200uM
进行SDS-PAGE电泳分析，结果表明仅混合了EB病毒标准品的反应管有扩增产物，取扩增产物委托上海生工生物工程技术服务有限公司进行序列分析，其序列即为如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的5′连接了一段与捕获探针互补的序列。
实施例8：其他引物的特异性实验
参照实施例7，将单纯疱疹病毒的UL30基因如SEQ ID NO.2所示的核酸片段、巨细胞病毒的UL83基因如SEQ ID NO.3所示的核酸片段、腺病毒的外壳蛋白六聚体基因如SEQ ID NO.4所示的核酸片段的几个碱基随机突变后形成的干扰序列分别与其对应的靶核酸片段、人DNA进行特异性实验，即取其中之一或两两混合或三种混合共配制成7种不同的待测样品，分别在不同的反应管用相应的引物进行扩增，SDS-PAGE电泳分析表明仅有混合了靶核酸的反应管有扩增产物，取扩增产物委托上海生工生物工程技术服务有限公司进行序列分析，其序列即为靶核酸序列5′连接了一段与捕获探针互补序列。
以上实验结果说明本发明提供的引物特异性强，分析原因在于由于外来双链DNA无T7启动子序列，不能被扩增，这就显著提高了NASBA反应的特异性；而且NASBA的反应条件温和，且比PCR反应需要的时间短，因此转录更加忠实于模板，进一步减少了错配率。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110>北京海康基因芯片开发有限公司
<120>一种检测传染病病原体的方法及试剂盒
<130>MP090692
<160>18
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>148
<212>DNA
<213>EB病毒的EBNA-1基因161-308
<400>1
gtcacgtaga aaggactacc gatgaaggaa cttgggtcgc cggtgtgttc gtatatggag 60
gtagtaagac ctccctttac aacctcaggc gaggaattgc ccttgctatt ccacaatgtc 120
gtcttacacc attgagtcgt ctcccctt 148
<210>2
<211>167
<212>DNA
<213>单纯疱疹病毒UL30基因64208-64374
<400>2
atcaacttcg actggccctt cttgctggcc aagctgacgg acatttacaa ggtccccctg 60
gacgggtacg gccgcatgaa cggccggggc gtgtttcgcg tgtgggacat aggccagagc 120
cacttccaga agcgcagcaa gataaaggtg aacggcatgg tgaacat 167
<210>3
<211>192
<212>DNA
<213>巨细胞病毒UL83基因120206-120397
<400>3
ccaagatgca ggtgataggt gaccagtacg tcaaggtgta cctggagtcc ttctgcgagg 60
acgtgccctc cggcaagctc tttatgcacg tcacgctggg ctctgacgtg gaagaggacc 120
tgacgatgac ccgcaacccg caacccttca tgcgccccca cgagcgcaac ggctttacgg 180
tgttgtgtcc ca 192
<210>4
<211>116
<212>DNA
<213>腺病毒外壳蛋白六聚体基因34-149
<400>4
tacatgcaca tcgccggaca ggacgcttcg gagtacctga gtccgggtct ggtgcagttc 60
gcccgggcca cagacaccta cttcagtctg gggaacaagt ttaggaaccc cacggt 116
<210>5
<211>45
<212>DNA
<213>引物EB-F
<400>5
gatgcaaggt cgcatatgag gtcacgtaga aaggactacc gaaga 45
<210>6
<211>55
<212>DNA
<213>引物EB-R
<400>6
aattctaata cgactcacta tagggagaag gaaggggaga cgactcaatg gtgta 55
<210>7
<211>26
<212>DNA
<213>探针EB-P
<400>7
ggtagtaaga cctcccttta caacct 26
<210>8
<211>43
<212>DNA
<213>引物HSV-F
<400>8
gatgcaaggt cgcatatgag atcaacttcg actggccctt cgt 43
<210>9
<211>53
<212>DNA
<213>引物HSV-R
<400>9
aattctaata cgactcacta tagggagaag gatgttcacc atgccgttca cct 53
<210>10
<211>23
<212>DNA
<213>探针HSV-P
<400>10
caagctgacg gagatttaca agg 23
<210>11
<211>42
<212>DNA
<213>引物CMV-F
<400>11
gatgcaaggt cgcatatgag ccaagatgca ggtgataggt ga 42
<210>12
<211>52
<212>DNA
<213>引物CMV-R
<400>12
aattctaata cgactcacta tagggagaag gtgggacaca acaccgtaaa gc 52
<210>13
<211>25
<212>DNA
<213>探针CMV-P
<400>13
tgacccgcaa cccgcaaccc ttcat 25
<210>14
<211>40
<212>DNA
<213>引物Ad-F
<400>14
gatgcaaggt cgcatatgag tacatgcaca tctccggaca 40
<210>15
<211>54
<212>DNA
<213>引物Ad-R
<400>15
aattctaata cgactcacta tagggagaag gacagtggga ttcctgaact tgtt 54
<210>16
<211>22
<212>DNA
<213>探针Ad-P
<400>16
caggatgctt cggagtatct ga 22
<210>17
<211>20
<212>DNA
<213>捕获探针
<400>17
gatgcaaggt cgcatatgag 20
<210>18
<211>148
<212>DNA
<213>EB病毒的EBNA-1基因片段的干扰序列
<400>18
gtcacgagtc aaggactacc gatgaaggaa cttgggtcgc cggtgtgttc gtatatggag 60
gtagtaagac ctccctttac aacctcaggc gaggaattgc ccttgctatt ccacaatgtc 120
gtcttacacc attgagtcgt ctcccctt 148
Claims (2)
1.一种非疾病诊断或治疗目的的对可能存在于生物样品中的传染病病原体进行检测的方法，包括：
（ⅰ）扩增生物样品的核酸片段，所述核酸片段为EB病毒的EBNA-1基因的如SEQ ID NO.1所示的核酸片段或其与以下各种核酸片段的组合：
单纯疱疹病毒的UL30基因的如SEQ ID NO.2所示的核酸片段；
巨细胞病毒的UL83基因的如SEQ ID NO.3所示的核酸片段；
腺病毒的外壳蛋白六聚体基因的如SEQ ID NO.4所示的核酸片段；
（ⅱ）用探针进行检测，所述探针与步骤（ⅰ）扩增产物中的一种特异性杂交；
所述步骤（ⅰ）使用第1组引物用于扩增如SEQ ID NO.1所示的核酸片段，其上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，其下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示或其与以下各组的组合作为引物进行扩增：
第2组引物用于扩增如SEQ ID NO.2所示的核酸片段，其上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示，其下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示；
第3组引物用于扩增如SEQ ID NO.3所示的核酸片段，其上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示，其下游引物核苷酸序列如SEQ IDNO.12所示；
第4组引物用于扩增如SEQ ID NO.4所示的核酸片段，其上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示；
所述步骤（ⅰ）利用NASBA技术扩增样品的核酸片段，NASBA运行条件为41℃～45℃温育90～150分钟；
步骤（ⅱ）中所述探针与步骤（ⅰ）所得扩增产物的杂交在固体支持物上进行；
所述步骤（ⅱ）使用捕获探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示，所述捕获探针直接或间接的连接在固体支持物上；
步骤（ⅱ）中使用以下的核苷酸序列作为检测探针：
如SEQ ID NO.7所示，检测如SEQ ID NO.1所示的核酸片段；
如SEQ ID NO.10所示，检测如SEQ ID NO.2所示的核酸片段；
如SEQ ID NO.13所示，检测如SEQ ID NO.3所示的核酸片段；
如SEQ ID NO.16所示，检测如SEQ ID NO.4所示的核酸片段。
2.一种对可能存在于生物样品中的传染病病原体进行检测的试剂盒，其包含用于扩增如SEQ ID NO.1所示的核酸片段的引物或其与用于扩增如SEQ ID NO.2所示的核酸片段的引物、用于扩增如SEQ ID NO.3所示的核酸片段的引物和用于扩增SEQ ID NO.4所示的核酸片段的引物中的一组或一组以上的组合；
所述引物选自：
第1组引物用于扩增如SEQ ID NO.1所示的核酸片段，其上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，其下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；
第2组引物用于扩增如SEQ ID NO.2所示的核酸片段，其上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示，其下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示；
第3组引物用于扩增如SEQ ID NO.3所示的核酸片段，其上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示，其下游引物核苷酸序列如SEQ IDNO.12所示；
第4组引物用于扩增如SEQ ID NO.4所示的核酸片段，其上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示；
还包含如核苷酸序列SEQ ID NO.17所示的捕获探针。
还包含以下至少一种与引物对应的检测探针：
如SEQ ID NO.7所示，检测如SEQ ID NO.1所示的核酸片段；
如SEQ ID NO.10所示，检测如SEQ ID NO.2所示的核酸片段；
如SEQ ID NO.13所示，检测如SEQ ID NO.3所示的核酸片段；如SEQ ID NO.16所示，检测如SEQ ID NO.4所示的核酸片段。
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